PAPEL DE LA METALOTIONEINA EN LA ACTIVACION DE LA ApoENZIMA. FOSFATASA ALCALINA taro Bria Columbres, Felipe Rivero Agine aban de Investigaciones Quinn Cina ela acutad de Cenc Ques Bereta Un Asner de Pacha EI objetivo del proyecto de investigacién es desarrollar un modelo en animales que permita dilucidar si las metatotioneinas (Mts) son capaces de transferir al zinc in vivo. Este mecanismo tiene gran relevancia para los organismos, ya que representaria un mecanismo de control metabélico adicional en ciertas situaciones fisioldgicas y patolégicas en los seres vivos. La metalotioneinas son proteinas de baja masa molecular ricas en grupos sulfhidrilo es de fijar metales esenciales (zinc) y metales t6xicos (cadmio, mercutio, plomo, etc). Una de las principales funciones que han sido atribuidas a las metalotioneinas es su ‘capacidad para activar enzimas que dependen de zinc para su funcién mediante la transferencia del metal. Trabajos previos han mostrado que las metalotioneinas son capaces de llevar a cabo la transferencia del metal a varias apoenzimas in vitro, en hhuestro caso particular, la apofosfatasa alcalina (aALP), ésta como enzima (fosfatasa alcalina ALP) presenta incrementos después de la induccién de la colestasis, presentando una actividad maxima a las 16 horas (Brambila y Col. 2000), sin embargo, no existen modelos que prueben esta Funcién in vivo. Para llevar a cabo este modelo nosotros utilizamos u las metalotioneinas, la propargilglicina (PPG), para e\ inhibidor de la sintesis de novo de tar la entrega del zinc ala aALP. MATERIAL Y METODOS Animales y tratamiento Ratas wistar hembra (obtenidas del bioterio de la B.U.A.P.) con un peso aproximado de 120-180g fueron mantenidas en jaulas de policarbonato, en condiciones controladas (temperatura, 23 + 2 °C; ciclo de 12 horas luz oscuridad, comenzando desde las 0600; 50% de humedad relativa); recibieron comida y agua ad libitum. Sin embargo la comida fue retirada después del proceso quinirgico. Las ratas fueron divididas en dos grupos: control y problema, a las que se les administré por via i.p. propargilglicina (50 mg/kg) y agua inyectable respectivamente, durante tres dias. Al tercer dia de la administracién de propargilglicina, las ratas fueron sometidas a una obstruccién biliar mediante un proceso quirirgico abdominal (colestasis). El procedimiento se realiz6 de la siguiente forma: los animales fueron anestesiados con er sulfirico medicinal, se elimino totalmente el pelo # nivel abdominal y se realiz6 una laparotomia ventral de 4 em. Que consistié en la retraccién de la aponeurosis y el masculo para dejar expuesto al higado, después el conducto biliar comin fue aislado y ligado 2 veces, cerca de su unin con el higado, para asegurar fa obstruccién completa. Durante la operacién fue necesario tener cuidado para no dafar tejido pancreitico. arteria hepatica 0 vena porta. Después, la incisién fue cerrada con hilo de sutura, en dos capas peritoneal y muscular. En la fase postoperatoria las ratas fueron mantenidas en Jauias separadas. y anestesiadas de nuevo a las 16 horas para la obtencién de sangre por Puncién cardiaca, y sacrificadas por desangrado, al ser extraido el higado.Resultados ALP hepatica 200 + 180 160 140 120 100 actividad de la ALP (U) o8 888 2 ‘0.Control 135.1408 91.0848 193.0546 Problema 73.9832 43.7303 29.1705 ‘Tomando en cuenta los valores de la tabla, y siendo el grupo de ratas control el 100%. la. actividad de ALP expresada en porcentaje del grupo problema, fue de la siguiente manera: 35%, 32% y 13% respectivamente Discusién de resultados La actividad enzimética de ALP del grupo de ratas problema, comprueba nuestra hipotesis, de que la metalotioneina juega un rol muy importante en la activacin de ésta Ultima, Sin embargo todavia no tenemos evidencia que hayan descendido los niveles de esta proteina en el tejido hepatico debido q que los resultados saldrén en el transcurso de esta semana, Estos resultados obtenidos también nos hacen, pensar que la sintesis de novo de la ALP no es llevada a cabo, por que, al disminuir la reserva en la cisterna de cisteina, a causa de la inhibicién en ta ruta de la cistationasa-y-liasa; el proceso de traduccién del ARNm se detiene al leer los codones UGU y UGC que corresponden al anticodon que transporta a el aminodcido antes mencionado. Esta iltima hip6tesis solo podra comprobarse, haciendo RT-PCR de el ARNm de ALP siguendo el mismo modelo experimental. Aunque esta iltima idea se vendria abaio si puede ser activada la enzima siguiendo el método utilizado por Kenji Sorimachi ConclusionLos resultados obtenidos, son ittiles para ef diagndstico de la obstruccién biliar en personas que tengan alteraciones en el metabolismo del Zin. La cisteina es in aminodcido esencial para la sintesis de novo protéica especialmente de Jas enzimas como es el caso de fa ALP. Agradecimientos Agradezco, a la VIEP por el apoyo brindado al obtener esta beca para realizar el estudio preeliminar de este proyecto que seguramente se convertira en mi temo de tesis También agradezco al Dr. Eduardo Brambila por su apoyo, al Dr. Osvaldo Vindrola y a Ja Dra. Maria Rosa Padrés y a mis compafieros del LIQC. Bibliografia E. Brambila, J. L. Mufloz Sanchez, M. P. Waalkes y A. Albores, Effect of Surgically induced cholestasis on the levels of hepatic zinc and metallothionein in rat liver. 2000 Biol. Trace elements. pp.255-264 Masao Sato and Kauzo T. Suzuki. Recent Studies on measurement of metallothionein and its Isoforms in biological materials. Biomed Res. Trace Elements 1995 6(1) pp. 13- 28. RK. Morton. Separation and purification of enzymes associated with insoluble particles Nature December 30” 1950 pp. 1092-1095 RK. Morton, The purification of Alkaline Phosphatases of Animal Tissues, Nature ‘October 5* 1953 (57) pp. 596-603, Kenji Somarichi. Activation of alkaline phosphatase with Mg’? and Zn’? in rat hepatoma cells. JBC February 5 1987 262(4) pp. 1535-1541