1. En que se basan las tcnicas de extraccin de ADN?

Existen muchas tcnicas de extraccin de ADN pero todas ellas se basan en lo siguiente: Lisis celular. Precipitacin y sedimentacin de proteinas. Concentracin, precipitacin sedimentacin del ADN. Conservacin del ADN. 2. Cul es la tcnica que permite visualizar el ADN extrado?. Indique porqu y como las molculas del ADN se pueden separar a travs de esta tcnica. La presencia de ADN extrado se puede visualizar usando la tcnica de electroforesis. Los cidos nucleicos poseen carga negativa (a pH neutro) debido a los grupos fosfatos que poseen. Por ello durante la electroforesis se desplazan hacia el polo positivo al someterlas a un campo elctrico. La separacin de las molculas de ADN se realiza entonces, en base a su peso molecular (tamao) y a su forma. En cuanto a su peso molecular, las molculas grandes migran ms lentamente a travs del soporte y las molculas pequeas migran ms rpido por lo que recorren diferentes distancias a travs del soporte. Las molculas de ADN tambin se separan de acuerdo a su forma. Por ejemplo: Las molculas de ADN circular relajada migra ms lento y las molculas superhelicoidales por ser compactas migran ms rpido. Despus el ADN se tie para poder visualizarlo, se puede teir con bromuro de etidio y despus de teido se visualiza sobre una lmpara UV. 3. Seale en que se basan las tcnicas de ingeniera gentica e indique cuales son las tres herramientas que utiliza esta tcnica. Se basa en la manipulacin de las molculas de ADN de un organismo para introducirla en el ADN de otro organismo y producir un ADN Recombinante. Las Herramientas que utiliza la Ingeniera Gentica para producir un ADN Recombinante son: -Enzimas de restriccin -Los vectores -Enzimas ADN ligasas

4. Indique en qu tipo de organismos se encuentran las enzimas de restriccin y seales que funcin cumple en estos organismos. En las bacterias existen estas enzimas como mecanismo de defensa, pues son capaces de degradar las molculas de ADN de los virus que las atacan. 5. Indique cmo se utilizan las enzimas de restriccin en la ingeniera gentica, y seale cules son los dos extremos que producen estas enzimas al cortar el ADN. Se utilizan como Tijeras Moleculares que cortan a la doble cadena de ADN en sitios especficos (donde reconocen una secuencia de bases especfica), ya que son capaces de hidrolizar el enlace fosfodiester que une a los nucletidos. Los cortes que realizan las enzimas de restriccin pueden producir dos tipos de extremos: -Extremos cohesivos (pegajosos) -Extremos romos.

6. Explique cul es la nomenclatura para estas enzimas La nomenclatura de las enzimas depende de: Organismo que se asla. Factor de resistencia. Orden del descubrimiento. especie coli cepa RV 13

Gnero Escherichia

Eco RI

primera endonucleasa aislada de esta cepa.

7. Indique qu son los vectores y seale cmo se utilizan en la ingeniera gentica. Indique los tipos de vectores utilizados en estas tcnicas. Los vectores de clonacin, son pequeas molculas de ADN que tienen capacidad para autorreplicarse, para el clonaje del ADN utilizando una clula husped. Son como vehculos que se utilizan en ingeniera gentica para producir un ADN Recombinante Una vez recombinados, los vectores pueden ser posteriormente introducido en una bacteria para la clonacin de ese ADN. Se utilizan con frecuencia dos tipos de vectores de clonacin: plsmidos y bacteriofagos. 8. Indique qu son los plsmidos y seale que tipo de marcadores llevan para ser utilizados como vectores. Adems del cromosoma principal muchas bacterias tienen molculas de ADN circular, con un tamao menor que el del cromosoma. Se replican de forma independiente y de manera ms rpida que el cromosoma bacteriano ya que tienen su propio origen de replicacin. Se suelen utilizar como marcadores, genes de resistencia a antibiticos y genes de bioluminiscencia. 9. Indique qu son los bacterifagos y seale porqu pueden ser utilizados en ingeniera gentica. Bacteriofagos o Fagos, son virus que parasitan a las clulas bacterianas. Son muy utilizadas como vectores en la Ingeniera Gentica, ya que entran a las clulas con facilidad 10. Indique cmo se forma un csmico y cul es su utilidad como vector de clonacin. Los csmicos estn formados por plsmidos y fago lambda. Al plsmido se le adiciona el gen de inters y luego se inserta en un fago. Se construye el csmido, para poder introducir en la clula receptora fragmentos largos de ADN (30,000 a 50,000pb)

11. Indique que son las enzimas ADN ligasas y seale para que son utilizadas en la ingeniera gentica. Son enzimas capaces de unir 2 fragmentos de una misma molcula o de distintas molculas de ADN (ya que son capaces de establecer el enlace fosfodiester entre los nucletidos) Son muy utilizados en la Ingeniera Gentica para Empalmar ADN (unir ADN) y producir un ADN Recombinante.

12. Defina ADN Recombinante y seale los 4 pasos para obtener o clonar un ADN Recombinante. Se define ADN Recombinante al ADN resultante de la combinacin de 2 fragmentos distintos de ADN obtenindose as de manera artificial un nuevo material gentico. Los pasos para conseguir y clonar a un ADN Recombinante en las bacterias son: a.) Cortar y separar, tanto al ADN de inters (al que se quiere introducir) como al ADN del vector (Plasmido o Fago) que se utilizar como vehculo. El corte se realiza en ambos casos con la misma enzima de restriccin que forme extremos cohesivos o pegajosos (no romos).

b.) Por medio de la enzima ADN Ligasa se unen (empalman) por complementariedad de bases el ADN de inters con el ADN vector, obtenindose as el ADN Recombinante.

c.) Introduccin del ADN Recombinante a una clula husped para su transformacin. Los vectores modificados pueden ser colocados de nuevo, en la bacteria y sern copiados en cada divisin celular.

d.) Seleccin de las clulas que han sido Transformadas para proceder a la Clonacin del ADN de inters introducido.

13.

Mencione algunos logros obtenidos de la ingeniera gentica.

Uno de los principales logros que se ha conseguido con la Ingeniera Gentica ha sido el de convertir a microorganismos como las bacterias y levaduras en fbricas vivas productores de protenas. Muchas sustancias teraputicas, como la insulina, el interfern, las vacunas y los antibiticos, se producen hoy gracias a la manipulacin por ingeniera gentica del genoma de bacterias y levaduras. Tambin incluye el desarrollo de plantas y animales superiores que expresan genes ajenos. 14. Qu son los OGM o Transgnicos. OGM (Organismos Genticamente Modificados) o Transgnicos son organismos (bacterias, hongos, plantas y animales) que se le incorporan genes extraos (de otros organismos) por ingeniera gentica. 15. Mencione la utilidad de las plantas transgnicas y de los animales transgnicos. Las plantas transgnicas son cada vez mas importantes en la agricultura pues se le pueden introducir genes que mejoren la resistencia a insectos, hongos o virus, etcAs como tambin mejoran la calidad Ej: frutos o granos con mayor contenido nutricional, alto contenido de fibra, etc. Los animales transgnicos son tiles en la investigacin Tambin comercialmente, ej: Introducir genes que en tejidos mamarios produzca una protena, en la leche es que se obtienen en grandes cantidades y puede obtenerse simplemente al ordear al animal. La protena se purifica despus de la leche.

16. Seale qu son y cmo se obtienen los Fragmentos de Restriccin. Indique cul tcnica est basada en obtener estos tipos de fragmentos y seales alguna utilidad de esta tcnica. El ADN es cortado en sitios especficos por Enzimas de Restriccin obtenindose de estos cortes varios fragmentos de ADN de diferentes tamaos, llamados Fragmentos de Restriccin.Los fragmentos de restriccin se separa por Electroforesis para su anlisis.

La tcnica que esta basada en la obtencin de fragmentos de restriccin es conocida como RFLP (Restriccin de Fragment Length Polymorphims o Polimorfismos en la Longitud de Fragmentos de Restriccin). En el RFLP una vez que ha cortado y separado los fragmentos de ADN por Electroforesis, se permite que el ADN separado en el gel hbride con una sonda (por la tcnica de hibridacin de Southerm) para su posterior determinacin y anlisis. Los anlisis RFLP se pueden utilizar para los estudios de las enfermedades genticas Por lo tanto, las mutaciones, deleciones o inserciones pueden producir la prdida de una diana o bien, la aparicin de una nueva donde antes no exista y de esta manera puede detectarse la mutacin por RFLP. As por ejemplo la enfermedad de las clulas falciforme puede detectarse mediante una alternacin del patrn de restriccin cuando se estudia el ADN humano. Tambin puede usarse esta tcnica para generar un patrn de RFLP que es casi nico para cada individuo, es decir una especie de huella dactilar de ADN. 17. Indique en qu se basa la tcnica de PCR y seale cmo se realiza. Mencione adems cules son los componentes de la mezcla de reaccin para PCR. La tcnica de PCR se basa en la replicacin in vitro del ADN de forma anloga al proceso natural de la replicacin que ocurre in vivo en todas las clulas. La amplificacin in vitro del ADN lo realiza la ADN polimerasa (Taq polimerasa), extrada de bacterias termfilas (Thermus acuatiqus), capaces de resistir altas temperaturas de hasta 95C sin perder su actividad. La reaccin de amplificacin de ADN ocurre dentro de un tubo para PCR, que es colocado en un aparato programable llamado TERMOCICLADOR. Los componentes de la mezcla son: a.) b.) c.) d.) e.) f.) La enzima Taq polimerasa. ADN molde. Desoxinuclesidos trifosfatos (dNTPs). Cebadores o primers. Agua. Tampn o Buffer

La tcnica de PCR comprende: a.) Desnaturalizacin inicial del ADN a 92C. b.) Posteriormente 30 ciclos que comprenden: Desnaturalizacin, 30 segundos a 92C Hibridacin, 2min a 37C Elongacin, 30 segundos a 72C. c.) Elongacin final 8 minutos a 72C. 18. Seale y explique en qu consiste cada uno de los pasos de un ciclo de amplificacin por PCR. Cada ciclo de amplificacin consiste en 3 pasos bsicos: 1. Desnaturalizacin del ADN molde: Por calentamiento del ADN a alta temperatura (92C- 94C ) por un minuto para separar la doble cadena de ADN. 2. Hibridacin o apareamiento de los cebadores o primers al ADN molde reduciendo la temperatura (36C a 56C) por 45 segundos, los primers unen a sus secuencias complementarias del ADN molde separado. 3. Elongacin o crecimiento de la nueva hebra complementaria al ADN molde, se eleva la temperatura a 72 C por 2 minutos para que la Taq polimerasa inicia la sntesis de la nueva hebra a partir del extremo 3 OH de los cebadores apareados al ADN molde. 19. Seale porqu se obtiene millones de copias de un fragmento de ADN despus de la PCR e indique con qu tcnica se visualizan los productos de la PCR. Despus de la PCR se pueden obtener millones de copias de un fragmento de ADN por que en cada ciclo se obtiene un duplicado del ADN proveniente del ciclo anterior. Luego de un determinado n No. de ciclos, en el tubo existen 2n copias del ADN molde, duplicndose en cada ciclo el No. de cadenas de ADN, siendo la amplificacin exponencial o logartmica. Una PCR tpica amplifica de 106 a 109 veces el ADN. Los productos de la amplificacin se observan al separarse en geles de agarosa o poliacrilamida por electroforesis

20. Indique las aplicaciones de la tcnica de PCR. Resulta prcticamente imprescindible en muchas disciplinas : a.) En Biologa Molecular se amplifica ADN para clonar y/o secuenciar. b.) En Biotecnologa, para la identificacin rpida y temprana de OGMs. c.) En Gentica de poblaciones, para caracterizar y conocer la estructura gentica de las poblaciones. d.) En Mejora de plantas y animales, se realiza seleccin asistida por marcadores (RAPD, AFLP, etc.) tcnicas basadas en la PCR. e.) En Medicina, para el tratamiento precoz de enfermedades (cncer, SIDA) y deteccin de mutaciones y translocaciones cromosmicas. f.) En Microbiologa, Botnica y Zoologa para la identificacin de microorganismos, plantas y animales. g.) En Medicina Forense y Legal en la lucha contra el crimen y la determinacin precisa de paternidad. h.) En Antropologa y Geologa con la amplificacin de ADN fsiles y actuales que permite conocer la divergencia de los organismos 21. Seale qu se determina con la tcnica de Secuenciacin y describa cmo se realiza y cmo se determinan los resultados de la Secuenciacin por la tcnica de didesoxi. Con la tcnica de Secuenciacin se determina la secuencia de nucletidos de un ADN. Se ha conseguido gracias a las enzimas de restriccin y a la posibilidad de obtener numerosas copias de un cido nuclico por clonacin. Por digestin con restrictasas se obtienen muchos fragmentos, de diversos tamaos y seguidamente se trata de recomponer la molcula original como si se tratase de un rompecabezas. As se han secuenciado genes, desde virus hasta el genoma humano. El mtodo ms usado para la secuenciacin es el conocido como tcnica de terminacin de cadena de Sanger, la cual se ha perfeccionado conocindose actualmente como la tcnica del didesoxi. Se denomina as por utilizar los didesoxirribonucletidos (izquierda), que han perdido su grupo OH del carbono 3, son ddNTP. En la figura (derecha) vemos un nucletido normal con el grupo OH en el carbono 3, son dNTP normales.

Como los nucletidos se unen por este grupo OH del carbono 3', si se encuentra con un didesoxinucletido ser imposible que se una otro nucletido y la cadena terminar aqu. Como la tcnica se basa en la sntesis de ADN, para hacer la reaccin de secuenciacin se necesita preparar 4 mezclas de reaccin, cada una contienen: 1. Como molde se utiliza una de las cadenas del fragmento de ADN que se va a secuenciar. 2. Como cebador para iniciar la sntesis, se necesita un cebador que es un corto oligonucletido complementario al ADN a secuenciar. 3. Desoxinucletidos de las cuatro bases: dATP, dTTP, dGTP, dCTP. 4. ADN-polimerasa, comienza la polimerizacin en el cebador, pero cesa al incorporarse un didesoxinucletido A cada mezcla de reaccin solo se le pone un tipo de ddNTP (Didesoxinucletidos). Las reacciones se realizan en aparatos secuenciadores. Los fragmentos resultantes se separan por tamao mediante electroforesis. Se lee la sucesin de bandas de cada una de las cuatro reacciones, para obtener la secuencia complementaria del ADN

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE NICARAGUA UNAN-LEN Facultad de Ciencias Mdicas Escuela de Bioanlisis Clnico III Ao

C.CURRICULAR: Biologa Celular.

TEMA: Tcnicas de Biologa Celular.

MSc: Lourdes Callejas.

ELABORADO POR: Ramiro Ignacio Guido Martnez Jos Ramn Rocha Mega. #12 #19

A la libertad por la universidad Fecha 02-06-2010