ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LA CERVEZA: ESTUDIOS IN VITRO E IN VIVO

OBJETIVO:

Evaluar la actividad antioxidante de la cerveza tanto por ensayos qumicos como biolgicos. Evaluar el contenido fenolico de la cerveza.

ANTIOXIDANTES
Los antioxidantes son molculas que tienen la propiedad de evitar o prevenir la oxidacin con otras molculas.

Se produce una oxidacin, siempre que una especie cede electrones a otra, la especie que gana electrones se reduce, y la que pierde se oxida. En estas reacciones de oxidacin, a veces, se pueden producir radicales libres, especies muy oxidativas y que pueden producir daos al organismo. Los antioxidantes son especies que acaban estas reacciones, inhibiendo algn producto intermedio y oxidndose los mismos.

COMPUESTOS FENOLICOS DE LA CERVEZA

Los polifenoles presentes en la cerveza provienen de la cascara da la cebada malteada y del lpulo. Estos son: cidos fenolicos ( ferulico, galico, siringico) ; flavonoides de tres tipos ( flavanos, antocianos, flavonoles); entre otros.

MATERIALES Y MTODOS
Cervezas analizadas: 80 cervezas comerciales (Espaa) las cuales se clasificaron en:

46 cervezas rubias

14 cervezas sin alcohol

14 cervezas negras 6 cervezas especiales

METODOLOGA
De cada una de ellas se analizaron 3 botellas, de lotes distintos, con el fin de que los datos encerraran la mxima variacin posible. Todos los anlisis qumicos se realizaron por duplicado.

DETERMINACIN DE LAS FAMILIAS FENOLICAS

Los polifenoles totales se determinaron mediante la reaccin de Folin-Ciocalteau y se expresan en mg/L de acido glico. Las catequinas se avaluaron por reaccin de condensacin con la vainillina y se expresan como mg/L de D-catequina. Las proantocianidinas se determinan tras su transformacin en antocianidinas al calentarse en medio acido, en presencia de oxigeno. Se expresan como mg/L de cloruro de cianidina.

NDICE DE FOLIN-CIOCALTEU (IFC)

Reaccin xido-reduccin entre el reactivo de FolinCiocalteu (se reduce) y los polifenoles de la cerveza (se oxidan).
Reactivo Folin-Ciocalteu es una mezcla de cido fosfotngstico y cido fosfomolbdico (obtenido a partir de di-hidrato de tungstato de sdio y di-hidrato de Molibdato de sodio) Se mide absorbancia a 700 nm del color azul formado (mximo en torno a esa longitud de onda) Funciona midiendo la cantidad de sustancia analizada que se necesita para inhibir la oxidacin del reactivo.

DI - HIDRATO DE TUNGSTATO DE SDIO

Se encuentra a menudo como un dihidrato, Na2WO4.2H2O. Tiene una masa molar de 329,86 g / mol. Se presenta como un slido cristalino blanco. Esta sal es soluble en agua (~ 730 g / L a 20 C) es un agente oxidante fuerte y moderadamente, pero no es muy comn el uso en el laboratorio. Tiene un punto de fusin de 100 C con prdida de agua de hidratacin. Tiene una densidad de 3,23 (20 C).

DI - HIDRATO DE

M OLIBDATO
DE SODIO

Compuesto Inorgnico de Sodio - Sal de Sodio Inorgnico.

Es slido como polvos cristalinos que van de incoloros a blancos.

Apreciable solubilidad en Agua (65 g por 100 ml de Agua a 20C). Temperatura de Fusin 100C (se eliminan dos molculas de Agua). Tiene una densidad de 3.28 a 20C

ANLISIS DE LOS COMPUESTOS FENOLICOS

La separacin se llevo a cabo en funcin del peso molecular, estructura qumica y polaridad. Se uso el metodo de DiStefano y Cravero, este consiste en un fraccionamiento en columna sobre una resina de absorcin (Amberlita XAD-2) de 150 250 um de tamao de partcula.

El fraccionamiento se consigue eluyendo con disolventes de polaridad diversa obteniendose las siguientes fracciones: Agua, ter etlico y metanol. Cada fraccin se llevo a sequedad evaporando el disolvente a 35C en rotavapor. El contenido de fenoles pormenorizados se llevo a acabo mediante HPLC.

MTODO DE DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

Se determinaron cromatograficamente, utilizando el mtodo de Fogliano. Este mtodo tiene las siguientes ventajas:

Mayor estabilidad del punto fijado para la medida.

Alta reproductibilidad interensayo.

Poca sensibilidad ante los antioxidantes hidrofobicos.

Se calcularon las curvas de ensayo con soluciones estndar de Trolox (analogo de alfa- tocoferol) y vitamina C. Los resultados se expresaron en: TEAC (capacidad antioxidante equivalente de trolox), se utiliza para medir la capacidad antioxidante de los alimentos, bebidas y suplementos nutricionales.. CEAC (capacidad antioxidante equivalente de vitamina C).

ANLISIS ESTADSTICO
Se obtuvieron datos suficientes como para poder aplicar distintos tratamientos estadsticos (statgraphics plus para windows).

Se llevaron a cabo anlisis comparativos ANOVA y LSD o t-Students para determinar diferencias significativas. Y anlisis de correlacin lineal simple para estudiar las relaciones entre variables.

ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LA CERVEZA : C ONTRIBUCIN DE LA FRACCIN FENLICA

M ATERIALES

Y METODOS

CERVEZAS ANALIZADAS

Este trabajo se ha realizado con unas 80 cervezas comerciales representativas del mercado actual, bien por sus caractersticas peculiares o porque se consideraron con una presencia significativa entre las consumidas en los ltimos aos. 46 cervezas se clasificaron como "rubias", 14 formaron el grupo de las cervezas "sin alcohol", 14 se englobaron en el grupo de cervezas "negras", y 6 cervezas forman el grupo de "especiales" englobando cervezas de frutas, de trigo y una etiquetada como cerveza "ecolgica". De cada una de ellas se analizaron 3 botellas, intentando que fueran de lotes (cocidas) distintos, con el fin de que los datos encerraran la mxima variacin posible. Todos los anlisis qumicos se realizaron por duplicado.

DETERMINACIN DE LAS FAMILIAS FEN LICAS

Las familias fenlicas Polifenoles Totales, Catequinas y Proantocianidinas se analizaron sobre las cervezas objeto de estudio, por medida directa. En todos los casos se control la posible interferencia de la presencia de azcares y dextrinas para evitar sobrevaloraciones. Los Polifenoles Totales se determinaron mediante la reaccin de Folin-Ciocalteau y se expresan en mg/L de cido glico. Las Catequinas se evaluan por reaccin de condensacin con la vainillina y se expresan como mg/L de D-catequina.

Las Proantocianidinas se determinan tras su transformacin en antocianidinas al calentarse en medio cido, en presencia de oxgeno. Se expresan como mg/L de cloruro de cianidina.

DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES TOTALES

El contenido de azcares reductores totales se evalu basndose en su accin reductora sobre una solucin de cobre (II)

ANLISIS DE LOS COMPUESTOS FENLICOS PORMENORIZADOS: FRACCIONAMIENTO DE LAS CERVEZAS

La separacin de los compuestos fenlicos se llev a cabo en funcin del peso molecular, estructura qumica y polaridad siguiendo el mtodo descrito por DiStefano y Cravero

El fraccionamiento se llev a cabo por duplicado para cada cerveza analizada.

EL contenido en fenoles pormenorizados se llev a cabo mediante HPLC. La identificacin de los compuestos se realiz por comparacin de los tiempos de retencin y los espectros UV-visible con las sustancias patrn. Adems, se realiz un anlisis HPLC-MS para corroborar la identidad de los compuestos, los cuales se expresaron en mg/L.

MTODO DE DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

la actividad antioxidante de la cerveza y de las fracciones aisladas cromatogrficamente, utilizando el mtodo propuesto por Fogliano et al. La eleccin de este mtodo frente a otros similares se realiz teniendo en cuenta las siguientes ventajas: mayor estabilidad del punto fijado para la medida, alta reproducibilidad interensayo, y poca sensibilidad ante los antioxidantes hidrofbicos, reduciendo as las posibles interferencias.

AISLAMIENTO DE CLULAS HEPTICAS

Se utilizaron ratas Wistar machos de 3-4 meses de edad y peso comprendido entre 250-300 g, alimentadas con dieta estndar IPM R-20 comercializada por la casa Letica, Barcelona. Para el aislamiento de las clulas hepticas se utiliz el mtodo de perfusin

PRUEBAS DE VIABILIDAD DE LOS HEPATOCITOS AISLADOS

Para comprobar el porcentaje de clulas viables en la suspensin se utiliz la tcnica de exclusin del azul tripano, consistente en una mezcla en proporcin 1:1 (v/v) de hepatocitos con una solucin de azul tripano al 0,2%, en ClNa al 0,9% (Krebs et al., 1979). De esta mezcla se deposita una gota en una cmara cuenta glbulos de Buerke y se observ en el microscopio ptico. Las clulas con membrana ntegra no permiten la entrada del colorante, quedando transparentes. Las clulas alteradas toman una coloracin azul. El porcentaje de clulas viables fue superior al 85% en todos los casos, coincidiendo con otros autores

PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL PARA EL ESTUDIO DEL EFECTO ANTIOXIDANTE DE LA FRACCIN 3 DE LA CERVEZA EN LOS HEPATOCITOS AISLADOS DE RATA

Aproximadamente 80 mg de hepatocitos aislados fueron incubados en matraces de 25 ml en presencia de adriamicina o doxorrubicina, suministrada por la casa probndose diferentes concentraciones. Finalmente, una vez observados los efectos se eligi una concentracin de 25 mM, en presencia/ausencia de diferentes concentraciones de extracto de cerveza, en concreto la fraccin 3. Se eligi la fraccin 3 porque es la que contiene los flavan-3ol, monmeros y oligmeros de hasta al menos cuatro unidades, tericamente los que mayor actividad antioxidante presentan segn la bibliografa consultada.

Se usaron tanto extractos de cerveza rubia, como negra, por si se detectaban efectos distintos segn el tipo de cerveza.

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD LACTATODESHIDROGENASA (LDH)

La viabilidad celular tras la incubacin se determin por medida de la LDH liberada al medio extracelular, usando la tcnica de Hakala (basada en la conversin de piruvato en lactato)

DETERMINACIN DE LOS PRODUCTOS QUE REACCIONAN CON EL CIDO TIOBARBITRICO (TBARS)

Para determinar los productos que reaccionan con el cido tiobarbitrico se sigui la tcnica de Stacey y Priestly. sta se basa en aadir a 0,4 ml de una suspensin celular de hepatocitos, 1 ml de cido tricloroactico y 2 ml de cido tiobarbitrico cuyas concentraciones son 20% y 0,67% (p/v) respectivamente. De esta manera, se forma un complejo entre el tiobarbitrico y los productos de la peroxidacin lipdica.

DETERMINACIN DE LOS GRUPOS CARBONILO DE LAS PROTENAS DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE ADENOSIN TRIFOSFATO (ATP)

DETERMINACIN DEL GLUTATION REDUCIDO (GSH)

ANLISIS ESTADSTICO

Las distintas repeticiones enunciadas en los respectivos apartados ponen de manifiesto que se obtuvieron datos suficientes como para poder aplicar distintos tratamientos estadsticos, los cuales se llevaron a cabo con el programa Statgraphics Plus para Windows

Los datos se someten a distintos tratamientos estadsticos con el fin de obtener la mayor informacin posible, y para su mejor interpretacin. As se llevaron a cabo anlisis comparativos ANOVA y LSD, o t-Students, para determinar diferencias significativas entre grupos y se recurri al anlisis de correlacin lineal simple para estudiar las relaciones entre las variables.

RESULTADOS

ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE GLOBAL (AAO)

La actividad antioxidante global de las cervezas analizadas oscila entre los valores mnimos y mximos de 2 y 56 mg CEAC, o entre 20 y 190 mg TEAC. Estos rangos fueron similares en los cuatro grupos o tipos de cervezas estudiados.

Tabla I. Valores medios de la actividad antioxidante global por tipos de cervezas.

FAMILIAS FENLICAS Y AZCARES REDUCTORES

Tabla II. Valores medios de las familias fenlicas indicadas y de los azcares reductores totales por grupos de cervezas.

F IGURA 4. C ONTENIDOS DE POLIFENOLES

TOTALES DE LAS CERVEZAS POR GRUPOS

Contenidos de catequinas y proantocianidinas de las cervezas por grupos

CORRELACIN ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y FAMILIAS FENLICAS

Se analizaron las posibles correlaciones lineales entre la actividad antioxidante (TEAC y CEAC) y los valores de las familias fenlicas (polifenoles totales, proantocianidinas y catequinas). Este anlisis se realiz con el conjunto de las cervezas analizadas, sin separarlas por grupos con el fin de estudiar la existencia de una correlacin global. Tan slo se obtuvieron correlaciones estadsticamente significativas (a<0,05) entre la actividad antioxidante y las proantocianidinas, resultados que coincide con los de Goupy et al. Sin embargo, los coeficientes de correlacin no toman valores elevados (0.4707 con TEAC y 0.5576 con CEAC), por lo que la correlacin aunque significativa no puede considerarse estrecha y, por tanto, habr que interpretar estos resultados con ciertas precauciones.

COMPOSICIN FENLICA PORMENORIZADA

La presencia de compuestos fenlicos individualizados en cada fraccin, as como su cuantificacin se llev a cabo por HPLC-DAD.

Tabla I. Contenidos medios de los fenoles indicados por grupos de cervezas

CORRELACIN ENTRE FENOLES PORMENORIZADA Y LA AAO

Los resultados expuestos hasta este momento sealan que la actividad antioxidante global de las cervezas es similar a la de otras bebidas y es independiente del tipo de cerveza. Es decir, tanto en la gama de cervezas rubias, como negras, como en las sin alcohol, se encuentran cervezas con valores de AAO muy variables, y no se ha detectado que dentro de esta variabilidad predominen las cervezas de valores de actividad ms altos en un grupo concreto.

CONCLUSIONES

R ESULTADOS

La cerveza es un producto con una capacidad antioxidante global significativa, con valores similares a otras bebidas alcohlicas como los vinos, o analcohlicas como mostos, nctares o zumos. La actividad antioxidante es independiente, en principio, del tipo de cerveza. Cervezas rubias, negras y sin alcohol presentan valores similares, con mayor variabilidad intra-grupo que inter-grupo.

En general, la dotacin fenlica, tanto global como pormenorizada, de las cervezas es similar, aunque las cervezas negras presentaron contenidos algo mayores.
Las proantocianidinas parecen ser la familia fenlica ms correlacionada con la capacidad antioxidante de las cervezas.

Los compuestos aislados de las cervezas, esencialmente derivados flavan-3ol, (F3) han actuado aumentando la viabilidad celular (LDH), disminuyendo la peroxidacin lipdica (TBARS), aumentando los niveles de ATP, reduciendo la formacin de grupos carbonilo, y finalmente aumentando o mantieniendo los niveles de GSH de hepatocitos aislados de rata y sometidos a la accin de un antibitico antitumoral. Todos estos resultados ponen de manifiesto el poder antioxidante, y por tanto protector, ante el estrs oxidativo inducido por el antibitico antitumoral adriamicina.