VIRUS

Mtodos de propagacin

Para fines diagnsticos la inoculacin de animales es un medio para detectar virus en muestras clnicas, como el virus de la rabia en ratones lactantes.
Actualmente el uso de animales experimentales como hospederos para propagacin viral est limitado por razones ticas.

Huevos embrionados. Este sistema se usa para propagacin viral con fines diagnsticos y de investigacin.

Cuando se usa huevos embrionados, se debe considerar la posible presencia de anticuerpos maternos en el saco vitelino del huevo. Por lo que, frecuentemente es preferible obtener huevos embrionados de parvadas libres de patgenos especficos (spf)

Cultivo de explantes Estos son cultivos de pequeos fragmentos de tejidos especficos, tomados directamente del hospedero animal.

Los cultivos de explantes son tiles para el aislamiento viral. Se requieren para el aislamiento de algunos coronavirus. La demostracin de latencia de algunos alfa herpesvirus humanos y animales puede requerir explantes de ganglio nervioso sensitivo.

Cultivos celulares primarios Estos se derivan de tejidos frescos que han sido digeridos enzimticamente con tripsina u otras proteasas, para liberar clulas individuales. En condiciones in vitro las clulas de los cultivos primarios raramente pueden dividirse, o se dividen a una velocidad muy baja.

A pesar del tiempo de vida limitado de los cultivos primarios, son ideales para el aislamiento de algunos virus. Los cultivos primarios raramente sobreviven ms all del vigsimo pase in vitro.

Cultivos semi-continuos Son por lo general de fibroblastos. Los cultivos semi-continuos tienden a morir entre el 30 y el 50 pase in vitro. Son tiles en la propagacin de una gran variedad de virus.

Cultivos celulares continuos Estos cultivos se derivan de tejidos normales o neoplsicos y se caracterizan por su habilidad para ser propagados in vitro indefinidamente. Las lneas celulares continuas no son tan sensibles como las otras para propagacin viral;

Facilitan la propagacin a gran escala de algunos virus para vacunas e investigacin. Muchas lneas continuas estn disponibles de proveedores como la Coleccin Americana de Cultivos Tipo (ATCC)

La mayora de los laboratorios de virologa almacenan en congelacin alcuotas iniciales de sus cultivos continuos, debido a que las lneas celulares que estn continuamente en cultivo pueden sufrir cambios en sus caractersticas celulares. Ej. Contaminacin con otros virus.

Efectos de la infeccin viral en las clulas

Muerte celular: El efecto citoptico de los virus se puede observar en todo el tejido diana: Ej: virus respiratorios destruyen epitelio respiratorio y los virus del polio destruyen las clulas del cuerno anterior en la mdula espinal casusando parlisis. Escaso efecto directo: Algunos virus producen escasa muerte celular, Ej: el virus de la hepatitis B no causa dao en las clulas hepticas. El dao lo produce la respuesta inmunitaria del husped a la presencia viral. Transformacin celular: Los virus tambin pueden modifcar las clulas y transformarlas en clulas malignas, Ej: Los virus del papiloma humano y el cncer genital. El virus de la hepatitis B y el carcinoma hepatocelular. El virus de Epstein Barr (EBV) y el linfoma de Burkitt con el carcinoma nasofarngeo. El virus de la leucemia de clulas T (HTLV I y II) y la leucemia de clulas T del adulto.

Concentracin y purificacin de virus

Una vez que un virus ha sido propagado adecuadamente, necesita ser recuperado de las clulas hospederas y luego ser purificado. Esto se logra por varios procesos que involucran: centrifugacin diferencial (a diferentes velocidades), dilisis, precipitacin, cromatografa y gradientes de densidad.

Visualizacin de los virus

Los dos mtodos principales usados para visualizar la estructura / morfologa de los virus son: la microscopa electrnica y la microscopa de fuerza atmica. Otros tipos de microscopa se usan para observar cambios inducidos por la replicacin viral en las clulas infectadas

Microscopia electronica

La microscopa electrnica proporciona imgenes tridimensionales de viriones y de su localizacin (nuclear o citoplasmtica) dentro de la clula hospedera en un momento dado durante la infeccin. La observacin de viriones en clulas vivas no es posible, debido a que las muestras tienen que ser tratadas con metales pesados.

Microscopia de fuerza atmica

Los electrones son capaces de "atravesar por tnel" entre los tomos, provocando una fuerza pequea pero cuantificable. El resultado de estas mediciones es un mapa detallado del contorno o la superficie de la estructura. La ventaja de la microscopa de fuerza atmica es que la preparacin de la muestra es mnima y pueden usarse especmenes vivos.

Microscopia ptica.

Es til para observar los efectos de la infeccin viral en la clula hospedera. El dao celular o la destruccin causada por el virus es conocida como efecto citoptico (CPE por sus siglas en ingls). Los efectos citopticos que pueden observarse incluyen:

Clulas redondeadas y agregados en forma de racimo de uvas, como se observa con adenovirus. Clulas redondeadas, encogidas, lisadas, dejando gran cantidad de restos celulares, como se observa con los enterovirus. Clulas agrandadas y redondeadas en reas focales, como los herpesvirus. Fusin de clulas que se convierten en clulas multinucleadas (sinsitios) como en el caso de paramyxovirus.

Adems es posible observar cuerpos de inclusin, caractersticos de algunos virus

Microscopia de fluorescencia

Puede ser usada para visualizar clulas o tejidos infectados por virus, usando anticuerpos antgeno-especficos marcados con fluorocromos. El anticuerpo se une especficamente a los antgenos virales presentes dentro de las clulas o tejidos y los marca con la molcula fluorescente (generalmente fluorescena)

Enumeracin indirecta de virus

Los mtodos indirectos de cuantificacin viral son aquellos que usan factores asociados con la infectividad (actividad biolgica). Los tres mtodos principales usados para determinar indirectamente concentraciones virales son: ensayos de hemoaglutinacin, ensayos de formacin de placas el mtodo de la dilucin limitante.

Hemoaglutinacion

Esta prueba se basa en la propiedad que tienen muchos virus envueltos para aglutinar glbulos rojos. Se realiza en una microplaca, aadiendo glbulos rojos a diluciones de la muestra que contiene virus, y observando posteriormente la hemoaglutinacin.

La hemoaglutinacin es til en la concentracin y purificacin de algunos virus, y como prueba presuntiva rpida para la presencia de este tipo de virus en fluidos de cultivos celulares infectados y de embriones de pollo.

Formacion de placas

la inoculacin de clulas hospederas susceptibles con un virus, y usar su actividad biolgica para estimar el nmero de viriones presentes. En este procedimiento se usan diluciones decimales seriadas del virus para inocular monocapas de clulas hospederas

Con los virus citopaticos la destruccin de las clulas lleva a la formacin de zonas desocupadas llamadas placas, que pueden ser vistas entre las 24 y 72 horas de incubacin.

El mtodo de dilucin limitante

Basado en titulacin, mide un efecto in vitro sobre las clulas, como el CPE, cuando stas se expone a varias diluciones de la solucin que contiene el virus. Dependiendo del virus, se hacen diluciones seriadas dobles o diluciones seriadas decimales del material viral y se ponen en contacto con las clulas.

. El ttulo infectivo (el recproco de la dilucin ms alta que provoca el 50% de CPE en el cultivo infectado) se expresa como TCID50/ml (dosis infectiva 50 cultivo celular). Este ensayo puede usarse con clulas en cultivo, embriones de pollo o incluso con animales de laboratorio.

Metodos Inmunologicos

Los animales infectados con virus responden produciendo anticuerpos especficos. La deteccin y cuantificacin de estos anticuerpos, reflejan el estado de la enfermedad.