Universidade Federal do Rio de Janeiro Escola de Quimica

Prof. Rodrigo Pires do Nascimento 2012

1. Introduo ao Laboratrio de Microbiologia

Apresentao do Laboratrio de Microbiologia Normas de Segurana em Laboratrio Observao dos Microrganismos no Ambiente

Os microrganismos so encontrados em praticamente todos os ambientes naturais, como ar, gua, solo, alimentos, esgoto, corpo humano, plantas, animais, fendas hidrotermais, lagos salinos, etc. Nestas condies, eles se apresentam como populaes mistas, e para que possamos estud-los no laboratrio, necessitamos separ-los em espcies individuais, formando culturas puras. Definies Cultura Pura consiste no crescimento, em meio nutritivo adequado, de um conjunto de clulas idnticas, correspondentes mesma espcie de microrganismo. Colnia aglomerado de clones (clulas idnticas) oriundos da multiplicao de uma clula me (progresso geomtrica), em um meio nutritivo slido, visvel a olho nu. Esterilizao consiste na eliminao de toda e qualquer forma de vida presente em determinado material ou ambiente. Assepsia procedimento que envolve o uso das manobras asspticas, que so tcnicas que impedem a entrada de microrganismos onde no so desejados.

Cultivo de Microrganismos: Meios de Cultura slidos lquidos semi-slidos (agar em p)

agar inclinado agar em placa

Vidraria

tubos (rosca, algodo, alumnio) pipeta Pasteur beckers placas de Petri Erlenmeyers bales volumtricos

Cmaras de Cultivo

banhos incubadoras

Cmaras de Inoculao

cmara assptica cmara de fluxo laminar

Esterilizao: Autoclave Forno Pasteur Filtros Esterilizantes Transferncia de Microrganismos: Alas e agulhas de inoculao Pipetas (vidro ou plstico) Swabs

Preservao dos Microrganismos: Refrigeradores Freezers Liofilizadores Outros materiais de laboratrio: Bico de Bunsen Cnulas de placas e pipetas Algodo cardado Papel de embrulho Esptulas e Pinas

2. Normas de Segurana de Aulas Prticas

No decorrer das aulas, o aluno ir trabalhar com material de baixo risco infeccioso e, por conseguinte, ser responsvel pela sua prpria segurana, pela segurana dos seus colegas, dos funcionrios encarregados pela limpeza da sala e das pessoas que se aproximarem. Mesmo que o risco seja baixo, cuidado nunca demais. Deste modo, a sua atitude na sala de aula dever ser consciente e sobretudo responsvel com as normas de segurana aplicadas a qualquer Laboratrio de Microbiologia NB-1. Assim sendo, visando minimizar os acidentes e aumentar o nvel de conscincia dos profissionais de laboratrio importante seguir algumas normas: Dentro do laboratrio de microbiologia, sempre use um jaleco, guarda-p ou avental. Este equipamento de proteo individual (EPI) proteger voc e suas roupas comuns contra contaminaes e danos, eventualmente, causados por corantes ou outras substncias; No fume no interior da sala. Lembre-se que h gs, material inflamvel e equipamentos sensveis a fumaa (microscpios); Assim que entrar no Laboratrio, lavar as mos antes de realizar qualquer atividade de aula prtica ou pesquisa; Aps trabalhar com qualquer tipo de material microbiolgico, infeccioso ou no, faa a desinfeco das mos com soluo germicida, gua e sabo e tambm faa a limpeza da bancada; Cuidado com gestos bruscos e impetuosos no decorrer de uma prtica ou de um experimento, pois voc pode quebrar algum frasco, espalhando assim material biolgico que pode ser infeccioso; Qualquer contato de mos, partes expostas do corpo ou vestes, com material possivelmente infeccioso, dever ser comunicado ao responsvel imediatamente, que orientar sobre as providncias necessrias; Nunca coloque o instrumental (alas, pipetas, etc.) sobre a mesa, aps ter sido utilizado. Flambe alas e agulhas antes e depois de usar (VERIFIQUE A PRESENA DE DEPSITOS APROPRIADOS PARA O DESCARTE DE PLACAS DE PETRI E PIPETAS);

Antes de acender o Bico de Bunsen, verifique se a entrada de ar do bico esta na posio correta e se a sada de gs esta fechada; Para abrir e fechar um tubo que contenha material microbiolgico ou meio de cultura a ser inoculado, segure-o com a mo esquerda (se for destro), tire a tampa com a mo direita e procure ret-la com o dedo mnimo, sempre dentro da zona de segurana do Bico de Bunsen. Aproxime ento a boca do tubo na chama do bico, inocule ou retire o material e novamente aproxime a boca do tubo na chama. NUNCA DEIXE A TAMPA OU ROLHA SOBRE A MESA. Ao utilizar o microscpio, no esquea de ao findar a sua utilizao, desliga-lo, coloca-lo na posio inicial, retirar a lmina, limpar a objetiva com leno de papel (caso utilize a objetiva de imerso) e cobri-lo adequadamente; Coloque as lminas utilizadas em uma travessa de vidro contendo desinfetante; No mexa, sem autorizao do responsvel, em nenhum equipamento do laboratrio. EVITE ACIDENTES; No abra, sem a ordem do professor, os meios de cultura que estiverem sobre a mesa. EVITE CONTAMINAO. Nunca pipete com a boca cidos, bases ou suspenses com microrganismos. Sempre que possvel use pipetadores ou peras; Dentro de um laboratrio de microbiologia no se deve comer, beber, fazer higiene bucal, maquilagem ou roer as unhas; Cabelos compridos devem ser mantidos presos para evitar acidentes; Mantenha as unhas bem cortadas; Utilize vestimentas adequadas. Sandlias abertas ou Chinelos no so permitidos dentro do laboratrio. Assim voc evita qualquer dano em caso de um possvel acidente; Qualquer problema que venha a ocorrer comunique imediatamente ao responsvel.

Produto Radioativo

Risco Biolgico

3. Boas Prticas de Laboratrio

o conjunto de normas que dizem respeito organizao e s condies sob as quais estudos em laboratrio e/ou campo so planejados, realizados, monitorados, registrados e relatados. 3.1. APLICAES estudos que fundamentam a concesso, renovao ou modificao de registro e pesquisas de produtos qumicos, biolgicos ou biotecnolgicos; testes de produtos qumicos, biolgicos ou biotecnolgicos para obteno de propriedades fsicas, qumicas, fsico-qumicas e dados de segurana; estudos de campos; estudos conduzidos em laboratrios de qualquer natureza. 3.2. UNIDADE OPERACIONAL: Laboratrio A Unidade Operacional engloba instalaes, equipamentos e pessoal necessrio para a conduo dos estudos. O Diretor de Estudos (Pesquisador Principal) o principal responsvel pela conduo do estudo em toda a sua extenso.

A Unidade de Garantia de Qualidade uma pessoa ou um grupo de pessoas, designado pelo Diretor de Estudos para executar as atividades relacionadas garantia de qualidade. Os Procedimentos Operacionais Padro (POPs) so procedimentos escritos que descrevem como conduzir as rotinas laboratoriais ou atividades normalmente no especificadas ou detalhadas no protocolo de estudo. O Patrocinador (Agncia de Fomento) a pessoa ou entidade que d apoio a um estudo atravs de provises financeiras ou outros recursos. 3.3. ESTUDO O Estudo um ensaio ou conjunto de ensaios nos quais uma ou mais substnciasteste so estudadas para a obteno de dados sobre suas propriedades e/ou segurana, com respeito sade humana, vegetal, animal e ao meio ambiente. O Protocolo (Plano) de Estudos o documento que define o ttulo, o objetivo do estudo e como ser conduzido. O Sistema-Teste qualquer animal, planta, microrganismos, sistema qumico, fsico, biolgico ou biotecnolgico ainda no exposto a substncia-teste ou substncia de referncia. Os Dados Brutos so documentos de laboratrio, registros, memorandos, notas ou cpias fiis aos mesmos, resultantes de observaes originais e das atividades de um estudo. O Espcime qualquer material derivado de um sistema-teste encaminhado para exame, anlise ou armazenamento. A Data do Incio do Estudo a data na qual se inicia o trabalho no sistema-teste, devidamente autorizado e assinado pelo Diretor de Estudos. A Data do Trmino do Estudo a data na qual se termina o trabalho no sistemateste, em que os ltimos dados brutos so coletados. A Data de Finalizao do Estudo a data na qual se o relatrio final assinado pelo Diretor de Estudos. A Agenda-Mestre uma tabela onde constam dados referentes aos estudos conduzidos segundo os princpios da BPL, contendo, no mnimo, os seguintes dados: substncia-teste, sistema-teste, natureza do estudo, data do incio do estudo, estado em que se encontra o estudo, identidade do patrocinador e nome do diretor de estudos.

4. Nveis de Biossegurana e Classes de Risco

Para manipulao dos microrganismos pertencentes a cada uma das quatro classes de risco devem ser atendidos alguns requisitos de segurana, conforme o nvel de conteno necessrio. Estes nveis de conteno so denominados de nveis de Biossegurana. Os nveis so designados em ordem crescente, pelo grau de proteo proporcionado ao pessoal do laboratrio, meio ambiente e comunidade.

4.1. Nvel de Biossegurana 1 o nvel de conteno laboratorial que se aplica aos laboratrios de ensino bsico, onde so manipulados os microrganismos pertencentes a classe de risco 1. No requerida nenhuma caracterstica de desenho, alm de um bom planejamento espacial e funcional e a adoo de boas prticas laboratoriais. O nvel de Biossegurana 1 adequado ao trabalho que envolva agentes bem caracterizados e conhecidos por no provocarem doena em seres humanos sadios e que possuam mnimo risco ao pessoal do laboratrio e ao meio ambiente. O laboratrio no est separado das demais dependncias da edificao. O trabalho conduzido, em geral, em bancada, com adoo das boas prticas laboratoriais (BPL). Equipamentos especficos de proteo ou caractersticas especiais de construo no so geralmente usados ou exigidos. O pessoal do laboratrio deve ter treinamento especfico nos procedimentos realizados no laboratrio e devem ser supervisionados por um profissional treinado em Biossegurana e com conhecimentos especficos da rea. Abaixo relacionamos os padres e prticas especiais, equipamentos de segurana e detalhamento de itens referentes s instalaes que devem ser respeitados quando houver a manipulao de agentes classificados como microrganismos da classe de risco 1.

4.2. Nvel de Biossegurana 2 o laboratrio de conteno, onde so manipulados microrganismos da classe de risco 2. Aplica-se aos laboratrios clnicos ou hospitalares de nveis primrios de diagnstico, sendo necessrio, alm da adoo das boas prticas, o uso de barreiras fsicas primrias (cabine de segurana biolgica e equipamentos de proteo individual) e secundrias (desenho e organizao do laboratrio). O nvel de Biossegurana 2 semelhante ao nvel de Biossegurana 1, sendo acrescentado de especificidades que veremos a seguir. adequado ao trabalho que envolva agentes de risco moderado para as pessoais e para o meio ambiente, classificados como microrganismos da classe de risco 2. Difere do NB-1 nos seguintes aspectos: (1) O pessoal de laboratrio dever ter um treinamento especfico no manejo de agentes patognicos e devem ser supervisionados por profissionais competentes; (2) o acesso ao laboratrio deve ser limitado durante os procedimentos operacionais; (3) precaues extremas sero tomadas em relao a objetos perfuro-cortantes infectados; (4) determinados procedimentos nos quais exista possibilidade de formao de aerossis e borrifos infecciosos devem ser conduzidos em cabines de segurana biolgica ou outros equipamentos de conteno fsica.

4.3. Nvel de Biossegurana 3 destinado ao trabalho com microrganismos da classe de risco 3 ou para manipulao de grandes volumes e altas concentraes de microrganismos da classe de risco 2. Para este nvel de conteno so requeridos alm dos itens referidos no nvel 2, desenho e construo laboratoriais especiais. Deve ser mantido controle rgido quanto a operao, inspeo e manuteno das instalaes e equipamentos e o pessoal tcnico deve receber treinamento especfico sobre procedimentos de segurana para a manipulao destes microrganismos. O nvel de Biossegurana 3 possui semelhanas ao

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nvel de Biossegurana 2 e ao nvel de Biossegurana 1, sendo acrescentado de especificidades que veremos a seguir, por isso recomendamos a leitura dos dois nveis anteriores. O laboratrio de nvel de Biossegurana 3, ou de conteno, destina-se ao trabalho com agentes de risco biolgico da classe 3, ou seja, com microrganismos que acarretam elevado risco individual e baixo risco para a comunidade. aplicvel para laboratrios clnicos, de diagnstico, ensino e pesquisa ou de produo onde o trabalho com agentes exticos possa causar doenas srias ou potencialmente fatais, como resultado de exposio por inalao. A equipe profissional deve possuir treinamento especfico no manejo de agentes patognicos, potencialmente letais, devendo ser supervisionados por profissional altamente capacitado e que possua vasta experincia com estes agentes. Esse nvel de conteno exige a intensificao dos programas de boas prticas laboratoriais e de segurana, alm da existncia obrigatria de dispositivos de segurana e do uso, igualmente obrigatrio, de cabine de segurana biolgica. Os trabalhadores devem usar roupas de proteo especficas para esta rea e equipamentos de proteo individual. Alm das prticas padres e especiais estabelecidas para os laboratrios NB1 e NB-2, devem ser adotadas as recomendaes abaixo descritas que se aplicam manipulao de agentes classificados como sendo da classe de risco 3.

4.4. Nvel de Biossegurana 4 Tambm chamado de laboratrio de conteno mxima, destina-se a manipulao de microrganismos da classe de risco 4, onde h o mais alto nvel de conteno, alm de representar uma unidade geogrfica e funcionalmente independente de outras reas. Esses laboratrios requerem, alm dos requisitos fsicos e operacionais dos nveis de conteno 1, 2 e 3, barreiras de conteno (instalaes, desenho equipamentos de proteo) e procedimentos especiais de segurana. O nvel de Biossegurana 4 possui semelhanas quanto aos procedimentos e prticas estabelecidas ao nvel de Biossegurana 3, nvel de Biossegurana 2 e ao nvel de Biossegurana 1, sendo

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acrescentado de especificidades que veremos a seguir, por isso recomendamos a leitura dos trs nveis anteriores, sendo que s deve operar com tcnicos especializados e treinados em procedimentos de Biossegurana. Recomenda-se que os laboratrios de nvel de Biossegurana 4, ou de conteno mxima, s funcionem sob o controle direto das autoridades sanitrias, alm disso, dada a grande complexidade do trabalho, a equipe do laboratrio dever ter um treinamento especfico e completo direcionado para a manipulao de agentes infecciosos extremamente perigosos e dever ser capaz de entender as funes da conteno primria e secundria, das prticas padres especficas, do equipamento de conteno e das caractersticas do planejamento do laboratrio. necessria a elaborao de um manual de trabalho pormenorizado; este deve ser testado previamente atravs de exerccios de treinamento. O nvel de Biossegurana 4 indicado para o trabalho que envolva agentes exticos e perigosos que exponham o indivduo a um alto risco de contaminao de infeces que podem ser fatais, alm de apresentarem um potencial relevado de transmisso por aerossis, classificados como microrganismos da classe de risco 4. Os trabalhadores devem ser supervisionados por profissionais altamente competentes, treinados e com vasta experincia no manuseio dos agentes manuseados, alm dos procedimentos de segurana especficos. O acesso ao laboratrio deve ser rigorosamente controlado por sistemas automatizados. A instalao laboratorial deve estar localizada em uma edificao separada ou em uma rea controlada dentro do edifcio, que seja totalmente isolada de todas as outras. Um manual de operaes especfico para as instalaes deve ser preparado ou adotado. O trabalho deve ser executado exclusivamente dentro de cabines de segurana biolgica Classe III ou dentro de cabines de segurana biolgica da Classe II associadas ao uso de roupas de proteo com presso positiva, ventiladas por sistema de suporte de vida. O laboratrio do nvel de Biossegurana 4 deve possuir caractersticas especficas quanto ao projeto e a engenharia para preveno da disseminao de microorganismos no meio ambiente Todos os procedimentos dentro do laboratrio devem ser conduzidos em cabines de segurana biolgica Classe III ou cabines de Classe II usadas em associao com roupas de proteo pessoal com presso positiva e ventiladas por sistema de suporte de vida.

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Existem dois modelos de laboratrio de nvel de Biossegurana 4: (A) Laboratrio onde todas as manipulaes do agente so realizadas em uma cabine de segurana biolgica Classe III (B) Laboratrio onde a equipe usa uma roupa de proteo de presso positiva. Os laboratrios de nvel de Biossegurana 4 podem se basear em um dos modelos ou em uma combinao dos dois modelos na construo de um s laboratrio. Se a combinao for utilizada, cada tipo deve atender todos os requisitos identificados para o mesmo.

4.5. CLASSES DE RISCO A classificao de risco de um determinado microrganismo patognico baseia-se em diversos critrios que orientam a avaliao de risco e est, principalmente orientada pelo potencial de risco que oferece ao indivduo, comunidade e ao meio ambiente. Cada pas adota uma classificao, onde os microrganismos exticos sofrem um controle rigoroso das autoridades de sade pblica. At 1995, o Brasil utilizava as classificaes existentes mundialmente, tais como a do Center for Disease Control (CDC), National Institute of Health (NIH), Institut National de la Sant et de la Recherche Mdicale (INSERM), Comunidade Europia, dentre muitas. Todas as classificaes utilizam os mesmos critrios para a avaliao de risco dos microrganismos, porm existem alguns critrios variveis de acordo com a realidade epidemiolgica local, o que pode levar confuses. No Brasil, em 1995, com a formao da Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana, em cumprimento da Lei n 8.974 e do decreto n 1.752, do Ministrio de Cincia e Tecnologia, surgem uma srie de instrues normativas, para o gerenciamento e normatizao do trabalho com engenharia gentica e a liberao no ambiente de OGMs em todo o territrio brasileiro. Dentre elas est a Instruo Normativa n 7, de julho de 1997, que estabelece normas para o trabalho em conteno com organismos geneticamente modificados e, apresenta, em seu anexo, a classificao de agentes etiolgicos humanos e animais com base no risco apresentado.

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Esta instruo agrupa os microrganismos em classes de 1 a 4, sendo a classe 1 a de menor risco e a classe 4 a de maior risco.

4.5.1. Classe de risco 1 O risco individual e para a comunidade ausente ou muito baixo, ou seja, so microrganismos que tm baixa probabilidade de provocar infeces no homem ou em animais. Exemplos: Bacillus subtilis, Serratia marcescens. 4.5.2. Classe de risco 2 O risco individual moderado e para a comunidade baixo. So microrganismos que podem provocar infeces, porm, dispe-se de medidas teraputicas e profilticas eficientes, sendo o risco de propagao limitado. Exemplos: Klebisiella pneumoniae, Vrus da Febre Amarela e Schistosoma mansoni, Salmonella tiphymurium. 4.5.3. Classe de risco 3 O risco individual alto e para a comunidade limitado. O patgeno pode provocar infeces no homem e nos animais graves, podendo se propagar de indivduo para indivduo, porm existem medidas teraputicas e de profilaxia. Exemplos: Vrus da Encefalite Equina Venezuelana, HIV e Mycobacterium tuberculosis. 4.5.4. Classe de risco 4 O risco individual e para a comunidade elevado. So microrganismos que representam srio risco para o homem e para os animais, sendo altamente patognicos, de fcil propagao, no existindo medidas profilticas ou teraputicas. Exemplos: Vrus Marburg e Vrus Ebola.

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5. Manobras Asspticas

As manobras asspticas vo impedir, por exemplo, que os microrganismos presentes no ar, ou depositados sobre as mais variadas superfcies que possam estar prximas ao ambiente de trabalho e que podem ser carregados com as partculas de poeira. Assim, impede-se que ocorra a contaminao de materiais estreis e meios de cultivo estreis por estes microrganismos, ou ainda, impedir a contaminao de culturas pura. Objetivo: Conceitos de esterilizao, desinfeco e assepsia; Descrever as principais tcnicas de manobras asspticas; Desenvolver habilidade de manipular tubos de ensaio contendo meio de cultivo estril, bem como transferir microrganismos de um meio slido para outro meio slido e tambm meio lquido. Materiais: Tubos vazios esterilizados (18 x 150 mm); tubos contendo meio caldo simples; pipetas estreis (ou ponteiras de 100 1000 L); tubos de gar simples inclinado; tubos com crescimento de Serratia; alas e agulhas de platina; algodo cardado; papel de embrulho; pipetas Pasteur. Procedimentos: 1- Distribuir o caldo simples estril do tubo estril para um outro tubo vazio e estril, utilizando pipeta Pasteur ou pipeta graduada estril (2 mL) ou ponteiras estreis (100 1000 L) 2- Transferir uma pequena quantidade do crescimento de Serratia marcescens em tubo contendo gar simples inclinado para um outro tubo contendo o mesmo meio de cultivo estril, com auxlio de uma ala de platina. 3- Transferir uma pequena quantidade do crescimento de Serratia marcescens em tubo contendo gar simples inclinado para um outro tubo contendo caldo simples estril. 4- Incubar todos os tubos a 28C por 72 horas.

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Interpretao dos Resultados: Observar, nos tubos de caldo simples, submetidos transferncia em condies de assepsia, caractersticas como ausncia de turvao, no formao de pelcula ou depsito no meio de cultivo. Se por algum motivo for observado qualquer um dos itens mencionados, significa que a manobra assptica no foi conduzida corretamente. Observar, nos tubos de gar simples inclinado submetidos inoculao com S. marcescens, colnias com aspecto vermelho-alaranjado. Se por algum motivo no for observado colnias com essa colorao, indica que o procedimento de assepsia no foi conduzido de maneira correta. Observar, nos tubos de caldo simples submetidos inoculao com S. marcescens, se houve ou no turbidez. Porm, neste caso, no possvel determinar se houve ou no contaminao, pois a grande maioria das bactrias cresce turvando meio de cultivo lquido.

1 flambar a ala

2 remover as tampas e flambar os tubos

3 transferir a cultura

4 flambar os tubos e retampar

5 flambar a ala novamente

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PRINCIPAIS TCNICAS DE MANOBRAS ASSPTICAS a) Trabalhar dentro da zona de segurana do bico de Bunsen ( 10 cm de raio), ou seja, os recipientes com meio de cultivo ou no devem ser abertos prximos a chama do bico; b) Flambar a ala antes e aps a inoculao, SEMPRE; c) Deixar arrefecer o instrumento antes de obter o inculo, dentro da zona de segurana, preferencialmente na parte interna do recipiente, com meio de cultivo; d) Com o auxlio do dedo menor, retirar a rolha de algodo, mantendo a ala bem firme na mo. Em hiptese alguma coloque a ala ou a rolha na bancada ou mesmo retire da zona de segurana; e) Flambar rapidamente a boca dos tubos contendo microrganismos ou meio de cultivo estril, imediatamente aps abri-los e antes de fech-los; f) Introduzir a ala de platina, j arrefecida na zona de segurana, dentro do tubo e retirar o contedo. g) Abrir uma pipeta ou uma caixa de ponteiras estreis dentro da zona de segurana, flamba-la rapidamente, quando for pipeta de vidro e mant-la dentro da zona de segurana.

6. Observaes Microscpicas de Microrganismos

Os microrganismos constituem um grupo de seres vivos com dimenses reduzidas e bastante variveis de acordo com o grupo a que pertencem. Os procariotos podem variar de 0,3 a 1 m (exceto o Epulopiscium, que pode chegar a 600 m). Os eucariotos constituem o grupo mais heterogneo, variando de 10 a 100 m. Os vrus, por sua vez, apresentam uma organizao estrutural totalmente diferente daquelas encontradas em clulas, e variam de 27 a 300 nm. A visualizao dos microrganismos somente pode ser feita atravs de um equipamento denominado microscpio. O microscpio pode ser ptico (utiliza a luz visvel ou ultravioleta para gerar a imagem de um objeto que normalmente est colocado sobre uma lmina de vidro) ou eletrnico.

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A grande maioria dos microscpios pticos capaz de fornecer um aumento final de at 1200 vezes, dependendo das lentes e dos condensadores, mas sem grandes resolues. Porm, a resoluo a capacidade que um sistema ptico tem de distinguir objetos separados por pequenas distncias. Assim, define-se como limite de resoluo a distncia mnima entre dois objetos a partir da qual estes podem ser vistos como entidades individualizadas. O limite de resoluo do microscpio ptico de aproximadamente 0,2 m e conseguido atravs da seguinte frmula: D = 0,61 NA Onde o D corresponde ao limite de resoluo (menor distncia entre dois detalhes separveis) e corresponde ao comprimento de onda da luz visvel, cujo valor mais comumente utilizado de 0,5 m e NA, a abertura numrica. A trajetria da luz de um microscpio ptico no corresponde exatamente ao modelo terico fundamentado nos estudos de ptica geomtrica. A luz cria diferentes rotas decorrentes da sua interao com diferentes tipos de materiais que no pertencem (lminas) ou que pertencem (lentes, aberturas, anis de difrao, espelhos) aos microscpios. As interaes podem ser definidas como Transmisso, Reflexo, Difrao, Absoro e Refrao. As interaes da luz com as lentes dos microscpios pticos causam distores na imagem formada do objeto que quase sempre so percebidas pelo observador como uma falta de foco ou definio final da imagem. As distores mais clssicas da microscopia ptica so conhecidas pelo nome de aberraes e so causadas por diferenas no plano do feixe de luz paralela que entra pelas lentes do microscpio. A aberrao esfrica causada pelo formato das lentes que desviam certos componentes do feixe luminoso provocando diferentes planos de foco. A aberrao cromtica derivada dos diferentes planos de foco de cada um dos comprimentos de onda que formam a luz branca. A curvatura de campo faz com que a imagem de um objeto plano seja curva, ou seja, o objeto ter foco apenas na regio central.

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As aberraes so corrigidas com o uso de lentes compostas formadas por at 10 lentes inseridas no corpo de uma lente objetiva, onde so combinados formatos e materiais diferentes para que se faam as correes necessrias. Existem diferentes tipos de lentes objetivas: a) Acromtica apresenta a melhor correo da aberrao cromtica para a regio central do espectro de luz visvel. So satisfatrias para a observao direta, pois o nosso olho mais sensvel exatamente ao comprimento de onda verde. b) Semi-acromtica possui fluorita na sua composio, semelhante a acromtica. c) Apocromtica a correo da aberrao cromtica se d sobre todo o espectro visvel. d) Plan-acromtica correo equivalente das acromticas e correo para curvatura de campo.

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e) Plan-apocromtica correo equivalente das apocromticas e correo de curvatura de campo.

As lentes objetivas so identificadas por uma srie de cdigos impressos no corpo de cada uma delas, os quais fornecem todas as informaes necessrias para que se escolha a melhor objetiva para a observao de diferentes amostras.

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Cuidados no uso do microscpio

a) Nunca fora-lo. Todas as coneces devem funcionar suavemente. Caso contrrio, chame o professor; b) As lentes da objetiva nunca devem tocar a lmina. Portanto, nunca focalizar abaixando o canho com o parafuso macromtrico olhando para a ocular; c) No tocar as lentes. Se estiverem sujas, limpe-as com algodo ou com pano que sero fornecidos; d) Limpar sempre a objetiva de imerso aps o uso. Se o leo est endurecido, pode aplicar um pouco de xilol sobre o algodo. Cuidado, pois um excesso de xilol pode dissolver o cimento das lentes; e) No esquecer a lmina no microscpio aps o uso; f) Manter a platina sempre limpa e seca. Limpa-la com o guardanapo apropriado. g) No inclinar o microscpio, pois neste curso quase todas as tcnicas empregadas exigem que a lmina seja examinada sempre na posio horizontal; h) Quando o microscpio no estiver em uso, dever ser guardado coberto ou em sua caixa; i) Habitue-se no deixar a fonte de luz acesa quando no estiver utilizando o microscpio

Uso do microscpio
a) Com a amostra a ser examinada sempre na parte superior, colocar a lmina sobre a platina, tomando o cuidado de que a parte a ser examinada esteja bem no centro; b) Ajustar a iluminao de forma a que passe maior quantidade possvel de luz atravs da amostra;

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c) Colocar a objetiva de menor aumento e abaixar o canho utilizando o parafuso micromtrico at que a lente esteja cerca de 0,5 cm da lmina. Nunca efetuar esta operao olhando pela ocular; d) Olhar pela ocular e levantar levemente o canho at obter uma focalizao grosseira. Se no conseguir, repetir a operao; e) Aps focalizar grosseiramente, utilizar o parafuso micromtrico para uma focalizao fina; f) Acertar a quantidade de luz, movimentando o diafragma. A iluminao deve ser adequada, nem fraca nem excessiva. Nunca movimentar o condensador para baixo para diminuir a quantidade de luz. O condensador deve estar sempre em posio elevada; g) Se necessrio um aumento maior, girar o revolver para utilizar a objetiva de aumento 45X. Reajustar a focalizao com o parafuso micromtrico e a iluminao com o diafragma. h) Para utilizar a objetiva 100X, necessria a colocao de uma gota de leo sobre a lmina depois da perfeita focalizao com as objetivas de aumento 10X e 45X. Observando lateralmente, girar o revolver at encaixar a objetiva de aumento 100X, ficando esta imersa no leo e sem que a lente toque na lmina. A seguir, reajustar o foco com o parafuso micromtrico e a iluminao como no item f. Nunca tentar focalizar diretamente com as objetivas de maior aumento

Objetivos: Manusear adequadamente um microscpio ptico; conhecer os principais mtodos de observao microscpica de microrganismos; distinguir morfologicamente bactrias, leveduras, bolores e protozorios; identificar os principais tipos morfolgicos de bactrias.

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Materiais: lminas, lamnulas, microscpios pticos, lupas, bateria de corantes da colorao de Gram (cristal violeta, lugol, fucsina), ala, bico de Bunsen, placas ou tubos com crescimento microbiano (Escherichia coli, Bacillus subtillis, Streptococcus sp., Staphylococcus aureus, Streptomyces sp., Saccharomyces cerevisiae, Aspergilus niger). 1 PARTE (Colorao de Gram) Procedimentos: Culturas bacterianas em meio slido ou lquido, corante cristal violeta, corante fucsina bsica, lugol, etanol-acetona (1:1 v:v), lmina de microscopia; microscpio ptico e bico de Bunsen. A. Composio dos corantes A.1. Soluo de cristal violeta (corante) Soluo A Cristal violeta Etanol:acetona 2,0 g 20 ml Soluo B Oxalato de amnia gua destilada 0,8 g 100 ml

Misturar as solues A e B e deixar em repouso por 24 horas antes do uso. A.2. Soluo de fucsina (contra-corante) Fucsina gua destilada A.3. Soluo de lugol (fixador) Iodo Iodeto de potssio gua destilada 1,0 g 2,0 g 100 ml 1,0 g 100 ml

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Coletar uma pequena amostra de uma suspenso de clulas microbianas ou de uma colnia crescida em agar slido, com o auxlio de uma ala devidamente flambada (estril). B. Preparo do esfregao na superfcie da lmina

C. Colorao de Gram 1- Preparo do esfregao da bactria. Deve-se suspender uma pequena poro da amostra bacteriana a ser corada em uma gota de gua ou soluo salina 0,85%, sobre uma lmina de microscpio, espalhando a gota. Este procedimento deve ser feito com um ala bacteriolgica flambada ou um palito de madeira esterilizado. Deixar o material secar e, em seguida, fix-lo com calor, flambando rapidamente a lmina acima da chama de um bico de Bunsen.

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2- Adicionar soluo de Cristal Violeta ou Violeta de Genciana sobre a superfcie da lmina onde se encontra o esfregao e deixar em repouso por 1 minuto; 3- Descartar o excesso de corante e enxaguar a lmina com gua destilada; 4- Adicionar soluo de Lugol (fixador) sobre a superfcie da lmina onde se encontra o esfregao corado e deixar em repouso por 1 minuto; 5- Adicionar suavemente com lcool 96 para remover o complexo insolvel p-rosaanilina (mximo de 5 segundos) e depois enxaguar a lmina com gua destilada para remover excesso de solvente; 6- Adicionar a soluo de Fucsina ou Safranina sobre a superfcie da lmina onde se encontra o esfregao e deixar em contato por cerca de 40 segundos. Princpio da Colorao de Gram e Interpretao dos Resultados A colorao de Gram um mtodo de colorao de bactrias desenvolvido pelo mdico dinamarqus Hans Christian Joachim Gram (1853-1938), em 1884, e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregao bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina bsica. Essa tcnica permite a separao de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinao da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. O mtodo da colorao de Gram baseado na capacidade das paredes celulares de bactrias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um tratamento com etanol-acetona enquanto que as paredes celulares de bactrias Gram-negativas no o fazem. O mtodo consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio slido ou lquido, com um corante primrio, o cristal violeta, seguido de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactrias Gram-positivas quanto Gramnegativas absorvem de maneira idntica o corante primrio e o fixador, adquirindo uma colorao violeta devido formao de um complexo cristal violeta-iodo (p-rosa-anilina), insolvel, em sua poro hidroflica (citoplasma e espao periplasmtico) e hidrofbica

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(membrana). Segue-se um tratamento com um solvente orgnico, o etanol-acetona (1:1 v:v). O solvente dissolve a poro lipdica das membranas externas das bactrias Gramnegativas e o complexo cristal violeta-iodo removido, descorando as clulas. Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactrias Gram-positivas e provoca a contrao dos poros da peptidoglicana, tornando-as impermeveis ao complexo; o corante primrio retido e as clulas permanecem coradas. A etapa da descolorao crtica, pois a exposio prolongada ao solvente ir provocar a remoo do cristal violeta dos dois tipos de bactrias, podendo produzir resultados falsos. A reteno ou no do corante primrio , portanto, dependente das propriedades fsicas e qumicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura, densidade, porosidade e integridade. Em seguida, a amostra tratada com um corante secundrio (contra-corante), a fucsina bsica. Ao microscpio, as clulas Gram-positivas aparecero coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. Clulas de bactrias Grampositivas, clulas velhas, mortas ou com envelopes danificados por agentes fsicos ou qumicos, tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as clulas coradas como Gram-negativas. Portanto, o uso de material fresco importante. Por outro lado, resultados do tipo "falso Gram-positivo" s so obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido. O corante cristal violeta pode ser substitudo, com os mesmos resultados, pelo azul de metileno e a fucsina bsica pode ser substituda pelo corante vermelho safranina. A fucsina cora muitas bactrias Gram-negativas mais intensamente que a safranina, que por sua vez no cora prontamente algumas espcies de bactrias. O solvente etanolacetona pode ser substitudo por lcool 95%. As figuras 1 e 2 mostram clulas de bactrias Gram-positiva e as figuras 3 e 4 mostram clulas de bactrias Gram-negativa, ambas coradas pelo mtodo de Gram e observadas ao microscpio ptico com aumento de 1000 vezes.

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Figura 1 Bacillus subtilis

Figura 2 Streptococcus oralis

Figura 3 Escherichia coli

Figura 4 Neisseria gonorrhoeae

2 PARTE (visualizao de fungos e leveduras) Em casos clnicos, a observao de um fungo na amostra biolgica tem grande valor diagnstico, pois demonstra a invaso do fungo no tecido e permite uma informao imediata ao mdico, a qual pode ser crucial para determinar a terapia apropriada ao paciente. No entanto, se a quantidade da amostra biolgica for insuficiente para o exame microscpico e cultura do material, a cultura, na maioria das amostras, tem prioridade sobre o exame microscpico, desde que mtodo mais

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especfico e em muitos casos, mais sensvel. O exame microscpico da amostra realizado por vrias tcnicas, dependendo do tipo da amostra e suspeita clnica. - Lactofenol de Amann o mais usado em laboratrios de fitopatologia. Excelente para colorao de esporos e miclios de fungos hialinos. Apresenta ndice de refrao de 1,45. Usualmente adicionase ao Lactofenol de Amann, azul de algodo (corante) na proporo de 0,1 a 0,5%. Composio: cido ltico p.a. ------------------10ml gua destilada --------------------10ml Fenol crist. ------------------------ 10ml - Liquido de montagem de Shear Composio: Acetato de potssio(soluo aquosa a 2%) -------- 300ml Glicerina -------------------------------------------------- 120ml lcool etlico 95% -------------------------------------- 180ml Glicerina p.a. gua - Azul de Amann Composio: Lactofenol de Amann mais azul de algodo a 0,1 0,5% Lactofuscina Fuscina cida -------------------------------------- 0,1g cido ltico --------------------------------------100ml

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EXAME MICROSCPICO DIRETO COM TINTA NANQUIM (TINTA DA CHINA) Utilizada em amostras de lquor, urina, secrees ou exsudatos, para visualizao de leveduras capsuladas do gnero Cryptococcus, que se tornam mais evidentes contra o fundo negro proporcionado pela tinta. Colocar uma gota de tinta nanquim e uma gota do sedimento da amostra centrifugada, sobre uma lmina. Cobrir a preparao com lamnula e observar ao microscpio ptico (objetivas de 10x e 40 x). Nesta tcnica, um erro bastante frequente confundir linfcitos com clulas de leveduras. A diferenciao feita pela refringncia da parede celular e das incluses no citoplasma das leveduras, alm da presena de brotamentos. Cryptococcus sp: leveduras em brotamento rodeadas de halo transparente (cpsula polissacardica), sobre fundo negro formado pela tinta nanquim

EXAME MICROSCPICO COM COLORAO PELO MTODO DE GRAM Todos os fungos so Gram-positivos (coram-se de roxo), assim a utilizao da colorao no visa a diferenciao dos microrganismos, mas possibilita discriminar elementos fngicos de artefatos existentes em urina, secrees e fezes. A amostra

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espalhada de modo homogneo, em movimentos circulares, em uma lmina de microscopia, fixada com calor e submetida colorao. EXAME MICROSCPICO UTILIZANDO FITA ADESIVA Preparaes grosseiras para exame rpido podem ser obtidas estendendo-se sobre a superfcie da leso ou da cultura em placa de Petri um pedao de fita adesiva transparente (durex). A fita removida cuidadosamente e readerida lmina, contendo 1 gota do corante azul de lactofenol. Procedendo-se a observao ao microscpio, utilizando aumento de 100x, 400x ou 1000x. A tcnica se presta especialmente para fungos que esporulam na superfcie de leses / placas de Petri contendo meio de cultivo e cujos esporos no so produzidos no interior da frutificao. Com relao as amostras ambientais, a utilizao de visualizao microscpica essencial para a sua identificao e classificao, atravs da observao de estruturas de reproduo. Primeiramente amostras ambientais devem ser coletadas e transportadas para o laboratrio para serem processadas (isolamento por diluio seriada). Aps cultivar e purificar os fungos isolados da amostra ambiental, a observao microscpica pode ser conduzida por 2 maneiras: (i) microcultivo: lminas contendo uma fina camada de meio de cultivo, no qual o fungo inoculado; (ii) tcnica da fita adesiva EXAME MICROSCPICO UTILIZANDO FITA ADESIVA Preparaes para exame rpido podem ser obtidas estendendo-se sobre a superfcie cultura do fungo em placa de Petri um pedao de fita adesiva transparente (durex). A fita removida cuidadosamente e readerida lmina, contendo 1 gota do corante azul de lactofenol. Procedendo-se a observao ao microscpio, utilizando aumento de 100x, 400x ou 1000x. A tcnica se presta especialmente para fungos que esporulam na superfcie de leses / placas de Petri contendo meio de cultivo e cujos esporos no so produzidos no interior da frutificao.

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EXAME MICROSCPICO DIRETO EM MICROCULTIVO Para executar esta tcnica, necessrio ter uma placa de microcultivo esterilizada. Esta deve conter papel de filtro umedecido com gua destilada estril no fundo da placa e sobre o papel um basto de vidro em forma de U junto com uma lmina e lamnula. A placa funcionar como uma cmara mida para o crescimento do fungo na superfcie do meio de cultivo sobre a lmina.

a e g d c

a) Lmina para microscopia com meio de cultura aps inoculao do fungo. b) Basto de vidro encurvado em forma de "U". c) Papel de filtro embebido em gua destilada estril. d) Placa de Petri. e) Lamnula. f) Meio de cultura. g) Fungo filamentoso.