DETERMINACION DE GLUCOSA. Material biolgico. 0.1ml de suero o plasma.

fundamento: la ortotoluidina es una amiba aromtica primaria que en cido aceico reacciona con las aldohexosas para formar un complejo verde azuloso, estable de intensidad proporcional a su concentracin. Reactivos. Reactivo de ortotoluidina 3 frascos con 230ml c/u Patrn de glucosa 1mg/ml 1 frasco con 20ml. El patrn de la glucosa 3mg/ml, para curva de calibracin, se surte sobre pedido, en frasco con 18ml. Consrvese en refrigeracin (entre 2C y 8C ). Procedimiento. Pipetear en un tubo de ensayo: Blanco testigo problema Agua 0.1ml Patrn de glucosa 1mg/ml 0.1ml Suero problema 0.1ml Reactivo de ortotoluidina 5.0ml 5.0ml 5.0ml Mezcla y colcalos en bao de agua a ebullicin durante 8 min. El nivel del agua en el bao debe de ser superior al nivel de los reactivos en los tubos. Sacar los tubos del bao y enfriar inmediatamente con agua fra corriente. Leer a longitud de onda de 630nm o con el filtro correspondiente (rojo) ajustando 100% de transmitancia o cero de absorbancia con el blanco de reactivo. El color es estable 20 min. Convertir la lectura a su concentracin por calculo o con la curva de calibracin. Valores normales Suero o plasma: 70 a 100mg de glucosa/100ml.

NOTA: la curva de calibracin es la lineal hasta concentraciones superiores a 1000mg/100ml. DETERMINACIN DE UREA. Material biolgico 0.1ml de suero o plasma. Fundamento. La ureasa hidroliza a la urea transformndola en bixido de carbono y amoniaco que reacciona con el fenol en presencia de hipoclorito alcalino y produce un color azul de intensidad proporcional a su concentracin. Reactivos. Ureasa liofilizada 1 frasco con 0.0038g para 20ml. Una vez reconstituida es estable un mes en refrigeracin. Reactivo de fenol 1 frasco con 230ml. Reactivo de hipoclorito alcalino 1 frasco con 230ml. Patrn de urea 1mg/ml 1 frasco con 20ml Consrvese en refrigeracin (entre 2C y 8C). Procedimiento: Diluir cuidadosamente el problema 1:10 con agua destilada. pipetear en un tubo de ensayo: BLANCO TESTIGO PROBLEMA Agua 0.2 patrn de trabajo 0.02mg/ml 0.2 suero problema diluido 1:10 0.2 ureasa 2 gotas 2 gotas 2 gotas mezclar e incubar en bao de agua a 37C durante 15 minutos. Reactivo de fenol 2.0ml 2.0ml 2.0ml Reactivo de hipoclorito alcalino 2.0ml 2.0ml 2.0ml mezclar e incubar en bao de agua 37C durante 15 minutos. Agua 6.0ml 6.0ml 6.0ml 2

Las incubaciones pueden hacerse a 56C por 3 min o a 51C por 5 min. Leer a longitud de onda de 550nm o con el filtro correspondiente (verde) ajustando a 100% de trasmitancia o cero de absorbancia con el blanco de reactivo. El color es estable 2 horas. Convertir la lectura a su concentracin por clculos o con la curva de calibracin. Valores normales. Suero o plasma: 15 a 38mg/100ml NOTA: debe evitarse la contaminacin con amonio ambiental (trabajar lejos del departamento de orinas). DETERMINACIN DE CREATININA. Material biolgico. 1.0ml de sangre total, suero o plasma. Fundamento. El picrato en solucin alcalina da con la creatinina una coloracin rojiza amarillenta de intensidad proporcional a su concentracin. Reactivo. cido pcrico 0.04N 1 frasco con 110ml Hidrxido de sodio 0.75N 1 frasco con 110ml. Patrn de creatinina 0.1mg/ml 1 frasco con 20ml. Consrvese en refrigeracin (entre 2C y 8C). Reactivos de trabajo. Patrn de trabajo 0.001mg/ml. diluir 1ml del patrn a 100ml con agua destilada. Usar pipeta y matraz volumtricos. Estable una semana en refrigeracin. Procedimiento: desproteinizar la sangre total, suero o plasma con tungstato de sodio al 10% y cido sulfrico 0.083N, como se indica en el frasco, filtrar o centrifugar. pipetear en un tubo de ensayo. BLANCO TESTIGO PROBLEMA Agua 3.0ml Patrn de trabajo con 0.001mg/ml 3.0ml

filtrado 3.0ml cido pcrico 0.04N 1.0ml 1.0ml 1.0ml Hidrxido de sodio 0.75N 1.0ml 1.0ml 1.0ml Mezcla y deja en reposo 15minutos a temperatura ambiente. Leer a longitud de onda de 520nm o con el filtro correspondiente(verde) ajustando a 100% de transmitancia o cero de absorbancia con el blanco de reactivo. El color es estable 30 minutos. Valores normales. Sangre total suero o plasma: 0.5 a 1.5mg/100ml DETERMINACIN DE ACIDO URICO. Material biolgico. 1.0ml de suero o plasma. Fundamento: El cido rico en solucin alcalina reduce el reactivo de cido fosfotungtico y forma un complejo de color azul cuya intensidad es directamente proporcional a su concentracin. Reactivos. Reactivo de cido fosfotungstico 1 frasco con 230ml Carbonato de sodio al 14% 1 frasco con 230ml Patrn de cido rico 1mg/ml 1frasco con 20ml Consrvese en refrigeracin (entre 2C y 8C). Reactivo de trabajo. Patrn de trabajo 0.01mg/ml. Diluir 1.0ml del patrn a 100ml con agua destila. Usar pipeta y matras volumtrico. Establecer una semana de refrigeracin. Procedimiento. Desproteinizar el suero, plasma con tungstato de sodio al 10% cido sulfrico 0.083N, como se indica en el frasco, filtrar o centrifugar. Pipetear en tubos de ensayo: BLANCO TESTIGO PROBLEMA 4

Agua 3.0ml Patrn de trabajo con 0.01mg/ml 3.0ml Filtrado 3.0ml Reactivo de cido fosfotungstico 1.0ml 1.0ml 1.0ml Carbonato de sodio al 14% 1.0ml 1.0ml 1.0ml Mezclar y dejar en reposo 15 minutos a temperatura ambiente. Leer a longitud de onda 710nm o con el filtro correspondiente (rojo), ajustando a 1005 de transmitancia o cero de absorbancia con el blanco de reactivos. El color es estable 15 minutos, (si se, usa colormetro leitz leer a 640nm). Valores normales: Suero o plasma 3.0a 7.5mg/100ml. DETERMINACIN DE COLESTEROL. Material biolgico. 0.1ml de suero o plasma. Fundamento. El colesterol reacciona en forma especifica con la mezcla (cido sulfricoanhdrido actico cidoactico) dando una coloracin verde intensidad proporcional a su concentracin. Reactivo. Reactivo de color para colesterol. 3 frascos con 175ml c/u cido actico glacial QP 1 frasco con 10ml Patrn de colesterol 2mg/ml 1 frasco con 10ml Consrvese en congelacin a 20C Procedimiento: Pipetear en tubos de ensayo. BLANCO TESTIGO PROBLEMA cido actico glacial QP 0.1ml Patrn de colesterol 2mg/ml 0.1ml Suero problema 0.1ml 5

Reactivo de color para colesterol fri 5.0ml 5.0ml 5.0ml Mezclar e incubar en bao de agua a 37C durante 6 minutos. El nivel de agua enel bao debe ser superior al nivel de los reactivos en tubos. Sacar los tubos y secarlos por fuera. Leer a longitud de onda de 625nm o con el filtro correspondiente (rojo) ajustando a 100% de transmitancia a cero de absorbancia con el blanco de reactivos. El color es estable 20 minutos, (si se usa calormetro leitz se lee a 610nm) Valores normales. Suero: 100 a 250mg de colesterol/100ml NOTA: Con este mtodo se pueden encontrar valores 20% mas elevados que los obtenidos en los mtodos de extraccin por ser un mtodo directo; suero hemoliados, ictridos o lipemicos dan resultados elevados. Determinacin de protenas totales. Material biolgico. 0.1ml de suero Fundamento. Las uniones peptidicas de las protenas reaccionan con el sulfato de cobre en solucin alcalina y produce un color violeta proporcional a su concentracin. Reactivos. Reactivo de biuret. 2 frascos con 230ml c/u Patrn de protenas 0.08g/ml. Consrvese en refrigeracin (entre 2C y 8C). Procedimiento. Pipetear en tubos de ensayo: BLANCO PROBLEMA Agua 0.1ml Suero problema 0.1ml Reactivo de biuret 5.0ml 5.0ml 6

mezclar y dejar en reposo 20 minutos a temperatura ambiente. Leer a longitud de onda de 550nm o cn el filtro correspondiente (verde) ajustado a 100% de transmitancia o cero de absordancia con el blanco de reactivo. El color es estable 2 horas. Valores normales. Suero: 5.5 a8.0g de proteinas/100ml. NOTA: Los sueros hemolizados dan resultados altos. DETERMINACION DE ALBUMINA. Material biologico. de suero. Fundamento. El verde de bromocresol tiene la propiedad de enlazarse especficamente con la albmina produciendo un cambio de color de intensidad proporcional a su concentracin. Reactivos. Reactivo para albmina 1 frasco con 110ml. Patrn para albmina 0.08g/ml. Consrvese en refrigeracin (entre 2C y 8C). Procedimiento. iluir cuidadosamante el suero problema 1:10 con agua destilada. Pipetear en tubos de ensayo: BLANCO PROBLEMA Agua 0.1ml Suero problema diluido 1:10 0.1ml Reactivo para albmina 1.0ml 1.0ml Agua 4.0ml 4.0ml mezclar y dejar en reposo 5 minutos a temperatura ambiente.

Leer a longitud de onda de 630nm o con el filtro correspondiente (rojo) ajustando a 100% de transmitancia o cero de absorbancia con el blanco de reactivo. El color es estable 30 minutos (si se usa colormetro leitz se lee a 640nm). Valores normales. Suero: 3.5 a 5.0g de albmina/100ml. DETERMINACIN DE FOSFATASA ALCALINA. Material biolgico. 0.2ml de suero. Fundamento. La fosfatasa alcalina hidroliza el fosfato pnitrofenilo con formacin de pnitrofenolibre que en medio alcalina se transforma en un in nitrofenclado de color amarillo intenso proporcional a la actividad de la enzima. Reactivos. Sustrato de fosfatasa 1 tubo con 10 tabletas. Solucin amortiguadora de glicina pH 10.5 1 frasco con 110ml. Hidrxido de sodio 4N 1 frasco con 55ml. Patrn de pnitrofenilo 2.7mM 1 frasco con 10ml Consrvese en refrigeracin (entre 2C y 8C). Reactivos de trabajo. Sustrato de amortiguador. diluir 1 tableta de sustrato para fosfatasas en 10ml de solucin amortiguadora de glicina pH 10.5(estable un mes en el refrigerador). Hidrxido de sodio 0.02N diluir 1ml de hidrxido de sodio 4N a 200ml con agua destilada. Patrn de trabajo de pnitrofenol diluir 1ml de patrn de nitrofenila 1000ml con hidrxido de sodio 0.02N. Procedimiento. pipetear en tubos de ensayo. BLANCO PROBLEMA Sustrato amortiguado 1.0ml 1.0ml Incubar en bao de agua a 37C durante 5 minutos.

suero problema 0.1ml. incubar en bao de agua a 37C durante 3 min. Exactos sacar los tubos del bao y agregar hidrxido de sodio 0.02N 100ml 100ml suero problema 0.1ml mezclar. Leer a longitud de onda de 405nm o con el filtro correspondiente ajustado a 100% de transmitancia cero de absorbancia con el blanco. El color es estable 20 minutos. Valores normales. Suero: 13 a 40 m unidades internacionales /ml adultos 45 a 115m unidades internacionales /ml nios NOTA: si la concentracin del problema es mayor a 100mui se diluye el suero 1:10 con cloruro de sodio al 0.85% se repite la determinacin y el resultado se multiplica por 10. Determinacin de fosfatasa cida y fraccin prosttica. Material biolgico. 0.6ml de suero. Fundamento. La fosfatasa cida hidroliza el fosfato pnitrofenilo a pH cercano a 5.0 con formacin de pnitrofenol libre, que en medio alcalino se transforma en un in nitrofenalado de color amarillo intenso proporcional a la actividad de la enzimas. La fosfatasa cida prosttica se inhibe con el tartrato de sodio, por lo que la cantidad de enzima prosttica es la diferencia entre la fosfatasa cida total y la fraccin inhibida. Reactivos. Sustrato para fosfatasa. 1 frasco con 10 tabletas. Solucin amortiguadora de citratos pH 4.8 1 frasco con 110 ml Hidrxido de sodio 4N 1 frasco con 55 ml Tartrato de sodio 0.2M 1 frasco con 10 ml Patrn de pnitrofenol 2.7mM 1 frasco con 10 ml Consrvese en refrigeracin (entre 2C y 8C). Reactivos de trabajo. Sustrato amortiguador: diluir 1 tableta de sustrato para fosfatasa en 10ml de solucin amortiguadora de 9

citratos pH 4.8 (establecer una semana entre 2C y 8C). Hidrxido e sodio 0.02N diluir 1ml de hidrxido de sodio 4N a 200ml con agua destilada. Patrn de trabajo de pnitrofenol: diluir 1ml del patrn de pnitrofenol a 100ml con hidrxido de sodio. Procedimiento. Pipetear en tubos de ensayo, BLANCO PROBLEMA PROBLEMA CON INHIBIDOR. Sustrato de amortiguador 1.0ml 1.0ml 1.0ml Incubar a bao de agua a 37C durante 5 minutos. Tartrato de sodio 0.2M 0.1ml suero problema. 0.2ml 0.2ml incubar en bao de agua a 37C durante 30min. Exactos. Sacar los tubos del bao y agregar. Hidrxido de sodio 0.02N 10.0ml 10.0ml 10.0ml Suero problema 0.2ml Mezclar. Leer a longitud de onda de 405nm o con el filtr correspondiente, el color es estable 20min. Valores de referencia. Suero : 4.8 a 13.5m DETERMINACIN DE BILIRRUBINA. Material biolgico.. de suero. Fundamento. La bilirrubina al combinarse con las sales de diazonio forman un complejo azoado de color morado e intensidad proporcional a su concentracin en el suero sanguneo se encuentra en dos formas al directa soluble en el agua y la indirecta insoluble en el agua pero soluble en metanol. Reactivos de trabajo. Nitrito de sodio al 0.5% diluir 0.1ml de nitrito de sodio al 10% a 10ml de agua destilada ( descartar si cambia a color amarillo claro) 10

Agregar 0.3ml de nitrito de sodio al 0.5% a 10ml de cido sulfanilico al 0.1% en cido clorhdrico al 15% este reactivo debe prepararse antes de usarse estable solo 30min. Procedimiento bilirrubina total. Pipetear en tubos de ensayo. BLANCO PROBLEMA Metanol Q P 3.0ml 3.0ml Diazo blanco 0.5ml Diazo reactiv 0.5ml Suero diluido 1;10 2.0ml 2.0ml mezcal y reposar 30min. Leer a 540nm contra su blanco respectivo. Procedimiento bilirrubina directa. Pipetear en un tubo de ensayo BLANCO PROBLEMA. Agua destilada 3.0ml 3.0ml Diazo blanco 0.5ml Diazo reactico. 0.5ml Suero diluido 1:10 2.0ml 2.0ml Mezclar y leer exactamente al minuto de agregar el suero diluido leer a 540nm con el banco respectivo. Valores normales. Adultos 35 R/nacidos 17.5 NOTA: Los sueros hemolizados dan error con este mtodo Los sueros con bilirrubina superior a 50mg/100ml se deben diluir. DERMINACION DE TRANSAMINASA GLUTAMICA OXALACETICA (TGO). Material biolgico. 0.1ml de suero. Fundamento. 11

La transaminasa glutamica oxalacetica cataliza la formacin de cido oxalacetico a partir de cido aspartico y cido alfacetoglutarrico. El grado en que se forma el cido oxalacetico en la reaccin se mide agregando una solucin de dinitrofenilhidrazina para formar la dinitrofenilhidrazona oxalacetica, que en medio alcalino desarrolla color caf. Reactivos. Sustrato para TGO 1 frasco con 35ml Solucin de 2,4 dinitrofenilhidrazina* 1 frasco con 35ml Hidrxido de sodio 4N 1 frasco con 35ml Patrn de pirubato de sodio 0.151mg/ml* 1 frasco con 10ml Consrvese en refrigeracin (entre 2C y 8C). Reactivo de trabajo. Hidrxido de sodio 0.4N diluir 10ml de hidrxido de sodio 4N a 100ml con agua destilada. Procedimiento. Pipetear en tubo de ensayo. PROBLEMA. Sustrato de TGO 0.5ML Incubar en bao de agua a 37C durante 5 minutos. Suero problema 0.1ml Incubar en bao de agua a 37C durante 60minutos exactos sacar los tubos y agregar y agregar inmediatamente. 2,4 dinitrofenilhidrazina. 0.5ml mezclar, dejar en reposo 20min a Temp. Ambiente y agregar hidrxido de sodio 5ml mezclar y dejar en reposo 10min a temperatura ambiente. Leer a longitud de onda de 505nm o con el filtro correspondiente. El color es estable 30 minutos. Valores normales. Suero: 6 a 40 unidades reitman/ml. NOTA: No se deben procesar sueros homolizados.

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DETERMINACIN DE TRANSAMINASA GLUTAMICA PIRUVICA (TGP) Material biolgico. 0.1ml de suero. Fundamento. La transaminasa glutamica piruvica cataliza la formacin de cido piruvico a partir de DLalanina y cido alfacetoglutmico. El grado en que se forma el cido piruvico en la reaccin, se mide agregando una solucin de dinitrofenilhidracina para formar la dinitrofenilhidrazona piruvica, que en medio alcalino desarrolla color caf. Reactivo. Sustrato para TGP* 1 frasco con 35ml Solucin de 2,4 dinitrofenilhidrazina* 1 frasco con 35ml Hidrxido de sodio 4N 1 frasco con 55ml Patrn de piruvato de sodio con 0.151mg/ml* 1 frasco con 10ml Consrvese en refrigeracin (entre 2C y 8C). Reactivo de trabajo. Hidrxido de sodio 0.4N Diluir 10ml de hidrxido de sodio 4N a 100ml con agua destilada. Procedimiento. Pipetear en tubos de ensayo. TUBO PROBLEMA Sustrato para TGP. 0.5ml Incubar a bao de agua a37C durante 5 minutos. Suero problema 0.1ml Incubar en bao de agua a37C durante 30 minutos exactos. Sacar los tubos del bao del agua y agregar inmediatamente. 2,4 dinitrofenilhidrazina mezclar, dejar en reposo 20 minutos a temperatura ambiente y agregar. 13

Hidrxido de sodio 0.4N Mezclar y dejar en reposo 10 minutos a temperatura ambiente y agregar. Leer a longitud de onda 505nm con el filtro correspondiente. el color es estable 30 minutos. Valores normales. Suero: 5 a 335 unidades reitman/ml DETERMINACIN DE TRiGLICERIDOS. Material biolgico. Suero o plasma Fundamento. Los triglicridos presentes en la muestra original, segn las reacciones acopladas descritas a continuacin, un complejo coloreado que se cuantifica por espectrofotometra. Triglicridos + H2O glicerol + cidos grasos Glicerol + ATP Glicerol3p + ADP Glicerol3P + O2 dihidroxiacetonaP +H2O 2H2O2 + 4aminoantipirina +4clorofenol Quinonaimina + 4 H2O Procedimiento. Dejar atemperar el reactivo durante unos minutos a temperatura ambiente o en un bao de agua. Pipetear en tubos de ensayo BLANCO PATRON PROBLEMA Patrn triglicridos 10ul Muestra 10ul Reactivo 1.0ml 1.0ml 1.0ml Agitar bien e incubar los tubos durante 15 minutos a temperatura ambiente (1625C) o durante 5 minutos a 37C. Leer la absorbancia del patron y de la muestra frente al blanco a 500nm. El color es estable durante al menos 2 horas. Valores normales. 60150mg/dl. 14

Calculo. A muestra X 200 = mg/dl triglicridos A muestra

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