Bahan

Poli (D, L-lactic-co-glycolic acid) (PLGA) 50:50 Resomer RG 503H Polyvinyl alcohol (PVA, Mowiol 498) ethyl acetate EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodii- mide) Alexa Fluor 546 bovine serum albumin (BSA) fluorescein Coomassie Plus reagent semua pelarut merupakan grade analisis

Persiapan antibodi monoclonal

isolasi mAb dari tikus galur hibridoma menggunakan metode standar dari Koehler dan Milstein mAb dilabeli dengan pewarna Alexa Fluor 546 dipindahkan ke pewarna reaktif Alexa Fluor 546 selama 1 jam

Sodium bikarbonat

dimurnikan pada resin dan disimpan pada suhu 20 C.

Persiapan nanopartikel PLGA

400 l larutan aqueous BSA (10 mg/ml)

2 ml etil asetat (0.45 mg fluorescein + 100 mg PLGA)

7000 rpm + Sonikasi stimultan 2 menit 8 ml larutan aqueous PVA + emulsi W/O W/O/W (5 menit) memperkuat nanopartikel aduk emulsi ganda dengan 200 ml larutan aqueous 0.1% (w/w) PVA pada 5000 rpm selama 5 menit Hasil dispersi nanopartikel disentrifugasi pada 15,000 rpm selama 15 menit dicuci 3 kali dengan purified water dan di freeze-dried

Karakterisasi nanopartikel Ukuran partikel dan analisis zeta potensial Dispersi deionized water Zetasizer 3000 Diameter partikel rata-rata dan lebar distribusi partikel Muatan partikel dihitung sebagai zeta potensial dengan Doppler anemometry

Morfologi permukaan scanning electron microscopy (SEM) akselerasi voltase 1,00 kV dan detektor sekunder sampel bubuk dari freeze-dried nanopartikel dimasukkan ke dalam kancing logam dengan perekat konduktif dua sisi

Formulasi imuno-nanopartikel

Adsorpsi

Nanopartikel (dispersi) PBS, pH 5.0, (0.6 mg/ml) +600 l aliquot + 200 l larutan mAb (2 mg/ml) volume 500 l menggunakan buffer fosfat adsorpsi ke dalam nanopartikel 4 C 24 jam, disentrifugasi 10,000 rpm 15 menit Sedimen dicuci PBS, pH 7.4 di redispersikan 500 l of PBS, pH 7.4

Ikatan kovalen

4.5 g EDC + 360 l (400 g nanopartikel +400 g mAb) Rasio molar EDC ke mAb = 8.8 diaduk 2 jam pada suhu kamar sentrifugasi 13,200 rpm 10 menit endapan dicuci 3 kali dengan 1 ml PBS, pH 7.4 imuno-nanopartikel di redispersikan dalam 100 l PBS protein ditetapkan dengan uji Bradford

Penentuan mAb pada permukaan nanopartikel Surface plasmon resonance system Biacore X melumpuhkan protein A terbiotinilasi pada kecepatan alir 1 ml/menit 10 menit Sel referensi diblok dengan biotin (10 M, 10 min) chip dicuci 5 l 10 mM glycine buffer (pH 2.2) kecepatan alir 30 l/menit mAb yang dimodifikasi didispersikan dalam buffer PBST dan 5 l diinjeksikan untuk setiap uji semua dilakukan pd suhu 25 C dengan kecepatan alir 1 l/menit dalam 0.05% PBST running buffer

Flow cytometry Dispersi nanopartikel dengan Alexa Fluor 546 berlabel mAb flow cytometer dianalisis menggunakan FACSCalibur kontrol, non-coated nanopartike

Uji Protein
300 l Coomassie + reagen + ke 10 l disperse nanopartikel 10 menit inkubasi 595 nm microplate reader absorbansi Hasil dibandingkan dengan kurva standar larutan BSA rentang 10 g/ml -750 g/ml

Fluorescence microscopy

Nanopartikel yang dimodifikasi mAb +0.5 l Ab sekunder (1:1000) disentrifugasi 13,200 rpm 15 menit dan dicuci dua kali dengan 1 ml PBS endapan diredispersikan dalam PBS pada pH 7.4 microplate reader intensitas fluoresens dari kedua pewarna floresen Carl Zeiss LSM 510 confocal microscope kedua pewarna floresen Alexa Fluor 546 dan fluorescein tereksitasi dengan laser argon (488 nm) atau laser He/Ne (543 nm) emisi difilter narrow band LP 505530 nm (floresen hijau) dan filter 560 nm (floresen merah) Carl Zeiss LSM image software 3.0 analisis gambar Stabilitas kompleks mAb yang teradsorpsi nanopartikel (Ab sekunder) diamati 24 jam pada medium pertumbuhan yang mengandung protein serum dan diamati pd mikroskop floresen

Kultur sel Sel MCF-7 dan MCF-10A NeoT berasal dari sel epitel payudara manusia dikultur dalam monolayer sampai 80% confluence dalam medium DMEM/F12 (1:1, v/v) 2 mM glutamine, 10 g/ml insulin, 0.5 g/ml hydrocortisone, 20 ng/ml epidermal growth factor, HEPES, antibiotik, dan 5% fetal bovine serum penelitian 2.5104 sel per sumur Sel Caco-2, yang berasal dari sel adenocarcinoma usus manusia dikulturkan hingga 80% bersatu dalam medium MEM 2 mM glutamine, 0.1 mM asam amino non esensial dan 10% fetal bovine serum pewarna floresen Blue Cell Tracker (10 M) membedakan Perbandingan penumbuhan antara MCF-10A neoT dan sel caco-2 adalah 2:1 semua dilakukan pada 37 C dalam atmosfer lembab yang mengandung 5% CO2

Sifat pengenalan imuno-nanopartikel MCF-7 atau sel lisat MCF-10A neoT Sel di tripsinisasi dengan 0.05% trypsin dan 0.02% EDTA dalam PBS, pH 7.4, disentrifugasi dan dicuci dengan PBS + 500 l buffer lisis Lisat dibekukan pada suhu 70 C, dilelehkan, disonikasi, dan disentrifugasi 3300 rpm, 15 menit dan 4 C Supernatan + buffer karbonat pH 9,6 (1:5) 100 l aliquot diinkubasi pada 4 C selama 24 jam blocking buffer 3% BSA dalam PBS, pH 7.2 menutup sisi lain inkubasi 30 menit temperatur ruangan dicuci buffer pencuci PBS 3kali 150 l imuno ditambahkan ke setiap sumur pre-coated diinkubasi selama 2 jam 37 C dan dicuci PBS 3 kali dengan, pH 7.4 150 l sodium hydroxide 1M hidrolisis Nanopartikel berikatan microplate reader menukur fluoresensi

Penargetan sel dan internalisasi imuno-nanopartikel monokultur atau co-culture dari MCF-10A neoT dan sel Caco-2 + 100 l sampel diinkubasi pada 37 C hingga 24 jam Olympus IX/81 inverted fluorescence microscope dilengkapi Dapi/FITC/TxRed filter set (E0435016) Cell R Imaging software analisis dievaluasi flow cytometry 200 l nanopartikel non-coated (0.3 mg/ml) 12 plate sumuran (3105/sumuran) dan dibiarkan tumbuh, diinkubasi selama 1, 4, atau 24 jam Kontrol sel terpisah tanpa nanopartikel

Hasil sistem imuno-nanopartikel mampu menarget sel yang diinginkan pengikatan mempertahankan aktivitas biologis dari ligan yang ditarget metode efektif untuk memodifikasi permukaan nanopartikel dengan mAb dan tetap mempertahankan aktivitas biologisnya

Persiapan nanopartikel dan karakterisasi

polimer PLGA yang mengandung gugus akhir karboksilat bebas, menggunakan metode modified double emulsion solvent diffusion diameter 320360 nm, indeks polidispersitas 0.34, Zeta potensial rata-rata -25 mV gugus akhir karboksilat bebas dari polimer terletak di permukaan nanopartikel