MINISTRIO DA AGRICULTURA, PECURIA E ABASTECIMENTO SDA - SECRETARIA DE DEFESA AGROPECURIA DDA - DEPARTAMENTO DE DEFESA ANIMAL

Braslia - DF 2003

Presidente da Repblica Luis Incio Lula da Silva Ministro da Agricultura, Pecuria e Abastecimento Roberto Rodrigues Secretrio Executivo Jos Amauri Dimarzio Secretrio de Defesa Agropecuria Maao Tadano Diretor do Departamento de Defesa Animal Joo Crisostomo Mauad Cavallro Coordenador de Vigilncia e Programas Sanitrios Jamil Gomes de Souza Programa Nacional de Controle da Raiva dos Herbvoros e outras Encefalopatias Guilherme Henrique Figueiredo Marques Assessoria Maria das Graas Queiroz Turbio - PNESA Catalogao na Fonte Coordenao Geral de Informao Documental Agrcola - CENAGRI Coordenao e Planejamento de Produo e Marketing PeterPublisher & Associados Direo de Arte Amrico de Brito Impresso Lid Grfica Editora Ltda.

Barros, Claudio Severo Lombardo. Procedimentos para o diagnstico das doenas do sistema nervoso central de bovinos / Claudio Severo Lombardo Barros e Guilherme Henrique Figueiredo Marques. -- Braslia : MAPA/SDA/DDA, 2003. 50 p. : il. color. 1. Doena da Vaca Louca. 2. Doena animal - EEB. 3. Doena animal - BSE. 4. Diagnstico. 5. Preveno. 6. Controle. 7. Doena da Vaca Louca - Manual. I. Marques, Guilherme Henrique Figueiredo. II. Secretaria de Defesa Agropecuria. Departamento de Defesa Animal. III. Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento. IV. Ttulo. AGRIS 5212; L73; L70 CDU 619 : 636.2

Apresentao
Com a crescente globalizao dos mercados a manuteno da sade dos rebanhos tornou-se fundamental para a preservao do patrimnio pecurio de pases como o Brasil. Atualmente o comrcio internacional estabelece exigncias sanitrias rgidas, que constituem obstculos maiores do que as barreiras tarifrias. Dentro desse quadro a iniciativa privada no ter condies de competir no mercado globalizado de oferta de produtos de qualidade sem que haja o concurso de um eficiente servio de defesa sanitria atestando a qualidade da matriaprima e dos produtos, atuando como parceiro essencial dos segmentos de exportao. Durante a ltima dcada a epidemia de Encefalopatia Espongiforme Bovina - EEB, registrada no Reino Unido e, subseqentemente, em outros pases europeus, causou enormes prejuzos ao setor pecurio, em conseqncia, principalmente, da elevada percepo de risco em relao doena, que resultou em acentuada reduo do consumo de carne bovina naquele continente. Embora o risco associado EEB no Brasil seja extremamente reduzido, a adoo de medidas sanitrias para prevenir a sua introduo no Pas imprescindvel, pois a sua ocorrncia causar prejuzos imensurveis pecuria nacional, alm do risco para a sade humana , atingindo repercusses sociais e econmicas elevadssimas. Assim, desde o aparecimento da EEB no Reino Unido, as autoridades sanitrias brasileiras preocuparam-se em evitar a sua introduo no Pas, mediante a adoo de medidas sanitrias que envolveram, entre outras, restries importao de animais susceptveis e de seus produtos originrios de pases considerados de risco para a enfermidade, o rastreamento de animais anteriormente importados desses pases e a proibio da utilizao de protena de origem animal na formulao de alimentos destinados aos ruminantes. A valorizao e a qualificao dos servios de defesa sanitria animal, como elementos fundamentais no processo de avaliao e certificao da condio sanitria dos rebanhos, so os pilares para a credibilidade internacional. Por sua vez, o processo de tomada de deciso, relacionado manuteno de eficiente gesto de toda a estrutura sanitria, envolve a presena de profissionais permanentemente informados , motivados e avaliados, participando de uma organizao voltada s atividades fundamentais que devem no mnimo considerar: - a obteno constante e permanente da informao referente ao espao sob ateno, e o seu processamento de forma sistemtica e oportuna; - a anlise e elaborao de documentos informativos e de apoio ao sistema; - o armazenamento dos dados nos nveis locais e centrais determinados; - a retroalimentao do sistema de vigilncia e preveno, considerando todos os atores sociais envolvidos. Nesse contexto, o Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento , alicerado em legislaes especficas, implantou o sistema nacional de vigilncia para as Encefalopatias Espongiformes Transmissveis - EET, que recebe agora o suporte deste manual, que, alm da padronizao de aes, tem por objetivo oferecer subsdios tcnicos para a vigilncia das sndromes neurolgicas a todos os Mdicos Veterinrios Oficiais e aos profissionais autnomos envolvidos nos programas de sanidade animal, fornecendo garantias do estado sanitrio de nosso rebanho e disponibilizando s autoridades sanitrias brasileiras um valioso instrumento para a manuteno do Brasil como pas livre da EEB.

Joo Crisostomo Mauad Cavallro

Diretor do Departamento de Defesa Animal

Sumrio
1. Encefalopatia Espongiforme Bovina: Compreendendo essa Doena....05

2. Coleta do Encfalo de Bovinos para Exame Laboratorial......................15

3. Processamento do Encefalo para o Diagnstico Histolgico da Encefalopatia Espongiforme dos Bovinos...............................................................35

Claudio S.L. de Barros, Med. Vet., PhD.

Professor Titular Chefe do Setor de Patologia Veterinria Departamento de Patologia Universidade Federal de Santa Maria Santa Maria, Rio Grande do Sul

Guilherme H. Figueiredo Marques, Med. Vet.

Fiscal Federal Agropecurio Gerente Nacional do PNCRH Departamento de Defesa Animal Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abatecimento Braslia, Distrito Federal

ENCEFALOPATIA ESPONGIFORME BOVINA: COMPREENDENDO ESSA DOENA

1 - Definio A encefalopatia espongiforme bovina - EEB - (em ingls, BSE, sigla para bovine spongiform encefalopathy), conhecida como doena da vaca louca - uma condio degenerativa crnica e transmissvel do sistema nervoso central (SNC) de bovinos caracterizada clinicamente por nervosismo, reao exagerada a estmulos externos e dificuldade de locomoo, principalmente nos membros plvicos6. As alteraes espongiformes encontradas no exame microscpico deram o nome doena. O agente da EEB extremamente resistente ao calor, aos processos convencionais de esterilizao e no induz resposta imune ou inflamatria. A doena j foi relatada em bovinos de cerca de 20 pases, embora acima de 90% dos casos tenha ocorrido na Gr-Bretanha. A EEB faz parte de um grupo complexo de doenas neurodegerativas que afetam pessoas e animais, conhecidas como encefalopatias espongiformes transmissveis (EETs). As principais caractersticas das EETs encontram-se na Tabela 1. As principais EETs de pessoas e animais so relacionadas, respectivamente, nas Tabelas 2 e 3. 2 - A causa da EEB e das outras EETs Durante pesquisas para elucidar a etiologia das EETs os crebros homogeneizados de hamsters infectados por scrapie (uma EET de ovinos) eram fracionados em vrios componentes. Desses, a frao mais infecciosa demonstrou possuir grandes quantidades de uma determinada protena que no era destruda pelas proteases (enzimas que dissolvem as protenas). Essa protena, batizada como pron (do ingls proteinaceous infectious particle, com o i e o o trocados por convenincia lingstica) ou PrP (prion protein)7, no era encontrada em crebros de hamsters normais. A seqncia de aminocidos da PrP era a mesma que a de uma protena encontrada em quantidades iguais em crebros infectados e no infectados, mas que, ao contrrio da PrP, podia ser degradada por enzimas proteolticas. Havia, portanto, duas formas (apresentaes estruturais) da mesma protena. A forma encontrada apenas nos crebros dos animais infectados foi subseqentemente denominada PrPsc (onde sc significa scrapie, a doena prottipo das EETs). A forma encontrada tanto nos crebros infectados como nos no infectados foi chamada de PrPc (onde c significa celular, i., prpria das clulas normais)1. Vrias evidncias acumuladas at os dias de hoje indicam que a protena PrPsc seja o agente etiolgico das EETs, embora outras teorias como a do vrus e a do virino ainda persistam.

A PrPc glicoprotena normal da membrana plasmtica da clula e ocorre na maioria das clulas, mas predominantemente nas clulas do SNC. A PrPc transformada na isoforma anormal PrPsc que se acumula no SNC e produz a doena. O agente das EETs extremamente resistente inativao por calor (1 hora a 360 C de calor seco), radiao ultravioleta e substncias qumicas. Estudos da patogenia das EETs, baseados em experimentos com scrapie indicam que, quando se usam as rotas perifricas da infeco, o agente replica inicialmente no bao e linfonodos e chega ao crebro provavelmente por via das fibras simpticas dos nervos das vsceras que so conectados poro mdia da medula espinhal torcica14. Da medula o agente progride para o crebro numa velocidade de um milmetro por dia. Uma vez no SNC, a infectividade pode passar centrifugamente para os tecidos perifricos. A presena do agente das EETs nos tecidos determinada pela inoculao de camundongos com o material a ser testado, o que pode levar 700 dias. A EEB tem sido transmitida experimentalmente a vrias espcies. Em bovinos naturalmente afetados, o agente foi encontrado no encfalo, medula espinhal e retina. Em bovinos afetados experimentalmente, a poro distal do leo, a medula ssea, os gnglios do nervo trigmeo e os gnglios das razes dorsais dos nervos espinhais tambm mostraram infectividade. No foram encontradas evidncias de infectividade no leite e na carne (tecido muscular) de bovinos afetados tanto experimental como naturalmente. 3 - Epidemiologia A EEB foi identificada pela primeira vez na Gr-Bretanha, em 198610, mas dados epidemiolgicos e revises de arquivos de preparaes histolgicas deram conta da ocorrncia de casos j em 198513 e alguns estudos sugerem que casos possam ter ocorrido j na dcada de 70. A grande maioria dos bovinos afetados por EEB pertence a rebanhos da Gr-Bretanha. So oficialmente cerca de 180.000, desde 1986, distribudos por 35.000 rebanhos, numa mdia 1 a 2 casos por rebanho afetado13. Fora da Gr-Bretanha, a doena foi confirmada num nmero relativamente pequeno (cerca de 2.800) de bovinos nativos da Alemanha, ustria, Blgica, Canad, Dinamarca, Eslovquia, Eslovnia, Espanha, Finlndia, Frana, Grcia, Irlanda, Israel, Itlia, Japo, Liechtenstein, Luxemburgo, Pases Baixos, Polnia, Portugal, Repblica Tcheca e Sua. Com exceo de algumas poucas dezenas de casos, todos os 2.800 bovinos afetados fora da Gr-Bretanha so nativos. Em alguns pases ocorreram casos somente em bovinos importados, como foi o caso de Ilhas Malvinas e Oman. Informaes atualizadas podem ser obtidas no endereo eletrnico da Organizao Mundial de Sanidade Animal - OIE (www.oie.int).

Embora no exista predileo por raa ou sexo ou por questes de manejo, a doena na Gr-Bretanha ocorre principalmente em vacas de leite, entre 3 e 6 anos de idade. A EEB foi adquirida pelos bovinos atravs da alimentao com raes de farinha de carne ou de osso contaminadas pelo agente etiolgico. A fonte da infeco poderia ser ovinos contaminados por scrapie ou bovinos afetados por uma forma espordica da doena, at ento no detectada. A entrada dos primeiros bovinos contaminados na cadeia alimentar por certo aumentou a epidemia. Alteraes nos processos de fabricao dessas raes de farinha de carne ou de osso, ocorridas no fim da dcada de 1970 e incio da dcada de 80, podem ter contribudo para o aparecimento da doena13. A ingesto de menos que um grama de crebro de um animal contaminado suficiente para produzir a doena. No h evidncia de que a EEB se dissemine horizontalmente, mas sugere-se que a transmisso materna ou vertical possa acontecer. No entanto, acredita-se que isso ocorreria em nveis muito baixos, insuficientes para perpetuar a epidemia13. 4 - Sinais clnicos O perodo de incubao da EEB (tempo decorrido desde que o animal foi infectado at o aparecimento dos primeiros sinais clnicos) de 2 a 8 anos (mdia 5 anos), embora perodos de incubao mais longos tenham sido relatados. Aps o aparecimento dos sinais clnicos, a doena evolui invariavelmente para morte num curso de 3 semanas a 6 meses. Bovinos afetados por EEB sofrem de degenerao progressiva do sistema nervoso central e podem apresentar alteraes do temperamento, da sensibilidade e da locomoo2,8,9,12. Sinais clnicos gerais incluem decrscimo na produo de leite e perda de peso, apesar da manuteno do apetite.

a. Distrbios no comportamento. Incluem nervosismo, medo ou agressividade, postura anormal, incoordenao e dificuldade em levantar. Bovinos com EEB so freqentemente muito nervosos, alerta e excitveis, alteraes que podem se manifestar por um tipo de movimento espasmdico de todo o corpo. Esses distrbios do comportamento so mais evidentes quando o animal excitado. Sinais clnicos possveis de ocorrer tambm so salivao e um olhar assustado com olhos esbugalhados. Por vezes o animal apresenta ranger de dentes. Outros sintomas incluem lamber freqente do focinho e franzir do nariz. Alguns bovinos tambm exibem movimentos nervosos das orelhas. Nos estgios terminais da EEB, o animal tem dificuldade em levantar-se ou pode permanecer em decbito permanente. b. Distrbios na sensibilidade. Bovinos com EEB comumente apresentam distrbios na sensibilidade, reagindo exageradamente ao toque (alterao mais comum), ao som e luz. c. Distrbios na locomoo. Andar rgido, incoordenao, hipermetria e ataxia generalizada so sinais freqentes em bovinos afetados por EEB. A hipermetria mais pronunciada nos membros plvicos e confere aos bovinos um passo alto semelhante ao observado em cavalos com harpejamento. A ataxia grave evolui para quedas e finalmente paresia posterior e decbito. 5 - Achados de necropsia e histopatologia No h leses macroscpicas diretamente relacionadas doena, mas as leses microscpicas da EEB so altamente especficas. So leses degenerativas, simtricas e bilaterais e localizam-se em certas regies da substncia cinzenta do tronco enceflico11,12. Essas alteraes caracterizam-se basicamente por vacolos que do o aspecto espongiforme substncia enceflica.

Existem achados incidentais que devem ser considerados com cuidado no exame histolgico de bovinos. Vacolos no citoplasma dos neurnios do ncleo vermelho do mesencfalo so um achado incidental comum em crebros de bovinos e encontrados em 64% de encfalos de bovinos normais5. Quando encontrados somente nesse local, no devem ser levados em conta no diagnstico da BSE11,12. Inflamaes no-purulentas inespecficas (manguitos perivasculares) so encontradas em cerca de 30% de bovinos adultos normais4 e podem resultar de infeces subclnicas ou latentes. Da mesma forma, aparecem grnulos intracitoplasmticos de ceride-lipofuscina nos neurnios. Esses achados parecem no ser significativos12 e devem ser considerados achados incidentais. 6 - Diagnstico Atualmente no h teste para detectar a doena no animal vivo. A doena pode ser confirmada pelo exame microscpico do tecido enceflico ou pela deteco da forma anormal do pron (PrPsc). Isso pode ser feito por microscopia eletrnica ou por mtodos imunolgicos. Quando extratos de crebros de animais afetados com EETs so examinados ao microscpio eletrnico, as PrPsc (prons) aparecem como estruturas em forma de bastonete denominadas SAFs (scrapie associated fibrils). Mtodos imunolgicos incluem a deteco da protena (PrPsc) por imunoistoqumica ou por western immunobloting3 e os chamados testes rpidos em ELISA ou immunoblotting5. Atualmente, no Brasil, o diagnstico realizado pelo exame histolgico de cortes selecionados do tronco enceflico e por imunoistoqumica. Para ambos os testes suficiente o envio do crebro, fixado conforme especificado no informativo Procedimentos para o Diagnstico das Doenas do Sistema Nervoso Central de Bovinos. 7 - Controle, profilaxia e tratamento No h tratamento ou vacina para impedir o aparecimento da doena. Medidas para prevenir a introduo de casos incluem no importar ruminantes e seus produtos de pases considerados de risco para a EEB, no alimentar ruminantes com protena de origem animal, com cama de frango, com resduos da explorao de sunos e impedir a permanncia de carcaas no campo.

8 - Dados sobre o sistema de vigilncia brasileiro A produo de leite e de carne bovina no Brasil feita quase que exclusivamente pela criao e engorda de animais a pasto. A suplementao alimentar, quando ocorre, feita com protena vegetal, tornando remota a difuso da EEB no pas. No entanto, desde o aparecimento da doena no Reino Unido (RU), as autoridades sanitrias brasileiras preocuparam-se em proteger o pas da entrada da EEB, visando preservar o patrimnio pecurio e a sade pblica. Foram tomadas medidas sanitrias como a restrio importao de animais susceptveis e seus produtos, quando originrios de pases de risco, o rastreamento dos animais importados desses pases e a imposio de restries formulao de alimentos destinados aos ruminantes. grande o nmero de produtos para uso humano que so obtidos de tecidos de vrias espcies de ruminantes. Essas substncias de origem animal so utilizadas como componentes na produo de medicamentos, cosmticos, produtos biolgicos e outros insumos para sade humana. Diversas medidas sanitrias foram adotadas pela Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria - ANVISA (www.anvisa.gov.br/vacalouca/index.htm) com objetivo de proteger a sade da populao, garantindo a segurana sanitria de produtos e servios. O Governo Brasileiro no importou farinha de carne e ossos dos pases considerados de risco para a EEB, tendo como nica e eventual fonte de risco os bovinos importados desses pases, nos quais no foram detectados sinais de EEB. Considerando que as importaes ocorreram entre 10 e 23 anos atrs (tempo consideravelmente mais longo do que o perodo mdio de incubao da doena), a possibilidade que esses bovinos venham a desenvolver EEB remota. No obstante, todos os bovinos importados, assim como seus descendentes, vm sendo acompanhados, inclusive com anlises laboratoriais. Na Tabela 4, esto relacionados os tipos de populaes bovinas avaliadas no sistema de vigilncia da EEB no Brasil. Em 2001 e 2002 foram examinados histologicamente 5.894 encfalos de bovinos, sendo que 1.361 desses apresentavam sinais clnicos de doena neurolgica. Essa cifra de longe superior aos 433 encfalos de bovinos com sinais clnicos nervosos que a OIE recomenda examinar. Os pases que mantm comrcio de produtos de origem animal com o Brasil, consideraram satisfatrias as garantias fornecidas pelo governo brasileiro sobre os bovinos importados e quanto a estabilidade de nosso sistema de vigilncia, classificando o risco da importao desses produtos e bovinos como desprezvel.

9 - Referncias
1. Baker HF, Ridley RM: Fatal Protein. The story of CJD, BSE and Other Prion Diseases, p. 3. Oxford University Press, Oxford, England, 1998. 2. Davis AJ, Jenny AL, Miller LD: Diagnostic characteristics of bovine spongiform encephalopathy. J Vet Diagn Invest, 3:266-271, 1991. 3. Farquar J, Sommerville RA, Ritchie LA: Postmortem immunodiagnosis of scrapie and bovine spongiform encephalopathy. J Virol Methods 24:215-222, 1989. 4. Gavier-Widen D, Wells GAH, Simmons MM, Wilesmith JW, Ryan J:Histological observations on the brains of symptomless 7-year-old cattle. J Comp Path 124: 52-59, 2001. 5. Moynagh J, Schimmel H: Tests for BSE evaluated. Nature 4000:105, 1999. 6. Pattison JR: Bovine spongiform encephalopathy. Infect Dis Review 1: 119-121, 1999. 7. Prusiner SB: Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science, 216: 136-144, 1982 8. World Health Organization: Understanding the BSE Threat, WHO, Genebra 23 p, 2002. 9. Weber P. Mstl K, Weissenbck E, Mstl E, Baumgartner W: Bovine Spongiforme Enzephalopathie (BSE)- Verlauf und Bekmpfung 1987 - 1997. Wien Tierrztl Mschr, 85: 175-186, 1998. 10. Wells GAH, Scott AC, Johnson CT, Gunning RF, Hancock, RD, Jeffrey M, Dawson M, Bradley R: A novel progressive spongiform encephalopathy in cattle. Vet Rec, 121: 419-420, 1987. 11. Wells GAH. Bovine spongiform encephalopathy: diagnostic significance of vacuolar changes in selected nuclei of the medulla oblongata. Vet Rec, 125: 521-524, 1989. 12. Wells GAH: Bovine spongiform encephalopathy: A neuropathological perspective. Brain Pathol, 1:69-78, 1991. 13. Wilesmith JW: Manual on Bovine Spongiform Encephalopathy, p. Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome, 1998. 14. Zeidler M, Gibbs CJ, Meslin F: WHO Manual for Strengthening Diagnosis and Surveillance of Creutzfeldt-Jakob Disease p. 39-40, World Health Organization, Genebra, 1998.

Claudio S.L. de Barros, Med. Vet., PhD.

Professor Titular Chefe do Setor de Patologia Veterinria Departamento de Patologia Universidade Federal de Santa Maria Santa Maria, Rio Grande do Sul

COLETA DO ENCFALO DE BOVINOS PARA EXAME LABORATORIAL

1 - Introduo
A encefalopatia espongiforme bovina (BSE), conhecida em todo o mundo como doena da vaca louca, uma doena degenerativa crnica que afeta o sistema nervoso central de bovinos. A doena foi diagnosticada pela primeira vez na Gr-Bretanha em 198612 e causou grande impacto econmico na pecuria do Reino Unido. Foi tambm confirmada em bovinos nativos da ustria, Blgica, Canad, Repblica Tcheca, Dinamarca, Eslovquia, Eslovnia, Espanha, Finlndia, Frana, Alemanha, Holanda, Itlia, Irlanda, Israel, Japo, Liechtenstein, Luxemburgo, Portugal e Sua. A preocupao de que a BSE apresentasse risco para os consumidores de carne bovina esteve presente desde o incio da epidemia na Inglaterra. Essa preocupao atingiu nveis extremamente altos quando, na terceira semana de maro de 1996, num comunicado ao parlamento ingls, o Secretrio do Estado da Sade da Inglaterra anunciou que a ocorrncia de uma nova variante da doena neurolgica de humanos, Creutzfeldt Jakob (CJD), era provavelmente relacionada BSE1,2. Um dos resultados dessa crescente preocupao que as autoridades sanitrias internacionais esto solicitando dos pases exportadores de carne que apresentem evidncias de que seus rebanhos so livres da doena. Isso equivale a dizer que esses pases devem ter um controle capaz de atestar que seu rebanho bovino livre de BSE, identificar as doenas que afetam os sistema nervoso central e reconhecer casos de BSE, se eles ocorrerem. O objetivo deste manual fornecer uma orientao para coleta de material para o diagnstico histolgico de BSE e de outras doenas do sistema nervoso de bovinos. Embora a BSE no ocorra no Brasil, necessrio

manter-se um esquema de vigilncia para essa doena. Constam aqui instrues para o exame preliminar do tecido nervoso, seleo e remessa ao laboratrio de diagnstico. As enfermidades que afetam direta ou indiretamente o sistema nervoso de bovinos no Rio Grande do Sul foram revisadas recentemente10 e presume-se que a distribuio no restante do Brasil seja, pelo menos, semelhante, com variaes quanto prevalncia das doenas em certas regies. Essas doenas sero levadas em considerao na coleta do material. Para que o exame do sistema nervoso de bovinos atinja um nmero significativo de casos, espera-se poder contar com o material recebido pela rede de diagnstico para raiva, j existente no pas. Por essa razo, procurou-se incluir instrues que contemplem a coleta de material, possibilitando o exame para o diagnstico de raiva, da BSE e de outras enfermidades do sistema nervoso de bovinos10. 2 - Recomendaes gerais 2.1 As doenas do sistema nervoso central (SNC) freqentemente no apresentam leses bvias necropsia. Por isso, o patologista que examina o material no laboratrio depende de um histrico e de observaes clnicas confiveis para orientao sobre a natureza da doena neurolgica9. Um formulrio com os principais dados referentes ao(s) animal(ais) afetado(s), aos achados epidemiolgicos e clnicos e aos principais achados de necropsia deve ser preenchido (Anexo 1). A remoo e coleta de amostras do sistema nervoso requerem tempo e esforo. , portanto, necessrio estabelecer critrios para realizao dessas tarefas. Se no houver sinais clnicos e histrico sugestivos de doena neurolgica, pouco provvel que o exame do sistema nervoso revele leses significativas. Nos casos em que no h histrico clnico ou ele pouco preciso ou quando a morte do animal ocorreu sem sinais premonitrios, recomenda-se o exame neuropatolgico. 2.2 Informe sobre a data e hora da morte, o tempo decorrido entre a morte e a necropsia e sobre qualquer demora entre coleta e fixao do material. Esses dados so importantes para a realizao do exame neuropatolgico. Doenas que oferecem risco para a sade humana (por ex., raiva, listeriose) devem ser consideradas antes da realizao dos exames e os cuidados necessrios devem ser tomados. O uso de luvas de borracha e de um visor (culos) durante a abertura do crnio recomendado.

2.3 Se o material for destinado ao exame histolgico, extremamente importante que o manuseio do tecido nervoso ainda no-fixado seja o mnimo possvel. O exame macroscpico detalhado deve, por isso, ser feito aps a fixao. O manuseio do tecido nervoso no-fixado causa artefatos que prejudicam a avaliao histolgica das leses. 2.4 Tanto quanto possvel, o exame macroscpico sistemtico do encfalo deve ser feito no rgo fixado (a fixao endurece os tecidos). Isso facilita a seleo de reas apropriadas para o diagnstico de doenas especficas e permite que se determine a distribuio das leses. A distribuio das leses no sistema nervoso (i., bilaterais, simtricas, focais, multifocais, na substncia branca, na substncia cinzenta) caracterstica para vrias doenas e deve ser anotada. Muitas vezes o encfalo no pode ser fixado inteiro, como seria o ideal, pois h necessidade de conservar partes do rgo no fixadas para exames virolgicos e bacteriolgicos. 2.5 No misture tecidos de animais diferentes, mesmo que representem casos de uma mesma doena. Tecidos de cada animal devem ser identificados claramente. 3 - Retirada do encfalo A coleta no criteriosa e aleatria de numerosas amostras de encfalo no-fixado pode dificultar o exame neuropatolgico no laboratrio. Quando houver vrios animais para necropsia, num surto de uma doena neurolgica, o tempo para a retirada do encfalo pode ser um fator limitante. Nesse caso, selecione alguns animais para o exame neuropatolgico. Colha o material tentando eliminar, ou diminuir ao mximo, danos ao tecido nervoso, causados durante a sua retirada. 3.1 Atravs de um acesso ventral, remova a cabea, desfazendo a articulao atlanto-occipital. Nesse ponto, examine a superfcie e a cpsula das articulaes e o aspecto fsico do lquido cefalorraquidiano (LCR) que flui quando a dura-mter seccionada. Em casos com pouco tempo decorrido desde a morte, pode-se retirar uma amostra assptica de LCR antes de seccionar-se a duramter. 3.2 Disseque a pele e os msculos da cabea. Abra a cavidade craniana seguindo as linhas mostradas na Figura 1. Isso pode ser feito com serra comum ou cutelo do tipo usado por aougueiros. O encfalo , ento, exposto com a dura-mter intacta.

3.3 Usando tesouras, retire a dura-mter, seccionando a foice do crebro e o tentrio (tenda) do cerebelo (Figura 2). Com a cabea do bovino inclinada, remova o encfalo seccionando os nervos cranianos. Sem o corte prvio dessas estruturas, impossvel remover o crebro intacto. Evite ao mximo manusear, pressionar e apertar o tecido nervoso durante o processo de remoo, para evitar artefatos histolgicos que prejudiquem o exame no laboratrio. 3.4 O gnglio do nervo trigmeo (gnglio de Gasser) e a rete mirabile carotdea devem ser colhidos junto com a hipfise (Figura 3). O exame desse par de gnglios nervosos do 5 par de nervos cranianos importante para o diagnstico de doenas como raiva e meningoencefalite por herpesvrus bovino (BHV-5). Nessas duas doenas, freqentemente se observa inflamao (ganglioneurite) do gnglio do nervo trigmeo. Em casos de febre catarral maligna11, os vasos da rete mirabile mostram leso caracterstica (vasculite). 3.5 Examine o encfalo para possveis leses macroscpicas, pesquisando possveis assimetrias (i. , algumas estruturas mais volumosas que outras) e alteraes da cor (por ex., hiperemia das meninges, congesto do crtex em casos de babesiose por Babesia bovis, crtex amarelo-castanho em casos de polioencefalomalacia).

4 - Seleo das amostras a serem colhidas O material para exames virolgicos e bacteriolgicos deve ser colhido antes da fixao do encfalo. Por outro lado, o congelamento torna o encfalo inadequado para o exame histolgico. Como muitos casos necessitam da realizao dos trs tipos de exame, um meio-termo deve ser alcanado. 4.1 Coleta de amostras para a bacteriologia e virologia 4.1.1 Inicialmente remova o cerebelo, cortando no nvel dos pednculos cerebelares. Introduza a ponta de uma lmina no 4 ventrculo pela parte caudal do cerebelo (Figura 4). Corte rostral e horizontalmente os pednculos cerebelares separando o cerebelo do bulbo num dos lados e, depois, no outro. Ao findar essa operao, o cerebelo estar completamente separado do encfalo (Figura 5).

4.1.2 Corte na altura do tlamo, separando o tronco enceflico do resto do encfalo (Figura 6). Ao findar essa operao, voc obter trs partes: a) o tronco enceflico, b) o cerebelo, c) o restante do encfalo (Figura 7). 4.1.3 Para obter a amostra 1, retire uma fatia sagital (cerca de 0,5 cm) do verme do cerebelo (Figura 8). 4.1.4 Para obter a amostra 2, corte um segmento transversal de cerca de 2,5 cm da medula espinhal cervical (Figura 9). 4.1.4 A amostra 3 obtida cortando-se uma fatia do tlamo cerca de 1 cm de espessura (Figura 10). 4.1.5 A amostra 4 obtida dividindo um dos hemisfrios cerebrais na altura do quiasma ptico, separando a parte caudal do restante (Figura 11). 4.1.6 Nesse ponto, as quatro amostras a serem enviadas para o exame virolgico ou bacteriolgico foram obtidas (Figura 12). Os fragmentos selecionados so adequados para o exame de raiva3,8 e para exame de outras doenas causadas no sistema nervoso de bovinos por outros vrus e bactrias9,11. Essas trs amostras devem ser conservadas em um refrigerador e remetidas refrigeradas. No entanto, se o tempo entre a coleta e a remessa for maior que 24 horas aconselhvel congelar as amostras para a remessa, mas nunca fix-las. 4.1.7 O restante do encfalo (Figura 13) deve ser fixado conforme instrues a seguir (item 4.2), pois destina-se ao exame histolgico. Deve-se tambm fixar em formol a 10% e remeter, junto com o material mostrado na Figura 3, o bloco de tecidos constitudo pela rede admirvel carotdea, o gnglio do nervo trigmeo e a hipfise. 4.2 Coleta e fixao de material para exame histolgico 4.2.1 Para fixar o encfalo, formol a 10% o fixador indicado. Para preparar um litro dessa soluo, use 100 ml de formaldedo (35-40%) e 900 ml de gua de torneira. Existe uma confuso freqente entre aldedo frmico (ou formaldedo) e formalina comercial (ou formol). Formaldedo um gs com o qual se prepara uma soluo aquosa de 35-40%. Essa soluo constitui a formalina comum.

O termo formalina refere-se, portanto, apresentao comercial da soluo de formaldedo. Assim, formol (ou formalina) a 10% representa uma soluo preparada misturando-se 10 ml de formalina comercial (formaldedo a 35-40%) com 90 ml de gua4. O formol tamponado fornece uma fixao com melhores resultados, mas no essencial, pois a frmula dada acima permite um exame histolgico aceitvel do encfalo. A frmula para preparao de um litro de formol tamponado dada a seguir7. Reagentes Soluo de 35-40% de formaldedo (formalina) gua destilada Fosfato monobsico de sdio Fosfato dibsico (anidro) de sdio Procedimento Misture previamente os tampes fosfato em gua quente para que se dissolvam, antes de adicionar o restante da gua com soluo de formaldedo. Adicione o formaldedo aps esfriar a soluo para diminuir os vapores. Inverta o recipiente vrias vezes para permitir uma boa mistura. Faa a mistura e use a soluo apenas em reas bem ventiladas. Observaes Mesmo que essa soluo de formol seja tamponada, com o tempo o pH vai baixar, provocando o aparecimento de pigmentos de hematina cida em tecidos congestos (que tm muito sangue). 4.2.2 Coloque o encfalo num volume de fixador que seja, pelo menos, 10 vezes maior que o volume de tecido a ser fixado. Assim, so necessrios 6 litros do fixador para fixar o encfalo inteiro de um bovino adulto (600 cm3). O tempo mnimo de fixao varia com o tamanho do encfalo. Um encfalo de camundongo necessita 24 horas para ser fixado; um encfalo de ovelha, aproximadamente 4 dias; um encfalo de bovino adulto, uma semana. Aps a fixao, o tecido necessitar uma quantidade muito menor de fixador, facilitando o transporte ao laboratrio. 100ml 900ml 4g 6,5g

Ao fixar o encfalo, evite mistur-lo com outros materiais que possam comprimir o tecido nervoso, danificando-o para o exame histolgico.

5 - Remessa do material ao laboratrio 5.1 Cada material de encfalo deve ser enviado em vasilhame no deformvel (por ex., um vasilhame plstico duro), ao invs de ser enrolado em algodo ou gaze. O vasilhame deve ser completamente preenchido pelo fixador, de modo a excluir o ar, amortecendo, assim, os efeitos do movimento. Em casos urgentes, mesmo crebros no completamente fixados podem ser transportados, mas, nesse caso, devem ser fornecidas informaes sobre o tempo de fixao. 5.2 importante que a embalagem que contm o encfalo (tanto as partes no fixadas como as fixadas) a ser remetido ao laboratrio seja hermeticamente fechada para evitar vazamentos e exposio de pessoas que manuseiem o pacote. Qualquer remessa deve ser acompanhada do formulrio do Anexo 1, preenchido.

6 - Referncias 1. Baker HF, Ridley RM: Fatal protein. The story of CJD, BSE and other prion diseases. Oxford University Press, Oxford, 249 p., 1998. 2. Baker HF, Ridley RM: What went wrong in BSE? From prion disease to public disaster. Brain Research Bull. 40:237-244,1996. 3. Bingham J, van der Merwe M: Distribution of rabies in infected brain material: determining the reliability of different regions of the brain for rabies fluorescent antibody test. J Virol Methods 101:85-95, 2002. 4. Escourelle R, Poirer J: Manual of basic neuropathology. WB Saunders, Philadelphia, 1978. Brief survey of neuropathological techniques: p. 213-226. 5. Getty R: Sistema nervoso. Cap. 13, p.205. In Getty R: Sisson/Grossman Anatomia dos animais domsticos. 5 ed. Interamericana, Rio de Janeiro, 1981. 6. Jenkins TW: Functional mammalian neuroanatomy. Lea & Febiger, Philadelphia, p. 17, 1972. 7. Luna LG: Manual of histologic staining methods of Armed Forces Institute of Pathology. 3 ed. McGraw-Hill, New York: p.3,1968. 8. Office International des Epizooties (World Organization For Animal Health). Manual of standards for diagnostic tests and vaccines. Chapter 3.1.5 (rabies), p. 209-210, Paris, 1996. 9. Riet-Correa F, Riet-Correa G, Schild AL: Importncia do exame clnico para o diagnstico das enfermidades do sistema nervoso em ruminantes e eqdeos. Pesq Vet Bras 22:161-168, 2002. 10. Sanches AWD, Langohr IM, Stigger AL, Barros CSL: Doenas do sistema nervoso central em bovinos no Sul do Brasil. Pesq Vet Bras 20: 113-118, 2000. 11. Summers BA, Cummings JF, De Lahunta A: Veterinary Neuropathology. Mosby, St. Louis. 527p., 1995.

12. Wells GAH, Scott AC, Johnson CT, Gunning RF, Hancock, RD, Jeffrey M, Dawson M, Bradley R: A novel progressive spongiform encephalopathy in cattle. Vet Rec, 121:419-420,1987. 7 - Glossrio Aracnide: membrana delgada que recobre o encfalo e a medula espinhal. BSE: encefalopatia espongiforme dos bovinos (do ingls, Bovine Spongiform Encephalopathy). CJD: doena de Creutzfeldt Jakob. Doena neurolgica de humanos causada por pron, com leses semelhantes s da BSE. Dura-mter: membrana mais espessa que recobre o encfalo e a medula espinhal. Foice do crebro: prega da dura-mter em forma de foice, localizada entre os hemisfrios cerebrais. Sua parte rostral fixa-se na crista galli e a parte caudal se junta ao tentrio do cerebelo4. Gnglio: acmulo de neurnios fora do sistema nervoso central. Leptomeninges: conjunto formado pela pia-mter e aracnide. Paquimeninge: dura-mter. Pia-mter: membrana delgada que recobre o crebro e a medula espinhal. Prons: um nome dado a molculas proticas consideradas os agentes etiolgicos das encefalopatias espongiformes, como a BSE. Essa protena central para o desenvolvimento dessas doenas. Em indivduos sadios ela pode ser digerida por uma protease (enzima que digere protenas). Nos indivduos com doenas causadas por prons (por ex., BSE), essa protena sofre uma modificao pstranslacional, de maneira a se tornar resistente digesto de proteases.

O nome pron derivado da expresso inglesa proteinaceous infectious. Deveria, por lgica, ser denominada proin, mas a expresso pron era mais facilmente pronuncivel1. Rete mirabile (rede admirvel): uma rede intercalada no trajeto de uma artria4. A rede admirvel carotdea fica de cada lado da hipfise, entre essa glndula e o gnglio do nervo trigmeo. Tentrio do cerebelo: extenso da dura-mter que separa transversalmente o cerebelo e os plos occipitais dos hemisfrios cerebrais4. Tronco enceflico: composto do mielencfalo, a ponte (que pertence ao metencfalo) e o diencfalo. Assim, quando retiramos, do sistema nervoso central, a medula espinhal na altura do formen magno, o telencfalo (hemisfrios cerebrais) e o cerebelo, o que resta o tronco enceflico6.

Claudio S.L. de Barros, Med. Vet., PhD.

Professor Titular Chefe do Setor de Patologia Veterinria Departamento de Patologia Universidade Federal de Santa Maria Santa Maria, Rio Grande do Sul

PROCESSAMENTO DO ENCFALO PARA O DIAGNSTICO HISTOLGICO DA ENCEFALOPATIA ESPONGIFORME DOS BOVINOS

1 - Introduo
Esta a segunda parte do manual iniciado com a coleta do encfalo de bovinos para o exame laboratorial. O objetivo da primeira parte foi fornecer uma orientao para a coleta, a campo, do encfalo de bovinos e sua preparao para a remessa ao laboratrio. Esta segunda parte tratar do processamento do material, no laboratrio, para o exame histolgico. O objetivo principal dos manuais fornecer bases para o diagnstico da encefalopatia espongiforme dos bovinos (EEB), a fim de possibilitar a manuteno de um sistema de vigilncia para a doena no Brasil. No entanto, nossa inteno que as indicaes fornecidas permitam tambm o diagnstico de outras doenas do sistema nervoso em bovinos. Para tanto, a primeira parte inclui instrues para a remessa de material para exames virolgicos (principalmente raiva), bacteriolgicos e histolgicos. As principais enfermidades que afetam direta ou indiretamente o sistema nervoso de bovinos no Brasil so brevemente revisadas para orientar o diagnstico diferencial. Essas doenas sero tratadas resumidamente, mas o leitor poder encontrar maiores detalhes sobre cada uma delas nas publicaes listadas nas referncias1,4-6. As instrues para o processamento e exame histolgico levam em conta o material recebido em formol pelo laboratrio, conforme consta no manual para coleta do encfalo.

2 - Encefalopatia espongiforme dos bovinos (EEB) 2.1 Localizao dos cortes a serem obtidos para o diagnstico histolgico da EEB O exame macroscpico deve ser feito no encfalo fixado. O encfalo rotineiramente fatiado a intervalos de 5 mm, e as duas superfcies de corte so examinadas.Os cortes usados para o diagnstico da BSE so obtidos do tronco enceflico (Figura 1). So recomendados cortes em quatro locais: 1. Bulbo no nvel do bex (Figura 2) 2. Ponte no nvel dos pednculos cerebelares caudais (posteriores) (Figura 3) 3. Mesencfalo incluindo o colculo caudal (tubrculos quadrigmeos inferiores) (Figura 4) 4. Mesencfalo incluindo o colculo rostral (tubrculos quadrigmeos superiores) e ncleo vermelho (Figura 5) 2.2 Leses histolgicas na EEB As leses microscpicas na EEB so altamente especficas e consideradas patognomnicas2,7-10. So leses degenerativas, simtricas e bilaterais e localizam-se em certas regies da substncia cinzenta do tronco enceflico8-10. Duas apresentaes de vacuolizao neuronal so observadas. Na neurpila h vacolos nos neuritos de at 20 micrmetros de dimetro - alterao espongiforme (Figura 6). No pericrio ocorrem vacolos maiores, solitrios ou mltiplos, que chegam a 30-40 micrmetros de dimetro (Figura 7). Esses vacolos distendem o pericrio produzindo neurnios balonosos que conservam apenas uma fina margem de citoplasma (Figura 8). A presena de vacolos na neurpila da substncia cinzenta e no pericrio dos neurnios so os critrios para o diagnstico positivo de EEB, no exame histolgico10.

Ateno: vacolos no citoplasma dos neurnios do ncleo vermelho do mesencfalo so um achado incidental comum em encfalo de bovinos e encontrados em 64% de encfalos de bovinos normais3. Quando encontrados somente nesse local, no devem ser levados em conta no diagnstico da EEB9,10. A distribuio das leses bastante regular10. Ocorrem principalmente no ncleo do trato solitrio, no trato espinhal do nervo trigmeo, no ncleo vestibular, na formao reticular do bulbo, na substncia cinzenta periaqueductal do mesencfalo, na rea paraventricular do tlamo e no septo talmico. A densidade de vacolos maior no bulbo, mesencfalo e tlamo. Alteraes no cerebelo, hipocampo, ncleos basais e crtex cerebral so mnimas. O mapeamento das leses em 684 crebros afetados por EEB revelou que, em 99,6% dos casos, o corte do bulbo no nvel do bex (ver Figura 2) apresentou as alteraes caractersticas da doena, principalmente as alteraes espongiformes no ncleo do trato solitrio e no trato espinhal do nervo trigmeo (ver Figura 6), indicando que este o corte do encfalo mais importante para o diagnstico. Esferides e necrose individual de neurnios ocorrem ocasionalmente, mas h evidncia de neuroniofagia. No h reao inflamatria, e pode ocorrer gliose discreta com formao de gemistcitos. Numa pequena proporo dos casos ocorre amiloidose. Inflamaes no-purulentas inespecficas (manguitos perivasculares) so encontradas em cerca de 30% de bovinos adultos normais3 e podem resultar de infeces subclnicas ou latentes. Da mesma forma, aparecem grnulos intracitoplasmticos de ceride-lipofuscina nos neurnios. Esses achados parecem no ser significativos10 e devem ser considerados achados incidentais. 3 - Diagnsticos diferenciais Os distrbios neurolgicos de bovinos podem resultar de vrias causas1,4-6. No Brasil, a doena mais comumente diagnosticada em bovinos com sinais clnicos de distrbios nervosos a raiva.

Os sinais clnicos da raiva podem ser confundidos com EEB, mas a observao clnica por um perodo prolongado ajuda a diferenciar as duas doenas. Na raiva, o curso clnico , em geral, mais curto (2-7 dias). O exame de imunofluorescncia realizado no material no-fixado resolve a questo. Alm disso, as leses histolgicas de EEB so bastante caractersticas e diferentes das da raiva. Nesta ltima, h meningoencefalite no-purulenta e, muitas vezes, incluses acidoflicas em neurnios - os corpsculos de Negri. Um estudo cuidadoso do histrico clnico, da epidemiologia e dos achados de necropsia ajuda a distinguir vrias doenas neurolgicas de bovinos. Por exemplo, as doenas genticas ou congnitas ocorrem em animais recmnascidos ou muito jovens, enquanto a EEB ocorre somente em animais adultos (4 a 5 anos). Por outro lado, certas intoxicaes como a causada pela toxina do fungo Claviceps paspali ocorrem apenas no incio de outono, quando a gramnea parasitada (Paspalum spp.) est sementando. Os principais distrbios neurolgicos observados em bovinos no Brasil esto relacionados nas Tabelas 1-4. Ali constam a idade e a categoria doa animais afetados, os principais sinais clnicos e leses encontradas em cada doena. As informaes constantes nessas tabelas servem apenas como uma orientao para o diagnstico diferencial. Mais informaes sobre cada uma dessas doenas devero ser obtidas dos trabalhos relacionados na lista de referncias ou em livros texto especializados. 4 - Cortes adicionais Devem-se realizar regularmente cortes adicionais que facilitam o diagnstico diferencial de outras doenas do sistema nervoso. Esses cortes incluem: 1. Corte sagital medial pelo verme do cerebelo (Figura 9) 2. Crtex frontal rostralmente ao quiasma ptico (Figura 10) 3. Crtex parietal no nvel dos corpos mamilares (Figura 11) Em todos os casos em que o exame dos blocos inicialmente selecionados for inconclusivo, cortes adicionais do crebro devem ser feitos, conforme a deciso do patologista.

5 - Referncias 1. Barlow R: Differential diagnosis of bovine neurological disorders. In Practice, 10:64-73,1989. 2. Davis AJ, Jenny AL, Miller LD: Diagnostic characteristics of bovine spongiform encephalopathy. J Vet Diagn Invest, 3:266-271, 1991. 3. Gavier-Widen D, Wells GAH, Simmons MM, Wilesmith JWW, Ryan J:Histological observations on the brains of symptomless 7-year-old cattle. J Comp Path 124: 52-59, 2001. 4. Lemos RA, Brum KB, Bernardo KC, Katayama KA, Mori AE, Bonilha MM, Carvalho JCM: Aspectos epidemiolgicos das principais enfermidades caracterizadas por sintomatologia nervosa em bovinos, diagnosticados no Mato Grosso do Sul, Campo Grande. Relatrio de Bolsa de Iniciao Cientfica do CNPq 16 p. 1998. 5. Riet-Correa F, Schild AL, Fernandes CG: enfermidades do sistema nervoso dos ruminantes no sul do Rio Grande do Sul. Cincia Rural, 28: 341-348, 1998. 6. Sanches AWD, Langohr IM, Stigger AL, Barros CSL: Doenas do Sistema nervoso central em bovinos no sul do Brasil. Pesq Vet Bras, 20(3): 113-118, 2000. 7. Weber P. Mstl K, Weissenbck E, Mstl E, Baumgartner W: Bovine Spongiforme Enzephalopathie (BSE)- Verlauf und Bekmpfung 1987 - 1997. Wien Tierrztl Mschr, 85: 175-186, 1998. 8. Wells GAH, Scott AC, Johnson CT, Gunning RF, Hancock, RD, Jeffrey M, Dawson M, Bradley R: A novel progressive spongiform encephalopathy in cattle. Vet Rec, 121: 419-420, 1987. 9. Wells GAH. Bovine spongiform encephalopathy: diagnostic significance of vacuolar changes in selected nuclei of the medulla oblongata. Vet Rec, 125: 521-524, 1989. 10. Wells GAH: Bovine spongiform encephalopathy: A neuropathological perspective. Brain Pathol, 1:69-78, 1991.