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DEFINICIONES BÁSICAS
1.1 CROMATOGRAFÍA: Metodología usada principalmente para
la separación de los componentes de una muestra, valiéndose
de la distribución de sus componentes entre dos fases, una en
reposo (fase estacionaria), y otra en movimiento (fase móvil).

Método de separación fisicoquímico basado en la migración

diferencial entre zonas de solutos transportados por una fase
móvil, que son retenidos selectivamente por una fase
estacionaria. La fase estacionaria puede ser sólida o líquida,
extendida como una capa o distribuida como una película. La
fase móvil puede ser líquida, gaseosa o un fluido supercrítico.
DESARROLLO HISTÓRICO:

Se considera a Mikhail Tswett (1872-1919), el padre de la

cromatografía por ser el inventor de la técnica
moderna, y haber establecido parcialmente la
terminología. La utilizó para separar clorofilas,
xantofilas y otros pigmentos vegetales, por medio de
una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio.
Experimento de Tswett
Las especies separadas aparecian como
bandas coloreadas en la columna, por lo
que bautizó a su técnica a partir de las
palabras griegas chroma=color, y
graphos=escritura.
Sistema Cromatográfico: Se denomina así al conjunto de
las fases móvil y estacionaria, la muestra a separar y a
los aditamentos instrumentales que aseguran las
condiciones de temperatura, presión, humedad relativa,
disolventes, etc., necesarios para el desarrollo de la
separación cromatográfica. Algunos ejemplos:

TLC CC HPLC
1.2 Fundamentos Básicos de la Separación:

Cuando la muestra y la fase móvil son forzados a atravesar

la fase estacionaria, pueden entrar en juego diversas
fuerzas fisicoquímicas (interacciones hidrofóbicas-
hidrofílicas, puentes de hidrógeno, interacciones
dipolares y electrostáticas), que propician diferencias
afinidad y atracción entre cada uno de los componentes
de la muestra por la fase móvil o la fase estacionaria.
Así el componente más afín a la fase estacionaria se
retiene más y tarda más en eluir (es decir, en salir de la
columna), y el más afín a la fase móvil se retiene menos
y eluye en menos tiempo.
1.2 Fundamentos Básicos de la Separación:

Para cada componente de una mezcla se establecerá un

equilibrio que involucra la fracción de cada especie
distribuida por cada fase en equilibrio, esto es, para A,
B y C:

Am ⇔ Ae; Bm ⇔ Be; Cm ⇔ Ce
Entonces, puede definirse una Constante de Distribución,
(K), que describa la razón de la distribución de los
componentes de la mezcla entre las fases:

KA = cAe / cAm ; KB = cBe / cBm; KC = cCe / cCm

Las características químicas de A, B y C pueden ser lo

suficientemente diferentes para ser atraídas con
distinta fuerza por la fase estacionaria. Para este
ejemplo, las moléculas de C viajarán a mayor velocidad
que las de B y las de B a mayor velocidad que las de A.
Para que A eluya de la columna es necesario que una
cantidad determinada de fase móvil atraviese la
columna. Esta se denomina Volumen de Elución. (Ve) El
volumen de elución será creciente en el orden C, B y A.
Si se trabaja a caudal constante (p.ej.: en HPLC), el
volumen de elución de cada especie será proporcional a
un tiempo de retención, o tiempo de elución. (tR)
Desarrollo Cromatográfico

Cromatograma: Es un gráfico u otra representación de la

medida de la concentración del efluente versus el
volumen del efluente o el tiempo.
Las abcisas (eje x), corresponden al tiempo durante el
cual se efectúa la medición. Las ordenadas (eje y),
corresponden a la señal analógica proveniente del
detector (absorción, índice de refracción, fluorescencia,
etc.). La altura de la señal indica en cada momento la
intensidad de la respuesta, proporcional a la
concentración de analito, la cual se evalúa por medición
del área bajo la curva o altura del pico, el cual
idealmente corresponde a una distribución normal
gaussiana. Es frecuente que el pico se deforme y
presente asimetrías, las cuales es menester minimizar
ajustando las condiciones operativas
La consecuencia de los procesos individuales aleatorios es
una dispersión simétrica de las velocidades alrededor
del valor medio, el cual representa el comportamiento
más frecuente de las partículas, confiriendo la
carácterística forma gaussiana a los picos de elución.
El movimiento descendente por la columna aumenta la
distancia entre las bandas y a su vez, aumenta el
ensanchamiento de las mismas. Esto puede dar pié a
una disminución en la eficiencia de separación, aunque
pueden encontrarse condiciones en que el
ensanchamiento de las bandas ocurra más lentamente
que la separación de las mismas.
Durante la migración a través de la f.e., un analito experimenta
miles de transferencias entre fases. El tiempo que pasa en
cada fase después de una transferencia depende de que gane
suficiente energía térmica del medio para producir la
transferencia inversa. Un analito eluye solamente cuando
reside en la fase móvil. El ensanchamiento de la banda se
relaciona directamente con el tiempo de residencia en la
columna e inversamente con la velocidad a la que fluye la
fase móvil.
2. Clasificación de la Cromatografía:

2.0 Por la geometría de contacto entre las fases:

•  Cromatografía Plana:
•  La F.E. se mantiene sobre una placa lisa o en los
intersticios del papel.
•  La F.M. se desplaza a través de la F.E. por capilaridad o
gravedad.

•  Cromatografía en Columna
•  La F.E. se sostiene por las paredes de la columna.
•  La F.M. se desplaza a través de la F.E. por adición
continuada.
2.1 Por el tipo de fase móvil y estacionaria:

•  Cromatografía de líquidos.

•  Cromatografía de gases.

•  Cromatografía de fluidos supercríticos.

•  Cromatografía de líquidos.
•  Cromatografía en fase normal: fase móvil no polar y fase
estacionaria polar (sílica gel).
•  Cromatografía en fase reversa: fase móvil de naturaleza polar
y fase estacionaria no polar. La cadena hidrocarbonada puede
ser de cadena larga (C18), cadena intermedia (C8), cadena
corta (C2.