BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA VICERRECTORA DE DOCENCIA DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

LICENCIATURA EN QUMICO FARMACOBILOGO

AREA MICROBIOLOGA

ASIGNATURA LABORATORIO DE INMUNOLOGA

CDIGO LQF 306L

M.C. ALMA LPEZ GARCA

VERANO 2010

M.C. Alma Lpez Garca

BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA VICERRECTORA DE DOCENCIA DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS OBJETIVOS: a. Educacional:

Los

alumnos

egresados

de

la

carrera

de

Qumico

Farmacobilogo sern poseedores de conocimientos, habilidades y actitudes valorativas que le permitirn comprometerse con el desarrollo responsable de la nacin y su cambiante realidad. Para lo cual contar con las herramientas como son aptitudes y un pensamiento reflexivo, crtico y cientfico que le permitirn ser un profesionista de alto desempeo laboral con un espritu emprendedor, innovador y propositivo. Por lo que el egresado pondr en uso las herramienta y el conocimiento obtenido a lo largo de su estancia en la universidad. b. General: Es una materia prctica que tiene como finalidad proporcionar un panorama general del laboratorio de inmunologa. Revisar de manera general la importancia de las reacciones antgeno-anticuerpo en el diagnstico de determinadas enfermedades infecciosas, y su aplicacin como mtodos inmunolgicos cualitativos y cuantitativos con el fin de obtener informacin diagnstica-clnica y pronostica de los pacientes. c. Especficos: Definir la terminologa empleada comnmente en laboratorio de Inmunologa. Aplicar las medidas de seguridad en el laboratorio clnico. Adquirir destreza manual para desarrollar las metodologas bsicas aplicadas en Inmunologa Aplicar medidas de seguridad en el trabajo con muestras biolgicas como sangre y suero humanos. Comprender la importancia del laboratorio de Inmunologa para su formacin profesional. Motivar en el alumno su inters por la bsqueda de informacin actualizada sobre el rea de conocimiento y desarrollar en l su capacidad para la interpretacin, discusin y sntesis Desarrollar en el alumno la capacidad de trabajo en equipo y liderazgo. Desarrollar la capacidad de auto-aprendizaje, a travs de lectura, comprensin y discusin de artculos

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BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA VICERRECTORA DE DOCENCIA DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS Desarrollar en el alumno valores ticos profesionales acerca del conocimiento y aplicacin de los mismos en la manipulacin de las formas farmacuticas en los pacientes. Desarrollar en el alumno una actitud crtica, constructiva, propositiva y responsable. Desarrollar capacidad de observacin y una actitud abierta a la bsqueda del conocimiento, consciente de la continua evolucin de la ciencia. Contribuir a los cambios de hbitos de higiene en el alumno.

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BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA VICERRECTORA DE DOCENCIA DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS PRACTICA 1 SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

INTRODUCCIN: Los laboratorios de Inmunologa son ambientes especiales, las muestras clnicas de pacientes recibidas para su estudio significan un riesgo para el personal debido a los agentes infecciosos que pueden contener. La educacin del personal que manipula a diario las muestras, potencialmente infecciosas y la educacin por medio de avisos sobre riesgos biolgicos, as como instrucciones escritas y verbales de aquellos que solo tienen una exposicin limitada al ambiente del laboratorio son las medidas disponibles ms importantes para prevenir las infecciones adquiridas en el laboratorio, los riesgos de un laboratorio de Inmunologa pueden extenderse a laboratorios adyacentes. Adems del riesgo por infeccin los laboratorios de Inmunologa, tambin estn expuestos a todos los riesgos asociados a cualquier ambiente de laboratorio como incendio, riesgos elctricos, qumicos, materiales radiactivos, mal funcionamiento de los equipos, peligros dependientes de desastres naturales, situaciones ambientales como pisos deslizantes, sistemas de circulacin de aire deficiente. Se debe poseer un manual de seguridad que contenga informacin sobre la conducta a seguir en caso de una contingencia OBJETIVO: El alumno de habituara a las medidas de seguridad necesarias en el laboratorio. DESARROLLO: El conocimiento de las propiedades fisicoqumicas y de la infecto-contagiosidad de los microorganismos, permite definir las normas que en materia de seguridad, son necesarias para no correr ningn riesgo de adquirir an en forma accidental, una infeccin por este tipo de partculas. Con base en lo anterior, se enlistan a continuacin los reglamentos y normas que habrn de seguirse en el Laboratorio del rea de Microbiologa, con la finalidad de asegurar la integridad fsica de los alumnos, as como para mantener una organizacin adecuada para el desarrollo de las prcticas correspondientes. La hora de entrada tiene 10 minutos de tolerancia, pasado este tiempo, no se permitir el acceso al laboratorio. Entrar al laboratorio con la bata puesta y abotonada. Colocar todo los artculos personales en la zona lateral o en los cajones de las mesa de trabajo. Al iniciar y finalizar las prcticas, lavarse las manos con agua y jabn desinfectante. Queda estrictamente prohibido comer, beber o fumar en el laboratorio, as como introducir algn objeto en la boca. La puerta del laboratorio debe mantenerse cerrada. Limpiar y desinfectar el rea de trabajo antes y despus de utilizarla. Permanecer en la zona de trabajo asignada para cada equipo. Comunicarse con sus compaeros solo en la medida indispensable. Antes de iniciar la prctica, leer y recordar la metodologa a seguir de acuerdo con las indicaciones del profesor. Si se tienen dudas, es el momento para aclararlas.

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BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA VICERRECTORA DE DOCENCIA DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra (rotura de material, derramamiento de suspensiones virales, etc.). Todo el material que se va a incubar o desechar, deber colocarse en el sitio indicado por el profesor. Sea cuidadoso con el material y equipo que se le proporciona; el material de desecho no contaminado deber depositarse en los contenedores correspondientes. En forma previa a su lavado, siempre se deber desinfectar el material que se le proporcione en el laboratorio. Rotule todo el material que se va a incubar, con los siguientes datos: grupo, seccin, equipo, nombre del alumno, as como fecha de entrada y salida. En general, las disposiciones anteriores tienden al cumplimiento de la Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-1995, en la cual se establecen los requisitos para la separacin, envasado, almacenamiento, recoleccin, transporte, tratamiento y disposicin final de los Residuos Peligrosos biolgico-infecciosos que se generan en establecimientos e instituciones relacionadas con el sector salud. En la NOM referida, se establecen adems definiciones de inters para los laboratorios y reas de microbiologa, tales como: Desinfeccin: Destruccin de microorganismos patgenos en todos los ambientes, materias o partes que pueden ser nocivos, por los distintos medios mecnicos, fsicos o qumicos contrarios a su vida o desarrollo, con el fin de reducir el riesgo de transmisin de enfermedades. Residuo peligroso biolgico-infeccioso: El que contiene bacterias, virus u otros microorganismos con capacidad de causar infeccin o que contiene o puede contener toxinas producidas por microorganismos que causan efectos nocivos a seres vivos y al ambiente, que se generan en hospitales y establecimientos de atencin mdica. En adicin, se consideran residuos peligrosos biolgico-infecciosos los siguientes: La sangre Los cultivos y cepas almacenadas de agentes infecciosos Los cultivos generados en los procedimientos de diagnstico e investigacin, as como los generados en la produccin de biolgicos Los instrumentos y aparatos para transferir, inocular y mezclar cultivos Las muestras biolgicas para anlisis qumico, microbiolgico, citolgico e histolgico Los residuos anatmicos derivados de la atencin a pacientes de los laboratorios Los equipos y dispositivos desechables utilizados para la exploracin y toma de muestras Los objetos punzo cortantes usados o sin usar Los que han estado en contacto con pacientes o sus muestras clnicas durante el diagnstico y tratamiento, incluyendo navajas, lancetas, jeringas, pipetas Pasteur, agujas hipodrmicas, de acupuntura y para tatuaje, bistures, cajas de Petri, cristalera entera o rota, porta y cubreobjetos, tubos de ensayo y similares.

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BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA VICERRECTORA DE DOCENCIA DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS Con base en lo anterior, los residuos peligrosos infecto-contagiosos, debern ser tratados por mtodos fsicos o qumicos, los cuales: Debern garantizar la eliminacin de microorganismos patgenos Debern volver irreconocibles a los residuos peligrosos biolgico-infecciosos Debern ser cremados, si se trata de residuos patolgicos. El cumplimiento de las consideraciones sealadas con anterioridad, garantiza la seguridad que deber observarse tanto para alcanzar los objetivos de las prcticas, como para su desarrollo en condiciones aspticas.

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BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA VICERRECTORA DE DOCENCIA DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS PRACTICA 2 DILUCIONES INTRODUCCIN: Se les llama diluciones a las soluciones con concentracin menor obtenidas al agregar volmenes conocidos de diluyente a una solucin de concentracin conocida. Las diluciones se expresan en forma de una proporcin, por ejemplo 1/10 (1:10) donde la primera cifra o numerador (1) corresponde al volumen de lo que se est diluyendo y la segunda cifra o denominador (10) al volumen total en que se encuentra. OBJETIVO: El alumno aprender a calcular diluciones en forma directa o en serie. DESARROLLO: As, una dilucin 1/10 indica que se tiene un volumen de la solucin original contenido o diluido en 10 volmenes totales, de los cuales 9 corresponden al diluyente. Dado que en una dilucin lo que se indica es la relacin entre el volumen de la solucin original y el volumen total en que se encuentra, una dilucin 1/10 puede prepararse de diferentes maneras: Por ejemplo: 1 ml de muestra en 9 ml de diluyente 0.1 ml de muestra en 0.9 ml de diluyente 0.5 ml de muestra en 4.5 ml de diluyente En la prctica el clculo de las diluciones se puede efectuar de dos maneras diferentes que cumplen ciertas expectativas, la dilucin directa y la dilucin en serie. Dilucin directa. Para realizar una dilucin directa se puede hacer uso de la siguiente expresin: 1/d=Vm/Vt donde 1/d= dilucin Vm= volumen de muestra Vt= volumen total (volumen de diluyente + volumen muestra)

de

Ejemplo N1 Lleve 5 ml de muestra a una dilucin 1/10. Sustituyendo los valores conocidos tenemos: 1/d=1/10 Vm=5 ml Vt= ? As: 1/10=5 ml/Vt despejando Vt tenemos que Vt=10 x 5/1=50 ml volumen de diluyente = volumen total-volumen de muestra volumen de muestra = 50-5 = 45 ml Ejemplo N2 Prepare exactamente 200 ml de una dilucin 1/50. Sustituyendo los valores conocidos tenemos: 1/d=1/50

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BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA VICERRECTORA DE DOCENCIA DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS Vm=? Vt= 200 ml As: 1/50=Vm/200 Despejando Vm tenemos que Vm=200 x 1/50=4 ml Volumen de diluyente = volumen total-volumen de muestra Volumen de diluyente = 200-4=196 ml Sin embargo, las diluciones directas tienen el inconveniente de que cuando es necesario hacer una dilucin alta por ejemplo 1/ 10 000, se desperdicia mucho reactivo o se incurre en un error de medicin. As, una dilucin 1/ 10 000 se preparara con 1 ml de muestra y 9 999 ml de diluyente o bien 9.999 ml de diluyente y 0.001 ml de muestra. Dilucin seriada Este tipo de dilucin soluciona los inconvenientes que presenta el calculo directo de las diluciones altas. Adems, en microbiologa permite el calculo de la poblacin microbiana en la muestra de estudio, de la cual se toma una alcuota que se diluye en varios tubos y se siembra por vertido en placa. La diferencia entre la dilucin de dos tubos consecutivo se conoce como factor de dilucin, siendo 2, 4 y 10 los ms usados. En el ejemplo de la dilucin 1/ 10 000, la muestra se puede diluir 1/ 100 (Vm= 0.1 ml + Vt= 10 ml) en un primer tubo y colocar 0.1 ml de esta dilucin en un segundo tubo con 9.9 de diluyente. El segundo tubo tendr una dilucin 1/ 100, sin embargo como la muestra ya se encuentra diluida previamente 1/ 100, multiplicando sus denominadores tenemos: 1/ 100 x 1/ 100= 1/ 10 000 En este caso el factor de dilucin es de 100. Debe insistirse en que solo el primer tubo lleva la alcuota de la muestra sin diluir, los dems tubos toman la alcuota ya diluida del tubo previo. El nmero de tubos y las diluciones intermedias se plantean considerando el volumen de los tubos as como el volumen mnimo que se puede medir fcil y exactamente con las pipetas disponibles.

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BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA VICERRECTORA DE DOCENCIA DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS PRACTICA 3 TOMA DE MUESTRA

INTRODUCCIN: En el laboratorio de inmunologa la muestra a estudiar es principalmente sangre y sus derivados suero o plasma. En el plasma o suero se determina principalmente la presencia de anticuerpos, los cuales desde el descubrimiento de la alta especificidad de las reacciones antgeno-anticuerpo (Ag-Ac), se comprueban con propsitos de diagnstico (inmunodiagnstico). Inicialmente los investigadores se dedicaron a la deteccin de anticuerpos en el suero del paciente como un signo de infeccin y as a la identificacin serolgica del microorganismo. Sin embargo, hoy en da la sensibilidad y especificidad de los inmunoensayos permiten no solo la deteccin de anticuerpos contra una amplia variedad de organismos infecciosos incluyendo bacterias, parsitos, hongos y virus sino a la identificacin del propio microorganismo. An ms, proporcionan un medio para la deteccin y cuantificacin de antgenos no infecciosos y anticuerpos de importancia clnica tales como la determinacin del grupo sanguneo, el VDRL, la determinacin de la protena C-reactiva, una prueba que seala un proceso inflamatorio agudo, la deteccin de antgenos asociados a tumores y la demostracin de la hormona gonadotropina corinica, una prueba diagnstica del embarazo. OBJETIVO: Aprender el procedimiento apropiado para la obtencin de sangre venosa de las venas del dobles del codo. DESARROLLO: Obtencin de Muestra de Sangre. Para efectuar anlisis serolgicos, las muestras de sangre pueden ser de sangre capilar o perifrica y de sangre venosa. Sangre capilar o perifrica. La sangre capilar o perifrica es la que fluye despus de aplicar una puncin superficial cutnea. Se puede obtener de la yema del dedo. Algunas pruebas pueden realizarse con sangre capilar o perifrica y se aconseja cuando no es posible obtener una muestra de sangre venosa o no se desea puncionar la vena. Sangre venosa. Esta muestra se obtiene por puncin de una de las tres venas del pliegue del codo: la baslica, la ceflica o la mediana cubital. Se emplean jeringas desechables con agujas de tipo 21x32, 20x32 o el sistema para la extraccin de sangre intravenosa al vaco Vacuntainer . Previamente se realiza la limpieza del rea elegida con torunda y alcohol. Antes de puncionar se coloca el torniquete aproximadamente a 8 cm de distancia arriba del pliegue del codo. No debe olvidar soltarlo tan pronto empiece a obtenerse la muestra. La cantidad mxima de sangre a extraer ser estrictamente la necesaria para las pruebas. Anticoagulantes. Los anticoagulantes ms usados son el citrato de sodio, oxalato de sodio y EDTA. El citrato de sodio se emplea al 3.8% y el oxalato de sodio al 1.4%. Se usan en relacin de una parte de anticoagulante por cada nueve partes de sangre, habitualmente se usan 0.25ml de la solucin para completar a 2.5ml de volumen total con la muestra de sangre. El EDTA (cido etilen-diamino-tetra-actico) se utiliza al 10% y es uno de los anticoagulantes de eleccin para el trabajo de rutina.

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BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA VICERRECTORA DE DOCENCIA DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS Manejo y conservacin de la muestra. La muestra debe rotularse correctamente y separase segn el caso en plasma o suero, y dependiendo del tipo de anlisis debe analizarse inmediatamente o puede conservarse adecuadamente refrigerada entre 4 y 8C para el anlisis posterior.

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BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA VICERRECTORA DE DOCENCIA DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS PRACTICA 4 OBSERVACION DE LEUCOCITOS (CUENTA DIFERENCIAL) INTRODUCCIN: Los cinco principales tipos de leucocitos son los neutrfilos (5070%), los eosinfilos (1-5%), basfilos (0.5-1.0%), linfocitos (20-30%), y monocitos (2 6%). Por cuenta diferencial se entiende la determinacin del porcentaje relativo de cada tipo de leucocito en una muestra de sangre. Se realiza en extendidos (frotis) preparados cuidadosamente y teidos con colorantes tales como Wright, el cual tie el ncleo de los leucocitos de un color prpura que facilita la diferenciacin. OBJETIVO: Identificar los diferentes tipos de leucocitos en un frote teido MATERIAL Y EQUIPO Portaobjetos Lancetas desechables Algodn Colorante de Wright Solucin reguladora pH 6.4 Microscopio DESARROLLO: 1. A partir de la muestra de sangre preparar 2 extendidos (frotis) siguiendo las indicaciones del instructor. 2. Dejar secar completamente los frotis, colocar en un puente de tincin y cubrirlos (contar el nmero de gotas) con colorante de Wright. Dejar el colorante 1 minuto y aadir el mismo nmero de gotas de solucin reguladora pH 6.4 durante 8 minutos. 3. Lavar suavemente la preparacin por 30 segundos y secar el exceso de agua. 4. Cuando la preparacin est completamente seca, colocar una gota de aceite de inmersin y observar al microscopio. 5. Para facilitar la identificacin consultar las lminas a color que ilustran los diferentes leucocitos.

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BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA VICERRECTORA DE DOCENCIA DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS PRACTICA 5 DETERMINACIN DEL GRUPO SANGUNEO INTRODUCCIN: Alrededor de 1900 Karl Landsteiner descubri que en el humano existen cuatro tipos de sangres con respecto a la presencia o ausencia de dos antgenos especficos denominados A y B. Estos cuatro grupos se conocen actualmente como tipos A, B, AB y O. Este ltimo se caracteriza por la ausencia de los antgenos A y B. En 1940 Landsteiner y Wiener reportaron que el suero de conejo producido contra eritrocitos de mono Rhesus poda aglutinar los eritrocitos del 85% de una poblacin caucsica. Este antgeno se design inicialmente como factor Rh, posteriormente se encontr que existe como seis antgenos a los cuales Fisher y Race designaron con letras C, D, E, c, d, e. Uno de estos antgenos, el D es responsable de la condicin Rh positivo. La tipificacin de eritrocitos en el laboratorio se realiza con antisueros especficos contra los antgenos A, B y D, y puede realizarse por mtodos en tubo o en portaobjetos. OBJETIVO: Demostrar por medio de una reaccin de aglutinacin la presencia de los Ag eritrocitarios A, B y D. MATERIALES Y EQUIPO 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Muestras de sangre con anticoagulante Pipetas graduadas de 1 y 5 ml Tubos de ensayo de 10 X 75 mm Solucin salina isotnica Lancetas desechable Aplicadores de madera o palillos Sueros tipificadores anti-A anti-B anti-D (Rh) 8. Placa oscilatoria

DESARROLLO: Mtodo en tubo 1. Se obtiene aproximadamente 5 ml de sangre venosa y se colocan en un tubo con EDTA (0.1 ml de EDTA al 1% por cada ml de sangre). Se centrfuga por 2 min. a 2000 r.p.m. para separar el plasma del paquete celular. 2. Se toman 0.1 ml del paquete celular y se resuspenden en 1.9 ml de solucin salina para una suspensin aproximada del 5%. 3. Se marcan tres tubos de la siguiente manera: anti-A, anti-B y anti-D, y se agrega una gota del suero tipificador segn corresponda. 4. Se agregan 4 gotas de la suspensin de eritrocitos a cada tubo y se agitan suavemente. 5. Los tubos se centrifugan 1 min a 2000 r.p.m. 6. Se busca la presencia de aglutinacin agitando suavemente los tubos. La aglutinacin se reconoce por la formacin de grumos. 7. Si la prueba en el tubo anti-D es negativa se realiza el siguiente procedimiento. 8. Se incuba a 37C por 30 minutos, se centrfuga y se busca la aglutinacin. 9. Si persiste la negatividad se lavan los eritrocitos 3 veces con 0.5 ml de solucin salina y se elimina perfectamente el sobrenadante.

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BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA VICERRECTORA DE DOCENCIA DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS 10. Se agrega una gota del suero de Coombs y se agita suavemente, se centrfuga y se busca la aglutinacin Interpretacin: Si aglutina en el paso 6 es Rh positivo Si aglutina en el paso 10 es Du Si persiste la negatividad es Rh negativo. Mtodo en portaobjetos 1. Depositar 2 gotas de sangre en tres diferentes divisiones de un portaobjetos. 2. Agregar de izquierda a derecha una gota del antisuero anti-A, una gota de anti-B y una gota de anti-D respectivamente. 3. Mezclar los reactivos con un aplicador de madera diferente para cada gota. 4. Agitar suavemente en la placa oscilatoria. 5. Buscar la presencia de aglutinacin.

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BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA VICERRECTORA DE DOCENCIA DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS PRACTICA 6 DETERMINACIN DEL TITULO DE ANTICUERPOS ABO DEL SUERO. INTRODUCCIN: El sistema de grupo sanguneo ABO posee una caracterstica nica; la presencia de anticuerpos fuertemente reactivos en el suero de los que carecen de los antgenos correspondientes. Estos anticuerpos pertenecen a la clase IgM y son producidos en respuesta a una inmunizacin. Se dice que estos anticuerpos se producen de manera natural en base a que los inmungenos son probablemente de origen bacteriano, dado que algunas bacterias presentan sustancias similares a los antgenos A o B. El ttulo es una medida relativa de anticuerpos o antgenos en una reaccin serolgica. Se determina realizando a partir del suero problema diluciones seriadas. El ttulo del anticuerpos A o B del suero se reporta como el recproco de la mxima dilucin en la cual es posible observar eritrocitos aglutinados. OBJETIVO: Establecer a travs de diluciones seriadas el concepto de ttulo aplicado en las reacciones serolgicas MATERIAL Suspensin de eritrocitos de grupo A o B al 5 % en SSI Suero (plasma) de grupo O Pipetas graduadas de 1 y 5 ml Tubos de ensayo de 10 X 75 mm Solucin salina isotnica Lancetas desechable Aplicadores de madera o palillos Sueros tipificadores anti-A anti-B DESARROLLO: 1. Colocar en una gradilla una serie de 6 tubos rotulados del 1 al 6 y se agregar 0.1 ml de solucin salina cada uno de ellos. 2. Agregar 0.1 ml del suero problema al tubo n 1, mezclar bien y transferir 0.1 ml al tubo n 2 y as sucesivamente hasta el tubo n 6 del cual se desechan 0.1 ml. 3. Agregar 4 gotas de la suspensin de eritrocitos a cada tubo y mezclar. 4. Incubar a 37C por 15 minutos, mezclan suavemente y centrifugar a 1000 r.p.m. durante 1 minuto. 5. Desprender el botn suavemente y buscar la presencia de aglutinacin. INTERPRETACIN 1. El ttulo de anticuerpos en el suero problema se determina como el recproco de la dilucin mxima en la que se observa aglutinacin. 2. Adems de la aglutinacin se puede observar hemlisis, por lo que se debe comprobar la presencia de hemoglobina libre

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BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA VICERRECTORA DE DOCENCIA DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS PRACTICA 7 PRUEBAS CRUZADAS INTRODUCCIN: El objetivo de una transfusin es el proporcionar al paciente (receptor) el tipo preciso de sangre. Por supuesto este objetivo es difcil de lograr, pero es posible aproximarse mucho si se realizan las pruebas correctas de hemaglutinacin. En primer lugar, deben determinarse con exactitud los anfgenos de los grupos sanguneos principales: el grupo ABO y el Rh del paciente, sobre la base de estos grupos se selecciona la unidad de sangre de grupo ABO y Rh compatible y se procede a efectuar las denominadas pruebas cruzadas mayor y menor. La prueba cruzada mayor, denominada prueba de compatibilidad, se realiza mezclando el suero del receptor con los eritrocitos del donador. Si se produce hemaglutinacin, esta sangre no puede darse al receptor porque tiene anticuerpos capaces de reaccionar y destruir la sangre administrada. En la prueba cruzada menor, los eritrocitos del receptor son incubados con suero del donador y se observa si hay aglutinacin. Si se produce hemaglutinacin, la sangre del donador no debe administrase. En ambas pruebas una suspensin de los eritrocitos respectivos se mezclan con el suero y la mezcla se incuba a 37C durante unos 30-60 minutos. Despus del periodo de incubacin los eritrocitos se lavan para eliminar los anticuerpos que no se han fijado a los eritrocitos, y se aade el reactivo de Coombs (anti-globulina). OBJETIVO: Realizar las pruebas de compatibilidad sangunea denominadas Pruebas Cruzadas MATERIAL Y EQUIPO Muestras de sangre con y sin anticoagulante Pipetas graduadas de 1 ml y 5 ml 8 tubos de ensaye de 10 X 75 mm Solucin salina isotnica. Bao serolgico Centrfuga Solucin de albmina bovina al 10% DESARROLLO: 1. Se obtiene una muestra de sangre del donador y receptor y se procede igual a lo descrito en los incisos 1 y 2 de la prctica anterior. 2. Se disponen 4 tubos etiquetados como sigue: PM/S =Prueba Mayor en solucin salina pm/s =Prueba Menor en solucin salina PM/A =Prueba Mayor en albmina pm/a =Prueba Menor en albmina 3. Se agregan a cada tubo los siguientes reactivos en el orden indicado: PM/S. donador pm/s. receptor 2 gotas del suero del receptor + 4 gotas de eritrocitos (al 5%) del 2 gotas del suero del donador + 4 gotas de eritrocitos (al 5%) del

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PM/A.

2 gotas del suero del receptor + 4 gotas de albmina + 1 gota de eritrocitos (al 5%) del donador pm/a. 2 gotas del suero del donador + 4 gotas de albmina + 1 gota de eritrocitos (al 5%) del receptor 4. Se mezclan bien y se incuban a 37C por 30 minutos. 5. Se centrifugan 1 minuto a 2000 r.p.m. y se busca la presencia de aglutinacin. 6. En caso de que no se presente la aglutinacin, los tubos se centrifugan nuevamente y se descarta el sobrenadante. Se lava el paquete celular de cada tubo con 1 ml de solucin salina y se centrifuga nuevamente descartando el sobrenadante. Repetir el lavado 2 veces. 7. Al paquete celular se le agrega un agota del suero de Coombs y se busca la presencia de hemaglutinacin. Interpretacin: Si hay aglutinacin en cualquiera de los tubos, ser indicativo de que hay incompatibilidad entre el posible donador y el receptor (paciente). Si no la hay, las sangres son compatibles.

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BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA VICERRECTORA DE DOCENCIA DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS PRACTICA 8 DIAGNSTICO SEROLGICO DE INFECCINES BACTERIANAS (REACCIONES FEBRILES) INTRODUCCIN: La aglutinacin de clulas bacterianas con antisueros es una de las pruebas serolgicas mas antiguas de la inmunologa prctica. Se inici como un mtodo para el diagnstico de las infecciones bacterianas y fue propuesta por Widal en 1896. La pruebas de aglutinacin bacteriana tienen dos aplicaciones principales en el diagnstico; las clulas bacterianas desconocidas pueden identificarse por medio de anticuerpos conocidos, o bien utilizando bacterias conocidas pueden identificarse los anticuerpos en el suero del paciente. La identificacin bacteriolgica completa del agente patgeno es un proceso que lleva tiempo (3 o ms das), mientras se intenta el reconocimiento del agente es posible la identificacin serolgica. En la aglutinacin de los antgenos bacterianos con sus anticuerpos portaobjetos produce un agregado macroscpico. OBJETIVO: Demostrar en el suero problema anticuerpos contra los antgenos bacterianos. MATERIAL Y EQUIPO 1. 2. 3. 4. 5. 6. Muestras de sueros problema Placa de vidrio marcada en 6 cuadros Pipetas graduadas de 1 y 0.2 mL Pipeta Pasteur Placa oscilatoria Equipo con antgenos: O de Salmonella typhi H de Salmonella typhi H de Salmonella enteritidis paratyphi A H de Salmonella enteritidis paratyphi B Brucella abortus Proteus OX-19

DESARROLLO: 1. En una placa de vidrio perfectamente limpia se depositan 0.08 ml del suero problema en cada una de las seis divisiones. 2. Se agrega una gota de cada antgeno comenzando por la izquierda arriba, respetando el orden establecido. 3. Se mezclan las gotas con palillos diferentes y se agita suavemente en la placa de rotacin durante dos minutos. 4. La lectura se hace observando la aglutinacin macroscpica. 5. Si aparece aglutinacin con alguno de los antgenos, continuar con el siguiente paso. 6. Se toma otra placa y se depositan 0.08, 0.04, 0.02, 0.01, y 0.005 ml del suero problema. 7. Se agrega una gota del antgeno seleccionado, se mezclan con un palillo y se revisa la presencia de aglutinacin. INTERPRETACIN:

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BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA VICERRECTORA DE DOCENCIA DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS 1. Los volmenes de suero empleados corresponden respectivamente a diluciones 1/20, 1/40, 1/80, 1/160 y 1/320. 2. El titulo de anticuerpos del suero problema se reporta como el recproco de la mxima dilucin que muestra aglutinacin. 3. La mayora de los ttulos mayores de 160 son presuntivos de infeccin. 4. La mejor indicacin de una infeccin activa es un aumento en el ttulo de dos determinaciones sucesivas con una diferencia de 5-7 das concomitantes a la infeccin.

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BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA VICERRECTORA DE DOCENCIA DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS PRACTICA 9 DIAGNSTICO SEROLGICO DE INFECCINES BACTERIANAS (Prueba Rpida de Reagina, RPR) INTRODUCCIN: La prueba de RPR es una prueba de floculacin no treponmica macroscpica que es utilizada para detectar y cuantificar reaginas, un anticuerpo antilipdico encontrado en el suero o plasma de personas con sfilis y ocasionalmente en personas con infecciones agudas o crnicas en otras condiciones aparte de la sfilis. El antgeno utilizado en el equipo es una modificacin del antgeno VDRL que contiene micropartculas de carbn para realzar la diferencia entre un resultado positivo y negativo. Si una muestra contiene reaginas, ocurre la floculacin con las partculas de carbn contenidas en la suspensin del antgeno, la cual aparece como un cmulo negro. Las muestras no reactivas se observan con un ligero color gris. OBJETIVO: Demostrar en el suero problema anticuerpos anti-lipdicos de personas con sfilis. MATERIAL Y EQUIPO 1. Muestras de sueros problema 2. Tarjetas de Prueba (crculos de aproximadamente de 18 mm) 3. Pipetas graduadas de 1 y 0.2 mL 4. Equipo con antgeno: Suspensin de Antgeno RPR conteniendo micropartculas de carbn activado. Control Positivo RPR. Control Negativo RPR. 5. Rotador mecnico 6. Lmpara DESARROLLO: Procedimiento cualitativo 1. Lleve a temperatura ambiente la suspensin del antgeno de RPR, los controles y las muestras. 2. Tome la pipeta/agitador del extremo sellado. Al tiempo que oprime y mantiene presionado dicho extremo, coloque la pipeta dentro de la muestra. Suelte para permitir que la pipeta aspire un poco de muestra. 3. Sostenga en posicin vertical la pipeta/agitador directamente sobre un crculo de la tarjeta de prueba y coloque una gota de muestra sobre esta rea. 4. Utilizando el extremo plano de la pipeta/agitador, extienda la muestra para cubrir el total de la superficie del crculo. Deseche la pipeta/agitador. Repita el mismo procedimiento para cada muestra. 5. Agite el frasco de la suspensin del antgeno antes de utilizarlo. Sostngalo en posicin vertical y dispense varias gotas en la tapa del frasco para asegurarse de que el paso por la aguja es correcto. No limpie la aguja. Coloque una gota de la suspensin del antgeno sobre cada muestra. NO EXTIENDA!

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BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA VICERRECTORA DE DOCENCIA DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS 6. Agite por 8 minutos a 100 rpm en un rotador mecnico. 7. Transcurrido este tiempo retire la tarjeta del rotador y agtela breve y suavemente. 8. Lea macroscpicamente bajo una lmpara de luz intensa. INTERPRETACIN: Reactivo: Presencia de flculos grandes o pequeos en el centro o la periferia del crculo de prueba. Dbil reactivo: Presencia de flculos pequeos pero definidos. No reactivo: Apariencia lisa, uniforme pero sin flculos visibles. Los resultados positivos deben ser confirmados mediante pruebas de las muestras utilizando procedimientos cuantitativos. Se recomiendan pruebas serolgicas confirmativas como el ensayo de microhemaglutinacin para anticuerpos treponmicos (MHA-TP). El diagnstico final debe estar en base a la correlacin de los resultados de prueba junto con otros hallazgos clnicos. Procedimiento cuantitativo 1. Seleccione los sueros positivos obtenidos en la prueba cualitativa. 2. Colocar en una gradilla cuatro tubos 12 x 75 mm y numerarlos. 3. Agregar a cada uno de ellos 0.5 mL de solucin salina. 4. Depositar 0.5 mL de suero problema en el tubo No. 1 y mezclar. 5. Pasar 0.5 mL del tubo No. 1 al tubo No. 2 y mezclar. 6. Continuar esta operacin hasta el tubo No. 4. 7. Depositar 0.05 mL de cada una de las diluciones sobre anillos diferentes de la placa de reaccin. Extienda sobre el total de la superficie de cada crculo donde se colocaron las diluciones. 8. Aadir una gota de la suspensin del antgeno previamente resuspendido, exactamente sobre cada una de las gotas de las diluciones anteriores utilizando el frasco gotero al cual se le ha insertado la aguja No. 18 sin bisel. 9. Agite por 8 minutos a 100 rpm en un rotador mecnico. 10. Transcurrido este tiempo retire la tarjeta del rotador y agtela breve y suavemente. 11. Leer el resultado macroscpicamente. INTERPRETACIN: La ltima dilucin que contenga agregados macroscpicos indica el ttulo de la muestra. Ejemplo: Nmero de tubo 1 2 3 4 Dilucin del suero 1:2 1:4 1:8 1:16 Resultado Positivo Positivo Positivo Negativo

. El ttulo del suero problema ser: 1:8.

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BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA VICERRECTORA DE DOCENCIA DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS LIMITACIONES DE LA PRUEBA El diagnstico de la sfilis no debe ser hecho basado en un resultado positivo nico de una prueba no treponmica, sin el soporte de una historia positiva o evidencia clnica. Las muestras de suero que son reactivas en pruebas cualitativas deben ser cuantificadas para establecer un tratamiento en el cual los cambios de ttulo puedan ser determinados como un indicador de la respuesta al mismo. Las muestras de plasma no deben ser utilizadas para pruebas cuantitativas. Las muestras que son noreactivas pero dudosas, se deben de repetir y cuantificar ya que se pueden detectar reacciones poco frecuentes de prozona.

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BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA VICERRECTORA DE DOCENCIA DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS PRACTICA 10 FACTOR REUMATOIDE Y PROTEINA C REACTIVA

INTRODUCCIN: Los factores reumatoides son anticuerpos dirigidos contra los determinantes antignicos de la regin Fc de las IgG. En personas sanas, estos anticuerpos pueden hallarse en baja concentracin, sin embargo se encuentra aumentado en la mayora de los pacientes con artritis reumatoide. La determinacin del factor reumatoide se lleva a cabo con partculas de latex cubiertas de IgG. La Protena C Reactiva forma parte de las protenas de fase aguda, un conjunto de protenas del suero cuya concentracin aumenta de manera drstica durante el dao tisular, la infeccin o el estrs. No es especfica de una enfermedad sino que es un indicador del proceso inflamatorio. OBJETIVO: Realizar la determinacin del Factor Reumatoide y la Proteina C Reactiva por aglutinacin en placa. MATERIAL Y EQUIPO 1. Muestras de sueros 2. Placa de vidrio oscuro marcada 3. Pipetas graduadas de 1 y 0.2 ml 4. Aplicadores de madera o palillos 5. Pipeta Pasteur 6. Reactivo de latex-FR 7. Reactivo de latex- Protena C Reactiva 8. Solucin amortiguadora de glicina-cloruro de sodio pH 8.2 9. Solucin salina isotnica 10. Placa rotatoria DESARROLLO: Factor Reumatoide (FR). Por el mtodo de aglutinacin en latex en placa, utiliza una suspensin estabilizada de partculas de latex sensibilizadas con IgG humana. 1. El suero se inactiva previamente calentando en bao serolgico a 56C por 15 min o 60C por 1 min. Ya inactivado se diluye 1:20 con amortiguador de glicinacloruro de sodio colocando 0.1 ml de suero y 1.9 ml del amortiguador. 2. Se coloca una gota de la dilucin en la placa de vidrio oscura y se aade una gota del reactivo latex-FR. 3. Se mezcla y se agita suavemente en la placa rotatoria durante dos minutos. 4. Se busca la aglutinacin macroscpica. 5. La prueba semicuantitativa utiliza diluciones del suero 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 y 1/640, las cuales se preparan con 0.5 ml de la dilucin 1/20 en 0.5 ml del amortiguador para una dilucin 1/40 y as consecutivamente. Protena C Reactiva (PCR). Por el mtodo de aglutinacin en latex en placa. Utiliza una suspensin acuosa de partculas de latex recubiertas de anticuerpos especficos anti- Protena C Reactiva. 1. El suero problema se diluye 1/5, 1/40 con solucin salina isotnica y se coloca una gota de la dilucin en una placa de vidrio oscuro.

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BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA VICERRECTORA DE DOCENCIA DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS 2. Se aade una gota del reactivo latex-PCR se mezcla bien y se agita suavemente en la placa rotatoria por 3 min. 3. Se busca la aglutinacin macroscpica. 4. La prueba semicuantitativa utiliza diluciones del suero a partir de 1/80.

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BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA VICERRECTORA DE DOCENCIA DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS PRACTICA 11 DETERMINACIN DE ANTIESTREPTOLISINAS INTRODUCCIN: Las estreptolisinas son enzimas hemolticas producidas por la mayora de los estreptococos del grupo A, destruyen la membrana de los eritrocitos ocasionando la hemlisis. Este producto bacteriano es una de las muchas toxinas extracelulares y enzimas producidas por los estreptococos. En particular, la estreptolisina O recibe este nombre debido a que sensible al oxgeno, solo posee actividad en estado reducido, razn por la cual se le incorpora un reductor (el hidrosulfito de sodio) inmediatamente antes de usarla. En el laboratorio las ASO pueden determinarse por una reaccin serolgica de neutralizacin, en la cual si el suero del paciente contiene anticuerpos contra la enzima (antiestreptolisinas) neutralizarn su capacidad hemoltica y ocurrir inhibicin de la hemlisis. OBJETIVO: Determinar el titulo de anticuerpos contra la estreptolisina O en el suero problema MATERIAL Y EQUIPO Muestras de suero Suspensin de eritrocitos al 5% Amortiguador para ASO (fosfatos pH 6.5) Estreptolisina O Bao serolgico Centrfuga Pipetas graduadas de 1 ml y 5 ml 15 tubos de ensaye de 10 X 75 mm DESARROLLO: 1. Preparar a partir del suero problema las siguientes diluciones iniciales: a) 1:10 con 0.2 ml del suero problema + 1.8 ml de solucin amortiguadora b) 1:100 con 0.3 ml de la dilucin 1:10 + 2.7 ml de solucin amortiguadora c) 1:500 con 0.6 ml de la dilucin 1:100 + 2.4 ml de solucin amortiguadora 2. Rotular los tubos de ensaye con nmeros del 1 al 12 y dos ms como control (+) y control (-). 3. Preparar diluciones secundarias aadiendo primero el volumen de solucin amortiguadora y posteriormente el volumen del suero diluido segn se indica a continuacin: Tubos N ml amortiguado r Dilucin ml suero diluido Unidades Todd 1 0. 1 2 0. 4 3 --4 5 6 0.1 0.2 0.3 7 0.3 5 8 --9 10 0.1 0.2 11 0.3 12 0.4 (+) (-) 0. 0.7 5 5

1:10 1:100 1:500 0. 0. 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.5 0.4 0.3 0.2 4 1 5 12 50 10 12 16 25 333 50 62 83 125 0 5 6 0 0 5 3 0

0.1 250 0

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4. Mezclar suavemente y aadir a cada tubo 0.25 ml de estreptolisina, EXCEPTO al tubo control (-).

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BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA VICERRECTORA DE DOCENCIA DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS 5. Mezclar por agitacin e incubar a 37C por 15 min. 6. Aadir a cada tubo 0.25 ml de una suspensin de eritrocitos al 5%., mezclar e incubar a 37C por 30 min. 7. Centrifugar los tubos a 2500 rpm por 2 min. 8. Comprobar la presencia de hemlisis completa en el tubo control (+) y la ausencia de hemlisis en el tubo control (-) 9. Determinar el ttulo de antiestreptolisinas (unidades Todd) como el de la mxima dilucin que no presenta hemlisis.

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BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA VICERRECTORA DE DOCENCIA DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS PRACTICA 12 DETERMINACIN DE LA HORMONA GONADOTROPINA CORIONICA HUMANA INTRODUCCIN: Las pruebas de laboratorio para el diagnstico del embarazo se basan en la determinacin de la gonadotropina corinica humana (hGC), hormona producida por la placenta y que puede detectarse tanto en el suero como en la orina. La excrecin de hGC alcanza su mximo durante la duodcima a decimocuarta semana de gestacin y a partir de entonces desciende de nivel. Hasta los aos 60, las pruebas de embarazo eran bioensayos en los cuales la presencia de la hGC en el suero o en la orina se demostraba por su efecto en animales. Las primeras pruebas utilizaban ratones y conejos, las pruebas ulteriores ratas hembra o ranas. Actualmente estas pruebas han sido sustituidas por pruebas inmunolgicas. Las pruebas inmunolgicas dependen del anticuerpo anti-hGC. La presencia de hGC en el suero u orina se demuestra por un sistema indicador. Los ensayo de aglutinacin denominados de inhibicin de la aglutinacin consisten de eritrocitos de conejo o partculas de ltex recubiertas con hGC. Cuando se realiza la prueba, el suero u orina de la paciente se incuban con el anticuerpo. Si existe hGC en la muestra, el anticuerpo es inactivado y los eritrocitos o partculas de ltex no aglutinan. Si la muestra no contiene hGC, el anticuerpo permanece activo y se produce la aglutinacin. Adems de la aglutinacin, existen otras tcnicas inmunolgicas para la determinacin de la hGC, tales como los inmunoensayos enzimticos (ELISA) y el radioinmunoanlisis (RIA), el cual requiere de equipo especial para su realizacin. Esta tcnicas varan en su sensibilidad, esto es las pruebas inmunolgicas son, ms sensibles al detectar concentraciones menores de hGC, por ejemplo las pruebas con eritrocitos tienden a ser ms sensibles que la que emplean partculas de ltex. OBJETIVO: Determinar la presencia de la hormona Gonadotropina Corinica Humana en una muestra de orina. MATERIAL Orina del Paciente (10 ml) Solucin salina isotnica (SSI) Equipo de diagnostico de hGC Pipetas serolgicas de 1 ml DESARROLLO: 1. Se filtran unos 5 ml de orina o se centrifuga a 3000 r.p.m. 5 minutos para precipitar el material insoluble. Se usa el filtrado o el liquido sobrenadante 2. Se diluye un volumen de orina en dos volmenes de solucin salina, por ejemplo 0.5 ml de orina y 1.0 ml de solucin salina. 3. Se colocan en el tubo apropiado 0.25 ml de antisuero anti-hGC, se agregan 0.25 ml de la orina diluida y se agita suavemente. 4. Se agrega una gota de la suspensin de eritrocitos sensibilizados y se agita suavemente hasta lograr una suspensin homognea. 5. Se coloca en una superficie libre de vibraciones o del calor. De preferencia en una gradilla con el espejo adecuado. 6. Efectuar la lectura 2 horas despus.

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BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA VICERRECTORA DE DOCENCIA DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS RECOMENDACIONES 1. Los residuos de orinas anteriores falsearan la prueba. 2. Tubos diferentes a los apropiados distorsionan la lectura 3. No deben mezclarse los goteros o tocar con ellos los tubos de ensayo. 4. Los reactivos deben agregarse en el orden establecido. INTERPRETACION Para la lectura se interpretan los esquemas celulares en el fondo del tubo de ensayo Prueba positiva = un botn claramente definido Prueba negativa = un tapiz difuso de clulas

PRUEBA NEGATIVA

PRUEBA POSITIVA

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BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA VICERRECTORA DE DOCENCIA DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS PRACTICA 13 PRUEBA DE COOMBS La prueba de Coombs se emplea para poner de manifiesto los anticuerpos que no provocan una aglutinacin visible. Para ello se utiliza el llamado suero de Coombs obtenido en conejos inmunizados con Ig humana. ste funciona como anti-Ig que se enlaza con los Ac que hayan reaccionado con los determinantes antignicos de los eritrocitos. Existen dos Pruebas de Coombs: la directa que demuestra Ac adheridos a eritrocitos, y la indirecta que demuestra la presencia de Ac en el suero. En esta practica se emplear para poner de manifiesto los Ac anti-Rh en el suero de la madre en la incompatibilidad materno-fetal.

MATERIAL Suero problema Suspensin de glbulos rojos Rh + al 5% Pipetas graduadas de 1 y 5 ml Tubos de ensayo de 10 X 75 mm Solucin salina isotnica Suero de Coombs 1. Colocar en una gradilla una serie de 6 tubos rotulados del 1 al 6 y se agregar 0.1 ml de solucin salina cada uno de ellos. 2. Agregar 0.1 ml del suero problema al tubo n 1, mezclar bien y transferir 0.1 ml al tubo n 2 y as sucesivamente hasta el tubo n 6 del cual se desechan 0.1 ml. 3. Aadir 2 gotas de la suspensin de eritrocitos a cada tubo y mezclar. 4. Agregar 1 gota del Suero de Coombs. 5. Incubar a 37C por 30 minutos, mezclan suavemente y centrifugar a 1000 r.p.m. durante 1 minuto. 6. Desprender el botn suavemente y buscar la presencia de aglutinacin.

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BIBLIOGRAFA
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