Fuente Original: Revista Enlogos (editada por la Federacin Espaola de Asociaciones de Enlogos y Periodistas Asociados).

Revista Enlogos n 48
Prevencin del riesgo de Brettanomyces a travs de la utilizacin de herramientas analticas innovadoras y de la gestin rigurosa del proceso de elaboracin Marie-Laure Murat1, Emmanuel Gindreau1 y Florent Dumeau2.
: Laboratorio SARCO, filial de investigacin de la empresa Laffort nologie, BP , 33015 Bordeaux. info@sarco.fr 2 : C/Coral Diana 27, 08758 Cervell, Barcelona. www.vins-consultant.com
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Introduccin
El origen de los fenoles voltiles en los vinos tintos se conoce desde hace ms de una dcada (Chatonnet, 1992). Pese a ello, un gran nmero de vinos presentan todava este tipo de desviacin. Desde un punto de vista organolptico, el carcter fenolado se traduce, en los casos menos graves, en una prdida de tipicidad y de finura mientras que en los casos ms graves, se observa la presencia de un fuerte olor animal tipo establo o sudor de caballo. Desde un punto de vista analtico, la alteracin se traduce por la presencia de dos compuestos: el etil-4-fenol (E4P) y el etil-4-guayacol (E4G). El umbral lmite de percepcin (concentracin a partir de la cual se altera el aroma del vino) se estima en 426 g/L para una mezcla 10/1 E4P/E4G (Chatonnet, 1992). En un mercado cada vez ms competitivo, en busca de vinos autnticos y afrutados, el carcter fenolado, signo de una alteracin microbiana, ya no es aceptable. El origen microbiolgico de los etilfenoles se ha determinado con claridad: las levaduras pertenecientes al gnero Brettanomyces bruxellensis estn dotadas de un equipamiento enzimtico que les permite formar grandes cantidades de E4P y de E4G a partir de cidos fenoles presentes de forma natural en la uva (Chatonnet, 1992). En el presente artculo, tras exponer las recientes investigaciones relativas al desarrollo de las Brettanomyces, presentaremos cuatro casos de contaminacin registrados en los diferentes estadios del proceso de elaboracin y propondremos diferentes estrategias de prevencin, combinando un seguimiento analtico oportuno con una vinificacin racional.

Situacin de las investigaciones sobre las Brettanomyces

La microflora presente en la superficie de la baya de uva rene micro-organismos de inters enolgico (Saccharomyces cerevisiae, Oenococcus oeni) pero tambin especies nefastas como Brettanomyces. Por lo tanto, hay que tener presente que es la uva la que contamina la bodega. La deteccin de estas levaduras contaminantes en el viedo es delicada, debido a que en este estadio son minoritarias. El proceso de transformacin de los azcares en alcohol por Saccharomyces cerevisiae va a implicar una autntica seleccin de estos microorganismos. En efecto, las levaduras Brettanomyces son especialmente resistentes al etanol y al SO2 y son capaces de sobrevivir en el medio a pesar de su empobrecimiento en azcares. Recientes estudios ecolgicos realizados en diferentes bodegas bordelesas (Renouf et al., 2006a) han demostrado tambin que, desde el encubado hasta el final de la FA (Fermentacin alcohlica), las Brettanomyces son minoritarias en relacin con las levaduras no-Saccharomyces. Por el contrario, a partir del final de la maceracin, se vuelven ms numerosas con respecto a las levaduras no-Saccharomyces, especialmente en los orujos y las las. A partir de este estadio, podemos asistir a un desarrollo intempestivo de las poblaciones de Brettanomyces, que van a utilizar los cidos fenoles y los azcares residuales, presentes de forma natural, para producir grandes cantidades de etilfenoles.

As, los finales inactivos en las fermentaciones o las maceraciones realizadas en condiciones poco higinicas, se convierten a veces en el escenario de una multiplicacin de Brettanomyces, ocasionando una alteracin del vino. Despus del sangrado, la fase de latencia antes de la fermentacin malolctica (FML) corresponde a un perodo muy propicio para su desarrollo. Durante la FML, el riesgo es menor, debido a la ocupacin del nicho ecolgico por las bacterias lcticas. Por ltimo, durante la crianza, el desarrollo de Brettanomyces es por lo general ms lento, por lo que puede controlarse ms fcilmente. En este estadio, el riesgo de multiplicacin depende esencialmente de las condiciones del medio. Aparte de una higiene impecable, se debe tener un perfecto control del sulfitado. Para ello, se debe tener en cuenta el valor de pH. En efecto, este ltimo condiciona la proporcin de SO2 molecular, es decir, de SO2 activo en relacin con los microorganismos. El porcentaje de SO2 molecular puede calcularse fcilmente con ayuda de la frmula establecida por Sudraud y Chauvet (1985): 100/ (10 pH-1,81 + 1). As, para un mismo contenido en SO2 libre, la proporcin de SO2 molecular activo es, por ejemplo, dos veces menos importante con un pH 3,9 que con un pH 3,6. Para valores de pH elevados, a veces es delicado, incluso imposible, mantener el SO2 en dosis suficientes. Llegado el caso, conviene aumentar el nivel de sulfitado durante el perodo estival, ya que las temperaturas elevadas favorecen el crecimiento de estas levaduras de contaminacin. Adems, es muy recomendable la puesta en prctica de un seguimiento analtico ms exhaustivo con el fin de prevenir cualquier contaminacin que pueda implicar un aumento del contenido en fenoles voltiles. La frecuencia de los trasiegos, as como el modo de limpieza de los recipientes, especialmente en el caso de una crianza en barrica, constituyen igualmente parmetros importantes. Una limpieza eficaz aplicada al parque de barricas seguida de un secado perfecto y de un azufrado son esenciales despus de un trasiego. Para los vinicultores contrarios al trasiego, un seguimiento analtico que combine recuento de Brettanomyces y dosificacin de fenoles voltiles, es el nico medio de prevenir una alteracin. La presencia de azcares residuales, y en particular de glucosa-fructosa, constituye igualmente un elemento favorable para el desarrollo de estas levaduras de contaminacin. Recientemente, la legislacin ha autorizado a algunas denominaciones a elaborar vinos con contenidos en azcares residuales relativamente importantes. Ahora bien, tan slo un 0,3 g/L de glucosa-fructosa basta a una poblacin de Brettanomyces para producir 425 g/L de fenoles voltiles (Chatonnet, 1999). Sealemos tambin que, en ausencia de glucosa-fructosa, el crecimiento de las Brettanomyces resulta imposible a partir de otros azcares no utilizados por Saccharomyces. Por ltimo, durante la crianza, el oxgeno podra favorecer, directa o indirectamente, el crecimiento de las Brettanomyces (Renouf et al. 2006b). Por consiguiente, todas las etapas de la elaboracin del vino que entraen una disolucin importante de oxgeno (trasiegos, rellenado de barricas, filtracin, embotellado, etc.) podran favorecer su desarrollo.

Ejemplos de alteraciones localizadas en los diferentes estadios del proceso de elaboracin

Alteracin al final de la FA
El primer ejemplo se refiere a una multiplicacin precoz al final de la FA. Las caractersticas del mosto se presentan en la tabla 1. Se advierte una fuerte carencia de nitrgeno, un factor que limita el buen desarrollo de la FA (el umbral se sita alrededor de 130 mg/L, Belly, 1990). El proceso de elaboracin se describe en la tabla 1. Cuando d = 1,010 se observa una ralentizacin de la FA hasta que d = 1,005, punto en el que la FA se detiene. En el momento en que se detiene, el contenido en fenoles voltiles es ms de tres veces superior al umbral de percepcin, lo que demuestra un desarrollo de Brettanomyces. Los orgenes de esta alteracin pueden ser mltiples. Para empezar, a nivel prefermentativo, hay que saber que la maceracin

prefermentativa en fro, lejos de inhibir las Brettanomyces, refuerza su capacidad de adaptacin al medio (Renouf et al., 2006b). De igual modo, a medida que se eleva la temperatura, se facilita su crecimiento. Cuando las levaduras intervienen despus de esta maceracin, el riesgo de fracaso de implantacin de las LSA inoculadas - lo que podra llevar a una parada y a una eventual contaminacin - es mayor. Probablemente sea ste el origen del problema en el caso descrito. Por ltimo, a pesar del aporte de nitrgeno, la carencia de nitrgeno asimilable no se ha corregido del todo, lo que es un error.

Alteracin entre FA y FML

El segundo ejemplo se refiere a una contaminacin observada entre FA y FML. Las caractersticas del vino despus de la FA se presentan en la tabla 2. Durante el sangrado, el vino presenta muy pocas Brettanomyces y su contenido en fenoles es despreciable. Doce das despus del sangrado, la poblacin de Brettanomyces y el contenido en fenoles voltiles han aumentado significativamente. Tres semanas despus del sangrado, la FML se bloquea y prosigue el aumento de la poblacin de Brettanomyces y del contenido en fenoles voltiles. Este tipo de contaminacin se ha observado a menudo en el curso de la aada 2005. Se constata por otra parte, una correlacin muy clara entre el tiempo de latencia FA-FML y el contenido en fenoles voltiles de vinos despus de la FML (figura 1).

Alteracin durante la crianza

El tercer ejemplo se refiere a un desarrollo producido en el transcurso de una crianza en depsito, durante el perodo estival. La figura 2 presenta la evolucin del contenido en fenoles voltiles en el transcurso del sptimo mes de crianza. En todas las mediciones del contenido en fenoles voltiles, la cantidad de SO2 molecular es determinante: en cuanto el contenido en SO2 molecular activo es inferior a 0,4 mg/L, aumenta el contenido en fenoles voltiles.

Alteracin despus del embotellado

El ltimo ejemplo se refiere a una alteracin producida despus del embotellado. Se trata de un vino de la aada 2001, cuyas caractersticas se presentan en la tabla 3. Este vino ha sido embotellado despus de una filtracin en el umbral de 2 m. Inmediatamente despus de ser embotellado, el vino no presenta un carcter fenolado. Tras dos aos en botella, el contenido en fenoles voltiles es ms de tres veces superior al umbral de percepcin y sigue aumentando durante el ao siguiente. Estos distintos ejemplos nos muestran que las contaminaciones pueden producirse en diferentes estadios de la vinificacin. Por consiguiente, conviene estar extremadamente alerta en todas las etapas.

Medio de deteccin y de prevencin de las alteraciones

Para controlar el riesgo Brettanomyces, tenemos a nuestra disposicin, a da de hoy, tres herramientas analticas eficaces: - el recuento de levaduras Brettanomyces mediante cultivo en medio selectivo - el anlisis de fenoles voltiles mediante SBSE/GC/MS - el microscopio de epifluorescencia No obstante, estas herramientas analticas slo son tiles si se emplean e interpretan de forma apropiada. Para empezar, hay que saber que no existe ninguna correlacin entre el contenido de fenoles voltiles de un vino y su poblacin de levaduras Brettanomyces (figura 3); lo que significa que se debera medir la evolucin de estos dos parmetros mediante un seguimiento oportuno. A continuacin, tal y como lo hemos mencionado anteriormente, la poblacin de levaduras Brettanomyces se reparte de forma heterognea en un mismo recipiente. La tabla 4 presenta los resultados de muestreos realizados en tres barricas, en superficie y en profundidad. En todos los casos, se registran escasas o ninguna Brettanomyces

en superficie mientras que la poblacin es sistemticamente ms elevada en el fondo de la barrica. Existe por lo tanto un gradiente de concentracin entre la superficie y el fondo del recipiente; a escala de un depsito, este gradiente es probablemente todava ms marcado. A la vista de esto, se comprende la importancia de realizar trasiegos con regularidad con el fin de eliminar esta biomasa susceptible de contaminar la totalidad del recipiente. En efecto, por lo que respecta al contenido en fenoles voltiles, es idntico en las dos zonas de muestreos. Por lo tanto, para un seguimiento analtico oportuno, es indispensable la dosificacin de estos componentes, uniformemente repartidos. La tabla 5 presenta un ejemplo de utilizacin de estas dos herramientas analticas. Se refiere a una bodega en la que se debe hacer un ensamblaje de dos depsitos. En la cata, el depsito 2 no parece fenolado si bien presenta un contenido en fenoles voltiles superior al umbral de percepcin. Este mismo depsito contiene una poblacin elevada de levaduras Brettanomyces. En este caso, la puesta en prctica conjunta de los dos anlisis permite tratar el depsito contaminado (filtracin, flash-pasteurizacin, etc.) antes de ensamblarlo, evitando as la alteracin de la partida entera. Aparte de la utilizacin apropiada de estas herramientas analticas, el riesgo de Brettanomyces debe controlarse a travs de la gestin rigurosa de las diferentes etapas del proceso de elaboracin. En este sentido, hemos querido profundizar en dos de los ejemplos de contaminacin descritos anteriormente.

Control del riesgo de Brettanomyces a travs de la gestin rigurosa de la fase prefermentativa y de la fermentacin alcohlica.
En el caso de la contaminacin al final de la FA (ver tabla 1), la mala gestin de la maceracin prefermentativa es probablemente la responsable de un fracaso de implantacin de la Levadura Seca Activa inoculada, ocasionando la inactividad fermentativa observada. En efecto, su realizacin a una temperatura ms baja, su reduccin en el tiempo mediante la utilizacin de enzimas de maceracin, as como una siembra del mosto precoz, habran favorecido ciertamente una mejor implantacin de los fermentos. Por ltimo, tal y como lo hemos subrayado anteriormente, a pesar del aporte de fosfato diamnico (DAP), la carencia de nitrgeno no ha sido corregida. En efecto, teniendo en cuenta el grado alcohlico elevado, hay que tender a un contenido del orden de 200 mg/L. Sabiendo que el contenido inicial del mosto era de 48 mg/L y que 20 g/hL de DAP aportan 40 mg/L de nitrgeno asimilable, habra sido necesario aportar unos 80 g/hL de DAP. Se ha demostrado recientemente que los mostos con una fuerte carencia de nitrgeno, la tienen tambin de lpidos (Dumeau et al., 2004). En este caso, la utilizacin de un preparador de levaduras rico en factores de supervivencia (esteroles, cidos grasos), como el Superstart, permite asegurar una buena terminacin de la FA. Por ltimo, recordemos que es necesario un sulfitado homogneo y suficiente de las uvas durante la recepcin para la buena implantacin de los fermentos.

Control del riesgo de Brettanomyces a travs de la gestin rigurosa de la FML

En el segundo ejemplo de contaminacin mencionado anteriormente (ver tabla 2), el vino ha sido tratado por flash-pasteurizacin tras observar la parada de la FML. Este tratamiento curativo ha eliminado todas las poblaciones microbianas. Inmediatamente despus del tratamiento, el vino ha sido sembrado con bacterias lcticas liofilizadas, permitiendo as la finalizacin de la FML sin aumentar el contenido en fenoles voltiles. El perodo de latencia entre el final de la FA y el inicio de la FML, corresponde a un perodo muy propicio para el desarrollo de las levaduras Brettanomyces. Conviene por lo tanto reducir al mximo su duracin. Se puede optimizar la gestin de la FML gracias a la utilizacin de bacterias lcticas liofilizadas, ya sea en co-inoculacin, ya sea en inoculacin secuencial una vez finalizada la FA. En el segundo caso, la siembra debe determinarse en

funcin de dos elementos: el estado microbiolgico del vino y su balance analtico. A la vista de los resultados analticos obtenidos, se podr poner en prctica una estrategia adecuada. El microscopio de epifluorescencia constituye una excelente herramienta para conocer el estado microbiolgico del vino. Permite en efecto medir muy rpidamente la carga microbiana del vino: en menos de una hora, se puede determinar la poblacin bacteriana y se pueden obtener indicios de la presencia de microorganismos de contaminacin como Brettanomyces. Por lo que respecta a este segundo punto, en caso de duda, la contaminacin observada con el microscopio de epifluorescencia puede confirmarse mediante recuento en medio nutritivo especfico. En funcin de las poblaciones observadas, se decidir si procede una inoculacin y/o si es necesario poner en prctica un tratamiento para eliminar una eventual poblacin de levaduras Brettanomyces. En efecto, para asegurar un buen desarrollo de las bacterias lcticas, es absolutamente necesario eliminar estas levaduras de contaminacin. La eleccin del modo de inoculacin, co-inoculacin o inoculacin secuencial, se har en funcin de los hbitos de la bodega y de urgencia de la salida al mercado. En el caso de optar por una inoculacin secuencial, los vinicultores podrn recurrir a un nuevo procedimiento de inoculacin mediante bacterias preaclimatadas al vino, el proceso PreAc, (Laffort Oenologie), que permite un rpido desencadenamiento de la FML.

Seguimiento analtico preventivo que hay que poner en prctica

Como hemos visto a travs de diferentes ejemplos, el control del riesgo Brettanomyces requiere un seguimiento analtico apropiado. La tabla 6 presenta el posicionamiento de las herramientas analticas a nuestra disposicin en cada estadio de elaboracin, con el objetivo de realizar un seguimiento preventivo. En el estadio prefermentativo, la vigilancia de la carga microbiana mediante microscopio de epifluorescencia, permite verificar el control de las poblaciones autctonas. Durante la FA, la vigilancia de implantacin de la cepa de levadura inoculada permite validar el control de las levaduras. En caso de ralentizacin de la FA, esta vigilancia es evidentemente muy necesaria; de hecho, debera acompaarse sistemticamente de una medicin del contenido en fenoles voltiles y de un anlisis con microscopio de epifluorescencia. La dosificacin de fenoles voltiles mediante SBSE/GC/MS permite un diagnstico extremadamente rpido y fiable. Puede realizarse en un slo da a partir de tan slo 10 mL de vino. La presencia de fenoles voltiles indica una contaminacin por Brettanomyces. Durante la fase de latencia FA-FML as como en caso de FML inactiva, es muy recomendable poner en prctica un seguimiento analtico ms exhaustivo, utilizando las tres herramientas a nuestra disposicin: este seguimiento deber permitir predecir una multiplicacin importante de las Brettanomyces. Durante la crianza, el seguimiento mensual del contenido en fenoles voltiles es indispensable si se desea prevenir la aparicin del carcter fenolado: cualquier aumento entre dos mediciones indica una contaminacin. El recuento de las levaduras Brettanomyces, si bien a veces resulta til, no es indispensable en este estadio, si se pone en marcha un seguimiento mensual o bimensual del contenido en fenoles voltiles. El inters de este tipo de seguimiento radica en poder actuar rpidamente, siguiendo una estrategia adecuada con el nivel de riesgo. Por ltimo, en el momento de la preparacin para el embotellado, el conocimiento del nivel de poblacin es indispensable para determinar los tratamientos previos al envasado. Evidentemente, una vez en botella, debe verificarse la eficacia de los tratamientos puestos en prctica.

Conclusin
Brettanomyces forma parte de la microflora natural de la uva, los profesionales deben aprender por lo tanto a gestionar la presencia constante de esta poblacin microbacteriana durante todo el proceso de elaboracin. Por lo general, las alteraciones en el estadio prefermentativo y en el transcurso de la FA son raras. En caso de fermentaciones difciles, alcohlica y/o malolctica, el riesgo de multiplicacin de Brettanomyces es importante. La perfecta gestin de las fermentaciones sigue siendo por lo tanto, en este estadio, el mejor medio de prevencin: el nicho ecolgico debe ser ocupado por los micro-organismos implicados en estas fermentaciones. Cualquier ralentizacin debe poner en alerta al enlogo, quiere la rpida puesta en prctica de una estrategia adecuada. En este sentido, las herramientas analticas actualmente disponibles permiten determinar las elecciones enolgicas y predecir contaminaciones irreversibles. Despus de la FML, el vino estabilizado contiene poblaciones bajas de Brettanomyces, ms fciles de controlar que durante la crianza. As pues, para limitar el crecimiento de estos microorganismos, el enlogo debe poner en prctica todas las medidas en un estadio anterior, con el fin de iniciar la crianza con la poblacin ms baja posible. Aparte de una perfecta higiene y de un respeto a las reglas enolgicas elementales, slo un seguimiento analtico regular permite evitar un desarrollo excesivo de Brettanomyces durante la fase de crianza.

Tabla 1. Caso de alteracin al final de la fermentacin alcohlica (2005). Caractersticas del mosto Grado alcohlico (% vol.) 13,5 pH 3,7 SO2T (mg/L) 60 Nitrgeno asimilable (mg/L) 48 Procesos de elaboracin Maceracin pre-fermentativa 13C / 5 das Siembra de levaduras 20 g/hL tras la maceracin Gestin del nitrgeno A la siembra: 20 g/hL (adicin de fosfato de amonio) A d = 1,060: 20 g/hL Tabla 2. Caso de alteracin entre FA y FML (2005). Caractersticas del mosto tras la FA Grado alcohlico (% vol.) 13,65 Azcares residuales 2,6 pH 3,64 SO2T (mg/L) 49 cido mlico (mg/L) 2,35 Seguimiento de la poblacin de Brettanomyces, del cido mlico y de los fenoles voltiles Fechas de 05/10 17/10 20/10 28/10 muestreo (trasiego) cido mlico 2,35 2,1 1,85 1,90 Brettanomyces 2.101 / mL 1.102 / mL 2.3.104 / mL 5.104 / mL (UFC/mL) Fenoles voltiles (g/L) 52 132 334 401 (E4P + E4G) (E4P+E4G)/UP* 0,12 0,31 0,76 0,94
* UP: Umbral de percepcin

Tabla 3. Caso de alteracin despus del embotellado (2001). Caractersticas del vino al embotellado SO2L (mg/L) 30 pH 3,67 Seguimiento del contenido en fenoles voltiles Fechas del muestreo Fenoles voltiles (g/L) (E4P + E4G) (E4P+E4G)/UP*
* UP: Umbral de percepcin Inmediatamente tras el embotellado (03/02) 2 aos tras el embotellado (04/04) 3 aos tras el embotellado (04/05)

240 0,56

844 1,98

928 2,18

Tabla 4. Heterogeneidad de la poblacin de Brettanomyces dentro de un mismo recipiente 7

Nivel del muestreo Barricas 1 Barricas 2 Barricas 3 Superficie Profundidad Superficie Profundidad Superficie Profundidad

Poblacin Brettanomyces (UFC/mL) 8 2.102 < 1 / 10 mL 7.101 1.101 2.102

Fenoles voltiles (gL) (E4P + E4G) 218 219 100 130 171 208

Tabla 5. Ejemplo de utilizacin del anlisis de fenoles voltiles y del recuento de levaduras Brettanomyces antes del ensamblaje. Depsito 1 Depsito 2 Fenoles voltiles (g/L) 150 498 (E4P + E4G) Brettanomyces 3 1.103 (UFC/mL)

Tabla 6. Seguimiento analtico preventivo que debe ponerse en prctica. Fase de la elaboracin FV1 BRETT2 EPI3 Control de implantacin LSA4

Fase pre-fermentativa

FA

Final FA Fase de latencia FA/FML Final FML Crianza (seguimiento mensual a bimensual) Fase de preparacin del embotellado Tras el envasado

FV1: Anlisis de los fenoles voltiles por SBSE/GC/MS. BRETT2: RECUENTO de levaduras Brettanomyces por cultivo en un medio especfico.

EPI3: RECUENTO de los microorganismos con microscopio de epifluorescencia. CI LSA4: CONTROL de implantacin de las LSA sembradas por control gentico (PCR).

Figura 1. Relacin entre el tiempo de latencia final FA / inicio FML y el contenido en fenoles voltiles de los vinos despus de la FML (2005, n = 9)
2500 2000 1500 1000 500 0 0 20 40 60 80 100 120 140 Jours

Figura 2. Seguimiento del contenido en fenoles voltiles y de la cantidad de SO2 molecular activo en el transcurso de la crianza (2004).
450 400 (E4P+E4G) g/L 350 300 250 200 150 100 50 0 septembre novembre octobre mai juin juillet aot 0 0,2 0,4 0,6 0,8 Cantidad de SO2 molecular activo (mg/L) 500 1

(E4P+E4G) g/L

SO2 activo EP

Figura 3. Relacin entre el contenido en fenoles voltiles de un vino y su poblacin de levaduras Brettanomyces (vinos procedentes de diferentes DOC y aadas, n = 24).
1,00E+07 Poblacion BRETT (UFC/mL) 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 (E4P+E4G) g/L

Bibliografa
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