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Monografico VI Workshop MRAMA

Monografico VI Workshop MRAMA

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Published by: Kleyder Ramirez Puerta on Oct 30, 2012
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12/04/2012

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VI WORKSHOP MRAMA
E
l pasado noviembre, tuve laoportunidad de asistir alWorkshop sobre MétodosRápidos y Automatización enMicrobiología Alimentaria que, bajo ladirección de los doctores MartaCapellas Puig y Josep Yuste Puigvert,se celebra anualmente en la Facultadde Veterinaria de la Universidad Autónoma de Barcelona. Se trata deun curso muy interesante que permiteadquirir una amplia visión de losmétodos de detección e identificaciónrápida de los microorganismos pre-sentes en los alimentos, así comoconocer los últimos avances aplica-bles al análisis microbiológico en laindustria alimentaria. El curso constade: (i) conferencias impartidas por destacados científicos españoles yextranjeros; (ii) presentaciones acargo de expertos de importantesempresas de microbiología, incluyen-do “rotaciones” en las que gruposreducidos de participantes en el cursoasisten a la demostración del funcio-namiento de equipos y productos; y(iii) dos sesiones prácticas de labora-torio, un taller y una visita a unaempresa de Biología Molecular. Entrelos conferenciantes que intervinieronen el curso, destaca la figura del Dr.Daniel Y. C. Fung, profesor de laKansas State University enManhattan (Kansas) y director delmundialmente conocido Workshop onRapid Methods and Automation inMicrobiology que se celebra anual-mente en la mencionada universidaddesde 1980. El Dr. Fung, autoridadinternacional en el campo de losMétodos Rápidos en Microbiología yautor de más de 800 artículos científi-cos en la materia, impartió seis intere-santes conferencias basadas en suartículo
Rapid Methods and  Automation in Microbiology 
(1), cuyosaspectos más destacados presento acontinuación.El desarrollo de métodos rápidos yautomatizados para la detección, ais-lamiento, identificación y enumera-ción de microorganismos (y/o susmetabolitos) relacionados con la alte-ración y seguridad de los alimentos esuna subdivisión del área de la micro-biología aplicada con una importanciacada vez mayor. En este sentido,según investigaciones de mercadorealizadas en 2003 por StrategicConsulting Inc.´s, del total de ensayosmicrobiológicos realizados por laindustria en el mundo (1.136,5 millo-nes), el 58% (660, 5 millones) corres-pondieron a la industria de la alimen-tación (49%) y bebidas (9%). Aproximadamente, el 20% de los aná-lisis se dirigieron a la detección de losmicroorganismos patógenos
Salmonella
y
Escherichia
coliO157:H7 y el 80% restante fueronanálisis rutinarios (recuento total, decoliformes, de mohos y de levaduras). Anivel mundial, el porcentaje deensayos realizado en Europa, América del Norte y el resto delmundo fue de un 33% en cada uno delos casos. No obstante, se estima queen un futuro próximo el porcentaje deensayos realizados en el resto delmundo podría incrementarse hasta el50% debido a la concienciación queestán experimentando países coneconomías en desarrollo sobre lagran importancia de la seguridad ali-mentaria (1, 2, 3). Así por ejemplo, lasautoridades sanitarias de China, paísque se ha visto envuelto en variasocasiones en escándalos debidos a laexportación de alimentos con condi-ciones higiénico-sanitarias no ade-cuadas, están tomando las medidasnecesarias para asegurar el suminis-tro de alimentos seguros a los más de10.000 atletas y 3 millones de espec-tadores que se calcula asistirán a losJuegos Olímpicos que se celebraránen agosto de este año en Beijing (4).Los métodos microbiológicos “con-vencionales”, empleados actualmenteen numerosos laboratorios de todo elmundo y establecidos en muchoscasos como métodos estándares deanálisis microbiológico de los alimen-tos, se caracterizan por ser laborio-sos, emplear grandes volúmenes demedios de cultivo y requerir un tiempoconsiderable para la obtención y elanálisis de los resultados. Por el con-trario, los métodos rápidos requierenun tiempo reducido para la obtenciónde los resultados y/o permiten proce-sar un número elevado de muestraspor unidad de tiempo, y son en gene-ral fáciles de usar, precisos (sensibili-dad y especificidad adecuadas y lími-tes de detección bajos) y económica-mente rentables (aunque, en algunoscasos, pueden requerir una inversióneconómica inicial considerable).Conviene destacar que, en la mayoríade los casos, el empleo de métodosrápidos no excluye la etapa de enri-quecimiento del microorganismodiana ni la necesidad de obtener culti-vos puros, así como que los resulta-dos positivos obtenidos con métodosalternativos (distintos del método dereferencia) deben ser confirmados. Asimismo, es de suma importancia, aligual que en el caso de los métodostradicionales, una adecuada toma ypreparación de las muestras a anali-zar. En lo que se refiere a este últimoaspecto, destacan los siguientesavances: (i) para muestras sólidas,instrumentos gravimétricos que reali-zan automáticamente las dilucionesprogramadas (Dilumat, AESChemunex; Dilumacher, PBI; LabproGravimetric Diluter, Spiral Biotech) yhomogeneizadores que funcionanmediante ondas de choque y unaintensa agitación para transferir losmicroorganismos del alimento al dilu-yente, produciendo una mínima des-trucción de la muestra (Pulsifier,
MÉTODOS RÁPIDOS YAUTOMATIZACIÓN ENMICROBIOLOGÍAALIMENTARIA
Carmen Herranz Sorribes
Dpto. de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los AlimentosFacultad de Veterinaria. Universidad Complutense de Madrid(c.herranz@vet.ucm.es)
 
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Alimentaria Abril 08
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Microgen); (ii) para muestras líquidas,sistemas rápidos para realizar dilucio-nes seriadas (sistema Dilucup,LabRobots Products AB); (iii) paramuestras de superficie, esponjas pre-hidratadas con un medio de transpor-te o enriquecimiento diseñadas paraobtener muestras de lugares de difícilacceso (SpongeSicle y Extend-a-Sicle, Biotrace International) y elmétodo “manos libres” para la obten-ción de muestras de la superficie decanales mediante el empleo de cintaadhesiva (5); y (iv) para muestras deaire, instrumentos portátiles que aspi-ran un volumen determinado de aire yrecogen los microorganismos en lasuperficie del agar de placas de con-tacto para la estimación de la calidadmicrobiológica aire (SAS sampler,Bioscience International; MicroBio Air Sampler, Parrett).Los métodos rápidos utilizados enmicrobiología de los alimentos pue-den dividirse en cinco grandes gru-pos, incluyendo los empleados parael recuento de células viables, para lamedición de la biomasa, los sistemasminiaturizados y kits de diagnóstico,los inmunológicos y los genéticos. Enlos siguientes apartados se tratan lasinnovaciones introducidas reciente-mente en cada uno de estos grupos.
RECUENTO DE CÉLULASVIABLES
El recuento de células viables, tantode los alimentos como de las superfi-cies en contacto con los mismos y delaire de las industrias alimentarias, esuno de los parámetros más importan-tes a la hora de determinar la calidady seguridad de los alimentos.Tradicionalmente, el recuento decélulas viables se ha realizadomediante el método estándar derecuento en placa, que, aunque sen-cillo, es laborioso, requiere un volu-men considerable de tubos de ensayoy medio de dilución, y espacio para elalmacenamiento y la incubación delas placas de cultivo. En lo que serefiere a la preparación de placas decultivo, destacan las siguientes mejo-ras: autómatas para la preparación ydistribución de medios de cultivo(Masterclave, AES Chemunex); siste-mas que incluyen pectina como agen-te gelificante en lugar de agar, evitan-do así la necesidad de calentar elmedio para fundirlo (Redigel, 3M); ymedios liofilizados que utilizan comosoporte una película plástica de tama-ño y grosor similar al de una tarjeta decrédito que contiene geles solublesen agua fría que se rehidratan aldepositar la muestra en su superficiey que requieren un espacio mínimopara su almacenamiento e incubación(Petrifilm, 3M), existiendo asimismoinstrumentos para la lectura rápida yautomática de los resultados (Lector de placas 3M Petrifilm, 3M). En esteapartado cabe asimismo destacar eldesarrollo de numerosos medios decultivo cromogénicos que acortan eltiempo necesario para la obtención deresultados (RAPID´ ChromogenicMethods, Bio-Rad; BBLCHROMagar,BD; medios cromogénicosbioMérieux; medios cromogénicos AES Chemunex). En cuanto a losmétodos de siembra, existen sembra-dores automáticos en espiral quereducen o eliminan la necesidad derealizar diluciones seriadas de lamuestra (Autoplate 4000, SpiralBiotech; WASP, Don Whitley ScientificLimited) y que facilitan el recuentomediante el empleo de contadoresautomáticos de colonias (Q Count,Spiral Biotech; EasyCount2, AESChemunex). Con respecto a la enu-meración de microorganismos, exis-ten sistemas basados en la simplifica-ción de la técnica del número másprobable (NMP), que poseen unrango de enumeración amplio enausencia de diluciones, tales como elsistema de filtración Isogrid/Neo-Grid(Neogen), que emplea una membranacon 1.600 celdillas o “compartimentosde crecimiento” delimitados por unarejilla hidrofóbica, y la placa SimPlate(Biocontrol), que permite recuentosde hasta 738 ufc (frente a las 300 ufcde una placa de cultivo convencional).Recientemente se ha miniaturizado yautomatizado el método NMPmediante el empleo de tarjetas dematerial plástico que contienen 3 gru-pos de 16 pocillos, con 1 logaritmo dediferencia en volumen para cadagrupo de pocillos, y medios de cultivocon indicadores fluorescentes(Tempo, bioMérieux). Este sistemadisminuye considerablemente lanecesidad de reactivos, espacio ytiempo con respecto al método NMPconvencional. Aunque la mayoría delos métodos de recuento menciona-dos están diseñados para la enume-ración de microorganismos aerobios,en los años 80, el Dr. Fung desarrollóun método ingenioso y sencillo para elrecuento de microorganismos anaero-bios, conocido como “doble tubo deFung”, que permite lograr instantáne-amente condiciones de anaerobiosisen el medio de cultivo y que norequiere sistemas generadores dehidrógeno ni jarras de anaerobiosis(6).Los métodos citados en esta secciónfacilitan de diversas maneras la reali-zación del recuento microbiano y/odisminuyen el tiempo necesario parala obtención de resultados. Sinembargo, necesitan un tiempo deincubación variable para que losmicroorganismos crezcan y puedanser detectados y enumerados. Por elcontrario, existen métodos para larealización de recuentos microbianosprácticamente en tiempo real basadosen el empleo de colorantes fluores-centes que permiten distinguir célulasvivas de muertas mediante un micros-copio de epifluorescencia (DEFT, delinglés
Direct Epifluorescent Filter Technique
), escáner (ScanRDI, AESChemunex), o citómetro de flujo digi-tal (BactiFlow ALS, AES Chemunex).
MEDIDA DE LA BIOMASAMICROBIANA
Puesto que el método “convencional”de recuento de microorganismos enplaca es muy laborioso, se han des-arrollado métodos para estimar demanera indirecta el número de micro-organismos presentes en los alimen-tos. El desarrollo de dichos métodosestá íntimamente ligado al de la ins-trumentación necesaria para detectar las señales relacionadas con el creci-miento microbiano. El principio en elque se basan estos sistemas es quedichas señales (niveles de ATP, enzi-mas específicas, pH, impedancia,conductancia y capacitancia eléctri-cas, etc.) se modifican paralelamentecon el crecimiento microbiano.
 
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Conviene destacar que para que lasmediciones sean significativas esnecesario establecer la correlaciónentre estos parámetros y el recuentode células viables.Todas las células vivas contienen ATP, que se degrada muy rápidamen-te mediante autolisis al morir las célu-las. En presencia de la enzima lucife-rasa y el sustrato luciferina (proce-dentes de la luciérnaga), oxígeno ymagnesio, el ATPfacilita el paso de laluciferina a oxiluciferina, generándoseluz (bioluminiscencia) que puede ser detectada mediante un luminómetro.La cantidad de luz emitida en estareacción es directamente proporcio-nal a la cantidad de ATPpresente enla muestra, es decir, al número decélulas vivas, y está correlacionadacon la biomasa celular (la cantidad de ATPde 1 unidad formadora de colonia –ufc- oscila entre 0,22 y 1,03 fg). Estemétodo (por ejemplo, el sistemaPromicol) puede emplearse para ladetección específica de ATPmicrobia-no en productos líquidos tales comoleche UHT, zumos, postres lácteos,etc., en los que es necesario determi-nar la presencia/ausencia de microor-ganismos. No obstante, la principalaplicación de este principio en laindustria alimentaria se encuentra enla monitorización de la higiene desuperficies. En este caso, la presen-cia de altos niveles de ATPde cual-quier origen (microbiano o no) es indi-cativa de una limpieza deficiente. Enla actualidad, existen numerosos sis-temas que utilizan dispositivos deltipo escobillón o hisopo para la tomade muestra y luminómetros portátiles,robustos, sensibles y fáciles de utili-zar que ofrecen lecturas rápidas (enmenos de 1 min) del nivel de ATP(Ultrasnap y systemSURE Plus,Hygiena; Accupoint, Neogen;Lightning MVP, Biocontrol; Clean-Trace y Uni-Lite, 3M) lo que permiteaplicar las acciones correctoras esta-blecidas en el plan de Análisis dePeligros y Puntos de Control Crítico(APPCC) antes de que se contamineel producto. Asimismo, existen siste-mas para la detección rápida de res-tos de proteínas o azúcares en lassuperficies que actúan como fuentede nutrientes para los microorganis-mos. Estos sistemas se basan en lareacción de dichos nutrientes con losreactivos presentes en hisopos espe-ciales, lo que origina un cambio decolor (reacción semicuantitativa) quepuede detectarse visualmente (PRO-TECT, Biotrace International; PRO-Clean y SpotCheck plus, Hygiena;Clean Test, LiofilChem). De manerasimilar, puede detectarse la presenciade Listeria spp. en muestras ambien-tales de la industria alimentariamediante el uso de escobillones a losque se les añaden antibióticos, sus-tancias enriquecedoras del crecimien-to y compuestos indicadores quecambian de color en aproximadamen-te 30 h en caso de un resultado posi-tivo (InSite, Hygiena; Listeria superfi-cies PDX-LIB/Enviroswab, ParadigmDiagnostics/Tecra). Además, existenotros sistemas para la detección delcrecimiento microbiano que se basanen el empleo de instrumentos más omenos sofisticados para la monitori-zación continua de los cambios decolor del medio de cultivo relaciona-dos con la actividad metabólica micro-biana y que permiten obtener resulta-dos en pocas horas (BacT/Alert 3D,bioMérieux; Soleris, Neogen).Otro grupo de técnicas para la medidade la biomasa son las basadas en ladetección de cambios en la conducti-vidad eléctrica y la resistencia delmedio de cultivo producidas comoconsecuencia del metabolismo denutrientes de gran tamaño a molécu-las de menor tamaño y químicamentemás activas durante el crecimientomicrobiano (Bactometer, bioMérieux;RABIT, Don Whitley ScientificLimited). Puesto que se conoce quepara que estos cambios tengan lugar debe alcanzarse una población críticade aproximadamente 10
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ufc/g, esposible estimar la población inicial dela muestra a partir del tiempo necesa-rio para la detección de dichos cam-bios.
SISTEMASMINIATURIZADOS Y KITSDE DIAGNÓSTICO
Los sistemas miniaturizados surgen apartir del concepto de la placa micro-tituladora (96 pocillos, formato 8x12),que permite reducir el volumen dereactivos y medio a emplear en losensayos, así como estudiar en un for-mato manejable el efecto de un com-puesto sobre un gran número de ais-lados o el de una serie de compues-tos sobre un aislado determinado.Esta línea de investigación ha permiti-do desarrollar algunos de los mediosde cultivo selectivos que se encuen-tran en el mercado actualmente.Entre los sistemas miniaturizados deidentificación microbiana disponiblesen la actualidad, basados en el meta-bolismo de sustratos específicos por parte de los microorganismos y sudetección mediante diversos sistemasindicadores, destacan los siguientes:tarjetas desechables para la identifi-cación sencilla de colonias sospecho-sas mediante pruebas bioquímicasrápidas (O.B.I.S., Oxoid); galerías quepermiten la identificación de más de800 especies de bacterias y levadu-ras (API, bioMérieux); tubos de plásti-co con compartimentos que contienenagar con distintos sustratos y con unaaguja en su interior que posibilita lainoculación del tubo de forma rápida ysencilla a partir de una única colonia(BBLEnterotube y Oxi/Ferm Tube,BD); y soportes plásticos con pocillosde fácil inoculación que contienensustratos cromogénicos y/o fluorogé-nicos en estado deshidratado que serehidratan en contacto con la muestra(BBLCrystal, BD; RapID systems yMicroID, Remel; Biochemical IDsystems, Microgen). Uno de los siste-mas miniaturizados y automatizadosmás conocidos y sofisticados es elsistema VITEK (bioMérieux) que,basándose en cambios de color delos sustratos o en la producción degas de los cultivos inoculados en lospocillos de una tarjeta plástica quecontiene los sustratos bioquímicos enforma deshidratada, puede identificar un cultivo típico de Escherichia coli en2-4 h. Una rapidez similar en la obten-ción de resultados puede obtenersecon el sistema Biolog (AESChemunex) que detecta la capacidadde los microorganismos para oxidar 95 fuentes de carbono. Los 2
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(4x10
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) patrones metabólicos posi-bles permiten, además de la identifi-cación, el establecimiento de relacio-nes filogenéticas entre distintos aisla-dos. El empleo de un único cromóge-

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