39

BAB IV METODOLOGI PENELITIAN

4.1

Rancangan Penelitian Rancangan penelitian ini adalah penelitian true eksperiment terhadap tikus putih dengan menggunakan 3 kelompok perlakuan dan 2 kelompok kontrol. Penelitian bersifat preventif sehingga dilaksanankan dengan menggunakan Post Test-Only Control Group Design. Setelah tikus melalui masa adaptasi, peneliti mengukur intervensi yang diberikan kepada masing-masing kelompok perlakuan, kemudian membandingkan hasil pengukuran dengan kelompok kontrol. Pemilihan objek penelitian untuk pengelompokan dalam perlakuan menggunakan metode Simple Random Sampling karena tikus, bahan pakan tikus, dan tempat penelitian dapat dikatakan homogen. Hasil yang akan diteliti adalah perbedaan kadar kolesterol darah pada kelompok perlakuan dan kontrol. Pada penelitian ini kelompok perlakuan dibagi menjadi 5 kelompok yaitu: 1. Kelompok kontrol negatif (P0): kelompok tikus yang hanya diberi pakan diet normal 30,5 g/hari selama 8 minggu 2. Kelompok kontrol positif (P1): kelompok tikus yang hanya diberi pakan diet aterogenik 25 g/hari selama 8 minggu 3. Kelompok perlakuan (P2): kelompok tikus yang diberi pakan diet aterogenik 25 g/hari dan tepung iles-iles kuning dosis 1 selama 8 minggu

40

4. Kelompok perlakuan (P3): kelompok tikus yang diberi pakan diet aterogenik 25 g/hari dan tepung iles-iles kuning dosis 2 selama 8 minggu 5. Kelompok perlakuan (P4): kelompok tikus yang diberi pakan diet aterogenik 25 g/hari dan tepung iles-iles kuning dosis 3 selama 8 minggu

4.2 4.2.1

Populasi dan Sampel Populasi Penelitian Pada penelitian ini binatang coba yang digunakan adalah tikus jenis (Rattus novergicus) strain Wistar yang dipelihara di Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang.

Pemeliharaan tikus dilakukan dalam kandang bebas patogen penyakit.

4.2.2

Randomisasi dan Desain Layout Agar setiap percobaan mempunyai peluang yang sama untuk mendapatkan perlakuan, maka dalam pengambilan sampel dilakukan pengacakan dengan langkah langkah sebagai berikut:

1.

Berikan nomor urut 1-30 pada sampel 2. Ambil bilangan random sebanyak sampel dengan menggunakan angka acak 3. Beri rangking pada bilangan random yang diperoleh. Tabel randomisasi dapat dilihat pada lampiran 1. Dengan demikian hasil randomisasi menunjukkan kelompok kontrol negatif (P0) terdiri dari peringkat 3, 10, 27, 5, 9, 26;

41

kelompok kontrol positif (P1) terdiri dari peringkat 21, 23, 7, 14, 13, 30; kelompok perlakuan (P2) terdiri dari peringkat 15, 8, 4,6, 2, 24; kelompok perlakuan (P3) terdiri dari peringkat 18, 11, 29, 1, 12, 19; kelompok perlakuan (P4) terdiri dari peringkat 22, 20, 28, 16, 17, 25. 4. Kemudian masukkan jenis perlakuan dalam sampel pada rancangan penelitian sebagaimana disajikan pada tabel berikut:

Tabel 4.1 Desain Layout Penelitian 1 P3 6 P2 11 P3 16 P4 21 P1 26 P0 2 P2 7 P1 12 P3 17 P4 22 P4 27 P0 3 P0 8 P2 13 P1 18 P3 23 P1 28 P4 4 P2 9 P0 14 P1 19 P3 24 P2 29 P3 5 P0 10 P0 15 P2 20 P4 25 P4 30 P1

4.2.3

Estimasi Jumlah Pengulangan

42

Dalam penelitian ini terdapat 5 perlakuan, maka jumlah binatang coba untuk masing-masing perlakuan dapat dicari dengan menghitung besaran sampel menggunakan rumus Kemas (2005) sebagai berikut :

n =jumlah pengulangan/besar sampel dalam kelompok t = jumlah perlakuan/banyaknya kelompok (5 kelompok) Maka jumlah sampel yang dibutuhkan dalam kelompok adalah :

dibulatkan menjadi 5 Jadi, jumlah minimal tikus untuk masing-masing perlakuan adalah 5 ekor dan disiapkan 1 ekor sebagai cadangan. Sehingga, tikus yang digunakan untuk masing-masing perlakuan adalah 6 ekor, dan untuk 5 kelompok perlakuan dibutuhkan 30 ekor tikus.

4.2.4

Prosedur dan Teknik Pengambilan Sampel Seluruh tikus sampel yang tersedia dikelompokkan menjadi 5 kelompok perlakuan berdasarkan Simple Random Sampling, sehingga tiap tikus memiliki peluang yang sama untuk semua kelompok.

4.2.5

Kriteria Hewan Percobaan

43

Tikus jenis Rattus novergicus strain wistar Jenis kelamin jantan Usia 8-12 minggu Berat badan 200 g Warna bulu putih bersih Anggota badan lengkap, dan tidak cacat, gerakan aktif, mata jernih Tikus sehat dan tidak menderita penyakit Tidak mendapat pengobatan sebelumnya

4.3

Variabel Penelitian Variabel bebas pada penelitian ini adalah pemberian per oral dosis tepung iles-iles kuning, sedangkan variabel terikat pada penelitian ini adalah kadar kolesterol darah pada tikus coba. Variabel kendali adalah variabel yang dapat dikendalikan oleh peneliti agar objek penelitian selalu terkendali dan dalam keadaan homogen. Variabel kendali dalam penelitian ini meliputi hal-hal sebagai berikut: 1. Jenis tikus 2. Umur tikus 3. Jenis kelamin tikus 4. Berat badan awal 5. Pemberian diet aterogenik 6. Kondisi lingkungan kandang 7. Pemberian per oral tepung iles-iles kuning dengan sonde

4.4

Lokasi dan Waktu Penelitian

44

4.4.1

Lokasi Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Farmakologi untuk

pemeliharaan hewan coba, dan Laboratorium Faal Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang untuk pengukuran kadar kolesterol darah. Penelitian ini berlangsung selama dua bulan, yaitu dari bulan Juli 2011 sampai dengan bulan September 2011.

4.5 4.5.1

Bahan dan Alat Penelitian Bahan Penelitian

4.5.1.1 Bahan Pakan Tikus 1. Diet Normal dan Diet Aterogenik Dalam penelitian ini terdapat dua macam pakan tikus yaitu pakan diet aterogenik untuk tikus kelompok kontrol positif (P1) dan kelompok perlakuan yang juga diberikan tepung iles-iles kuning dosis 0,16 g/hari , 0,32 g/hari , 0,64 g/hari (P2 sampai P4), serta pakan diet normal untuk kelompok kontrol negatif (P0). Pakan normal terdiri dari comfeed PARS, tepung terigu dan air secukupnya sedangkan diet aterogenik terdiri dari PARS, tepung terigu, kolesterol 2%, minyak babi 5%, asam kolat 0,2% dan air secukupnya (Muwarni, 2005). Kebutuhan makan tikus dewasa per ekor untuk diet normal adalah 30,5 g dan untuk diet aterogenik adalah 25 g dengan energi yang sama yaitu 104 kalori. Prinsip pemberian ransum pada beberapa perlakuan adalah isokalori, yaitu masing-masing jenis pakan tikus yang diberikan memiliki kandungan kalori yang hampir sama, tetapi memiliki berat dan

45

komposisi yang berbeda. Komposisi diet tikus dapat dilihat pada lampiran 2 dan 3. 2. Tepung iles-iles kuning a. Dosis iles-iles Tepung iles-iles kuning yang digunakan adalah tepung yang berasal dari iles-iles kuning dari daerah Jawa Timur. Penggunaan dosis didasarkan akan kebutuhan serat manusia yang kemudian dikonversi ke kebutuhan serat tikus coba menggunakan persamaan sebagai berikut (Harmita, 2008): Kebutuhan serat larut air manusia 6 g/hari (Titissari, 2010) Jumlah serat larut air (glukomanan) dalam 100 g tepung iles-iles

kuning 65 g Berat badan rata-rata manusia 70 kg Berat badan rata-rata tikus 200 g Kebutuhan serat larut air tikus/hari

Kebutuhan serat larut manusia x faktor konversi dosis untuk tikus (0,018)

Sehingga: 6 g/hari x 0,018 = 0,108 g/hari

Kebutuhan tikus konsumsi tepung iles-iles kuning Kebutuhan serat larut tikus (g) Kadar serat larut air tepung (g) 0,0108 65 X = = = X jumlah tepung iles-iles 100 gram tepung iles-iles X 100 0,16 g

46

Jadi, dalam penelitian ini terbagi menjadi 3 dosis, yaitu Dosis I: 0,16 g/200gBB/hari Dosis II: 0,32 g/200gBB/hari (2x dosis I) Dosis III: 0,64 g/200gBB/hari (4x dosis I)

4.5.2

Alat Penelitiaan

4.5.2.1 Alat Pemeliharaan Binatang Coba Kandang dari bak plastik Tutup kandang yang terbuat dari anyaman kawat Botol air untuk minum Timbangan analitik Alat untuk memantau keadaan tikus: form pemantauan harian,

timbangan untuk mengukur BB tikus 4.5.2.2 Alat Pengambilan Sampel Darah Binatang Coba jarum suntik dan spuit disposable tabung untuk penyimpanan serum mikropipet sentrifuge

4.5.2.3 Alat Pengukuran Serum Kolesterol mesin Cobas Mira cuvet disposable rak reagen, rak sampel mikro pipet 100 l, mikro pipet 500 l, mikro pipet 1000 l yellow tip dan blue tip

4.5.2.4 Alat Pembuatan Ransum Makan Tikus Sendok

47

Timbangan analitik untuk mengukur kebutuhan tepung iles-iles kuning dan diet aterogenik Baskom Pengaduk Sarung tangan

4.5.2.5 Alat Pemberian Tepung Iles-iles Tepung iles-iles kuning dicampur dengan air hingga mencapai 3 ml, lalu diberikan pada tikus melalui spuit yang ujungnya dipasangi suatu sonde yang bisa melewati mulut, esophagus hingga lambung

4.6 4.6.1

Definisi Operasional Tepung Iles-iles Tepung iles-iles kuning merupakan tepung yang terbuat dari umbi iles-iles kuning dengan kandungan glukomanan sebesar 33%, kemudian

diberikan kepada tikus melalui sonde berdasarkan 3 dosis yang telah ditetapkan.

4.6.2

Diet Aterogenik Diet yang digunakan untuk meningkatkan kadar kolesterol total dalam tubuh tikus diberikan selama 8 minggu dengan kandungan berupa : PARS, tepung terigu, kolesterol 2%, minyak babi 5%, asam kolat 0,2%, dan air secukupnya (Muwarni, 2005).

48

4.6.3

Diet Normal Diet normal merupakan ransum yang komposisinya terdiri dari Confeed PAR-S sebanyak (53%), tepung terigu sebanyak (23.5%), dan air sebanyak (23.5%)

4.6.4

Kadar Kolesterol Darah Besarnya kadar kolesterol darah tikus dalam satuan mg/dl yang diperoleh dari pengujian serum darah tikus dengan menggunakan alat Cobas Mira setelah 8 minggu perlakuan

4.6.5 Dosis tepung iles-iles kuning Besarnya jumlah pemberian tepung iles-iles kuning (dosis I : 0,16

g/200gBB; dosis II : 0,32 g/200gBB; dosis III : 0,64 g/200gBB) per hari yang diberikan kepada tikus strain wistar pada masing-masing perlakuan

49

4.7 Prosedur Penelitian

30 ekor tikus wistar Pakan normal 1 minggu dan pengondisian lingkungan Menimbang berat badan tikus Randomisasi

Diet normal kontrol (-)

Diet aterogenik kontrol (+)

Diet aterogenik + 0,16 g/200gBB/hari tepung iles-iles kuning yang dibuat larutan

Diet aterogenik + 0,32 g/200gBB /hari tepung iles-iles kuning yang dibuat larutan

Diet aterogenik + 0,64 g/200gBB /hari tepung iles-iles kuning yang dibuat larutan

Konsumsi pakan perhari dihitung dari berat awal dan berat akhir pakan

8 minggu

Pengambilan darah tikus dan penghitungan kadar kolesterol darah tikus

Analisa data

4.7.1

Pengkondisian Hewan Coba

50

Tikus jantan dengan berat badan sekitar 200 gram akan ditempatkan pada suhu 25 1 C dengan siklus cahaya selama 12 jam (08.00-12.00). Semua hewan coba akan diberikan diet normal yaitu berupa komposisi comfeed PARS, tepung terigu dan air selama 1 minggu dan diberikan secara ad libitum. Setelah pengkondisian selama 1 minggu, hewan coba akan dilakukan penimbangan berat badan untuk kemudian dibagi secara acak kedalam kelompok negatif, kelompok positif, dan kelompok perlakuan.

4.7.2

Pemberian Pakan dan Tepung Iles-iles Kuning Kelompok negatif akan diberikan diet normal berupa komposisi comfeed PARS, tepung terigu, dan air. Kelompok positif akan diberikan diet aterogenik berupa komposisi kuning telur, lemak kambing, minyak, minyak babi, asam kolat, PARS, dan terigu. Diet normal dan diet aterogenik serta minuman diberikan secara ad libitum. Pada kelompok perlakuan P2 sampai P4, akan diberikan diet aterogenik yang disertai dengan pemberian tepung iles-iles kuning yang sudah dilarutkan melalui sonde. Untuk kelompok kontol negatif dan positif akan dilakukan sonde plasebo untuk menyamakan tingkat stress akibat sonde pada semua kelompok perlakuan. Pemberian tepung iles-iles sesuai dengan dosis yang telah ditentukan yaitu 0,16 g/200gBB/hari, 0,32 g/200gBB/hari, dan 0,64 g/200gBB/hari dengan memperhatikan volume lambung tikus. Volume cairan lambung tikus dalam keadaan nyaman penuh adalah 3,38

51

0,52 ; merenggang 4,63 0,44 dan penuh makanan 6,63 0,92 (Harmita, 2008)

4.8

Pengumpulan Data Teknik pengumpulan data dilakukan dengan pengambilan darah tikus dan penghitungan kadar kolesterol darah pada tikus. Data yang dikumpulkan meliputi: 1. Berat badan tikus yang diperoleh dari penimbangan tikus setiap hari 2. Data asupan makanan perhari dihitung dari sisa makanan yang diberikan pada hewan coba setiap harinya 3. Kadar kolesterol darah tikus yang diperoleh dari pengambilan darah pada tikus

4.9

Analisa Data Data yang didapat dianalisis menggunakan program SPSS 16 for windows. Seluruh data yang ada diuji dengan menggunakan test of homogeneity of variances untuk mengetahui bahwa semua data homogen. Kemudian, dilanjutkan dengan uji one-way ANOVA untuk mengetahui adanya perbedaan kadar kolesterol darah antar kelompok. Jika terdapat perbedaan, maka dapat dilanjutkan dengan uji Post Hoc Tuckey untuk mengetahui perbedaan tiap kelompok. Uji statistik dilakukan dilakukan pada tingkat kepercayaan 95% ( = 0,05), perbedaan dikatakan bermakna jika p < 0,05.