Saccharomyces Cerevisiae

Evaluacin de la fuente de carbono y nitrgeno en S.
cerevisiae para la produccin

de etanol.

1

CAPITULO l
1.1 INTRODUCCIN.
En los ltimos aos se ha especulado mucho con respecto al petrleo en
diferentes aspectos, tales como: el incremento de su precio, la disminucin de
reservas y la falta de certeza en su suministro. Por otro lado, la necesidad de
conservar y buscar nuevas fuentes de energa se ha convertido en una necesidad
para las principales actividades de la humanidad. Entre las posibles opciones para
obtener fuentes alternas de energa, destaca la obtencin de energa a partir de
biomasa (residuos agroindustriales o energa almacenada en forma de
carbohidratos en material vegetal) (Martnez et al., 2002). Siendo una opcin que
ha recibido atencin especial en varias partes del mundo. La biomasa es una
fuente de energa que tiene varias ventajas, no obstante su caracterstica
renovable es el punto clave. Los equipos y sistemas diseados por los humanos
para colectar y almacenar energa solar son costosos e ineficientes si se les
compara con el almacenamiento de energa en la biomasa mediante la
fotosntesis. La biomasa tambin tiene una versatilidad nica, la lista de especies
de plantas, sub-productos y materiales de desecho que pueden ser utilizados es
casi interminable. Con las tecnologas que actualmente se encuentran en
desarrollo, se podrn producir combustibles renovables, que sustituyan a los
combustibles fsiles en gran parte de sus roles actuales, (Martnez et al., 2002).
Los intentos para utilizar a la biomasa como fuente de energa no es nueva, los
combustibles tales como madera, carbn, rastrojos, entre otros; han sido
empleados como fuente de calor durante miles de aos. De hecho en nuestros
das, en los pases en vas de desarrollo, una gran parte de las personas usan
formas de energa relacionadas con la biomasa, siendo sta la principal fuente de
energa que consumen.
Probablemente uno de los retos ms difciles de la presente bsqueda de
sustitutos de combustibles derivados del petrleo son los carburantes lquidos
alternos. La produccin de etanol a partir de la biomasa es una de las pocas
Evaluacin de la fuente de carbono y nitrgeno en S. cerevisiae para la produccin
de etanol.

2

opciones que es viable actualmente (Mielenz, 2001) Existen tecnologas que estn
en proceso de maduracin; se pueden utilizar una gran variedad de materias
primas; y el etanol producido es un compuesto valioso y verstil, ya que puede ser
utilizado como oxigenante, carburante, solvente o ser transformado, mediante
tecnologas ya establecidas para otros combustibles. (Bungay, 2004).
El programa ms grande de produccin de etanol por tecnologas biolgicas
sustentables ha sido desarrollado por Brasil. La produccin de etanol ha sido
promovida desde 1975, cuando el Programa Nacional de Alcohol (Pro-alcohol) fue
establecido con el fin de reducir el dficit generado por las compras de petrleo y
por las alzas del precio de ste durante la dcada de los setentas. En ese pas en
1981 ms de 450 000 automviles funcionaban con etanol anhidro o etanol al
96%((Vergara y Castello-Branco, 1981)
Hoy en da, Brasil produce ms de 15 mil millones de litros de etanol al ao y el
40% de los automviles que circulan emplean mezclas de gasolina-etanol que
contienen 95% (v/v) de etanol (combustible conocido como E95), el resto utiliza
mezclas que contienen 22% (v/v) del mismo alcohol.
El etanol puede ser obtenido de materiales renovables como la sacarosa de caa,
de remolacha, melazas, suero de leche, almidones, cereales (maz, trigo, sorgo o
cebada) en los cuales, previo tratamiento de la materia prima, la glucosa es la
fuente de carbono que las levaduras, como Saccharomyces cerevisiae, pueden
utilizar a manera de sustrato para crecer, obtener energa y producir etanol. Otra
alternativa es la utilizacin de materiales lignocelulsicos que constituyen una
fuente barata y viable, en los que se incluyen, entre otros, rastrojo de maz, paja
de arroz, papel, residuos de madera y bagazo de caa (Ingram et al., 1999).
En el caso de Mxico, a diferencia de otros pases como EUA, la obtencin de
Etanol a partir de maz u otros cereales no es una alternativa viable, debido a que
algunos son utilizados para el consumo humano y no se producen en cantidades
suficientes para cubrir las necesidades de alimentacin del pas. Tampoco la
sacarosa proveniente de la caa de azcar, y que en Brasil es utilizada en el
de etanol.

3

programa Pro Alcohol, constituye una materia prima alterna para nuestro pas,
debido a que la demanda requerida de etanol carburante es elevada as como el
precio de la sacarosa (Martnez et al., 2002).
Se ha sugerido el uso de levaduras de deficientes respiratorias (petite) de S.
cerevisiae porque los rendimientos de alcohol son ms altos debido a que este
tipo de clulas son insensibles al oxgeno y, por tanto, el sustrato no se desva
hacia el crecimiento (Brown et al., 1994). Sin embargo, las deficientes respiratorias
crecen ms lento que la competente que les dio origen.
Se propone como una opcin viable el uso de la miel B como fuente de carbono
ya que es rica en azucares tales como sacarosa, glucosa, fructuosa y pequeas
cantidades de manosa ya que son asimilables para la levadura S. cerevisiae
ITV01 DR en la produccin de etanol; y como fuente de nitrgeno, la utilizacin de
urea, sulfato de amonio, fosfato de amonio. El nitrgeno puede ser utilizado por
las levaduras de diversas formas, ya sea como compuesto orgnico o inorgnico,
esto puede dar beneficios en la obtencin de etanol.

de etanol.

4

1.2 JUSTIFICACIN.
El mundo encara el agotamiento progresivo de sus recursos energticos basados
mayoritariamente en combustible no renovable. Al mismo tiempo el consumo de
energa aumenta a ritmo cada da ms acelerado. En la actualidad no se satisface
la demanda de etanol a nivel nacional para la utilizacin en la industria.
Efectivamente el precio de la caa de azcar en Mxico es bastante elevado,
cerca de 38 U$/TM. Cifras que se comparan con pases de Sudamrica
prcticamente, se triplica.
La posibilidad de usar otras fuentes de carbono, puede ayudar la obtencin de
etanol ms econmico: el uso de la miel intermedia B, es presentado como una
alternativa viable para la produccin de etanol, ya que la miel B solo es utilizada
para la produccin de azcar y no para etanol. Sin embargo por el alto contenido
de azucares fermentables que tiene, y la disponibilidad de nutrientes lo hace ser
un interesante sustrato renovable.
La utilizacin de fuente de nitrgeno como la de sulfato de amonio, fosfato de
amonio y urea que puede ayudar a la levadura en su biosntesis de protenas,
cidos nucleicos y polmeros de la pared celular, para una mayor obtencin de
etanol.

de etanol.

5

1.3 OBJETIVOS.

1.3.1 Objetivo general.
Evaluar el efecto de la fuente de carbono y nitrgeno sobre la produccin
de etanol con S. cerevisiae ITV01 DR.

1.3.2 Objetivos especficos.

Seleccionar la mejor fuente de carbono para la produccin de etanol con S.
cerevisiae ITV01 DR.

Evaluar el efecto del sulfato de amonio, urea y fosfato de amonio sobre el
crecimiento y actividad fermentativa de S. cerevisiae ITV01 DR empleando
la fuente de carbono previamente seleccionada.

de etanol.

6

1.4 PLANTAMIENTO DEL PROBLEMA.
La importancia que hoy en da tienen los temas de corte energtico, no solo en
nuestro pas, sino en el mundo en general, que es el agotamiento progresivo de
sus recursos energticos no renovables, al mismo tiempo el consumo de energa
aumenta cada da ms, y esto hace que generen enorme cantidades de gases
contaminantes que son liberados a la atmsfera, estos tipos de contaminantes han
causado cambios climticos en el planeta. La nica forma de encarar este
problema es mediante recursos energticos renovables, para ello la biotecnologa
ofrece mltiples alternativas como emplear diferentes fuentes de carbono y
nitrgeno para la obtencin de etanol y satisfacer las necesidades de la
humanidad en materia energtica. Es por ello, que se ha planteado el uso de S.
cerevisiae ITV01 DR como la cepa a emplear; sin embargo, se desconoce el
efecto de la fuente de carbono y nitrgeno industrial sobre la produccin de etanol.

1.5 ALCANCES Y LIMITACIONES.

En los alcances que se lograron, fueron el aprendizaje del de los mtodos de
fermentacin, las tcnicas de conteo de microorganismo, el manejo de equipos,
tales como: espectrofotometro UV-Vis y el cromatografo de lquidos de alta
resolucin (HPLC, por sus siglas en ingls).
En nuestras limitaciones que encontramos que las tcnicas de conteo y viabilidad
del microorganismo son difciles de llevar a cabo, el tiempo de residencias que se
da para llevar a cabo el proyecto es demasiado corto, sin embargo fue posible
alcanzar el objetivo del estudio.

de etanol.

7

1.6 FUNDAMENTO TERICO.
1.6.1 ALCOHOL ETLICO.
Los alcoholes son aquellos compuestos cuyas molculas se componen de
carbono, hidrgeno y uno o ms hidroxilos (-OH). Los alcoholes ligeros son
lquidos miscibles con el agua, es decir, que pueden mezclarse fcilmente. Existen
otros alcoholes ms densos o espesos, como las ceras.
El etanol, o tambin llamado alcohol etlico (CH
3
CH
2
-OH), es el ms comn de
los alcoholes y se caracteriza por ser un compuesto lquido, incoloro, voltil, con
un punto de ebullicin de 78.4 C, inflamable y soluble en agua.
El biocombustible ms importante es el alcohol carburante (etanol) el cual puede
ser utilizado como oxigenante de la gasolina, elevando su contenido de O
2
lo que
permite una mayor combustin de la misma disminuyendo las emisiones
contaminantes de hidrocarburos no oxidados completamente (Thomas y Kwong
2001).
El uso de etanol como oxigenante representa varias ventaja, mayor contenido de
0
2
, mayor octanaje, no es toxico, reduce mas las emisiones de CO y no
contamina las fuentes de agua (thomas y kwong 2001).
En Mxico, desde hace varios aos, se produce etanol de caa de azcar en los
diferentes ingenios del pas que cuentan con destileras, slo que su uso es para
bebidas embriagantes e industriales, no para su uso como combustible. Se
produce, principalmente, de melazas de caa de azcar y con una tecnologa
tradicional.
No obstante de contar con capacidad instalada para producir mayor cantidad, los
ingenios del pas no la utilizan, dado que la demanda es limitada y que el insumo
es cclico. En promedio, la capacidad utilizada es de 44% respecto a la capacidad
instalada; adems es relativamente fcil hacer adecuaciones para ampliar esa
capacidad.
de etanol.

8

Aproximadamente, la mitad de los ingenios del pas cuentan con destileras, unas
ms, otras menos modernas, pero pueden producir etanol (96GL). Por ejemplo,
la oferta total en el ciclo agrcola 2002-2003 fue de 39.2 millones de litros,
producidos por los ingenios. Ahora bien, hay que decir que no todo el etanol que
se produce en Mxico es anhidro.
Se estima que la capacidad instalada para etanol combustible sera de 33 millones
de litros por ao, producidos fundamentalmente en los ingenios La Gloria y San
Nicols, ambos ubicados en el Estado de Veracruz (Horta, 2005).
Segn datos de la produccin de etanol mundialmente en el 2004 fue cerca de
41,000 mil litros y en el 2007 fue de 55,700 millones de litros, y segn estudios
realizados la demanda de etanol para el 2010 ser de 101.000 millones de litros.
1.6.2 MTODOS DE PRODUCCIN DE ETANOL.
El etanol (alcohol etlico) se obtiene por dos mtodos: por va qumica, empleando
derivados del petrleo, pero no resulta una opcin viable debido al agotamiento de
las reservas de petrleo; y por va fermentativa, teniendo como ventaja el uso de
recursos renovables como: monosacridos (glucosa), disacridos (sacarosa) y
polisacridos (almidones, celulosa, hemicelulosa) lo que permite un desarrollo
sustentable del proceso (Poy, 2005).

La eficiencia del proceso de produccin de etanol se ve afectada por varios
factores, como:

- El modo de operacin del reactor, ya sea por lote, lote alimentado y cultivo
continuo.
- Las condiciones ambientales, como el pH, la temperatura y la aireacin.
- Los requerimientos nutricionales, tales como la fuente de carbono, nitrgeno,
el uso de diferentes sales y la suplementacin del medio de cultivo con
vitaminas.
de etanol.

9

- El microorganismo empleado, entre los que se encuentran bacterias y
levaduras.
Las levaduras presentan ventajas sobre las bacterias para este proceso, debido a
que no son susceptibles a la contaminacin por bacterifagos, es menos probable
la contaminacin con bacterias cido lcticas, adems del tratamiento final que se
le debe dar a la biomasa bacteriana producida, mientras que la biomasa de
levadura producida puede ser empleada en diferentes industrias (Kuyper, 2006).
Es por ello que se han reportado varias caractersticas deseables en las levaduras
para la produccin de etanol (Panchal, 1990 y Hutter y Oliver, 1998), entre las que
se encuentran:

- Ser fcil de propagar.
- Ser genticamente estable.
- Fermentar rpida y eficientemente.
- Poseer la actividad Killer.
- Ser capaz de utilizar una amplia vaiedad de sustratos.
- No presentar represin en el consumo de sacridos por glucosa.
- Generar un mnimo de calor durante la fermentacin.
- Tener caracteristicas floculantes.
- Ser osmotolerante.
- Ser resistente a etanol.
- Ser termotolerante.
- Ser resistente a bajos pH.
- Ser cido tolerante.
- Ser resistente a compuestos txicos.
- Ser deficiente respiratoria.

Tomando como base estas caractersticas se han desarrollado varias tecnologas
para la produccin de etanol con levaduras; de manera general se pueden
clasificar en procesos en lote, lote alimentado y continuo.
de etanol.

10

Existen varios procesos en lote, entre los que se encuentran el proceso a partir de
la cuba madre y el proceso con recirculacin de levaduras, teniendo semejanzas
entre ellos.
En el proceso a partir de la cuba madre, la levadura crece bajo condiciones
aerbicas en concentraciones bajas de sustrato (70 g/L), despus de
aproximadamente 10 horas se obtienen concentraciones de biomasa entre 60 y
80x10
6
cel/mL, y stas son transferidas a la cuba de fermentacin, ocupando
aproximadamente un 30% del volumen total y se alimenta el sustrato azucarado
concentrado (melazas de caa de azcar o remolacha, por ejemplo) hasta obtener
una concentracin de azcar alrededor de 220 g/L. Este proceso se realiza sin
aireacin, y en un tiempo de 36 a 48 horas se obtiene alrededor del 10 a 16 % v/v
de etanol, con productividades entre 2.2 y 3.6 g/Lh, dependiendo del sustrato
empleado (Gilis, 1999).
El proceso con recirculacin de clulas se lleva a cabo de manera similar al
proceso a partir de la cuba madre, slo que al terminar la fermentacin se separan
las levaduras del medio. La crema de levadura obtenida puede ser llevada a una
cuba de regeneracin durante un corto perodo de tiempo en presencia de aire,
transcurrido este tiempo se obtienen alrededor de 2x10
8
cel/mL que se alimentan
a la cuba de fermentacin teniendo como resultado tiempos de fermentacin de 36
a 48 horas, obteniendo productividades entre 3.2 y 4.8 g/Lh y concentraciones del
19 al 21% de etanol (Cot, 2007). Los procesos continuos tienen como ventaja
general un incremento en la productividad de cualquier proceso, entre los
procesos continuos se encuentran principalmente el multietapas y el continuo en
cuba nica, tambin conocido como Proceso BIOSTIL (Gilis, 1999).
El cultivo continuo multietapa consiste en una serie de cinco a ocho fermentadores
colocados en serie, obteniendo concentraciones de etanol de 16.7 %v/v con
productividades de 12 a 18 g/Lh (Cot, 2007).
El cultivo continuo de cuba nica (BIOSTIL) fue propuesto en los aos 80 por la
Compaa Alfa-Laval. Este mtodo consta de un fermentador nico aireado donde
de etanol.

11

se tienen dos alimentaciones: la primera proviene de la alimentacin fresca de
medio y la segunda de la recirculacin de levaduras y vinazas. En cuanto a la
forma de realizar la recirculacin existen diferentes mtodos, como la
centrifugacin y la sedimentacin; sin embargo, se destacan los procesos de
membrana que permiten altas densidades celulares y confieren menor dao a las
clulas; obteniendo concentraciones de alcohol del 12 %v/v con productividades
de 30 a 40 g/Lh a partir de un medio enriquecido en slidos, disminuyendo el
volumen de vinazas obtenidas (Cot, 2007).
En modo de operacin en lote alimentado deriva del cultivo por lote, donde el
sustrato es alimentado durante la fermentacin con el fin de evitar la inhibicin por
sustrato. La produccin de etanol se divide en dos etapas: una fase de crecimiento
y una fase de produccin de etanol (Cot, 2007). Con este mtodo, se han
alcanzado concentraciones entre 19 y 21 %v/v y en tiempo entre 20 y 48 horas
con productividades de hasta 12 g/Lh, en los cuales se manejan estrategias de
alimentacin de cofactores y de la fuente de carbono (Alfenore et al., 2002) .
De lo anterior, es posible inferir que la osmotolerancia y la resistencia a etanol son
factores cruciales para el xito de un proceso de produccin, puesto que hacen
posible la obtencin de concentraciones elevadas de etanol en el medio, lo que
minimiza los costos de recuperacin y el volumen de vinazas obtenidas. Es por
ello, que estudiar cada una de las variables del proceso (medio de cultivo, factores
fisicoqumicos) que afectan el comportamiento cintico y metablico de las
levaduras resulta de inters, puesto que con el entendimiento de los procesos
celulares se podr sugerir la estrategia que permita mejorar el proceso. A
continuacin se presentan algunos aspectos tericos sobre las levaduras.
1.6.3 LEVADURAS
Las levaduras tienen importancia econmica, social y de salud en la cultura
humana. A menudo, las levaduras han sido referidas como los primeros
organismos domesticados, debido a que la fermentacin para la produccin de
vinos representa, probablemente, la primera biotecnologa. En la actualidad, las
de etanol.

12

levaduras han encontrado un amplio nmero de aplicaciones; adems de su uso
en fermentaciones en el rea de alimentos, las levaduras genticamente
manipuladas pueden ser usadas para producir agentes biofarmaceticos para
prevenir y tratar enfermedades humanas.
A futuro, el uso de las levaduras ser ms significante proporcionando fuentes de
energa renovables, biotecnologa ambiental incluyendo el control biolgico.
Horecker (1978) fue aun ms lejos, sugiriendo que la fermentacin alcohlica
representa una gran esperanza para la sobrevivencia de la civilizacin en el
planeta.
La fisiologa de las levaduras es definida como el entendimiento de su crecimiento
y metabolismo. En trminos generales explica cmo las levaduras interactan con
su medio bitico y abitico, especficamente explica cmo las levaduras se
alimentan, metabolizan, crecen, se reproducen y finalmente mueren. La
biotecnologa de levaduras se define como el uso de la fisiologa de levaduras
(Walker, 1998). A continuacin se har una revisin sobre los aspectos ms
importantes sobre la nutricin y metabolismo de las levaduras.
1.6.3.1 NUTRICIN DE LEVADURAS.
El trmino nutricin de levaduras se refiere a cmo las levaduras se alimentan; de
forma especfica involucra dos aspectos: requerimientos nutricionales y la
adquisicin de los nutrientes. El entendimiento de los requerimientos nutricionales
y las estrategias de adquisicin de nutrientes, junto con la regulacin del
transporte de nutrientes es importante no slo para el cultivo de las levaduras en
el laboratorio, sino tambin para la optimizacin del proceso de fermentacin
industrial.
de etanol.

13

1.6.3.2 REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES.
Los compuestos orgnicos e inorgnicos en un medio de cultivo desempean
funciones de activadores o inhibidores para el crecimiento, su efecto depender de
su naturaleza y de las concentraciones en el medio de cultivo. Cada levadura
presenta requerimientos nutricionales diferentes, sin embargo, es posible
generalizar sobre sus requerimientos de la siguiente forma: carbono, hidrgeno,
oxgeno, nitrgeno, azufre, fsforo, oligoelementos y factores de crecimiento.
1.6.3.2.1 CARBONO.
Las levaduras son organismos quimioorganotrficos porque obtienen la energa y
el carbono de compuestos orgnicos. Estos compuestos son generalmente
azcares, de los cuales la glucosa es la ms empleada en levaduras; sin embargo,
no es el azcar ms efectivamente metabolizable para todas ellas, debido a que
no se encuentra libre de forma natural en sus habitats. Adems, la glucosa
generalmente ocasiona efectos inhibitorios y de represin en la asimilacin de
otros azcares. Las levaduras pueden asimilar azcares (hexosas, pentosas,
disacridos, trisacridos, oligosacridos, polisacridos), alcoholes, cidos
orgnicos, cidos grasos, hidrocarburos y compuestos aromticos. Una pequea
proporcin (5%) de sus requerimientos de carbono pueden ser incorporados del
dixido de carbono. Esta fijacin es necesaria en reacciones anaplerticas para
reemplazar los cidos dicarboxlicos del ciclo de los cidos tricarboxlicos
empleados para la sntesis de cidos grasos, purinas y pirimidinas (Walker, 1998).

GLUCOSA.
La glucosa es un monosacridos con frmula emprica C
6
H
12
O
6
, la misma que la
fructosa pero con diferente posiciones relativa de los grupos OH y O=. Es una
hexosa, es decir que contiene seis tomos de carbono y es una aldosa, esto es el
grupo carbonilo esta en el extremo de la molculas, es una forma de azcar que
se encuentra libres en las frutas y en la miel.
de etanol.

14

SACAROSA.
La sacarosa tiene la frmula C
12
H
22
O
11
que pertenece a un grupo de hidratos de
carbono llamados disacridos. Es el azcar normal de mesa, extrada de la
remolacha azucarera o de la caa de azcar, es soluble en agua y ligeramente
soluble en alcohol y ter.

MIEL INTERMEDIA B
La miel intermedia B, un jarabe viscoso y oscuro, es un intermediario del proceso
de obtencin del azcar de caa (azcares no cristalizables en las condiciones del
segundo tacho). Los componentes principales de la miel los constituye el agua,
que se encuentra en su mayor parte como agua libre y otra aparte retenida como
agua de hidratacin, y los hidratos de carbono. El azcar presente en la miel se
encuentra fundamentalmente como sacarosa, glucosa, fructosa y pequeas
cantidades de manosas, en su composicin estn presentes los no azcares
orgnicos e inorgnicos en los que se puede citar los compuestos nitrogenados,
cidos, aminocidos, albuminas, vitaminas, ceras, esteroles, lpidos, sales
minerales.
de etanol.

15

1.6.3.2.2 NITRGENO.
El nitrgeno puede ser utilizado por las levaduras de diversas formas, ya sea
como compuesto orgnico o inorgnico. Ciertos gneros de levaduras son
incapaces de consumir nitratos, como Saccharomyces, Kluyveromyces y Pichia;
por el contrario, Brettanomyces es capaz de consumirlos, lo cual ha sido
empleando como criterio taxonmico para la identificacin de este gnero (Aguilar,
1998). Las levaduras son capaces de utilizar fuentes orgnicas e inorgnicas
para incorporarlas a los componentes estructurales y funcionales de la clula.
Los iones amonio son transportado activamente y pueden ser asimilados
directamente a pocos aminocidos, dentro de los cuales existe: glumato y a la
glutamina, estos compuestos sirven como precursores para la biosntesis de
otros aminocidos. El glutamato y la glutamina son productos del amonio y por
tanto son compuestos claves para el metabolismo del nitrgeno y del carbono. El
principal producto formado despus de la asimilacin de ion amonio por levaduras
es el glutamato (figura 3) por la glutamato deshidrogenada dependiente de NADP.
NADPH + H
+
NADP
-cetoglutarato + NH
4
+
L-glutamato + H
2
O
FIGURA 3. Reaccin alfa- cetoglutarato a L-glutamato (Walker, 1998)
La forma NAD dependiendo de esta enzima lleva acabo la desaminacin
catablica del glutamato de manera reversible. Sin embargo, si la disponibilidad
del ion amonio se encuentra reducida (1 Mm), las otras enzimas realizaran la
asimilacin del amonio de manera significativa.
La glutamina sintetasa es una enzima de gran importancia ya que cataliza el
primer paso de varias rutas que conducen a la sntesis de muchas
macromolculas importante para la celula. En levaduras que crecen en presencia
de sales de amonio, casi todas del nitrgeno es primero asimilado a glutamato y
de etanol.

16

glutamina, donde estos aminocidos obtienen su nitrgeno amino requerido
para el crecimiento celular. Las rutas metablicas de la glutamato deshidrogenada
y la glutamina sintetasa se encuentra altamente reguladas por iones de amonio
por residuos intracelulares de aminocidos. Con respeto a la asimilacin ion
nitrato aunque Saccharomyces cerevisiae no es capaz de asimilar esta forma
nitrogenada aunque otras levaduras (Candida, Hansenula spp.) pueden
transportarlo y asimilarlo como su nica fuente nitrogenada ( Walker 1998).
La asimilacin a nitrgeno orgnico es a travs de la enzima nitrato reductasa y
la enzima nitrito reductasa (Figura 4)

NASPH+ H
+
NADP
+
NADPH+H
+
NADP
NO
-
3
NO
-
2
NO
-
2
NH
-
4
FIGURA 4. Transporte electrnico de nitrato al ion amonio ( Walker, 1998).
Los iones de amonio formados de esta ltima reaccin pueden ser asimilados
como se mencionaba anteriormente, de tal manera que la glutamato y la glutamina
pueden considerarse como los productos finales de la asimilacin del nitrato
por levaduras.
El nitrato exgeno es generalmente toxico en levaduras, pero ciertas especies
(candida nitrapophila) pueden transportarlo si se presenta a bajas concentraciones
y sea reducida a amonio (Hipkin, 1989)
Algunas levaduras pueden presentar nitrificacin de amonio a nitrato y a travs
de la ruta ambiental de las levaduras con nitrificacin heterotrfica se ha pensado
que es de poca significancia ambiental. Wainwright y Falinth (1996) encontraron
que Williposis californica puede ser importante en la nitrificacin de suelos ricos en
carbono.

de etanol.

17

UREA.
La urea es ampliamente utilizada como fuente de nitrgeno por levaduras, y
dependiendo de su concentracin extracelular puede ingresar a la clula por
transporte activo o por difusin facilitada. Como se puede obeservar en la (Figura
5). En levaduras ureasas negativa Sacharomyces cerervisiae, urea
aminohidrolasa (urea carboxilasa + alofanato hidrolasa) hidroliza urea amonio:
3H
2
O
NH
2
CONH
2
+ATP+HCO
3
NH
2
CONHCOO
-
2NH
+
4
+ 2HCO
3
UREA ALOFANATO
FIGURA 5. Metabolismo de la urea por levaduras (Walker, 1998).
La urea puede ser utilizada como una fuente econmica de nitrgeno para
fermentaciones industriales en donde se emplean por ejemplo las melazas. Sin
embargo, no es recomendado como suplemento nutricional en fermentaciones de
producciones de bebidas alcoholicas, debido a que es posible la formacin de
etilcarbomato (compuesto carcinognico ) el cual es formado como producto de la
reaccin qumica entre etanol y la urea residual dentro del proceso de destilacin.
El etilcarbomato puede tambin presentarse como un intermediario del
metabolismo de la urea en fermentaciones para produccin de vino por levaduras
(Hensck y Jiranek, 1993)
Algunas levaduras (Candida, Pichia ssp.) pueden tambin utilizar aminas
metiladas como nica fuente de nitrgeno (Van Dijken, 1981). Las levaduras
transportan L-aminocidos por procesos especficos de membranas dentro de la
clula donde pueden asimilar hacia protenas como tambin descomponerlos a
travs de varias rutas metablica. En medios industriales, la concentracin y los
tipos de aminocidos presentan un papel importante en el curso de la
fermentacin de las levaduras y en el espectro de metabolitos producidos.
de etanol.

18

SULFATO DE AMONIO.
El sulfato de amonio y sulfato diamnico son las sales ms utilizadas como fuente
de nitrgeno, ya que aportan, al mismo tiempo, azufre y fsforo que la clula
necesita. El in amonio es empleado por las levaduras para la formacin del cido
glutmico, que acta como donador de un grupo amino para la sntesis de otros
aminocidos para la clula (Aguilar, 1998). La asimilacin y utilizacin de
nitrgeno amoniacal y nitrgeno amino pueden variar segn la levadura utilizada,
ya que puede ser afectada por numerosos factores como la aireacin y la
concentracin de glucosa, entre otras. Por otro lado, el ion sulfato aporta el azufre
necesario para maximizar el crecimiento de las levaduras.
FOSFATO DE AMONIO.
El fosforo es esencial para las clulas de levaduras para su incorporacin en
molculas estructurales, los cidos nucleicos y sus metabolitos fosforilados.
Levaduras tambin pueden almacenar fosforo en la vacuola, en forma de fosforo
ortofofato polimrico comn mente disponible para la levadura en forma de
ortofosfato inorgnico. Que metabolizan muy rpidamente para el transporte
nucletidos trifosfato, en la levadura se produce contra un transporte de con
centracion en contra de un gradiente de concentracin y por lo tanto se activa.
Tambin depende de la presencia en la de un sustrato fermentable exgeno
como la glucosa, pero sustratos respirables como acetato o etanol que no son
compatibles con la absorcin de fosfato. En s. Cerevisiae, al menos tres sistema
se cree que translocan ortofosfato. En s. cerevisiae es concebible que los bajos y
los sistema de alta afinidad pueden operar simultanea mente dependiendo sobre
la disponibilidad de fosfato, de hecho la absorcin de fosfato pueden ser
controlados por la concentracin de ortofosfato intracelular. Por ejemplo, en
mitocondria levadura, que exhiben altas y bajas de transporte de afinidad, y en las
vacuolas en la formacin de fosfato insolubles pueden contribuir a la forma en que
la levadura controles citolgica los niveles de fosfato.

de etanol.

19

1.6.3.3 ADQUISICIN DE NUTRIENTES.
Para que las levaduras puedan cumplir con sus funciones, no solo es importante
que en el medio de cultivo se tengan los compuestos necesarios, sino que la
levadura sea capaz de adquirir estos nutrientes del medio y guarde un equilibrio
con el mismo.
El transporte de azcares en levaduras ha sido estudiado por muchos aos,
debido a la importancia biotecnolgica de esto en fermentaciones industriales. As,
se conoce que la velocidad de formacin de etanol est limitada por la velocidad
de transferencia de azcares al interior de la clula (Walker, 1998).
Las levaduras, generalmente, transportan preferentemente la glucosa; sin
embargo, las membranas celulares no son permeables a azcares, por lo que
existen varios mecanismos para la translocacin de la glucosa y otros sacridos;
por ejemplo: en S. cerevisiae se conocen 20 transportadores de hexosas que
difieren en su abundancia y afinidad para ciertas hexosas (Kruckeberg, 1996).
Aunque cada levadura es diferente se pueden realizar ciertas generalidades con
respecto al transporte de azucares:
a) La glucosa es tomada en contra de un gradiente de concentraciones.
b) Los transportadores de glucosa son estreo especficos para ciertas
hexosas, y pueden transportar glucosa, fructosa y manosa.
c) El transporte de glucosa alcanza el equilibrio y no es acumulativo.
d) Los transportadores de glucosa facilitan la difusin libre.
e) Durante el transporte no hay consumo de energa.
f) La fosforilacin acompaa a la glucosa al entrar a la clula.

La sacarosa es un azcar fcilmente fermentable por las levaduras y es muy
abundante en la naturaleza. Santos et al. (1982) reportaron que algunas cepas de
S. cerevisiae tienen un simport sacarosa-protn (transporte simultneo de una
molcula no cargada y de un catin en la misma direccin, por un mismo
de etanol.

20

transportador). Pero de manera general, la sacarosa es primero convertida a
glucosa y fructosa, mediante la presencia de una invertasa periplsmica. El gen
SUC2 (gen de la invertasa) es reprimido en presencia de glucosa, y es expresado
cuando la concentracin de glucosa es baja (Walker, 1998).
En lo concerniente al transporte de etanol, se ha demostrado que la difusin libre
es el medio de transporte del etanol en la clula. La salida del etanol es,
obviamente, importante para la industria de la fermentacin, mientras que la
entrada del etanol es relevante en el crecimiento aerbico de S. cerevisiae en
glucosa, debido a la presencia de un crecimiento diaxico (Walker, 1998).
TRANSPORTE DE NITRGENO.
Las levaduras no pueden fijar el nitrgeno atmosfrico, pero son capaces de
trasportar y utilizar compuesto de nitrgeno. Las fuentes de nitrgeno
generalmente tienen una funcin anablica de protenas estructurales y enzimas
funcionales. Algunas fuentes de nitrgeno pueden ser catabolizadas
inmediatamente a la entrada de la clula. Las fuentes favorables de nitrgeno
para maximizar el crecimiento de levaduras son los iones de amonio, glutamato y
glutamina. Todas las levaduras son capaces de usar el amonio como una fuente
de nitrgeno y sales de amonio. En S. cerevisiae se ha demostrado se lleva a
cabo por un transporte activo con las siguientes caractersticas:
- Alta afinidad (K
T
0.2 mM).
- Requiere un sustrato fermentable.
- Los aminocidos causan una inhibicin no competitiva.

1.6.3.4 EFECTOS DE REGULACIN.
En la actualidad se conocen cuatro mecanismos de regulacin para la
fermentacin y respiracin en levaduras. Estos mecanismos son: Efecto Kluyver,
Efecto Custer, Efecto Pasteur y Efecto Crabtree (Pronk et al., 1996), para fines del
de etanol.

21

presente trabajo se describiran los ltimos dos, que son los que presenta S.
cerevisiae.

1.6.3.4.1 EFECTO PASTEUR.

El efecto Pasteur relaciona al oxgeno con la cintica de consumo de azcares y
bajo condiciones anaerbicas. Es la inhibicin de la va de Embden-Meyerhof-
Parnas (EMP) en presencia de oxgeno, manifestado como una inhibicin de la
fermentacin alcohlica (Fiechter et al., 1981; Lagunas et al., 1982). La velocidad
de consumo de glucosa es menor en aerobiosis que en anaerobiosis. Este
mecanismo modifica el metabolismo bsico a nivel enzimtico como: regulacin de
la actividad isocitrato deshidrogenasa, inhibicin de la actividad de la
fosfofructoquinasa e inhibicin alostrica sobre la actividad de la glucosa a travs
de la membrana plasmtica (Aguilar, 1998). Este efecto solo se presenta cuando
las concentraciones de glucosa son bajas (5mM en S. cerevisiae) o bajo ciertas
limitaciones de nutrientes (Lagunas, 1979), est asociado con una disminucin de
la afinidad del transporte de azcares en aerobiosis (Fiechter et al., 1981). Cuando
se realiza un cambio de aerobiosis a anaerobiosis (menor produccin de ATP) las
clulas responden con un incremento en el flujo en la gluclisis. Nissen et al.
(1997) realizaron la determinacin de los flujos metablicos en anaerobiosis en
cultivo continuo limitando la fuente de carbono con S. cerevisiae.
Busturia y Lagunas (1986) observaron que al crecer a la levadura bajo limitacin
de nitrgeno se induce la inactivacin en el sistema de transporte de azcares lo
cual reduce la velocidad de la fermentacin, pero no altera la velocidad de
respiracin. La razn por la cual la velocidad de fermentacin disminuye puede ser
explicada por la teora de competencia enzimtica de Holzer (Holzer, 1961), es
decir, la piruvato deshidrogenasa tiene mucho mayor afinidad por el piruvato que
la piruvato decarboxilasa de la ruta fermentativa.
Otros factores intracelulares y extracelulares han sido implicados en el control de
flujo glucoltico sobre la expresin del efecto Pasteur, esto incluye: fosfato
inorgnico (Lagunas y Gancedo, 1983); iones amonio (Lloyd et al., 1983);
de etanol.

22

intermediarios de la va glicoltica (Muller et al., 1995); AMP (Dombek e Ingram,
1988) y pH intracelular (Rowe et al., 1994). La regulacin puede estar dada por la
enzima fosfofructoquinasa, la que es considerada la enzima regulatoria de la
gluclisis y del efecto Pasteur.
Sin embargo, el control fisiolgico sobre la gluclisis, ms correctamente involucra
una regulacin a travs de varias enzimas (Zimmerman, 1992) y no solo de la
fosfofructoquinasa. De hecho la sobre-expresin del gen de la fosfofructoquinasa
en S. cerevisiae no ocasiona cambios en el flujo glicolitico (Brindle, 1996). Pero lo
anterior es diferente para cultivos en crecimiento de S. cerevisiae donde la
respiracin es slo del 3 al 20% del azcar catabolizado comparando con el 25 al
100% con las clulas que no se encuentran creciendo (Lagunas et al., 1982).

1.6.3.4.2 EFECTO CRABTREE.
Si la concentracin de glucosa es alta el efecto Pasteur no opera, por lo que se
presenta el efecto Crabtree. Este fenmeno (tambin conocido como efecto
glucosa o contra efecto Pasteur) relaciona la concentracin de glucosa con la ruta
catablica particular adoptada por las levaduras sensibles a glucosa (por ejemplo,
S. cerevisiae) en presencia de oxgeno y establece que, aun bajo condiciones
aerbicas, prevalece la fermentacin sobre la respiracin. Es decir, el NADH es
preferentemente oxidado durante la fermentacin que durante la respiracin; otra
forma de definir al efecto Crabtree es que la fermentacin alcohlica se presenta
en condiciones de aerobiosis en exceso de glucosa (Aguilar, 1998). La glucosa es
convertida a etanol en aerobiosis. La glucosa tiene un efecto represivo en los
procesos de biosntesis de enzimas respiratorias en Saccharomyces spp. (Moulin
et al., 1984). El mecanismo propuesto es la acumulacin de piruvato, lo que
provoca una saturacin en el metabolismo respiratorio (Figura 6), observndose lo
siguiente:
a) En limitacin de glucosa no se observa la fermentacin alcohlica y el
rendimiento de biomasa se incrementa hasta alcanzar un mximo.
de etanol.

23

b) En presencia de un exceso de glucosa se logra una acumulacin de
piruvato en el citosol, lo que causa que ste al no ser metabolizado mediante
respiracin, sea dirigido hacia la produccin de etanol.

FIGURA 6. Saturacin del metabolismo de piruvato ocasionado por el exceso de glucosa. a) No
hay saturacin del metabolismo del piruvato debido a la baja concentracin de glucosa en el
medio. b) Saturacin del metabolismo de piruvato. Glucosa ( ), piruvato ( ), biomasa ( ) y
etanol ( ).
En la Figura 7 se puede observar el comportamiento cintico de las levaduras que
estn sujetas a este mecanismo de regulacin, destacndose que existe una
concentracin de glucosa debajo de la cual no se presenta la fermentacin
alcohlica y se obtiene el mayor rendimiento de biomasa, por arriba de esta
concentracin se logra la produccin de etanol.
El efecto Crabtree de corto trmino es observado cuando se agrega un exceso de
glucosa al medio de cultivo que no se encuentra fermentando, por lo que la
respuesta del cultivo es iniciar la fermentacin en presencia del exceso de
glucosa. El efecto Crabtree de largo trmino es manifestado bajo condiciones de
fermentacin aerbicas en condiciones de estado estacionario en cultivos de
levaduras completamente adaptadas a dichas condiciones (Postma et al., 1989).
de etanol.

24

FIGURA 7. Comportamiento cintico de las levaduras que presentan el efecto Crabtree. Velocidad
especfica de crecimiento (), rendimiento en biomasa (Yx/s), velocidad especfica de formacin de
etanol (v
p
) y concentracin de sustrato (Cs).

El efecto Crabtree no es solo aplicable al crecimiento en glucosa debido a que S.
cerevisiae tambin fermenta aerbicamente fructosa. En presencia de manosa o
galactosa, S. cerevisiae respira y fermenta simultneamente (De Deken, 1966).
El efecto Crabtree no es aplicable para levaduras insensibles a glucosa (C. utilis,
Kluyveromyces marxianus, Trichosporon cutaneum). C. utilis, una levadura
Crabtree negativa, puede limitar su velocidad en la va glicolitica por acumulacin
intracelular de carbohidratos o bien, puede presentar una regulacin diferente al
transporte de los mismos (Postma et al., 1989).
En S. cerevisiae, la supresin de la respiracin por glucosa se considera debida a
la represin y/o inactivacin de las enzimas respiratorias y a la actividad de los
transportadores (Lagunas, 1993).
La represin catablica ocurre cuando la glucosa (o un producto inicial del
metabolismo de la glucosa) reprime la sntesis de varias enzimas respiratorias y
de etanol.

25

gluconeognicas (Fiechter et al., 1981); dicha inactivacin catablica resulta en
una rpida desaparicin de tales enzimas con la adicin de glucosa. En la
represin catablica, la actividad enzimtica se pierde por dilucin con el
crecimiento celular, esto es, aunque las enzimas continan estando presentes, no
se sintetizan ms debido a la represin de los genes por seales derivadas por la
glucosa u otros azcares (Gancedo, 1992).
La contribucin de la fermentacin en el consumo global de glucosa es mayor para
las levaduras creciendo aerbicamente en altas concentraciones de glucosa. Sin
embargo, cuando los niveles de glucosa disminuyen, las enzimas respiratorias son
desreprimidas lo que induce su sntesis, esto resulta en un consumo de etanol
cuando las clulas inician una segunda fase de crecimiento conocida como diauxia
(Walker, 1998).
Generalmente concentraciones cercanas a 5mM de glucosa afectan no slo a las
enzimas respiratorias sino tambin a la expresin de muchos genes involucrados
en el transporte de azcares y en su utilizacin (Carlson, 1987). Por ejemplo los
genes de SUC, MAL y GAL (genes para la utilizacin de la sacarosa, maltosa y
galactosa).
La inactivacin catablica es ms rpida que la represin catablica, se piensa
que es debido a que la glucosa induce la desactivacin de un nmero limitado de
enzimas como la fructosa 1,6 bifosfatasa (Holzer, 1976). La inactivacin de la
enzima ocurre primero por fosforilacin de la enzima, seguido de una lenta
proteolisis vacuolar. Franois et al. (1984) demostraron que la inactivacin
irreversible de la 1,6 bifosfatasa ocurre en S. cerevisiae por fosforilacin mediada
por una protena cinasa dependiente de adenosina monofosfato cclico (AMPc).
El efecto Crabtree puede, adems, ser debido a una saturacin de la capacidad
respiratoria de las levaduras (Kappeli y Sonnleitner, 1986). As, las levaduras que
presentan el efecto Crabtree (Crabtree positivas) poseen una capacidad oxidativa
limitada cuando crecen en glucosa, lo que ocasiona la acumulacin de piruvato y
en consecuencia la produccin de etanol.
de etanol.

26

La regulacin entre respiracin y fermentacin es fundamental para el xito de
muchos procesos industriales donde se aprovecha del metabolismo de las
levaduras. En S. cerevisiae, la optimizacin de la respiracin es importante para la
produccin de levadura (por ejemplo, para la industria de alimentos), mientras que
la optimizacin de la fermentacin es importante para la produccin de etanol
(Panchal, 1990). As por ejemplo, para la produccin de levadura en lote
alimentado se controla la concentracin de azcares con lo que se suprime la
formacin de etanol, obtenindose un mayor rendimiento en biomasa.
El metabolismo de levaduras, adems de ser afectado por los efectos de
represin catablica, es tambin afectado por efectos de inhibicin en presencia
de un exceso de sustrato y producto.
1.6.3.5 LEVADURAS DEFICIENTES RESPIRATORIAS.
Una levadura deficiente respiratoria (DR) se caracteriza por presentar una
respiracin alterada (Arneborg y Chi, 1999). Estas levaduras son de dos tipos:
mitocondriales y nucleares, dependiendo del lugar de la mutacin (Nagai et al.,
1963). Las mutantes mitocondriales presentan una disminucin del ADN
mitocondrial (OConnor et al., 1976). Debido a su deficiencia en respiracin
presentan incapacidad para crecer en sustratos no fermentables, tales como el
glicerol (Heslot et al., 1970).
Las levaduras DR son tres veces ms resistentes al sulfato de cobalto, al cianuro,
a la antimicina A y a la adriamicina, por lo que pueden ser consideradas como
resistentes a compuestos txicos (Heslot et al., 1970; Daugherty et al., 1980 y
Poinsot, 1987).
Nagai et al. (1963) resumen que la mutacin deficiente respiratoria puede ser
obtenida por medio de agentes qumicos, tales como: colorantes bsicos
(acriflavina, ametista violeta, etc.), por sales de metales pesados (Co, Ni, Mn y
Cd), por inhibidores enzimticos (azida de sodio, p-nitrofenol y 2,4 dinitrofenol) y
por otros agentes (como la cafena, el TTC y etanol). Tambin pueden ser
obtenidas por medios fsicos, como radiacin UV, y por tratamientos trmicos
de etanol.

27

subletales. Las mutantes obtenidas por medios qumicos generalmente son
mutantes mitocondriales, por lo que el elemento de respuesta al stress (STRE)
puede ser afectado, mientras que las mutantes obtenidas por medios fsicos
generalmente son nucleares, lo cual ayuda a mantener la integridad y
funcionalidad de la mitocondria.
Las condiciones de cultivo afectan directamente la mutacin DR, por lo que ha
sido recomendado emplear condiciones de microaerobiosis o anaerobiosis para
inducir la mutacin (Guiraud et al., 1987).
Hutter y Oliver (1998) obtuvieron una levadura deficiente respiratoria por medio de
la eliminacin del gen PET191, en el cromosoma X de S. cerevisiae; se piensa
que este gen codifica para una protena ensambladora del citocromo C, sin
embargo la funcin biolgica del gen no ha sido totalmente entendida
(Saccharomyces genome database). El fenotipo de la levadura fue afectado en el
metabolismo de trehalosa, por lo que es posible que el elemento de respuesta al
estrs se vea afectado tambin.
Este tipo de mutacin no es deseable durante la fermentacin de la cerveza y,
aunque es frecuente de manera natural (mayor al 1%), produce efectos adversos,
tales como cambios en las propiedades de floculacin, produccin de compuestos
de aroma no deseados (diacetil) e incapacidad para utilizar azcares no
fermentables. Guiraud et al. (1987) establecieron que las levaduras DR presentan
una disminucin en la concentracin de los citocromos a+a
3
y b con respecto a la
levadura Silvestre (ver Figura 8), son incapaces de crecer en sustratos no
fermentables y no consumen etanol, por lo que no presentan un crecimiento
diaxico.
de etanol.

28

FIGURA 8. Espectros de absorcin de levaduras competentes y deficiente respiratoria. W,
Levadura Silvestre; M, Mutante deficiente Respiratoria (Guiraud et al., 1987).

Se ha sugerido el uso de mutantes deficientes respiratorias (petite) de S.
cerevisiae porque los rendimientos de alcohol son ms altos debido a que este
tipo de clulas son insensibles al oxgeno y, por tanto, el sustrato no se desva
hacia el crecimiento (Brown et al., 1994). Sin embargo, las deficientes respiratorias
crecen ms lento que la competente que les dio origen.
Guiraud et al. (1987) Reportaron que las levaduras deficientes respiratorias
presentan una mayor velocidad de formacin de etanol (en condiciones de
anaerobiosis para la levadura silvestre 1 g/gh y 2.5 g/gh para la DR) y un mayor
rendimiento especfico de etanol (Yp/x) en condiciones de aerobiosis para la
levadura silvestre de 7.6 g/g y 28 g/g para la levadura DR. Adems, las levaduras
deficientes respiratorias son cidotolerantes y resistentes a los compuestos
txicos que alteran la cadena respiratoria y el proceso de fosforilacin en
levaduras. Los resultados obtenidos por Giraud et al. (1987) son debidos a los
cambios realizados en la represin catablica ejercida por el efecto Crabtree y
Pasteur dados por la mutacin deficiente respiratoria.
de etanol.

29

Tradicionalmente, se ha recomendado emplear condiciones de microaerobiosis
para la produccin de etanol; sin embargo, Alfenore et al. (2004) encontraron que
bajo condiciones de aerobiosis es posible disminuir la produccin de glicerol a
0.01 g/g contra 0.042 g/g obtenido en condiciones de anaerobiosis. Estos
resultados son importantes puesto que la presencia de glicerol en el medio de
cultivo dificulta el proceso de destilacin del etanol.
Poinsot et al. (1987) Encontraron que la velocidad de produccin de CO
2
en
anaerobiosis aumenta de 130 a 250 L/hmg para la levadura silvestre y su
deficiente respiratoria y el valor del coeficiente respiratorio vara de 1.2 a 5,
respectivamente; tales resultados indican un aumento en la represin ejercida por
el efecto Crabtree y por tanto la imposicin del metabolismo fermentativo sobre el
respiratorio. Adems, se presenta una disminucin del efecto Pasteur, dado por el
aumento del valor del indice del efecto Pasteur (PE) de 15% a un 85% para la
levadura silvestre y su deficiente respiratoria. El resultado de los cambios en la
represin catablica causa un aumento en la velocidad de fermentacin tanto en
aerobiosis como en anaerobiosis.
Gong et al. (1981) evaluaron la produccin de etanol con S. cerevisiae y su
deficiente respiratoria, encontrando un aumento de un 3% en la eficiencia del
proceso. ner et al. (2005) y ner (2006) concluyen que las levaduras deficientes
respiratorias presentan mejores caractersticas que sus competentes respiratorias
para la produccin de etanol.

de etanol.

30

1.6.3.6 S. cerevisiae ITV01 DR.
S. cerevisiae ITV01 DR, es un levadura resistente a bajos valores de pH, tambin
es osmotolerante debido que la velocidad especfica de crecimiento permanece
sin alteracin en un amplio intervalo de concentraciones iniciales de glucosa,
produce altas cantidades de etanol. Esta mutante fue obtenida mediante
exposicin a bromuro de etidio y seleccionada por presentar mejores
caractersticas que la cepa parental. La deficiencia en su metabolismo oxidativo
est dada por la ausencia del citocromo c (ver Figura 9). Las mejores condiciones
para la produccin de etanol son: pH 3.5, 30 C, 150 rpm (Ortiz-Muiz, 2009). Sin
embargo, se desconoce el efecto de la fuente de carbono y nitrgeno sobre el
crecimiento y la produccin de etanol en S. cerevisiae ITV01 DR.

FIGURA 9. Espectros absolutos de () S. cerevisiae ITV01 y () S. cerevisiae ITV01 DR. Cit
a+a
3
, 610nm; Cit b, 560nm y Cit c, 549nm.
de etanol.

31

CAPITULO ll

2.1 MATERIALES Y METODOS.
2.1.1 MATERIAL BIOLGICO.
La cepa que se empleo fue S. cerevisiae ITV01 DR obtenida mediante mutacin
con bromuro de etidio por Ortiz-Muiz (2009).

2.2 MEDIOS DE CULTIVOS.
2.2.1 MEDIO DE CONSERVACIN.
La cepa es conservada en refrigeracin a 4C, resembrada cada mes en el medio
de conservacin (Tabla 1).

TABLA 1. Composicin del medio de conservacin.
Componente g/L
Agar-agar 150
Glucosa 100
Extracto de levadura 10

de etanol.

32

2.2.2 MEDIO DE FERMENTACIN.
Las fermentaciones se realizan utilizando un medio de cultivo sinttico mnimo
(Tabla 2), propuesto por Strehaiano (1984).

TABLA 2. Composicin del medio de fermentacin.
COMPONENTE g/L
Glucosa o Sacarosa 150
KH
2
PO
4
5.0
(NH
4
)
2
SO
4
2.0
MgSO
4
.
7H
2
O 0.4
Extracto de levadura 1.0

Para las cinticas realizadas empleando como fuente de carbono, miel intermedia
B, ajustando el contenido de azcares a 200 g/L. Los medios de cultivo fueron
suplementados empleando tres fuentes de nitrgeno (urea, sulfato de amonio y
fosfato de amonio) y cinco niveles para cada una de ellas (1 a 5 g/L, incrementos
de 1 g/L), realizndose todas las fermentaciones por duplicado.
Los medios sintticos fueron esterilizados en autoclave a 121C durante 15 min
(matraces Erlenmeyer). Los medios con miel intermedia B no fueron esterilizados.
2.3 CONDICIONES DE FERMENTACIN.
Para poder disminuir la fase de adaptacin del microorganismo al medio de cultivo
de fermentacin, la levadura fue previamente activada por medio de un precultivo.
Se toman tres asadas de la caja petri de la levadura en conservacin y se incuba
en un matraz Erlenmeyer de 250 mL (100 mL de medio de cultivo e incubado a
150 rpm y 30 C). Despus de transcurridas 12 horas de incubacin, un nmero
de 6x10
6
clulas viables/mL son tomadas del precultivo e inoculadas a un segundo
de etanol.

33

matraz, el cual es incubado a las mismas condiciones. Finalmente, se toman
6x10
6
clulas viables/mL como inculo para las cinticas a nivel matraz.
2.4 MTODOS ANALTICOS.
2.4.1 ANLISIS DE BIOMASA.
La densidad ptica (DO) es medida a 620 nm empleando un espectrofotmetro
Cintra 10, en celdas de metacrilato con una trayectoria ptica de 10 mm, se
realizan las diluciones adecuadas para tener valores de absorbencia menores a
0.8, correlacionando estos valores obtenidos con el peso seco (Figura 10).

2.4.2 CUENTA CELULAR.
La cuenta celular se realiza empleando una cmara de Thoma. Las muestras de
cultivo fueron diluidas con el fin de contar cada vez un nmero mximo de 500
clulas. Cada conteo es realizado a partir de cinco cuadros grandes de la cmara
de Thoma (Figura 11). El volumen de cada cuadro es de 4x10
-6
mL.

FIGURA 10. Correlacin Densidad ptica Peso Seco obtenida.

de etanol.

34

FIGURA 11 .Distribucin de la cuadrcula de la cmara de Thoma.

La concentracin de clulas (X) por mililitro est dada por la ecuacin:

cel / mL =
Nd
4n10
6 (2.1)

Donde:
N: Nmero de clulas contadas
d: Dilucin
n: Nmero de cuadros grandes
2.4.3 VIABILIDAD CELULAR.
El conteo de clulas viables de levadura es estimado por conteo al microscopio
despus de la coloracin de azul de metileno (Lange et al., 1993). La muestra se
mezcla volumen a volumen con el colorante, y despus de 10 minutos de
contacto, se realiza la observacin al microscopio, en donde las clulas viables no
de etanol.

35

presentan coloracin y las clulas muertas presentan una coloracin azul. Esto
puede ser debido a dos motivos:
a) La membrana de las levaduras muertas se debilita permitiendo que el
azul de metileno penetre a la clula, mientras que las clulas vivas
conservan la permeabilidad de la membrana;
b) El azul de metileno es un colorante de xido-reduccin, y es reducido por
una hidrogenasa y se vuelve incoloro (forma reducida) si la clula esta
viva.

Preparacin del azul de metileno: el reactivo se prepara disolviendo 1g de azul de
metileno por litro de tricitrato de sodio trihidratado al 2%. Esta solucin debe ser
conservada a 4C y en ausencia de luz.
Este mtodo permite fijar con precisin la tasa de inoculacin y el estado
fisiolgico de las levaduras durante la fermentacin. El porcentaje de viabilidad
(%V) est dado por la siguiente frmula:

%V =
Nv
Nt
100
(2.2)
Donde
Nv Nmero de clulas vivas
Nt Nmero de clulas vivas y muertas
2.4.4 ANLISIS DE GLUCOSA, GLICEROL, CIDO ACTICO Y ETANOL.
Las muestras son centrifugadas a 10,000 rpm por 10 minutos a 4C y congeladas,
para posteriormente ser analizadas mediante cromatografaa de lquidos de alta
resolucin.
de etanol.

36

Antes de de pasar las muestras al HPLC se realiz un pretratamiento de hidrolisis
a las muestras de miel congeladas. Se tomaron 0.8 mL de muestra y se mezcl
con 0.1 mL de Ba(OH)
2
0.3 N y 0.1 mL de ZnSO
4
5 %p/v, se dejaron reposar 5
minutos en el refrigerador, depus que transcurrido el tiempo, la muestras fueron
centrifugadas a 10,000 rpm por 10 minutos. Finalmente, se tomaron 0.5 mL de
sobrenadante y 0.5 mL de cido sulfrico 0.2 N y se colocaron en un bao mara
por 15 minutos a una temperatura de 65 C.
La concentracin de glucosa, etanol, glicerol y cido actico fue determinada
mediante HPLC, utilizando una columna Shodex SH1011P, especfica para la
separacin de azcares, cidos orgnicos y alcoholes. Es una columna de
exclusin molecular e intercambio catinico combinada.
La fase mvil empleada fue H
2
SO
4
10 mM. El detector utilizado fue de ndice de
Refraccin. Las condiciones fueron: 0.6mL/min, 60C. A su vez, el volumen
inyectado fue de 10l utilizando un Alliance (Waters). El software que se utiliz fue
el Empower V2.0 calculando el rea del pico y la concentracin de la muestra
mediante una correlacin con estndares previamente realizados. En la Tabla 3 se
muestran las correlaciones obtenidas.

TABLA 3. Correlaciones rea-concentracin obtenidas en HPLC para los diferentes compuestos
evaluados.
COMPONENTE R
2
ECUACION.
GLUCOSA 0.999528 Y=7.83e+004 X-5.56+004
FRUCTOSA 0.999506 Y=1.46e+005 X-6.87e+004
GLICEROL 0.999486 Y=8.90e+004 X-1.80e+004
ACTICO 0.999498 Y=4.76e+004 X-9.51e+003
ETANOL 0.999487 Y=4.47e+004 X-4.95e+004

de etanol.

37

2.5 ANLISIS DE RESULTADOS.
2.5.1 CLCULO DE RENDIMIENTOS.
La ecuacin de rendimiento Yx/s (g de biomasa / g de sustrato):

(2.3)

La ecuacin de rendimiento Yp/s (g de producto/g de sustrato):

(2.4)

2.5.2 CLCULO DE PRODUCTIVIDADES.
La ecuacin de productividad P (g de producto/Litrohora):
(2.5)

Y
X
S
=
X
f
X
0
S
0
S
f

Y
P
S
=
P
f
P
0
S
0
S
f

P =
P
f
t
f
de etanol.

38

2.5.3 CLCULO DE VELOCIDADES GLOBALES.
El clculo de las velocidades globales se realiza de acuerdo a las siguientes
frmulas.

Produccin de biomasa (r
x
):
(2.6)
Consumo de sustrato (r
s
):
(2.7)
Produccin de producto (r
p
):
(2.8)

2.5.4 CLCULO DE VELOCIDADES ESPECFICAS.

El clculo de las velocidades especficas se realiz de acuerdo a las
siguientes formulas:

Crecimiento ():
(2.9)

r
x
(gl
1
h
1
) =
dX
dt

r
s
(gl
1
h
1
) =
dS
dt

r
p
(gl
1
h
1
) =
dP
dt

(h
1
) =
1
X
dX
dt
de etanol.

39

Consumo (v
s
):

Vs(gg
1
h
1
) =
1
X
dS
dt
(2.10)

Produccin (v
p
):
(2.11)

v
p
(gg
1
h
1
) =
1
X
dP
dt
de etanol.

40

2.6 RESULTADOS
2.6.1 EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO.
Al evaluar el efecto de la fuente de carbono se empleo glucosa, sacarosa y miel
intermedia B. Los resultados obtenidos (Tabla 4) demostraron que empleando miel
intermedia B se obtuvo la mayor productividad de etanol (2.5 g/Lh) en
comparacin con el empleo de glucosa y sacarosa (1.02 y 0.95 g/Lh,
respectivamente). Sin embargo, el rendimiento de etanol empleando glucosa y
sacarosa (0.37 y 0.36 g/g) fue mayor que al empleo de miel intermedia B (0.31
g/g), lo cual es debido a que las cinticas fueron realizadas sin esterilizar el medio
de cultivo. Adems, la viabilidad al final de la fermentacin fue del 100%
empleando miel intermedia B y menor para el uso de glucosa y sacarosa (82 y
79%, respectivamente) como fuente de carbono. Por lo anterior, se seleccion
como la mejor fuente de carbono a la miel intermedia B debido a que se obtuvo
una mayor productividad y viabilidad al final de la fermentacin.

TABLA 4. Viabilidad, rendimiento (Yp/s) y productividad (Pe) de etanol en S. cerevisiae ITV01 DR
en diferentes fuentes de carbono.
Parmentro/Fuente
de Carbono
Glucosa Sacarosa Miel intermedia B
Yp/s (g/g) 0.37 0.36 0.31
Pe (g/Lh) 1.02 0.95 2.50
Viabilidad (%) 82 79 100

Los resultados indican que la miel intermedia B es una muy buena fuente de
carbono para la produccin de etanol, concordando con lo reportador previamente
por Campos (2008).

de etanol.

41

2.6.2 EFECTO DE LA FUENTE DE NITRGENO.
Con el fin de evaluar la fuente de nitrgeno fueron seleccionadas las ms
comunes empleadas en procesos industriales para la produccin de etanol: sulfato
de amonio, fosfato de potasio y urea. A continuacin se presentan los resultados
obtenidos con cada una de las fuentes de nitrgeno evaluadas.

2.6.2.1 EFECTO DEL SULFATO DE AMONIO.
El sulfato de amonio es una sal que tiene la caracterstica de proporcionar a la
clula, tanto el nitrgeno amoniacal necesario, como el azufre, en forma de
sulfatos. En S. cerevisiae ITV01 DR al aumentar la concentracin de sulfato de
amonio en un medio de cultivo realizado con 180 g/L de azcares totales,
empleando miel intermedia B, como fuente de carbono, no se present un efecto
en la estimulacin del crecimiento, de la produccin de etanol y glicerol (producto
secundario de la fermentacin alcohlica), as como en el consumo de los
azcares presentes (sacarosa, glucosa y fructosa). De manera particular en
cuanto al crecimiento no se observaron diferencias en cuanto al tiempo de la fase
de latencia (adaptacin de la clula al medio de cultivo), como en el tiempo de
inicio de la fase estacionaria (ver Figura 12). La cantidad de biomasa producida no
fue significativamente diferente de acuerdo al anlisis de varianza realizado (p =
0.95).
Previamente, ha sido reportado el uso de sulfato de amonio por Ancona (2006) y
por Prez-Bibbins (2007) en levaduras de gnero Saccharomyces y Candida,
respectivamente; donde se encontr que concentraciones mayores a 4 g/L de
sulfato de amonio las levaduras presentan un efecto de inhibicin debido al exceso
de este componente en el medio de cultivo; no obstante, este fenmeno no se
observ en S. cerevisiae ITV01 DR lo cual puede ser debido a que el medio de
cultivo empleado es diferente del empleado en los trabajos previos (melazas de
caa de azcar e hidrolizado de bagazo de caa).
de etanol.

42

Figura 12. Efecto del sulfato de amonio sobre la cintica de S. cerevisiae ITV01 DR en un medio
basado en miel intermedia B. Sulfato de amonio: 0 (), 1 (), 2 (), 3 (), 4 () y 5 () g/L.

De la cintica de produccin de etanol se puede corroborar el estado deficiente
respiratorio de la cepa ITV01 DR debido a la falta de consumo de etanol,
causando la ausencia del crecimiento diaxico caracterstico de las levaduras
competentes en respiracin.
En la Figura 13 se demuestra que no existe efecto en la suplementacin del medio
de cultivo basado en miel intermedia B con sulfato de amonio sobre los
rendimientos y productividades de biomasa, etanol y glicerol.

de etanol.

43

Figura 13. Rendimientos y productividades de S. cerevisiae ITV01 DR en un medio de cultivo
basado en miel intermedia B a diferentes niveles de sulfato de amonio. Sulfato de amonio: 0 (),
1 (), 2 (), 3 (), 4 () y 5 () g/L.

2.6.2.2 EFECTO DE LA UREA.
Con respecto al efecto de la urea se evaluaron diferentes concentraciones de 1 a
5 g/L empleando el medio con miel intermedia B nicamente con agua destilada
como testigo. Los resultados obtenidos, mostrados en la Tabla 5, demuestran que
la urea no afect el rendimiento de etanol en los niveles evaluados. Adems, no
hubo efecto en cuanto a la produccin de glicerol (producto secundario). La
suplementacin del medio de cultivo con urea origin una disminucin del efecto
de la urea sobre en el rendimiento especfico de etanol-biomasa. Sin embargo, las
variaciones que se obtuvieron no permiten concluir sobre la presencia de un efecto
negativo o positivo sobre el crecimiento y produccin de etanol por S. cerevisiae
ITV01 DR B14.

2.6.2.3 EFECTO DEL FOSFATO DE AMONIO
Con el fin de evaluar el efecto del fosfato de amonio, de manera similar se
presentan los datos obtenidos en la Tabla 6, donde es posible observar que se
present efecto sobre el rendimientos de etanol al verse incrementado para los
niveles de fosfato de amonio ms bajos evaluados (1 y 2 g/L); glicerol, biomasa y
la productividad de etanol. Adems, se present una estimulacin del metabolismo
de etanol.

44

fermentativo de acuerdo a los valores de Ye/x puesto que a las concentraciones
de 1 y 2 g/L de fosfato de amonio, se present un incremento en el rendimiento
especfico de etanol, lo cual est relacionado con el efecto del in fosfato sobre la
regulacin del efecto Pasteur en levaduras (Efecto Harden-Young, regulacin de la
fosfructocinasa), lo cual ha sido previamente reportado en la literatura (Walker,
1998). Esta estimulacin se refleja a su vez con el aumento de la productividad de
etanol.
TABLA 5. Rendimientos de etanol (Ye/s), glicerol (Yg/s), biomasa(Yx/s), especfico de etanol
(Ye/x) y productividad de etanol (Pe) de S. cerevisiae ITV01 DR B14 empleando como medio
testigo miel intermedia B sin suplementar con urea.
Parmetro
Testigo
Urea (g/L)
1 2 3 4 5
Ye/s (g/g) 0.37 0.38 0.36 0.36 0.37 0.36
Yg/s (g/g) 0.06 0.06 0.06 0.06 0.05 0.07
Yx/s (g/g) 0.06 0.08 0.08 0.07 0.06 0.08
Ye/x (g/g) 6.49 5.72 4.28 5.10 5.82 5.26
Pe (g/Lh) 1.95 1.90 1.78 1.93 1.87 2.03

TABLA 6. Rendimientos de etanol (Ye/s), glicerol (Yg/s), biomasa (Yx/s), especfico de etanol
(Ye/x) y productividad de etanol (Pe) de S. cerevisiae ITV01 DR B14 empleando como medio
testigo miel intermedia B sin suplementar con fosfato de amonio.
Parmetro Testigo
Fosfato de amonio (g/L)
1 2 3 4 5
Ye/s (g/g) 0.37 0.41 0.41 0.37 0.39 0.40
Yg/s (g/g) 0.06 0.07 0.07 0.07 0.07 0.07
Yx/s (g/g) 0.06 0.04 0.04 0.05 0.11 0.14
Ye/x (g/g) 6.49 10.25 10.58 8.30 3.54 2.80
Pe (g/Lh) 1.95 2.19 2.21 2.04 2.10 2.14

de etanol.

45

Sin embargo, los cambios obtenidos por la suplementacin del medio de cultivo
con bajas concentraciones de fosfato de amonio no representan cambios
importantes en la cintica de crecimiento que permitan optar por su uso, ms all
del incremento en el rendimiento y productividad de etanol. Sin embargo, esta
aseveracin est en funcin de la probabilidad de que la fermentacin sea
contaminada por bacterias y otras levaduras en funcin de las condiciones de
cultivo empleadas.
Por todo lo anterior, es posible sugerir que el medio de cultivo basado en miel
intermedia B es una excelente fuente de carbono, puesto que no requiere de su
suplementacin, tanto por fuentes de nitrgeno y otros iones de importancia para
las levaduras, como lo es el in fosfato.

de etanol.

46

2.7 CONCLUSIONES.
La mejor fuente de carbono fue la miel intermedia B, ya que fue la que present
la mejor productividad de etanol y viabilidad, en comparacin a la glucosa y
sacarosa. La miel intermedia B es una opcin viable como fuente de carbono ya
que en la actualidad solo se usa para fabricacin de azcar y no para la obtencin
de etanol.
Utilizando sulfato de amonio con diferentes concentraciones (1 al 5 g/L) como
fuente de nitrgeno en un medio con miel intermedia B no se present un efecto
sobre la produccin de etanol y el crecimiento en S. cerevisiae ITV01 DR.
Al utilizar la urea con diferentes concentraciones (1 al 5 g/L) se demostr que no
tuvo un efecto en el rendimiento de etanol en los niveles evaluados, tampoco
afecto en la produccin de glicerol que es un producto secundario en la
fermentacin. La urea no afecto el crecimiento de la levadura.
Con fosfato de amonio, al igual que con las anteriores fuentes de nitrgeno se
evaluaron cinco concentraciones (1 al 5 g/L) con la concentracin ms bajas (1 y 2
g/L) se present una estimulacin del metabolismo fermentativo, esto hizo que se
obtuviera un incremento en la produccin de etanol, lo cual est relacionado con la
presencia del efecto Pasteur en S. cerevisiae ITV01 DR.

de etanol.

47

2.8 RECOMENDACIONES.
Evaluar otras fuentes de carbono para la produccin de etanol, tales como: jugo
de caa, sorgo, hidrolizados de almidones (papas, maz).
Probar en fermentador empleando miel intermedia B y con 1 y 2 g/L de
concentracin de fosfato de amonio como fuente de nitrgeno en cultivo continuo
para obtener una mayor productividad de etanol.
Evaluar las fuentes de nitrgeno (urea, sulfato de amonio, fosfato de amonio) con
otras fuentes de carbono (jugos de caa, sorgo, hidrolizado de bagazo de caa)
para estudiar los efectos que pueden tener sobre la produccin de etanol.
Utilizar mango de la regin de la cuenca del Papaloapan como fuente de carbono
en una fermentacin, utilizando la levadura S.cerevisiae ITV 01 DR y evaluar los
rendimientos de etanol.

de etanol.

48

2.9 REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.

Aguilar, MG., (1998). Caractrisation cintique et metabolique d une souche
Brettanomyces. Tesis Doctoral. I.P.N. Toulouse, Francia.
Alfenore, S., C. Molina-Jouve, S.E. Guillouet, J-L. Uribelarrea, G. Goma y L.
Benbadis (2002) Improving ethanol production and viability of Saccharomyces
cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 60: 67-72.
Alfenore, S., X. Cameleyre, L. Benbadis, C. Bideaux, J-L. Uribelarrea, G. Goma, C.
Molina-Jouve y S.E. Guillouet (2004) Aeration strategy: a need for very high
ethanol performance in Saccharomyces cerevisiae fed-batch process. Appl.
Microbiol. Biotechnol. 63: 537-542.
Arneborg, N. y Z. Chi (1999) Relationship between lipid composition, frequency of
ethanol-induced respiratory deficient mutants, and ethanol tolerance in
Saccharomyces cerevisiae. J. Appl. Microbiol. 86:1047-1052.

Brown, S.W., Sugden, D.A. y Olivier, S.G. (1984) Ethanol production and tolerance
in grande and petite yeasts. Journal of Chemical Technology and Biotechnology
34B: 116-120.

Bungay , H. R. (2004) Confessions of a bioenergy advocate. Trends Biotechnol.
22: 67-71.
Busturia, A. y Lagunas, R. (1986). Catabolite inactivation of the glucose transport
system in Saccharomyces cerevisiae. J. G. Microbiol.132: 379-385.

Carlson, M. (1987). Regulation of sugar utilization in Saccharomyces species.J.
Bact.169: 4873-4877.
de etanol.

49

Campos, J. (2008). Establecimiento de un proceso de produccin de etanol a partir
de jugo de caa y miel intermedia B con Saccharomyces cerevisiae ITV01. Tesis
de Maestra, UNIDA-ITV, Mxico.

Cot, M. (2007). Etudes physiologiques de ladaptation et de la rsistance de la
levure Saccharomyces cerevisiae au cours de la production intensive dethanol.
Tesis Doctoral INSA, Toulouse, Francia.

Daugherty, PJ., S.C. Hixon y J.E.T. Adil Ocak (1980) Resistance to adriamycin
cytotoxiticity among respiratory deficient mutants in yeasts.
De Deken, R.H. (1966) The Crabtree Effect: a regulatory system in yeast. J. G.
Microbiol.44: 149-418.
Dombek, K.M. e Ingram, L.O. (1988). Intracellular acumulation of AMP as a cause
for the decline in the rate ethanol production by Saccharomyces cerevisiae during
batch fermentation.Appl. Environ. Microbiol.54: 98-104.
Fiechter, A., Fuhrmann, G.F., y kappeli, O. (1981).Regulation of glucose
metabolism in growing yeast cell.Adv. Microbiol Physiol.22, 123-183.

Franois, J., Van Schaftingen, E. y Hers, H.G. (1984) The mecanism by which
glucose increases fructose-2-6-bisphosphate concentration in Saccharomyces
cerevisiae. J. Biochem.145: 187-193.
Gancedo, C. (1992) Carbon catabolic repression in yeast. J. Biochem.193: 111-
119.

Gilis, F. (1999). Etude de Contaminations de Fermentations alcooliques
Industrialles par les levures Brettanomyces. Tesis Doctoral, INPT, Francia.
de etanol.

50

Gong, C-S., L.F. Chen, M.C. Flickinger, L.C. Chiang y G.T. Tsao (1981) Production
of ethanol from D-xylose by using D-xylose isomerase and yeasts. Appl.
Enviroment. Microbiol. 41-2: 430-436.
Guiraud, J.P., J. Bourgi, M. Stervinou, M. Claisse y P. Galzy (1987) Isolation of a
respiratory deficient Kluyveromyces fragilis mutant for the production of ethanol
from Jerusalem artichoke. Biotechnol & Bioeng.29: 850-858.
Henschke P.A y Jiranek V.(1993). Yeasts metabolism of nitrogen compounds wine
microbiol. And Biotechnol.Ed.G.H. Fleet. Harwood Academic Publishers Chur
Switzerland. 77-164..
Heslot, H., C. Louis y A. Goffeau (1970) Segregational respiratory-deficient
mutants of a petite negative yeast Schizosaccharomyces pombe 972h
-
. J.
Bacteriol.104:482-491

Hipkin C.R (1989) Nitrate assimilation in yeasts. Molecular and genetic aspects of
nitrate assimilation. Oxford science publications.Ed. J.L Wray and J.R Kinghorn 51-
68.
Holzer, H. (1961). Regulation of carbohydrate metabolism by competition.Cold
Spring Harbor Simposia on Quantitative Biology, 26: 277-288.

Holzer, H. (1976). Catabolite inactivation in yeast.Trends in Biochemical Sciences,
1: 178-181.

Horecker, B.L. (1978). Yeast enzymology: retrospectives and perspetives. In
Biochemestry and Genetics of Yeasts (eds. M. Bacila, B.L. Horecker y A.O.M.
Stoppani), pp. 1-15. Academic Press Inc., New York.

de etanol.

51

Horta Nogueira Luiz Augusto; Ethanol and ETBE production and end-use in
Mexico; Dast 5; Potenciales y Viabilidad del Uso de Bioetanol y Biodiesel para
Transporte en Mxico; Sener, BID-GTZ.

Hutter, A., y Oliver, SG. (1998) Ethanol production using nuclear petite yeast
mutants.Appl. Microbiol. Biotechnol. 49: 511-516.
Ingram L.O., Aldrich H.C., Borges A.C.C., Causey T.B., Martinez A., Morales F.,
Saleh A., Underwood S.A., Yomano L.P., York S.W., Zaldivar J., Zhou S. (1999)
Enteric Bacterial Catalysts for Fuel Ethanol Production. Biothechnol. Prog. 15: 855-
866.
Kruckeberg, A.L. (1996). The hexose transporter family of Saccharomyces
cerevisiae.Archiv. Microbiol.166. 283-292.
Kuyper, M. (2006) Enginnering of Saccharomyces cerevisie for production of fuel
ethanol from xilose.Tesis Doctoral, TUDelft, Holanda.
Lagunas, R. (1979). Energetic irrevelance of aerobiosis for S. cerevisiae growing
on sugars.Mol. Cel. Biochem.27, 139-146.
Lagunas, R. (1993) Sugar transport in Saccharomyces cerevisiae. FEMS
Microbiology Reviews104: 229-242.
Lagunas, R. y Gancedo, C. (1983) Role of phosphate in the regulation of Pasteur
effect in Saccharomyces cerevisiae.J. Biochem.137: 479-483.
Lagunas, R., Dominguez, C., Busturia, A. y Saez, M.J. (1982). Mechanisms of
appearance of the Pasteur effect in Saccharomyces cerevisiae: inactivation of
sugar transport systems. J. Bact.152, 19-25.
Lange, H., Bavouzet, J.M., Taillandier, P. y Delorme, C. (1993). Systematic error
and comparison of four methods for assessing the viability of Saccharomyces
cerevisiae suspensions.Biotechnol. Tech.7: 223-228.
de etanol.

52

Lloyd, D., Krinstensen, B., y Degn, H. (1983). Glycolysis and respiration in yeasts:
the effect of ammonium ions studied by mass spectrometry. J. G. Microbiol.129,
2125-2127.
Martnez A., Bolvar F., Gosset G. (2002). Biotecnologa energtica sustentable:
etanol carburante para el transporte. Revista Universidad de Mxico.
Mielenz J.R. (2001) Etanol producction from biomass: technology and
commercialization status. Current Opinion Microbiol. 4: 324-329.
Moulin, G., Boze, H. y Galzy, P. (1984). Inhibition of alcoholic fermentation.
Biotechnol. Gen. Eng. Rev.2: 365-382.
Muller, S., Boles, E., May, M. Y Zimmerman, F.K. (1995) Diferent internal
metabolites trigger the induction of glycolytic gene expression in Saccharomyces
cerevisiae. J. Bact.177: 4517-4519.
Nagai, S., N. Yanagishima y H. Nagai (1963) Advances in the study of respiration-
deficient (RD) mutation in yeast and other microorganisms. Instituto Politcnico,
Osaka, Japn.
OConnor R.M., C.R. McArthur y G.D. Clark-Walker (1976) Respiratory deficient
mutants of Torulopsis glabrata, a Yeast with circular mitochondrial
deoxyribonucleic acid of 6 m.J. Bacteriol. 126-2:959-968.
ner, E.T. (2006) Optimization of ethanol production from starch by an amylolytic
nuclear petite Saccharomyces cerevisiae strain.Yeast 23: 849-856
ner, E.T., S.G. Oliver y b. Kirdar (2005) Production of ethanol from starch by
respiration-deficient recombinant Saccharomyces cerevisiae.Appl. Environment.
Microbiol.71: 6443-6445
Ortiz-Muiz, B. (2009) Estudio de la fisiologa de S. cerevisiae ITV01 y su
dficiente respiratoria para la produccin de etanol. Documento Predoctoral.
UNIDA-ITV.
de etanol.

53

Panchal, C. (1990) Yeast strain selection. Biotechnology and Bioprocessing
Series. Marcel Dekker Inc.
Poinsot, C., G. Moulin, M. Claisse y P. Galzy (1987) Isolation and characterization
of a mutant of Schwanniomyces castellii with altered respiration. Antonie van
Leeuwenhoek 53:65-75.
Postma, E., Verduyn, C., Scheffers, W.A. y Van Dijken, J.P. (1989).Enzymatic
analysis of the Crabtree effect in glucose-limited chemostat cultures of
Saccharomyces cerevisiae.Appl. Environ. Microbiol. 53: 468-477.
Poy, M (2005). Produccin de etanol anhidro en ingenios azucareros. Cmara
Nacional de la Industria Azucarera.
Pronk, J.T., Steensma, H.Y. y Van Dijken, J.P. (1996). Pyruvate metabolism in
Saccharomyces cerevisiae.Yeast 12 1607-1633.
Rowe, S.M., Simpson, W.J., y Hammond, J.R.M. (1994) Intracellular pH of yeast
during brewery fermentation. Lett. Appl. Micriobiol.18: 135-137.
Santos, E., Rodrguez, L., Elorva, M.V., y Sentandreu, R. (1982). Uptake of
sucrose by Saccharomyces cerevisiae. Archiv. Biochem. Biophysics, 216. 652-
660.

Strehaiano, P. (1984). Phnomenes dinhibition et fermentation alcoolique, These
Dr. s Sciences. I.N.P. Toulouse, Francia.
Thomas V., Kwong, A. (2001) Ethanol as led replacement: phasing out leded
gasoline in Africa. Energ.policy 29:1133-1143.

Van Dijken J.P.,Scheffers W.A. Redox balances in the metabolism of sugars by
yeasts. F.E.M.S.Rev.,32: 199-224.
de etanol.

54

Vergara W., Castello-Branco J.R. (1981) Energy Use for Etanol Production.
Proceedings of the internacional conference on Energy Use Management
(I.C.E.U.M) Editor R. Fazzolaire. Pergamon Press. Oxford.
Wainwright M. y Falith A.M.K (1996). Involvement of yeasts in urea hydrolysis and
nitrification in soil amended with a natural source of sucrose. Mycological.
Research, 100:307-310.
Walker, M.G. (1998). Yeast Phisiology and Biotechnology. John Wiley & Sons.
England.
Zimmerman, F.K. (1992). Glycolytic enzymes as regulatory factors. J.
Biotechnol.27: 17-26.

Saccharomyces Cerevisiae

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Saccharomyces Cerevisiae

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Evaluacin de la fuente de carbono y nitrgeno en S.

cerevisiae para la produccin

You might also like