Memorias V Congreso de la Sociedad Cubana de Bioingeniera, Habana 2003, Junio 10 al 13 de 2003

VALIDACI N DE CICLOS DE ESTERILIZACI N EN AUTOCLAVES

J. A. Padr n, M. E. Reyes, C. E. Gandolff Grupo Nacional de Validaci n - Instituto Finlay Ave. 25 # 222A14 e/ 222A y 230, La Coronela, La Lisa, AP 13600. Jorgepp@finlay.edu.cu Adems, las regulaciones nacionales e internacionales establecen que todos los procesos crticos deben ser validados, haciendo marcado nfasis en los procesos de esterilizaci n. Los esterilizadores modernos son dise ados y fabricados bajo estrictas normas y cuentan adems de los dispositivos de seguridad y de otras caractersticas que aseguran la fiabilidad de los procesos, con un sistema de control completamente automatizado que se ocupa no s lo de la ejecuci n de todas y cada una de las etapas de un ciclo de esterilizaci n, sino tambin de la verificaci n de las condiciones de operaci n para evitar da en el os equipo, en el proceso e incluso en el operador [1]. Una particularidad importante es que estos sistemas de control permiten el registro, en papel o en formato electr nico, de todos los parmetros de los ciclos ejecutados, lo cual adems de ser un requisito exigido por las regulaciones y las Buenas Prcticas de Producci n, permite la detecci n de posibles condiciones de fallo, a n antes de que ocurran. Otro aspecto importante en el control de los ciclos de esterilizaci n, mediante vapor saturado, es que adems del tradicional control mediante la combinaci n tiempotemperatura es posible controlar por un parmetro denominado tiempo equivalente . Esta variante es de suma importancia en los procesos de esterilizaci n donde la carga sea termolbil, pues evita una exposici n prolongada al calor. Este enfoque es usualmente es empleado en el caso de lquidos. La esterilizaci n por vapor saturado es el mecanismo mejor comprendido para la destrucci n de la vida microbiana. Es el mtodo preferido en equipos que puedan operar en el rango de 120 a 135 C. Aunque existen a n diferencias entre los especialistas, en cuanto al mecanismo de muerte a escala molecular, hay un acuerdo universal acerca de los tres parmetros crticos que afectan la esterilizaci n: tiempo, temperatura y humedad [5]. Cuando una poblaci n grande de clulas bacterianas, esporas o virus, son expuestos al vapor saturado a una temperatura fija el n mero de sobrevivientes puede ser determinado como una funci n del tiempo de exposici n. La temperatura afecta dramticamente la tasa de muerte. Al aumentar la temperatura la resistencia de los microorganismos disminuye sensiblemente, por lo que en la misma unidad de tiempo se observa una acentuada disminuci n de su poblaci n. El efecto de la humedad en la esterilizaci n por calor es evidenciada por las grandes diferencias observadas en las temperaturas requeridas por la esterilizaci n mediante

RESUMEN
Se estudi el proceso de esterilizaci n realizado en una autoclave de una instalaci n farmacutica. Como parte del estudio se llev a cabo una revisi n acerca de la esterilidad, sus aspectos te ricos y de los procesos de esterilizaci n en equipos empleados a escala de producci n. Se describen conceptos fundamentales, particularmente el concepto de Fo y su empleo, en la evaluaci n de la efectividad de un proceso de esterilizaci n. El dise de un protocolo de validaci n y o la posterior ejecuci n de ste, permiti aplicar un mtodo cientfico en las diversas fases del estudio. Las corridas experimentales se realizaron por triplicado, registrndose automticamente las temperaturas de 16 canales de medici n; durante estas etapas se calcul , en tiempo real, el tiempo equivalente (Fo), en cada uno de los canales y simultneamente se realiz un desafo con un indicador biol gico. Los resultados experimentales demostraron la efectividad de los procesos estudiados, con los patrones de carga definidos, as como la configuraci n de los ciclos del esterilizador. Las conclusiones de este estudio, son aplicables tambin en los entornos hospitalarios. Palabras clave: tiempo equivalente, esterilizaci n, validaci n, biondicadores, , perfil de temperatura.

1. INTRODUCCI N
El objetivo de una instalaci n productora de formas farmacuticas estriles es fabricar un producto libre de microorganismos capaces de reproducirse en el propio producto o despus de su administraci n a un paciente. Para lograr este objetivo la fabricaci n de soluciones parenterales es tpicamente acompa ada de una esterilizaci n terminal o mediante procesamiento asptico, sin embargo ambos procesos tienen sus limitaciones. Los procesos de esterilizaci n terminal no son aplicables a los productos termosensibles por la degradaci n que sufren debido a la acci n del calor. Por otro lado, el procesamiento asptico ha estado hist ricamente asociado con fallos en la esterilidad y el retiro de productos del mercado [2]. Independientemente del mtodo utilizado para lograr la esterilidad de un producto, es indiscutible la importancia que tiene el equipamiento empleado en este proceso, ocupando un lugar fundamental las autoclaves esterilizadores. Es debido a esto que la calificaci n de los equipos involucrados y la validaci n de los procesos ejecutados en ellos, sean de sumo inters para garantizar la calidad y seguridad de los productos farmacuticos.

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959-212-095-1 2003, Sociedad Cubana de Bioingeniera, artculo T_0111

calor seco y la esterilizaci n mediante calor h medo. Mientras que un proceso de calor seco ocurre generalmente entre 160 y 180 C, un proceso de calor h medo ocurre a temperaturas mucho menores que varan desde 115 C hasta 135 C [1], [5]. Este fen meno ha sido atribuido a que la presencia de agua disminuye la temperatura requerida para desnaturalizar las protenas, sin embargo en el caso del calor seco se requiere inicialmente un proceso de deshidrataci n antes de que la temperatura alcance un valor suficiente para producir la desnaturalizaci n o coagulaci n de las protenas, consecuentemente este es un proceso de oxidaci n, con una cintica diferente al proceso de calor h medo [1], [3], [5]. En el enfoque cintico de la muerte microbiana se asume frecuentemente que esta sigue un modelo similar a una reacci n qumica de primer orden. Se ha encontrado experimentalmente que la tasa de muerte, la cual es medida, en trminos prcticos, como una tasa de supervivencia, tiene un comportamiento exponencial, en el cual la constante de velocidad de reacci n k del paso ms lento, es la que controla el proceso [1], [5], tal como se muestra en la expresi n (1):

El microorganismo usualmente empleado como desafo, es el B. stearothermophilus, ampliamente conocido por su resistencia al calor. Los valores ms comunes de D varan entre 1,0 y 3,0 minutos a 121 C, mientras que el valor Z oscila entre 8 y 13 C [1], [6], aunque recientemente el autor ha empleado en estudios de validaci n indicadores biol gicos con un valor Z = 30 C. Una vez conocidos estos parmetros es posible desarrollar un modelo matemtico que permita calcular la capacidad de un proceso de esterilizaci n, para eliminar los microorganismos, en trminos de letalidad, seg n la expresi n (2):
( T Tb ) Z

L = 10
donde:

(2)

L: letalidad T: temperatura instantnea Tb: temperatura base Z: valor Z La letalidad puede ser determinada en un instante dado, pero si se calcula la sumatoria de todas las letalidades acumuladas, es decir se integra como una funci n de la temperatura en el tiempo ( L = f (T,t) ), entonces es posible calcular el tiempo equivalente F. La expresi n (3) sera:

N = N o e kt
donde: N: poblaci n microbiana en cualquier instante No: poblaci n microbiana inicial k: constante de velocidad de reacci n t: tiempo e: base de los logaritmos neperianos

(1)

t2

F = L dt
t1

(3)

Debe destacarse que cada reacci n de inactivaci n enzimtica o de degradaci n de ADN tiene su propio valor de k. La caracterizaci n y estudio de un proceso de esterilizaci n trmico requiere de la medici n de los perfiles de temperatura y adems de un reto con un microorganismo, empleado como bioindicador, cuyos parmetros de resistencia al calor sean conocidos y cuantificables; estos parmetros se denominan D y Z. El valor D, conocido tambin como tiempo de reducci n decimal, es una magnitud cuantitativa del ndice de muerte de los microorganismos. Se define como el tiempo requerido en minutos, a una temperatura especfica, para lograr una reducci n de un orden de magnitud, esto equivale a una reducci n del 90 % de la poblaci n microbiana inicial [4], [6], [7]. El valor D nos permite una comparaci n directa de la resistencia al calor de varios microorganismos. Un cambio en la temperatura afecta de forma significa la tasa de muerte de las bacterias. Al aumentar la temperatura, el log D disminuye de forma lineal y esta dependencia se define a travs de Z y se expresa en C. El valor Z se define como el cambio de temperatura requerido para reducir el valor D en un orden de magnitud, lo cual es igual a una reducci n del 90 % del propio valor D [4], [6], [7].

Una soluci n grfica de esta ecuaci n sera calcular el rea bajo la curva en un grfico de Temperatura vs. tiempo, seg n se muestra en la Fig. 1.
Temperatura vs tiempo

Temperatura (C)

tiempo (min)

Fig.1. El rea bajo la curva en un grfico de Temperatura vs. tiempo, equivale al tiempo equivalente valor F. No obstante la soluci n numrica es la ms empleada.

El valor F es definido como el tiempo equivalente durante el cual un producto ha sido sometido a una temperatura de esterilizaci n determinada [4], [6], [7]. En el clculo de F se toman en consideraci n distintos factores: la temperatura instantnea en cualquier momento, la temperatura base, el valor Z y el intervalo de

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tiempo. El concepto de tiempo equivalente necesariamente implica que este tiempo es diferente al tiempo real [4], [6], [7]. La soluci n de la ecuaci n 3 se expresa en la forma siguiente:
( T Tb ) Z

F = t 10
donde:

(4)

F: tiempo equivalente (min) T: temperatura instantnea (C) Tb: temperatura base (C) Z: valor Z (10 C) t: intervalo de tiempo (min) En el caso particular de la esterilizaci n por vapor saturado, la temperatura base (Tb) es igual a 121 C y el valor Z es igual a 10 C, en ese caso el trmino F se denomina Fo.

Por ltimo, los estudios de penetraci n de calor persiguen demostrar la eficiencia con que el vapor saturado es capaz de penetrar en los materiales y objetos que se pretenden esterilizar. La medici n de temperatura solo nos dara un criterio fsico, sin embargo el desafo microbiol gico nos dara un criterio biol gico de la efectividad del proceso. En este estudio los termopares se colocan en el interior de la carga, conjuntamente con ampollas conteniendo esporas del microorganismo de reto. El estudio requiri la ejecuci n de varias corridas experimentales en el siguiente orden cronol gico: prueba de hermeticidad, distribuci n de temperatura con cmara vaca y penetraci n de calor con reto microbiol gico.

3. RESULTADOS
La prueba de hermeticidad se realiz con un programa, identificado como P6, previsto en el sistema de control del esterilizador. Una vez alcanzado el nivel de vaco requerido (P < 100 mbar) y luego de un tiempo de estabilizaci n de 5 minutos la prdida de vaco no super los 13 mbar en 10 minutos. Los estudios de distribuci n de temperatura con cmara vaca, se realizaron con un ciclo identificado como P3, con una temperatura de 121 C durante 30 minutos. Sus resultados aparecen en la Tabla I, mientras que en la Fig.1 se muestran los perfiles de temperatura. La duraci n promedio de las tres corridas fue de 48 minutos. Tabla I Distribuci n de temperatura con cmara vaca

2. METODOLOG A
Para ejecutar el estudio se dise un protocolo de validaci n en el cual se describen las pruebas necesarias, as como la metodologa a seguir en su ejecuci n. La fases de mayor inters que abarcan este trabajo, fueron las etapas de Calificaci n de la Operaci n y de Calificaci n del Desempe o. El registro de los perfiles de temperatura fue realizado con un sistema de medici n de temperatura industrial, formado por una microcomputadora PC IBM compatible, un sistema multicanal Kaye, modelo Portable Validator y la aplicaci n Validator v1.05; los elementos de medici n utilizados fueron termopares tipo T. La calibraci n inicial, previa a las corridas, se realiz en tres temperaturas: 100, 121 y 140 C, empleando para ello un calibrador de temperatura Kaye HTR-400 y como patr n de temperatura una sonda IRTD-400, del mismo fabricante. A continuaci n se mencionan las pruebas de mayor relevancia: } } } } Prueba de hermeticidad Distribuci n de temperatura con cmara vaca Penetraci n de calor sin reto Penetraci n de calor con reto

CORRIDA

1 2 3

TEMPERATURA, (C) MNIMA MEDIA MXIMA 122,7 123,0 123,4 122,6 122,9 123,3

122,5

122,8

123,2

Las diferencias entre las temperaturas mximas y mnimas, con respecto a la temperatura media no supera 0.5 C.

Temperatura durante el ciclo

140.0 120.0 100.0

El objetivo de la primera prueba es demostrar que la cmara es hermtica, lo cual implica que no hay posibilidad de penetraci n de aire no filtrado (aire no estril) hacia el interior del esterilizador, ya que esta condici n puede comprometer la fiabilidad del proceso, en las etapas finales. Esta prueba se realiza ejecutando el programa de prueba de vaco del esterilizador y registrando el perfil de la presi n. La prdida de vaco no debe ser superior a 13 mbar en un periodo de 10 minutos. Los estudios de distribuci n de temperatura con cmara vaca y cmara cargada tienen como objetivo demostrar que la cmara del esterilizador es homognea y que la presencia de la carga no afecta la distribuci n de calor, respectivamente. Esta prueba es ejecutada fijando los termopares homogneamente, en el interior de la cmara y registrando el perfil de temperatura.

T (C)

80.0 60.0 40.0 20.0 0.0 0:00:00 0:02:29 0:04:59 0:07:29 0:09:59 0:12:29 0:14:59 0:17:29 0:19:59 0:22:29 0:24:59 0:27:29 0:29:59 0:32:29 0:34:59 0:37:18 0:39:29 0:41:59 Tavg Tmax Tmin

tiempo (min)

Fig.2. Perfil de temperatura durante las corridas de distribuci n con la cmara vaca. Se observa la coincidencia de las tres curvas (Tmn, Tmed, y Tmx) en la fase de exposici n.

Una vez realizadas las corridas requeridas para demostrar que el autoclave opera de acuerdo a las

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especificaciones del fabricante se realizaron las pruebas con carga. El estudio de penetraci n de calor se realiz a un patr n de carga formado por frascos, probetas y beakers, junto a otros accesorios envueltos en papel permeable al vapor. En las tres corridas se obtuvieron valores de Fo superiores a 24 minutos, de acuerdo con el criterio aplicado. El ciclo empleado se identific como P3, con una temperatura de 121 C durante 25 minutos. La Tabla II expone los resultados obtenidos mostrando los valores mnimos y mximos de Fo obtenidos en cada corrida. Tabla II Resumen de las corridas de penetraci n de calor

consigna fijado, como una garanta de que en un peor caso el punto mas fro nunca estar por debajo de este. Las pruebas de desafo microbiol gico, ejecutadas simultneamente, con el estudio de penetraci n de calor, dieron como resultado que los bioindicadores recibieron una cantidad de calor suficiente para eliminar las esporas de B. stearothermophilus brindando un criterio biol gico de la efectividad del proceso de esterilizaci n.

5. CONCLUSIONES
El control automtico de todos los pasos de un proceso de esterilizaci n garantiza que la ejecuci n del ciclo se efect e siempre de la misma forma, asegurando la consistencia y reproducibilidad de los resultados. Este aspecto constituye un elemento fundamental en la obtenci n de productos farmacuticos. Los estudios previos con la cmara vaca demostraron que el sistema tiene un comportamiento muy homogneo durante la fase de exposici n del ciclo de esterilizaci n, con diferencias inferiores a 0.5 C, lo cual favorece el desempe del proceso. o La medici n y registro de los perfiles de temperatura, durante la ejecuci n del ciclo de esterilizaci n, as como el clculo simultneo de los valores de Fo y el desafo microbiol gico con esporas de B. Stearothermophilus constituyen un mtodo adecuado para demostrar la efectividad de los procesos de esterilizaci n. Los valores de Fo que se obtuvieron en cada uno de los puntos estudiados, indicaron que el proceso brind suficiente letalidad para eliminar las formas de vida microbiana potencialmente presentes en los materiales que conformaron el patr n de carga.

CORRIDAS

1 2 3

VALOR DE Fo (minutos) Fo mn. Fo mx. 33,4 38,7 34,4 44,2 32,6 36,1

El criterio asumido fue realizar un proceso de esterilizaci n que permitiera obtener un Fo > 24 minutos.

Los indicadores sometidos a la esterilizaci n y los empleados como controles positivos fueron incubados en las condiciones recomendadas, 58 C durante 48 horas. Ninguno de los indicadores biol gicos sometidos al proceso mostr evidencia de crecimiento, mientras que los controles positivos evidenciaron un cambio de coloraci n como signo del crecimiento microbiano.

4. DISCUSI N
Los resultados de la prueba de hermeticidad indicaron que la cmara es hermtica, lo cual aunque no tiene marcada influencia en el comportamiento trmico, es un aspecto de suma importancia en la etapa de posttratamiento pues es en esta donde generalmente se realiza un pulso de vaco prolongado, para extraer la humedad residual, en los procesos de esterilizaci n para cargas s lidas. La Tabla I indica que la cmara del esterilizador es homognea pues las diferencias entre los valores mnimos con respecto a la media es inferior a 1 C; de igual forma la diferencia entre los valores mximos y la media es menor que 1 C. De aqu se infiere que cualquier comportamiento an malo del perfil de temperatura, en la carga, se debe a la configuraci n de la misma y no al desempe del esterilizador. En la Fig. 1 se observan las o tres curvas correspondientes a la temperaturas mnimas, mximas y media durante todo el ciclo. Durante las fases de pre- y post-tratamiento los valores de temperatura se diferencian notablemente, lo cual es de esperar debido a que los pulsos de inyecci n de vapor y de vaco no permiten el establecimiento de condiciones estables. Una vez que se inicia la fase de exposici n las variaciones de la presi n del vapor saturado son muy peque lo que as, trae como consecuencia que las temperaturas en todos los puntos de la cmara estn pr ximas. Debe destacarse que el sistema de control de esta autoclave, por dise del o fabricante, asume siempre 1 C por encima del valor de

REFERENCIAS
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