Labora staphylococcus epidermidis libro staphylococcus utilidad tincin gram tincion simple Utilizan un solo colorante * Las estructuras

se tien con la mismatonalidad * Se utiliza para ver la morfologa y arreglo en elcrecimiento de las bacterias Tinciones http://www.slideshare.net/josemagarinos/morfologia-bacteriana-y-tinciones-diferenciales TINCIN DE LOS MICROORGANISMOS Existen distintos tipos de tincin: 1.-Tincin simple: Aquella en la que slo se utiliza un colorante, que generalmente tie a los microorganismos. Este tipo de tincin se denomina directa. Si el colorante proporciona una coloracin al fondo, sin alterar el aspecto de las clulas, que permanecen sin teir, la tincin se denomina negativa. La tincin simple permite observar morfologa celular, tamao y agrupacin de los microorganismos. 2.-Tincin diferencial: Es aquella que emplea secuencialmente dos colorantes que permiten distinguir tipos de microorganismos en funcin de diferencias en su estructura y composicin qumica. La tincin de Gram y la cido-alcohol-resistente, basadas en las propiedades de la pared celular bacteriana, son las ms utilizadas. TINCIN SIMPLE Objetivo: Estudiar las caractersticas de los microorganismos en cultivo, es decir, tamao, forma y agrupacin de las clulas. Material: Asa de siembra, portabojetos, cultivos bacterianos de microorganismos (Escherichia coli y Staphylococcus aureus), colorantes, microscopio y aceite de inmersin. Tcnica: Preparar extensiones de los distintos microorganismos, dejar secar al aire y proceder a su fijacin. Realizar la coloracin cubriendo la preparacin con abundante colorante y dejarlo actuar durante algn tiempo. Para la fuchsina fenicada bastan de 15 a 30 segundos, para el cristal violeta es suficiente de 30 a 45 segundos y para el azul de metileno de 3 a 5 minutos. Lavar con agua las preparaciones teidas y continuar con la tcnica tal y

como se indica previamente. Examinar la preparacin al microscopio con el objetivo de inmersin. Observar la forma y disposicin de los microorganismos teidos con el colorante. Procedimiento general para realizar una tincin18 TINCIN NEGATIVA Objetivo: Conocer la morfologa de los microorganismos, realizando una coloracin del fondo, sin que se coloreen las bacterias o las estructuras que se tratan de observar. Material: Asa de siembra, portaobjetos, cultivo bacteriano de microorganismos (Escherichia coli y Staphylococcus aureus), nigrosina al 10%, microscopio y aceite de inmersin. Tcnica: Depositar una gota de la suspensin de microorganismos, con el asa de siembra previamente esterilizada, sobre un portaobjetos Aadir una gota de solucin de nigrosina al 10%. Mezclar totalmente y dejar secar al aire. Hacer una extensin en otro portaobjetos mezclando una cierta cantidad de sarro dentario, extrado recientemente con un palillo estril, con una gota de solucin de nigrosina, hasta conseguir una suspensin homognea. A continuacin dejar secar al aire. Examinar las dos preparaciones con el objetivo de inmersin. Los microorganismos aparecern sin teir, en contraste con el fondo oscuro, pudindose apreciar su forma y agrupacin caractersticas. TINCIN DIFERENCIAL La tincin diferencial colorea selectivamente ciertos tipos de clulas, ya que los colorantes que se utilizan reaccionan de modo diferente con los distintos microorganismos, generalmente debido a diferencias en la estructura y/o composicin qumica de la pared celular de stos. Estas tcnicas son de gran inters en la identificacin y la clasificacin de las bacterias, y la ms utilizada es la tincin de Gram. Tincin de Gram: Es uno de los procedimientos de tincin ms tiles en la identificacin de microorganismos, ya que divide a stos en dos grandes grupos: Gram positivos y Gram negativos. En esta tcnica es necesario utilizar varias soluciones: 1.- Un primer colorante bsico, generalmente cristal violeta, que se aplica sobre la muestra y que reacciona con las clulas (cargadas negativamente), colorendolas. 2.- Un mordiente, que incrementa la afinidad entre el primer colorante y las clulas. Parece ser que el mordiente (solucin diluida de yodo) se combina con el colorante, para formar un compuesto insoluble coloreado en el interior de la clula. 19

3.- Un agente decolorante, como el etanol de 95% o la mezcla alcoholacetona (1:1), que son disolventes orgnicos capaces de eliminar el primer colorante de algunas bacterias, decolorndolas. 4.- Un colorante de contraste, igualmente de carcter bsico pero de distinto color que el primer colorante. Generalmente se suele utilizar la safranina, de color rosa, que contrasta con el color violeta del primer colorante, y que teir slo a las bacterias decoloradas en el paso anterior. Los organismos que resisten la decoloracin y retienen el complejo cristal violeta-yodo aparecern de color violeta oscuro al microscopio y se denominan Gram positivos. Aquellos que pierden el color inicial del cristal violeta tras la decoloracin, se clasifican como Gram negativos y toman el color rosa debido al segundo colorante, la safranina. Las diferencias qumicas en sus paredes celulares, son las que permiten o no la salida del complejo cristal violeta-yodo. Las bacterias Gram positivas tienen una pared celular gruesa, compuesta principalmente por peptidoglucano, mientras que en Gram negativas, aunque la pared est tambin constituida por pptidoglucano, es ms delgada y presenta adems una membrana externa con lipopolisacridos. Las paredes de las bacterias Gram positivas tratadas con alcohol sufren una deshidratacin y sus poros se contraen, dificultando la salida del complejo cristal violeta-yodo. En las Gram negativas, el alcohol desorganiza la capa lipdica ms externa y lava el colorante de la delgada capa de peptidoglucano. La tincin de Gram es ms reproducible cuando se aplica a cultivos jvenes de bacterias, ya que las bacterias Gram positivas, en la fase estacionaria de crecimiento, pueden aparecer como Gram negativas. Objetivo: Aprender una tcnica de coloracin diferencial e interpretar los resultados obtenidos en la misma, distinguiendo bacterias Gram positivas y Gram negativas. Material: Asa de siembra, portaobjetos, cultivos bacterianos de microorganismos (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis y Neisseria spp.), colorantes, solucin de lugol, etanol de 95%, microscopio y aceite de inmersin. Tcnica: Preparar extensiones de los distintos microorganismos, que debern encontrase en fase exponencial de crecimiento. Dejar secar al aire y proceder posteriormente a la fijacin, siguiendo la tcnica ya descrita. Para la coloracin se seguir el siguiente protocolo (modificacin de Hucker): Teir durante un minuto con la solucin cristal violeta. Lavar el exceso de colorante con agua. 20 Cubrir la extensin con una solucin diluida de yodo (lugol), que actuar como mordiente, durante un minuto. Lavar con agua el exceso de lugol.

 Decolorar con etanol de 95%, cubriendo la preparacin y dejando actuar durante 30 segundos. Lavar con agua abundante para eliminar el resto del disolvente. Colorear con safranina durante un minuto (coloracin de contraste). Lavar con agua y dejar que la preparacin se seque. Examinar las preparaciones al microscopio, con aceite y usando el objetivo de inmersin. Las bacterias Gram positivas aparecern coloreadas de violeta, mientras que las Gram negativas se observan de color rosa. DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA II

GUIA DE PRCTICAS DE MICROBIOLOGA e INMUNOLOGA

Segundo Curso 2010/2011

Importancia de la espora ambiental Bacillus IMPORTANCIA SANITARIA Y AMBIENTAL

Son organismos saprofitos del suelo.

Gracias a su capacidad para degradar carbohidratos, alcoholes y cidos orgnicos pueden emplearse en tratamientos de aguas que posean estos compuestos.

Los patgenos de insectos se pueden utilizar como insecticidas y controladores biolgicos.

Aquellos que descomponen lpidos y polisacridos podran emplearse en tratamientos para desechos cargados en grasas (trampa grasas). La importancia radica en que las esporas ayudan a las bacterias a soportar falta de nutrientes y sequedad. Las esporas se caracterizan por ser altamente resistentes al calor, a las radiaciones y a la desecacin, contienen todo lo necesario para que la bacteria vuelva a nacer. En resumen, las esporas le permiten a las bacterias soportar condiciones ambientales adversas.

Gram importancia Su importancia prctica de rutina en Laboratorio de Microbiologa radica en que permite identificar la morfologa celular bacteriana y mediante esto identificar si las bacterias pertenecen al genero de cocos, bacilos, positivas o negativas.

Tincin de Gram. La diferente coloracin que adquieren las bacterias Grampositivas se basa en el menor contenido lpidos de la pared celular y en la reducida permeabilidad a los solventes de estos microorganismos, en comparacin con los gramnegativos. Las bacterias grampositivas se tien violeta por la retencin del complejo cristal violeta genciana/yodo, mientras que las grannegativas no retienen el complejo y se tien rojas al usar la contratincin de safranina. La tincin de Gram ayuda a determinar rpidamente las caractersticas morfolgicas , por lo que es til en la indicacin de los antibiticos. Esta tincin tambin permite establecer si el material enviado al laboratorio para su cultivo posee la calidad adecuada. Por ejemplo, es inadecuada una muestra de expectoracin en que se observan abundantes clulas epiteliales, lo que indica que est constituida principalmente por saliva y no secrecin del tracto respiratorio. La presencia de polimorfosnuecleares (PMN) puede indicar infeccin. Los hongos levaduriformes se observan formando pseudomicelios cuando hay invasin y no slo colonizacin.

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA CLINICA. DIAGNOSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS

Dr. Francisco Montiel Avendao Profesor adjunto, UDA Laboratorios Clnicos Dra.Ana Mara Guzmn Durn Instructor Asociado, UDA Laboratorios Clnicos