Welcome to Scribd, the world's digital library. Read, publish, and share books and documents. See more
Download
Standard view
Full view
of .
Save to My Library
Look up keyword
Like this
1Activity
0 of .
Results for:
No results containing your search query
P. 1
DISEÑO DE OLIGOS

DISEÑO DE OLIGOS

Ratings: (0)|Views: 92 |Likes:
Published by lalo199

More info:

Categories:Types, Research, Science
Published by: lalo199 on Sep 12, 2012
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOCX, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

09/12/2012

pdf

text

original

 
DISEÑO DE OLIGOSAunque no existe una 'regla' general, se recomienda que:1.
 
Los primers no tengan ninguna discrepancia (mismatch), a exepción de losutilizados para mutagenesis.2.
 
No exista algún sitio alternativo en el templado donde el primer puedahibridarse.3.
 
Los primers no formen estructura secundaria, especialmente en el extremo3' o que sean parcialmente complementarios4.
 
La longitud del oligo sea de 20 a 24 bases para reducir al mínimo laposibilidad de hibridización en sitios secundarios en el vector o inserto.5.
 
La temperatura de fusión (Tm) sea de 55
o
C o más, de manera que este porarriba de la temperatura de "annealing".6.
 
El oligo no contenga "strings" de más de una base. Es de especialimportancia evitar 3 o mas G's o C's consecutivas.7.
 
Los primers tengan un contenido de C/G entre 40 y 60%. Para primers concontenido menor al 50% de C/G, es necesario incrementar la secuencia delos mismos para levar la Tm sobre la temperatura de annealing.8.
 
El primer sea más afín en su extremo 3
Diseño deOligonucleótidos paraPCR
 
Uno de los parámetros más importantes para tener éxito en laamplificación por PCR es el diseño de los oligonucleótidos cebadores(oligos o
 primers
). Si éstos no están bien diseñados la PCR puede nofuncionar bien; el resultado es la nula amplificación del producto debidoa amplificación no específica o a la formación de dímeros deoligonucleótidos que pueden competir con la amplificación del productodeseado.
 
¿Qué debemos tener en cuenta a la hora de diseñar oligonucleótidospara PCR?
 
Las principales variables a tener en cuenta son:
 1.
 
Tamaño del oligonucleótido
 
 
2.
 
Temperatura de fusión (Tm)
 3.
 
Especificidad
 4.
 
Secuencias complementarias
 5.
 
Contenido en G/C y tractos de polipirimidinas (T, C) or polipurinas (A, G)
 6.
 
Secuencia 3’ terminal.
 7.
 
Secuencia
5’ terminal y regiones centrales
 
1. Tamaño del oligonucleótido
 
El tamaño del oligonucleótido influye en la especificidad, en latemperatura de fusión y en el tiempo necesario para la hibridación deloligonucleótido a su secuencia complementaria, por tanto es decisivopara que salga bien la PCR. Los oligonucleótidos de 18 a 24 bases sonmuy específicos de secuencia, siempre que la temperatura dehibridación sea óptima.
 
El tamaño del oligonucleótido es proporcional a la eficiencia dehibridación: en general, cuanto más largo sea el oligonucleótido másineficiente será la hibridación. Si hay pocos moldes con suoligonucleótido hibridado (o anillado) en cada paso de la PCR elresultado va a ser muy poco producto amplificado.
 
Los oligos no deberían ser demasiado cortos a menos que seespecifique lo contrario en el protocolo. La meta es diseñar unoligonucleótido con una temperatura de hibridación (la queprogramamos en el termociclador) de al menos 50ºC.
 
La relación entre temperatura de hibridación y temperatura de fusión esmuy importante en la PCR. Como regla general la temperatura dehibridación debe ser 5- 8°C más baja que la de fusión. Por tanto, siqueremos un oligonucleótido con una temperatura de hibridación de almenos 50°C, correspondería a un oligonucleótido con una temperaturade fusión de (Tm ~ 55-58°C). A menudo, la temperatura de hibridaciónasí determinada no es óptima y es necesario determinarlaempíricamente. Se puede hacer fácilmente con un termociclador congradiente (por ejemplo el Mastercycler® gradient de Eppendorf).
 
2. Temperatura de fusión (Tm)
 
Es importante tener en cuenta que en una reacción de PCR hay dosoligonucleótidos. Ambos oligonucleótidos deberían diseñarse demanera que tengan temperaturas de fusión similares. Si losoligonucleótidos no tienen Tm parecidas, la amplificación será menoseficiente o incluso puede no funcionar ya que el oligonucleótido con laTm más alta hibridará mal o inespecíficamente a bajas temperaturasmientras que el oligonucleótido con la Tm más baja puede que no
 
funcione a temperaturas más altas.
 
Las temperaturas de fusión de los oligos se calculan de una maneramuy exacta con cálculos termodinámicos usando la siguiente fórmula:
 
Tm
oligonucleótido
 
= ∆H [∆S+ R ln (c/4)] –
273.15°C + 16.6 log 10 [K+]
 
donde H es la entalpía y S la entropía para la formación de la hélice, Res la constante molar y c es la concentración del oligonucleótido. Perolo más sencillo es usar cualquiera de los paquetes de software para eldiseño de oligonucleótidos del mercado. Por suerte, una buenaaproximación (generalmente válida para oligos en el rango de 18
 –
24bases) a la Tm se puede calcular con la fórmula:
 
Tm = 2(A+T) + 4(G+C) Fórmula de Wallace
 
En esta tabla hay valores de Tm de oligonucleótidos de varios tamañosusando la fórmula de Wallace asumiendo un contenido en G/C del50%.
 
Tamaño
 
delOligonucleótido
 
Tm = 2 (A+T)+ 4(G+C)
 
Tamañodel Oligonucleótido
 
Tm = 2 (A+T) +4(G+C)
 
4
 
12°C
 
22
 
66°C
 
6
 
18°C
 
24
 
72°C
 
8
 
24°C
 
26
 
78°C
 
10
 
30°C
 
28
 
84°C
 
12
 
36°C
 
30
 
90°C
 
14
 
42°C
 
32
 
96°C
 
16
 
48°C
 
34
 
102°C
 
18
 
54°C
 
36
 
108°C
 
20
 
60°C
 
38
 
114°C
 
Las temperaturas calculadas usando la ecuación de Wallace soninexactas en los valores extremos.
 
 Además hay que tener cuidado de que la Tm del producto sea losuficientemente baja para asegurar que esté totalmentedesnaturalizada a 92º. Este parámetro ayudará a asegurar una PCRmás eficiente, pero no siempre es necesario para amplificar por PCR.En general, productos entre 100
 –
600 pares de bases se amplificaneficientemente en muchas reacciones de PCR. En caso de duda, la Tmdel producto puede calcularse con la fórmula:
 

You're Reading a Free Preview

Download
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->