UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS Y FARMACUTICAS

PAPEL DEL FACTOR TRANSCRIPCIONAL TonEBP EN EL DAO CARDIACO INDUCIDO POR HIPEROSMOLARIDAD
TESIS ENTREGADA A LA UNIVERSIDAD DE CHILE PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR EN FARMACOLOGA

POR

MARIO CHIONG LAY

Dr. Jorge Jalil M.

Facultad de Medicina Pontificia Universidad Catlica de Chile

Dr. Sergio Lavandero G.

Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacuticas Universidad de Chile

Directores de Tesis

2009

Necrosis
Hinchamiento

Ruptura de la

Clula Normal

- clula - mitocondria ATP Ca2+

membrana plasmtica Captacin de colorantes Fragmentacin del DNA al azar

Fagocitosis

Compactacin celular Condensacin

- cromatina - citoplasma

Cuerpo apopttico

Apoptosis

Cuerpo apopttico

Fagocito

Figura 1. Diferencias morfolgicas y bioqumicas entre apoptosis y necrosis. Las clulas normales pueden morir a travs de necrosis o apoptosis. El proceso necrtico implica bsicamente un hinchamiento celular con ruptura y vaciamiento del contenido citoplasmtico al entorno. Esto genera un proceso inflamatorio en el sitio de la necrosis. El proceso apopttico se caracteriza por una compactacin celular, con fragmentacin celular formando cuerpos apoptticos, manteniendo la estructura de la membrana plasmtica intacta. Este proceso es programado genticamente y requiere de ATP. Los restos celulares son fagocitados por macrfagos o clulas vecinas sin originar un proceso inflamatorio. La va intrnseca o mitocondrial se caracteriza por una alteracin de la integridad de las membranas mitocondriales externa e interna debido a la apertura del poro de transicin de permeabilidad mitocondrial (MPTP, un gran canal no selectivo ubicado en la membrana externa mitocondrial), prdida del potencial de membrana mitocondrial y liberacin de protenas proapoptticas al citoplasma celular, tales como el citocromo c, el factor inductor de apoptosis (AIF), endonucleasa G y las protenas Smac/Diablo (25-27). El citocromo c liberado de la mitocondria forma el apoptosoma, un complejo integrado por la procaspasa-9 y su cofactor APAF-1. En presencia de ATP, se activan secuencialmente el apoptosoma, la caspasa-9 y la caspasa-3 (25,26,28) (Figura 2). Las protenas de la familia Bcl-2 son importantes reguladoras de la apoptosis a nivel de la mitocondria, controlando la integridad de su membrana. Se subdividen en tres subfamilias, una antiapopttica y las otras dos proapoptticas. Algunas protenas Bcl-2 se 3

asocian con protenas del poro MPTP y regulan la liberacin del citocromo c. Los miembros proapoptticos y antiapoptticos de la familia Bcl-2 se asocian y neutralizan entre s, de manera que el balance relativo de estos efectores determina la decisin entre la vida y la muerte celular (Figura 2) (29-31). En el cardiomiocito, algunas protenas Bcl-2 son reguladas a nivel transcripcional, mientras que otras se modulan post-transduccionalmente ya sea por fosforilacin, degradacin o cambios en su distribucin subcelular (25).

Apoptosis tipo I
TNFR-1 Fas TRADD
RIP RAIDD

Apoptosis tipo II
APAF-1 Citocromo c Procaspasa 9 + ATP Procaspasa 8
Otros agentes de muerte

FADD
Procaspasa 8

Bax

Bcl-2

Caspasa 8

Bid

Apoptosoma

Caspasa 3 activada

Caspasa 3 activada

Mitocondria

Sustratos

Sustratos

Apoptosis

Figura 2. Vas de activacin de la apoptosis. La apoptosis es activada principalmente por dos vas: la de tipo I, conocida tambin como va extrnseca o mediada a travs de receptores de muerte; y la de tipo II, conocida tambin como extrnseca o mitocondrial. Aunque la activacin de las dos vas es diferente, ambas convergen en un nico evento final, la activacin de la caspasa 3. La caspasa-3 y otras caspasas ejecutoras activan DNAsas endgenas tales como el factor de fragmentacin del DNA (DFF40), la DNasa activada por caspasa (CAD) y NUC70. Estas DNAsas cortan la regin internucleosomal del DNA de doble hebra, generando fragmentos de DNA de 180-200 pares de bases (pb) (32). 4

a) Isquemia
PCr MgATP triglicridos glicgeno K+ cardiomiocito 360 mOsm Cr + Pi (ADP, AMP +Mg2+ + Pi adenosina) acil-CoA lactato + H+

b) Reperfusin
PCr MgATP triglicridos Cr + Pi (ADP, AMP +Mg2+ + Pi adenosina) acil-CoA lactato + H+

cardiomiocito

360 mOsm

vaso

360 mOsm

vaso (sangre normotnica)

290 mOsm

Figura 3. Cambios osmticos en los cardiomiocitos durante isquemia y reperfusin. a) La osmolaridad en el tejido cardiaco aumenta durante la isquemia debido a la acumulacin de metabolitos tales como Cr (creatina), Pi (fosfato), nucletidos de adenina, acil-CoA y lactato. La osmolaridad intracelular se equilibra con el extracelular alcanzando los 360 mOsm (38). b) Durante la reperfusin la sangre normotnica lava el medio extracelular hipertnico, entra agua a la clula hipertnica, y en los primeros minutos hay resntesis de PCr (fosfocreatina), ATP y triglicridos. Figura reproducida de la referencia (40).

Sin embargo, durante la reperfusin se observa un aumento explosivo en el volumen de los cardiomiocitos (43). La reperfusin del miocardio isqumico con medio extracelular normotnico lava el medio extracelular hipertnico, mientras que el interior de las clulas contina hipertnico. De esta manera se creara una gradiente de tonicidad que impulsa la entrada masiva de agua al interior de los cardiomiocitos. Este hinchamiento celular inducido por la reperfusin est asociado con la formacin de blebs y la ruptura de las membranas del sarcolema (42,44). En nuestro Laboratorio hemos observado que la reduccin en 60 mosmol en el medio de mantencin de cardiomiocitos en cultivo induce un 40% de muerte y genera blebs necrticos (36). El dao generado por la reperfusin de corazones isqumicos es atenuado cuando estos se reperfunden con medios hipertnicos, impidiendo que ocurra el desbalance osmtico (38,43,45,46). Los 6

Regin de homologa a Rel (RHR)

RHR-N RHR-C

p65 (RelA) c-Rel NFB RelB p100 / p52 p105 / p50 TonEBP NFAT1 NFAT2 NFAT3 NFAT4 TAD TAD

TAD

TAD ANK

TAD TAD

Dominio regulatorio y de unin a calcineurina

Figura 5. Diagrama esquemtico de las protenas de la familia Rel. RHR: regin de homologa a Rel; TAD: dominio de transactivacin, ANK: ankirinas. Cuando las clulas son expuestas a condiciones hiperosmticas, TonEBP rpidamente se transloca al ncleo (56,71,72). Adems, ms tardamente se detecta un aumento en los niveles de mRNA y luego protena de TonEBP (60,71,73,74). Recientemente se han identificado tres motivos en el dominio N-terminal de TonEBP que controla su exportacin e importacin del ncleo (75). El primer motivo es una secuencia de localizacin nuclear (NLS) y corresponde a los residuos RKSRKRNPKQRPGVKRRD, en donde la secuencia RKR es esencial para la translocacin nuclear. El segundo motivo corresponde a un dominio de exportacin auxiliar (AED) localizado en el N-terminal de la NLS que es necesaria para la exportacin nuclear bajo condiciones hipotnicas en forma independiente de CRM1 (receptor de exportacin nuclear exportina-1). El tercer motivo es una seal rica en leucina de exportacin nuclear (NES) capaz de interaccionar con CRM1 y corresponde a la secuencia MPSDFISLLSADLDLESPK (75). El mecanismo de translocacin nuclear inducido por estrs hiperosmtico parece involucrar la inactivacin 10

seleccion la poblacin de cardiomiocitos dentro de la muestra Control, la cual se design como P1 (Figura 6), esta ltima se dividi en tres subpoblaciones representadas en el grfico Count vs. PerCP-Cy5-5-A. La poblacin P2 se defini como los cardiomiocitos apoptticos de la muestra, mientras que P3 y P4 se definieron como clulas binucleadas y mononucleadas, respectivamente.

P3

P4

Figura 6. Evaluacin de la muerte por apoptosis en cardiomiocitos mediante citometra de flujo. 5.10.3. Activacin de caspasas La activacin se determin por Western blot detectando la fragmentacin de las procaspasas 3 y 9. Adems, se determin la actividad enzimtica de la caspasa 9 por un mtodo colorimtirico usando como sustrato Ac-LEHD-pNA (Calbiochem) (120). 5.11. Determinacin necrosis por liberacin de lctico deshidrogenasa Los cardiomiocitos se cultivaron en placas de 12 pocillos conteniendo 500.000 clulas por pocillo. A diferentes tiempos se recuper completamente el sobrenadante de cada pocillo y se les determin el volumen total. Paralelamente, se les agreg a cada pocillo 0,5 mL de amortiguador fosfato 0,1 M pH 7,0 conteniendo 0,1% v/v Triton X-100 y las clulas se rasparon. Los sobrenadantes se traspasaron a tubos eppendorf y se centrifugaron a 10.000 x g por 5 min. Luego se determin la actividad de lctico deshidrogenasa (LDH) en el medio de cultivo sobrenadante y en el lisado celular. Para ello se mezcl en una cubeta de 1 mL 850 L de amortiguador fosfato 0,1M pH 7,0, 33 mL de piruvato de sodio 2,5 mg/mL, 16,7 L de NADH sal sdica 10 mg/mL y 100 L de muestra. La mezcla se agit y se registr la disminucin de la absorbancia a 340 nm a 37C por 3 min. La actividad LDH se calcul multiplicando el valor absoluto de la pendiente por 20 y se corrigi por la dilucin empleada. La actividad LDH total se calcul 22

Figura 8. Estrs hiperosmtico induce salida de la mitocondria de citocromo c, pero no del factor inductor de la apoptosis (AIF). Cardiomiocitos cultivados sobre cubreobjetos fueron expuestos a medio de cultivo conteniendo sorbitol (600 mOsm) y en los tiempos indicados fueron fijados, bloqueados con BSA e incubados con anticuerpo A) anti-factor inductor de apoptosis (AIF) o B) anti citocromo c (Cit c), y revelado con anticuerpo anti ratn IgG-Alexa 488. Los ncleos se tieron con yoduro de propidio (PI). La escala corresponde a 20 m. las imgenes son representativas de al menos 3 experimentos independientes.

33

PCMV PCMV
BamH I Sal I

BamH I

pDC32

wtTonEB

Digestin BamH I / Sal I

Digestin Xho I/BamHI

Xho I BamH I

PCMV

BamH I

pDC32

wtTonEBP

Sal I
Ligacin

Xho I

PCMV

BamH I

pDC32 / wtTonEBP

wtTonEBP

Sal I / Xho I

Figura 15. Esquema de subclonamiento del gen que codifica para wtTonEBP en el vector adenoviral pDC32.

45

PCMV PCMV
Bgl II EcoICR I

BamH I

pDC316

pCMV-Tag3c / dnTonEBP dnTonEBP

Digestin Bgl II / EcoICR I

Digestin BamH I / Pme I

Pme I BamH I

PCMV

Bgl II

pDC316

dnTonEBP

EcoICR I
Ligacin

Pme I

PCMV

Bgl II / BamH I

pDC316 / dnTonEBP

dnTonEBP

EcoICR I / Pme I

Figura 16. Esquema de subclonamiento del gen que codifica para dnTonEBP en el vector adenoviral PDC316.

46

Ad MCMV

SV40 AN CRE
pDC316 dnTonEBP amp SV40 polyA Ad ori loxP MCMV dnTonEBP

HCMV IE amp E1 E3 pBHGlox E1,3Cre 34707 bp loxP

pDC32 wtTonEBP amp

wtTonEBP

Genoma viral

SV40 polyA ori loxP

Cotransfeccin en HEK293

30 a 45 das
wtTonEBP loxP o ITR dnTonEBP E1 E3

ITR

Adenovirus recombinante

Figura 17. Procedimiento empleado para la obtencin recombinantes Ad wtTonEBP y Ad dnTonEBP.

de

los

adenovirus

48

Ad LacZ

Ad dnTonEBP

Ad wtTonEBP

Faloidina

AR

Merge

Figura 23. Efecto de la sobreexpresin de wtTonEBP y dnTonEBP sobre la morfologa de los cardiomiocitos de rata. Cardiomiocitos en cultivo se transducieron con los adenovirus galactosidasa (Ad LacZ), wtTonEBP (Ad wtTonEBP) o dnTonEBP (Ad dnTonEBP) usando MOI = 3000. Despus de 48h las clulas se fijaron con metanol, se bloquearon con BSA, y se incubaron con anticuerpo anti-aldosa reductasa (AR) y segundo anticuerpo-FITC (verde). Posteriormente, despus de lavar, las clulas se trataron con faloidina-rodamina (rojo) para teir F-actina. Las clulas se visualizaron por microscopa confocal. Las fotos son representativas de 3 experimentos independientes. La escala corresponde a 20 m.

57

Ad LacZ

Ad dnTonEBP

Ad wtTonEBP

Faloidina

AR

Merge

Figura 24. Efecto de la sobreexpresin de wtTonEBP y dnTonEBP sobre la morfologa de los cardiomiocitos de rata sometidos a estrs hiperosmtico. Cardiomiocitos en cultivo se transducieron con los adenovirus galactosidasa (Ad LacZ), wtTonEBP (Ad wtTonEBP) o dnTonEBP (Ad dnTonEBP) usando MOI = 3000. Despus de 24h las clulas se trataron con medio de cultivo que contena sorbitol 600 mOsm por otras 24 h. Posteriormente, las clulas se fijaron con metanol, se bloquearon con BSA, y se incubaron con anticuerpo anti-aldosa reductasa (AR) y segundo anticuerpo-FITC (verde). Despus de lavar, los cardiomiocitos se trataron con faloidina-rodamina (rojo) para teir F-actina. Las clulas se visualizaron por microscopa confocal. Las fotos son representativas de 3 experimentos independientes. La escala corresponde a 20 m.

58

A
Count

24 h de transduccin Ad LacZ Ad dnTonEBP Ad wtTonEBP

B
Count

48 h de transduccin Ad LacZ Ad dnTonEBP Ad wtTonEBP

Count

Count

Count

MOI = 300

MOI = 300

PI

PI

PI

PI

PI

Count

PI

Count

Count

Count

Count

Count

MOI = 10000

MOI = 10000

PI

PI

PI

PI

PI

Count

PI

100 75 * (%) 50 25 0
Ad LacZ Ad dnTonEBP Ad wtTonEBP

100 75 (%) 50 25 0
Ad LacZ Ad dnTonEBP Ad wtTonEBP

Viabilidad

Viabilidad

* ** **

* **

400

600 1000 2000 4000 6000 10000

400

600 1000 2000 4000 6000 10000

MOI MOI Figura 25. Efecto de la sobreexpresin de wtTonEBP y dnTonEBP sobre la viabilidad de cardiomiocitos de rata. Cardiomiocitos en cultivo se transducieron con los adenovirus -galactosidasa (Ad LacZ), wtTonEBP (Ad wtTonEBP) o dnTonEBP (Ad dnTonEBP) usando distintas multiplicidades de infeccin (MOI). Despus de 24 h (A) o 48 h (B) las clulas se soltaron con tripsina, se incubaron con yoduro de propidio (PI) y se evaluaron por citometra de flujo. Los resultados son el promedio SEM de 3 experimentos independientes. *p<0,05 y ** p<0,01 vs sin adenovirus. 60

A
Count

24 h de transduccin Ad LacZ Ad dnTonEBP Ad wtTonEBP

B
Count

48 h de transduccin Ad LacZ Ad dnTonEBP Ad wtTonEBP

Count

Count

Count

MOI = 300

MOI = 300

PI

PI

PI

PI

PI

Count

PI

Count

Count

Count

Count

Count

MOI = 10000

MOI = 10000

PI

PI

PI

PI

PI

Count

PI

100
Ad LacZ

100 Fragmentacin del DNA (%) 75 50 25 0

Ad LacZ Ad dnTonEBP Ad wtTonEBP

Fragmentacin del DNA (%)

Ad dnTonEBP

75 50 25 0

Ad wtTonEBP

**

**

** *

****

400

600 1000 2000 4000 6000 10000

400

600 1000 2000 4000 6000 10000

MOI MOI Figura 26. Efecto de la sobreexpresin de wtTonEBP y dnTonEBP sobre la apoptosis de cardiomiocitos de rata. Cardiomiocitos en cultivo se transducieron con los adenovirus -galactosidasa (Ad LacZ), wtTonEBP (Ad wtTonEBP) o dnTonEBP (Ad dnTonEBP) usando distintas multiplicidades de infeccin (MOI). Despus de 24 h (A) o 48 h (B) las clulas se soltaron con tripsina, se permeabilizaron con etanol, se trataron con RNAsa, se incubaron con yoduro de propidio (PI) y se evaluaron por citometra de flujo las poblaciones subG1. Los resultados son el promedio SEM de 3 experimentos independientes. *p<0,05 y ** p<0,01 vs sin adenovirus. 62

A
Count

MOI 1000 Control Zop (40 M) Control

MOI 10000 Zop (40 M)

Count

Count

Ad LacZ

PI

PI

PI

Count

PI

Count

Count

Count

Ad wtTonEBP

PI

PI

PI

Count

PI

B
Viabilidad (veces)

1,2
Ad LacZ Control

0,9
* **

Ad LacZ + Zop 10 M Ad LacZ + Zop 20 M Ad LacZ + Zop 40 M wtTonEBP Control wtTonEBP + Zop 10 M wtTonEBP + Zop 20 M wtTonEBP + Zop 40 M

0,6

0,3

6 MOI x 10-3

12

Figura 28. Efecto del inhibidor de aldosa reductasa zopolrestat, sobre la viabilidad de cardiomiocitos de rata transducidos con Ad wtTonEBP. Cardiomiocitos en cultivo se transducieron con los adenovirus -galactosidasa (Ad LacZ) o wtTonEBP (Ad wtTonEBP) usando MOIs entre 0 y 1000 y se coincubaron con zopolrestat (Zop) (10 a 40 M). Despus de 24h las clulas se determin la viabilidad por citometra de flujo en clulas tratadas con yoduro de propidio. A) Diagramas de citometra de flujo representativos. B) Cuantificacin de la viabilidad. Los resultados son el promedio SEM de 3 experimentos independientes. *p<0,05, **p<0,01 vs respectivo control Ad LacZ. 66

250 m

4X

250 m

4X

50 m

20X

50 m

20X

Figura 30. Fotografas del ventrculo izquierdo de ratas sometidas a transduccin intracardiaca con un adenovirus que sobreexpresa la protena fluorescente verde (Ad GFP) vistos bajo microscopa de fluorescencia. Corazones de ratas se transdujeron con 1 x 1011 partculas virales/corazn de Ad GPF. A los 15 das post transduccin los animales se sacrificaron y se les extrajo los corazones. A y B) Cortes transversales de 10 m del ventrculo izquierdo (VI) de ratas transducidas con Ad GFP vistas bajo fluorescencia y en campo claro, respectivamente; C y D) cortes longitudinales de 10 m del VI de ratas transducidas con Ad GFP vistas bajo fluorescencia y en campo claro, respectivamente.

69

A
Count

24 h de transduccin Ad LacZ Ad dnTonEBP Ad wtTonEBP

B
Count

48 h de transduccin Ad LacZ Ad dnTonEBP Ad wtTonEBP

Count

Count

Count

300 mOsm

300 mOsm

PI

PI

PI

PI

PI

Count

PI

Count

Count

Count

Count

Count

600 mOsm

600 mOsm

100 75 Viabilidad (%) 50 25 0

PI

PI

PI

Ad LacZ Ad dnTonEBP Ad wtTonEBP

100 75 Viabilidad (%)

PI

PI

Count

PI

Ad LacZ Ad dnTonEBP Ad wtTonEBP

* **

50 25

**

* *

0 400 500 600 300 400 500 600 Osmolaridad (mOsm) Osmolaridad (mOsm) Figura 32. Efecto de la sobreexpresin de wtTonEBP y dnTonEBP sobre la viabilidad de cardiomiocitos de rata sometidos a estrs osmtico. Cardiomiocitos en cultivo se transducieron con los adenovirus -galactosidasa (Ad LacZ), wtTonEBP (Ad wtTonEBP) o dnTonEBP (Ad dnTonEBP) usando MOI = 1000. Despus de 24h las clulas se incubaron con medio de cultivo (300 mOsm) o medio de cultivo conteniendo sorbitol 400, 500 o 600 mOsm. Despus de 24 h (A) o 48 h (B) se contaron las clulas vivas y muertas usando yoduro de propidio (PI) y citometra de flujo. Los resultados son el promedio SEM de 3 experimentos independientes. *p<0,05, **p<0,01 vs respectivo control a 300 mOsm. #p<0,05 vs Ad LacZ de la misma osmolaridad. 300 73

A
Count

24 h de transduccin Ad LacZ Ad dnTonEBP Ad wtTonEBP

B
Count

48 h de transduccin Ad LacZ Ad dnTonEBP Ad wtTonEBP

Count

Count

Count

300 mOsm

300 mOsm

PI

PI

PI

PI

PI

Count

PI

Figura

Count

Count

Count

Count

600 mOsm

600 mOsm

100 Fragmentacin del DNA (%) 75 50 25 0

PI

PI

PI

100 Fragmentacin del DNA (%) 75 50 25 0

PI

PI

Count

PI

Ad LacZ Ad dnTonEBP Ad wtTonEBP

Ad LacZ Ad dnTonEBP Ad wtTonEBP

* **

##

##

* *

*
300 400 500 Osmolaridad (mOsm) 600

300

400 500 Osmolaridad (mOsm)

600

Figura 33. Efecto de la sobreexpresin de wtTonEBP y dnTonEBP sobre la apoptosis de cardiomiocitos de rata sometidos a estrs osmtico. Cardiomiocitos en cultivo se transducieron con los adenovirus -galactosidasa (Ad LacZ), wtTonEBP (Ad wtTonEBP) o dnTonEBP (Ad dnTonEBP) usando MOI = 1000. Despus de 24 h las clulas se incubaron con medio de cultivo (300 mOsm) o medio de cultivo conteniendo sorbitol 400, 500 o 600 mOsm. Despus de 24 h (A) o 48 h (B) se determin la fragmentacin del DNA cuantificando la poblacin subG1 por citometra de flujo de clulas permeabilizadas tratadas con yoduro de propidio. Los resultados son el promedio SEM de 3 experimentos independientes. *p<0,05, **p<0,01 vs respectivo control a 300 mOsm. #p<0,05, ##p<0,01 vs Ad LacZ de la misma osmolaridad. 75

Control Ad LacZ 48 h

Sobreexpresin wtTonEBP 48 h

Basal

Insulina (100 mM) 10 min

Figura 36. Comparacin de la reorganizacin de actina inducida por sobreexpresin de wtTonEBP con la inducido por insulina. (A) Cardiomiocitos transducidos con Ad LacZ y (B) transducidos con Ad wtTonEBP por 48 h con MOI 1000 y revelados con faloidina-rodamina. (C), (E) y (G) Clulas musculares esquelticas no estimuladas o (D), (F) y (H) estimuladas con 100 nM insulina por 10 min. (C) y (D) se revelaron con anticuerpo anti actina; (E) y (F) con faloidina-Oregon Green; y (G) y (H) con faloidina-rodamina. Las flechas indican zona de reorganizacin de actina. Los paneles (A) y (B) se extrajeron de la Figura 23 de este trabajo, los paneles (C) y (D) de la referencia (177), (E) y (F) de la referencia (178),y (G) y (H) de la referencia (179).

87

A
sangre (290 mOsm)

estrs osmtico ambiental

tejidos rin (1500 mOsm)

actividad metablica y sensibilidad al estrs osmtico quiescente activa (no proliferativa) proliferativa

estrs osmtico funcional

actividad de TonEBP

B funcin renal

mdula renal

epitelio tubular renal

C respuesta inmune

centro del linfonodo germinal

linfoblasto

Figura 39. Contribuciones de las osmolaridades extracelulares e intracelulares a estrs hiperosmtico funcional. (A) En el organismo la osmolaridad vara desde 290 mOsm, que corresponde a la sangre, hasta 1.500 mOsm, que representa a la osmolaridad en la mdula renal. En tejidos no renales la osmolaridad puede aumentar hasta unos 350 mOsm. En clulas no proliferativas la actividad metablica celular puede variar desde baja, por ejemplo en clulas quiescentes, regular o activa, por ejemplo en clulas heptica. En clulas proliferativas el metabolismo celular puede ser muy alto, como por ejemplo en linfocitos activados. Una actividad metablica baja o intermedia dentro de un tejido sometido a una osmolaridad extracelular alta, tales como las clulas de la mdula renal (B) puede estar sometida un estrs osmtico funcionalmente equivalente a clulas con una actividad metablica muy alta ubicadas en un entorno con una osmolaridad baja o intermedia, como por ejemplo en el centro germinal de un nodo linftico durante la respuesta inmune (C). Figura extrada de la referencia (217). 100