ANAEROBIOS

ORIGEN Y DEFINICION La presencia de una atmsfera terrestre rica en O2 ha permitido que los seres vivos hayan evolucionado desarrollando un metabolismo aerbico, el cual se caracteriza por ser una forma muy eficiente de obtencin de energa. A nivel bacteriano las bacterias anaerobias precedieron largamente a las aerbicas y sin duda predominaron largamente en un mundo vivo que comenzaba a desarrollarse. Los anaerobios generalmente poseen un metabolismo de tipo fermentativo en el cual sustancias orgnicas son los aceptores finales de electrones. Las formas vegetativas mueren cuando son expuestos al O2 molecular libre en la atmsfera, aunque el grado de resistencia bajo estas condiciones es variable (AEROTOLERANCIA); Los esporos bacterianos no son afectados por tratarse de formas biolgicas metablicamente inertes y con muy escasa proporcin de agua en su composicin. En consecuencia una definicin simple de las bacterias anaerobias sera: anaerobios son aquellos grmenes que slo pueden desarrollarse en ausencia de cantidades significativas de Oxgeno (O2) y bajo condiciones de potenciales REDOX (Eh) muy reducidos. En el mundo microbiano existen especies capaces de alternar con sistemas metablicos diferentes para crecer y multiplicarse en muy diferentes condiciones de aerobiosis, total, reducida o ausente. Son grmenes facultativos. Otros solamente subsisten en rangos estrictos de gases tales como el O2 y el CO2 (microaerfilos). Los anaerobios son poseedores de sistemas enzimticos que solamente funcionan en ausencia de O2 por tanto son estrictos en cuanto a sus exigencias de Medio Ambiente. De ahora en ms el trmino Anaerobios se aplicar solamente para este tipo de grmenes. El conocimiento de estas bacterias es poco y relativamente reciente ya que para poder lograr condiciones de anaerobiosis en el Laboratorio se necesitaban, hasta los aos 60, equipos costosos y tcnicas bacteriolgicas muy dificultosas. A partir de la introduccin de sistemas simples para producir anaerobiosis con equipos y reactivos de bajo costo el conocimiento de los anaerobios se desarrolla intensamente. Aun as, no hay un gran nmero de Microbilogos que se dediquen al Tema, la taxonoma est en permanente revisin e infinidad de aspectos se mantienen oscuros. MORFOLOGIA Y TINCION Como en casi toda la bacteriologa, la morfologa de los anaerobios se basa en la tincin de Gram. Un Rivas problema adicional se plantea por la tendencia a tornarse Gram negativos, sea por la poca estabilidad frente a la decoloracin (se prefiere el uso de alcohol a la mezcla alcohol-acetona) lo que los convierte en Gram inestables al examen directo de los materiales, sea porque existe una variacin tintorial en los cultivos bacteriolgicos. Dos aspectos a tener en cuenta en la tincin de Gram son: a. efectuar la decoloracin solamente con alcohol etlico prescindiendo de la acetona, y b. prolongar el tiempo de contacto con Lugol hasta 1 minuto. La morfologa celular, sobre las bases del Gram, permite distinguir formas variadas que incluyen toda la gama: Cocos Gram positivos, cocos Gram negativos, diplococos, estreptococos; bacilos Gram negativos, cocobacilos, fusiformes, bacilos rectos o curvos; bacilos Gram positivos, esporulados o no esporulados, espiroquetas, etc. EL METABOLISMO DE LOS ANAEROBIOS OXIGENO SENSIBILIDAD Los anaerobios estrictos crecen y se multiplican en ausencia total de Oxgeno molecular (O2) logrando obtener energa libre y sintetizar todos sus componentes estructurales sin la ayuda del O2. Todos sabemos que la va anaerobia posee un menor rendimiento energtico y est sujeta a potenciales REDOX bajos (algunas enzimas solamente operan en estas condiciones) y sin la presencia de elementos que interfieran el flujo normal de electrones. Si bien el O2 es potencialmente txico para cualquier forma de vida, los anaerobios son intolerantes al mismo aunque en diferentes grados. Existe un espectro que va desde los extremadamente intolerantes (aerointolerantes) hasta los aerotolerantes moderados los cuales pueden sobrevivir a la presencia de O2 durante breves perodos. Varias son las causas de la Oxgeno toxicidad. En 1er lugar el Oxgeno es un poderoso oxidante, es decir, un vido receptor de electrones, por lo tanto su presencia en solucin es incompatible con potenciales REDOX bajos. En esta situacin el flujo de electrones se ve interferido por un receptor extrao al usual de los grmenes provocando shunts letales. En segundo lugar el Oxgeno puede interactuar directamente con enzimas o cofactores causando inactivaciones irreversibles. En tercer lugar y aparentemente, la causa ms importante de la Ox. toxicidad se atribuye a la produccin de sustancias txicas derivadas de la reduccin parcial de la molcula O2. Simplificando se pueden dar las siguientes reacciones qumicas:

O2 + 4H + 4e- --> H2O (reduccin completa) O2 + 2H + 2e- --> H2O2 (reduccin parcial) O2 + e--> O2.-

antibioticoterapia emprica racional y al microbilogo para seleccionar los Medios de Cultivo ms apropiados al aislamiento e identificacin bacterianos. La TABLA 1 muestra el predominio de las especies ms comunes como flora normal humana segn diferentes localizaciones.

La formacin de Perxidos de Hidrgeno (H2O2) puede ser catalizada por varias enzimas y su letalidad para las bacterias est fehacientemente comprobada. Por otra parte el anin Superxido (O2.-) es altamente txico por su participacin en la produccin de hidroxilos libres (HO.-) agentes letales para los microorganismos. Aquellos anaerobios aerotolerantes poseen enzimas como Catalasas y peroxidasas que descomponen los H2O2 en H2O + O; otros poseen Superxido-dismutasas (SOD) que actan eliminando los O2.-; ms aun las SOD han sido postuladas como factores de virulencia en los anaerobios ya que estas enzimas permitiran la sobrevida de las bacterias en tejidos oxigenados hasta que el consumo de Oxgeno crear el ambiente adecuado para la multiplicacin y desarrollo. POTENCIALES REDOX El potencial de Oxido Reduccin (Eh) de una pareja REDOX es la medida en VOLTIOS de la tendencia espontnea a donar o recibir electrones por parte de uno de los integrantes de la pareja (flujo de electrones). Una pareja REDOX posee una forma reducida (dador de electrones) y una forma oxidante (receptor de electrones) Reductor <---> oxidante + electrones. En consecuencia cuanto menor sea la cantidad de formas oxidantes menor o ms bajo ser el potencial REDOX. La presencia de O2 en los cultivos o en el medio natural debe ser eliminada imprescindiblemente del microclima de desarrollo (O2 atmosfrico y en solucin. An mas el descenso de los Eh debe afirmarse con la presencia en el medio de sustancias reductoras que superen en gran nmero a las oxidantes. FLORA NORMAL ANAEROBIA El hombre conjuntamente con los animales (mamferos, aves, peces) es hospedero en sus epitelios, mucosas y aparatos de un gran nmero de Especies y de un gran nmero de individuos anaerbicos. Estos son miembros de una FLORA NORMAL beneficiosa y hasta en algunos casos esencial para la vida. El conocimiento de esta flora normal es importante desde varios ngulos. Si pensamos que muchas infecciones anaerbicas se desarrollan en la vecindad de las superficies mucosas en las cuales estos grmenes predominan como flora autctona, el conocimiento de la misma se presenta de gran utilidad para sospechar quienes estaran involucrados en los procesos infecciosos. Esta informacin ayuda al Clnico para establecer una

TABLA 1 Piel Bacilos Gram (+) esporulados Clostridia Bacilos Gram (+) no esporulados Actinomyces Bifidobact. Eubacterium Lactobac. (*) Propionibact. Bacilos Gram (-) no esporulados Bacteroides Fusobact. Cocos G (+) Cocos G (-) 0 0 2 0 2 2 2 2 3-4 3-4 3-4 3-4 2 2 3-4 2 2 2 2 0 2 2 1 d 2 1 2 2 0 0 1 0 3-4 2 0 1 0 2 2 2 2 2 1 1 1 3-4 2 1 0 0 d 0 d 0 0 d 1 0 0 2 1 3-4 2 0 0 1 3-4 0 1 1 V.R.S.(#) Boca Intestino Genitales externos Uretra Vagina

(#) Vas Respiratorias Superiores; incluye vas nasales, nasofaringe, orofaringe y amgdalas. (*) Incluye anaerobios, facultativos y microaerfilos. (d = desconocido) (0 = no encontrados o raros) (1 = hallazgo irregular) (2 = habitualmente presentes) (3-4 presentes en gran nmero). de superficie ricas en cistena. Esta propiedad de esporular le confiere a las especies que la poseen una singular resistencia frente los agentes fsicos y qumicos habitualmente usados para la desinfeccin y una permanencia prolongada en el medio ambiente. Sin duda la ubicuidad y la peligrosidad de estos grmenes son resaltables y su permanencia en la ecologa microbiana est por dems asegurada. El proceso de esporulacin comienza durante la fase de desarrollo estacionario luego de la falta de ciertos nutrientes, una vez que se inicia el proceso este es irreversible y una enorme cantidad de cambios metablicos comienzan dentro de la clula con la produccin y almacenamiento de enzimas y protenas distintas a las de la forma vegetativa, que luego formarn parte del esporo. El factor desencadenante est constituido por la carencia de fuentes de Carbono y Nitrgeno, concretamente la falta de concentraciones adecuadas de trifosfato de guanosina (GPT) intracelulares inicia la esporulacin y se sabe que todas las deficiencias nutricionales que conducen a una disminucin del pool

ESPOROS Algunas especies de anaerobios (bacilos Gram positivos del Gnero Clostridium) poseen la capacidad de esporular, esto es, producir esporos. Se trata de estructuras biolgicas genticamente iguales a su antecesor vegetativo, metablicamente inactivos y altamente resistentes a condiciones medioambientales adversas (Temperatura, humedad, radiaciones UV, agentes qumicos). La germinacin de los esporos conduce a la forma vegetativa de la bacteria y puede suceder, en algunos casos luego de varios aos. La resistencia de los esporos a altas temperaturas -120C hasta 15 minutosdesecacin, falta de nutrientes, presencia de sustancias qumicas antispticas, radiaciones. La resistencia al calor se explica por los escasos porcentajes de H2O en su constitucin (proceso de desecacin paulatino del esporo en la maduracin) y la presencia de Calcio y cido dipicolnico como agentes quelantes, mientras que la resistencia a los otros agentes fsico/qumicos estara dada por lo menos en parte por la presencia de protenas

de GPT desencadenan la esporulacin. Dos tipos de carencias son conocidas como responsables de la disminucin del GPT: 1. Disminucin del precursor purnico Pribosil-PP, que ocurre cuando hay carencias de Carbono. 2. La carencia de aminocidos la cual se relaciona con el aumento de nucletidos fosforilados de guanina, ppGpp y pppGpp. La germinacin de los esporos comprende 3 etapas: a. ACTIVACIN: La activacin es esencial para el proceso de la germinacin y un esporo activado germina en forma irreversible. Activan los esporos el calor y algunos estmulos qumicos. b. GERMINACION: Esta etapa comienza cuando los esporos activados son estimulados por variados elementos nutritivos y no nutritivos (l-alanina, el ms comn,) glucosa, otros aminocidos. Cambios morfolgicos y fisiolgicos muy interesantes se producen cuando finaliza el estado latente; el esporo se hincha, pierde su refringencia, pierde su resistencia a los agentes fsico-qumicos y comienza a observarse actividad metablica. c. CRECIMIENTO: En esta etapa se produce la sntesis proteica y de los componentes estructurales de la futura forma vegetativa. La membrana del 'core' del esporo se ir convirtiendo en pared celular y la actividad proteica se ir intensificando. En este momento toda esta actividad puede anularse o interferirse por Antibiticos, o carencias de nutrientes. Por su especial constitucin los esporos no se tien con el Gram aunque existen tcnicas especiales que permiten ponerlos en evidencia. Si se tie una bacteria esporulando mostrar el esporo en su interior (debemos recordar que cuando el esporo finaliza su maduracin la forma vegetativa se desintegra) como una imagen en negativo -ausencia de colorante-. La ubicacin de los esporos dentro de los bacilos as como su tamao contribuyen a la identificacin bacteriana. De esta manera podemos distinguir a los esporulados segn: Ubicacin: esporos medianos, subterminales, terminales. Tamao : con deformacin o no del cuerpo bacteriano. FACTORES DE VIRULENCIA Se pueden separar en 2 categoras segn su importancia. Por un lado existen las poderosas toxinas producidas por los Clostridios; por otro, una serie de estructuras y sustancias de mucho menor poder patgeno que se observan en varias especies de no esporulados. Se conocen los lipopolisacridos de superficie en varias

especies de Fusobacterium, Veillonella y Bacteroides. Estas sustancias tienen una actividad "endotoxina" similar a las de los bacilos Gram negativos facultativos. Su actividad es algo menos potente pero se ha demostrado su capacidad (en Bacteroides) de participar en la produccin de abscesos y de causar hipercoagulabilidad. El polisacrido capsular de los Bacteroides del grupo fragilis es otro factor de virulencia importante, ya que se comporta en forma similar a las Cpsulas de otras bacterias, es decir, le confiere al germen "la lanza y el escudo" en cuanto favorece su poder invasivo y dificulta la accin defensiva de los leucocitos polinucleares. Aun ms, est claramente demostrada su participacin en la formacin de abscesos causados por Bacteroides. Diversas enzimas de los anaerobios deben considerarse como factores de virulencia: colagenasa, hialuronidasa, DNAsa, elastasa, heparinasa, son las principales. Tambin deben incluirse aquellas enzimas que protegen contra la accin letal del O2 tales como Catalasa y Superxidodismutasa en cuanto permiten la sobrevida del germen en ambiente no apropiado hasta que se presenten las condiciones favorables. Estos factores de virulencia no deben considerarse como "toxinas". LAS TOXINAS Corresponde a las potentes exotoxinas producidas por los Clostridios las cuales sern analizadas con estos microorganismos. GENETICA DE INTERES EN LOS ANAEROBIOS Elementos extra cromosmicos: Plsmidos. Los Plsmidos estn ampliamente difundidos entre los anaerobios especialmente a nivel de especies de Clostridium y Bacteroides. Un muy buen porcentaje de estos elementos no han demostrado funciones especficas. Entre los Plsmidos funcionalmente conocidos encontramos: a. Plsmidos que codifican la producin de Bacteriocinas. Similares a las Colicinas estas sustancias las poseen especies de Clostridium y Bacteroides. b. Plsmidos toxignicos. Ampliamente distribuidos entre las especies de Clostridium productoras de exotoxinas (toxignicas). La correlacin fehaciente entre plsmido y produccin de toxina no se ha podido establecer en muchos casos. El caso con ms evidencias de la relacin plsmido-toxina para Clostridium tetanii donde puede afirmarse que la produccin gentica de toxina tetnica est codificada por un Plsmido.

c. Plsmidos que codifican la resistencia a los ATB. Existen evidencias de que entre diferentes especies de Clostridium, Bacteroides y Cocos anaerobios existen plsmidos de diferente tamao que codifican la resistencia a Macrlidos (Clindamicina, Eritromicina) Tetraciclinas y Cloramfenicol. RECOLECCION DE MUESTRAS Teniendo en cuenta que los anaerobios pueden causar o contribuir a la infeccin de cualquier tipo y en cualquier lugar del organismo, parece claro que se debe procurar siempre una muestra libre de contaminacin con Flora Normal para tener resultados verdaderamente positivos. Las muestras siguientes habitualmente estn contaminadas con anaerobios de la Flora Normal y por lo tanto no deben ser cultivadas en anaerobiosis. Exudados de garganta, nasofarngeos, bucales. Esputo tosido o aspirado va oral/nasal. Contenido gstrico e intestinal (salvo excepciones). Materias fecales (salvo excepciones). Orina obtenida por sonda o espontneamente. Exudados vaginales y cervicales. Una recoleccin de muestra adecuada debe evitar siempre la ms mnima contaminacin con flora normal (donde en algunos casos la proporcin de individuos anaerobios es de 1000 a 1 por aerobio). Los mtodos de recoleccin ms adecuados se pueden resumir de la siguiente manera: LUGAR PULMON Procedimiento Puncin Transtraqueal (PTT) percutnea. Puncin Pulmonar Transparietal (PPTP). Lavado Bronquial con Cepillo Protegido. Toracocentesis. Puncin Suprapbica (PSP) percutnea. Aspiracin con aguja y jeringa en abs. cerrados. Igual en abiertos; evitar hisopados de material al aire, puncionar lateralmente. Obtencin por culdocentesis previa desifeccin vaginal con yodoforos. Cepillo protegido de uso bronquial. Aspiracin con jeringas y catter plstico previa desinfeccin, curetajes, biopsias.

EL POR QUE DE LA INUTILIDAD DE ALGUNAS MUESTRAS La expectoracin no sirve porque el esputo se contamina con la flora anaerobia normal de la faringe y la boca en su pasaje al exterior; igualmente pasa con el esputo obtenido por fibroscopa o los aspirados nasotraqueales ya que el tubo arrastra en su introduccin flora normal en su extremo distal. La orina emitida espontneamente o con sonda se contamina por la colonizacin natural de la porcin distal de la uretra y el meato o por la colonizacin de la sonda. Si existen catteres suprapbicos o renales pueden utilizarse para tomar la muestra con resultados aceptables. La endometritis presenta serias dificultades. En estos casos los anaerobios casi constantemente estn involucrados en la etiologa de estas infecciones y estos grmenes como siempre sucede son los mismos de la flora normal (vaginal o cervical). Como la mayora de las endometritis suceden al nacimiento o a los abortos se encuentran en el endometrio cantidades significativas de anaerobios. TRANSPORTE DE MUESTRAS Otro factor crucial para el xito en el aislamiento de anaerobios es el transporte de muestras. Se debe proteger a los microorganismos de los efectos del O2 durante el tiempo que transcurre entre la extraccin y la siembra anaerbica. El primer y ms efectivo sistema es "correr" ya que en ninguna otra ocasin como esta el envo inmediato al Laboratorio es tan fundamental. Las muestras deben ser colocadas en un sistema de transporte que asegure la anaerobiosis. Existen tubos, comercialmente disponibles en los que se ha sustituido de aire por otro gas ("Tubos gaseados") y que contienen un indicador de anaerobiosis. En casos de extraccin de material con aguja y jeringa, si la demora no supera los 30 minutos puede enviarse el material en la misma jeringa expulsando el aire residual y obturando la aguja con un tapn de goma. Existen para perodos prolongados tubos con medios de transporte adecuados o bolsas plsticas con sistemas de anaerobiosis qumica. Los lquidos purulentos espesos (Abscesos, Empiemas) se comportan como medios de transporte 'per se' por su propia constitucin y hemos podido recuperar anaerobios hasta 24-48 despus de realizada la extraccin. METODOS DE CULTIVO Los cultivos incluyen el uso de Jarras anaerbicas, bolsas plsticas, el mtodo PRAS de Hungate y la

PLEURA TRACTO URINARIO ABCESOS

GENITAL FEMENINO TRACTO SINUSAL

Cmara de anaerobiosis o "cmara de guantes". Los dos ltimos mtodos son muy caros, requieren equipamiento complejo, son lentos y se usan para estudios de Flora Normal y en laboratorios altamente especializados. Desde el punto de vista prctico las Jarras pequeas y los sobres o bolsas son equiparables en rendimiento a los ms sofisticados y son aceptables para los estudios de anaerobios de inters mdico. Con estos sistemas son posibles los cultivos en medios slidos para la obtencin de aislamientos que permitan la identificacin bacteriana. El uso de medios lquidos en forma exclusiva no es recomendable (salvo para hemocultivos) ya que la mayora de las infecciones por anaerobios son polimicrobianas incluyendo facultativos o microaerfilos. Medios lquidos (slo para hemocultivos) Existen varios medios comercialmente disponibles. Algunos contienen (SPS) sodium polyanetol sulfonate el cual estimula el desarrollo de los anaerobios, aunque al parecer sera inhibidor para Peptococcus anaerobius. Se trata de frascos de 100 ml, al vaco, con el agregado de CO2, una base nutritiva (digerido trptico de soja o peptonas) y un agente reductor (thiol o thioglicolato). El por-centjae de sangre a inocular es del 5 al 10 % v/v. Los frascos se examinan diariamente buscando turbidez, hemlisis o gas; se consideran negativos definitivamente a los 10 das de incubacin previos subcultivo final. Jarras de Anaerobiosis Existen varias marcas comerciales de jarras con performance aceptable para generar atmsfera de anaerobiosis. El fundamento del sistema ms utilizado (Gas Pak)- se basa en: 1. La generacin de H2 y CO2 por medio de una reaccin qumica cuyos sustratos se encuentran separados en un sobre al cual se le agrega agua, desencadenando la reaccin. 2. La combinacin del H2 y el O del aire para formar agua generan la anaerobiosis, esta reaccin se cataliza utilizando granallas de Zinc recubiertas de Paladio las cuales se encuentran depositadas en una canastilla dentro de la jarra. Una tirilla de papel impregnada en Azul de metileno (azul en presencia de O2, incoloro en ausencia) introducida en la Jarra es el indicador de Anaerobiosis. Sobres de Anaerobiosis El sistema BioBag consiste en una bolsa plstica transparente, gas impermeable, una ampolla de indicador de anaerobiosis (resarzurina) y una ampolla generadora de anaerobiosis. Una o 2 placas de Petri pueden introducirse antes de sellar la bolsa mediante un sellador plstico por calor. Luego se rompen las ampollas de indicador y generador. Los grmenes crecen y se mantienen viables por lo menos una semana. Este sistema tiene las ventajas de su economa y practicidad,

adems de poder observar directamente si existe crecimiento sin abrir el Sistema; tambin se puede utilizar para los sistemas de identificacin tipo API-20A. SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIBITICOS La antibioticoterapia de las infecciones por anaerobios es habitualmente emprica ya que los cultivos y el aislamiento son lentos y dificultosos. Por otra parte, las pruebas de sensibilidad realizadas en los laboratorios Clnicos no dan resultados confiables. De manera pues, que nos debemos guiar por las pruebas realizadas en los laboratorios de Referencia Internacionales que aportan datos sobre sensibilidad que permiten predecir con un nivel razonable de seguridad cuales son los Antibiticos de eleccin para cada germen. Las pruebas de sensibilidad se realizan de forma similar a las de grmenes aerobios. Existe una prueba de dilucin en Caldo que permite establecer CMI y CMB; el Test de Dilucin en Agar (muy til para realizar estudios de varias Cepas) en donde el Antibitico se incorpora al Agar en diluciones sucesivas en placas de Petri. IDENTIFICACION DE LOS ANAEROBIOS Los anaerobios se presentan corrientemente en cultivos mixtos con otras especies sea anaerobias, micoraerfilas o facultativas. El primer paso es pues, la observacin de las colonias y su correspondiente Gram para establecer distintas especies las cuales sern subcultivadas para establecer aerotolerancia "aire, CO2 y anaerobiosis". Informacin complementaria puede obtenerse observando las placas de Petri bajo luz UV para determinar la fluorescencia de las colonias. En las placas de Subcultivos (con medios ricos, selectivos y/o diferenciales) segn la sospecha de Gnero pueden agregarse Discos de Vancomicina 5 g, Kanamicina 1000 g, Coilistin 10 g , SPS y NO3, los cuales aportan datos para la identificacin preliminar. En el diagrama siguiente se esquematizan los pasos a seguir: Cultivo en placa Realizar: Gram Indol Catalasa Test de NO3

Registrar: ! ! ! ! !

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Morfologa de colonias ! ! Pigmento ! Hemlisis Fluorescencia ! Susceptibilidad a: Vancomicina Kanamicina Colistin SPS Actividad lipasa Actividad lecitinasa

La mayora de los Laboratorios deben conformarse con la realizacin de los Tests de Identificacin preliminares. La identificacin final queda reservada para los laboratorios de Referencia y comprende: Estudios de fermentacin de azcares y estudio de los productos finales del metabolismo los cuales pueden agruparse en: cidos grasos voltiles y alcoholes. Metabolitos no voltiles. cido frmico. Produccin de Hidrgeno. Estos estudios se realizan utilizando la Cromatografa Gas-lquida. ANAEROBIOS NO ESPORULADOS DE INTERES MEDICO Bacilos Gram negativos Bacteroides fragilis vulgatus ovatus thetaiotamicron distasonis ureolyticus gracilis Bacteroides Estas especies del gnero (fundamentalmente fragilis, de alta proporcin en flora intestinal) se asocian con infecciones anaerobias subdiafragmticas y genitales (por su vecindad con la porcin final del aparato digestivo y regin perineal), y con las sepsis al punto de partida de estas infecciones. Todos los miembros del gnero son resistentes a Penicilinas (por Betalactamasas) y Cefalosporinas -con alguna excepcin-. La morfologa es de coco-bacilos pleomrficos, pequeos, Gram negativos. En los cultivos se presentan como colonias pequeas, bajas, brillantes. El desarrollo se estimula por la adicin de Bilis a los medios, lo cual permite el aislamiento selectivo para estos grmenes. Poseen antgenos proteicos y lipopolisacardicos pero lo caracterstico es la Cpsula. Su poder patgeno radica en la actividad endotoxina smil de sus Ag. de membrana y del polisacrido capsular. Existen descripciones de cepas productoras de enterotoxinas capaces de dar enfermedades diarreicas en el hombre y animales. Prevotella melaninognica buccae oris bivia corporis dentcola intermedia Estos bacilos de similares caractersticas a los

Bacteroides se ha reclasificado, ya que anteriormente se agrupaban como Bacteroides y subespecies de los mismos. Las cepas con produccin de pigmento negro a marrn en los medios de cultivo son fcilmente identificables y son miembros de flora normal de boca y vas respiratorias superiores y partes blandas subyacentes. Algunas cepas (menos del 20 %) son productoras de penicilinasas, pero en general son sensibles a este antibitico. La Prevotella bivia prevalece en flora vaginal y produce vaginosis e infecciones de origen obsttrico. Porphiromonas asacaroltica gingivalis endodontalis Flora normal de boca y encas (gingivalis y endodontalis) y flora intestinal (asacaroltica) producen infecciones relacionadas con su habitat. Su morfologa vara desde los cocobacilos hasta formas alargadas. Las colonias son convexas, lisas y pigmentan con el tiempo, algunas veces se observa beta hemlisis. La vitamina K estimula el desarrollo de estos grmenes. Fusobacterium mortiferum nucleatum necrophorum Miembros de flora normal de bucofaringe (nucleatum) y flora intestinal su morfologa es caracterstica; bacilos largos con extremos acintados o filamentos delgados. Algunos (necrophorum) pueden ser ms abultados en su sector medio. Producen alfa y beta hemlisis en los cultivos y las colonias son translcidas de forma varias a veces irregulares. Fusobacterium nucleatum es el ms comn en infecciones del aparato respiratorio, mientras que necrophorum se lo asla de infecciones subdiafragmticas. Son habitualmente sensibles a las Penicilinas y su poder patgeno se establece por la presencia de lipasa y leucotoxinas. Bacilos Gram positivos Actinomyces israelii naeslundii bovis odontolyticus viscosus Se trata de bacilos Gram positivos largos y ramificados, delgados y delicados, bajo ciertas circunstancias, frotis o cultivos pueden fragmentarse simulando bacilos del tipo difteroides. De variada aerotolerancia, israelii (el patgeno de inters mdico ms importante) y bovis son los menos

tolerantes al Oxgeno; aunque las cinco especies crecen mejor en presencia de CO2, las otras especies deben considerarse facultativos. Miembro de flora normal bucal (Actimomyces israelii) se relaciona con una entidad Clnica conocida como Actinomicosis la cual tiene varias manifestaciones clnicas que veremos ms adelante. El poder patgeno no est determinado con claridad; las infecciones se ven favorecidas por un traumatismo o por alguna otra disminucin de las barreras defensivas locales. ACTINOMICOSIS CERVICOFACIAL Constituye aproximadamente el 50% de los casos de actinomicosis. Secundario a caries o enfermedades odonto-periodontales el germen atraviesa (por traumatismo) la mucosa bucal intacta conduciendo en su forma tpica a un proceso inflamatorio de regin maxilar inferior con compromiso seo (osteomielitis maxilar). Si la enfermedad progresa se abre una fstula al exterior evacundose el pus al exterior. El diagnstico etiolgico se realiza evidenciando la presencia de "grnulos de azufre", material granulomatoso con colonias de microorganismos y filamentos ramificados al Gram. ACTINOMICOSIS TORACICA Por aspiracin del agente o por extensin de lesiones crvicofaciales puede producirse enfermedad pulmonar de tipo subagudo, febril, con tos y expectoracin purulenta. La progresin de la enfermedad conduce a cavitacin pulmonar, con fistulizacin al exterior a travs de la pared torcica pudiendo interesar costillas y vrtebras. ACTINOMICOSIS ABDOMINAL Como consecuencia de una perforacin intestinal, la enfermedad se desarrolla lentamente generando signos y sntomas segn el rgano abdominal afectado. Es posible la extensin vertebral y la fistulizacin al exterior. ACTIMOMICOSIS GENITAL Se ha descrito infeccin en mujeres que utilizan dispositivos intrauterinos con sintomatologa escasa y sin presencia de grnulos. Principales caractersticas bioqumicas de Actinomyces israelii. Req. de Oxgeno: Anaerobio Eubacterium lentun nodatum timidum brachy De lento desarrollo en cultivos y aerotolerancia muy amplia, estos pequeos bacilos tienen su hbitat en boca

y vas respiratorias superiores, E. lentum forma parte de la flora intestinal. Las infecciones estn relacionadas con la vecindad de su hbitat produciendo infecciones odontolgicas, de cabeza y cuello, y aparato genital femenino. Propionobacterium acnes granulosum Integrantes de flora normal de piel, fundamentalmente, de escaso poder patgeno se los asla como contaminantes de hemocultivos y procesos de piel. P. acnes deben su nombre al relacionarlo con el Acn. Bacilos, a veces ramificados, pueden confundirse con Actinomyces, a veces pleomrficos y cortos se los confunde con Difteroides. Lactobacillus Mltiples especies asociadas con la flora normal de boca y en gran cantidad en flora vaginal, poseen un poder patgeno mnimo; se trata de bacilos largos, Gram positivos netos, de bordes paralelos y extremos rectangulares. Mobiluncus mulieris curtisii Estas especies de bacilos Gram positivos inestables, eran conocidos como Bacilos Anaerobios curvos que se aslan de vaginitis inespecfica; de lento crecimiento son difciles de cultivar y su participacin en infecciones se puede sospechar por una buena microscopa. Bifidobacterium Miembros de flora normal de boca y tractogastrointestinal, hay varias especies; de escaso poder patgeno deben su nombre a la morfologa del Gram que les de su nombre. Cocos Gram positivos Peptoestreptococos anaerobius magnus asaccharoliticus tetradius prevotti A pesar del nombre del Gnero la morfologa de estos grmenes incluye formas en pares, ttradas, racimos, y cadenas. Un estudio microscpico cuidadoso muestra a estos cocos con tamao irregular y alguna decoloracin parcial, lo que permite diferenciarlos de sus similares aerobios. Forman parte de la flora de la boca, intestino y genitales. Se encuentran involucrados en infecciones pleuropulmonares, abscesos, infecciones ginecolgicas, sinusitis. Casi constantemente son

sensibles a los betalactmicos. Cocos Gram Negativos Veillonella parvula Pequeos cocos Gram negativos en diplos o cadenas cortas y racimos, miembros de flora bucal intestinal y genital, se asla de materiales Clnicos, pero es dudoso y desconocido su poder patgeno. BACILOS GRAM POSTIVOS ESPORULADOS Los Clostridium son bacilos Gram positivos, esporulados, anaerobios estrictos, salvo alguna especie con mayor aerotolerancia. Los patgenos son productores de poderosas exotoxinas las cuales por s mismas provocan todos los sntomas y signos de las infecciones. Dentro del Gnero podemos separar 4 grandes grupos. 1. Clostridios histotxicos (especies ms comunes) Clostridium perfringens septicum histoliticum novyi sordelli fallax bifermentans Dentro de este grupo la especie ms importante es perfringens, (80 a 90%) por lo que nos referiremos fundamentalmente a esta especie. Este grupo de grmenes causa infecciones muy severas caracterizada por una mionecrosis, infeccin clsicamente conocida como gangrena gaseosa; (debemos tener en cuenta que la presencia de gas en infecciones de partes blandas no siempre significa mionecrosis. Todos estos clostridios producen exotoxinas de diferente potencia que veremos ms adelante. El clostridio ms frecuente (C. perfringens) posee cinco tipos diferentes, del A al E, los cuales producen 4 tipos de toxinas letales clasificadas como: alfa, beta, epsiln y theta. El tipo ms comn de inters mdico es el tipo A que produce la alfatoxina y algunas otras toxina de menor poder (omega, kappa, micrn). C. perfringens tipo A se halla como flora normal del hombre y los animales aunque en estos no es frecuente causa de enfermedad. Lo contrario sucede con los otros tipos de clostridios. Morfologa y tincin Bacilo netamente Gram positivo corto y grueso de bordes redondeados, con formas hasta cocoides. De los frotis directos de muestras clnicas destacamos que no se observan esporos y que la clulas que componen un frotis de material clnico se encuentran ausentes (debido a la intensa citlisis txica). Cuando en cultivos vemos

formas esporulando, los esporos medianos o subterminales no deforman el soma vegetativo. Fisiologa y cultivo Anaerobio aerotolerante, de fcil recuperacin, de crecimiento rpido en Agar sangre, es el nico inmvil de los clostridios patgenos, no esporula en medios comunes, desarrolla en pH variable y temperaturas de 20 a 50 grados. En 24 horas de incubacin produce colonias de 2 a 4 mm con formas lisas a rugosas. Se puede ver una hemlisis doble, una estrecha betahemlisis producida por la alfa toxina y una zona ms amplia de hemlisis incompleta producida por la toxina omega. Desarrolla abundantemente en medios con glucosa y carne picada o medios con leche, produciendo abundante gas e intensa fermentacin (ferment. lactosa >acidificacin ->coagulacin de la casena ->rotura del cogulo por la produccin de gas). La produccin de alfa-toxina se puede realizar colocando suero humano en presencia de un sobrenadante de cultivo el cual produce una opalescencia clara del mismo (Reaccin de Nagler), o alternativamente sembrando Agar con yema de huevo el cual se torna opalescente. La adicin de la antitoxina especfica se usa como contraprueba, sea en placas o en la prueba del suero. La siembra directa de materiales en Agar yema de huevo (media placa con antoxina) permite determinar en pocas horas la presencia de C. perfringens en muestras clnicas. La opalescencia del suero y la yema de huevo se deben a que la alfa-toxina es qumicamente una lecitinasa. Estructura antignica - Toxinas C. perfringens del tipo A produce por lo menos 12 sustancias de naturaleza proteica de poder antignico, 4 de ellas toxinas, de las cuales la alfa es la ms poderosa. Esta toxina se define como dermonecrtica-letal y hemoltica. Qumicamente es una lecitinasa C - o fosfolipasa C- que degrada la lecitina. La activacin de la toxina es dependiente de los iones Ca++ y Mg++. De alto poder antignico, los Ac. antitoxina son los nicos que pueden neutralizar el efecto de la misma. La alfatoxina acta sobre lipoprotenas que contienen lecitina en la membrana celular y en las mitocondrias. La accin necrtica tisular es evidente, no as las acciones a nivel sistmico. Otras sustancias antignicas de menor poder txico son importantes auxiliares en la diseminacin de la enfermedad. Clostridium septicum Flora normal intestinal de hombre y animales, mvil pertrico, es productor de alfa-toxina y se encuentra asociado en el 10% de los casos de mionecrosis o sepsis de origen endgeno. Clostridium histoliticum Flora normal del hombre y los animales, aerotolerante productor de alfa-toxina y beta-toxina. Esta ltima es una protena con actividad enzimtica (colagenasa) que destruye las fibras del colgeno.

Clostridium novyi Existen tres tipos A B y C. Se trata de bacilos grandes, mviles pertricos con esporas subterminales. 2. Clostridios enterotoxignicos C.perfringens tipo A. --> Intoxicacin alimentaria Este germen productor de una enterotoxina (detallada en otro Captulo) produce una intoxicacin alimentaria de tipo leve. Los sntomas de la enfermedad dependen de la accin de la enterotoxina sobre la mucosa intestinal, la misma es producida cuando alimentos contaminados con esporos son calentados para su coccin y la germinacin y posterior multiplicacin acumula toxinas. C. prefringens tipo C. --> Enteritis necrotizante Se trata de una enfermedad mucho ms severa que la anterior, pudiendo ser letal. Los sntomas de la enfermedad son ocasionados por la beta-toxina producida por estos grmenes. C. difficile --> Enterocolitis seudomembranosa Se trata de una especie anaerobia estricta, miembro de flora normal intestinal humana, y se han descrito seis serogrupos en relacin con su toxicidad. C. difficile produce 2 toxinas: una toxina B citotxica y una toxina A, enterotoxina potente; ambas son las determinantes de la enfermedad. En ciertas circunstancias el origen de la enfermedad es endgeno y su causa es, por una intensa antibiticoterapia, en especial con Clindamicina. Al parecer los ATB al eliminar la flora normal permitiran un hiperdesarrollo de C. difficile. 3. Clostridium tetani TETANOS C. tetani es el agente productor del Ttanos, descubierto en 1889 por Kitasato. Morfologa Bacilo Gram positivo, delgado, de 3 a 8 m de longitud, mvil pertrico, posee tendencia al Gram negativo en cultivos viejos y materiales clnicos, con esporos terminales que deforman el soma bacteriano dndole una forma caracterstica de raqueta o palillo de tambor. Cultivos Anaerobio obligado, algo exigente, temperatura ptima de crecimiento a 37C, pH ptimo 7.4. Las exigencias nutritivas son cubiertas por el agregado de sangre o carne cocida, produce una betahemlisis dbil, no fermenta hidratos de carbono. Los esporos resisten 20 minutos a la ebullicin y una esterilizacin segura requiere auto-clave (121C, 15 min.) Antgenos Posee antgenos H flagelares (10 tipos), O somticos y en los esporos. Poder patgeno Todos los sntomas de la enfermedad son atribuibles

a la produccin de una poderosa toxina: ttanoespasmina. La toxina, intracelular y liberada por autlisis, es una protena TERMOLABIL que se inactiva por calentamiento -60C durante 20 minutos- o por formaldehdo, esta propiedad es de extraordinaria importancia ya que si bien la toxina pierde su poder patgeno, no pierde su poder antignico transformndose en toxoide, el cual confiere una excelente inmunidad a los sujetos inoculados. Qumicamente es una cadena polipeptdica de pm 150 kdalton, que posee tres subunidades A, B y C. Al momento de su liberacin existe un clivaje, al parecer por las proteasas bacterianas, quedando dos subunidades A y BC unidas por un puente disulfuro. La toxina tetnica es una de las toxinas ms poderosas que existen, en especial para el hombre y los animales. Mecanismo de accin de la toxina tetnica Con exclusivo sitio de accin a nivel de Sistema Nervioso (regiones A y BC con afinidad para receptores ganglisidos) es capaz de actuar a distancia por el siguiente mecanismo. Una vez fijada al receptor celular la toxina ingresa a la clula por endocitosis y se mueve por va retrgrada a travs de los axones. Entonces la toxina interfiere la transmisin sinptica inhibiendo la liberacin de neurotrasmisores inhibitorios tales como la Glicina, de las neuronas inhibitorias. Los efectos estmulo-inhibicin de las neuronas motoras son desbalanceados causando una rigidez muscular. Esta se manifiesta en los msculos ms fuertes: maseteros (trismus) flexores de extremidades superiores y extensores de extremidades inferiores y tronco (opsittonos). La contaminacin Los esporos de C. tetani se hallan ampliamente distribuidos en el suelo y medio ambiente, las formas vegetativas son flora normal de hombre y animales, especialmente equinos. Una herida contaminada con esporos de C. tetani es la puerta de entrada del germen. Estas heridas deben poseer un contexto especial de necrosis o de sustancias necrotizantes (bajos Eh.); en general se trata de heridas punzantes, cuerpos extraos como astillas, espinas, etc. Existe una forma muy temida de ttanos que es el ttanos neonatal, provocado por el corte del cordn umbilical con instrumentos contamindos. La Clnica Luego de un perodo de incubacin variable 4 a 10 das se desarrolla la enfermedad que puede ser localizada, con espasmos musculares de msculos adyacentes a la herida o, con mayor frecuencia, generalizada. Los sntomas son todos aquellos provocados por la contraccin espstica muscular con afectacin de los msculos respiratorios, alteraciones cardiovasculares y muerte.

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El Diagnstico El diagnstico es Clnico ya que es muy difcil el aislamiento bacteriolgico; apenas unos pocos grmenes que produzcan nfimas cantidades de toxina son suficientes para desencadenar el proceso. La inmunidad y la prevencin La enfermedad no confiere inmunidad ya que la cantidad de toxina que desencadena los sntomas no es lo suficientemente grande como para activar el Sistema Inmunitario. La prevencin se logra con la inmunizacin activa de toda la poblacin a partir de los 3 meses de edad utilizando el Toxoide tetnico. Confiere una proteccin del 100% en inmunocompetentes y es inadmisible no estar correctamente inmunizado. La inmunizacin pasiva con gamma globulinas hiperinmunes de donantes se utiliza como coadyuvante en la enfermedad y como proteccin pasiva en sujetos no vacunados con heridas tetangenas. 4. Clostridium Botulinum BOTULISMO La enfermedad del botulismo data desde 1870 para describir una intoxicacin alimentaria mortal por ingestin de salchichas (latn, botulus = salchicha). En realidad mltiples alimentos conservados pueden provocar la intoxicacin. En la poca actual el empleo de autoclaves y mtodos modernos de esterilizacin hacen que los productos comerciales enlatados hayan perdido el protagonismo quedando el riesgo reducido a la manufactura casera de enlatado de carnes, pescados y vegetales. Aun as la coccin de los enlatados destruye la toxina botulnica por lo cual slo existe riesgo en aquellos alimentos a consumirse directo de la lata sin previa coccin. Morfologa El C. botulinum es un bacilo Gram postivo recto, con extremos redondeados, mvil pertrico, produce esporos resitentes al calor, subterminales que deforman algo el soma bacteriano. Cultivos Anaerobio estricto, desarrolla en medios con sangre, produciendo colonias betahemolticas, bastante exigente en cuanto a requerimientos nutritivos, fermentan la glucosa. Los esporos son muy resistentes al calor, a las radiaciones y a los agentes qumicos. Estructura antignica De composicin compleja y bastante indefinida no existen antgenos en las clulas vegetativas que resulten de importancia. Segn el tipo de exotoxina producida se han descrito 8 tipos serolgicos A al G. Tienen importancia epidemiolgica ya que, excepto los tipos C y D, el resto produce un solo tipo de toxina. El poder patgeno

La patogencidad est dada exclusivamente por la exotoxina que habitualmente es producida fuera del organismo, al punto que ms que una infeccin se debera considerar como intoxicacin o envenenamiento. La toxina botulnica y su mecanismo de accin La toxina se genera incubando los grmenes entre 25 a 38C a un pH de aproximadamente 7. Si bien es considerada una exotoxina, se libera cuando se produce la lisis de la bacteria. Su dosis letal es tan poderosa que un g (milsima de mg) contiene 200.000 dosis letales para un ratn de 20 gr y se acepta que apenas unos gramos seran capaces de eliminar toda la humanidad. De naturaleza proteica, al igual que la tetnica, se trata de una cadena polipeptdca de 150kda con tres regiones A, B, y C de baja toxicidad, que cuando son clivadas se forman dos cadenas, una pesada y una liviana unidas por puentes disulfuro y con marcada actividad txica. Existen 8 tipos de toxina antignicamente distintos, genticamente dirigidos por bacterifagos. La toxina botulnica es ingerida y sortea la barrera digestiva aparentemente protegida por otras protenas con las cuales forma complejos, ms aun, de hecho las proteasas digestivas activan la toxina. A diferencia de la toxina tetnica, la toxina botulnica afecta las terminaciones nerviosas perifricas. Una vez que atraves la barrera intestinal, llega va hematgena a las uniones neuromusculares, provocando un bloqueo presinptico de la liberacin de acetilcolina. La interrupcin de la estimulacin nerviosa provoca una parlisis flccida irreversible conduciendo a la muerte por parlisis de los msculos respiratorios. Tipos de intoxicacin botulnica Existen 4 formas de botulismo. a. Botulismo alimentario. Forma clsica letal por ingestin de la toxina producida en alimentos conservados mal esterilizados. b. Botulismo infantil. Se trata de la ingestin de esporos por los lactantes (clsico chupete con miel) con multiplicacin de los Clostridios en el intestino con produccin de toxina en la luz intestinal y posterior absorcin. c. Botulismo de las heridas. Forma muy rara a partir de heridas infectadas. d. Botulismo no determinado. En mayores de un ao que padecen la enfermedad sin hallarse ningn vehculo aparente. La Clnica Con un perodo de incubacin corto (12 a 24 hs), dependiendo de la cantidad de toxina ingerida, se producen los signos toxo-dependientes: debilidad, lasitud, visin borrosa y doble, disfagia y disfona. Con el progreso de la enfermedad otros grupos musculares son afectados entre ellos los respiratorios. El diagnstico Es fundamentalmente Clnico, pudiendo confirmarse

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la intoxicacin con el estudio de los alimentos o restos de alimentos ingeridos para buscar toxina botulnica. La prevencin La prevencin de esta enfermedad pasa por evitar la fabricacin y consumo de alimentos "en forma Casera" si no existe seguridad de la perfecta esterilizacin. En cuanto a alimentos de origen comercial las severas normas bromatolgicas hacen casi imposible la contaminacin; si no existe esa certeza deber siempre calentar los alimentos a la ebullicin durante unos minutos. Respecto al botulismo del lactante se evitarn los alimentos posiblemente contaminados.

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