Lab Oratorio Bioquimica General

Gua Laboratorios Bioqumica General
Primer Semestre 2006
Profesores Autores: Fuentes O & E Campos
Laboratorios Bioqumica General 2006
Seminario 1: Equilibrio cido-base y pH

INTRODUCCIN Para comprender la importancia del pH en el funcionamiento normal de los seres vivos se requiere revisar los conceptos de equilibrio cido-base y de pH o acidez. Un buen nmero de intermediarios y productos metablicos son cidos orgnicos, considerados cidos dbiles. Ejemplos: cido carbnico, cido lctico, cido hidroxibutrico, cido ctrico, etc. Estos compuestos se disocian liberando H+ al medio. Otros productos metablicos como el amoniaco (NH3), captan H+ del medio y se comportan como bases. En ltimo trmino tenemos compuestos biolgicos como los aminocidos y las protenas que se pueden comportar como cidos o como base liberando o captando H+ del medio, fenmeno de gran importancia tanto en la estructura y funcin de las protenas como en la regulacin del pH del medio. Mientras un cido fuerte se disocia totalmente en solucin acuosa, un cido dbil lo hace solo parcialmente. Si representamos a un cido dbil por RH y su base conjugada por R-, su disociacin ser RH ------- H+ + R- ; el grado en que se disocia el cido se representa por su constante de disociacin o de acidez Ka, siendo Ka = [H+] [R-] [RH] Ejemplo de algunos cidos orgnicos y sus constantes de acidez cido cido actico cido lctico cido carbnico cido fosfrico Ka 1.8x10-5 1.38x10-4 7.94x10-7 6.3x10-8(pKa2) pKa 4.75 3.86 6.1 7.2
Similar ecuacin de equilibrio se puede escribir para el agua H2O ------- H+ + OHsiendo la Ka = [H+] [OH-] , despejando Ka y considerando que [H2O] en agua Pura [H2O] es constante, tenemos que Ka [H2O] = Kw = [H+] [OH-] = 10-14 Siendo Kw = producto inico del agua, de acuerdo al cul en toda solucin acuosa se cumple que [H+] [OH-] = 10-14 A partir del producto inico del agua se pueden derivar los conceptos de pH y la escala de pH. As, tomando logaritmos negativos de Kw = [H+] [OH-] = 10-14 nos da lo siguiente -log Kw = -log H + -log OH- = -log 10-14, si -log = p, Entonces pKw = pH + pOH.
El usuario solo podr utilizar la informacin entregada para su uso personal y no comercial y, en consecuencia, le queda prohibido ceder, comercializar y/o utilizar la informacin para fines NO acadmicos. La Universidad conservar en el ms amplio sentido la propiedad de la informacin contenida. Cualquier reproduccin de parte o totalidad de la informacin, por cualquier medio, existir la obligacin de citar que su fuente es "Universidad Santo Toms" con indicacin La Universidad se reserva el derecho a cambiar estos trminos y condiciones de la informacin en cualquier momento.
Tenemos entonces que: pH = -log [H+] o log 1/ [H+], pOH = -log [OH-] y pH + pOH = 14. Este valor de pKw determina una escala de pH que va de 0 ([H+] =10) a 14 ([H+] = 10-14). Se hace notar que la escala de pH es una escala de acidez, tal como el pH es una medida de acidez. CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. 5. Calcular la [H+], la [OH-], el pH y el pOH de una solucin de HNO3 Calcular la [H+] de una muestra de a) plasma pH 7.4 Calcular el pH de una solucin de cido actico 0.02 M Una solucin 0.15 M de cido ascrbico (vitamina C) Calcular su Ka. tiene un pH = 5.4. b) orina pH 5.2
Los glbulos rojos de un individuo en condiciones normales producen aproximadamente 0.35 moles de cido lctico al da. Asumiendo un volumen sanguneo (volemia) de 5 litros y que el cido lctico se acumula en la sangre determine el cambio de pH sanguneo producido en un da. Calcular el pH de 100 ml de cido clorhdrico 0.1 M al cul se adicionan 20 ml de NaOH 0.1 M En la titulacin de una muestra de 10 ml de jugo gstrico se gastaron 0.7 ml de NaOH 0.1 M. Cul es el pH de la muestra de jugo gstrico? Busque informacin con respecto a lo que se entiende por acidez valorable o titulable y acidez real. En base a esa informacin explique que significa que una muestra de orina de pH = 5.5, tenga una acidez valorable de fosfato igual a 6 mmol de NaOH.
6. 7. 8.
Laboratorio N 1: Soluciones Amortiguadoras y Capacidad Amortiguadora

INTRODUCCIN Una solucin amortiguadora (Buffer o Tampn) es capaz de resistir cambios de pH cuando pequeas cantidades de cido o base son agregadas a la solucin. Por ejemplo, cuando 0,01 moles de cido fuerte y base fuerte son adicionados a agua destilada, el pH desciende a 2 con el cido y aumenta a 12 con la base. Si la misma cantidad de cido o base son adicionados a una solucin amortiguadora formada por cido actico acetato de sodio, el pH puede variar solamente en una fraccin de unidad. La regulacin del pH es importante en muchas reacciones qumicas, como as tambin en el control de procesos metablicos dentro de nuestro organismo. As encontramos que la sangre de nuestro organismo se encuentra regulada a un pH de 7,4. Notables variaciones de dicho valor pueden causar enfermedades e incluso la muerte, debido a que afecta los procesos bioqumicos que ocurren en dicho fluido. Una solucin amortiguadora requiere dos especies. Una es capaz de reaccionar exclusivamente con OH- y la otra con H3O+. Estas soluciones se forman por la combinacin de un cido dbil y una sal derivada de ste (cido actico/acetato de sodio) o por una base dbil y una sal derivada de sta (amoniaco/cloruro de amonio). Debido a que las soluciones amortiguadoras presentan efecto de in comn, es posible aplicar la ecuacin de Henderson Hasselbalch con la finalidad de prepararlas:
pH = pKa + log
[base conjugada(sal)] [cido dbil]
La Capacidad Amortiguadora () es una medida de la resistencia a los cambios de pH de una solucin amortiguadora cuando un cido o una base son agregados a sta. Este parmetro es expresado como los moles de cido o base necesarios para cambiar el pH de un litro de una solucin reguladora en una unidad. Mientras ms grande el valor de , mayor la resistencia de la solucin amortiguadora a cambios de pH.
(cambio de pH )(volumen de buffer en L )
(moles de OH - o H3O+ adicionados)
En este laboratorio, la ecuacin de Henderson Hasselbalch ser usada para determinar la cantidad del par base conjugada cido dbil necesario para producir un una solucin amortiguada a pH fisiolgico. OBJETIVOS: Conocer el funcionamiento y preparacin de soluciones reguladoras. Determinar la capacidad reguladora de una solucin tampn.
Procedimiento Preparacin de solucin reguladora. 1. En base a los siguientes equilibrios cido-base determine que sistema cido dbil base conjugada considerara para preparar una solucin amortiguadora que presente un pH aproximado de 7,40.
H 3PO 4 (ac) H + (ac) + H 2 PO 4 - (ac) K a1 = 7,5 x10 3 ; pK a1 = 2,12 H 2 PO 4 - (ac) H + (ac) + HPO 4 - 2 (ac) K a2 = 6,2x10 -8 ; pK a2 = 7,21 HPO 4 - (ac) H + (ac) + PO 4 -3 (ac)
2
K a3 = 4,8x10 -13 ; pK a3 = 12,32
2. Calcular la razn [base conjugada]/[cido dbil] empleando la ecuacin de Henderson Hasselbalch. Calcular la cantidad de base conjugada necesarios para preparar 250 mL de buffer, conociendo la concentracin del cido dbil: Grupo I. 0,1 M de cido dbil. Grupo II. 0,5 M de cido dbil Grupo III. 1,0 M de cido dbil 3. Chequear resultados con el profesor. 4. Preparar solucin amortiguadora. Determinacin de capacidad amortiguadora 1. Calibrar pH-metro. Seguir instrucciones del profesor para calibrar y limpiar pH-metro. 2. Medir pH de solucin amortiguadora preparada. 3. Llenar una bureta de 50 mL con solucin amortiguadora y otra bureta de 50 mL con solucin estandarizada de NaOH ( 0,1 M) 4. Transferir 50 mL de solucin amortiguadora en un vaso de precipitado de 250 mL. 5. Adicionar alcuotas de solucin de NaOH (10 mL) a la solucin reguladora. Despus de cada adicin, anotar el volumen de NaOH adicionado y el pH de la solucin. Completar Tabla I. 6. Continuar hasta adicionar 100 mL de solucin de NaOH. 7. Completar Tabla II. 8. Graficar pH versus moles de NaOH adicionados. 9. Calcular el pH terico de cada solucin empleando la ecuacin de Henderson Hasselbalch, y compararlos con los valores experimentales.
Tabla I
Volumen NaOH (mL) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
pH
Tabla II V. Buffer (L) V. NaOH (L) Moles NaOH Cambio de pH (pH) Capacidad Reguladora,
Referencias Qumica. R. Chang. Sptima Edicin. Editorial Mc.Graw-Hill. 2002. Quantitative Chemical Analysis. D. Harris. Fifth Edition. Freeman and Company. 1998.
Laboratorio N 2: Reconocimiento de las protenas

INTRODUCCIN Las protenas son las biomolculas ms importantes de los seres vivos. Todas las estructuras celulares estn formadas por protenas y prcticamente todas las funciones celulares son realizadas por protenas. Las enzimas, los transportadores, los anticuerpos, los receptores, los microtbulos y los microfilamentos del citoesqueleto, etc, son todos protenas. Aparte de sus funciones especficas, las protenas participan en la regulacin del equilibrio osmtico y tienen capacidad tamponante o reguladora del pH.
OBJETIVOS Una vez desarrollada esta actividad prctica los alumnos conocern algunos mtodos de reconocimiento de las protenas y sus fundamentos tericos ACTIVIDADES 1. Reconocimiento de protenas plasmticas El plasma sanguneo tiene un contenido de protenas de aproximadamente 7 g /100 ml (g/dl), de los cuales aproximadamente 4 g corresponden a albmina y el resto est constituido por anticuerpos, factores de coagulacin, apoprotenas de las lipoprotenas, enzimas proteicas, etc. Este contenido de protenas puede variar de acuerdo a las condiciones nutricionales o el estado de salud del individuo. a) Reconocimiento por absorbancia a 280 nm de luz ultravioleta (UV). Las protenas absorben luz ultravioleta a 280 nm, longuitud de onda a la que absorben los aminocidos aromticos (triptofano, tirosina y fenilalanina) de las protenas, especialmente el grupo indol de triptofano. Esta propiedad se puede aprovechar para reconocer la presencia de protenas En esta actividad se utilizar plasma (u ovoalbmina) diluido 1: 20 con suero fisiolgico (NaCl 0.9 % p/v), una solucin de seroalbmina de bovino (SAB) 5 mg/ml y una solucin de NaCl 0.9 % p/v, segn el cuadro siguiente Tubos Na Cl 0,9 % p/v SAB 5mg / ml Plasma diluido 1 3 ml 2 3 ml 3 3 ml -
Leer en el espectrofotmetro a 280 nm (UV) en cubetas de cuarzo. (El vidrio detiene la luz UV). Comparar resultados y discutir la utilizacin de tubos con SAB y con la solucin de NaCl.
b.- Reconocimiento de protenas con el reactivo de Biuret (mtodo colorimtrico) Este mtodo se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el in Cu++ del reactivo y los nitrgenos amdicos del enlace peptdico. Por lo tanto este reactivo reconoce especficamente la presencia de enlaces peptdicos. Se utiliza como blanco el reactivo de Biuret a la misma concentracin de los tubos muestra y estndar. Preparar los siguientes tubos.
Tubos 1 2 3 NaCl 0,9 % p/v 1ml 1ml 2 ml SAB 5 mg/ml 1 ml Plasma diludo 1 ml Reactivo de Biuret 4 ml 4ml 4ml Mezclar bien, sin agitar, y leer despus de 30 minutos a 540 nm (luz visible) en cubetas de vidrio. Como alternativa se puede calentar a 50C en bao de agua por 5 minutos para desarrollar color y leer despus de enfriar en corriente de agua. Discuta sus resultados e identifique en el procedimiento los tubos con muestra y estndar Compare y discuta los resultados obtenidos con ambos mtodos (UV y colorimtrico) Reactivos y Soluciones 1. 2. 3. 4. Reactivo de Biuret Solucin NaCl 0.9 % p/v Plasma diluido 1 : 20 v/v con NaCl 0.9 % p/v Solucin estndar de seroalbmina de Bovino (SAB) 5 mg / ml en NaCl 0.9 % p/v
Equipo y materiales 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Espectrofotmetro UV- Visible Cubetas de cuarzo y de vidrio Tubos de ensayo de 10 ml y gradillas Matraces Erlermeyer de 100 ml Pipetas de 1, 5 y 10 ml Bao de agua a 50C Balanza analtica
Laboratorio N 3: Cuantificacin de protenas

INTRODUCCIN La determinacin colorimtrica cuantitativa de una sustancia se basa en la capacidad de sta para absorber selectivamente ciertas longitudes de onda de la luz incidente. La cantidad de luz absorbida es directamente proporcional al espesor del medio y a la concentracin de la sustancia presente. De esta manera, si se mantiene constante el espesor del medio, la absorcin de luz por una sustancia disuelta en un medio transparente (Ej agua) ser proporcional a su concentracin molar. Estos principios estn contenidos en las leyes de Lambert Beer y estn expresadas en la siguiente ecuacin: log Io/ I = E c l o DO = E c l, donde DO es la Densidad ptica o Absorbancia de la sustancia, E es el coeficiente de extincin molar, c es la concentracin e l es el espesor, siendo ste ltimo igual a 1 cm. El coeficiente E se expresa en litros/M cm y es numricamente igual a la DO de una solucin 1M (1 Molar) de concentracin. Si las sustancias siguen la ley de Lambert-Beer, presentan una relacin lineal entre DO y concentracin. Por otro lado si la relacin entre DO y concentracin es lineal para dos soluciones de la misma sustancia a igual espesor y longitud de onda, entonces se puede usar una de ellas de concentracin conocida (estndar) para determinar la concentracin de la otra solucin. En la prctica para determinar espectrofotomtricamente la concentracin de una sustancia se requiere: a) una serie estndar de concentracin conocida, en un rango de concentracin que muestre absorcin lineal y que permita expresar la concentracin en DO por unidad de masa o concentracin. b) un blanco que contiene todos los componentes del ensayo con excepcin de la sustancia a medir y c) la muestra con la sustancia problema a una dilucin tal que su lectura de DO este en el rango lineal de la curva de calibracin OBJETIVOS Una vez desarrollada esta actividad prctica los alumnos conocern algunos mtodos o procedimientos para determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica. ACTIVIDADES Determinacin de la concentracin total de protenas plasmticas de una muestra de sangre por el mtodo de Biuret utilizando seroalbmina de bovino (SAB, PM = 66.500) como estndar. En esta actividad se utilizar plasma diluido 1:20 con NaCl 0.9 % p/v y solucin de SAB 100 ug / ml (ug = microgramo) de acuerdo al siguiente cuadro
Tubos NaCl 0.9% p/v SAB 100ug/m Plasma diluido Reactivo de Biuret
3 1,8 0,2 2,0 2,0 4,0 4,0 4,0
4 1,5 0,5 4,0
5 1,0 1,0 4,0
6 0,5 1,5 4,0
8 2,0 2,0 4,0 4,0
Mezclar bien, sin agitar y leer despus de 30 minutos a 540 nm en cubetas de vidrio. Se puede calentar en bao a 50C por 5 minutos y leer despus de enfriar en agua corriente. Determinar el contenido de protenas de la muestra a partir de la curva estndar y a partir de la DO promedio calculada por mg de estndar. Compare y discuta sus resultados. Calcule la concentracin total de protenas del plasma en mg/dl. Cmo determinara usted la concentracin de hemoglobina de una muestra de sangre? Infrmese al respecto. Reactivos y Soluciones 1. 2. 3. 4. Reactivo de Biuret Solucin NaCl 0.9 % p/v Plasma diluido 1 : 20 v/v con NaCl 0.9 % p/v Solucin estndar de seroalbmina de Bovino (SAB) 5 mg / ml en NaCl 0.9 % p/v
Equipo y materiales 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Espectrofotmetro UV- Visible Cubetas de cuarzo y de vidrio Tubos de ensayo de 10 ml y gradillas Matraces erlermeyer de 100 ml Pipetas de 1, 5 y 10 ml Bao de agua a 50C Balanza analtica
Seminario N 2: Aminocidos y Protenas

INTRODUCCIN La gran diversidad de funciones biolgicas realizadas por las protenas implica una gran diversidad estructural. Aunque todas las protenas estn formadas por las mismas unidades monomricas, es decir 20 diferentes aminocidos, la secuencia de la cadena aminoacdica es especfica de cada organismo y est determinada genticamente. La estructura espacial o conformacin que la cadena de aminocidos puede adoptar en el medio celular va a depender de las caractersticas de los aminocidos constituyentes y de las caractersticas del medio (polaridad, pH, fuerza inica o concentracin de sales, etc). La estructura molecular que adopte la protena est estabilizada por uniones qumicas predominantemente dbiles o no-covalentes, las que sin embargo permiten cambios reversibles de la conformacin proteica y de su actividad funcional en respuesta a cambios fisiolgicos del medio ambiente. Adems la protena establece interacciones o enlaces qumicos con agua, con iones y con otras molculas, las que son determinantes para su actividad biolgica. Las protenas presentan mltiples grupos ionizables, los que son aportados por los radicales (grupo R) de los aminocidos, por lo que en solucin acuosa las protenas son molculas cargadas. Asimismo estos grupos ionizables le confieren a la protena su capacidad de tampn biolgico o amortiguador de los cambios de pH del organismo. La alteracin de la estructura molecular de las protenas ms all de estos cambios conformacionales en un rango fisiolgico, determina la prdida de la actividad biolgica de la protena. La cual puede llegar a ser irreversible provocando graves daos celulares. OBJETIVOS 1. El desarrollo de esta actividad persigue que los alumnos 2. Conozcan la estructura qumica y comprendan el comportamiento cidobase de los aminocidos y las protenas 3. Conozcan la estructura molecular de las protenas y comprendan su importancia en la diversas funciones biolgicas que ellas realizan CUESTIONARIO 1. a) Determine el punto isoinico de los siguientes aminocidos: Arginina, tirosina e histidina. Escriba la estructura del zwitterin. b) Cul ser la carga neta de histidina, tirosina y fenilalanina a pH 7.0? Escriba la estructura del in correspondiente.
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c) A un pH igual al pHi la carga neta de la lisina es 0. Determine cul es este pH y escriba la estructura inica correspondiente. Nota: para los ejercicios 1, 2 y 3 utilice los valores de pK de la tabla al final de la gua. 2. a) Escriba la estructura completa de los siguientes pptidos i. -glu- cis - gli ii. leu - met ala iii. fen - tir - arg - trip b) A qu polo migrar cada pptido en una electroforesis a pH 7.0? 3. Dada la siguiente secuencia de aminocidos pK=9.5 H O H O H O +H3N - C - C - N - C - C - N - C - C - OCH2 H (CH2)3 H H NH C NH2 NH2 pK= 12.5 a) Cuntos aminocidos estn representados? b) Encierre en un recuadro los enlaces peptdicos c) Cul ser la carga neta de esta molcula a pH 7.0? 4. Que entiende por: a) b) c) d) Estructura primaria Estructura secundaria Estructura terciaria Estructura cuaternaria de una protena pK=2.4
Indique en cada caso el (los) tipo (s) de enlace qumico que estabilizan la estructura correspondiente y entre que grupos qumicos se producen. 5. a) Qu aminocidos favorecen y cuales interrumpen la estructura de alfa hlice? b) Qu tipo de estructura secundaria predomina en protenas globulares y fibrilares? c) Qu entiende por dominios de organizacin de las protenas y cual es su rol funcional? 6. Una protena globular contiene entre otros los siguientes aminocidos: Metionina, aspartato, fenilalanina, tirosina, arginina y leucina. En un medio acuoso
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a) Cules de estos aminocidos estarn probablemente situados cerca de la superficie? b) Cules de estos radicales podran interactuar entre s? Indique el tipo de interaccin que presentaran. 7. Cmo se puede determinar la composicin aminoacdica de la oxitocina (un nonapptido)? Explique brevemente. 8. Cmo se explica el efecto tampn de las protenas y en que rango de pH es ms evidente? 9. a) Cmo afectan a la solubilidad de las protenas los cambios de pH y de concentracin de sales? Explique considerando los diferentes tipos de protenas. b) Qu entiende por punto isoelctrico de una protena? c) Qu entiende por denaturacin de una protena? Qu agentes denaturantes fsicos y qumicos conoce y cmo afectan a la estructura de las protenas? Valores de pK de los aminocidos ms comunes Aminocido Abreviatura Smbolo pKCOOH pKNH2 pKR Glicina (Gli) G 2.34 9 Alanina (Ala) A 2.35 9.69 Leucina (Leu) L 2.36 9.60 Metionina (Met) M 2.28 9.21 Isoleucina (Ileu) I 2.36 9.68 Fenilalanina (Fen) F 1.83 9.13 Valina (Val) V 2,29 9.74 Serina (Ser) S 2.19 9.21 Prolina (Pro) P 2.95 10.65 Triptofano (Trip) W 2.38 9.38 Ac. Glutmico (Glu) G 2.13 9.76 4.31 Histidina (His) H 1.82 9.17 6.0 Arginina (Arg) R 2.17 9.04 12.48 Lisina (Lis) K 2.18 8.95 10.53 Tirosina (Tir) Y 2.20 9.11 10.07 Cistena (Cis) C 1.92 10.78 8.33 BIBLIOGRAFIA 1. Lehninger A, Nelson D, & M Cox. 1995. Principios de bioqumica. Captulos 5 y 6 Ed Omega. 2. Murray, Mayes, Granner y Rodwell. Bioqumica de Harper Appleton-Lange Eds. 22 .Edicin, Captulos 4, 5 y 6.
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Laboratorio N 4: Enzimologa I
INTRODUCCIN Las enzimas son biocatalizadores proteicos esenciales para mantener los procesos metablicos a velocidades compatibles con la vida, contribuyendo adems a su regulacin. Debido a su naturaleza proteica las enzimas pueden modificar su actividad por cambios de temperatura y pH, factores que pueden alterar la estructura molecular de la enzima, provocando su desnaturalizacin. En general una reaccin qumica aumenta su velocidad de reaccin al aumentar la temperatura, pero en el caso de las reacciones catalizadas por enzimas, este efecto se observa slo entre 0 y 40 C, ya que a temperaturas mayores la enzima se desnaturaliza debido a la ruptura de enlaces dbiles, principalmente puentes de hidrgeno y la prdida de su conformacin nativa. Debido tambin a su naturaleza proteica la enzima presenta numerosos grupos ionizables, los que derivan de los radicales de sus aminocidos constituyentes. Las alteraciones del pH pueden cambiar el grado de ionizacin de los grupos qumicos involucrados en el sitio activo de la enzima, afectando su actividad cataltica. Las enzimas son activas en un rango estrecho de pH, con una actividad mxima a un valor de pH denominado pH ptimo. Por tal motivo la actividad enzimtica se mide en presencia de tampones o amortiguadores de pH. OBJETIVOS Estas actividades prcticas tienen como objetivo que los alumnos 1. Se familiaricen con los procedimientos de laboratorio para manipular muestras biolgicas 2. Conozcan algunos procedimientos para determinar la actividad de una enzima en muestras biolgicas 3. Comprueben el efecto que tiene en la actividad de una enzima las variaciones de pH y temperatura
ACTIVIDADES Objetivo: Estudiar el efecto de las variaciones de pH y temperatura sobre la actividad de la amilasa salival. La amilasa salival es una enzima que rompe especficamente los enlaces glicosdicos 1-4 de los polisacridos. La hidrlisis del almidn por amilasa salival da como producto una mezcla de maltosa, maltotriosa (dextrinas) y glucosa. El almidn es un poliscarido formado por 2 tipos de cadena: amilasa (lineal), que presenta slo enlaces 1-4 y amilopectina (ramificada), con enlaces 1-4 y 1-6 El almidn se reconoce qumicamente por el color azul intenso que desarrolla en El usuario solo podr utilizar la informacin entregada para su uso personal y no comercial y, en consecuencia, le queda prohibido ceder, comercializar y/o utilizar la informacin para fines NO acadmicos. La Universidad conservar en el ms amplio sentido la propiedad de la 13
informacin contenida. Cualquier reproduccin de parte o totalidad de la informacin, por cualquier medio, existir la obligacin de citar que su fuente es "Universidad Santo Toms" con indicacin La Universidad se reserva el derecho a cambiar estos trminos y condiciones de la informacin en cualquier momento.
presencia de yodo, por lo que la hidrlisis enzimtica del almidn se puede determinar por la prdida del color azul de una mezcla de reaccin. PROCEDIMIENTO A.- Efecto de la Temperatura sobre la hidrlisis enzimtica del almidn Numere 4 tubos de ensayo y agregue a cada uno 2 ml de la preparacin enzimtica, 1 ml de la solucin de cloruro de sodio, 1 ml de la solucin tampn fosfato pH 7.0 y 2 ml de solucin de almidn. Mezcle suavemente sin agitar e incube durante 15 minutos en las siguientes condiciones: tubo 1 a 0C (sobre hielo), el tubo 2 a 37C en un bao termorregulado, el tubo 3 a 100C (bao mara) y el tubo 4 a temperatura ambiente. Incluya un quinto tubo sin cloruro de sodio en la mezcla de Reaccin a temperatura ambiente. Al cabo de los 15 minutos agregue 1 gota de lugol, mezcle y observe. Anote y discuta sus resultados. B.- Efecto del pH sobre la actividad de la amilasa salival Numere 4 tubos de ensayo y agregue a cada uno 2 ml de preparacin enzimtica, 1 ml de solucin de cloruro de sodio y 2 ml de solucin de almidn. Posteriormente adicione 1 ml de tampn fosfato pH 4.0 al tubo 1, 1 ml bufer pH 5.0 al tubo 2 , 1 ml buffer pH 6.0 al tubo 3 y 1 ml buffer pH 8.0 al tubo 4. Mezcle y deje incubando a temperatura ambiente por 15 minutos. Al cabo de ese tiempo agregue una gota de lugol, mezcle y observe. Anote y discuta sus resultados. Reactivos y Materiales 1. Preparacin enzimtica: Lavado bucal con agua destilada, filtrado y mantenido en hielo. 2. Tampn fosfato 0.1 M, pH 7.0, pH 5.0, pH 6.0 y pH 8.0 3. solucin de Cloruro de sodio 0.03 M 4. solucin de almidn 1% p/v 5. solucin de lugol 6. Bao termoregulado y de agua hirviendo
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Laboratorio N 5: Enzimologa II
INTRODUCCIN La catalasa es una enzima tetramrica, de naturaleza hemoproteica, que contiene un grupo hem en el sitio cataltico de cada subunidad. La catalasa es una enzima universalmente presente en los organismos aerbicos. Su presencia parece estar relacionada con un sistema de defensa contra los efectos txicos de la utilizacin de oxgeno por los organismos aerbicos. En las clulas eucariticas se encuentra asociada con los peroxisomas de clulas animales, glioxisomas de clulas vegetales y glbulos rojos de organismos superiores. La catalasa cataliza la degradacin del H2O2, producto txico del metabolismo aerbico, mediante dos formas de reaccin: cataltica y peroxidativa, segn las siguientes reacciones 1) catalasa + H2O2 ------------------------- catalasa- H2O2 (compuesto I) 2) catalasa- H2O2 + H2O2 --------------- catalasa + 2 H2O + O2 3) catalasa- H2O2 + RCH2OH ------ catalasa + RCOH + 2 H2O Las reacciones 1 y 2 corresponden a la reaccin cataltica y las reacciones 1 y 3 corresponden a la reaccin peroxidativa. En la clula intacta la catalasa funciona en forma peroxidativa , mientras que en condiciones de ensayo de laboratorio lo hace en forma cataltica. La reaccin cataltica presenta cintica de primer orden, tal que V = k [H2O2]. Se puede seguir la reaccin determinando el consumo de H2O2 en el tiempo y calculando el valor de la constante de primer orden k a partir de la siguiente frmula k = log Co / Ct x 2.3/t, donde Co y Ct son las concentraciones de H2O2 al tiempo 0 y al tiempo t (seg) respectivamente, en tanto que t es la variacin en el tiempo en segundos. Ensayo enzimtico de catalasa La actividad de catalasa se puede determinar en muestras biolgicas midiendo la disminucin en el tiempo de la concentracin de H2O2 mediante absorcin de luz UV a 240 nm (espectrofotometra UV) o por titulacin del H2O2 remanente con KmnO4 (permanganometra). En este trabajo prctico se determinar la actividad de muestras de hgado y hemolizados, determinando la concentracin de H2O2 por absorcin UV. OBJETIVOS Esta actividad prctica tiene como objetivos que los alumnos: 1. Conozcan algunos procedimientos clsicos para determinar la actividad de la enzima catalasa en muestras hepticas y sanguneas
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2. Observen la variacin de la concentracin de sustrato en el tiempo, determinen la constante de velocidad de primer orden de la reaccin catalizada y sean capaces de expresar grficamente sus resultados A. Muestras, Reactivos y Materiales 1. Muestras a) Se utilizarn sobrenadantes de homogenizados de hgado al 10% p/v en buffer fosfato pH 7.0, 50 mM , tratados con Triton X-100 y conservados a 4C (refrigerado) hasta las determinaciones. b) Los hemolizados se preparan a partir de glbulos rojo lavados 3 veces con NaCl isotnico y hemolizados con 4 volmenes de agua destilada (hemolizado Stock) y se conservan a 4C hasta las mediciones. En caso de guardar para otro da se deben congelar las muestras (sin diluir) 2. Soluciones a) Tampn fosfato pH 7.0, 50 mM. Se preparan soluciones de Na2HPO4 y NaHPO4 0.2 M se mezclan 122 ml de Na2HPO4 y 78 ml de NaHPO4 y se completan a 1 L con agua destilada en un matraz aforado, conservndose en fro. b) Solucin de H2O2 300 mM (Stock). 3.4 ml de H2O2 30 % se diluyen a 100 ml con tampn fosfato. Conservar en fro. O bien usar H2O2 comercial de 10 volmenes como stock. Materiales a) b) c) d) e) f) g) h) i) Tubos de ensayo de 20 ml Pipetas de 1 , 2 y 5 ml Vasos de precipitado de 50 ml Matraces Erlermeyer de 50 ml y 100 ml Propipetas Papel absorbente (toallas de papel) Marcador para vidrio Espectrofotmetro UV y cubetas Cronmetro (Timer)
B. ACTIVIDADES 1. Tomar 2 ml de solucin H2O2 Stock y diluir a 20 ml con tampn fosfato en matraz Erlermeyer de 50 ml (solucin sustrato) 2. Preparar diluciones 1: 100 del extracto de hgado y 1: 50 de hemolizados con tampn fosfato 3. Tomar 3 ml de la solucin sustrato y leer DO a 240 nm, da [H2O2] a tiempo 0. 4. Echar a andar la reaccin agregando rpidamente (soplando fuerte) 1 ml de la dilucin de enzima al matraz con solucin sustrato y agite inmediatamente por rotacin. Simultneamente tome el tiempo en segundos.
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5. Tome muestras de 3ml cada 20 segundos y lea rpidamente su DO a 240 nm. Registre el tiempo exacto, en segundos, al momento de la lectura. 6. Completar la tabla siguiente Tubos Tiempo (s) Concentracin H2O2 [H2O2]0 / [H2O2]t 0 1 2 3 4 A partir de los moles de H2O2 en 3 ml determinar la concentracin molar de H2O2 en la solucin sustrato. 7. Construir grficos [H2O2] versus tiempo y log [H2O2] versus tiempo. Comparar y discutir en relacin al tipo de cintica de la reaccin 8. Calcular la actividad de catalasa a partir de la ecuacin siguiente k = log Co / Ct x 2.3 / t ( k = seg. 1)
La actividad de catalasa se puede expresar tambin como unidades internacionales U.I., siendo 1 U.I. = k x 13 / 6.93 x 10 -3
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Seminario N 3: Enzimas y bioenergetica

INTRODUCCIN Las enzimas son de vital importancia para el metabolismo de todos los seres vivos (bacterias, vegetales y animales). Sin estos compuestos las reacciones bioqumicas seran tan lentas, que seran incompatibles con la vida. Adems de acelerar las reacciones, en su papel de biocatalizadores, las enzimas presentan una instancia de regulacin del metabolismo, ya que pueden modular su actividad en presencia de activadores, inhibidores, cambios de pH y concentracin de iones y metabolitos. El estudio de las enzimas es esencial para entender el metabolismo celular y muchas de ellas presentan localizacin celular especfica, lo que permite utilizarlas como marcadores celulares. Asimismo su determinacin puede ser de gran importancia para el diagnstico y evolucin de enfermedades que involucran dao tisular con liberacin de enzimas. Muchas enfermedades genticas que afectan el metabolismo en bacterias, animales y vegetales son producidas por mutaciones de genes que codifican enzimas. OBJETIVOS El desarrollo de esta gua pretende que los alumnos 1. Revisen las caractersticas de las enzimas como biocatalizadores 2. Comprendan la relacin entre los parmetros cinticos de V, Vo, Vmx. y KM en relacin a los procesos de reaccin enzimtica 3. Sean capaces de aplicar los mtodos de representacin grfica en la determinacin y anlisis de los parmetros cinticos de una enzima. 4. Analicen los principales mecanismos de regulacin enzimtica y comprendan su importancia en la regulacin del metabolismo. CUESTIONARIO 1. Indique que entiende por: a) Energa de activacin b) Catalizador c) Estereoespecificidad d) Reaccin de 1er orden e) Reaccin de orden 0 f) Sitio activo g) Efector alostrico h) Inhibidor no-competitivo i) Complejo activado
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2. Qu efecto tiene una enzima sobre: la velocidad de reaccin, el equilibrio de la reaccin, el orden de reaccin, la energa de activacin y el E de una reaccin enzimtica? Qu relacin puede establecer entre E de activacin y velocidad de Reaccin? 3. Considerando la naturaleza proteica de las enzimas qu precauciones se deben tomar para manipular y realizar el ensayo de la actividad de una enzima? Qu ventajas puede tener analizar una reaccin enzimtica en condiciones de velocidad inicial (Vo)? 4. Dada una cierta reaccin catalizada por una enzima en presencia de un exceso de sustrato. Indique: a) Que ocurre con la velocidad inicial (Vo), la velocidad mxima (Vmx) y la constante de Michaelis (KM) si la concentracin de enzima aumenta al doble. b) Que ocurre con Vo, Vmx y KM si se adiciona una sustancia que aumenta al doble la afinidad de la enzima por el sustrato. 5. Dada la ecuacin general de una reaccin enzimtica k1 k2 E + S <----->ES <-----> E + P k-2 k-1 a) b) c) d) Escriba la expresin de velocidad a baja y alta concentracin de sustrato Cul es la expresin de KM en funcin de las constantes de velocidad? En qu caso KM sera igual a k2 / k1? Considerando una situacin de estado estacionario escriba una ecuacin que exprese la concentracin de ES en funcin de [S], [E] y KM
6. Dados los siguientes datos experimentales del estudio de la actividad de una enzima a 25 C S Vo (M) (M min-1) 28 2,5x10-6 -6 4,0x10 40 70 1x10-5 2x10-5 95 -5 112 4x10 1x10-4 128 -3 2x10 139 1x10-2 140 a) Utilizando anlisis grfico determine el valor de Vmx y KM b) Es posible determinar estos parmetros por simple inspeccin de los datos en la tabla? c) Es posible calcular el G de la reaccin? Porqu?
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7. Se ha estudiado la enzima malato deshidrogenasa de hgado de paloma , enzima que cataliza la reduccin de piruvato en lactato segn la siguiente reaccin global Piruvato + NADPH + H+ <----------> L- Lactato + NADP+ La reaccin se puede seguir por disminucin de absorbcin de luz (absorbancia) a 340 nm, correspondiente a la oxidacin del NADPH. Se ha medido la velocidad de reaccin expresada en mU a diferentes concentraciones de piruvato y a 25C, lo que se muestra en la siguiente tabla Piruvato (mM) Velocidad de reaccin (mU) 1,5 4,0 2,5 6,0 3,5 7,5 6,0 10,4 12,0 14,0 a) Determine la velocidad mxima de la reaccin y la Km de piruvato. b) Si los potenciales de reduccin de lactato y NAD+ son -0.19 volts y -0.32 volts. c) Respectivamente Cul ser el G de esta reaccin? Tiende a formar lactato? d) Qu reacciones se acoplan en esta reaccin de oxido-reduccin? e) Si las concentraciones en un sistema celular a 37C son 80 mM de lactato y 20 mM de piruvato Cul ser el valor de G para este sistema? 8. Cmo puede distinguir experimentalmente si un inhibidor acta en forma competitiva o no-competitiva? 9. a) Qu entiende por enzima alostrica? y Cmo puede reconocerla? Explique sobre la base de una enzima con efecto heterotrpico. b) D dos ejemplos de enzimas alostricas indicando sus efectores positivos y negativos. 10. a) Qu entiende por regulacin por modificacin covalente? b) Qu efecto tiene la fosforilacin y la defosforilacin sobre la actividad de una enzima? D 2 ejemplos.
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Laboratorio N 6: Metabolismo de carbohidratos fermentacin.

INTRODUCCIN Todos los seres vivos requieren un continuo aporte de nutrientes para suplir sus necesidades de materia y energa. El principal nutriente de la clula es la glucosa, la que es catabolizada para producir ATP, la forma ms importante de energa utilizable en la clula. El metabolismo de la glucosa ocurre a travs de una serie de reacciones: Gliclisis: Glucosa Ciclo de Krebs: Acetil CoA Piruvato, ATP CO2 + NADH + H+ + FAD + ATP ATP + H2O
Cadena respiratria: NADH + H+, FADH2 + O2
En ausencia o deficiencia de oxgeno, ocurre respiracin celular anaerbica o fermentacin, en que el piruvato (producto de la gliclisis) se transforma en etanol (levaduras) o acido lctico (msculo). En presencia de oxgeno suficiente ocurre respiracin celular aerbica, en que el piruvato se incorpora a la mitocondria y se transforma en Acetil CoA, el cual a travs del ciclo de Krebs origina CO2 y coenzimas reducidas. Estas coenzimas reducidas se incorporan a la cadena respiratoria mitocondrial, donde son reoxidados por O2, produciendo ATP y H2O. Esta va aerbica es la principal va de produccin de ATP. Algunas clulas como los glbulos rojos y las bacterias anaerbicas estrictas tienen en la fermentacin la nica va de produccin de ATP, en tanto que otras clulas como las levaduras, que son anaerobios facultativos, en ausencia de O2 realizan fermentacin y en presencia de l, realizan fermentacin y respiracin celular. OBJETIVOS 1. Observar experimentalmente los fenmenos de respiracin celular anaerbica (fermentacin) en levaduras. 2. Comprobar el efecto de inhibidores de la gliclisis y de la respiracin celular. 3. Aplicar los conceptos de sustrato, inhibidores competitivos, inhibidores no competitivos, oxido-reduccin, modificacin de pH e inhibidores en la interpretacin de sus resultados.
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ACTIVIDADES Fermentacin alcohlica en levaduras (Saccharomyces cerevisiae). La fermentacin alcohlica en levaduras ocurre de acuerdo a la reaccin: C6H12O6 2CO2 + 2 C2H5OH (etanol)
El etanol se acumula en el medio y el CO2 es liberado como gas, por lo que se puede medir la fermentacin por la produccin de CO2. Procedimientos. 1. Complete la siguiente batera de tubos: Tubos Suspensin de levadura 7% Solucin de glucosa Solucin NaF Agua destilada (43C) Solucin rojo neutro 1 1 ml 2 ml 2 1 ml 1 ml 1 ml 3 1 ml 1 ml 1 ml 4 1 ml 1 ml 1 ml
Agitar por inversin para homogenizar el contenido de cada tubo. 2. Tapar cada tubo con un frasco de penicilina invertido, presionndolo girar rpidamente de manera que el tubo quede invertido dentro del frasco. Marcar el nivel de la burbuja en la parte superior del tubo y amarrando con un elstico los 4 frascos, ponerlos a incubar en un bao de agua a 43C. 3. Al cabo de 30 min. marque el nivel final de la solucin en el tubo y mida el volumen de gas producido con una pipeta con agua. 4. Cual es el objetivo del tubo 4? Verifique el pH en el tubo 2 con papel pH. 5. Anote y discuta sus resultados. Soluciones: 1. Solucin de levadura: disolver a homogeneidad 7 g de levadura en 10 ml de agua destilada a 43C y completar a 100 ml con agua destilada a 43C. 2. Solucin de glucosa 0,1 M 3. Solucin de NaF 0,1 M 4. Solucin rojo neutro 0,02 M Papel pH.
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Laboratorio N 7: Metabolismo de carbohidratos ciclo de krebs

INTRODUCCIN Todos los seres vivos requieren un continuo aporte de nutrientes para suplir sus necesidades de materia y energa. El principal nutriente de la clula es la glucosa, la que es catabolizada para producir ATP, la forma ms importante de energa utilizable en la clula. El metabolismo de la glucosa ocurre a travs de una serie de reacciones: Gliclisis: Glucosa Ciclo de Krebs: Acetil CoA Piruvato, ATP CO2 + NADH + H+ + FAD + ATP ATP + H2O
Cadena respiratria: NADH + H+, FADH2 + O2
En ausencia o deficiencia de oxgeno, ocurre respiracin celular anaerbica o fermentacin, en que el piruvato (producto de la gliclisis) se transforma en etanol (levaduras) o acido lctico (msculo). En presencia de oxgeno suficiente ocurre respiracin celular aerbica, en que el piruvato se incorpora a la mitocondria y se transforma en Acetil CoA, el cual a travs del ciclo de Krebs origina CO2 y coenzimas reducidas. Estas coenzimas reducidas se incorporan a la cadena respiratoria mitocondrial, donde son reoxidados por O2, produciendo ATP y H2O. Esta va aerbica es la principal va de produccin de ATP. Algunas clulas como los glbulos rojos y las bacterias anaerbicas estrictas tienen en la fermentacin la nica va de produccin de ATP, en tanto que otras clulas como las levaduras, que son anaerobios facultativos, en ausencia de O2 realizan fermentacin y en presencia de l, realizan fermentacin y respiracin celular. Respiracin aerbica en corazn o hgado de rata. La deshidrogenada succnica es una enzima del ciclo de Krebs, que cataliza la oxidacin de acido succnico a cido fumrico. Usando FAD+ como coenzima. Esta enzima es especifica para el acido succnico, pero puede ser inhibida competitivamente por el acido malnico.
+ FAD
+ FADH+
Succinato
Fumarato
Malonato
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En sistemas de ensayo con extractos de tejido, se puede utilizar azul de metileno como aceptor de electrones de H+ el cual en estado oxidado es azul y en estado reducido es incoloro. Por lo tanto se puede reconocer la actividad enzimtica por la decoloracin del azul de metileno en ausencia de oxgeno, ya que el oxigeno del aire reoxida el azul de metileno. OBJETIVOS 1. Observar experimentalmente los fenmenos de respiracin celular aerbica en extractos de tejidos. 2. Comprobar el efecto de inhibidores de la gliclisis y de la respiracin celular. 3. Aplicar los conceptos de sustrato, inhibidores competitivos, inhibidores no competitivos, oxido-reduccin, modificacin de pH e inhibidores en la interpretacin de sus resultados. ACTIVIDADES 1. Complete la siguiente batera de tubos. Tubos Tampn fosfato Preparacin enzima Glucosa 0,1 M Succinato 0,1 M Malonato 0,1 M KCN 0,05 M 1 4 ml 1 ml 2 2 ml 1 ml 1 ml 1 ml 3 2 ml 1 ml 1 ml 1 ml 4 2 ml 1 ml 1 ml 0,5 ml 0,5 ml 5 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Nota: Agregar KCN con propipeta, NO USE LA BOCA PARA PIPETEARLO. 2. Mezclar por inversin y agregar 5 gotas de azul de metileno 0,02 % inclinando el tubo agregar por la pared del tubo una capa de aceite para aislar el aire de la mezcla de ensayo. 3. Incubar los tubos a 37C por una hora, observar y anotar los resultados. 4. Agite el tubo decolorado. Que observa? Explique. Analizar y discutir los resultados. Presentar un informe escrito. Soluciones: 5. Preparacin enzimtica de succinato deshidrogenada. Preparar un homogeneizado de corazn o hgado de rata al 20% p/v en tampn fosfato 100 mM a temperatura ambiente. Centrifugar a 1000 rpm aproximadamente y obtenga el sobrenadante que ser la preparacin enzimtica y consrvelo a 4C. 6. Solucin de glucosa 0,1 M 7. Solucin de azul de metileno 0,02 M 8. Solucin de succinato de sodio 0,1 M
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9. Solucin de malonato de sodio 0,1 M 10. Tampn fosfato 100mM 11. KCN 0,05 M Las soluciones 8 y 9 llevarlas a pH 7 con NaOH 0,2 M Nota: Soluciones NaF y KCN agregar con propipeta
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Seminario N 4: Estructura y metabolismo de hidratos de carbono

INTRODUCCIN Los organismos vivos dependen de un continuo aporte de materia y energa para realizar sus funciones bsicas y son dos los principales procesos de obtencin de energa: nutricin autotrfica y nutricin heterotrfica. En la nutricin autotrfica los organismos vegetales con clorofila realizan fotosntesis capturando para ello la energa solar en molculas orgnicas, principalmente hidratos de carbono. En la nutricin heterotrfica los organismos vivos aprovechan los productos de la fotosntesis para obtener energa a travs de procesos degradativos exergnicos u oxidativos. As, los hidratos de carbono que son el primer y principal producto de la fotosntesis, son a la vez la principal fuente de energa de la clula, cuyo metabolismo est adaptado para usar hidratos de carbono por gliclisis anaerbica o fermentacin o por respiracin celular va gliclisis, ciclo de Krebs y cadena respiratoria mitocondrial. Con respecto a los hidratos de carbono se sabe que las hexosas-P son la primera fuente de energa en la clula. A partir de su transformacin metablica se producen triosas-P que son intermediarios de alta energa para generar ATP en la gliclisis, dando piruvato como producto de esta va. El metabolismo mitocondrial aerbico del piruvato genera una serie de cidos carboxlicos que a travs de reacciones de oxido-reduccin generan a su vez coenzimas reducidos (NADH + H+ y FADH2) y liberan CO2. Estas coenzimas reducidas aportan electrones de alta energa para que en la cadena respiratoria mitocondrial se produzca la sntesis de ATP. El aceptor final de estos electrones es el oxgeno, el cul una vez reducido interacta con protones para producir agua. En resumen el metabolismo aerbico de la glucosa da como productos finales ATP, CO2 y agua. Es importante destacar la importancia de los sistemas enzimticos en estas vas metablicas, ya que adems de catalizar las mltiples reacciones, realizan un estricto control del metabolismo OBJETIVOS 1. Revisar la estructura, caractersticas e importancia de los hidratos de carbono 2. Conocer y comprender el papel de los hidratos de carbono como fuente de energa en la clula en relacin a los requerimientos energticos de los seres vivos 3. Conocer las vas metablicas de utilizacin de los hidratos de carbono, comprender sus mecanismos de regulacin y sus interrelaciones con otras vas metablicas 4. Conocer y comprender los mecanismos de regulacin de la glicemia en los organismos animales, especialmente mamferos
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CUESTIONARIO 1. Escriba la estructura de cadena abierta y/o cclica de: a) D- deoxiribosa b) -D- glucopiranosa c) -D- fructofuranosa -6-P d) Sacarosa e) Glucosa - 1- P f) Glucosa - 6 P g) Gliceraldehdo -P 2. Qu entiende por: a) b) c) d) e) f) Enantimeros Anmeros Enlace glicosdico 1-4 Cetohexosa Homopolisacrido Glicosaminoglicanos
3. Considerando que el Go de oxidacin completa de la glucosa es - 686.000 cal / mol y que el Go de formacin del ATP es de -7.500 cal /mol Cul sera la produccin de ATP en moles por la oxidacin de un mol de glucosa asumiendo una eficiencia energtica del 100%? Cul es el rendimiento real en la clula? 4. *Para un individuo que realiza trabajo pesado se estima un requerimiento energtico de 147 cal / min/ k de peso. Calcule el consumo de ATP expresado en gramos de un individuo de 70 kilos que realiza 8 horas de trabajo pesado. (PM ATP = 507.2 g/ mol). 5. *Con respecto a la glucosa indique a) Por qu es el principal carbohidrato utilizado en la clula? b) Cul puede ser el origen de la glucosa utilizada por los tejidos? Esquematice. c) Como se regula el nivel de glucosa sangunea o glicemia? Esquematice. 6. Qu papel tiene el glicgeno almacenado en el hgado y en el msculo esqueltico? Cmo se regula su nivel? 7. Seale las diferentes vas metablicas que puede seguir la glucosa -6-fosfato en la clula, indicando su importancia y su localizacin celular 8. *Respecto a la gliclisis indique: a) En un esquema los productos e intermediarios de esta va b) Cul es el papel de las primeras fosforilaciones que sufre la glucosa al ingresar a la clula e incorporarse a la gliclisis? c) Analice la importancia de la gliclisis en el msculo y en el glbulo rojo El usuario solo podr utilizar la informacin entregada para su uso personal y no comercial y, en consecuencia, le queda prohibido ceder, comercializar y/o utilizar la informacin para fines NO acadmicos. La Universidad conservar en el ms amplio sentido la propiedad de la 27
d) Cules son las etapas reguladas de esta va? Indique sus mecanismos de regulacin e) Cules son los productos de la glicolisis en condiciones aerbicas y con dficit de oxgeno en una clula muscular? Porqu siendo tan baja la produccin de ATP por la va anaerbica es tan alta su importancia para el trabajo muscular intenso? f) Qu efecto tiene en la glicolisis la adicin del i. Iodoacetato ii. Fluoruro iii. ATP iv. Fructosa 2,6 difosfato 9. Con respecto al ciclo de Krebs o ciclo del cido ctrico indique a) b) c) d) Cul es su importancia en el metabolismo? Porqu esta va es dependiente de oxgeno? Los sitios de la va en que se produce CO2, NADH, FADH2 y ATP Las etapas reguladas de esta va y los factores que la afectan
10. *Si tiene una preparacin de mitocondrias aisladas. a) Qu efecto tiene la adicin de KCN? y Qu consecuencias tiene para el ciclo de Krebs y la glicolisis? b) Qu tipo de sustancia es un compuesto desconocido que al agregarlo al sistema inhibe la fosforilacin oxidativa y aumenta el consumo de oxgeno? c) Cmo se explican las diferencias de produccin de ATP a partir de NADH citoslico y NADH mitocondrial? d) Cul es el mecanismo que explica la produccin de ATP a nivel mitocondrial?
NOTA: Las preguntas marcadas con asterisco se deben desarrollar de preferencia.
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Laboratorio N 8: Extraccin y Cromatografa de Lpidos

INTRODUCCIN Los lpidos comprenden una amplia gama de compuestos insolubles en agua y solubles en solventes orgnicos (ter, acetona, cloroformo, benceno, etc.). Debido a su insolubilidad en agua, los lpidos presentes en las estructuras biolgicas se encuentran generalmente asociados a otras biomolculas como protenas e hidratos de carbono. Por otra parte, aunque los lpidos se consideran sustancias hidrofbicas o apolares, presentan diferente grado de polaridad. Los triglicridos totalmente apolares, no tienen ningn grado de interaccin con el agua, en tanto que los fosfolpidos son molculas bipolares e interactan con el agua formando monocapas, bicapas y micelas. El colesterol es tambin una molcula bipolar debido al grupo OH unido a su anillo esteroidal. As por ejemplo la acetona extrae principalmente triglicridos y colesterol, ya que los fosfolpidos son poco solubles en acetona. Por lo tanto, cualquier mtodo de extraccin de lpidos requiere utilizar mezclas de solventes orgnicos que permitan solubilizar todos los lpidos y precipiten protenas e hidratos de carbono para su mejor separacin. Aprovechando la solubilidad diferencial de los lpidos se puede realizar una extraccin fraccionada con distintos solventes, lo que permite a la vez la separacin de los diferentes lpidos Se pueden extraer lpidos totales con una mezcla de metanol:ter (1:1) y separarlos posteriormente por cromatografa de adsorbcin en capa fina. La separacin de los componentes de una mezcla por cromatografa de adsorbcin, se basa en: 1. El diferente grado en que cada componente se une o es adsorbido a un soporte slido (fase estacionaria) 2. La diferente solubilidad de las sustancias de la mezcla en una combinacin de solventes de diferente polaridad, que se hace pasar por el soporte slido ( fase mvil) El soporte slido debe ser los suficientemente poderoso (activo) para retener la mayor cantidad de sustancia. Por ejemplo el gel de slica se utiliza como soporte slido para sustancias apolares como los lpidos. El grado de adsorbcin de cada sustancia es variable, as por ejemplo un fosfolpido con un grupo bastante polar ser ms retenido que el colesterol libre con un grupo menos polar y ste ms retenido que los triglicridos. De esta manera, el fosfolpido y el colesterol migran ms lentamente que los triglicridos, haciendo posible su separacin. Para la identificacin de los diferentes lpidos se usan patrones o estndar de la sustancia pura y se reconocen por comparacin de sus Rf.
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Frente del solvente
Rf = Distancia recorrida por la sustancia (x) Distancia recorrida por el solvente (d) El Rf es una constante para cada sustancia en las condiciones establecidas
d Punto de aplicacin
Placa de cromatografa: Placa de vidrio (20 x 20 cm.) Para la cromatografa de adsorbcin se usan placas de vidrio de 20 x 20 cm., cubiertas con una capa fina (+ 0,25 mm) de gel de slice (Silica gel G), formada a partir de una pasta fluida (10 g de Silica gel G + 20 ml de agua destilada). La placa es posteriormente deshidratada o activada colocndola a 120C por 30 minutos. OBJETIVOS Esta actividad de trabajo de laboratorio tiene como objetivos que 1. Los alumnos conozcan mtodos generales de extraccin de lpidos 2. Conozcan mtodos cromatogrficos sencillos de separacin e identificacin de lpidos 3. Comprendan las propiedades fisicoqumicas de los lpidos involucradas en la extraccin y cromatografa de lpidos con solventes orgnicos ACTIVIDADES 1. Extraccin de lpidos de yema de huevo. Colocar una yema de huevo en un matraz de 250 ml (con tapa) y agregar 50 ml de etanol y 50 ml de ter, tapar hermticamente y agitar. Dejar reposar 10 minutos y filtrar con papel filtro. El filtrado ser utilizado como muestra para separar e identificar lpidos. 2. Aplicacin de muestras y desarrollo de la cromatografa Tomar cuidadosamente una placa de vidrio cubierta con slica gel y marcar cuidadosamente 5 puntos para la aplicacin de la muestra y los 4 estndar: Triglicridos, colesterol, cido esterico y fosfolpidos. Las muestras y los estndar se colocan en la placa a ms o menos 2 cm del borde inferior. Las sustancias se aplican con una micropipeta gota a gota de manera que la mancha sea del menor dimetro posible, para ello se aplica la gota y se seca con secador de pelo cada vez. Posteriormente se pone la placa cromatogrfica en una cmara con una mezcla de solvente cloroformo:metanol:amoniaco (75 : 25 : 4), previamente saturada, para correr la cromatografa. El nivel de solvente en la cmara no debe ser mayor a 1,5 cm. Al cabo de de hora a 1 hora se saca la placa y se marca el frente del solvente.
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Se seca la placa y se revela en una cmara con vapores de yodo o por pulverizacin (spray) con cido fosfomolbdico etanlico 10 % p/v y se colocan en la estufa a 110 C por 10 minutos. En este ltimo caso se deja evaporar el alcohol antes de ponerlo a la estufa. A partir de las manchas producidas por el revelado se calculan los Rfs y se comparan las muestras con los estndar para la identificacin de las sustancias de la muestra. Anote sus resultados y compare con los datos de la literatura. Discuta con respecto a los valores de Rf obtenidos y la composicin de lpidos de la yema de huevo. Material y Reactivos: 1. Huevos enteros ( se ocupar la yema como fuente de lpidos) 2. Mezcla Metanol Eter (1:1 v/v) 3. Mezcla Cloroformo - Metanol Amoniaco (75:25:4 v/v) o Eter de petroleo: ter etlico: cido actico (10 :90 :1) 4. Soluciones 2 mg/ml en metanol-eter (1:1) de colesterol, tripalmitina, lecitina y cido Esterico (soluciones estndar) 5. Acido fosfomolbdico 10% en etanol 6. Yodo metlico 7. Placas de cromatografa (20 cm x 20 cm) 8. Slica gel G 9. Cmaras cromatogrficas de vidrio, con tapas. 10. Estufa a 110C 11. Secador de pelo 12. Micropipetas o pipetas Pasteur Nota: Las placas cromatogrficas se deben preparar con bastante antelacin (3 o 4 das); deben estar totalmente secas. O bien, se compran listas, existen en el mercado placas preparadas para cromatografa de lpidos. BIBLIOGRAFA 1. Clark J.M. Jr. (ed) Experimental Biochemistry, W. H. Freeman and Co. 1964. Pgs. 43 51. 2. Abboot D. y Andrews R.S. Introduccin a la cromatografa, Editorial Alambra S.A. 2 Edicin , 1970. 3. Nelson D.L. y Cox M.M. Principios de Bioqumica de Lehninger, 3 Ed.2000. Cap.11.
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Seminario N 5: Estructura y Metabolismo de Lpidos

INTRODUCCIN Los lpidos constituyen un grupo heterogneo de sustancias orgnicas insolubles en agua y solubles en solventes orgnicos como cloroformo, eter, acetona, etc. Los lpidos naturales se encuentran mayoritariamente como grasas slidas y aceites, con un rol principalmente de reserva energtica o aislante trmico o elctrico. Los lpidos son componentes de las membranas biolgicas (fosfolpidos) y tienen un importante papel en la regulacin (hormonas esteroidales, prostaglandinas, etc). Los lpidos de la dieta pueden afectar la composicin de lpidos de la clula y alterar las funciones biolgicas. El efecto de los lpidos de la dieta en la salud humana ha sido ampliamente estudiado y existen recomendaciones aconsejando el consumo de cidos grasos insaturados omega 3 y disminuir el consumo de colesterol, con el fin de prevenir alteraciones de las funciones cardiovasculares. Segn su composicin qumica las grasas naturales existen como steres de glicerol y cidos grasos (acilglicridos), o como steres de cidos grasos y esfingosina (esfingolpidos). Los cidos grasos son de dos tipos: cidos saturados, como los cidos grasos palmtico (16 C) y esterico (18 C), que son los ms abundantes y cidos grasos insaturados tales como los cidos oleico (18 C: 1), el cido linoleico (18 C:2, 6) y el cido Linolnico (18 C : 3, 3), siendo estos dos ltimos cidos grasos esenciales. La grasa ms abundante son los triglicridos (TG), principal reserva de energa de los seres vivos. Otro importante grupo de lpidos son los esteroides entre los que se encuentra el colesterol y sus derivados, tales como los cidos biliares y las hormonas estroidales. La utilizacin metablica de los lpidos, ya sea a partir de la dieta o de las reserva de TG, implica un proceso de activacin citoslica y oxidacin mitocondrial y peroxisomal (- oxidacin). Ambos proceso producen coenzimas reducidos (NADH y FADH2) y AcetilCoA, pero slo la oxidacin mitocondrial est acoplado a la produccin de ATP, en tanto que la oxidacin peroxisomal debe enviar sus productos a la mitocondria para generar ATP. La oxidacin de lpidos representa una alta fuente de energa para la clula, pero su uso excesivo genera exceso de cuerpos cetnicos y acidosis metablica, tal como ocurre en la diabetes y el ayuno prolongado. El organismo presenta una alta capacidad para acumular lpidos como triglicridos (lipognesis), esterificando el exceso de cidos grasos provenientes de la dieta o esterificando cidos grasos sintetizados a partir de hidratos de carbono y aminocidos.
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Con excepcin de los vegetales y algunos microorganismos, los organismos vivos tienen capacidad de sintetizar colesterol. En los mamferos el principal sitio de sntesis de colesterol es el hgado, el que es a la vez el principal sitio de degradacin de colesterol a cidos biliares. OBJETIVOS El desarrollo de esta gua de ejercicios pretende que los alumnos 1. Conozcan la composicin qumica y las propiedades de los lpidos 2. Conozcan y comprendan los procesos de transporte, las vas metablicas y mecanismos de regulacin en la utilizacin y biosntesis de los lpidos 3. Comprendan las relaciones del metabolismo de lpidos con otras vas metablicas y las alteraciones del metabolismo en patologas asociadas al metabolismo de lpidos. CUESTIONARIO 1. Escriba la estructura molecular de: a) cido graso C 20:4, 6,9,12,15 (serie 6) b) cido linolnico C 18:3, 3, 6,9 (serie 3) c) Tripalmitina d) Fosfatidil etanolamina e) Colesterol f) Etinil estradiol (anticonceptivo oral) Indique la polaridad y solubilidad en agua de cada compuesto. 2. Describa brevemente el proceso de digestin , absorbcin y transporte de lpidos 3. De qu manera afecta a la utilizacin de lpidos de la dieta: a) Una falla pancretica b) Una falla heptica 4. Esquematice el proceso de - oxidacin mitocondrial del cido esterico (C 18:0). Establezca a) El nmero de moles de NAD+, FA D+, ATP y CoASH requeridos b) Los moles de ATP producidos por la oxidacin completa del cido graso 5. Cmo se regula el nivel de cidos grasos libres en el plasma? Esquematice 6. Qu entiende por cetognesis? En que condiciones normales o patolgicas se puede producir un aumento de cuerpos cetnicos en el plasma? Explique 7. Explique brevemente Qu efecto tendr en la biosntesis de lpidos
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a) Un aumento del nivel de I. AcetilCoA II. Citrato III. Acidos grasos libres b) Una disminucin del nivel de I. Biotina II. NADPH III. Glucosa 8. Qu relaciones puede establecer entre el metabolismo de glucosa y la biosntesis de triglicridos? En base a estas relaciones explique porqu una dieta habitualmente rica en hidratos de carbono produce obesidad 9. Un investigador en la Antrtida decide utilizar mantequilla como fuente de energa. Explique qu le suceder al cabo de 15 das con respecto a: a) El nivel de cetognesis b) La utilizacin de sus protenas corporales 10. Esquematice el rol de las lipoprotenas plasmticas (QM, VLDL, LDL, HDL) en el transporte de lpidos.Qu importancia tiene su determinacin en el diagnstico de enfermedades cardiovasculares? 11. Esquematice las vas de utilizacin y sntesis de colesterol. Qu relacin tiene con la biosntesis de cidos biliares? 12. Podra prescindir de la presencia de lpidos en la dieta? Explique BIBLIOGRAFA 1. Nelson y Cox Bioqumica de Lehninger Captulos 11, 17 y 21
2. Styer Lbert Bioqumica 4 Edicin 1995 . Edit. Revert . Captulo 24.
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Seminario N 6A: Metabolismo de aminocidos

INTRODUCCIN El recambio natural de todas las protenas y otros compuestos nitrogenados, con una vida media de das a meses, exige un aporte constante de protenas en la dieta. La dieta normal debe contener alrededor de 20 % del contenido energtico en protenas de buena calidad, que aporte todos los aminocidos esenciales y que tenga alta digestibilidad. Las protenas ingeridas son digeridas por proteasas a nivel estomacal e intestinal dando origen a pptidos y aminocidos cuya absorcin intestinal depende de transportadores. Tambin existe absorcin de protenas no digeridas por pinocitosis, lo cul es de gran importancia para incorporar anticuerpos de la leche materna en la inmunizacin pasiva de los recin nacidos. La falta de protenas de la dieta determina aumento de degradacin de protena endgena, utilizadas como fuente de nitrgeno y de aminocidos, especialmente de aminocidos esenciales. En caso de ayuno prolongado se degradan protenas corporales como fuente de energa, lo que implica el catabolismo de los aminocidos a travs de dos procesos 1. Incorporar el esqueleto hidrocarbonato (cetocido) en las vas oxidativas de obtencin de ATP o en la formacin de glucosa por gluconeognesis y 2. Eliminar el grupo amino por transaminacin para formar aminocidos no esenciales y otros productos nitrogenados o generar amonio (NH4+) por desaminacin oxidativa, para posteriormente sintetizar urea, producto menos txico que el amoniaco. Las transaminaciones juegan tambin un importante papel en la eliminacin del nitrgeno proteico, ya que las transaminasas transfieren el grupo amino de la mayor parte de los aminocidos hasta glutamato, dado que este aminocido es el nico que sufre deaminacin oxidativa apreciable por la enzima glutamato deshidrogenada, enzima alostrica con alta actividad en hgado y activada por ATP, GTP y NADH. El transporte del grupo amino desde otros tejidos al hgado se realiza como glutamina, no toxica, la cul es desaminada a glutamato por la enzima glutaminasa heptica, liberando amonio para la sntesis de urea. Una glutaminasa renal libera amonio que es eliminado directamente en la orina. La glutamina sintetasa es una importante enzima que permite remover el amonio txico de los tejidos, especialmente del cerebro, sobre todo cuando existe una falla heptica. El hgado juega un rol central en la remocin del amonio producido por los tejidos convirtindolo en glutamato y urea.
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El hombre bien alimentado, con una actividad moderada, consume aproximadamente 100 gramos de protena al da y excreta 16 gramos de nitrgeno, 95% del cul es eliminado por los riones y el 5% restante por las heces. Entre el 80% al 90% del nitrgeno excretado por los riones es en forma de urea, sintetizada exclusivamente por el hgado, con un alto costo energtico. Por cada mol de urea formada se requieren 3 moles de ATP, como se aprecia en la reaccin siguiente de la sntesis de urea 2 NH4+ + CO2 + 3 ATP + 3 H2O -------------> urea + 2 ADP + AMP + Pi Existen varios desrdenes metablicos asociados con deficiencias de enzimas de la sntesis de urea y cuyos sntomas ms frecuentes son vmitos, intolerancia a protenas, letargo, ataxia intermitente y retardo mental. CUESTIONARIO 1. Haga un esquema del ciclo del nitrogeno y discuta la importancia de los vegetales en la incorporacin del nitrgeno a la cadena alimenticia. 2. Qu entiende por Recambio de protenas y Balance Nitrogenado (BN)? 3. Qu entiende por aminocidos esenciales? Nmbrelos. Qu relacin puede establecer entre los aminocidos esenciales con el Valor Biolgico de las protenas y su efecto en el Balance Nitrogenado? 4. Qu mecanismos de transporte importancia del Glutatin? de aminocidos conoce? Cul es la
5. Complete el esquema siguiente indicando con flechas las relaciones entre los distintos metabolitos. Protenas de la dieta ----------> L aminocidos <---------> Protenas corporales Urea NH4+ Orina Aminaciones y Transaminaciones NH3 Glucosa cetocidos Acetil CoA y cuerpos cetnicos Acidos grasos CO2 + H2O
6. Con respecto al catabolismo de los aminocidos indique a) b) c) d) Cul es el destino de los aminocidos ingeridos en la dieta? Cul es la fuente endgena ms importante de aminocidos? Compare la importancia de las transaminasas y de glutamato deshidrogenada. Cul es el destino del NH3 producido por desaminacin oxidativa? 36
e) Con respecto a la glutamina sintetasa y la gluaminasa, indique su importancia y su localizacin tisular y celular. 7. Qu interpretacin se puede dar a los aumentos de las transaminasas en el plasma o suero sanguneo? 8. Qu relacin (es) puede establecer entre el metabolismo de los aminocidos y el metabolismo de los hidratos de carbono? 9. En el estudio del metabolismo ha sido de gran importancia el uso de istopos para marcar nutrientes y metabolitos y seguir su camino en las vas metablicas. Al respecto indique como se explica que a) Si a un animal de experimentacin se administra una dieta completa adicionada con Alanina N15, presente cido glutmico- N15 y urea- N15? b) Cmo se explica la marca C14 y/o N15 en las protenas, hidratos de carbono, lpidos y cidos nucleicos de un animal que fue alimentado con alanina C14,N15? BIBLIOGRAFA 1. Syllabus de Bioqumica General Universidad Santo Tomas , Sesiones 18 y 19. 2. Nelson D.L. y Cox M. M. Principios de Bioqumica de Lehninger, Worth Publishers 3 Edicin 2000, Captulo 18. (Edicin en espaol de Editorial OmegaBarcelona). 3. Stryer N.V.L. Bioqumica Editorial Revert 4 Edicin, 1995. Captulo 25.
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Seminario 6B: Fotosntesis

INTRODUCCIN La luz solar es la fuente de energa directa o indirecta que hace posible la vida en la tierra. La fotosntesis es la conversin de energa luminosa en energa qumica y de ella dependen todos los sistemas biolgicos. Las plantas como organismos auttrofos y fotosintetizadotes dependen directamente de la luz solar, en tanto que los animales hetertrofos tienen una dependencia indirecta ya que deben de alimentarse de otros organismos vegetales y/o animales. Para los organismos auttrofos basta la energa solar, una fuente de carbono y agua para iniciar los procesos que satisfacen sus necesidades energticas y de paso sostienen toda la vida en la tierra. Energa solar 6 CO2 + 6 H2O ----------------> C6H12O6 + 6 O2 Clorofila Esta ecuacin qumica general de la fotosntesis no dice nada respecto del detalle de los procesos Qu papel juega la luz y cul es la naturaleza de la luz utilizada?, Cmo se sintetizan los compuestos orgnicos?, De donde se origina el oxgeno?, Cmo se transfiere la energa de los fotones a las molculas orgnicas?, Qu sistemas enzimticos participan?, etc El proceso fotosinttico ocurre en dos etapas; en una primera etapa dependiente de luz (etapa clara) se produce ATP y coenzimas reducidos (NADPH) y se lleva a cabo en los tilacoides de los cloroplastos. Una segunda etapa que no depende directamente de luz (etapa obscura), utiliza ATP, NADH + H+ y CO2 para producir azcar y se realiza en el estroma del cloroplasto. Las reacciones de la luz o de la etapa clara, se realizan por 2 fotosistemas, complejos fotosintticos que realizan transferencia de electrones de alta energa, desde la molcula de agua, para producir ATP (fotofosforilacin) y reducir el NADP+ a NADPH. Un fotosistema I (P700), asociado a ferredoxina, produce la reduccin de NADP+ y un fotosistema II (P680), produce la fotolisis del agua. Ambos fotosistemas, estn conectados por una cadena transportadora de electrones que contiene plastoquinona (PQ), citocromos (complejo f-b6) y plastocianina (PC). La fotofosforilacin puede ser cclica y nocclica, la fotofosforilacin no cclica genera ATP y NADPH y utiliza ambos fotosistemas, en tanto que la fotofosforilacin cclica produce ATP solamente y no produce liberacin de O2. La sntesis de ATP se explica por la teora quimiosmtica en forma similar a la sntesis de ATP mitocondrial. La etapa oscura o ciclo de Calvin-Benson utiliza ATP y NADPH para fijar CO2 en molculas orgnicas, siendo la Ribulosa-biP el aceptor de CO2 y el 3-P-Glicerato el intermediario estable. La ribulosa-bi P- carboxilasa (Rubisco), enzima El usuario solo podr utilizar la informacin entregada para su uso personal y no comercial y, en consecuencia, le queda prohibido ceder, comercializar y/o utilizar la informacin para fines NO acadmicos. La Universidad conservar en el ms amplio sentido la propiedad de la 38
universalmente presente en organismos fotosintetizadotes, es la protena ms abundante en la biosfera y cataliza la incorporacin de CO2 a la ribulosa-biP. La rubisco tambin acta como oxidasa catalizando la reaccin de la Ribulosa-biP con O2, reaccin conocida como fotorrespiracin y que interfiere con la fotosntesis. Las plantas desarrollaron sistemas que contrarrestan la fotorrespiracin, como son las plantas C4 y las plantas CAM. CUESTIONARIO 1. Dibuje un esquema del cloroplasto tal como se aprecia al microscopio electrnico. Anote el nombre de todas sus partes e indquelas con una flecha. 2. Con respecto al punto anterior elabore un cuadro indicando la funcin de cada una de las partes del cloroplasto 3. Cul es el origen de los cloroplastos? Refirase al origen evolutivo y su formacin en la clula. Discuta al respecto la importancia de la presencia de ADN. 4. Qu entiende por el esquema Z? Constryalo y explique como funciona. 5. Con respecto al esquema anterior indique: a) Qu entiende por los fotosistemas I y II? Indique su funcin. b) Qu entiende por fotofosforilacin y que efecto tiene en ella el bloqueo del fotosistema I y la ausencia total de NADP+? c) Cmo se explica el transporte de electrones entre ambos fotosistemas y que importancia tiene en la fotofosforilacin? 6. Qu entiende por ciclo de Calvin Benson?, Cul es su importancia y que relacin tiene con los fotosistemas? 7. Con respecto a la fijacin de CO2 indique a) Cul es la molcula aceptora de CO2? b) Qu papel juega la rubisco en este proceso? c) Cuales son los principales intermediarios y los productos finales? 8. a) Qu entiende por fotorrespiracin y que consecuencias tiene para la fotosntesis? b) Indique los diferentes mecanismos de fijacin de CO2 de las plantas, indicando ventajas y desventajas. BIBLIOGRAFA 1. Syllabus de Bioqumica General, Universidad Santo Toms, Sesin 11. 2. Purves y otros. Life: The Science of Biology, Sinauer- Freeman Edits. 5 Edition, Chapter 8
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3. Nelson, D.L. y Cox, M.M., Principios de Bioqumica de Lehninger, Edit. Omega, 2 Edicin, 1993. Capitulo 18 ( captulo 19 de la 3 Edicin) 4. Govindjee y Coleman, How plants make oxygen? Scientific American , Feb. 1990. 5. Sommerville C.R. et S.C. Les photosynthses des plantes. La recherch . Vol 15, N 154, Avril 1984. Nota: De las revistas Scientific American y la Recherche existen ediciones en Castellano.
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Seminarios 7 y 8: Estructura y Funcin de los cidos Nucleicos

INTRODUCCIN Los cidos nucleicos son macromolculas formadas por polmeros de nucletidos, los que estn formados por una pentosa, una base nitrogenada (prica o pirimdica) y un grupo fosfato. Existen 2 tipos de cidos nucleicos, el ADN formado por desoxirribonucletidos y que es la molcula portadora de los genes y el ARN formado por ribonucletidos, a cargo de la sntesis de protenas. Los desoxirribonucletidos contienen el azcar desoxirribosa, las bases pricas adenina y guanina, las bases pirimdicas citosina y timina y el grupo fosfato. Los ribonucletidos se diferencian en el azcar ribosa y en que poseen uracilo en lugar de timina. Los nucletidos se unen por enlaces fosfodiester formando cadenas de ADN o de ARN. El ADN se presenta como una molcula de doble hlice, cuyas hebras complementarias y antiparalelas se unen a travs de puentes de hidrogeno entra las bases A T y C G,de manera que las relaciones A/T y C/G son siempre igual a 1 en todas las molculas de ADN. La cantidad de pares de A T y C G son variables y propios de cada especie. Las principales fuerzas estabilizadoras de la doble hlice son fuerzas hidrofbicas entre las bases nitrogenadas en el centro de la doble hlice. Existen 3 tipos de ADN, el ADN A y el ADN B formados por doble hlices enrolladas a la derecha y el ADN Z formado por una doble hlice enrollada a la izquierda. El ADN fisiolgico (funcional o activo) sera el ADN B, en tanto que el ADN Z sera no funcional o inactivo. Los ADN B y Z son interconvertibles lo que tiene importantes implicancias en regulacin gnica. El ARN en cambio est usualmente formado por una hebra simple, aunque puede presentar zonas de doble hebra. La funcin de los cidos nucleicos se puede representar por el llamado dogma central de la biologa, que muestra el flujo de informacin en la expresin gnica. Replicacin Transcripcin Traduccin ADN---------------> ADN ---------------- > ARN -------------> Protena
Funcin
La replicacin del ADN garantiza la transmisin de la informacin gentica entre las generaciones, pero permitiendo algunos cambios o mutaciones que permiten la variabilidad entre los individuos y que a largo plazo hacen posible la evolucin. La replicacin del ADN requiere la participacin de enzimas (polimerasas, ligasas, nucleasas, helicasas, etc., adems secuencias especficas que actan como seales de inicio de la replicacin. La transcripcin a su vez requiere de enzimas particulares y secuencias de inicio y de trmino de la transcripcin, reconocidas por factores que regulan la transcripcin. Existen diferencias en la organizacin del ADN
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de eucariontes y procariontes que se reflejan en la regulacin de la replicacin, transcripcin y traduccin del material gentico. La sntesis de protenas reaalizado por los cidos ribonucleicos (Ribosomal, Mensajero y de Transferencia) y dirigidos por el cdigo gentico, se realiza en los ribosomas con el aporte de aminocidos, enzimas, factores de regulacin y una fuente de energa. La expresin de los genes es un fenmeno bajo estricta regulacin, ejercida a diferentes niveles segn la organizacin del material gnico (genoma) en los diferentes organismos, pero bsicamente se puede ejercer a nivel de la transcripcin y la traduccin. Tambin existen mecanismos de regulacin postranscripcionales y postraduccionales, los que son particularmente importante en eucariontes. OBJETIVOS El desarrollo del presente cuestionario persigue que los alumnos 1. Conozcan las evidencias experimentales que apoyan el papel del ADN como material gentico, su estructura molecular y su mecanismo de replicacin 2. Analicen la composicin qumica y las caractersticas ADN y del ARN moleculares del
3. Revisen los mecanismos de replicacin enzimtica del ADN y su relacin con fenmenos de mutacin y reparacin del ADN 4. Conozcan el papel del ADN y del ARN en la expresin de los genes a travs de la revisin y anlisis de los procesos de transcripcin y traduccin gnica. 5. Comprendan los mecanismos que regulan la expresin de los genes en la sntesis de molculas especficas de protenas CUESTIONARIO 1. Qu consideraciones apoyan el papel del ADN como material hereditario? 2. Indique una evidencia experimental que demuestra el papel del ADN como material hereditario? 3. En relacin a la composicin qumica del ADN indique que entiende por: a) b) c) d) Nucleosido Nucleotido, Indices de Chargaff, Efecto hipercrmico, 42
e) Hebras antiparalelas f) Enlaces N-glicosdico y fosfodiester g) Replicacin semiconservativa 4. Compare la composicin qumica del ADN y el ARN Qu caractersticas presenta la estructura de doble hlice del ADN y que factores determinan esta estructura? 5. Qu evidencias experimentales demuestran un mecanismo de replicacin semiconservativo del ADN en procariontes y eucariontes? 6. Qu requerimientos presenta la la autoreplicacin del ADN? 7. Cmo se explica la replicacin bidireccional y simultnea de las dos hebras del DN, si la ADN polimerasa sintetiza slo en sentido 5 3 ? 8. Cmo se explica que la duplicacin de todo el ADN celular humano dure slo horas (+ o 10 hrs.), si por su velocidad de sntesis (aprox. 2000 p.b./min) debera tomar alrededor de 3 aos? 9. Qu tipo de mutaciones debe sufrir el ADN y cuales son sus consecuencias genticas? 10. Indique que evidencias apoyan la expresin gentica a travs del control de la sntesis de las protenas 11. Compare los procesos de replicacin y transcripcin del ADN. 12. Qu diferencias y semejanzas puede establecer en transcripcin de procariontes y eucariontes? los procesos de
13. En que consiste el procesamiento del ARN transcrito primario hasta ARNm maduro? 14. Responda las siguientes preguntas a) Qu entiende por: codn, anticodn, triplete sin sentido, codn de inicio b) Cules son las caractersticas del cdigo gentico? c) A la luz de la informacin actual se puede seguir manteniendo que el cdigo gentico es universal? d) Qu significa que el cdigo gentico sea degenerado? y cul sera a su juicio la importancia gentica de esta caracterstica del cdigo gentico? e) Qu importancia gentica tiene la hiptesis del balanceo en la lectura del codn por el anticodn?
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15. La siguiente secuencia de bases corresponde al segmento de la hebra de ADN que codifica el nonapptido oxitocina. I II III 5......... ACAATAAATTTGATTACAAGGACGACC........ 3 a) Escriba la secuencia del ARNm correspondiente b) Utilizando el cdigo gentico adjunto determine la secuencia de aminocidos de la oxitocina. c) Explique que efecto tendra en la sntesis del pptido una mutacin i.- de transicin de bases en I ii.- por transversin de bases en II iii.- por delecin de una citosina en III. Considere el antiparalelismo de los cidos nucleicos, el orden de las bases en el codn y el sentido de lectura de la traduccin. 16. Indique el papel que juegan en la sntesis de protenas los ARN mensajero, ribosomal y de transferencia. 17. Qu entiende por aminoacil ARNt sintetasa y cual es su importancia en el proceso de sntesis proteica? 18. Los antibiticos han sido de gran importancia en el estudio de la expresin gnica y la aplicacin teraputica de ellos requiere conocer su mecanismo de accin y la sensibilidad del patgeno (antibiograma). Al respecto indique cmo actan los siguientes antibioticos: a) b) c) d) e) f) g) Puromicina, Eritromicina, Tetraciclina, Cloramfenicol, Estreptomicina, Cicloheximida, Acido fusdico.
19. Compare los mecanismos generales de regulacin de la expresin gnica de procariontes y eucariontes. 20. Indique que entiende por: Modelo operon, gen regulador, gen estructural, enzima inducible, inductor, represor, regulacin positiva, regulacin negativa, regulacin posttranscripcional. BIBLIOGRAFA 1. Syllabus de Bioqumica Sesiones 22 a 27 2. Bioqumica de Lehninger 2 Edicin Cap 9, 24, 26, 27 y 28 3. Bioqumica de Harper Murray y otros, 22 Edicin Cap. 37 a 41
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Primer Semestre 2006

Profesores Autores: Fuentes O & E Campos

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Seminario 1: Equilibrio cido-base y pH

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Laboratorio N 1: Soluciones Amortiguadoras y Capacidad Amortiguadora

[base conjugada(sal)] [cido dbil]

(cambio de pH )(volumen de buffer en L )

(moles de OH - o H3O+ adicionados)

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K a3 = 4,8x10 -13 ; pK a3 = 12,32

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Volumen NaOH (mL) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

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Laboratorio N 2: Reconocimiento de las protenas

Laboratorios Bioqumica General 2006

Laboratorios Bioqumica General 2006

Laboratorio N 3: Cuantificacin de protenas

Laboratorios Bioqumica General 2006

3 1,8 0,2 2,0 2,0 4,0 4,0 4,0

4 1,5 0,5 4,0

5 1,0 1,0 4,0

6 0,5 1,5 4,0

8 2,0 2,0 4,0 4,0

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Seminario N 2: Aminocidos y Protenas

Laboratorios Bioqumica General 2006

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Seminario N 3: Enzimas y bioenergetica

Laboratorios Bioqumica General 2006

Laboratorios Bioqumica General 2006

Laboratorios Bioqumica General 2006

Laboratorio N 6: Metabolismo de carbohidratos fermentacin.

Cadena respiratria: NADH + H+, FADH2 + O2

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Laboratorio N 7: Metabolismo de carbohidratos ciclo de krebs

Cadena respiratria: NADH + H+, FADH2 + O2

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Seminario N 4: Estructura y metabolismo de hidratos de carbono

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NOTA: Las preguntas marcadas con asterisco se deben desarrollar de preferencia.

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Laboratorio N 8: Extraccin y Cromatografa de Lpidos

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Frente del solvente

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Seminario N 5: Estructura y Metabolismo de Lpidos

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2. Styer Lbert Bioqumica 4 Edicin 1995 . Edit. Revert . Captulo 24.