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Pister Les Fraudes Au Miel

Pister Les Fraudes Au Miel

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l’actualité chimique - mai 2009 - n° 330
Chimie des aliments et du goût 
7
Pister les fraudes dans les miels
L’apport des microscopies et de la spectrométrie de masse du carbone13
Christophe B.Y. Cordella et Issam Moussa
Résumé
Cet article présente une étude utilisant deux types de microscopies et la spectrométrie de masse ducarbone13 (SMRI-
13
C) pour mettre en évidence l’adultération de miels par des sirops de sucre industriels.Il décrit l’une des approches possibles pour détecter les fraudes dans les miels par des méthodes simplesconsistant à rechercher des traceurs spécifiques (cellulaires ou moléculaires). La microscopie optique serévèle plus sensible que la SMRI pour détecter la fraude (respectivement de l’ordre de 2 et 7-10%). Alorsque la microscopie optique est limitée à la recherche d’éléments cellulaires de l’adultération et que la SMRIdonne ses meilleurs résultats pour un certain type de sirops industriels, nous avons mis en évidence lespossibilités de la microscopie électronique dans la détection de sirops ne possédant pas de traceur cellulaire.Cette extension intéressante se fait par le biais de l’étude morphométrique des grains d’amidonéventuellement présents dans les échantillons.
Mots-csMiel, fraude, microscopie optique, MEB, spectrométrie de masse, carbone13, traceurs.AbstractIdentication of fraud in honey: the use of microscopies and mass spectrometry of 13-carbon
This article presents a study using two types of microscopy techniques and the mass spectrometry of 13-carbon (
13
C-IRMS) to identify the adulteration of honey by industrial sugar syrups. We present here anapproach to detect fraud in honey by simple methods, that consist in seeking tracers (cellular or molecular)of the specific adulteration. We show that optical microscopy is more sensitive than the IRMS to detect fraud(by about 2% and 7-10%). While optical microscopy is limited to the search for cellular elements of adulteration and IRMS gives its best results for a certain type of industrial syrups, we have highlighted thepossibilities of electron microscopy in the detection of industrial syrups with no tracer cell. This extensionisinteresting through the morphometric study of starch grains if present in the samples.
KeywordsHoney, fraud, optical microscopy, SEM, mass spectrometry, carbon-13, tracers.
a qualité nutritionnelle et organoleptique des alimentsest un vaste sujet puisqu’il commence sur le terrain parle suivi et le soutien scientifique et technique des filières deproduction (élevages, agriculture…) et se poursuit jusqu’auproduit fini que nous retrouvons dans notre assiette. Leproblème posé ici est celui de «l’adultération des miels parles sucres exogènes», sujet délicat car il suscita unengouement important de la filière professionnelle apicole.Soucieuse de préserver la qualité et l’image de ses produitset notamment du miel, archétype du «produit de terroir»100% naturel, elle s’est adressée à l’administrationeuropéenne puis à l’AFSSA afin que des solutions lui soientproposées et que l’on puisse notamment détecter lesmélanges de sirops industriels vendus sous l’appellationdemiel.La falsification n’étant pas une pratique spécifique à lafilière apicole, cette recherche a été développée avec lesouci d’élargir le champ de la synthèse à d’autres produitsalimentaires et d’évaluer les différentes solutions techniquesdont nous disposons pour répondre au problème [1].Les études ont été organisées principalement autour dedeux approches analytiques opposées et complémentairesdépendant de la manière dont l’échantillon est analysé etimpliquant une forme adaptée de traitement des données.Il s’agit d’une part, de ce qu’il convient d’appeler uneapproche chimique spécifique, et d’autre part, d’uneapproche physique globale. La chronologie des travauxeffectués a fait intervenir cinq techniques différentes: lamicroscopie optique (MO) et électronique à balayage (MEB),la spectrométrie de masse des rapports isotopiques (SMRI),la calorimétrie différentielle à balayage (DSC ou «
differential  scanning calorimetr
») et la chromatographie ionique àampérométrie pulsée (HPAEC-PAD).Nous présentons ici les travaux effectués en microscopieoptique et électronique ainsi qu’en spectrométrie de massedu carbone 13 (SMRI-
13
C) [1]. Les principes et lesapplications de la DSC et de la HPAEC-PAD feront l’objetd’un autre article. Il n’est jamais inutile de montrer l’intérêt etla richesse des collaborations scientifiques transversalesentre laboratoires et équipes de recherche (surtout par lestemps qui courent), puisse cet article y contribuer à sa façon.
L
 
8l’actualité chimique - mai 2009 - n° 330
Chimie des aliments et du goût 
L’adultération du miel:un problème vieux comme le monde
 À l’instar des problèmes d’intoxication (naturels ou non)de l’abeille qui ne datent pas d’hier [2], celui de l’adultérationdes miels est lui aussi très ancien puisqu’à l’époque romaine,Pline l’Ancien
(1)
parlait déjà du miel comme d’une substancedivine aux propriétés merveilleuses, mais que «[…]
 la fraudede l’homme falsifie et perd toute chose
» [3]. Au XVIII
e
siècle,Sir John Hill [4] alertait ses contemporains de certainespratiques consistant à incorporer au miel diversessubstances telles que la paraffine, le glucose, le saccharose,le malt… De nos jours, malgré les efforts importantsengagés dans les analyses physico-chimiques, la détectionet la quantification de l’adultération des miels restentdes problèmes difficiles. Même avec l’adoption denormes internationales
(2)
, les fraudes sur les appellationset l’authenticité des miels restent une préoccupationactuelle.Le contrôle de l’adultération des miels exige une trèsbonne connaissance du produit. Il peut emprunter deuxvoies souvent complémentaires: la caractérisation duproduit pour en connaître les constituants chimiques etmettre en évidence de fortes variations de ceux-ci et larecherche et l’identification d’anomalies constitutives(traceurs cellulaires ou moléculaires). La première voie donneun point de vue global de l’échantillon tandis que la secondese rapproche d’une démarche «à la Sherlock Holmes», etdonne une information plus locale ou spécifique de la fraude.Chaque miel emprunte certaines caractéristiquesorganoleptiques de la plante butinée par l’abeille (lavande,acacia, pin…), avec un goût, une texture, un arôme, unecouleur, etc. qui lui sont propres. Les constituants chimiqueset biologiques du miel sont nombreux: glucides, eau,protéines, acides aminés, acides organiques, polyphénols,…pollens, levures, bactéries… Parmi ces éléments, on trouveparfois des grains d’amidon. Les pages qui suivent visentà montrer que deux options efficaces de contrôle analytiquesont possibles pour détecter l’adultération des miels. Lapremière consiste à rechercher des traceurs cellulaires(microscopie optique) ou des traceurs moléculaires(microscopie électronique). La seconde se base sur ladétermination et la mesure d’une propriété naturelle del’échantillon: son contenu isotopique en carbone 13, et surle calcul du rapport
13
C/ 
12
C.
L’amidon: l’indice à suivre
L’amidon est constitué pour 20-30% d’amylose(polymère naturel d’unités de D-glucose) et pour 70-80%d’amylopectine (également un polymère naturel de D-glucose mais dont l’arrangement spatial et l’enchaînementdes unités diffèrent). Il est l’homologue végétal duglycogène, macromolécule naturelle permettant le stockagede l’énergie et de la brique nutritive de base –le glucosedans la cellule. L’amidon est la structure carbohydratée laplus répandue et la plus abondante dans les plantes. Dans lanature, il est presque toujours sous forme de granules (grainsd’amidon). Dépendants de l’origine de la plante et de samaturité, les grains d’amidon varient beaucoup dans leurforme, leur taille et leur température de gélatinisationainsi que l’illustre le
tableauI
. La forme et la taille de sesgranules sont caractéristiques de leur plante d’origine etun microscopiste expérimenté peut facilement le déterminer[5-6].Observés par microscopie optique sous lumière polari-sée, les grains d’amidon présentent un motif d’interférencecaractéristique: la
croix maltaise
qui est toujours observablequelle que soit l’origine de l’amidon
(3)
. Elle peut cependantdisparaître partiellement lorsque l’amidon subit des transfor-mations dues à un traitement thermique (gélatinisation) ou àdes réactions chimiques ou enzymatiques.L’amidon n’est pas considéré comme un élémentconstitutif naturel du miel. Cependant, dans la pratique, destraces d’amidon y sont tolérées.
 
La quantification ou ledénombrement des grains d’amidon se fait par rapport auxpollens. Généralement, un échantillon de miel est considéréconforme lorsque la quantité d’amidon ne dépasse pas unà quatre grains pour cent pollens. Différentes étudesconfirment la légitimité de cette tolérance vis-à-vis des miels.Lobreau-Callen et Clément définissent les miels «sales»comme ceux qui présentent toutes sortes de débrisminéraux (argiles, cristaux, terre, lœss) ou organiques(épidermes, amidon), preuves d’une adultération de naturephysico-chimique [8]. Dans leurs travaux, Franchi
et al.
montrent que la plupart des plantes visitées par les insectespollinisateurs tels que l’abeille appartiennent à desfamilles botaniques bien définies
(4)
qui regroupent desplantes nectarifères et non nectarifères, dont le pointcommun est d’avoir peu ou pas d’amidon dans leurspollens [9]. En effet, pour ces plantes, les pollens sontdépourvus de réserves en carbohydrate alors que d’autresparties de ces végétaux en contiennent. Par ailleurs, denombreux auteurs ont montré que le nectar des plantesvisitées par l’abeille est une substance aqueuse composéeessentiellement de glucose, de fructose et de saccharose[10]. Les nectars ne contiennent donc pas de sucressupérieurs et certainement pas de polymères des sucrestelsque l’amidon.
 A contrario
, des plantes telles que la canne à sucre, labetterave, le riz, le blé, le maïs, la pomme de terre…contiennent une grande quantité d’amidon qui représente leurprincipale forme de stockage du sucre. Or ces plantes étantutilisées, partiellement ou dans leur totalité, comme matièrepremière dans la fabrication des sirops de sucre industriels(notamment la betterave sucrière, le maïs et la canne à sucre),on retrouve inévitablement de nombreux grains d’amidondans ces sirops. Ainsi, concernant l’aspect «amidon» dans les miels, ilest maintenant plus clair que cet élément n’est pas gage dequalité et qu’une attention particulière doit lui être accordéecar ce peut être un moyen de dépistage de l’adultérationpar les sirops de sucre issus ou non de l’hydrolyse (toujoursplus ou moins totale) de l’amidon.
Tableau I - Caractéristiques morphologiques et physiques dequelques-uns des principaux grains d’amidon.
Valeur entre parenthèses: moyenne en
µ
m. Selon [7].
SourceTaille(µm)Température degélatinisation (°C)
Maïs4-26 (15)64-71Pomme de terre blanche15-100 (33)62-68Pomme de terre à sucre15-55 (37)82-83Tapioca5-36 (21)69-70Blé2-38 (20)53-64Riz3-9 (5)65-73Canne--- (43)
 
9l’actualité chimique - mai 2009 - n° 330
Chimie des aliments et du goût 
Microscopie optique et spectrométrie de massedu carbone13: comparaison des méthodes
 Échantillons
 Afin de cibler les miels où les fraudes par ajout de sucresexogènes ont été le plus souvent décrites, 43 échantillonsont été prélevés dans le circuit de la grande distribution. Laméthode appliquée pour préparer les lames est celle del’analyse pollinique des miels [11] et nous nous sommesinspirés des travaux de Kerkvliet
et al.
[12] pour la mise enévidence de l’adultération. L’examen microscopique se faiten lumière blanche et polarisée.
 Microscopie optique
La microscopie optique permet de détecter facilementla présence de fragments cellulaires (fibres, cellulesépidermiques, anneaux scléreux) originaires de la canne àsucre. La
figure1
montre le spectre pollinique normal d’unmiel, c’est-à-dire ne présentant que des cellules polliniquesen nombre et de morphologie attendus. Sur la
figure2
, onpeut voir un anneau scléreux caractéristique d’uneadultération par un sirop de canne à sucre ou un produitdérivé de la canne à sucre. La méthode employée consisteà adopter un raisonnement binaire dans la lecture etl’interprétation des échantillons [13]. En effet, nous avonsconsidéré, après la lecture de deux lames par échantillon,que l’échantillon était déclaré positif lorsqu’au moins unanneau scléreux était observé sur les deux lames, ou defaçon plus générale, lorsqu’au moins un élément cellulairecaractéristique de la canne à sucre y était présent. Enrevanche, tous les échantillons ne présentant aucun élémentcellulaire douteux ont été déclarés négatifs, c’est-à-direconformes du point de vue de l’adultération par des produitsdérivés de la canne à sucre.
Spectrométrie de masse: mesure du rapport 
13
C/
12
C
La spectrométrie de masse du carbone13, dite SMRI,a longtemps été la technique officielle pour détecter lafalsification des produits alimentaires. Les travaux pionniersdans ce domaine ont été présentés par White et Doner, quiproposèrent une méthode pour détecter d’éventuellesadditions de sirops industriels, issus de plantes de type C4,dans les produits alimentaires et en particulier dans lesmiels [14]. Comment cela est-il possible? Lors de laphotosynthèse, l’assimilation du gaz carbonique par lesvégétaux s’effectue selon deux principaux types demétabolismes qui sont les métabolismes C3 (cycle de Calvin)et C4 (Hatch et Slack). Ces deux mécanismes dephotosynthèse présentent un fractionnement isotopiquedifférent. Ainsi, les produits issus des plantes C4, tels que lessucres et l’alcool dérivé par fermentation, présentent desteneurs en carbone13 plus élevées que celles de leurshomologues provenant des plantes C3. La plupart desvégétaux tels que la vigne et la betterave appartiennent augroupe C3. La canne à sucre et le maïs appartiennent augroupe C4. Ainsi, la mesure de la teneur en carbone13permet de détecter et quantifier le sucre d’origine C4 (sucrede canne ou isoglucose de maïs) ajouté aux produitsdérivés du raisin (moûts de raisins, vins...) ou au miel.Le principe de la SMRI consiste à mesurer le rapportisotopique d’un analyte transformé en un gaz simple,représentant isotopique de l’échantillon initial, avant d’entrerdans la source d’ions du spectromètre. Le système peutmesurer différents rapports isotopiques ( 
2
H/ 
1
H,
15
N/ 
14
N,
13
C/ 
12
C,
18
O/ 
16
O et
34
S/ 
32
S) en continu respectivement surdes gaz de H
2
, N
2
, CO
2
, CO et SO
2
. Dans le cas du carbone,le rapport
13
C/ 
12
C est naturellement constant dans tous lesproduits biologiques, mais peut varier d’une source decarbone à l’autre (CO
2
de l’atmosphère, plantes C3 et C4,carbone des animaux, etc.). Il est donc facile de détecter siune de ces différentes sources a été mélangée à une autrecar la proportion
13
C/ 
12
C dans le produit aura changé parrapport à celle du produit naturel. Pour plus de détailsthéoriques et pratiques, le lecteur est encouragé à lire Meier- Augenstein [15], qui présente tous les aspects de l’utilisationdu système SMRI, détaillant la préparation de l’échantillon, ladérivatisation, l’étalonnage isotopique, etc., et donne desexemples de nombreuses applications sur les arômes etparfums, vins, jus de fruits, huiles végétales et miels avecplus de 160 références.Le critère isotopique final, appelé
δ
(delta), calculé etutilisé pour déterminer la conformité des échantillons, prenden compte le rapport isotopique
13
C/ 
12
C des sucres du mielainsi que les rapports isotopiques
13
C/ 
12
C des protéinesdu miel:
δ
13
C/ 
12
C) = ( 
13
C/ 
12
C)
protéines
- ( 
13
C/ 
12
C)
miel
Les articles de référence dans ce domaine sont ceux deWhite, Winters, et Martin [14, 16], à la fois pour la méthode
Figure1- Cliché de microscopie optique d’un miel de lavande nonfrelaté.
Microscope Carl Zeiss Axiostar en lumière blanche, oculaire A-Plan 20x/0,45,grossissement x200.
Figure2- Clichés de microscopie optique d’un miel de lavande présentantun anneau scléreux (cellule issue de la canne à sucre).
Microscope Carl Zeiss Axiostar en lumière blanche à gauche et en lumière polarisée àdroite, oculaire A-Plan 20x/0,45, grossissement x200. Taille de l’anneau: 36x24
µ
m.

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