Ingeniera Gentica de la produccin de etanol en Escherichia coli

Se insertaron los genes de las enzimas esenciales de la va fermentativa de Zymomonas mobilis para producir etanol en E. coli.

Zymomonas mobilis
Bacilo gram negativo Microaeroflica a anaerobia Metabolismo fermentativo obligado con produccin de etanol Va de Entner-Douduoroff

Durante la gluclisis, las clulas convierten azcares simples, como glucosa, en piruvato, con produccin neta de ATP y NADH

 Los m.o. son muy diversos en la gama de productos de fermentacin. Entre los que se incluyen cidos orgnicos, (lactato, acetato, succinato, etc) y otros como etanol, butanol, acetona. La diversidad de los productos de fermentacin tiene gran utilidad taxonmica. Aplicaciones biotecnolgicas

OBJETIVOS

Clonar y expresar las enzimas piruvato descarboxilasa y alcohol deshidrogenes de Zymomonas mobilis en E.coli TC4, bajo el control de un nico promotor, generando un operon artificial, para la produccin de EtOH

MATERIALES Y MTODOS

E. coli TC4 (LB + glu) Plsmido pLOI276 (piruvato descarboxilasa) Plsmido pLOI284 (alcohol deshidrogenasa) Plsmido pLOI295 (ambas enzimas) A550nm___________1DO 0.25mg/ml
Mtodos genticos: transformacin, seleccin de transformantes, etc, articulo anterior

Actividad enzimtica. uM/mg prot/min Clulas- disrupcin celular- inactivacin de otras enz. de E.coli que reducen NAD+, por calor- medicin de protenas totales. Control Z mobilis
Anlisis de los productos de fermentacin. HPLC. HPX-87H

RESULTADOS

FIG. 2. Comparison of plasmidfree strain TC4 and strain TC4 carrying plasmids encoding alcohol dehydrogenase and pyruvate decarboxylase on solid medium. All plates were incubated under aerobic conditions. Panels A, B, and C show petri plates in which strain TC4 (prototrophic for relevant markers) and plasmid-containing derivatives were streaked in the same orientation for comparison. The lower streak in each of these three panels is plasmid-free strain TC4, the left streak is strain TC4(pLOI276), the right streak is strain TC4(pLOI284), and the upper streak is strain TC4(pLOI295). The plate in panel A was incubated for 2 h at 37C. The acetaldehyde produced by alcohol dehydrogenase reacted with pararosaniline to produce the diffusible red pigment observed in this alcohol dehydrogenase indicator plate (5). The plates in panels B, C, and D were incubated overnight at 37C. The plate in panel B contains Luria broth without added glucose. The plates in panels C and D contain Luria broth containing 2% glucose. Panel D is a photograph of transformants which grew in Luria broth with glucose as progeny of a ligation during the construction of pLOI295. The large white colonies (two of which are marked by arrows) were subsequently found to contain plasmid pLOI295.

Fermentacin de la glucosa por las cepas recombinantes

Los productos de fermentacin fueron analizados por HPLC y los picos observados identificados utilizando estndares de las sustancias puras. Cultivos en caldo Luria al 10 % de glucosa anaerobiosis

 E. coli TC4 succinato5,1( mM), lactato (18 mM) y acetato (7 mM) principalmente

Expresin operon pet en condiciones de anaerobiosisetanol, 750 mM

 TC4 (pLOI284) - gen adh perfil similar al de TC4

TC4 (pLOI276) - gen pdc se observa un pico correspondiente al etanol, 18 mM (piruvato decarboxilasa Z. mobilis + alcohol deshidrogenasa E. coli)

 E. coli con operon pet alcohol

deshidrogenasaypiruvatodecarboxilasa dominan la oxidacin de NADH en cepa pLOI295. Km piruvato decarboxilasa de Z. mobilis: 0,4 mM Km lactato deshidrogenasa: 10-1000 mM

El piruvato se desva hacia la produccin de etanol y la fermentacin de E.coli se hace equivalente a la de S. cerevisiae y Z. mobilis.

Crecimiento
Desviacin del flujo de piruvato hacia la produccin de etanol afecta rendimiento celular y pH del medio.

 TC4 y TC4 pLOI284 (alcohol deshidrogenasa II): *0,25 mg proteina celular/ mL *pH 4,4 TC4 pLOI276 (piruvato decarboxilasa): *mg proteina celular/ mL se duplica *pH 4,5

TC4 operon pet: *250 mg proteina celular/ mL *pH 4,7

 Produccin de cidos orgnicos acidifica el medio limitando el crecimiento en todos los casos. A partir de una densidad de 2,5 mg de protena celular/mL, Mg2+ se vuelve limitante

Discusin
Reemplazo de enzimas nativas de E. coli para la fermentacin por aquellas de Z. mobilis sin reducir la tasa de crecimiento
productos de fermentacin producidos son relativamente inocuos para E. coli. til en la produccin de productos metablicos especficos a partir de sustratos no convencionales o por transferencia de vas metablicas a partir de otros m.o.