Curso: Biologa Celular y Molecular

Oscar Nolasco Crdenas MSc.

oscarnol@hotmail.com
Noviembre 2012

 1954 Severo Ochoa descubri la polinucletido fosforilasa, capaz de sintetizar in vitro RNA a partir de ribonucleotidotrifosfato s: RNA polimerasa.

ARN -historia

Ese mismo ao George Gamow funda el RNA tie clubSe reunan 2 veces al ao para discutir sobre la estructura del RNA y como esta contribuye a la formacin de protenas 1955 F Crick propuso su "Adapter Hypothesis referida a la falta de una molcula que porte el aminocido

Reunin del RNA tie club, Cambridge, Inglaterra. Francis Crick (fondo, izquierda), Leslie Orgel (fondo, derecha), Alexander Rich (frente, izquierda), y James Watson (frente, derecha).1955

ARN -historia
Marshall Nirenberg y Heinrich Matthaei.

1961 Marshall Nirenberg inicia sus trabajos para descifrar el cdigo genetico (1961-1962 The coding race: entre el laboratorio de Ochoa y Nirenberg, el primero desisti al ver que tan avanzado estaban los trabajos de Nirenberg) 1965 Robert Holley descubre el ARNt la molcula faltante de Crick 1968 Francis Crick y Leslie Orgel propusieron al ARN como la primera molcula informativa 1986 Thomas Cech y Sidney Altman descubrieron el ARN catalitico (self-splicing) primera evidencia slida de primera molcula informativa 1993 el laboratorio de Harry Noller evidencio la participacin del ARNr en la sntesis de protenas

Severo Ochoa

A Esquema de la estructura cristalogrfica de una ribozima martillo B Modelo en cinta de ribozima martillo

ARN estructura
O

C HN C C

G
CH

H2N-C

ARN es un polimero de ribonucleotidos

NH2

5 end

-O - P O

N 5 CH2 O 4
3 O

1 2

C
N O C N O HN O C CH CH N NH2 C N O O P O O HC C C N O CH CH

pGCUA

OH

O P O O

CH2

Azucar ribosa Enlace fosfodiester Cadenas Direccionales (5 to 3) 4 Bases purines: adenina & guanina pirimidines: citosina & uracilo

O O P O O

OH

C O O

CH2

N CH N

OH

CH2 3

3 end

OH

OH

ARN tipos:
Principales ARN involucrados en los procesos de transcripcin y traduccin: -ARNm -ARNt -ARNr -Otros ARN en eucariotes ARNsn (ARN pequeo nuclear, ARN de edicin), ARNsc (ARN pequeo citoplasmatico, micro ARN) ARNs en E. coli
Tipo Sed. Coef. Mol. Wt. Residuos % del total ARN

mRNA
tRNA rRNA

6 - 25
~4 5 16

25,000 - 1,000,000
23,000 - 30,000 35,000 550,000

75 -3000
73 - 94 120 1,542

~2
16

82

23

1,100,000

2,904

rRNA es el principal componente de los ribosomas

mRNA procariote

mRNA eucariote

tRNA
tRNA estructura primaria Secuencia lineal de 60 a 95 nucletidos de longitud ( Comnmente 76). tRNA estructura secundaria La estructura de hoja de trbol muestra los brazos y los bucles o loops. tRNA estructura terciaria Nueve enlaces de hidrogeno entre las bases en los bucles de simple cadena y el plegamiento de la estructura secundaria en una estructura en forma de L con el anticodon y el brazo aceptor del aminocido en los extremos opuestos de la molcula.

Caracteristicas del tRNA 1. Brazo o tallo aceptor 7-bp apareadas del 5'-terminal con 3'-terminal. Puede contener apareamientos no tipo Watson-Crick. 2. CCA cola Secuencia 3' terminal. En procariotes el CCA es transcrita, y en eucariotes CCA es adicionada post transcripcional. 3. El brazo D tallo de 4 bp que termina en un bucle o loop que contiene dihidrouridina. 4. El Brazo del anticodon tallo de 5 bp apareadas y contiene el loop del anticodon. 5. El Brazo TC tallo de 5 bp apareadas que contiene la secuencia TC donde es una pseudouridina. 6. Un brazo variable, tRNAs de clase 1 contiene 3 a 5 bases y tRNA de clase 2 contiene 13 a 21 bases formando un tallo de 5 bases apareadas 7. Las bases que han sido modificadas por metilacin se encuentran fuera del anticodon. La primera base del anticodon algunas veces es modificada a Inosina (derivado de adenina) o pseudouridina (derivado de uracilo)

Aminoacil-tRNA sintetasas
Catalizan la unin aminocido - tRNA.

Nomenclatura de tRNA-sintetasas and charged tRNAs

Aminoacido: serine tRNA : tRNAser aminoacyl-tRNA sintetasa: seryl-tRNA sintetasa Aminoacyl-tRNA: seryl-tRNAser

Tipos de tRNA-sintetasas

Existen dos tipos de Aminoacil tRNA sintetasas clasificadas en la forma inicial de la unin del aminoacido a la adenina del CCA terminal del tRNA: CLASE I. Aminoacila inicialmente el 2 OH de la adenina, luego por una transesterificacion esta unin se traslada al 3 OH. Comprende las sintetasas para los tRNA de los aminoacidos: Leu,Ile,Val,Cys,Met,Glu,Gln,Arg,Tyr,Trp. CLASE II. Aminoacila el 3 OH de la adenina. Comprende las sintetasas para los tRNA de los aminoacidos: His,Pro,Ser,Thr,Asp,Asn,Lys,Gly,Ala,Phe

Etapa de activacin

La aminoacil tRNA sintetasa une una adenosina monofosfato AMP, al grupo COOH para crear un aminoacil adenilato intermediario. Etapa de transferencia Luego el apropiado tRNA desplaza el AMP. La aminoacil tRNA sintetasa puede realizar el proceso de relectura o proofreading valiendose de los determinantes de identidad del tRNA

Transcripcin
La informacin gentica almacenada en el DNA es transcrita a una copia de RNA complementario a una de las hebras del DNA. La hebra de ADN que ha servido como molde se denomina hebra antisentido y la otra hebra de ADN es denominada hebra codante o con sentido y la secuencia es identica a la del RNA sintetizado ( Excepto en las posicion de T que son cambiadas por U)
Doble hebra de DNA

(5')ATGCGCTATAGCTGTTT(3')

Hebra de DNA no molde (+) codante

(3')TACGCGATATCGACAAA(5') Hebra de DNA molde (-)

antisentido

(5')AUGCGCUAUAGCUGUUU(3') Transcrito de RNA

Localizacin de transcritos

Genoma de adenovirus, ambas hebras contienen codificacin de protenas. Muchos de los mensajeros se sintetizan inicialmente en forma de un transcrito largo que proviene de dos tercios de la longitud del DNA. Este transcrito es modificado posteriormente.

Transcripcin
El transcripto puede ser :
RNA mensajero o mRNA; RNA ribosomal o rRNA; RNA de transferencia o tRNA; o
Otros RNA como ribozimas (act. Enzimatica),RNA de interferencia o iRNA (actividades de regulacin de la expresin gentica), o participar en actividades postranscripcionales de edicin de mRNA (gRNA).

Inicio de la transcripcin
Los factores de transcripcin se unen al promotor

Inicio de la transcripcin
La subunidad sigma de la RNA polimerasa es un Factor de iniciacin que es especifico para la transcripcion de diferentes grupos de genes en E. coli Factor sigma mantiene estable la unin de la RNA polimerasa al promotor en el DNA
La RNA polimerasa de E. coli es una protena con mltiple subunidades: Subunidad Cantidad Rol 2 desconocido 1 forma el enlace fosfodiester 1 se une al DNA molde 1 reconoce al promotor y factores de iniciacin

Ka (M-1) Cualquier regin DNA (no especifico) Core Holo 2 X 1011 1 X 107 Promotor DNA (especifico)

1013 to 1015

Sintesis de RNA: Elongacin de la cadena

RNA
RNA

A=T

A = T

U=A

U=A

La sintesis de RNA generalmente se inicia en una purina ATP or GTP

(el primer nucleotido) La cadena es sintetizada en direccin 5 a 3

Terminacin de la transcripcin
Una vez que el proceso de transcripcin ha comenzado la burbuja de transcripcin avanza a medida que el RNA es transcrito y se contina hasta que la polimerasa encuentra una secuencia que induce la disociacin del complejo DNA-RNA y la separacin de la enzima. En eucariotes esta secuencia no ha sido bien estudiada, mientras que para los procariotes como E. coli se han reconocido dos tipos de seales de terminacin que se diferencian por la ausencia o presencia de un factor proteico que parece reconocer dicha seal.

Terminacin de la transcripcin Rho independiente

Terminacin Rho dependiente

La primera de ellas, conocida como terminacin independiente de rho (r), contiene una secuencia que induce a la formacin de una horquilla en el transcrito de RNA de 10 a 15 nucletidos antes del final, seguida por un tramo de poliA en la cadena molde que facilita la disociacin de los elementos de la transcripcin.

En la terminacin dependiente de r no se presenta el tramo de poliA, aunque s se forma una horquilla en la que la RNA polimerasa hace una pausa y si se encuentra la protena r presente se detiene la transcripcin. No se conoce a detalle el mecanismo de disociacin, pero en este se produce la hidrlisis de ATP por efecto de r.

 Transcripcin en eucariotes

3 RNA Polimerasas en Eucariotes

RNA polimerasa I transcribe la mayoria de los genes de rRNA RNA polimerasa II transcribe todos los genes que codifican proteinas y algunos RNA pequeos nucleares RNA polimerasa III transcribe los genes de tRNA y genes de 5S rRNA y RNA pequeos nucleares

Reconocimiento del promotor

Varias secuencias regulatorias Enhancer

Formacin del complejo de iniciacin

La fosforilacin de la polimerasa II inicia y promueve la sntesis del RNA

Compuestos que inhiben el proceso de transcripcin

Se une al surco menor del DNA

Se intercala entre G y C

EL TRANSCRIPTO DE mRNA EN EUCARIOTE SUFRE DIVERSOS PROCESOS POSTRANSCRIPCIONALES

Splicing

Mecanismo de splicing mediado por el splicesoma

Mecanismo
5 Capping

Proceso de

Poliadenilacin

Regulacin de la expresin por splicing alternativo segn el tejido

Componentes requeridos para las 5 etapas principales de la sntesis de protenas en E. coli

Fase Activacin de aminocidos

Iniciacin

Elongacin

Terminacin y liberacin

Plegamiento de protena y procesos postraduccionales

Componente esencial 20 aa 20 aa-tRNA sintetasa 20 o mas tRNA ATP Mg++ mRNA N-formilmetionina-tRNA Codon de inicio AUG 30S y 50S subunidad ribosomal Factores de iniciacin IF1,IF2, IF3 GTP Mg++ Funcional 70S ribosoma aa-tRNAs especificos por codones Factores de elongacion EF-Tu, EF-Ts, EF-G GTP Mg++ Codon de terminacion en mRNA Factores de liberacion polipeptidica RF1,RF2,RF3 ATP Enzimas especificas, cofactores y otros componentes para la remosion de residuos de iniciacion, secuencias seal procesaciento proteolitico, modificacion de residuos terminal, unin de fosfatos,metilos, carbonilos, carbohidratos, o grupos prosteticos

El inicio de la traduccion involucra el apareamiento del mRNA y el rRNA Shine-Delgarno (SD) es una secuencia que se presenta en muchos transcriptos de procariotes que consta de 3-9 bases del mRNA los que se complementan con el 3terminal del 16S rRNA

En transcriptos mRNA de eucariotes la secuencia que facilita la union inicial del mRNA a la subunidad pequea ribosomal es la secuencia Kozak ACCATGG o (GCC)RCCATGG

La subunidad menor inicia la busqueda del sitio de iniciacion: En Procariotes IF1 previene el enlace prematuro del aatRNA al sitio A IF2 facilita la unin del formilmetionina a la posicin P de la subunidad menor ribosomal IF3 previene el enlace prematuro de la subunidad mayor

Eucariotes usan un complejo de multiples factores de iniciacion

subunidades funcion

eIF1 eIF1A eIF2 eIF2B eIF3

1 1 3 5 11

Reconocimiento de codon AUG codon, destabiliza complejos aberrantes Promueve union del Met-tRNA al40S; GTPasa, guanine nucleotide exchange factor for eIF2 estabiliza la union 40S y Met-tRNA y previene

la asociacin con 60S eIF4A 1 RNA dependiente de ATPasa; esencial para

enlazar los ribosomas al mRNA eIF4B 1 protena de enlace al RNA; promueve la

actividad eIF4A eIF4E eIF4F eIF4G eIF4H eIF5 1 3 1 1 1 Se enlaza al m7G cap cap complejo de enlace eIFs 4A, 4E, and 4G enlaza mRNA, PABP, eIF4E, eIF4A, and eIF3 similar a eIF4B AUG reconoce y promueve actividad de

eIF2 GTPasa eIF5B 1 GTPasa, ensambla el ribosoma

Activacin del aminoaciltRNA

Elongacin

Elongacin

Terminacin

Transcripcin y traduccin ocurren simultaneamente en procariotes

RNA Pol.
Ribosome

mRNA
5

Ribosome

En Eucariotes los procesos de transcripcion y traduccin ocurren en diversos compartimientos

Citoplasma
DNA

Transcripcin
RNA

Procesamiento de RNA
mRNA G
AAAAAA

AAAAAA

Nucleo

Exportacin

Un gen de eucariote
Sitio de inicio 5 UTR de transcripcin Regin no traducida Intrones 3 UTR Regin no traducida

5
Promotor/ Regin de Control

Exon 1 Int. 1

Exon 2 Int. 2 Exon 3

3
Secuencia Terminador

Exones
RNA Transcripto

Exon 1 Int. 1

Exon 2 Int. 2 Exon 3

Procesamiento del mRNA

Exon 1 Exon 2 Exon 3

Cdigo gentico.

El Codigo es un triplete. Un codon son 3 nucleotidos consecutivos de mRNA especifico para 1 aminoacido. Presenta un codon de inicio y otro de termino. ATG para Met como codon de inicio. TAA, TAG, y TGA como codones stop de la traduccion del polipeptido.

El cdigo es universal. En la evolucin el cdigo gentico parece haberse congelado. La mayora de codones tiene el mismo significado en distintos organismos. (Diferencia del cdigo de mitocondria en animales)
Variacin de codones en mitocondria
Codones AGA AGG CUN Arg Leu

NORMAL Animales

UGA Stop

AUA Ile

CGG Arg

Vertebrados Drosofila Levaduras Saccharomyces cerevisiae Torulopsis glabrata Schizosaccharomyces pombe Hongos filamentosos Tripanosomas Plantas superiores Chlamydomonas reinhardtii
? No ha sido observado N es cualquier nucleotido + mantiene el mismo significado

Trp Trp
Trp Trp Trp Trp Trp + ?

Met Met
Met Met + + + + +

Stop Ser
+ + + + + + +

+ +
Thr Thr + + + + +

+ +
+ ? + + + Trp ?

Numero de codones por aminocido

El cdigo es degenerado. Muchos aminocidos tiene mas de un codon a excepcin de Met y Trp.

Codon-anticodon interacciones
Degeneracion de la tercera base

Y la hipotesis del bamboleo

El apareamiento codon-anticodon es crucial en la lectura del codigo genetico el apareamiento de bases es antiparalelo La hipotesis de Crick esta referida a la tercera posicion del codon, o primera posicion del anticodon (posicion de bamboleo) En la tercera posicion del codon pueden ocurrir apareamientos no canonicos, ocurre el bamboleo o alternacion del nucleotido sin alterar la secuencia del polipeptido Ventaja del bamboleo: disociacin del tRNA del mRNA mas rapida

Regla del bamboleo: 1 Reconocimiento de un codon

Anticodon
Codon 2 Reconocimiento de 2 codones Anticodon Codon 3 Reconocimiento de 3 codones Anticodon

Codon
Inosina = Adenosina Inosina = Citidina

Guanosina = Uridina Inosina = Uridina

AUC

mRNA

3
Un tRNAleu puede leer dos de Los codones de leucina

5
GAU CUA G

tRNAleu
Base del bamboleo

mRNA

El codigo esta escrito en el sentido 5 a 3 del mRNA El codigo no se sobrelapa cada nucleotido es leido una sola vez, de manera continua en un MARCO DE LECTURA (ORF)

Marco de lectura ORF

Esta determinado por el codon de inicio AUG siempre el triplete siguiente es ledo como un codon hasta el stop

INICIO ..

FIN

...AGAGCGGA.AUG.GCA.GAG.UGG.CUA.AGC.AUG.UCG.UGA.UCGAAUAAA... MET.ALA.GLU.TRP.LEU.SER.MET.SER

Inicio de un marco de lectura in procariotes and eucariotes

Puede ocurrir en codones internos AUG en mRNA procariote En eucariotes solo puede ocurrir en el primer codon AUG El operon lac en E. coli se transcribe como un mRNA policistronico con multiple codones AUG lac I P O
AUG

lac Z
AUG

lac Y
AUG

lac A
AUG

SD

AUG

AUG Codon interno de Met sin sitio Shine-Dalgarno

SD

AUG

Codon de inicio antecedido del sitio Shine-Dalgarno

Codon de inicio antecedido del sitio Shine-Dalgarno

mRNA de eucariote 5 cap

AUG AUG

El codon de inicio AUG es unico posterior al 5 cap

 TIPOS DE MUTACIONES GNICAS

En el ADN
Sustitucion de bases Transiciones PuPu o PiPi Transversiones PuPi o PiPu Inserciones Deleciones Duplicaciones, Inversiones, Transposiciones

 TIPOS DE MUTACIONES GNICAS

En la protena Mutaciones conservativas Mutacin silenciosa:Tripletes que codifican para el mismo aminocido: AAG(arg)CGG(arg) Mutacin con sentido o neutra:Tripletes que codifican para aminocidos equivalentes distintos. AAA(lys)AGA(arg). Ambos son aminocidos bsicos Mutaciones no conservativas Mutacin cambio de sentido: aparece un nuevo triplete que codifica para un aminocido de distinto tipo. La protena pierde su funcin si afecta su sitio catalitico Mutacin sin sentido: Aparece un triplete de terminacin o stop: CAG(gln)UAG(stop) Mutacin con cambio de marco de lectura inserciones y deleciones cambian el marco de lectura y la posicin del codon stop)
Silenciosa Con Sentido Sin Sentido Readthrough