[ESTUDO DA CINTICA DA ENZIMA INVERTASE] ndice

1. 2. 3.

Bioqumica I

Objectivo ........................................................................................................................................... 3 Introduo ......................................................................................................................................... 3 Material e Reagentes ......................................................................................................................... 5 3.1. Reagentes ............................................................................................................................................... 5 3.2. Material ................................................................................................................................................. 6

4.

Procedimento Experimental ............................................................................................................. 6 4.1 Recta de calibrao de DNS para o acar invertido ............................................................................ 6 4.2 Estudo da variao da actividade da enzima com a concentrao do substrato ................................... 7

5.

Apresentao e tratamento de resultados ......................................................................................... 8 5.1. Recta de calibrao do DNS para o acar invertido ........................................................................... 8 5.2. Traar o grfico da actividade da enzima (mol de acar invertido formado por minuto, por ml de extracto de enzima, i.e., velocidade da reaco), em funo da concentrao de substrato (mol.dm-3) e calcular KM e vmax (Curva de Michaelis-Menten). ...................................................................................... 10 5.3. Traar o grfico de Lineweaver-Burk e determinar os valores de KM e Vmax. ................................. 15

6. 7. 8.

Discusso /Concluso ...................................................................................................................... 17 Bibliografia...................................................................................................................................... 19 Anexos ............................................................................................................................................. 21 8.1. Anexo 1- Segurana e riscos ................................................................................................................ 21 8.2. Anexo 2- Deduo da equao de Lineweaver-Burk ........................................................................... 22 8.3. Anexo 3- Preparao de solues ....................................................................................................... 23

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[ESTUDO DA CINTICA DA ENZIMA INVERTASE] 1. Objectivo

Bioqumica I

O objectivo da actividade experimental estudar a cintica enzimtica invertase num substrato de sacarose, ou seja, determinar o valor da velocidade mxima e a respectiva afinidade enzimtica para o substrato. 2. Introduo Com o desenvolvimento da bioqumica fortaleceu-se a ideia de que dentro dos seres vivos, existiam substncias capazes de catalisar de modo muito especfico determinadas reaces qumicas.3 Uma enzima um catalisador biolgico, que mesmo em baixas concentraes aumenta a velocidade da reaco.4 As enzimas diminurem a energia de activao, mas no afectam o equilbrio da reaco.4 A invertase (-fructofuranosidade) uma enzima que catalisa a hidrlise da sacarose em acar convertido, isto , nos seus dois monmeros constituintes: glicose e frutose (figura 1). 2,5 O seu substrato preferencial a sacarose porm, tambm, pode hidrolisar ramonose e estaquiose.7

Figura 1 - Hidrolise da sacarose catalisada pela invertase. A glicose e a frutose so acares redutores.

A invertase encontra-se presente nos animais, mas tambm em plantas superiores, fungos e bactrias.5 possvel obter o extracto no purificado da enzima, destruindo as clulas de fermento por autlise e removendo os detritos celulares por centrifugao, aps a qual a invertase ficar no lquido sobrenadante.5 Existem actualmente vrias aplicaes desta enzima, principalmente na indstria alimentar, onde a enzima usada tem origem na levedura.2 A cintica enzimtica estuda a aco das enzimas, a sua actividade cataltica e seu estudo feito in vitro.3 Para esses estudos podem ser usados, como fonte de enzima, preparaes que a contenham em estado mais ou menos purificado, no entanto, quanto mais purificada estiver a preparao enzimtica mais fcil ser o seu estudo cintico.3 O mecanismo mais simples para explicar a aco enzimtica o modelo de MichaelisMenten:

Neste modelo a enzima (E) liga-se ao substrato (S) para formar um complexo enzimasubstrato (E-S). A quantidade de produto (P) formada, assim como a velocidade da reaco

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Bioqumica I

vo depender directamente da concentrao em complexo E-S, isto , da concentrao de enzima que se liga ao substrato.4,8 O modelo de Michaelis-Menten parte da hiptese que o passo limitante da velocidade a quebra do complexo E-S para formar o produto e a enzima livre.9 (1) A equao de Michaelis-Menten (equao 1) permite, aps a determinao experimental das variaes de V em funo da concentrao de substrato ([S]), obter o valor de velocidade inicial mxima (Vmx), e calcular a constante de Michaelis (Km).4,8 De forma geral, os valores de Km, esto compreendidos entre 10-2M e 10-8.4,8 A representao grfica da velocidade da reaco em funo da concentrao de substrato (grfico 1) uma hiprbole. A assmptota horizontal corresponde Vmx. O valor de Km tambm pode ser obtido atravs do grfico, uma vez que quando a [S]= Km , a equao de Michaelis-Menten prev que velocidade de reaco metade de Vmx.4,8 Km uma medida de afinidade da enzima para o substrato e essa afinidade igual a 1/ Km.4,8 Para um Km elevado, Grfico 1. Variao da velocidade de existe uma baixa afinidade ( necessria uma elevada [S] reaco em funo da concentrao de para se atingir a V igual na 1/2Vmx, para um Km baixo substrato existe uma elevada afinidade.4,8 O grfico de velocidade vs [S] mostrado anteriormente no linear, pelo que se torna difcil estimar os valores de Km e Vmx , sendo assim necessrio desenvolver mtodos de linearizao da equao de Michaelis-Menten. . Podemos transformar a equao de Michaelis-Menten, invertendo-a: (2) O grfico de Lineweaver-Burk (grfico 2) a forma mais comum, e simples, de mostrar os dados cinticos, apesar de no ser o mais fivel. Como se pode observar pelo grfico 2, no se podem tomar valores negativos para 1/[S], sendo o mnimo valor possvel 1/[S] = 0, que corresponderia a uma concentrao infinita de substrato, e da 1/v = 1/Vmax. O valor do ponto de interseco entre a recta e o eixo x uma extrapolao de dados experimentais. Assim sendo, os grficos de Lineweaver-Burke distorcem as medidas realizadas a baixas concentraes de substrato e isto pode dar lugar a estimativas no muito exactas de Vmax e de Km.10
Grfico 2. Grfico de Lineweaver-Burk.

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[ESTUDO DA CINTICA DA ENZIMA INVERTASE] 3. Material e Reagentes 3.1. Reagentes

Tabela 1- Caractersticas gerais dos reagentes utilizados Reagentes Soluo aquosa de invertase diluda 1:400 Frmula Qumica Massa Molar (g/mol) Grau de Pureza (%)

Bioqumica I

Densidade (g/cm3)

Riscos e Segurana1

Hidrogenocarbonato de sdio

NaHCO3

84,01

99,5

2,159

Hidrxido de Sdio

NaOH

39,997

98,6

2,13

Corrosivo R: 35 S: 2-26-37/39

cido 3,5dinitrosaliclic o (DNS)

cido 3,5dinitrosaliclico (DNS) Tartarato de sdio e potssio tetrahidratado

C7H4N2O 7

228,12

99

Nocivo R: 22 S: 22-24/25 -

C4H4KNa O6.4H2O

282,23

99-102

Irritante Acetato de sdio Tampo acetato CH3COO Na 82,03 99 1,52 Corrosivo R: 36/37/38 S: 16-29/56

cido Clordrico (37%)

HCl

36,46

37

1,19

Corrosivo R: 34-37 S: 26-45 -

Soluo de sacarose Soluo equimolar de glucose/frutose gua Destilada

Sacarose Frutose Glucose -

C12H22O 11 C6H12O6 C6H12O6. H20

342, 30 180,16 180,16 18,02

99,5 -

1,587 1,54

Anexo 1

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[ESTUDO DA CINTICA DA ENZIMA INVERTASE] 3.2. Material Tubos de ensaio Suporte para tubos de ensaio Micropipetas Pipetas graduadas Pipetador Vrtex Banho com gua 100C Banho com gua fria Espectrofotmetro Cronmetro Placa de aquecimento Pompete

Bioqumica I

4. Procedimento Experimental 4.1 Recta de calibrao de DNS para o acar invertido Para a construo da recta de calibrao preparar 5 tubos de ensaio de acordo com a tabela 1.
Tabela 2- Preparao de solues Vsol (mL) Gluc/frut 0,0025M H2O dest. Tampo acetato Sacarose 0,25M DNS Tubo1 (branco) 0,00 2,00 1,00 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 1,00

0,10 1,90 1,00

0,40 1,60 1,00

0,70 1,30 1,00

1,00 1,00

Perfazer com gua destilada o volume total de 2 ml

1,00 2,00

1,00 2,00

1,00 2,00

1,00 2,00

1,00 2,00

Agitar no vrtex.

Aquecer os tubos num banho com gua a 100C durante 5 minutos exactos.

Arrefecer num banho com gua fria.

Adicionar 4mL de gua destilada a cada tubo e agitar no vrtex.

Vsol (mL) Tubo1 (branco) H2O dest.
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Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

Tubo 5

4,00

4,00

4,00

4,00

4,00

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Ler absorvncia a 540 nm (Calibrar com tubo 1). 4.2 Estudo da variao da actividade da enzima com a concentrao do substrato Para o estudo da actividade enzimtica preparar 7 tubos de ensaio de acordo com a tabela 2.
Tabela 3- Preparao de solues Vsol (mL) Sacarose 0,25M H2O dest. Tampo acetato Tubo 1 0,00 2,00 1,00 Tubo 2 0,05 1,95 1,00 Tubo 3 0,10 1,90 1,00 Tubo 4 0,20 1,80 1,00 Tubo 5 0,40 1,60 1,00 Tubo 6 0,80 1,20 1,00 Tubo 7 1,60

0,40 1,00

Perfazer com gua destilada o volume total de 2 ml

Incubar a 25C durante 5 minutos.

Em intervalos de 60s adicionar.

Vsol (mL) Enzima 1:400

Tubo 1 1,00

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

Tubo 5

Tubo 6

Tubo 7

1,00

1,00

1,00

1,00

1,00

1,00

Agitar no vrtex.

Incubar a 25C durante 10 minutos exactos.

Em intervalos de 60s adicionar.

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Vsol (mL) DNS Tubo 1 2,00 Tubo 2 2,00 Tubo 3 2,00 Tubo 4 2,00 Tubo 5 2,00 Tubo 6 2,00

Bioqumica I

Tubo 7 2,00

Agitar no vrtex.

Aquecer em banho com gua a 100C durante 5 minutos exactos.

Arrefecer em banho de gua fria.

Adicionar 4mL de gua destilada e agitar no vrtex.

Vsol (mL) H2O dest.

Tubo1 (branco) 4,00

Tubo 2 4,00

Tubo 3 4,00

Tubo 4 4,00

Tubo 5 4,00

Ler absorvncia a 540 nm (usar tubo 1 como branco).

5. Apresentao e tratamento de resultados 5.1. Recta de calibrao do DNS para o acar invertido [soluo equimolar de glicose/frutose] (M) [soluo]conc. = 0,0025M Vfinal = 10mL Tubo 2 Vinicial 2 = 0,10mL [soluo]tubo 2 = ?

] 8

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[ESTUDO DA CINTICA DA ENZIMA INVERTASE] [ [ ] ] Tubo 3 Vinicial 3 = 0,40mL [soluo]tubo 3 = ? [ ]

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[ [ [

] ] ] Tubo 4

Vinicial 4 = 0,70mL [soluo]tubo 4 = ?

[ [ [

] ] ] Tubo 5

Vinicial 5 = 1,0mL [soluo]tubo5 = ?

[ [ [

] ] ]

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Tabela 4 Registo de resultados com os dados necessrios construo da recta de calibrao do DNS para o acar invertido

Tubo
1 - Branco 2 3 4 5

Vsoluo equimolar de glicose/frutose

0 0,1 0,4 0,7 1

[soluo equimolar de glicose/frutose]

0 0,000025 0,0001 0,000175 0,00025

Absorvncia
0 0,005 0,134 0,293 0,433

Recta de calibrao do DNS para o aucar invertido

0.500 Absorvncia (nm) 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000 0.0000 0.0001 y = 1801.2x - 0.0251 R = 0.9904 0.0002 0.0003

concentrao equimolar de glicose /frutose (M)

Grfico 3 Recta de calibrao do DNS para o acar invertido

5.2. Traar o grfico da actividade da enzima (mol de acar invertido formado por minuto, por ml de extracto de enzima, i.e., velocidade da reaco), em funo da concentrao de substrato (mol.dm-3) e calcular KM e vmax (Curva de Michaelis-Menten). 5.2.1. Clculos necessrios construo da curva Michaelis-Menten Clculo da concentrao de acar invertido aps os 10 minutos de incubao com a enzima Pela lei Lambert-Beer, a absorvncia em funo da concentrao deve ser uma linha recta, logo existe uma relao entre a lei e a equao da recta. y=m.x+b

A= .l.c
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Este clculo feito com base na recta de calibrao do grfico 3 e com as absorvncias medidas experimentalmente substituindo-as na equao obtida:

Tubo 2
[ ]

Tubo 3
[ ]

Tubo 4 [ ] Tubo 5
[ ]

Tubo 6
[ ]

Tubo 7
[ ]

Clculo do nmero de moles de acar invertido presentes em soluo aps os 10 minutos de encubao com a enzima. Tubo 2

Tubo 3

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[ESTUDO DA CINTICA DA ENZIMA INVERTASE] Tubo 4

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Tubo 5

Tubo 6

Tubo 7

Clculo da actividade enzimtica durante o tempo de encubao (10 minutos)

A enzima encontrava-se diluda 1:400, pelo que para a realizao do clculo da actividade enzimtica tem de entrar em linha de conta esse factor de diluio. Assim:

Tubo 2

Tubo 3

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[ESTUDO DA CINTICA DA ENZIMA INVERTASE] Tubo 4

Bioqumica I

Tubo 5

Tubo 6

Tubo 7

Tabela 5 Dados utilizados para construo da curva de Michaelis-Menten Tubo Branco 2 3 4 5 6 7 V Sac (mL) 0,00 0,05 0,10 0,20 0,40 0,80 1,60 [Sac] (M) 0,000 1,25E-03 2,50E-03 5,00E-03 1,00E-02 2,00E-02 4,00E-02 Absorvncia 0,000 0,003 0,022 0,213 0,381 0,528 0,616 [Acar Invertido] 0,000 1,560E-05 2,615E-05 1,322E-04 2,255E-04 3,071E-04 3,559E-04 n acar invertido 0,000 1,560E-07 2,615E-07 1,322E-06 2,255E-06 3,071E-06 3,559E-06 Activ. Enz (mol.min-1mL-1) 0,000 6,240 10,460 52,876 90,184 122,829 142,372

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[ESTUDO DA CINTICA DA ENZIMA INVERTASE] 5.2.2. Construo do grfico da curva de Michaelis-Menten Activ. Enz (mol.min-1mL-1)
Velocidade da reao (mol.min-1mL-1) 160.0 140.0 120.0 100.0 80.0 60.0 40.0 20.0 0.0 0.000 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050

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Concentrao de sacarose (M) Grfico 4 Curva de Michaelis-Menten

5.2.3. Determinao dos valores de KM e Vmax (pela representao Michaelis-Menten) A equao de Michaelis-Menten permite uma visualizao rpida e directa, mas no muito precisa dos valores de Vmx e de Km, uma vez que esta depende do observador. A velocidade atingir o ponto mximo quando a enzima estiver saturada, ou seja, quando todos os locais de ligao do centro activo estiverem ocupados com os ligandos e quando a concentrao de substrato no influenciar a velocidade. Como a curva relativa ao grfico de Michaelis-Menten tende para o infinito, no existe um valor preciso para Vmx mas sim uma estimativa deste. Neste caso, o valor foi de aproximadamente 145 mol.min-1mL-1 O Km corresponde ao valor da concentrao de substrato (eixo xx) lido a partir de V0 (eixo dos yy) que equivale metade de Vmx. Assim:

Observando o grfico, extrapolou-se que o Km ser de aproximadamente 0,0075 M

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5.3. Traar o grfico de Lineweaver-Burk e determinar os valores de KM e Vmax. Clculos necessrios construo do grfico de Lineweaver-Burk A deduo da equao de Lineweaver-Burk a partir da equao de Michaelis-Menten dada por:

Y = m

x + b

Assim, esta a equao de uma recta onde 1/v representa a ordenada, 1/[S] a abcissa, o declive dado por KM/vmax e a ordenada na origem 1/ vmax.

Tabela 6 - Dados usados para a construo da recta de Lineweaver-Burk 1/[sacarose] 1/V 800 1,602E-01 400 9,561E-02 200 1,891E-02 100 1,109E-02 50 8,141E-03 25 7,024E-03

Recta de Lineweaver- Burk

0.180 0.160 1/V (mol-1min.mL) 0.140 0.120 0.100 0.080 0.060 0.040 0.020 0.000 0 200 400 600 800 1000 y = 0.0002x - 0.0053 R = 0.9662

1/[sacarose] (M-1) Grfico 5 - Representao grfica da equao Lineweaver-Burk

Visto que o valor de b obtido negativo, no possvel calcular o valor de Vmx e consequentemente o valor de Km, uma vez que o valor da velocidade calculado daria negativo, o que impossvel.

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Tabela 7 - Dados usados para a construo da recta de Lineweaver-Burk desprezando 2 pontos 1/[sacarose] 1/V 800 1,602E-01 400 9,561E-02 50 8,141E-03 25 7,024E-03

Recta de Lineweaver-Burk
0.180 0.160 0.140 0.120 0.100 0.080 0.060 0.040 0.020 0.000 0 200 1/V (mol-1min.mL) y = 0.0002x + 0.003 R = 0.989

400

600

800

1000

1/[sacarose] (M-1)

Grfico 6 - Representao grfica da equao Leneweaver-Burk desprezando 2 pontos

De forma a obter um valor de velocidade mxima aceitvel, foi desprezado o ponto 3 e 4, obtendo a recta:

Tabela 8 Resultados obtidos pela curva de Michaelis-Menten e Lineweaver-Burk

Vmx KM

Michaelis-Menten 145 0,0075

Lineweaver-Burk 333,33 0,0667

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6. Discusso /Concluso Com o intuito de realizar esta experincia laboratorial e para efectuar o clculo dos parmetros cinticos relativos enzima invertase, onde se relaciona a velocidade reaccional com a concentrao do substrato presente, procedeu-se realizao de uma recta de calibrao. Esta recta relaciona a concentrao de glucose/frutose com as absorvncias lidas para cada uma das concentraes padro. Na segunda parte do trabalho e com recurso a esta recta, foi possvel calcular efectivamente a concentrao do produto da reaco (concentrao de glucose/frutose derivado da degradao da sacarose pela invertase) e efectuar de novo a leitura das absorvncias para as amostras com diferentes concentraes de substrato. Dependendo da concentrao de substrato presente na amostra, a concentrao dos produtos foi variando no decurso da reaco enzimtica, o que nos permitiu estudar a actividade da enzima invertase para com o substrato, ou seja, a sua afinidade para com este. O estudo desta mesma actividade enzimtica foi feito com recurso a duas representaes grficas: a curva de Michaelis-Menten e a recta de Lineweaver-Burk. O grfico 4 mostra a variao da [Sacarose] quando a [Invertase] constante. Como se pode observar, para concentraes relativamente baixas de sacarose, V0 aumenta quase linearmente com o aumento da [Sacarose], fruto da grande quantidade de enzima livre que se pode ligar ao substrato. Para concentraes elevadas deste mesmo substrato, V0 aumenta cada vez menos em resposta ao aumento da concentrao de sacarose, atingindo um patamar que representa o valor de Vmx. Esta tendncia para o infinito representa o momento em que os centros activos da invertase se encontram todos ligados sacarose (saturao da enzima), em que a velocidade reaccional no aumenta mais independentemente dos aumentos da concentrao da sacarose. Este grfico permitiu ento uma determinao emprica das constantes cinticas enzimtica: Km e Vmx. No nosso caso, os valores foram
1

0,0075 M e 145 mol.min-

.mL-1, respectivamente. Contudo, estes parmetros no so muito precisos dado que

Vmx no um valor preciso mas sim assimpttico (tende para o infinito) e por consequncia, Km tambm no rigoroso porque depende de Vmx. De forma a colmatar as falhas relativas a esta observao emprica, recorreu-se a uma das formas linearizadas da equao de Michaelis-Menten Equao de Lineweaver-

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Burk (inverso de Michaelis-Menten). Esta equao permite uma leitura mais correcta dos parmetros cinticos Km e Vmx (clculos matemticos). No obstante, no nosso trabalho prtico, os valores acima referidos no puderam ser calculados uma vez que a equao que representa a recta de Lineweaver-Burk tinha o parmetro b negativo (-0,0053) (grfico 5). Se assim fosse, Vmx daria negativo (Vmx =1/b) bem como Km (Km = m xVmx). Uma possvel explicao para este facto ocorrido de que este mtodo provoca uma distoro do erro experimental para baixos valores de V0, um pequeno erro em V0 corresponde a um enorme erro em 1/V0; pelo contrrio, para valores elevados de V0, o mesmo pequeno erro em V0 corresponder a erros desprezveis em 1/V0. Se pelo contrrio desprezssemos dois pontos da recta de Lineweaver-Burk (nomeadamente o 3 e 4 pontos), obteramos um b positivo (0,003) (grfico 6), o que nos permitiria obter valores de Vmx 333,33 mol.min-1.mL-1 e Km = 0,0667 M. Este a M). No entanto,

valor calculado esta dentro do limite terico previsto (

como no existem valores de referncia para actividade enzimtica da invertase no se pode inferir quanto aos erros analticos cometidos, nem exactido dos resultados experimentais. Tendo em conta o valor obtido para Km ( , tem-se uma m

actividade enzimtica visto que este se aproxima do limite superior terico previsto ( ). Todavia, este resultado no pode ser considerado estatisticamente significativo, uma vez que foram desprezados 2 pontos e o r2 inferior a 0,999 (correlao fivel). Outro motivo para os resultados no serem considerados fiveis que segundo o descrito na literatura, a enzima invertase no tem uma actividade significativa (24%), mesmo na capacidade mxima de actuao (actividade ptima). De referir ainda que apesar da baixa actividade, o pH ptimo (4,5) foi proporcionado pelo tampo acetato de sdio. Outra ilao que podemos retirar da realizao deste trabalho prtico foi que a sacarose no foi precisa para a preparao da recta de calibrao (grfico 3), uma vez que s os acares glucose e frutose tm a capacidade de reduzir o DNS devido presena de carbonos anomricos (carbonos capazes de participar na formao de ligaes glicosdicas). Pelo contrrio, como a sacarose j apresenta uma ligao glicosdica, no apresenta o carbono livre necessrio reduo do DNS. No entanto, utilizou-se a
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sacarose nesta primeira parte da experincia para que na medio das absorvncias houvesse os mesmos constituintes em ambas as partes do trabalho, pois na segunda parte a enzima invertase no capaz de degradar a sacarose na sua totalidade. De referir ainda que os valores no foram de encontro ao esperado, possivelmente por terem ocorrido erros sistemticos e experimentais, tais como: m preparao das solues-padro, desfasamento temporal entre a primeira parte e a segunda da experincia, ms leituras no espectrofotmetro devido a clulas danificadas e mau funcionamento do aparelho. Em suma, podemos ento afirmar que os parmetros cinticos podem ser calculados tanto pela curva de Michaelis-Menten como pela recta de Lineweaver-Burk. Pela curva de Michaelis-Menten o calculo de Km no rigoroso, pois depende da determinao do Vmx que calculada por aproximao, sendo que tambm exige um numero elevado de determinaes. Contudo, o segundo mtodo mais expedito, rigoroso e rpido e so necessrias menos leituras experimentais, pois o traado da recta exige um menor nmero de pontos da curva. Para alm disto, a recta de Lineweaver-Burk no implica aproximaes, mas sim clculos matemticos. 7. Bibliografia 1. Ado, M. H. et al. (1997). Bioqumica. LIDEL- Edies Tcnicas. ISBN: 972757-042-9; 2. http://legion.geleia.net/Guia_Laboratorios.pdf; 3. http://users.med.up.pt/ruifonte/PDFs/PDFs_arquivados_anos_anteriores/20062007/enzimas_e_cinetica_enzimica.pdf; 4. Nelson, D.L., Cox, M.M. (2001). Lehninger, Principles of Biochemistry, 3a edio, Worth Publishers,; 5. Protocolo da actividade prtica fornecido pelos docentes da cadeira; 6. Fiedurek, J.; Pielecki, J.; Skowronek, M. (2000). Direct methods for selecting mutants with increased production of invertase from mutagenised cultures of Aspergillus fumigatus. Journal of Basic Microbiology, v. 40, p. 111-118; 7. http://www2.ufp.pt/~pedros/bq/Enzimas.htm; 8. Campos L. (1999). Entender a BioqumicaEscolar Ed, 2 edio,. Captulo 2, Cintica das Reaces Bioqumicas;
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9. http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/apostilas/Apostila_cinetica_e nzimatica_ju.pdf; 10. Tseng SJ, Hsu JP. (1990). A comparison of the parameter estimating procedures for the MichaelisMenten model. J Theor Biol. Aug 23;145(4):45764. PMID 2246896; 11. http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S010466322000000400051&script=sci_artt ext

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[ESTUDO DA CINTICA DA ENZIMA INVERTASE] 8. Anexos 8.1. Anexo 1- Segurana e riscos NaOH: R 35: Provoca queimaduras graves. S 2: Manter fora do alcance das crianas.

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S 26: Em caso de contacto com os olhos lavar imediata e abundantemente em gua e chamar um especialista. S 37/39: Usar luvas adequadas e proteco para os olhos/cara cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS): R 22: Nocivo por ingesto. S 22: No respirar o p S24/25: Evitar o contacto com os olhos e com a pele cido Cloridrico:
R34: Provoca queimaduras R37: Irritante para as vias respiratrias. S26: Em caso de contacto com os olhos lavar imediata e abundantemente em gua e

chamar um especialista
S45: Em caso de acidente ou indisposio consultar imediatamente um mdico (se

possvel mostrar-lhe o rtulo do produto) Acetato de sdio: R 36/37/38: Irritante para os olhos, vias respiratrias e pele. S 16: Conservar longe de fontes de ignio - No fumar. S 29: No deitar os resduos no esgoto S56: No despejar na rede de esgotos nem no meio aqutico. Utilizar para o efeito um local apropriado para o tratamento dos resduos

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8.2. Anexo 2- Deduo da equao de Lineweaver-Burk Deduo da equao de Lineweaver-Burk por linearizao da equao de MichaelisMenten.
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[ESTUDO DA CINTICA DA ENZIMA INVERTASE] 8.3. Anexo 3- Preparao de solues Extracto no purificado de enzima

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Homogeneizar muito bem 50 g de fermento de padeiro em 100 ml de soluo NaHCO3 0,1 M, durante 1 ou 2 minutos. Transferir a mistura para um erlenmeyer de 250 ml, vedar com um pouco de algodo e incubar num banho termostatizado a 40C, durante 24 h. Aps a autlise da clulas de fermento, centrifugar a mistura durante 15 min. Transferir o lquido sobrenadante, lmpido, para uma proveta e registar o volume, guardando este extracto de enzima no frigorfico. Reagente de DNS Dissolver 1 g de cido 3,5-dinitrosaliclico em 200 ml de NaOH 2 N, aquecendo e agitando vigorosamente (soluo A). Dissolver 300 g de tartarato de sdio e potssio em 500 ml de gua destilada (soluo B). Misturar 30 ml da soluo A com 75 ml da soluo B e perfazer o volume para 150 ml com gua destilada. Tampo acetato 20 mM, pH 4.5 Pesar a quantidade de acetato de sdio necessria para preparar 500 ml de soluo 20 mM, colocar num copo de 500 ml, adicionar cerca de 400 ml de gua e homogeneizar. Verificar o pH da soluo resultante com o medidor de pH. Se necessrio, acertar o pH no valor pretendido (4.5), adicionando pouco a pouco, com um conta gotas, cido clordrico concentrado, agitando continuamente a soluo atravs de um agitador magntico. Transferir a soluo para um balo de 500 ml e aferir com gua destilada. Homogeneizar.

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