FONDUL SOCIAL EUROPEAN Investete n oameni!

Programul Opera ional Sectorial pentru Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 2013 Proiect POSDRU/6/1.5/S/16 Doctoranzi n sprijinul inovrii i competitivit ii

UNIVERSITATEA POLITEHNICA DIN BUCURETI

Facultatea Chimie Aplicata si Stiinta Materialelor Catedra Stiinta si Ingineria Materialelor Oxidice si Nanomateriale

Nr. Decizie Senat __________ din _____________

TEZ DE DOCTORAT

Materiale compozite hibride de tip polimer/ceramica Polymer/ceramic hybrid composite materials

Coordonator stiintific: Prof. Dr.Ing. Ecaterina ANDRONESCU Autor: Ing. Maria FICAI (SNMEZ)

Bucureti 2011

Cuprins
Justificarea alegerii temei de doctorat ..................................................................................... 5 I. MATERIALE COMPOZITE HIBRIDE BINARE ............................................................. 6 Compozite hibride de tip poli BisGMA-HA ............................................................................ 6 Compozite pe baz de APVHA ............................................................................................ 10 Compozite pe baz de APVAl2O3 ......................................................................................... 14

II. MATERIALE COMPOZITE HIBRIDE TERNARE ...................................................... 18 Materiale compozite hibride de tip colagen/hidroxiapatita/magnetita................................. 18 Ob inerea i caracterizarea materialelor compozite COL/HA-Fe3O4 .................................. 19 Sisteme multifunc ionale colagen/cisplatin i colagen/hidroxiapatit/cisplatin.................... 24 Sinteza materialelor multifunc ionale de tip COL/cisplatin i COL/HA/cisplatin............... 26 Caracterizarea materialelor multifunc ionale ..................................................................... 27 Studii de eliberare a cisplatinului din materialele multifunc ionale .................................... 30 Evaluarea potentialului citotoxic pe linii celulare de osteoblaste normale i din osteosarcom n prezenta sistemului cu eliberare controlat .................................................................... 31 Evaluarea potentialului proliferativ al osteoblastelor normale i din osteosarcom n prezenta sistemului cu eliberare controlat ...................................................................................... 33 Evaluarea potentialului apoptotic al osteoblastelor normale i din osteosarcom n prezenta sistemului cu eliberare controlat ...................................................................................... 35 Implicarea sistemelor cu eliberare controlat n modularea activitatii metaloproteinazelor matriceale ......................................................................................................................... 37 Concluzii ................................................................................................................................. 38 Diseminare rezultate............................................................................................................... 43 Bibliografie selectiv............................................................................................................... 43

Introducere Nanocompozitele polimerceramic pot fi considerate ca fiind o categorie important de materiale hibride organo-anorganice, n care blocurile anorganice nanodimensionale (de ex. nanoparticule, nanotuburi, nanofire sau filme nanometrice) sunt dispersate ntr-o matrice de polimer organic [1]. Triunghiul: sintez i fabricarecompozi ie i structurpropriet i i performan e reprezint rela ii esen iale n tiin a materialelor [2]. Propriet ile unui material de compozi ie dat depind, ntr-o foarte mare msur, de metoda dup care a fost realizat, acestea fiind o consecin a structurrii diferite. Invers, aplica iile speciale necesit propriet i structurale concrete, prin urmare i o compozi ie exact, care implic procedee de sintez i fabricare corespunztoare. Materialele polimer-ceramic se disting prin rezisten a lor mecanic mbunt it i stabilitatea termic ridicat [3]. n astfel de sisteme autoorganizate aflate n neechilibru, rolul cheie revine interac iilor interfaciale dintre componen i. n esen , aceasta este principala cale de formare a particulelor de oxizi nanodimensiona i (din scheletul polimerului anorganic) n mediu de polimer organic. Astfel de nanoparticule i gsesc o gam larg de aplica ii ca i componen i ai unor materiale compozite. n prezent se cunosc un numr mare de proceduri de ob inere ale materialelor hibride cu propriet i impuse, diferind ns modul de combinare al fazelor organice i anorganice (diferite variante de coprecipitare, procedee hidrotermale, piroliz prin pulverizare, tehnica sol-gel, sinteze de coloizi n prezen a polimerilor etc.) [4, 5]. Materialele organo-anorganice se numesc hibrid deoarece ele combin propriet ile gruprilor polimerilor organici (func ionalizare, uurin a realizrii la temperaturi sczute, duritate, rezisten ) cu propriet ile materialelor vitroase sau ceramice (robuste e, stabilitate chimic i termic) n scopul ob inerii unor propriet i noi i sinergetice inaccesibile pe alt cale. Osteosarcomul reprezint cea mai comun form de cancer primar al esutului osos ce i are originea n celulele mezenchimale. n plus, reprezint cea mai frecvent form de cancer ce se produce la copii i adolescen ii de pn n 20 de ani, n timp ce la copiii de pn n 10 ani, cea mai comun form de cancer osos primar este sarcomul Ewing. La nivel molecular, osteosarcomul este un puzzle de alterri genetice: patogeneza este bazat pe inactivarea genelor supresoare de tumori, n particular p53 i gena retinoblastoma (RB1), ale cror alterri au fost observate ntr-un numr semnificativ de osteosarcoame. Muta ii n alte gene de reglare a ciclului celular, inclusiv amplificarea produsului genelor MDM2 (murine double minute 2) i kinazei ciclin-dependente 4 (CDK4) au fost descrise n osteosarcom. S-a estimat c frecven a alterrilor suferite de RB1 n osteosarcoamele sporadice este de 30-75%.

Prognosticul pentru pacien ii cu modificri RB1 pare a fi mai nesatisfctor dect pentru pacien ii fr alterri RB1 [6]. Pn n anii 1970, osteosarcomul a fost tratat n special prin amputare sau prin radioterapie. Dup efectuarea tratamentului local, cei mai mul i dintre pacien i au murit dup o perioada scurt de timp din cauza metastazelor pulmonare. Prin urmare, rezultatele interven iei chirurgicale, singure, ca tratament al osteosarcomului sunt nesatisfctoare. Printre medicamentele utilizate cu success n tratamentul osteosarcomului se numra doxorubicina [7] i metrotrexatul [8]. Realizarea unui studiu despre tratamentul chimioterapic n osteosarcom a artat c vincristinul, bleomicina i dactinomicina sunt ineficiente. Ulterior, adugarea de cisplatina [9] i ifosfamid la doxorubicin i metotrexat s-a dovedit c mbunt ete semnificativ rezultatele clinice. Protocolul actual standard de chimioterapie cuprinde trei-medicamente: cisplatina, doxorubicina i o doz crescut de metotrexat i asigur aproximativ 70% din rata de supravie uire a pacien ilor cu osteosarcom fr metastaze [10]. Un suport adecvat pentru regenerarea osoas trebuie s fie biocompatibil pentru a permite adeziunea i proliferarea celular, sinteza i depunerea unei matrice extracelulare (MEC) i pentru a putea, n final, s sus in regenerarea osoas n vivo cu o vitez adecvat de degradare. Pentru optimizarea integrrii n esuturile nconjurtoare suportul ar trebui s mimeze morfologia, structura i func ia osului. Hidroxiapatita (HA) i -fosfatul tricalcic (-TCP) sunt principalii candida i pentru substituen ii osoi. HA, component mineral major a osului, are capacitatea de a forma legturi puternice cu esutul osos nconjurtor. HA este un material bioactiv larg acceptat, care promoveaz regenerarea rapid a esutului osos, avnd o excelent biocompatibilitate i osteoconductivitate, dar o rezisten mecanic i o viteza de degradare sczut [11]. Suporturile colagenice tridimensionale servesc ca analog al matricei extracelulare ac ionnd ca suport fizic structural favorabil pentru regenerarea esutului afectat stimulnd dezvoltarea noului esut. Cedarea controlat a medicamentelor i aplica iile acesteia n ingineria tisular pentru suportul i stimularea creterii tisulare, a atras aten ia multor cercettori n ultimii ani. Exist doi parametri foarte importan i care intervin n eliberarea controlat a substan elor medicamentoase i anume natura chimic a suportului i a substan ei medicamentoase i respectiv morfologia suportului din care se realizeaz eliberarea. Natura chimic influen eaz eliberarea controlata prin interac iile fizico-chimice ce se dezvolt ntre suport i medicament n timp ce morfologia intervine n special prin procesul de difuziune; un material cu ct este mai poros cu att fluxul de lichide este mai mare i implicit eliberarea este mai pronun at.

Justificarea alegerii temei de doctorat Necesitatea abordri prezentei teme de doctorat a aprut datorit numrului mare de interven ii chirurgicale care apar la nivelul tesutului osos (n special n cazul cancerului osos) n principal n rndul copiilor i adul ilor tineri cu vrst cuprins ntre 10-20 ani, fiind o problem major de sntate inclusiv la nivelul Romniei. Cancerul osos se clasific n cancer primar i secundar al oaselor. Cancerul primar al oaselor este un tip de cancer situat n os sau la periferia oaselor. Cel mai frecvent tratament al osteosarcomului este interven ia chirurgical care implic ndeprtarea esutului afectat mpreun cu o zon de esut sntos. nainte de interven ia chirurgical pn n prezent se utilizeaz chimioterapia neoadjuvant sau dup interven ie chimioterapia adjuvant. Pacienti cu osteosarcom n urma ndeprtri tesutului osos pot fi trata i prin introducerea n defectul osos a unui implant pe baza de colagen/hidroxiapatit care prezinta aceeasi compozi ie cu tesutul osos natural permi nd osteointegrarea rapid a implantului. n cazul utilizari materialelor multifunctionale pe baz de colagen/HA/cisplatin acesta ndeplinesc 2 roluri: suport regenerativ datorit compozitului colagen/hidroxiapatit i rol de eliberare controlat a medicamentelor acesta avnd ac iune local de distrugere a celulelor canceroase viabile neextirpate n urma interven iei chirurgicale, gradul de recuren fiind semnificativ redus i toxicitatea sistemic asociat cu eliberarea cisplatinului dup implantare ar fi minim. Pentru nlturarea radioterapiei se pot utiliza compozitele pe baz de colagen / HA / magnetit deoarece hipertermia produs cu 5% magnetit este adecvat pentru tratarea cancerului osos. Implantologia a devenit n ultimele decenii o tiin , nregistrnd progrese evidente, ndeosebi de cnd a fost demonstrat osteointegrarea titanului. Rezolvarea protetic a unor cazuri care erau considerate imposibile sau deosebit de dicile, a fcut astzi posibil o palet larg de tratamente cu ajutorul implanturilor dentare. Orice material selectat pentru fabricarea unui implant trebuie s ndeplineasc dou criterii de baz: biocompatibilitatea i biofunc ionalitatea. Aceasta explic preocuprile pentru realizarea unor materiale care s ndeplineasc ambele cerin e (biologice i func ionale), e acoperirea materialelor biotolerate (metale, aliaje i mase plastice) sau bioinerte (ceramici pe baza de Al2O3 i ZrO2) cu straturi sub iri de hidroxiapatit; n acest fel, suportul (substratul) confer protezei propriet ile mecanice necesare, iar stratul de acoperire propriet ile biologice, respectiv capacitatea de a reac iona chimic cu esuturile vii. Se estimeaz c n lumea industrializat, peste 250 de milioane de persoane sufer de lipsa unuia sau a mai multor din i. Plasarea unui implant dentar depinde direct de cantitatea i de calitatea osului pacientului. n ultimii ani, chirurgii i cercettorii au pus la punct numeroase tehnici de refacere a osului pierdut (datorit resorb iei excesive) cu ajutorul diverselor tipuri de os substitut (grafare osoas). Un tip de grefe osoase este reprezentat de grefe alloplastice fiind reprezentate de materiale

artificiale care imit osul natural (de obicei fosfatul de calciu). Au ca scop stimularea organismului s produc os acolo unde sunt plasate (n zonele cu defect). Materialele compozite hibride de tip polimer-ceramic utilizate pentru restaurri osoase i / sau implantologie trebuie s ndeplineasc o serie de condi ii esen iale pentru a fi implantate n organism: osteoconductivitate, osteoinductivitate, bioactivitate, biocompatibilitate, bioresorbabilitate, rezisten mecanic ridicat. Pe baza acestor criterii au fost selectate i realizate n cadrul tezei de doctorat urmtoarele compozite. Materialele compozite polimer ceramic de tipul poliBis GMA/HA rspund n totalitate acestor cerin e att din punct de vedere al matrici ct i a agentului de ranforsare. Datorit multitudinii de procedee de reticulare a matrici: chimic, fotochimic i termic se poate alege metoda optim de polimerizare, astfel nct s se exclud n totalitate introducerea unui ini iator chimic n material care poate provoca reac ii toxice n contact cu esuturile gazd. Compozitul ob inut poate fi prelucrat cu uurin n produse de tip micro filer, eliminnd astfel opera ia de lefuire, crescnd rezisten a i biocompatibilitatea acestui material. Urmtoarele materiale compozite realizate n cadrul tezei de doctorat att cele pe baz de APV/HA ct i cele pe baz de APV/Al2O3 sunt n totalitate biocompatibile i netoxice. Compozitele pe baz de APV/Al2O3 prezint o excelent rezisten la coroziune, biocompatibilitate putnd fi utilizat cu succes n chirurgia ortopedic. Ceramiciile pe baz de hidroxiapatit i alumin sunt utilizate pe larg n aplica ii dentare si sunt experimentate pentru aplicatii de inginerie tisular a tesutului osos. Rezumatul de fa prezinta o selec ie a contribu iilor originale care stau la baza elaborrii tezei de doctorat. Numerotarea capitolelor i subcapitolelor corespund cu cele din teza. Scopul lucrrii: Realizarea n implantologie. I. MATERIALE COMPOZITE HIBRIDE BINARE Compozite hibride de tip poli BisGMA-HA In cadrul tezei au fost obtinute materialele compozite binare hibride pe baza de BisGMA (bis-fenol-glicidil-metacrilat) unul dintre cei mai raspanditi monomeri utiliza i n compozitele dentare din ntreaga lume[20], fiind un derivat al bisfenolului A (BPA), cu structura ataat (Figura 1). de materiale compozite micro (nano)structurate hibride de tip polimer/ceramic, cu diferi i agen i de ranforsare n concentra ii variabile, cu poten iale aplica ii

Figura 1. Structura chimic a BisGMA i a bisfenol A

Utilizarea la scal larg a BisGMA are la baz propriet ile remarcabile precum rigiditatea moleculei datorate prezen ei grupei bisfenolice, cele dou grupe metil blocnd rotirea liber a moleculei n jurul legturii C6 H4-C-C6H4. Dintre cele mai cunoscute utilizri ale BisGMA se pot aminti adezivii i materialele de umplutur n care polimerul este nso it de alumin i silice(n special), materiale care confer acestuia o rezisten mecanic la solicitare sporit, dar i propriet ile estetice necesare[22]. Polimerizarea monomerului BisGMA a fost realizat prin dou metode diferite: termic (la 70 C) i respectiv chimic (5% peroxid de benzoil raportat la masa de Bis GMA utilizat). Raportul masic Bis-GMA/HA fiind de 1/9. Monomerul a fost dizolvat in izopropanol, omogenizat cu pulberea de hidroxiapatita, evaporare solvent, caracterizarea materialului obtinut. Din punct de vedere morfologic materialul a fost caracterizat prin SEM, TEM si HRTEM. Prin SEM se poate observa c materialul compozit rezultat este omogen, aglomeratele observate avnd dimensiuni submicronice Figura 2.
0

Figura 2. Imagini de microscopie electronic de baleiaj nregistrate pentru compozitele BisGMA/HA polimerizate termic la 70 0C

Imaginile de microscopie electronic prin transmisie (Figura 3), aduc informa ii suplimentare att din punct de vedere al dimensiunii particulelor ct i al formei acestora. Din

punct de vedere al formei, se pot distinge dou forme specifice: alungit, sub forma de plachete datorate n special polimerului provenit din polimerizarea Bis GMA i forme relativ sferice caracteristice hidroxiapatitei. Forma plachetar a polimerului se datoreaz asocierii mai multor molecule de polimer, molecule ce au o structur filiform (sub form de bastonae) datorate succesiunilor de grupri C6H4 CH2 C6 H4. Din punct de vedere dimensional, imaginile de microscopie electronic prin transmisie permit determinarea cu precizie a dimensiunii particulelor constituente. Pe baza acestor determinri, putem spune c materialele pe baz de poli Bis-GMA/HA se ncadreaz n categoria nanocompozitelor.

Figura 3.Imagini de microscopie electronic prin transmisie pentru compozitul Bis GMA-HA ob inut prin polimerizare termic la 70 0C

La nalt rezolu ie, se pot distinge cu claritate planele de cristalizare caracteristice hidroxiapatitei, acestea fiind suficient de stabile n fluxul de electroni pentru a se ob ine imagini foarte clare. Pe baza acestor imagini au fost calculate distan elor interplanare i s-au putut identifica, componentele compozitului. Difrac ia de raze X Difractograma de raze X (Figura 4) confirm prezen a fazelor cristaline, att a hidroxiapatitei (25,7; 28,9; 31,8; 32,06; 32,98; 35,95; 39,89; 46,66; 49,29) ct i prezen a poliBisGMA (22,96; 26,64; 30,33; 34,2), eviden iate de asemenea i n HRTEM.

1000

p o li B is G M A - H A , p o li m e r i z a t te r m ic

800

I, CPS

600

p o li B i s - G M A HA

400

200

10

20

30

40

50

60

70

2 T h e ta

Figura 4. Difractograma de raze X pentru compozitul poli Bis-GMA/HA ob inut prin polimerizare termic

Spectroscopia de absorb ie in IR Spectroscopia de IR (Figura 5), prin picurile caracteristice ale componentelor individuale confirm formarea compozitului poliBisGMA-HA. Picurile caracteristice HA apar la lungimi de und de 567, 601, 1034 cm-1 n timp ce picurile caracteristice poliBisGMA sunt mai pu in intense comparativ cu cele ale HA i apar la 3000, 2950, 2925, 1850, 1724, 1630, 1440, 1300, 1200 cm-1.
6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 Absorbance 3.5 3.0 2.5
567.2 3421.7 1724.6 1511.3 BisGMA-HA 1034.6

2.0
601.0

1.5 1.0 0.5 0.0 4000 3000 2000 W num ave bers (cm -1) 1000
1409.3

Figura 5. Spectrul IR al compozitului poliBisGMA-H ob inut prin polimerizare termic

Analiz termo-gravimetric (ATD-TG) Analiza termo-gravimetric suport mici diferen e func ie de modul de polimerizare. n acest sens, pe curba DTA a compozitului poli Bis GMA/HA ob inut prin polimerizare chimic (Figura 6) se poate observa despicarea picului de la ~ 330 0C comparativ cu cel al poli BisGMA/HA ob inut termic (Figura 7).

D T A (u V ) TG A (% )
20 0

T G A DrTG A 0 % m g/ C
10 0 98 0.0 00 5 0.0 00 0 -0 .0 0 05 -0 .0 0 10 -0 .0 0 15 -0 .0 0 20 -0 .0 0 25 -0 .0 0 30

DrTG A (m g /se c)

15 0

96 94 92 90 88

DTA, uA

10 0

50

-5 0 200 400 6 00 8 00 86 1 00 0

t, C

Figura 6. Curbele DTA-TG nregistrate pentru compozitul; BisGMA-HA, polimerizare chimica cu peroxid de benzoil.
2 50

T G A , D rT G A , 0 % m g/ C
100 98 96 0 .0 0 0 5 0 .0 0 0 0 -0 .0 0 0 5 -0 .0 0 1 0 94 -0 .0 0 1 5 92 -0 .0 0 2 0 90 -0 .0 0 2 5 -0 .0 0 3 0 -0 .0 0 3 5

2 00

1 50

DTA, uV

1 00

D T A (u V ) T G A , (% ) D r T G A ( m g /s e c )

50

0 88 -5 0 20 0 40 0 6 00 8 00 86 10 00

t, C

Figura 7. Curbele DTA-TG nregistrate pentru compozitul; BisGMA-HA, obtinut prin polimerizare termica la 700C.

n cazul polimerizrii chimice respectiv termice, pierderea de mas asociat proceselor caracteristice compozitului sunt aceleai, cu men iunea c n cazul polimerizrii chimice, diferen a care apare este datorat ini iatorului folosit. De altfel, peroxidul de benzoil (i produii de descompunere ai acestuia) apar i pe curbele DTA, ca efecte exoterme. Efectul endoterm, de la ~210 0C nso it de pierdere de mas se datoreaz exclusiv degradrii peroxidului de benzoil. Efectele exoterme, nso ite de pierdere de mas nsemnat (~ 10%) confirm arderea pr ii organice, n dou etape succesive, reac ia de ardere fiind complet. Efectul exoterm ce nu este nso it de varia ie de mas, aprut n cazul polimerizrii chimice poate fi justificat prin reac ia de polimerizare a urmelor de monomer nereac ionate.

Compozite pe baz de APVHA Sinteza compozitelor pe baz de APV i HA se realizeaz conform Figura 8. n acest sens se vor considera trei rapoarte de combinare APV:HA i anume: 4:1; 1:1 i respectiv 1:4. Procesul de dizolvare se efectueaz prin agitare magnetic i, dac e cazul, sub uoar nclzire. Hidroxiapatita se adaug sub form de pulbere. n toate cele trei cazuri men ionate masele de

APV i HA au fost astfel calculate nct s se ob in 2 g compozit; iar volumul solu iei n care sa fcut dizolvarea APV i ulterior omogenizarea HA a fost de 100 ml. Materialele compozite ob inute au fost caracterizate att din punct de vedere compozi ional ct i morfologic. Difrac ia de raze X (
Figura 9) a fost utilizat n scopul identificrii fazelor existente n compozitele ob inute.

Se observ creterea n intensitate a picurilor caracteristice HA precum i diferen ierea net a acestora odat cu creterea con inutului de HA din compozit. Alcoolul polivinilic din compozit apare n difractogram la unghiuri de 2 = 20 i respectiv la ~22; caracterul moderat de cristalinitate fiind eviden iat prin prezen a picurilor largi ale acesteia.
APV Ap distilat

DIZOLVARE HA OMOGENIZARE

USCARE

CARACTERIZARE
Figura 8. Schema de flux de ob inere a compozitelor APV/HA

2000

1500

P V A -H A 4 :1 P V A -H A 1 :1 P V A -H A 1 :4 H A PVA

I, CPS

1000

500

0 10 20 30 40 50 60 70

2 T h e ta

Figura 9. Difractograma de raze X a compozitelor APV-HA avnd con inut diferit de faz mineral.

Spectroscopia de absorb ie n infrarou (Figura 10) ofer informa ii suplimentare inclusiv metodei XRD care este puternic limitat de cristalinitatea fazelor. Spectrele IR ob inute au fost

suprapuse astfel nct s se eviden ieze att picurile caracteristice alcoolului polivinilic ct i al compozitelor APV-HA cu con inut variabil de faz mineral. Urmrind evolu ia intensit ii picurilor caracteristice alcoolului polivinilic (1095, 1254 1374, 1430, 1735, 2941 i 3360 cm-1) i respectiv al hidroxiapatitei (3360, 1033, 634, 602, 565 cm-1).

Figura 10. Spectrele de absorb ie n IR ale compozitelor APV-HA avnd con inut diferit de faz mineral raportate la spectru IR al APV.

Morfologia compozitelor este puternic influen at de raportul masic existent ntre faza mineral i respectiv cea polimeric. Imaginile de microscopie electronic de baleiaj (Figura 11). APV/HA 1:1

APV:HA 1:4

APV:HA 4:1

Figura 11. Imaginile SEM ale compozitelor APV-HA cu con inut variabil de faz mineral

Compozi ia chimic a compozitului induce modificri morfologice nsemnate n special la concentra ii mari de APV. n cazul compozitelor APV-HA cu rapoarte masice ntre componen i de 1:4 i respectiv de 1:1 morfologia materialelor este foarte asemntoare, materialele fiind omogene att din punct de vedere al distribu iei de particule ct i din punct de vedere al distribu iei celor dou faze, putndu-se afirma c cele dou materii prime sunt compatibile. Datorit con inutului ridicat de APV morfologia materialului compozit este foarte asemntoare materialelor polimerice, fiind un material cu aspect fibrilar pronun at. n condi iile uni con inut mult prea mare de faz polimeric, imaginile SEM difer net de cele nregistrate pentru celelalte compozite, materialul avnd un con inut ridicat de fibre, att n masa materialului ct i la suprafa a acestuia. Stabilitatea remarcabil a fibrelor n fascicul se datoreaz

HA existente. Fibrele de APV-HA au diametrul de ordinul 100 250 nm i lungime de ordinul zecilor de m. Compozite pe baz de APV Al2O3 Compozitele au fost ob inute n condi ii identice cu compozitele pe baz de APV-HA. Compozitele ob inute au fost caracterizate prin XRD i SEM. n cazul difractogramelor de raze X nregistrate pentru cele trei compozite (Figura 12), este de remarcat varia ia n cadrul seriei a picurilor de la 10 30 0. Dei domeniul de unghiuri 2=10-30 corespunde alcoolului polivinilic exista diferen e majore ntre aceast regiune n cazul compozitelor APV-HA i APV-Al2O3, excep ie cazul APV-Al2O3 n cazul n care raportul de combinare este 1:1. n cazul n care raportul de combinare APV:Al2O3 este 1:1 i respectiv 4:1 are loc apari ia unui pic suplimentar, larg, la ~ 25 i respectiv 150 ca urmare a modificrilor morfologice care pot fi vizualizate i prin imaginile de microscopie. Ca urmare a interac iilor ce au loc n cazul compozitelor cu rapoarte masice APV-Al2O3 1:1 i respectiv 1:4 restructurarea alcoolului polivinilic are loc diferit ceea ce duce la deplasarea planelor de cristalinitate.
3500 P V A - A l2 O 3000 P V A - A l2 O P V A - A l2 O 2500
3 3 3

4 :1 1 :1 1 :4

A l2 O

- [4 8 0 3 6 6 ]

PVA

I, CPS

2000

1500

1000

500

10

20

30

40

50

60

70

2 T h e ta

Figura 12. Difractograma de raze X a compozitelor APV-Al2O3 avnd con inut diferit de faz mineral.

Imaginile de microscopie electronic de baleiaj (Figura 13) nregistrate pentru compozitele APV-Al2O3 prezint, indiferent de compozi ie dou faze diferite: o faz preponderent polimeric i una compozit. Ponderea celor dou faze este puternic influen at de raportul de combinare. Se observa c n cazul celor 3 compozite raportul de combinare APV:Al2O3 este propor ional cu rapoartele dintre grosimile celor dou faze: polimer:compozit. Morfologia fazei compozite este similar n cazul celor 3 tipuri de compozite APV/Al2O3. Faza compozit a celor trei sorturi de materiale compozite este omogen, faza polimeric ac ionnd ca un agent de legare ntre particule de alumin sau de compozit.

APV-Al2O3 raport de combinare 4:1

APV-Al2O3 raport de combinare 1:1

APV-Al2O3 raport de combinare 1:4

Figura 13. Imagini SEM ale compozitelor APV-Al2O3 ob inute pentru cele 3 compozi ii diferite, la diverse magnifica ii

Compozite pe baz de APV Al2O3 prin metoda hidrotermal n scopul eliminrii celor dou faze distincte, s-a recurs la ob inerea n condi ii hidrotermale a compozitului, pornind de la premisa c, prin nclzire, gruprile hidroxil existente att n alumin (un con inut sczut) ct i n APV (con inut foarte ridicat), vor putea s se cupleze prin formarea unor grupri de tip eteric. n aceste condi ii, compatibilitatea acestor dou materiale va crete semnificativ i probabil faza preponderent polimeric va disprea sau, n cazul n care se lucreaz cu con inut ridicat de Al2O3 se va reduce substan ial. Raportul de combinare polimer:alumin fiind de 1:1. De men ionat este faptul c etapa de dizolvare i omogenizare se realizeaz la 150 0C i se pstreaz aceast temperatur pn la evaporarea a 7580% din apa de reac ie. Etapa de uscare se realizeaz n dou etape succesive: la 100 0C pentru ndeprtarea apei a pn la 90-95% urmat apoi de uscarea final n condi ii normale de temperatur. Materialul ob inut a fost caracterizat n special din punct de vedere al morfologiei i al fazelor ce intr n constitu ia compozitului. Imaginile de microscopie electronic de baleiaj (Figura 14) confirm ob inerea unei faze unice, morfologic foarte asemntor cu cea a fazei preponderent polimerice. Aceleai observa ii au putut fi realizate i vizual, materialul compozit ob inut avnd un aspect translucid, galbenmaroniu.

Figura 14. Imagini SEM ale compozitelor APV-Al2O3 ob inute la 100 0C avnd raportul de combinare 1:1, la diverse mriri

Difractogramele de raze X Difractogramele de raze X (Figura 15) nregistrate pentru APV i respectiv pentru compozitul APV-Al2O3 (raport masic 1:1) ob inut pe cale hidrotermal sunt asemntoare att din punct de vedere al fazelor ct i din punct de vedere al cristalinit ii acestora; mai mult, picurile caracteristice Al2O3 lipsesc din difractograma compozitului datorita hibridului format prin legturi chimice de tip - Al-O-C

3 0 0 0

2 5 0 0

I, CPS

P V A - A l
2 0 0 0

te r m

ic

P V A

1 5 0 0

1 0 0 0

5 0 0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

2 T h e ta

Figura 15. Difractogramele de raze X ale APV i respectiv ale compozitului APV-AL2O3 ob inut pe cale hidrotermal

Spectroscopia IR Spectrele IR ale materialelor APV/Al2O3 obtinute conform ambelor metode descrise anterior sunt prezentate in (Figura 16). Spectrul filmelor APV/Al2O3 obtinute la temperatura camerei prezint principalele benzi carateristice Al2O3 (2918, 2853, 1459 and 1376 cm-1) suprapuse peste benzile caracteristice APV-ului (607, 850, 1095, 1254, 1333, 1375, 1431, 1735, 2905, 2941 and 3361cm-1). Spectrul filmului ob inut n condi ii hidrotermale prezint att benzile de absorb ie ale Al2 O3 ct i cele ale APV (ns intensit i relative diferite) precum i benzi de absorb ie noi centrate la 1024 i 1050cm-1 [119]. Intensitatea relativ mai sczut a benzilor corespunztoare Al2O3-ului din filmul hibrid ob inut n condi ii hidrotermale, corelat cu apari ia benzilor Al-O-C sugereaz formarea legturii chimice dintre alumin i APV.

Figura 16. Spectrele IR ale filmelor APV-Al2 O3

Teste biologice Toate testele biologice efectuate pe probele pe baza de APV i Al2O3 prezint o citotoxicitate sczut. Citotoxicitatea crete puin odat cu creterea concentraiei de Al2O3; diferena fiind cel mai probabil datorit desprinderii particulelor de alumin din material (Figura 17).

Figura 17.a. Analiza citotoxicitatii asupra celulelor HCT8 prin flowcitometrie; b. Nivelul de citotoxicitate testate pe celule HCT8; A, B. Distributia ciclului cellular in cazul celulelor diploide umane (cuantificarea dupa modelul Dean-Jett-Fox).

Distributia ciclului celular al celulelor eucariote arat c APV induce o uoar scdere a ponderii de celule in faza S (12.83 vs. 8.40 pentru PVA sau 8.33 pentru PVA-Al2O3), in timp ce in faza G1 i G2 o cretere uoar.

II. MATERIALE COMPOZITE HIBRIDE TERNARE Materiale compozite hibride de tip colagen/hidroxiapatita/magnetita Magnetita este una dintre cele mai studiate materiale magnetice datorit aplica iilor biomedicale: imagistic de rezonan magnetic (MRI), agent de contrast magnetic [121]; eliberare controlat i purttor de medicamente [122, 123] i hipertermie [124].
Nanoparticule magnetice

Diagnoz (MRI)

Terapie

Eliberare controlat i transportor de medicamente

Figura 18. Aplica iile nanoparticulelor magnetice

Hipertermie

n cazul tratamentului cancerului osos, de obicei, prima etap const n ndeprtarea chirurgical a esutului osos tumoral [125]. Dup interven ia chirurgical, defectul osos rezultat este umplut cu material de umplutur cu rol regenerativ sau, mai bine, cu materiale regenerative care con in magnetit i/sau citostatice. n majoritatea cancerelor gradul de recuren este destul de mare n special datorit ndeprtrii par iale a esutului tumoral. Acesta este scopul pentru care interven ia chirurgical este asociat cu chimio/radioterapie. Ob inerea i caracterizarea materialelor compozite COL/HA-Fe3O4 Ob inerea i caracterizarea nanoparticulelor de magnetit Prima etap n ob inerea materialelor compozite de tipul COL/HA-Fe3O4 o reprezint punerea la punct a metodei de sintez a particulelor de magnetit de form i dimensiuni prestabilite eventual, n cazul ob inerii unei magnetite neuniforme (dimensional sau din punct de vedere al formei) frac ionarea acestei mase de reac ie i re inerea fazei de interes. Nanoparticulele de magnetit au fost ob inute prin precipitare pornind de la precursori de Fe i Fe3+, mediul de reac ie slab bazic fiind realizat de NaOH. Au fost ob inute mai multe arje de magnetit, cu caracteristici diferite, acestea putnd fi utilizate n diverse scopuri. n cazul n care, se dorete producerea hipertermiei n locul unde s-a implantat materialul (adic nu se impune transportul nanoparticulelor de magnetita prin aplicarea diverselor cmpuri electromagnetice care s induc migrarea acestora spre locul unde se va produce hipertermia) se pot utiliza, cu rezultate foarte bune, nanoparticule sferice ob inute prin coprecipitare, stabilizate sau nu cu diveri agen i tensioactivi. Caracterizarea nanoparticulelor Imaginile TEM au fost ob inute pe probele fin mojarate utiliznd un microscop electronic prin transmisie de nalt rezolu ie TECNAITM G2 F30 S-TWIN echipat cu detector STEM HAADF, EDX i EELS. Pentru o bun vizualizare a particulelor de magnetit ob inut se impune studierea acestor particule cu ajutorul microscopului electronic prin transmisie (Figura 19). Pot fi astfel ob inute informa ii referitoare la forma i dimensiunea acestora. Pot fi astfel identificate dou tipuri de magnetit: sferic i cilindric (sub forma de bastonae). Ob inerea magnetitei cilindrice poate fi pus n eviden doar n condi iile n care sinteza este realizat n prezen a cmpului magnetic. Dimensiunea particulelor sferice de magnetit variaz de la ~ 5nm i pn la 20 nm, diametrul mediu al acestor particule fiind 10 12 nm, n timp ce, n cazul particulelor cilindrice, acestea pot atinge pn la 50 nm n lungime, diametrul fiind apropiat de cel al particulelor sferice.
2+

a)

b)

c)

d)

Figura 19. a, b, c) imagini TEM la diverse mriri i d) imagine HRTEM a nanoparticulelor de magnetit

Ob inerea i caracterizarea materialelor compozite COL/HA-Fe3O4 Gelul de colagen utilizat a fost ob inut n cadrul INCDTP Suc. ICPI pornind de la piele bovin prin extrac ie chimic i enzimatic, concentra ia gelului fiind 1,6 iar pH-ul gelului 7. Ob inerea materialelor compozite COL/HA-Fe3O4 Mineralizarea gelului de colagen are loc n dou etape, n scopul mimrii ct mai fidel a osteosintezei naturale [126]. n prima etap, suspensia de hidroxid de calciu (Fluka) este adugat peste gelul de colagen i lsat s interac ioneze timp de 24h. n etapa a doua, peste masa de reac ie ob inut n etapa I, se adaug solu ia de fosfat diacid de sodiu ceea ce duce la precipitarea hidroxiapatitei. Cantit ile de gel de colagen i precursori de HA au fost astfel adugate nct s se ob in un material compozit cu raportul masic COL:HA = 1:4; pH-ul de precipitare final fiind ~ 9 i se ob ine prin adugare de solu ie de NaOH sau HCl diluat. n cazul ob inerii compozitelor COL/HA-Fe3O4 materialul compozit ob inut dup mineralizarea gelului de colagen este amestecat cu cantitatea adecvat de magnetit, particulele de magnetit fiind ob inute prin precipitare, aa cum a fost prezentat, pornind de la FeCl3 i FeSO4, la pH 9. Pe parcursul sintezei materialelor compozite de tip COL/HA-Fe3O4, temperatura a fost termostatat la 352C; uscarea materialului fiind realizat prin liofilizare.

Caracterizarea materialelor compozite COL/HA-Fe3O4 Materialele ob inute au fost caracterizate prin difractie de raze X, spectroscopie IR i microscopie electronic de baleiaj. Hipertermia a fost ob inut prin interac ia dintre materialele compozite ob inute i cmpul electromagnetic ob inut prin trecerea unui curent electric de frecven 150 kHz printr-o bobin orizontal. Compozi ia materialului compozit a fost confirmat prin analizele nregistrate: XRD, FTIR, EDS i ATD-TG. Difrac ia de raze X (Figura 20) confirm prezen a hidroxiapatitei i a magnetitei prin picurile caracteristice acestora: HA (2Theta = 25.90, 28.96, 31.79, 32.21, 32.92, 34.09, 39.82, 46.73 i 49.53) i magnetita (2Theta = 30.04, 35.43, 43.05, 56.94 i 62.52) (Figura 20).
I, CPS
500

H y d r o x y a p a t ite ( A S T M [7 4 - 5 0 6 6 ]) M a g n e tite ( A S T M [8 2 - 1 5 3 3 ])

400

300

200

100 10 20 30 40 50 60 70 80

2 T h e ta

Figura 20. Difractograma de raze X nregistrat pentru materialul compozit COL/HAFe3O4 ce con ine 2% magnetit

Imaginile SEM au fost ob inute la mriri diferite i sunt prezentate n Figura 21. La mriri moderate, materialele prezint o foarte bun omogenitate fiind foarte asemntoare cu morfologia materialelor compozite COL/HA. La mriri relativ mari, datorit interac iilor ce se dezvolt ntre colagen i magnetit, n masa materialului compozit putndu-se identifica cristale aciculare (cilindrice) (Figura 21. e,f). Dimensional, cristalele aciculare au lungimea n domeniul micronic iar diametrul este de 100 300 nm. Formarea structurilor aciculare poate fi explicat pe baza metodei de sintez prezentate anterior. Dup adugarea suspensiei de Ca(OH)2 pH-ul devine bazic i procesul de fibrilogenez ncepe [127]. La adugarea particulelor de magnetit, moleculele de colagen sunt asociate n fibrile i fibre i ac ioneaz drept surfactan i pentru stabilizarea magnetitei. Comparnd acest caz cu cazul stabilizrii magnetitei cu anionul citrat se poate observa o modificare a morfologiei materialului compozit. Daca n cazul stabilizrii cu acid citric particulele de magnetit sunt sferice n cazul stabilizrii n prezen de colagen conduce la o morfologie acicular datorit faptului c fibrilele i fibrele de colagen sunt mai mari dect n cazul citratului i ca urmare n jurul particulelor de magnetit se ataeaz doar cteva fibrile i fibre de colagen (prin interac ii electrostatice).

Figura 21. Imaginile SEM nregistrate pe materialele compozite COL/HA-Fe3O4

Teoria sus men ionat este de altfel confirmat i de analizele EDS (Figura 22). n acest scop au fost nregistrate, la aceleai mriri, spectrele EDS att n zonele aciculare ct i n zonele lipsite de forma iunile aciculare. Dei analiza are un caracter semicantitativ datorit con inutului sczut de magnetit spectrele nregistrate sunt sugestive. Prezen a ferului poate fi vizualizat n spectrul EDS al materialului compozit la 6,3keV nregistrat n zona acicular n timp ce n cazul zonelor lipsite de forma iuni aciculare aceast band lipsete.

Figura 22. Spectrele EDS ale materialelor compozite COL/HA-Fe3O4 nregistrate ntr-o: a) zon bogat n forma iuni aciculare i b) zon lipsit de forma iuni aciculare

Spectrul de absorb ie n infrarou, nregistrat pentru compozitul COL/HAFe3O4 confirm prezen a benzilor caracteristice ale componen ilor (Figura 23), benzi care uneori se suprapun. n scopul identificrii acestor benzi suprapuse s-a recurs la deconvolutarea spectrului. Dup deconvolu ie, n domeniul 4001800 cm-1 pot fi identificate att benzile de absorb ie

caracteristice ale compozitului COL/HA [126] ct i benzile caracteristice magnetitei (713, 878, 962, 1082 i 1450cm-1).

Figura 23. a) Spectrul IR al materialului compozit a) COL/HA-Fe3O4 i b) spectrul deconvolutat al materialului compozit COL/HA-Fe3O4 (domeniu 750 2000cm-1)

Materialele compozite ob inute au fost analizate din punct de vedere al hipertermiei produse (Figura 24). Deoarece nu a fost posibil eliminarea temperaturii datorate efectului capacitiv, temperatura datorat hipertermiei a fost ob inut prin diferen , ntre temperatura rezultat, n condi ii identice, att n cazul materialului compozit COL/HA ct i a materialului compozit COL/HA-Fe3O4. n condi iile sus prezentate, temperaturile materialelor a ajuns la 49,5 i respectiv 39,5 0C ceea ce nseamn c efectul inductiv, datorat nclzirii magnetitei ca urmare a interac iei cu cmpul electromagnetic este de ~10 0C, pentru cazul materialului compozit care con ine 7% magnetit.

Figura 24. Imaginile n infrarou nregistrate n cmp electromagnetic a) n prezen a materialului compozit COL/HA i b) n prezen a materialului compozit COL/HA-Fe3O4 n toate cazurile, determinarea temperaturii produse prin hipertermie este determinat n condi ii identice pentru a limita la maxim erorile experimentale, n acest scop, materialele fiind pstrate 1 h la aceeai temperatur (37 0C). Dup termostatare, materialele au fost introduse n cmp electromagnetic (frecven a curentului alimentat fiind 150 kHz) iar temperatura a determinat dup 5, 10, 15, 20, 30 i 60 minute. n toate cazurile studiate (materiale compozite cu con inut diferit de magnetit: 1, 2, 5%) se observ c creterea con inutului de magnetit duce la creterea hipertermiei produse, aa cum reiese din Figura 25.

46 45 44 43 42 41 40 39 38 37 36 0 10 20 30 time, min

Temperature, grd

COLL/HA-Fe3O4 1% COLL/HA-Fe3O4 2% COLL/HA-Fe3O4 5%

40

50

60

Figura 25. Dependen a creterii de temperatur datorate hipertermiei n cazul materialelor compozite COL/HA-Fe3O4 cu con inut variabil de magnetit cu timpul de iradiere

Este demn de men ionat c utilizarea aceluiai tip de nanoparticule magnetice (din punct de vedere al dimensiunii i formei nanoparticulelor) concentra ia poate influen a efectul termic rezultat ca urmare a aplicrii cmpului electromagnetic produs de trecerea curentului alternativ de frecven 150 kHz printr-o spiral special construit n acest sens. Chiar i n propor ii mici de magnetit, hipertermia poate fi eviden iat utiliznd o camer de msur cu IR, n toate cazurile, hipertermia produs fiind adecvat pentru tratarea cancerului osos, timpii de aplicare a cmpului electromagnetic fiind varia i func ie de concentra ia nanoparticulelor de magnetit. De asemenea, utilizarea unei magnetite nestabilizate va permite dizolvarea n timp a acesteia i metabolizarea acesteia n timp ce materialul compozit rezultat va asista regenerarea normal a esutului vtmat. Sisteme multifunc ionale colagen/cisplatin i colagen/hidroxiapatit/cisplatin Sistemele cu eliberare controlat sunt deosebit de utilizate n aplica ii medicale datorit reducerii toxicit ii sistemice [128, 129], n special. Avantajul sistemului COL/HA/cisplatin provine din multifunc ionalitatea sistemului i anume rol regenerativ datorit suportului compozit COL/HA i respectiv antitumoral datorit prezen ei cisplatinului. Tratarea cancerului osos presupune interven ia chirurgicala de ndeprtare a esutului osos tumoral (Figura 26) [130]. n func ie de gravitate, defectul osos produs poate varia n limite foarte largi. Dei organismul are mecanisme proprii de vindecare, n multe cazuri, datorita atingerii unor dimensiuni critice ale defectului se impune utilizarea unor substituen i de os [131]. Datorit faptului c, n foarte multe cazuri gradul de recuren este foarte mare, este de preferat ca substituentul osos care se implanteaz sa aib poten iale activit i antitumorale de lung durat (magnetit i nanoparticulele de Au i/sau Ag). n prezent, au fost ob inute i caracterizate sistemele simple COL/HA/cisplatin. n acest caz ac iunea antitumoral a sistemului antitumoral este datorat doar eliberrii cisplatinului, fr a fi posibil aplicarea hipertermiei (vezi Figura 26).

Figura 26.Reprezentarea schematic a etapelor de tratament a cancerului osos n cazul osteosarcomului [130]

Caracterizarea prealabil a cisplatinului utilizat Cisplatinul (Figura 27) face parte din clasa citostaticelor derivate de platin fiind descoperit nc din 1845 de ctre M. Peyrone i aprobat de FDA pentru aplica ii medicale n 1978 [132].

Figura 27. Cisplatinul (Sarea lui PEYRONE)

Cisplatinul este un antineoplazic citostatic, imunosupresiv si radiosensibilizant din clasa citostaticelor pe baza de platina. Produsul actioneaza ca alchilant bifazic, inhiba selectiv si preferential sinteza ADNului si mai putin a ARNului; nu are specificitate de faza a ciclului celular. Cisplatinul poate fi cuantificat prin diverse metode instrumentale de la clasicele determinri spectrofotometrice n domeniul UV-Vis [133] i pn la metodele moderne [134] (spectroscopie de absorb ie atomic, spectrometrie de mas sau spectrometrie de mas cu plasm cuplat inductiv). Spectrul de absorb ie n UV-VIS prezint un maxim de absorb ie la 300nm (Figura 28), acest pic putnd fi utilizat n determinrile cantitative ale cisplatinului. Domeniul de linearitate al cisplatinului (determinarea cisplatinului fiind efectuat la 300nm) este de aproximativ 3 ordine de mrime (~10 M 2mM).

Figura 28. Spectrul de absorb ie n UV-VIS al solu iei de cisplatin 1mM

Spectrul IR al cisplatinului este redat n Figura 29. Este deosebit de important de men ionat faptul c benzile caracteristice cisplatinului nu se suprapun cu cele ale suportului propriu-zis [135, 136], spectrele putnd fi utilizate n determinarea semi-cantitativ a con inutului de cisplatin.

Figura 29. Spectrul IR al cisplatinului

Sinteza materialelor multifunc ionale de tip COL/cisplatin i COL/HA/cisplatin Materialele multifunc ionale au fost ob inute prin adsorb ia cisplatinului pe matricile compozite COL/HA ob inute. Matricile compozite COL/HA au fost ob inute conform unei metodologii publicate n cadrul colectivului nostru cu men iunea c, materialul rezultat dup mineralizare a fost reticulat cu glutaraldehid, splat cu ap distilat pentru ndeprtarea srurilor rezultate n procesul de precipitare (Schema 1). Au fost astfel ob inute o serie de materiale multifunc ionale compozite n care s-a variat att morfologia suportului ct i con inutul de cisplatin. Metoda uscrii mixte a permis ob inerea unor materiale cu porozit i diferite i evident, procese de eliberare controlat diferite, materialele poroase permi nd eliberarea mai rapid a medicamentului. De asemenea, au fost ob inute i caracterizate materiale multifunc ionale cu con inut variabil de cisplatin (0,1%, 2% i 10%). Caracterizarea fizico-chimic a materialelor i eliberarea a fost studiat pentru toate materialele multifunc ionale COL/HA/cisplatin, iar activitatea antitumoral a fost testat doar pentru materialul multifunc ional mai complex, COL/HA/cisplatin, finalitatea acestor studii fiind aceea de a ob ine sisteme multifunc ionale mult mai complexe, ce includ i nanoparticule de magnetit i Au i/sau Ag precum i substan e cu activitate analgezic i antiinflamatorie.

Colagen

1. Ca(OH)2 2. NaH2PO4

Mineralizare COL/HA

Glutaraldehid Reticulare SBF Splare citostatic Adsorb ie de citostatic

Uscare

Caracterizare

Schema 1. Fluxul tehnologic de ob inere a sistemelor multifunc ionale COL/HA/cisplatin

Caracterizarea materialelor multifunc ionale Spectroscopia de absorb ie n IR permite analiza materialelor multifunc ionale COL/HA/cisplatin att din punct de vedere al materialului suport ct i din punct de vedere al substan ei cu rol antitumoral, avnd ca referin cisplatinul pur (Figura 30). Astfel, se pot distinge benzile de absorb ie caracteristice ale colagenului (1650 cm-1 corespunde amidei I, C=O; 1541 cm-1 corespunde amidei II (NH ntindere, CN deformare), 1420 cm-1 corespunde vibra iilor de deformare a legturii CN; 1235 cm-1 corespunde amidei III (vibra iile de deformare a legturii CN, ntindere NH), 2859 cm-1 (CH2) asimetric; 2927 cm-1 (CH2) simetric; 2957 (CH3) simetric) i respectiv al hidroxiapatitei (1 ntindere simetric PO (962 cm-1); 4 banda triplu degenerat OPO (604, 566, 487 cm-1); 3 PO ntindere antisimetric, triplu degenerat (1035, 1087, 1110 cm-1)) pentru toate materialele multifunc ionale ob inute, chiar dac unele dintre benzile men ionate pot fi identificate doar prin deconvolu ie.

Figura 30. Spectrele IR ale dou materiale multifunc ionale de tipul COL/HA/cisplatin raportate la spectrul IR al cisplatinului pur

La fel ca n cazul materialelor compozite COL/HA simple, sistemele multifunc ionale con in i hidroxiapatit carbonatat, prezen a carbonatului fiind explicabil pe baza absorb iei dioxidului de carbon din aer i poate fi dovedit pe baza benzilor de absorb ie de la 1340 (3
2CO3 ) i 895 (2 CO 2- ). n func ie de concentra ia de agent antitumoral, intensitatea benzilor 3

caracteristice cisplatinului difer n raport cu intensitatea benzilor materialului compozit suport, n raport linear cu concentra ia, dei la concentra iile de 2% cisplatin, cuantificarea este posibil doar dup deconvolu ie. Datorit interferen elor Rontgen produse att de HA ct i de cisplatin difrac ia de raze X poate fi utilizat n analiza materialelor multifunc ionale COL/HA-cisplatin.

Figura 31. Difractograma de raze X nregistrat pentru materialul multifunc ional COL/HA-cisplatin

Difractograma de raze X (Figura 31) poate fi uor interpretat pe baza fielor ASTM corespunztoare hidroxiapatitei (74-5066) i respectiv cisplatinului (74-0950). Picurile caracteristice hidroxiapatitei i respectiv cisplatinului nu sufer deplasri semnificative fa de pozi iile picurilor componentelor pure ns, picurile cisplatinului, excep ie picurile de la ~ 14,3 i 20.3, se suprapun peste picurile HA i nu pot fi identificate. Dac n cazul materialului multifunc ional COL/HA-cisplatin avnd un con inut de 10% cisplatin se pot identifica par ial picurile de interferen rontgen n cazul materialelor multifunc ionale cu con inut mai sczut de cisplatin aceste picuri nu pot fi decelate. Microscopia electronic de baleiaj este utilizat n analiza morfologic att a materialelor multifunc ionale COL/cisplatin ct i a materialelor multifunc ionale COL/HA-cisplatin.

Figura 32. Imagini SEM caracteristice materialelor multifunc ionale COL/cisplatin (1% cisplatin)

Morfologia materialelor COL/cisplatin (Figura 32) este practic identic cu cea a matricilor colagenice de la care s-a pornit, adsorb ia cisplatinului neavnd nici influen asupra suportului colagenic. Aglomeratele de cisplatin pot fi uor vizualizate ca fiind puncte albe intense prin SEM utiliznd detectorul de electroni retromprtia i backscattering. n cazul matricilor multifunc ionale compozite COL/HA-cisplatin morfologia se modific semnificativ fa de matricile multifunc ionale COL/cisplatin datorit depunerii unei cantit i nsemnate de faz mineral, raportul colagen:hidroxiapatit fiind de 1:4 (Figura 33). Per ansamblu, morfologia materialului este foarte asemntoare cu morfologia materialelor compozite COL/HA ns, la concentra ii mari de cisplatin, se pot distinge zone bogate n cisplatin, cu morfologie diferit (Figura 33f).

a)

b)

c)

d)

e)

f)

Figura 33. Imagini SEM caracteristice materialelor multifunc ionale COL/HA-cisplatin

Studii de eliberare a cisplatinului din materialele multifunc ionale

Studiile de eliberare au fost efectuate n SBF astfel nct a reproduce ct mai bine condi iile n vivo. Aceste studii au fost realizate n special din perspectiva aplicrii acestor sisteme n tratarea cancerului (cercetrii aplicative) i ntr-o mai mic msur din punct de vedere al cercetrii fundamentale. Studiile de eliberare au indicat faptul c, n toate cazurile de materiale multifunc ionale COL/cisplatin i respectiv COL/HA-cisplatin n decursul primei zile se elibereaz ~ 78-85% din con inutul total de cisplatin, fiind mai avansat n cazul matricilor multifunc ionale COL/cisplatin dect n cazul materialelor multifunc ionale compozite COL/HA/cisplatin, probabil datorit unor interac ii mai puternice ce se dezvolt ntre HA i cisplatin. n contextul integrrii acestor materialelor multifunc ionale de tip colagen/cisplatin i colagen/hidroxiapatit/cisplatin n sistemele mult mai complexe propuse n planul de realizare al proiectului, aten ia a ndreptat n special n direc ia controlului vitezei de eliberare. Viteza de eliberare este puternic dependent de temperatur, aa cum reiese din Figura 34 i Figura 35.

Figura 34. Influen a nclzirii asupra vitezei de eliberare a cisplatinului din materialele multifunc ionale de tip COL/HA-cisplatin

Figura 35. Influen a rcirii asupra vitezei de eliberare a cisplatinului din materialele multifunc ionale de tip COL/HA-cisplatin

Evaluarea potentialului citotoxic pe linii celulare de osteoblaste normale i din osteosarcom n prezenta sistemului cu eliberare controlat

Citotoxicitatea cisplatinului incorporat n sistemul cu eliberare controlat a fost evaluata prin realizarea testului LDH pe mediile de cultura mentinute n contact cu osteoblastele fetale (Figura 36) i de osteosarcom (Figura 37), test care permite stabilirea gradului de compromitere a integritatii membrane celulare i,implicit, a potentialului de inducere a mortii celulare.
LDH hFOB
0 .3

c ontrol 6M cisplatin 10M c isplatin

DO 495nm

0 .2

0 .1

0 .0

control

10

Figura 36. Evaluarea efectului compozitului colagen-hidroxiapatita fara cisplatin (control) i cu cisplatin incorporat (in concentratii de 6M i 10M) asupra eliberarii LDH n mediul de cultura de catre celulele hFOB 1.19

L D H- G 2 9 2
0 .3

DO495nm

0 .2

c ontr ol 6M c isplatin 10M c isplatin

0 .1

0 .0

control

10

Figura 37. Evaluarea efectului compozitului colagen-hidroxiapatita fara cisplatin (control) i cu cisplatin incorporat (in concentratii de 6M i 10M) asupra eliberarii LDH n mediul de cultura de catre celulele G292

Rezultatele obtinute demonstreaza ca n cazul ambelor linii celulare se inregistreaza o reducere a viabilitatii celulare ce este direct proportional cu concentratia citostaticului inglobat n matricile cu eliberare controlat. Citotoxicitatea sistemelor cu eliberare controlat a fost pusa n evidenta i prin evaluarea densitatii i morfologiei celulare ca rezultat al marcarii citoscheletului actinic al osteoblastelor cu faloidina-TRITC (Figura 38 i Figura 39). Osteoblastele fetale umane crescute n mediul de extractie al compozitului colagen-hidroxiapatita manifesta o citomorfologie tipica cu un citoschelet actinic bine evidentiat i o densitate celulara corespunzatoare unei culturi normale n faza exponentiala de crestere (Figura 38. A). In prezenta sistemului cu eliberare controlata (Figura 38. B i C), densitatea celulara scade proportional cu cresterea concentratiei de citostatic ceea ce reflecta inducerea mortii celulare de catre acesta. Mai mult, morfologia celulara se modifica n sensul ca celulele se micsoreaza gradat, fibrele de stres sunt mai putin evidente iar nucleii dobandesc n multe celule aspectul unei inflorescente asemanatoare corpilor apoptotici ce sunt caracteristici mortii celulare prin apoptoza.

(A)

(B)

(C)
Figura 38. Efectul compozitului colagen-hidroxiapatita fara cisplatin (A) i cu cisplatin incorporat n concentratii de 6M (B) i 10M (C) asupra morfologiei i densitatii osteoblastelor fetale hFOB 1.19. Marcarea actinei citoscheletale cu faloidina-TRITC.(x16)

Dupa cum se remarca n Figura 39A, compozitul colagen-hidroxiapatita nu influenteaza morfologia celulara, osteoblastele din osteosarcom prezentand o morfologie tipica: poligonala i usor alungita. La concentratii de cisplatin de 6 M (Figura 39B) densitatea celulara este redusa, fenomen ce se accentueaza la concentratia de 10 M (Figura 39C) ca rezultat al mortii celulare suferite de celule n prezenta sistemului cu eliberare controlat. In plus, morfolagia celulara care este expresia gradului de sanatate a celulelor se modifica n special la doza mare de cisplatin cand se constata aparitia nucleului fragmentat, micsorarea celulelor i absenta fibrelor de stres, fapt ce denota slabirea interactiilor dintre celule i suportul de crestere.

(A)

(B)

(C)
Figura 39. Efectul compozitului colagen-hidroxiapatita fara cisplatin (A) i cu cisplatin incorporat n concentratii de 6M (B) i 10M (C) asupra morfologiei i densitatii celulelor de osteosarcom G292. Marcarea actinei citoscheletale cu faloidina-TRITC.(x16)

Per ansamblu, osteoblastele normale par a suferi modificari morfologice mai putin pronuntate comparativ cu celulele din osteosarcom ce par a fi mai sensibile la sistemele cu eliberare controlat.

Evaluarea potentialului proliferativ al osteoblastelor normale i din osteosarcom n prezenta sistemului cu eliberare controlat

Cele mai comune citostatice actioneaza prin uciderea celulelor care se divid rapid, una dintre proprietatile principale ale majoritatii celulelor canceroase. Studiul prezentat si-a propus evaluarea potentialului proliferativ al osteoblastelor normale i din osteosarcom n prezenta sistemului cu eliberare controlat prin cuantificarea numarului de celule viabile metabolic active folosind testul MTT i prin determinarea nivelului de expresie a PCNA printr-un studiu Western blot.
M T T - hFO B
0.4

c o n tro l 6 M c isp la tin 1 0 M c isp la tin

DO550nm

0.3 0.2 0.1 0.0

control

10

Figura 40. Rata de supravietuire a celulelor hFOB 1.19 sub influenta compozitului colagen-hidroxiapatita fara cisplatin (control) i cu cisplatin incorporat (in concentratii de 6M i 10M)

Dupa cum reiese din Figura 40, viabilitatea celulelor hFOB 1.19 s-a diminuat de la 100% sub influenta compozitului colagen-hidroxiapatita la 53% i 44% n prezenta sistemului cu eliberare controlat cu 6 M i respectiv 10 M cisplatin.

M T T -G 2 9 2
0.4

DO550nm

0.3 0.2 0.1

c ontro l 6M c isplatin 10M c isplatin

0.0

control

10

Figura 41. Rata de supravietuire a celulelor G292 sub influenta compozitului colagen-hidroxiapatita fara cisplatin (control) i cu cisplatin incorporat (in concentratii de 6M i 10M)

Osteoblastele din osteosarcom s-au dovedit usor mai putin influentate din punct de vedere al numarului de celule metabolic active n raport cu osteoblastele fetale (Figura 41). Astfel, viabilitatea celulara a inregistrat o reducere de la 100% sub influenta compozitului colagenhidroxiapatita la 58% i 48% n prezenta sistemului cu eliberare controlat cu 6 M i respectiv 10M Pentru a avea o imagine cat mai completa n ce priveste efectul sistemelor cu eliberare controlat asupra potentialului proliferativ al osteoblastelor normale i din osteosarcom s-a realizat un studiu de determinare a expresiei proteice a ANPC. Acesta este o proteina de 36 kDa identificata ca o proteina auxiliara a DNA polimerazei. Distributia sa prin ciclul celular creste n faza G1, atingand un peak n faza G1/S i inregistrand o scadere n faza G2. Proteina nu poate fi detectata prin metode imunocitochimice n celulele n faza M i latente, fapt ce explica importanta sa ca marker de proliferare. La inceputul fazei S, ANPC are o distributie granulara fiind absent n nucleoli, iar la sfarsitul fazei S predomina n nucleoli. Analiza Western blot a expresiei proteice a ANPC a demonstrat un nivel de expresie aproape constat al ANPC n celulele aflate sub influenta compozitului colagen-hidroxiapatita i n prezenta sistemului cu eliberare controlat cu 6 M cisplatin, valoare ce este comparabila i cu celulele crescute n mediul de crestere uzual. Atat n osteoblastele fetale, cat i din osteosarcom se remarca o reducere a nivelului sau de expresie n prezenta sistemelor cu eliberare controlat cu 10 M cisplatin (Figura 42). Aceasta reducere este mult mai evident n cazul celulelor hFOB 1.19, sugerand ca ele sunt mai puternic afectate din punct de vedere al perturbarii ciclului celular.

Figura 42. Analiza Western blot privind efectul compozitului colagen-hidroxiapatita: fara cisplatin (linia 2) i cu cisplatin incorporat n concentratii de 6M (linia 3) i 10M (linia 4) asupra nivelului de expresie proteica a PCNA. Linia 1: cultura n mediul de crestere uzual

Evaluarea potentialului apoptotic al osteoblastelor normale i din osteosarcom n prezenta sistemului cu eliberare controlat

Actiunea citostatica a substantelor chimioterapeutice se manifesta nu numai prin limitarea potentialului proliferativ ci i prin inducerea mortii celulare. Celulele sufera 2 forme principale de moarte celulare: apoptoza i necroza. Spre deosebire de necroza, care este o forma de moarte celulara ce se sustrage descompunerii de catre fagocite conducand la debriuri celulare, apoptoza este o forma de moarte celulara programata, mediata printr-un program intracelular i care trimite semnale chimice sistemului imun. Prezentul studiu a urmarit evaluarea influentei sistemelor cu eliberare controlat asupra potentialului apoptotic al osteoblastelor fetale i din osteosarcom prin determinarea nivelelor de expresie ale doi dintre mediatorii importanti ai apoptozei celulare: supresorul tumoral p53 i caspaza 3. Proteina p53 este un factor de transcriptie care regleaza expresia unei largi varietati de gene implicate n oprirea ciclului celular i apoptoza celulara ca raspuns la stres genotoxic sau celular. In cadrul procesului de malignizare, instabilitatea genomica este factorul principal, iar proteina p53, prin reglarea raspunsului celular normal la leziunile DNA i la alte insulte celulare, indeplineste un rol central n controlul cresterii i diviziunii celulare, functionand ca un guardian of the genome. Este bine cunoscut ca proteina p53 este stabilizata prin fosforilarea de catre o kinaza inductibila de leziunile DNA - ATM kinaza (ataxia telangiectasia-mutated), iar p53 fosforilat este rezistent la proteoliza ubiquitin-dependenta. Deoarece proteina 53 este un puternic inhibitor al cresterii celulare, functiile ei sunt inalt controlate pentru a permite o crestere i dezvoltare normala. Controlul p53 este extrem de complex i se realizeaza prin reglarea sa la nivel transcriptional i post-translational. Inductia rapida a p53 ca raspuns la multiple forme de stres are loc prin mecanisme post-translationale, conducand la stabilizarea i activarea proteinei p53. In stare wild-type care nu a suferit mutatii, proteina p53 este produsul unei gene supresor de tumori, func ionnd ca un reglator negativ al diviziunii celulare, ce se gsete intracelular n celule normale i esuturi la nivele foarte scazute. Cand apar muta ii punctiforme la nivelul unor secvente inalt conservate din gena p53, este exprimata o proteina mutant care manifesta caracteristicile unui produs oncogenic activat. Proteinele p53 mutant i wild-type se deosebesc pe baza reactivitatii diferite fata de anticorpi monoclonali. Proteinele p53 mutant sunt prezente n concentratii mari n aproape toate clasele de tumori umane i n unele linii celulare tumorale n cultura. In general, proteinele p53 mutant au un t1/2 mai lung decat wild-type ceea ce permite formelor mutant sa se acumuleze n concentratii detectabile n acele tumori i linii celulare tumorale asociate cu o oncogena p53 activata. In contrast, p53 wild-type nu se acumuleaza n mod normal i nu este usor detectabila.

Proteazele detin un rol central n faza de executie a apoptozei, iar caspazele, o familie de cistein proteaze, sunt de importanta majora [137]. Proteazele sunt n general sintetizate ca precursori inactivi care necesita activare, cel mai adesea prin proteoliza limitata, constituind deci, ele insele substrat pentru proteaze. O asemenea semnalizare prin proteaze, ca o cale de transducere a unui semnal, este de aceea ireversibila, astfel diferentiindu-se de alte mecanisme de semnalizare [138]. Datorita acestei ireversibilitati, semnalizarea proteazica este o modalitate eficienta de omorare a unei celule, avand n vedere faptul ca odata initiat programul, moartea celulara nu mai poate fi reversata sau prevenita. Caspazele pro-apoptotice pot fi impartite n caspaze initiatoare (2, 8, 9 i 10) i caspaze efectoare (3, 6 i 7), n functie de rolul lor n procesul apoptotic [139]. Activarea caspazelor initiatoare constituie probabil punctul critic din intreaga cale apoptotica. Exista doua cai majore de activare a caspazelor, calea extrinseca i calea intrinseca. In calea extrinseca, legarea liganzilor mortii din familia TNF (tumor necrosis factor) conduce la oligomerizarea receptorilor. Acestia leaga apoi proteine adaptor formand astfel complexul DISC (death-inducing signalling complex), care serveste ca platforma de activare pentru caspazele 8 i 10. Calea intrinseca sau mitocondriala este declanat de stresul celular, care determina activarea membrilor proapoptotici ai familiei Bcl-2. Caspazele ini iatoare sunt recrutate prin intermediul domeniilor lor de recrutare, ca DED (caspazele 8 i 10) sau CARD (caspaza 9), la nivelul platformelor de activare, unde sunt activate intr-o manier alosteric, cum este de exemplu modificarea conforma ional indus de dimerizarea a doi monomeri inactivi [140]. Caspazele ini iatoare activate activeaz apoi direct caspazele efectoare prin scindare proteolitica. Dup activare, caspazele efectoare proceseaza printr-un numar limitat de scindri un subset de proteine celulare, dintre care circa 300 au fost identificate n diferite modele de apoptoza. Caspazele scindeaz proteine implicate n sinteza, clivarea i repararea DNA, proteine implicate n transla ie, reglatori ai ciclului celular, proteine ale citoscheletului, proteine de adeziune, protein kinaze i fosfataze i multe altele. In consecin , un numr de func ii vitale ale celulei sunt anulate iar celula moare. Analiza Western blot a nivelului de expresie proteica a proteinei p53 i procaspazei 3 (Figura 43) sub influenta compozitului colagen-hidroxiapatita i n prezenta sistemului cu eliberare controlat a eviden iat urmtoarele: i) n celulele din osteosarcom, proteina p53 este neexprimata iar pro-caspaza 3 nregistreaz valori extreme de mici; ii) n osteoblastele fetale, nivelul de expresie al proteinei p53 i procaspazei 3 nregistreaz valori similar n cazul celulelor crescute n mediul de cretere uzual (linia 1) i mediul de extrac ie al compozitului hidroxiapatita-colagen (linia 2); iii) osteoblastele crescute n mediile de extrac ie ale sistemelor cu eliberare controlat cu 6 M cisplatin (linia 3) i 10 M (linia 4) nregistreaz o reducere a nivelului de expresie a ambelor proteine pe msura creterii concentra iei de cisplatin.

Figura 43. Analiza Western blot privind efectul compozitului colagen-hidroxiapatita:fr cisplatin (linia 2) i cu cisplatin incorporat n concentra ii de 6M (linia 3) si 10M (linia 4) asupra nivelului de expresie proteica a proteinei p53 i pro-caspazei 3.Linia 1: cultura n mediul de cretere uzual.

Absenta expresiei proteinei p53 n linia G292 ar putea fi explicata prin mutatiile suferite de aceasta n osteosarcom. Inexplicabila este insa reducerea nivelului proteinei p53 n celulele hFOB 1.19 cu creterea dozei de cisplatin, cunoscut a genera leziuni ADN ce pot activa supraexpresia sa. Este foarte posibil ca inducerea apoptozei celulare, remarcata prin reducerea densit ii celulare i alterri morfologice sub influenta sistemelor cu eliberare controlat n ambele linii celulare, sa fie mediata prin activarea caspazelor. Acest lucru explica reducerea nivelului procaspazei 3 ca rezultat al conversiei sale n forma activa pe msura creterii concentra iei de cisplatin n sistemele cu eliberare controlat. Rezultatele ob inute sunt concordante cu studiul lui Seki i colab. care au investigat n
vitro efectele mai multor citostatice (adriamicina, cisplatin, vincristina, ciclofosmamida) asupra

celulelor de osteosarcom i caile de semnalizare pentru fiecare substan n parte. Ei au demonstrat ca cisplatinul induce apoptoza n mod specific prin activarea caspazelor iar ceilal i agen i antitumorali induc moartea celulara prin cai de semnalizare diferite.
Implicarea sistemelor cu eliberare controlat n modularea activitatii metaloproteinazelor matriceale

Celulele din osteosarcom manifesta poten ialul de metastazare, proces ce implica o cascada proteolitic ai cror actori principali sunt metaloproteinazele matriceale (MMP). MMP sunt Zn-endopeptidaze, nrudite din punct de vedere structural i func ional, capabile de degradarea majorit ii componentelor proteice din matricea extracelulara (MEC) (colageni, proteoglicani, laminin , fibronectin , etc.) att n vitro cat i n vivo. Principalele MMP implicate n procesele invazive i de metastazare sunt colagenazele de tip IV (gelatinaza A sau MMP-2 i gelatinaza B sau MMP-9) al cror substrat primordial este colagenul tip IV, componentul majoritar din membrane bazala. Un alt obiectiv al studiilor realizate a fost evaluarea efectului sistemelor cu eliberare controlat n modularea activit ii MMP responsabile de invazia tumoral i metastazare. Dup cum reiese din Figura 44, se remarca o inhibitie a activitatii specific MMP-2 pe msura creterii concentra iei de cisplatin n special n cazul celulelor din osteosarcom. Prin urmare sistemele cu eliberare controlat pot determina reducerea poten ialului invaziv al osteoblastelor tumorale.

Figura 44 Analiza zimografica a efectului compozitului colagen-hidroxiapatita:fr cisplatin (linia 1) i cu cisplatin incorporat n concentra ii de 6M (linia 2)si 10M (linia 3) asupra activit ii gelatinolitice specifice MMP-2 i MMP-9

Expresia activit ilor specifice MMP-2 i MMP-9 n mediile condi ionate ale osteoblastelor hFOB 1.19, foarte pu in inhibate de sistemele cu eliberare controlat, poate a fi asociata cu fenomenul de remodelare a MEC necesar regenerrii osoase.

CONCLUZII

Teza de doctorat intitulata Materiale compozite hibride de tip polimer ceramica a urmarit obtinerea de compozite polimerice ranforsate cu particule ceramice cu potentiale aplicatii in implantologie si /sau in practica stomatologica. In cadrul tezei au fost obtinute o gama larga de materiale compozite: compozite hibride binare pe baza de poli bis-GMA/HA, APV/HA, APV/Al2O3 respectiv compozite hibride ternare, COL/HA/magnetita si COL/HA/cisplatin. Rezultatele obtinute permit formularea urmatoarelor concluzii:

I. Concluzii asupra obtinerii si caracterizari materialelor compozite hibride binare pe baza de bis-GMA/HA

- s-a pus la punct dou metode de polimerizare (termic si chimic) a monomerului BisGMA, compatibile cu metodele de ob inere a compozitelor hibride prezentate precum i metodele de caracterizare ale acestora.
- raportul masic luat in lucru intre componentii fiind de 9/1;

- materialele nanocompozite hibride ob inute au fost caracterizate prin XRD, FTIR, SEM i TEM ct i din punct de vedere al comportamentului termic prin analiza ATD-TG. - prin vizualizarea imaginiilor SEM se observ ca materialul rezultat este omogen iar aglomeratele au dimensiuni submicronice; - prin TEM se observ dimensiunea i forma particulelor. Din punct de vedere al dimensiuni se poate afirma c materialele compozite ob inute se ncadreaz n domeniul nanometrilor; - XRD i FTIR confirm ob inerea compozitului prin picurile i benzile caracteristice componentelor individuale;

- analiza termogravimetric suport mici diferen e n func ie de modul de polimerizare, diferen ele care apar datorndu-se ini iatorului folosit; - materialele ob inute au poten iale aplica ii n stomatologie ca material de umplutur sau material de cementare (legare).

II. Concluzii asupra obtinerii si caracterizari materialelor compozite hibride binare pe baza de APV/HA

Au fost ob inute i caracterizate trei compozite pe baz de APV i HA, cu con inut variat de faz mineral, alcoolul polivinilic i HA fiind cunoscute ca biomateriale utilizabile in implantologie datorita faptului ca sunt netoxice, compozitul rezultat fiind i el studiat i utilizat n medicin. Sinteza compozitelelor pe baz de APV/HA se realizeaz pornind de la pulbere de alcool polivinilic i pulbere de HA; Procesul de omogenizare s-a realizat prin agitare magnetic i sub uoar nclzire; Materialele compozite ob inute au fost caracterizate att din punct de vedere morfologic ct i compozi ional: - Difrac ia de raze X a fost utilizat n scopul identificrii fazelor existente n compozitele ob inute. Se observ creterea n intensitate a picurilor caracteristice HA precum i diferen ierea net a acestora odat cu creterea con inutului de HA din compozit. - Spectroscopia de absorb ie n infrarou ofer informa ii suplimentare inclusiv metodei XRD care este puternic limitat de cristalinitatea fazelor. Spectrele IR ob inute au fost suprapuse astfel nct s se eviden ieze att benzile caracteristice alcoolului polivinilic ct i al compozitelor APV-HA cu con inut variabil de faz mineral. - Compozi ia chimic a compozitului induce modificri morfologice nsemnate n special la concentra ii mari de APV. - Imaginile SEM n cazul compozitelor APV-HA cu rapoarte masice ntre componen i de 1:4 i respectiv de 1:1 arat c morfologia materialelor este foarte asemntoare, materialele fiind omogene att din punct de vedere al distribu iei de particule ct i din punct de vedere al distribu iei celor dou faze, putndu-se afirma c cele dou materii prime sunt compatibile. - n cazul n care raportului masic ntre componen i este de 4:1 imaginile SEM difer net de celelalte compozite, materialul ob inut avnd un aspect fibrilar pronun at; - Fibrele de APV-HA au diametrul de ordinul 100 250 nm i lungime de ordinul zecilor de
m.

III. Concluzii asupra obtinerii si caracterizari materialelor compozite hibride binare pe baza de APV/alumina.

n cadrul acestei lucrri s-au ob inut i caracterizat i o serie de compozite pe baz de APV i Al2O3 cu rapoarte masice variabile. Compozitele astfel ob inute au fost caracterizate prin XRD, FTIR i SEM. Deoarece n condi ii normale de temperatur se formeaz dou faze distincte, unul preponderent polimeric i unul compozit, s-a propus i s-a realizat o metod hidrotermal de sintez care s permit realizarea unor legturi chimice suplimentare de tip polimer ceramic (Al-O-C) mrind astfel gradul de compatibilitate i astfel ob inndu-se un material compozit omogen n cazul unui raport polimer ceramic de 1:1. Etapa de dizolvare i omogenizare se realizeaz la 1500C i se pstreaz aceast temperatur pn la evaporarea a 75 80% din apa de reac ie. Etapa de uscare se realizeaz n dou etape succesive: la 100 0C pentru ndeprtarea apei a pn la 90-95% urmat apoi de uscarea final n condi ii normale de temperatur; Imaginile de microscopie electronic de baleiaj confirm ob inerea unei faze unice, morfologic foarte asemntor cu cea a fazei preponderent polimerice; Difractogramele de raze X nregistrate pentru APV i respectiv pentru compozitul APVAl2O3 sunt asemntoare att din punct de vedere al fazelor ct i din punct de vedere al cristalinit ii acestora; mai mult, picurile caracteristice Al2O3 lipsesc din difractograma compozitului datorit hibridului format prin legturi chimice de tip - Al-O-C -. Compozitele pe baza de APV/alumina pot fi utilizate pentru aplica ii dentare i pentru proteze de old. IV. Concluzii asupra obtinerii si caracterizari materialelor compozite hibride ternare pe baza
de COL/HA/magnetita

Materialele compozite ternare pe baz de colagen i hidroxiapatit indeplinescu 2 roluri: suport regenerativ datorita compozitului COL/HA si rol antitumoral datorita nanoparticulelor de magnetita. Rolul nanoparticulelor de magnetit este de a produce hipertermie i poate fi activat la comand, n condi ii uor controlabile: frecven , timp de aplicare a cmpului electromagnetic sau a con inutul de magnetit. Dei materialele compozite COL/HA-Fe3O4 ce con in 1 sau 2 % de magnetit pot produce hipertermia necesar, se recomand utilizarea unui con inut mai ridicat de magnetit pentru a reduce timpul de iradiere pe de o parte i, pentru c n cazul aplicrii in vivo, datorit esutului vecin, pierderile de cldur vor fi mai mari. Ob inerea structurilor cilindrice caracteristice doar n cazul materialelor compozite COL/HA-Fe3O4 poate fi explicat pe baza interac iilor ce se dezvolt ntre fibrilele i fibrele de colagen i nanoparticulele de magnetit. Pentru ob inerea materialelor multifunc ionale Col/HA/Fe3O4 prima etap constnd n ob inerea particulelor de magnetit prin precipitare pornind de la precursori de Fe2+ i Fe3+, mediul de reac ie slab bazic fiind realizat de NaOH. Caracterizarea nanoparticulelor a fost realizat cu ajutorul microscopului electronic

prin transmisie la nalt rezolu ie pe probele fin mojarate identificndu-se dou tipuri de magnetitit: sferic i cilindric (sub forma de bastonae). Ob inerea magnetitei cilindrice poate fi pus n eviden doar n condi iile n care sinteza este realizat n prezen a cmpului magnetic. Dimensiunea particulelor sferice de magnetit variaz de la ~ 5nm i pn la 20 nm, diametrul mediu al acestor particule fiind 10 12 nm, n timp ce, n cazul particulelor cilindrice, acestea pot atinge pn la 50 nm n lungime, diametrul fiind apropiat de cel al particulelor sferice. Ob inerea materialelor compozite COL/HA-Fe3O4 a fost realizat n dou etape. n prima etap, suspensia de hidroxid de calciu (Fluka) este adugat peste gelul de colagen i lsat s interac ioneze timp de 24h. n etapa a doua, peste masa de reac ie ob inut n etapa I, se adaug solu ia de fosfat diacid de sodiu ceea ce duce la precipitarea hidroxiapatitei. Materialul compozit ob inut dup mineralizarea gelului de colagen este amestecat cu cantitatea adecvat de magnetit. Materialele ob inute au fost caracterizate prin difractie de raze X, spectroscopie IR i microscopie electronic de baleiaj. Difrac ia de raze X confirm prezen a hidroxiapatitei i a magnetitei prin picurile caracteristice acestora: HA (2Theta = 25.90, 28.96, 31.79, 32.21, 32.92, 34.09, 39.82, 46.73 i 49.53) i magnetita (2Theta = 30.04, 35.43, 43.05, 56.94 i 62.52). Imaginile SEM au fost ob inute la mriri diferite rezultnd ca la mriri moderate, materialele prezint o foarte bun omogenitate fiind foarte asemntoare cu morfologia materialelor compozite COL/HA iar la mriri relativ mari, datorit interac iilor ce se dezvolt ntre colagen i magnetit, n masa materialului compozit putndu-se identifica cristale aciculare (cilindrice). Spectrul de absorb ie n infrarou, nregistrat pentru compozitul COL/HAFe3O4 confirm prezen a benzilor caracteristice ale componen ilor. Materialele compozite ob inute au fost analizate din punct de vedere al hipertermiei produse observandu-se c odat cu creterea cantit ii de magnetit crete i hipertermia produs. V.

Concluzii asupra obtinerii si caracterizari materialelor compozite hibride ternare pe

baza de COL/HA/cisplatin.

Materialele compozite pe baza de COL/HA/ cisplatin sunt materiale multifunctionale datorita compozitului COL/HA care faciliteaza regenerarea osoasa respectiv suport pentru eliberarea controlata de medicamente datorita prezentei cisplatinului acesta avnd ac iune local de distrugere a celulelor canceroase viabile neextirpate n urma interven iei chirurgicale, gradul de recuren fiind semnificativ redus i toxicitatea sistemic asociat cu eliberarea cisplatinului dup implantare ar fi minim.. Citostaticile sunt medicamente cu efect general asupra celulelor organismului, eficacitatea lor bazndu-se pe susceptibilitatea dintre celule maligne i benigne. Cisplatinul

utilizat a fost caracterizat n prealabil prin UV-Vis si FTIR. Este deosebit de important de men ionat faptul c benzile caracteristice cisplatinului nu se suprapun cu cele ale suportului, spectrele putnd fi utilizate n determinarea semi-cantitativ a con inutului de cisplatin. Materialele multifunc ionale au fost ob inute prin absorb ia cisplatinului pe matricile compozite Col/HA; Materialele ob inute au fost uscate prin metoda uscrii mixte, metod care a permis ob inerea unor materiale cu porozit ii diferite i implicit procese de eliberare controlate diferite, materialele poroase permi nd o eliberare mai rapid a medicamentului; Materialele au fost caracterizate prin spectrometrie de absorb ie n IR att din punct de vedere al materialului suport ct i din punct de vedere al substan ei cu rol antitumoral ct i prin difrac ie de raze X; Morfologia materialelor COL/cisplatin realizate prin SEM este practic identic cu cea a matricilor colagenice de la care s-a pornit, adsorb ia cisplatinului neavnd nici o influen asupra suportului colagenic. n cazul matricilor multifunc ionale compozite COL/HA-cisplatin morfologia se modific semnificativ fa de matricile multifunc ionale COL/cisplatin datorit depunerii unei cantit i nsemnate de faz mineral, raportul colagen:hidroxiapatit fiind de 1:4; Au fost studiate de asemenea mecanismele de eliberare controlat a medicamentelor, care s permit ca o anumit cantitate de medicament s fie eliberat ntr-o perioad determinat de timp, precum i de cerin ele impuse polimerului pentru ndeplinirea func iei de transportor de medicamente. Studiile de eliberare au indicat faptul c, n toate cazurile de materiale multifunc ionale COL/cisplatin i respectiv COL/HA-cisplatin n decursul primei zile se elibereaz ~ 78-85% din con inutul total de cisplatin, fiind mai avansat n cazul matricilor multifunc ionale COL/cisplatin dect n cazul materialelor multifunc ionale compozite COL/HA/cisplatin, probabil datorit unor interac ii mai puternice ce se dezvolt ntre HA i cisplatin. n urma efecturi testelor de biocompatibilitate pe medii de cultur men inute n contact cu osteoblastele fetale si din osteosarcom se nregistreaz o reducere a viabilit i celulare, densit i i morfologiei celulare n cazul ambelor linii celulare odat cu creterea cantit i de cisplatin. Materialele multifunc ionale realizate inhib activitatea MMP (metoloproteinazele matriciale) mpiedicnd invazia tumoral i metastazarea. Din punct de vedere al poten ialelor aplica ii, aceste materiale sunt promi toare att ca grefe ct i ca suporturi pentru sistemele multifunc ionale cu eliberare controlat deoarece metoda utilizat nu implic nici tehnologie foarte avansat i nici investi ii foarte mari.

Diseminare rezultate

Articole ISI 1. Maria Ficai, Ecaterina Andronescu, Denisa Ficai , Georgeta Voicu, Anton Ficai., Synthesis and characterization of COLL PVA/HA hybrid materials with stratified morphology, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 81 (2010) 614619. 2. Ecaterina Andronescu, Maria Ficai, Georgeta Voicu, Denisa Ficai,Maria Maganu, Anton Ficai, Synthesis and characterization of collagen/hydroxyapatite: magnetite composite material for bone cancer treatment, Mater Sci: Mater Med (2010) 21:22372242 3. Maria FICAI, Ioan-Avram NEDELCU, Denisa FICAI, Bogdan Stefan VASILE, Anton FICAI, Ecaterina ANDRONESCU, The Influence of Ultrasonication on the Formation of COLL/HA Composite Materials, MATERIALE PLASTICE, 48, No. 1, 2011. 4. Maria Ficai, Ecaterina Andronescu, Georgeta Voicu, Denisa Ficai, Madalina Georgiana Albu, Anton Ficai, Compozite colagen/cochilie de molusca potentiale biomateriale pentru substitutia osoasa, Revista Romana de Materiale 2010,40(4), 359-364. Articole BDI 1. Maria FICAI, Ecaterina ANDRONESCU, Anton FICAI, Georgeta VOICU, Bogdan tefan VASILE, Poly BIS-GMA/HA based hybrid composite materials, U.P.B. Sci. Bull., Series B, Vol. 73, Iss. 1, 2011. Bibliografie selectiv 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Violeta S. Contributii la studiul materialelor hibride polimeric-anorganice. Romania: Universitatea din Bucuresti; 2008. Laine RM. In Inorganic and Organometallic Polymers with Special Properties. NATO ASI Ser 1992:206. Sugimoto T. In Fine Particles. Synthesis, Characterization and Mechanism of Growth. New York: Marcel Dekker; 2000. Livage J. Sol-gel synthesis of solids In: King RB, editor. Encyclopedia of Inorganic Chemistry. John Wiley edition ed. New-York, 1994. p. 3836-3851 Watanabe T. In Photocatalytic Purification and Treatment of Water and Air. In: El-Akabi ebDOaH, editor. New York, 1993. p. 747. Link M, Gebhardt M, Meyers P, editors. Osteosarcoma. 5th ed: Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, 2006. Yuan X, Zhu X, Huang X, Sheng P, He A, Yang Z, et al. Interferon- enhances sensitivity of human osteosarcoma U2OS cells to doxorubicin by p53-dependent apoptosis. Acta Pharmacologica Sinica 2007;28:1835-1842. Decker S, Winkelmann W, Nies B, van Valen F. Cytotoxic effect of methotrexate and its solvent on osteosarcoma cells in vitro. J Bone Joint Surg 1999;81-B:545-551. Jin-Chao Zhang X-YJ, Li-WeiWang, Lu-Wei Li, Jing Sun, and Ying Zhang. "Synthesis, Characterization, and Cytotoxicity of New Types of Binuclear Platinum(II) Complexes". Synthesis and Reactivity in Inorganic, Metal-Organic, and Nano-Metal Chemistry 2010;40(ISSN: 1553-3174 print / 1553-3182 online):879882. Chou A, Gorlick R. Chemotherapy resistance in osteosarcoma: current challenges and future directions. . Expert Rev Anticancer Ther 2006;6:1075-1085. HONG SUN JM, YINGWU TANG, FUSHI ZHANG, GUOSHI WU. Hydroxyapatite coating on a polyamide implant. Journal Of Materials Science Letters 2002;21:901-902. M T. Curring performances of experimental bis-GMA based binary monomer mixtures for dental visible-light-cured composite resin inlays. Materials Science Letters 1994;13:12291231. Codru a N. Aplicarea in stomatologie a unor biomateriale compozite autohtone cu caracteristici optice superioare Universitatea de Medicin i Farmacie Iuliu Ha ieganu Cluj-Napoca, 2003. p. 1. KLEVERLAAN C. J. FAJ. Polymerization shrinkage and contraction stress of dental resin composites. Dent Mater 2005;21:1150-1157.

10. 11. 20. 21. 22.

121. Brahler M, Georgieva R, Buske N, Muller A, Muller S, Pinkernelle J, et al. MagnetiteLoaded Carrier Erythrocytes as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging. NANO LETTERS 2006;6(11):2505-2509. 122. Lin CY, Ho KC. Synthesis of superparamagnetic magnetite nanoparticles for thermoresponsive drug delivery. Nano Science and Technology Institute 2007;2:405 - 408. 123. Yang J, Lee H, Hyung W, Park S-B, Haam S. Magnetic PECA nanoparticles as drug carriers for targeted delivery : Synthesis and release characteristics. Journal of microencapsulation 2006;23(2):203-212. 124. Matsuoka F, Shinkai M, Honda H, Kubo T, Sugita T, Kobayashi T. Hyperthermia using magnetite cationic liposomes for hamster osteosarcoma. Biomagn Res Technol 2004;2(3). 125. Orentas R, Hodge JW, Johnson BD, editors. Cancer vaccines and tumor immunity: John Wiley & Sons, Inc., 2008. 126. Ficai A, Andronescu E, Ghitulica C, Voicu G, Trandafir V, Manzu D, et al. Collagen/hydroxyapatite interactions in composite biomaterials. Materiale Plastice 2009;46(1):11-15. 127. Li Y, Asadi A, Monroe MR, Douglas EP. pH effects on collagen fibrillogenesis in vitro: Electrostatic interactions and phosphate binding. Materials Science and Engineering: C 2009;29(5):1643-1649 128. Yan XL, Gemeinhart RA. Cisplatin delivery from poly(acrylic acid-co-methyl methacrylate) microparticles. Journal of Controlled Release 2005;106(1-2):198-208. 129. Ta HT, Dass CR, Dunstan DE. Injectable chitosan hydrogels for localised cancer therapy. Journal of Controlled Release 2008 Mar 20;126(3):205-216. 130. Andronescu E, Ficai M, Voicu G, Ficai D, Maganu M, Ficai A. Synthesis and characterization of collagen/hydroxyapatite:magnetite composite material for bone cancer treatment. Journal of Materials Science - Materials in Medicine 2010;21(7):2237-2242. 131. Zhao Z, Yang D, Ma X, Zhao H, Nie C, Si Z. Successful repair of a critical-sized bone defect in the rat femur with a newly developed external fixator. Tohoku J Exp Med 2009 Oct;219(2):115-120. 132. Approval Summary for cisplatin for Metastatic ovarian tumors. FDA Oncology Tools Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research 1978. 133. Fumarel R, Murgoi G, Albert P, Hurduc A, Pascu ML. Increase of cisplatin therapeutical index through optical irradiation: a case study of choroidal metastasis. Romanian Reports in Physics 2008;60(3):877-884. 134. Ito A, Shinkai M, Honda H, Kobayashi T. Medical application of functionalized magnetic nanoparticles. Journal of Bioscience and Bioengineering 2005 Jul;100(1):1-11. 135. Ficai A, Andronescu E, Trandafir V, Ghitulica C, Voicu G. Collagen/hydroxyapatite composite obtained by electric field orientation. Materials Letters 2010;64(4):541-544. 136. Ficai A, Andronescu E, Voicu G, Ghitulica C, Vasile BS, Ficai D, et al. Self assembled collagen/ hydroxyapatite composite materials. Chemical Engineering Journal 2010;160(2):794-800. 137. Earnshaw WC, Martins LM, Kaufmann SH. Mammalian caspases: structure, activation, substrates, and functions during apoptosis. Annu Rev Biochem 1999;68:383-424. 138. Turk B. Targeting proteases: successes, failures and future prospects. Nat Rev Drug Discov 2006;5:785-799. 139. Fuentes-Prior P, Salvesen GS. The protein structures that shape caspase activity, specificity, activation and inhibition. Biochem J 2004;384:201-232. 140. Boatright KM, Salvesen GS. Mechanisms of caspase activation. Curr Opin Cell Biol 2003;15:725-731.