Rev Med Uruguay

1996; 12: 215-223

Examencoproparasitario.Metodologay empleo. Revisintcnico metodolgica

Dr. Roberto Salvatella ', Tec. Carlos Eirale 2

El examertcoproparasitario es un conjunto de tcnicas diagnsticas que constituyen la irtdicaciafl metodol&ica para la identificacin de la mayora de las enteroparasitosis motivadaspor protozoarios o helmintos. Su eficacia y sensibilidad para establecer un diagiu5sticocorrecto dependende la adecuada indicacin y preparacin de la muestra, los datos cltiiros y antecedentes inters que sean aportados al laboratorio y de su correcta y de completa ejecucin coti ezmen directo microscpico, enriquecimiento y examen macroscpicoJna1. Otras tcnica.9 complementarias(coloraciones, enriquecimientos especiales,etctera},contribuyen a completar el esquemadel examen,en circunstancias especficas(agentesoportunistas, emergentes,exticos 0 endmicos).La presente comunicacinpresenta la metodologa y desarrollos en la prctica diaria del Laboratorio de Parasitologa de la Reparticin Microbiologa del Departamento de Lnboratorio Clnico de la Factdtad de Medicina. &&ibt~ &v@: &fermedades parasitarias-diagnstico Helmintos-microbiologa Ho6mintiasis-diagnstico Protozoari&microbiologa Infeccionespor protozoarios-diagnstico Anlisis microbiolgico

Actualmentelas enteroparasitosis representan el munen do un importante problema de salud pblica (l). La OrganizacinMundial de la Salud (OMS) @)estima que la ascaridiasisproducecuadrosclnicos en 214 millones de personasa nivel mundial la tricocefalosis en 133 y las uncinariasen 96 millones. En el casode los protozoarios enteroparsitos,sirven como ejemplo: la giardiasis con

1I Profesor Adjunto 2. Tecndlogo Laboratotista Laboratorio de Pmsitologia. Reparticin Microbiologa. Departamento de L&oratorio Clnico. Hospital de Clnicas. Facultad de Medicina. Universidad de la Repblica. Correspondencia: Dr. Roberto Salvatella. Hospital de Clnicas. Departamento de Laboratorio Clnico. Reparticin Microbiologa. Laboratorio de Parasitologa. Av. Italia s/n. Montevideo, Uruguay. Recibido 16/5/96 Aceptado 224 1/96

una incidencia de 500.000 nuevos casos anuales, as como la infeccin por Entamoeba histolytica que afecta aproximadamentea 50 millones de individuos. Aunque la mortalidad producida por enteroparasitosis es baja, los nmeros totales a nivel mundial, alcanzanaltas cifras como 90.000 decesos para anquilostomiasis, 60.000 por ascaridiasisy 70.000 por amibiasis. Fuera de estoslamentablesefectos, este grupo de afecciones motiva infecciones crnicas con efectos negativos e insidiosos en el crecimiento, nutricin y desarrollo psicofuncional de los nios,con especial repercusin en nias y mujeres. En Uruguay, es un grupo de afeccionescuya verdadera entidad se desconoci durante mucho tiempo, hasta que actuales investigaciones detectaron los verdaderos grupos de riesgo en los que las enteroparasitosis alcanzan prevalenciasy morbilidad de consideracin (3). Aunque se dispone para el diagnstico de algunos
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agentes, de mtodos inmunolgicos (4), la metodologa parasitolgica directa, organizadabajo el nombre de examen coproparasitario, constituye el procedimiento de eleccin para el diagnstico de la mayora de estasdolencias t5). El examen coproparasitarioposeelejanos antecedentes que van desde el reconocimiento de helmintos enteroparsitos en tiempos de Hipcrates (@, hastala visualizacin de Ciar& Iamblia (Stiles, 1915)por Leewenhoeckal observar materias fecales con el primer microscopio de SU invencin, en la Holanda de 1683 (7). El desarrollo de tcnicasconcretases relativamentereciente, con los trabajos de Brumpt y Langeron @lo), disponindose en la actualidad de variadas tcnicas que se complementan en diversos esquemas, implementados por diferentes grupos de trabajo. Esta comunicacin pretende mostrar los esquemasy mtodos de trabajo adoptadospor el Laboratorio de Parasitologa del Departamento de Laboratorio Clnico del Hospital de Clnicas y profundizar en las tcnicas,requerimientos e indicaciones de estos estudios. Se seguir un orden de exposicin lgico y acordea como avanzala decisin y ejecucin diagnstica.
Indicaciones y solicitud

oarsitos o dificultades nara extender frotis de coloraEl cronograma de obtencin del material debe considerar: a) que muestrasnicas solo permiten diagnsticos positivos en 60% de las materias con parsitos (i3); b) que los parsitos(protozoarios y helmintos) tienen ciclos de eliminacin de huevos y quistes con perodos negativos para la presenciade los mismos en las materiasfecales y c) que existen diversos esquemas sobrela secuencia de las muestras recolectables. Los esquemasde recoleccin ms empleadosindican tres muestrasen das alternos, colectadassegn lo anteriormente expresado. Una condicin fundamental paraobtenerlos mscompletos y rigurosos resultados es acompaarel material con datos clnicos y antecedentes (personales, familiares y ambientales)del paciente,as como la sospecha lleque va a la bsqueda del diagnstico coproparasitolgico. Datos como inmunodepresinde diverso tipo, procedencia del extranjero, condiciones ambientalesdel examinado o antecedentes familiares de parasitosis,puedenorientar o adaptar la secuenciade estudios y tcnicas que se ejecutarn.
Algoritmo de procesamiento y metodologas

La indicacin del examen coproparasitario,por parte del mdico, debe atenderal parsitoque se sospecha, tomndose en cuenta que esta metodologa es realmente til para aquellos protozoarios, cuyos trofozotos, quistes u ooquistes, o helmintos, cuyos huevos o anillos se emiten mezclados con las materias fecales. Esta consideracin excluye a Etzterobius vemicularis (oxiuro), dada su caracterstica biolgica de oviposicin en la margen anal, por lo que su diagnstico se efecta mediante el mtodo de esptula adhesiva. Debe tenerseen cuenta, para efectuar con xito el examen coproparasitario, la adecuada obtencin de tres muestras mnimas de materia fecal, debidamenteobtenidas mediante: preparacindel paciente,correcta preparacin del material y cronograma de obtencin (). La preparacin del paciente pasa por lograr mediante un rgimen alimenticio previo (48 horas antes), con la menor cantidad posible de frutas, verduras y grasas,observaciones microscpicas libres de residuos, que obstaculicen el estudio. Una muestra correcta de materia fecal para el examen coproparasitario debe ser suficiente (ms de 50 g), reciente (conservar en heladerahasta8 horas y aplicar conservadores en plazos mayores), correctamente rotulada (nombre del paciente y fecha de emisin), en frasco de vidrio transparente, limpio, seco y de boca ancha con tapa-rosca y sin mezcla de orina (para evitar deterioro de
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El desarrollo bsicodel examencoproparasitariodebeincluir ineludiblemente tres tiempos: a) examendirecto en fresco, b) tcnica de enriquecimiento y c) examen macroscpico. La presencia de nuevas enteroparasitosisemergentes (criptoporidiosis, ciclosporidiasis, etctera)o la pesquisa de parsitos exticos para nuestro medio, con requerimientos diagnsticos especiales(anquilostmidos,etctera) llevan actualmentea la adopcin de tcnicas complementarias en 10 referente a coloraciones y enriquecimientos. En la figura 1 se detallan los pasosde procesamiento que adopta el Laboratorio de Parasitologadel Departamento de Laboratorio Clnico de la Facultad de Medicina. El material recibido, en correctascondicionesde envo y conservacin,pasaa ser procesadoen un primer tiempo de observacinmicroscpica directa, en fresco y con tincin por lugo1 parasitolgico. Para la obtencin de la muestra se procedea una observacinde la materia fecal recibida, tomndose mediante asa bacteriolgica muestras de elementospatolgicos (moco, pus o sangre)si se los observara, o de cualquier sector aleatoriamenteen casode no identificarse materialesanormales. La observacin se inicia con la suspensinde ese material en una gota de 0,05 ml de solucin salina isotnica, sobre portaobjeto, y simultneamenteotra muestra simiRevistaMdica del Uruguay

Examen coproparasitario. Metodologa y empleo

Coloraciones y tcnicas especiales Diarreas crnicas Figura 1. Algoritmo del examen coproparasitario en el Laboratorio de Parasitologa del Departamento de Laboratorio Clnico. Tcnicas de enriquecimiento: Ritchie o Faust. Coloraciones o tcnicas especiales: 1) Negro de Clorazol, Tionina, Tricrmica, Bailenger; 2) Kinyoun, Sheater, WES y Calcofluor, autoflourescencia y flourescencia directa por anticuerpos monoclonales.

lar seri mezcladaen 0,015 de lugo1parasitolgico.Este ml colorante; de gran afinidad por los azcares complejos, permite obtenercoloracionescontrastadas facilitan la que observacinde elementosintracelulares. Los aumentos empleablesen el microscopio, se iniciarn por el lente topogrfico (30 x), para seguir progresivamentehastacompletarla totalidadde objetivos en seco disponibles (generalmente200 x y 450 x). La bsqueda de huevos o larvas de helmintos requiereespecialcuidado; ya que su presenciapuedeconcentrarse sectoresde en la laminilla o de la muestrapreparada. Un resultado positivo, en el examendirecto, depende del azaro de la presenciade un gran nmero y concentracin de elementosparasitariosen el material observado. El enriquecimiento es el tiempo del examen coproparasitario que tiene por finalidad la concentracin de los elementosparasitarios,aumentandola sensibilidad de la observacincuandosu nmeroesescaso escapaa la dey teccin del examendirecto. Existen dos grupos de tcnicasde enriquecimiento:a) tcnicasde sedimentaciny b) tcnicasde flotacin. Algunas de las tcnicas ms conocidas y empleadas son, entre las de sedimentacin,Ritchie o Carles y Barthelemy; y entre las de flotacin, Willis o Faust (14,5). En la prctica diaria del Laboratorio de Parasitologa del Departamentode Laboratorio Clnico, las tcnicasde concentracin empleadasson el Ritchie, en sedimentacin, y el Faust, en flotacin (ver anexos 1 y 2). En relacin a tcnicas de sedimentacinderivadas de la tcnica bsicade Ritchie, se cuentacon diversasmodificacionescomo en caso del tiempo de lavado para la exVol. 12 No3 Diciembre 1996

traccin de grasas,utilizndose en lugar de ter sulfrico el .acetato de etilo o el empleo soluciones alcohlicas tamponadas,en los ltimos lavados del sedimento (;). Existen en la actualidad tcnicas de enriquecimiento con equiposcomercialesdescartables, poseenla venque taja de un procesamientoen circuito cerrado, hecho que brinda resaltable bioseguridad con gran exactitud diagnstica,pero estosmaterialesdescartablesposeenun costo no siempreposible de absorberpor las instituciones(le. La tabla 1 detalla las ventajasy utilidades de las tcnicasde Ritchie y Faust, que se utilizan en Uruguay desde largo tiempo atrs. El examenmacroscpico se fundamentaen el macerado de la materia remanentesobre un tamiz (malla tina de 0,5 mm) que se coloca debajo de un fuerte chorro de agua de canilla, hastaobservarsolo restosvegetaleso eventuales parsitos macroscpicos. El residuo retenido en la malla fina se depositarpara su examen en una bandeja esmaltadade fondo bicolor (campo negro y blanco). Este tiempo del examen coproparasitario es til en el control de tratamientode teniasis por T.saginato/soLium con antihelmnticos, a los efectosde certificar curacin por eliminacion del escolex, o para detectarotros parsitosde gran tamao (Ascaris lumbricoides, hidatides evacuadaspor va digestiva, etctera.) Los tres tiempos bsicos (directo, enriquecimiento y macroscpico) constituyen etapasineludibles del trabajo diagnstico,que implica un completo examencoproparasitario. La realizacin de estastres etapasjunto con la correcta preparacindel material a examinar y la recoleccion se217

Dr. Roberto Salvatella, Tec. Carlos Eirale

Tabla 1. Capacidades comparadas entre las tcnicas de enriquecimiento coproparasitolgico de Ritchie (sedimentacin) y Faust (flotacin)
Tcnicas
Ritchie

Concentracin
s

Conteo
No

Identificacin huevos
s

Identificackjn quistes
s

Identificacin trofozotos
s

Preparaciones
No

preparaciones

permanentes directas. * no permite recuperar huevos operculados

l

Figura

2. Ooquistes

de Gfyptosporidium sp., extendido de material de enriquecimiento,

teido con tcnica de Kinyoun.

riada de tres muestras son la garanta de mayor eficacia en el diagnstico a realizar.

Tcnicas

especiales

y coloraciones

La llegada de nuevos agentesde enteroparasitosisoportunistas emergentes (Cryptosporidium sp., microsporideos, etctera.), la localizacin de endemiasenteroparasitarias focalizadas o regionales (estrongiloidiasis, uncinariasis, etctera.), problemas diagnsticos (identificacin de agentes,alteracin de trofozotos, etctera.)o finalidades de docencia e investigacin obligan al empleo de tcnicas especialeso de diversascoloraciones,muchas de ellas de reciente generalizacino descripcin, que permiten abordar los problemas y situacionesreseados. En la observacin directa en fresco y del enriquecimiento, la primera, ms simple y generalizadacoloracin
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empleada es la utilizacin del lugo1 parasitolgico (ver anexo 1). La irrupcin de Cryptosporidium sp., como un entero parsito oportunista emergente,determinala adopcindl una tcnica de enriquecimiento por flotacin: el mtodc consis de Sheater (ver anexo 3) o flotacin en sacarosa, tente en una flotacin simple capazde obtener una ade cuada concentracin.para los ooquistes de este agente, con coloracin identifkatoria de estoselementos. Tanto el sedimentocomo el sobrenadante enriquedel cimiento de rutina, para identificacin de Cryptosporidium sp., debenpasarpor la coloracin identificatoria del Ziehl-Neelsen modificado (tcnica de semi cido resistencia) o de Kinyoun, que utiliza las cualidadestintoriales de semicidoresistenciade los ooquistes(17) ane(ver xo 4 y figura 2). El empleo de anticuerposmonoclonales marcadoscon fluorescena, disponibles comercialmente, constituye otra alternativa al diagnstico.
Revista Mdica del Uruguay

Examen coproparasitario. Metodologa y empleo

Figura 3. Esporas de microspondios,

extendldo de matenal de enriquecimiento.

teido con tcnica de Kinyoun.

Figura 4. Ooquiste de Cyclospora cayetanensis,

extendido de material de enriquecimiento,

teido con tcnica de Kinyoun.

La propiedad de semi cido resistenciatambin colabora al diagnstico de dos nuevosenteroparsitosemergentes:los microsporidios (figura 3) y Cyclospora cayetanensis(figura 4). LOS microsporidios (Enterocytozoonbieneusi, Septata

intestinalis, Encephalitozoon sp.) se caracterizan por el pequeo tamao de sus esporas (1x2 Pm), que poseen propiedadesde fluorescencia al utilizar la tcnica de Van Gool con el colorante Uvitex 2b 0 Calcofluor (MR), siendoestatcnica de tincin y observacin en microsco-

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pio de tluorescencia el principal elemento de SU reconocimiento. Van Gool y colaboradoreshan empleado,complementariamente, tcnicas de concentracin especiales para estos parsitos (WES o tcnica del Cytospin (MR)(ver anexo IO), que logran aumentarsensiblemente su deteccin (*). C. cuyetunerzsispuede reconocersepor su semi cido resistencia, unida a un tamao de ooquistes que alcanza entre las 7 y 9 pm de dimetrosdel ooquiste,con fluorescencia propia al ser observadosen microscopio de fluorescencia (19). La identificacin de quistes, ooquisteso trofozotos de protozoarios enteroparrjsitospuede necesitar,en circunstancias determinadas, de coloraciones especiales.La hematoxilina frrica de Heindenhain ha sido el mtodo tradicionalmente empleadoen nuestro medio, pero su laboriosidad, prolongado tiempo de procesamientoy manejo artesanal de alguna de sus fases (decoloracin), han hecho desaconsejablesu empleo en los actualesesquemas diagnsticos de rutina. Por ello. nuevas tcnicas de coloracin ms simples, rpidas y fcilmente reproductibles se han integrado al trabajo en coproparasitologa.Una de ellas, la tincin con Negro E de clorazol (ver anexo 5), que permite una rpida solucin a la identificacin de quistes, con correcta apreciacin de detalles morfolgicos tiles en la identificacin. A la observacin rutinaria de los sedimentoso sobrenadantes,segn el enriquecimiento seleccionado,se puede aadir como rutina de extrema utilidad para fines docentes, la observacin de una muestrade material con coloracin de tionina (ver anexo 6), entre porta y cubreobjeto. Esta simple metodologa permite destacardetalles de pared, ncleos y organelos, en casosde difcil observacin como Endolirnax nana, con ventajas sustantivas para actividades de docencia o entrenamiento, Similar rendimiento y posibilidades posee la coloracin de Ballenger (ver anexo 7), aplicable al producto final de un enriquecimiento, para su rpida observacin coloreada entre lmina y laminilla. Otra coloracin de utilidad en la observaciny obtencin de preparacionesduraderas,en extendido sobreportaobjeto, es la tcnica de coloracin tricrmica (ver anexo 8) que permite observacionesidentificatorias de alta calidad con conservacin del material observado. Para la identificacin de los helmintos enteroparsitos es el examen coproparasitario la tcnica de eleccin, por medio de la observacin microscpica de sus huevos o macroscpica de anillos en el casode Tnenk sp. o de he]mintos adultos como en el caso de Ascuris lumbricoides, siendo Ellterobius vermiculnris (oxiuro) la nica excep220

Materiafecal Gasa Malla Agua

Tubo de centrfuga -

Figura 5. Aparatode Baermann,para diagnstico de larvasde Sstercorak. cin, ya que su diagnstico particular sefundamentaen I tcnica de esptulaadhesivaen todassus variantesQ) Pero en casosespeciales,como los nematodes di: que persan larvas y no huevos (Strongyloides stercomlis uncinarias),el empleo de una tcnicaclsica complemen taria, como la de Baermman, complementa el procedi miento del examencoproparasitario(anexo 9).
Conclusiones

El examencoproparasitarioes la mayor herramientadiagnstica disponible en el casode las enteroparasitosis, su y composicin puedeser variada de acuerdoa las necesidades eventuales de un diagnstico, presenciade nuevas afecciones emergenteso peculiaridadesregionales. que impongan el diagnstico de una endemialocal (2). Su eficacia est directamenterelacionadaa la interaccin del clnico con el parasitlogo actuante. Factores como la calidad de la muestra,el aportede datos clnicos y antecedentes suficientes y la solicitud oportuna y adecuada del procedimiento, harn que el rendimiento diagnstico alcancesu mxima performance. No debemenospreciarse prevalenciae incidencia de la las enteroparasitosis,ya que en nuestromedio para algunos grupos sociales de riesgo! estasafeccionesconstituyen un claro motivo de morbilidad.
Summary

Coproparasitaryexamination constitutesa setof diagnosRevistaMdica del Uruguay

Examen coproparasitario. Metodologa y empleo

tic technique involving the methodologic indication aimed at the identifcation of most enteroparasitoses derived from portozoa or helminths. Its effectivenessof responsiveness the indication andpreparationof samples, to the clinical dataand meaningful backgroundprovided for laboratory requirements and its correct, ful1 execution with direct microscopic examination, with enhancement andfinal macroscopicexamination.Other supplementary techniques(staining, special enhancements, etc.) contribute to complete the schemeof the examination, under specific circumstances(opportunistic agents,emergents, exotics or endemics).The presentreport deals with methodology and development in the daily practice of the Parasitology Laboratory of the Microbiology Section of the Department of Clinical Laboratory of the Faculty of Medicine of Montevideo.
Rsum

Lexamen coproparasitairecomprend plusieurs techniques diagnostiquesqui permettentdidentifier la plupart des entroparasitosescausespar des protozoaires ou helminthes. Leurs efficacit et leur sensibilit pour tablir un correct diagnostic, dpendent:dune correcte indication et prparationde Ichantillon, des donnscliniques et des antcdentsdintrt qui soient disponibles au laboratoire, et dun correct et complet procd avec un examen microscopique direct et un examen macroscopique final. Dautre techniquescomplmentaires (telles que la coloration, lenrichissement spcial), contribuent complter le schmade lexamen, en des circonstancesspcifiques(agentsopportunistes,mergents,exotiques ou endmiques).Le travail ci-joint, exposela mthodologie et la mise en cours de la pratique quoridienne au Laboratoire de Parasitologiedu Dpartement de Microbiologie du Laboratoire Clinique (Facult de Mdecine).
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Dr. Robeffo Salvatella, Tec. Carlos Eirale

ANEXO NoI
Enriquecimiento por sedimentacin. Mtodo de Ritchie.

1) Homogeneizado y filtrado. Mezclar y homogeneizar en un vaso de Bohemia una muestra de materia fecal de 5 g con 25 ml de suero fisilogico salino. Pasar por embudo con triple filtro de gasa y algodn a un tubo de centrfuga de fondo cnico 8 ml de la suspensin, buscando retener los residuos ms voluminosos. 2) Centrifugado y lavado. La suspensin obtenida en la etapa anterior se centrifuga a 2300 revoluciones por minuto (rpm) durante un minuto. Se descarta el sobrenadante,y secando el borde del tubo con un hisopo, se vuelve a resuspenderel sedimento en suero fisiolgico por agitacin, volviendo a centrifugar a 2300 rpm durante un minuto la nueva suspensin. Esta operacin se repite hasta obtener sobrenadantes translcidos, generalmentetres veces. 3) Fijacin y eliminacin de grasas. Al sedimento final obtenido se le adiciona 2 ml de formol al IO%, homogeneizndose muestra por agitala cin y dejndosereposar por cinco minutos, con fines de fijacin. A la suspensinlograda se le agregan3 ml de ter, agitando vigorosamente el tubo tapado, para extraer grasas. 4) Centrifugado final. Se centrifuga el tubo a 1500 rpm durante un minuto. Descartamos el sobrenadante,limpiando la boca del tubo con hisopo de algodn. 5) Observacin. El sedimento obtenido estpronto para la observacin microscpica, tomndolo con pipeta Pasteur,para suspender en suero fisiolgico y lugo1 parasitolgico(*) sobre lmina portaobjeto, cubrindoseambasmuestras con cubreobjetos. La observacin microscpica se efectuarcon objetivos en seco a aumentos de 100 x, 200 x y 450 x, sucesivamente. (*) Lugo1 parasitolgico. Yodo metlico 2g
Yoduro de potasio 4 g agua destilada looml Se disuelve el yoduro de potasio en el agua destilada y se agrega el yodo metlico, conservndoseel colorante preparado en botella color caramelo y fuera de luz solar.

a) homogeneizadoy filtrado y b) centrifugado y lavado. 2) El ltimo sedimentose resuspende una solucin de en sulfato de zinc al 33% de densidad 1033 glml. 3) Esta suspensinse centrifuga a 1500 rpm por un minuto. 4) Del material obtenido se extrae una muestradel material suspendidoen el menisco superior de la interfase lquido/aire de donde se extrae medianteasa o pipeta Pasteur. ANEXO No3
Mtodo de Sheather o flotacin identificacin en sacarosa para sp. de ooquistes de Ctyptosporidium

1) Se toma un ml del sedimento obtenido por el mtodo de enriquecimiento de Ritchie que se resuspende 5 en ml de solucin de Sheather(*). 2) Dejar reposarel material con el tubo en posicin vertical durante 3 minutos. 3) Se toma la muestra de la superficie de la suspensin con pipeta Pasteur, colocndoseuna gota entre portaobjeto y cubreobjeto. 4) Observacinde campos con aumentode 40 x en seco. Los ooquistes se observan de color rosa con gran refringencia, membranabien definida y halo hialino.
(*) Solucin de Sheather saturada. Sacarosa 500 g Cristales de fenol 65 g Agua Destilada 3200 ml Calentar el agua destilada a ebullicin, retirar el mechero y agrega1 los restantescomponentes,agitando con una varilla hasta completa disolucin.

ANEXO No4 Tcnicade

resistencia Ziehl-Neelsen sp. modificada; de semi cido o de Kinyoun, para diagnstico

de

Cryptosporidium

ANEXO No2
Enriquecimiento por flotacin. Mtodo de Faust.

1) Se repiten como en el mtodo de Ritchie las etapasde: 222

1)Colocar y extender una gota del sedimento obtenido por enriquecimiento sobre un lmina portaobjeto, dejando secar a temperaturaambiente. 2) Fijar con metano1por 5 minutos. 3) Cubrir el preparadocon carbol-fucsina al 4% durante 15 minutos a temperaturaambiente. 4) Lavar con agua destilada suavemente. 5) Breve lavado con alcohol etllico 95%. 6) Lavar con agua destilada suavtmente. 7) Etapa de decoloracin selectiva con cido sulfrico al 10% durante un minuto. 8) Lavar con agua destilada suavemente. 9) Aplicar coloracin de contrastecon verde malaquita al 0,8% o azul de metileno al 0,3% 10) Lavar con agua destilada y dejar secar al aire. 1l)Observacin con lente inmersin de 1OO o aumentos x en seco mximos con frotis transparentado aceite con
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Examen coproparasitario. Metodologa y empleo

de inmersin. Los ooquistes,por su condicin de semi cido resistentesse ven de color rojo sobre fondo verdoso (cuando se utiliz verde malaquita) o fondo azul (contrastecon azul de metileno).
ANEXO No5

ColoranteE de negro de cloruzol. 1) Mezclar una gota pequeadel material obtenido de un enriquecimiento, con una gota del colorante preparado(*). 2) Dejar en cmara hmedapor 24 horas, con cubre, se agregarglicerina fenicaday lutar para su observacin con lentes en seco de 450 x. (*) Mezclar alcohol etlico170 alcohol metlico 160 ml, cido acml. ticoglacial ml,fenollquido mi,cido 20 20 fosfotngstico 12ml, 1% agua destilada mly Colorantedeclorazol5 (molido, madura 618 E g se unmes). Filtrar papel con Whatman nmero 12. Para obtener preparaciones permanentes poralcohol, pasar luego cw bol-xilol,siguiendo xilol y montaje Permount. por con
ANEXO No6

3)Colocndose posteriormente en etanol al 70% con iodo de DAntonioni durante 2 a 5 minutos. 4)Se contina con un nuevo tiempo en etanol al 70% durante 5 minutos, dejando escurrir el preparado, repitiendo la operacin inicial dejndolo 5 minutos. 5) Se agregael colorante Tricrmico durante 10 minutos. 6) A continuacin, en la etapade diferenciacin, se agregar alcohol etlico al 90%, acidificado con cido actico al l%, durante 3 segundos. 7)Efectuar dos nuevos cambios con alcohol absoluto y dejar de 2 a 5 minutos, en etapa de deshidratacin. 8)Colocar en xi101o tolueno, durante 2 a 5 minutos, en etapa de clarificacin. 9) Se deja secar para ser observado al microscopio con lente de inmersin a 100 x. La cromatina del ncleo toma una coloracin rojiza, con citoplasma en tono verde azulado sobre fondo verde.
ANEXO No9

Coloracin Jionina. de 1) Se coloca sobre un portaobjeto20 microlitros del sedimento de un enriquecimiento,con 50 microlitros de colorante de tionina. 2) Se cubre con laminilla y se deja 5 minutos para que acte el colorante. 3) Observacin al microscopio ptico, en seco, a 10 x y 40 x. El citoplasmade los protozoariosse tie de color rojo-azulado obtenindoseuna mejor diferenciacin del elemento parasitarioy sus estructurasinternas.
ANEXO No7

Coloracin de Ballenger.

1) Se depositan20 microlitros, del sedimento de materia fecal obtenido por mtodo de enriquecimiento, sobre un portaobjeto al que se le agregan50 microlitros del reactivo de Ballenger (tomadode la superficie del frasco que lo contiene), cubrir con laminilla. 2) Observaral microscopio en secoa 40 x. La coloracin es inmediata colorendoselos quistes y las formas vegetativas, con citoplasmas de tono rojo y detalles de las estructurascitoplasmticascon gran claridad.
ANEXO
Coloracin

Tcnicade Baermann Se trabaja con materias fecales frescas (sin conservadores), en las cuales las larvas posean una importante movilidad. Contando con un aparatode Baermann, como se describe en la figuras, se procede de la siguiente forma: 1) El embudo se llena con agua a 4045C 2) Sobre el mismo, en una malla metlica se sobreponen dos capasde gasa,en contacto con el agua, sin sumergirse. 3) En las gasasse extiende la muestra fecal, que reposa por 3 horas. 4)Posteriormente se abre la pinza, recogindose en el tubo de fondo cnico 10 ml del agua portadora del sedimento acumulado. 5) Se centrifuga el material por 5 minutos a 1500kpm. 6) Observar al microscopio el sedimentoen buscade larvas (Strongyloides stercoralis).
ANEXO NI0
de Van Gool

Tcnica de deteccin de microsporidios

No8

Jricrmica. 1) Se realiza un frotis de materia fecal en portaobjeto y sin dejar secarlo,se le agregafijador de Schaudin,con la finalidad de preservar los elementos celulares, dejndole por un mnimo de 30 minutos o un mximo de 24 horas. 2) Se coloca el frotis en etanolal 70 % durante5 minutos.
Val. 12 No3 Diciembre 1996

1) 0,5 g a 1 g de materia fecal fresca se homogeiniza en 8 ml de agua destilada y se filtran por medio de una malla de 300 Pm. 2) Mtodo WES (agua-ter-sedimentacin) se agregan3 ml de ter a 8 ml de filtrado. Esta mezcla se agita en tubo cerrado por un minuto. 3) Se centrifuga a 700 g por dos minutos. 4) Se diluye el sedimento en 100 a 150 ml de agua destilada. 5) Una gota (10 a 15 ~1) de la suspensinse extiende sobre 15 mm2 de rea. 6) Se colorea con Uvitex 2B y se examina a 1250 x en microscopio de fluorescencia.
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