BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Pada dasarnya isolasi DNA dapat dilakukan dari berbagai sumber, antara lain organ manusia, darah, daun, daging buah, kalus, akar batang, daging dan sisik ikan. Namun, keberadaan setiap jaringan memiliki jumlah DNA yang berbedabeda. Jaringan hati memiliki jumlah DNA yang cukup dan kadar DNA-ase yang rendah. Penggunaan buah seperti buah papaya lebih banyak dilakukan dalam pengisolasian DNA dari sampel buah dewasa ini. Pepaya memiliki kumpulan DNA yang mudah diisolasi begitu pula dengan DNA yang terdapat dalam hati ayam. Hanya saja kandungan air pada buah papaya relative tinggi sehingga diperkirakan dapat mempengaruhi hasil ekstraksi DNA. Pengisolasian DNA pada sumber dilakukan terutama untuk pengenalan DNA secara lebih jelas karena dari isolasi ini DNA dapat terpisah dari kumpulannya, yaitu kromosom, protein dan komponen lain. Isolasi DNA telah banyak dilakukan dan dikembangkan di dunia ilmiah karena teknologi teknologi modern telah menjamah ilmu genetika. Isolasi DNA ini dapat dilakukan dengan cara dan bahan sederhana, hingga dengan teknologi modern. Metode pengendapan dengan pelarut etanol dilakukan untuk memisahkan, mengidentifikasi,

mengkarekterisasi dan purifikasi dari molekul DNA/ RNA. Metode pengendapan merupakan cara pengamatan DNA dengan bantuan alat sentrifugasi.

16

Berdasarkan hal-hal tersebut diatas dan tak lepas dari tujuan peningkatan khazanah ilmu pengetahuan terutama dalam bidang ilmu genetika, maka kami mengadakan praktikum isolasi DNA yang terkandung di dalam hati ayam dan buah pepaya.

1.2 Rumusan Masalah Rumusan masalah dari percobaan ini yaitu mengetahui bagaimana cara mengisolasi DNA dari hati ayam dan dari buah pepaya serta memahami cara kerja yang digunakan untuk mengisolasi DNA dari hati ayam dan buah papaya ?

1.3 Tujuan Percobaan Dari percobaan ini diharapkan praktikan mampu mengisolasi DNA dari hati ayam dan dari buah-buahan seperti buah papaya dengan metode pengendapan pelarut etanol.

1.4 Manfaat Percobaan Manfaat dari praktikum isolasi dan penentuan konsentrasi DNA memberikan keterampilan bagi praktikan dalam mengisolasi DNA serta dapat mengenal keberadaan DNA dalam berbagai jaringan yang berbeda-beda.

16

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

Asam-asam nukleat seperti asam dioksiribosa nukleat (DNA) dan asam ribonukleat (RNA) memberikan dasar kimia bagi pemindahan keterangan di dalam semua sel. Asam nukleat merupakan molekul makro yang memberi keterangan tiap asam nukleat mempunyai urutan nukleotida yang unik sama seperti urutan asam amino yang unik dari suatu protein tertentu karena asam nukleat merupakan rantai polimer yang tersusun dari satuan monomer yang disebut nukleotida Asam deoksiribonukleat (DNA) adalah asam nukleat yang mengandung instruksi genetik yang digunakan dalam pengembangan dan fungsi dari semua organisme hidup dikenal dan beberapa virus. Peran utama dari molekul DNA adalah penyimpanan jangka panjang informasi. DNA sering dibandingkan dengan satu set cetak biru atau resep, atau kode, karena berisi instruksi yang dibutuhkan untuk membangun komponen lain dari sel, seperti protein dan molekul RNA. Segmen DNA yang membawa informasi genetik ini disebut gen, tetapi urutan DNA lain yang memiliki tujuan struktural, atau terlibat dalam mengatur penggunaan informasi genetik. Kimia DNA terdiri dari dua polimer panjang unit sederhana yang disebut nukleotida, dengan tulang punggung yang terbuat dari gula dan gugus fosfat bergabung dengan ikatan ester. Kedua untai berjalan dalam arah yang berlawanan satu sama lain dan karena itu anti-paralel. Terlampir gula masing-masing adalah 16

salah satu dari empat jenis molekul yang disebut basa. Ini adalah urutan dari empat basa sepanjang tulang punggung yang mengkodekan informasi. Informasi ini dibaca dengan menggunakan kode genetik, yang menentukan urutan asam amino dalam protein. Kode ini dibaca oleh menyalin membentang dari DNA menjadi RNA asam nukleat terkait, dalam proses yang disebut transkripsi. Dalam sel, DNA diatur dalam struktur yang panjang yang disebut kromosom. Kromosom ini yang diduplikasi sebelum sel-sel membagi, dalam proses yang disebut replikasi DNA. Organisme eukariotik (hewan, tumbuhan, jamur, dan protista) menyimpan sebagian dari DNA mereka di dalam inti sel dan sebagian DNA mereka dalam organel, seperti mitokondria atau kloroplas. Sebaliknya, prokariota (bakteri dan archaea) menyimpan DNA mereka hanya dalam sitoplasma. Dalam kromosom, kromatin protein seperti histon kompak dan mengatur DNA. Struktur ini kompak memandu interaksi antara DNA dan protein lainnya, membantu mengontrol bagian mana dari DNA ditranskripsi. (Ratna Zulfarosda. 2010) DNA adalah molekul utama yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam organisme. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, 16

hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Keberadaan DNA dalam berbagai jaringan berbeda-beda, ada yang berlimpah ada juga yang terdapat dalam jumlah yang kecil. Selain itu, adanya DNA-ase yang merupakan enzim pengurai DNA menjadi fragmen yang lebih kecil juga mempengaruhi jumlah DNA. Sehingga pemilihan jaringan yang digunakan untuk isolasi DNA harus mengandung DNA yang cukup dan kadar DNA-ase yang rendah. Contoh jaringa yang banyak dijadikan sampel adalah jaringan hati. Untuk isolasi DNA pada tumbuh-tumbuhan khusunya pada buah juga harus diperhatikan pemilihan sampel buahnya. Kadar air pada masing-masing buah yang berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit. Buah papaya memiliki kadar air yang relatif cukup banyak. Pada individu yang sama DNA yang diperoleh dari berbagai sumber akan memiliki jenis jumlah dan ukuran yang sama. DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavonoid. Sedangkan DNA dari hewan lebih banyak mengandung protein. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan seringkali padabeberapa jenis tanaman, kontaminasi tersebut sulit 16 dipisahkan dari ekstrak asam

nukleatDemikian pula pada hewan yang memiliki kandungankitin (seperti serangga), memerlukan teknik dan metode khusus untuk menghancurkan sel hingga isi dapat terpisah atau keluar dari sel. (Diah Kusumawaty. 2010) Secara kimiawi penghancuran sel dilakukan dengan memanfaatkan senyawa kimia seperti EDTA (ethyllenediamine tetraacetic), dan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate). EDTA berfungsi sebagai perusak sel dengan cara mengikat ion magnesium (ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuclease yang merusak asam nukleat). SDS merupakan sejenis deterjen yang berfungsi merusak membrane sel. Enzim proteinase K dapat digunakan untuk menghancurkan protein. Kotoran akibat lisis sel dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Kemudian molekul nuleotida (DNA dan RNA) yang telah dipisahkan dibersihkan dari protein yang masih ada dengan menggunakan phenol. Dalam proses ini sebagian kecil RNA juga dapat dibersihkan. Sedangkan choloform digunakan untuk membersihkan sisa-sisa protein dan polisakarida dari larutan. Enzim RNAase digunakan untuk menghancurkan RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh. Pemurnian atau purifikasi DNA dapat dilakukan dengan mencampur larutan DNA tersebut dengan NaCl yang berfungsi memekatkan, memisahkan DNA dari larutan, dan mengendapkan DNA sewaktu dicampur dengan ethanol. Proses sentrifugasi dengan kecepatan tinggi akan mengendapkan tepung berwarna putih (DNA) dan menempel di dasar tabung ependorf. Supernatanya dibuang, dan penambahan buffer ditingkatkan, dicampur dan disentrifus lagi. Setelah supernatan dibuang, pelet dilarutkan kembali pada larutan detergent SDS dan proteinase K. Sampel 16

kemudian diekstrak fenol sekali dengan menggunakan phenol/chloroform/isoamyl alcohol solution. Setelah sentrifugasi, didapat 3 lapisan dalam tabung reaksi dengan lapisan ditengah berupa gelatin. Serat DNA terbentuk pada lapisan atas kemudian dipresipitasi dua kali dan ditambahkan etanol dingin untuk menghilangkan kloroform. (Syaiful yahya. 2012) DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia, hewan dan tumbuhan terdapat di dalam inti sel, dan beberapa organ lain di dalam sel seperti mitokondria dan kloroplast. Penyebutan nama DNA juga didasarkan pada lokasi asalnya. DNA genome inti (nuclear DNA genome) berasal dari inti sel, DNA genom mitokondria (mitochondrial DNA genome) berasal dari mitokondria, DNA genom kloroplast berasal dari kloroplast. Pada organisme tingkat rendah, DNA penyusun kromosom dan plasmid dibungkus oleh dinding sel (pada bakteri) atau dibungkus oleh protein tertentu (pada virus). Kromosom eukariot berbentuk linear sedangkan kromosom prokariot berbentuk sirkular. Selain itu prokariot juga mengandung satu atau lebih plasmid. Plasmid merupakan mulekul DNA sirkular dengan ukuran yang jauh lebih kecil dibanding kromosom. Sifat DNA mudah mengalami denaturasi , sehingga percobaan harus dilakukan dengan hati-hati agar kita dapat mengislasi DNA sesuai dengan jumlah yang sebenarnya didalam jaringan. Tekanik mekanik, perlakuan fisik dan kimiawi yang berlebih perlu dihindari, serta aktivitas enzim nuclease harus dihambat. Oleh karena itu , digunakan NA-sitrat untuk mengikat ion Ca2+ dan Mg 2+ dimanana keduanya merupakan kofaktor untuk DNA-ase. Isolasi DNA kromosom prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari 16

komponen-komponen sel lain. Isolasi DNA plasmid DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom. Untuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur di atas

Gambar.1 Skema yang biasa digunakan untuk proses ekstrasi DNA (Gia Marta. 2011)

16

BAB III METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat Praktikum mengenai isolasi dan penentuan konsentrasi DNA

dilaksanankan pada hari Selasa, 16 Oktober 2012 di laboratorium Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas sriwijaya.

3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Isolasi DNA dari Hati Ayam Alat dan Bahan yang digunakan berupa hati ayam 50 gr, buffer garam faal (015 mol /L Bufer NaCl dengan na sitrat 0,015 mol/L pH 7 , NaCl 2 mol kloroform-amil alcohol (6:1), etanol absolute, Eter, blender atau Mortil

3.2.2 Isolasi DNA dari Buah Pepaya Alat dan bahan yang digunakan berupa beker gelas 100 mL, batang pengaduk gelas ukur 50 mL, kertas saring, corong, tabung reaksi, buah kiwi, detergen, NaCl dan etanol.

3.3 Cara Kerja 3.3.1 Isolasi DNA dari Hati Ayam

1. Sebanyak 20 gram hati ayam dicincang menjadi bagian-bagian yang halus. Hancurkan dengan blender dalam 200 mL buffer garam faali selama satu 16

menit. Sentrifugasi susupensi pada kecepatan 5000 rpm selama 15 menit . Buang supernatanya dan suspensikan kembali endapan dengan 20 mL NaCl 2 mol/ L. Bersihkan semua endapan yang ada dengan sentrifugasi dan putar larutannya terus menerus dengan pengaduk dari gelas sambil ditambahkan akuades dengan volume yang sama. Angkat endapan fibrous denga batang pengaduk dan biarkan endapan fibrous melilit pada batang pengaduk didalam gelas piala selama 30 menit . 2. Selama waktu pelilitan akan tampak gumpalan endapan yag mengerut dan cait=ran yang keluar di bersihakan dengan kertas saring. Larutkan DNA dalam 20 mL NaCl 2 mol/L . tambahkan larutan klorofm/amil alcohol (6:1) dengan volume yang sama , kemudian campur dengan blender selama 30 detik. Sentrifugasi emulsinya dengan kecepatan 5000 rpm. Ambil bagian atas yang keruh berisi DNA dan tamping dalam gelas piala. 3. Ulangi perlakuan dengan pelarut organic sebnayak dua kalai atau lebih dan kumpulkan supernatannya dalam geals piala . Endapan DNA nya diaduk dengan supernatan ditmbah 2 volume etanol dingin dan aduk dengna batas gelas secara hati-hati. DNA dicuci dengan cara mencelupkan batang gelas yang melilit serabut DNA kedalam 4 pelarut dan pisahkan sisa cairan pelarut . Timbang DNA yang telah kering .

3.3.2 Isolasi DNA dari Buah Pepaya

1. Potong buah papaya dan haluskan dengan menggunkan garpu dalam gelas kimia. 16

2. Tambahkan 3 gr NaCl dan 10 mL detergen 3. Tambahkan volume hingga 100 mL 4. Aduk campuran dengan garpu dan saring 5. Diamkan cairan hasil penyaringan selaama beberapa menit dan pindahkan sebanyak 6 mL cairan keddalam tabung reaksi 6. Tambahkan 9 mL larutan ethanol dingin dan biarkan selama beberapa menit sampai terbentuk lapisan DNA berupa gelatin putih 7. Lilitkan DNA pada batang pengaduk dan larutkan dalam air.

16

BAB IV PEMBAHASAN

4.1 Pembahasan Pada percobaan ini dengan judul Isolasi dan penentuan konsentrasi DNA yang bertujuan agar mahasiswa mampu mengisolasi DNA dari hewan dan tumbuhan. Isolasi DNA yang dilakukan menggunakan sampel hati ayam dan buah pepaya. Dalam praktikum kali ini untuk menghancurkan membrane sel hati ayam dan dinding sel buah papaya dengan cara penggerusan menggunakan mortil. Untuk isolasi DNA dari hati ayam ditambahkan larutan buffer garam faal pada saat sebelum sentrifugasi suspensi yang berfungsi untuk mempertahankan pH sampel hati ayam. Dilanjutkan dengan sentrifugasi untuk memisahkan komponen sel lain yang menjadi pengotor dari DNA. Proses ini menghasilkan larutan dengan dua fasa, yakni supernatan dan endapan (ada yang berwarna bening dan juga masih terdapat sisa hati ayam yang tidak hancur) . Endapan yang berupa ekstrak hati ayam ditambah garam dapur (NaCl), penambahan garam NaCl berfungsi untuk melisiskan membrane sel pada hati ayam. Lalu ditambahkan Chloroform yang dilakukan untuk mengekstraksi DNA dari kontaminan Chloroform merupakan pelarut organik yang dapat melarutkan atau mendenaturasi protein, lipid dan molekul lain seperti polisakarida yang diharapkan akan didapatkan supernatan yang berisi DNA dari sampel hati ayam bebas kontaminan. DNA dan RNA tidak terdenaturasi karena tidak larut didalam pelarut organik seperti kloroform. 16

Kemudian saat disentrifugasi lagi, Pada tahap akhir isolasi DNA dari hati ayam dihasilkan tiga lapisan larutan di dalam tabung dengan lapisan atas berupa larutan berwarna keruh, lapisan tengah berupa gumpalan protein dan lapisan bawah berupa larutan bening atau pelarutnya. Lapisan bagian atas merupakan DNA dari sampel hati ayam. Disini DNA kita ambil dan kita tambahkan dengan etanol secara perlahan-lahan agar tidak merusak DNA yang akan kita dapatkan. Setelah ditambahkan etanol maka akan membentuk tiga lapisan lagi. Bentuk DNA dari sampel hati ayam yang dihasilkan pada pengamatan kali ini adalah berupa

gumpalan berbentuk seperti gel berwarna putih yang terdapat ditengah dan membatasi kedua lapisan lain. Pada percobaan isolasi DNA dari buah pepaya, sampel yang telah dihaluskan dengan mortil tidak melewati tahapan sentrifugasi seperti perlakuan pada isolasi DNA dari hati ayam. Pemisahan ekstrak buah pepaya dengan endapan hanya dilakukan dengan proses penyaringan. Adapun untuk melisiskan dinding sel dan mendenaturasi protein dari sampel buah pepaya buah perlu penambahan detergen sehingga DNA pada jaringan buah pepaya dapat diisolasi. Deterjen mengandung sodium dodesil sulfat (SDS) yang dapat menyebabkan hilangnya molekul lipid pada membran sel sehingga struktur membrane akan rusak dan melisiskan isi sel. Dengan kata lain penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya struktur dinding sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membrane membentuk senyawa lipid protein-deterjen kompleks. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, 16

demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia. Pengisolasian DNA dari sampel buah pepaya berhasil dilakukan. Pada tahap akhir, DNA dari sampel buah pepaya terbentuk dengan adanya tiga lapisan lagi seperti hati ayam, DNA yang didapat berada ditengah lapisan yang berupa seperti gumpalan putih. Pada percobaan yang kami lakukan DNA dari buah pepaya ini lebih banyak kami dapatkan dibandingkan DNA dari hati ayam, karena pada hati ayam kami menambahkan etanol tidak dengan perlahan- lahan sehingga merusak DNA yang didapat. Hasilnya DNA yang didapat pada hati ayam hampir tidak terlihat.

16

BAB V PENUTUP

5.1 Kesimpulan

1. DNA terdiri dari komponen gugus fosfat, gula deoksiribosa dan basa nitrogen. 2. Untuk melisiskan dinding sel dan mendenaturasi protein pada sampel buah pepaya dapat digunakan detergen. 3. Protein akan terdenaturasi didalam kloroform sedangkan DNA dan RNA tidak akan terdenaturasi. 4. Gumpalan serat-serat DNA yang didapat dari isolasi DNA dari hati ayam berbentuk seperti gel berwarna putih. 5. DNA dari buah pepaya lebih terlihat dan lebih banyak kami dapatkan dibandingkan DNA dari hati ayam. Karena pada saat penambahan etanol pada hati ayam tidak secara perlahan sehingga dapat juga mempengaruhi banyak atau tidaknya DNA yang dihasilkan.

5.2. Saran Lakukan setiap langkah percbaan dengan hati- hati. Kesalahan prosedur maupun kesalahan perlakuan terhadap sampel, dapat mengakibatkan pengaruh yang kurang baik terhadap hasil isolasi.

16

DAFTAR PUSTAKA

Kusumawaty, Diah. 2010. Pengertian DNA dan RNA .http://threeyanvaven. student.umm.ac.id/2010/01/29/pengertian-dna-dan-rna. Diakses pada 13 Oktober 2012. Marta, Gia. 2011. Isolasi DNA Palsmid. http://www.scribd.com/doc/

35566008/Isolasi-Dna-Plasmid . Diakses pada 13 Oktober 2012. Mustahib. 2010. Isolasi DNA. http://biologi.blogsome.com/feed/isolasi-

DNA.html. Diakses pada 13 Oktober 2012. Yahya, Saiful. 2012. Laporan Praktikum Genetika Molekuler. http://mangippul. blogspot.com/2012/06/laporan-praktikum-genetika-molekuler.html.Diakses pada 13 Oktober 2012. Zulfarosda, Ratna. 2010. DNA Struktur dan Fungsinya. http://www.informasitips. com/artikel/DNA-struktur-dan-fungsinya.html. Diakses pada 13 Oktober 2012.

16