Welcome to Scribd, the world's digital library. Read, publish, and share books and documents. See more ➡
Download
Standard view
Full view
of .
Add note
Save to My Library
Sync to mobile
Look up keyword
Like this
1Activity
×
0 of .
Results for:
No results containing your search query
P. 1
Isolasi dan karakterisasi lipase dari tanah TPA

Isolasi dan karakterisasi lipase dari tanah TPA

Ratings: (0)|Views: 232|Likes:
Published by Amin Fatoni
Tulisan ini merupakan hasil penelitian tentang isolasi dan karakterisasi enzim lipase dari tanah tempat pembuangan sampah, yang dipublikasikan di Jurnal Natur Indonesia 12(2), April 2010: 124-129
Tersedia juga free akses di http://lib.unri.ac.id/ejournal/index.php/JN/article/view/133/127
Tulisan ini merupakan hasil penelitian tentang isolasi dan karakterisasi enzim lipase dari tanah tempat pembuangan sampah, yang dipublikasikan di Jurnal Natur Indonesia 12(2), April 2010: 124-129
Tersedia juga free akses di http://lib.unri.ac.id/ejournal/index.php/JN/article/view/133/127

More info:

categoriesTypes, Research, Science
Published by: Amin Fatoni on Dec 17, 2012
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PDF, TXT or read online from Scribd
See More
See less

07/17/2013

pdf

text

original

 
124
 Jurnal Natur Indonesia
12(2): 124-129
Zusfahair,
et al.
 
 Jurnal Natur Indonesia
12(2), April 2010: 124-129ISSN 1410-9379,Keputusan Akreditasi No 65a/DIKTI/Kep./2008
*Telp: -Email: -
Isolasi, Pemurnian dan Karakterisasi Lipase Bakteri HasilSkrining dari Tanah Tempat Pembuangan Akhir (TPA) GunungTugel Banyumas
Zusfahair
*)
, Tien Setyaningtyas, Amin Fatoni
Program Studi Kimia, Fakultas Matematika Ilmu Pengetahuan Alam, FST,Universitas Jenderal Soedirman PurwokertoJl. Dr Soeparno 62, Karangwangkal, Purwokerto Jawa Tengah 53123
Diterima 07-11-2008 Disetujui 23-03-2009
ABSTRACT
A bacterial lipase producer was isolated from garbage dump soil and was identified its genus. Lipase was extractedaccording to production time optimized, purified using ammonium sulfate fractionation and gel chromatograph.Determination of enzyme characteristic studied were influence of pH, temperature, various metals to lipaseactivity. The result of this research shows that the genus of isolated bacteria which produced lipase was
Acinetobacter 
sp., the lipase optimum production time is about 18 hours with the activity is about 115 unit/mL. Thehighest activity of lipase fractionation using ammonium sulfate is about 45% and the highest activity of purifyingwith filtration gel chromatograph column using Sephadex G-150 at 24
th
fraction. Lipase from crude extract andpurifying product at this fraction has optimum pH 6 and optimum temperature is about 40
o
C. Lipase to be classifiedas metalloenzyme that shows with decreasing the activity after added the EDTA. Metals ion, such as Cu
2+
and Zn
2+
were inhibited the lipase activity. Ca
2+
ion could increase lipase crude extract activity but inhibited the activity oflipase purifying product. Hg
2+
ion could increase the activity of lipase purifying product.Keywords
:
Acinetobacter 
sp, garbage dismissal place’s soil, lipase
PENDAHULUAN
Lipase merupakan biokatalisator yang mempunyaikemampuan mengkatalisis reaksi hidrolisis lipidmenjadi asam lemak dan gliserol. Oleh karenakemampuannya dalam menghidrolisis lipid, lipase dapatdimanfaatkan sebagai aditif dalam industri detergen.Lipase yang digunakan dalam industri detergenmempunyai sifat seperti rentang pH antara 8-10,5,serta tetap aktif pada suhu 30
0
C-60
0
C.Sharma
et al 
., (2001) melaporkan bahwa totalpasokan enzim di dunia masih didominasi oleh negaraEropa. Hal tersebut mendorong upaya untukmengisolasi dan memurnikan lipase. Lipase telahdiisolasi dari hewan, tanaman dan mikroorganisme.Mikroorganisme penghasil lipase ditemukan dalambermacam-macam habitat seperti limbah industri,pabrik pengolahan minyak sayur, perusahaan susu,tanah yang terkontaminasi dengan minyak, makananyang membusuk, timbunan kompos (Sharma
et al.,
2001). Kojima dan Shimizu (2003) berhasil memurnikanlipase yang diisolasi dari bermacam-macam tanahseperti tanah sawah, kebun sayur dan hutan. Pemurniandilakukan menggunakan fraksinasi fenil-toyopearl,kromatografi DEAE-sepharosa dan kromatografisuperdex-200HR. Enzim yang diperoleh mempunyaiaktivitas spesifik 9854 U/mg dengan tingkat kemurnian24,3 kali ekstrak kasar.Tempat Pembuangan Akhir (TPA) limbah rumahtangga dan industri kecil diduga mengandung bakteripenghasil lipase, karena merupakan tempatpenimbunan bermacam-macam sampah, sepertimakanan yang membusuk dan limbah rumah tanggayang mengandung minyak. Sampah-sampah tersebutkemungkinan juga telah membentuk kompos. Olehkarena itu tanah TPA berpotensi mengandung bakteripenghasil lipase. Penelitian ini mempunyai tujuanmendapatkan isolat bakteri yang dapat menghasilkanlipase dari tanah TPA, dan menganalisis karakteristikenzim lipase yang dihasilkan.
METODE PENELITIAN
Alat dan Bahan.
 Alat-alat yang digunakan adalahalat-alat gelas yang umum digunakan padaLaboratorium Kimia. Bahan yang digunakan: NaCl,
 
Isolasi, Pemurnian dan Karakterisasi Lipase
125
medium NB (peptone from meat 5 g, yeast ekstrak3 g/l), minyak olive, ammonium sulfat, sephadexG-150, selophan, tributirin agar (komposisi per liter :pepton daging 2,5 g, pepton kasein 2,5 g, ekstrak ragi3 gr, agar 12 g dan tributirin 10 ml), buffer tris-HCl,buffer natrium asetat-HCl, buffer natrium fosfat, NaOH,polivinil alkohol, aseton, etanol, CuCl
2
, CaCl
2
, EDTA,HgCl
2,
Prosedur Kerja.
Penelitian ini akan dilakukandengan langkah sebagai berikut:
Isolasi Mikroorganisme Penghasil Lipase.
Mikroorganisme diisolasi dari sampel tanah TempatPembuangan Akhir (TPA) Gunung Tugel Banyumas.Skrining mikroorganisme penghasil lipase menggunakancawan petri yang berisi medium tributirin agar. Kultur diinkubasi pada 37
0
C selama 2 hari. Koloni penghasillipase yang memperlihatkan zona bening diukur indekslipolitiknya. Indeks lipolitik dinyatakan sebagai nisbahantara diameter zona bening dengan diameter koloni.Isolat yang memiliki indeks lipolitik terbesar dinamakanisolat potensial penghasil lipase (Gupta
et al.
, 2003).
Identifikasi isolat penghasil lipase yangpotensial.
Uji biokimia dan uji morfologi (pengamatansel) dilakukan untuk identifikasi bakteri. Uji biokimiameliputi uji katalase, uji oksidase, dan uji reduksi nitrat.Bakteri ditumbuhkan dalam medium tumbuh untukmengetahui jenis bakteri tersebut. Bakteri selanjutnyadiidentifikasi melalui serangkaian uji biokimiawi dan ujimorfologi. Identifikasi dilakukan di LaboratoriumMikrobiologi Fakultas Biologi Universitas JendralSoedirman Purwokerto.
Produksi Lipase.
Isolat potensial diinokulasike dalam 10 ml medium inokulum (medium NB),diinkubasi selama 2 hari dengan pengocokan 300 rpmpada suhu 37
0
C. Medium NB sebanyak 50 mldiinkubasi selama 5 menit, kemudian ditambahinokulum bakteri 0,5 ml dan minyak olive sebagaiinduser 0,5 ml. Medium produksi diinkubasi pada suhu37
0
C sambil digoyang dengan kecepatan 300 rpmselama 6, 12, 18, 24, 30 dan 36 jam dan diamatiaktivitas lipase yang dihasilkan isolat bakteri padainterval waktu tersebut.
Ekstraksi Lipase.
Medium produksi yang telahdiinkubasi diekstraksi dengan menggunakan sentrifuspada kecepatan 10.000 g selama 20 menit. Supernatanyang diperoleh disebut ekstrak enzim kasar. Enzimenzim kasar diuji aktivitas dan kadar proteinnya.Ekstrak enzim kasar yang mempunyai aktivitas tertinggidilakukan fraksinasi.
Fraksinasi Lipase.
Fraksinasi dilakukan denganpenambahan ammonium sulfat secara bertahap pada15, 30, 45 dan 60% jenuh. Caranya sebagai berikut:amonium sulfat sebanyak 15% dimasukkan secaraperlahan ke dalam gelas piala yang berisi ekstrak lipasesambil diaduk dengan
magnetic stirrer 
sampai terbentukendapan. Ekstrak kasar lipase kemudian disentrifuspada 10.000 g selama 20 menit. Endapan yang diperolehdinamakan F1. F1 dilarutkan dalam NaCl 1% dandisimpan pada suhu 4
0
C. Supernatan hasil fraksinasipertama ditambah ammonium sulfat sebanyak 30%,selanjutnya dilakukan prosedur yang sama sehinggadiperoleh F2. Prosedur yang sama dilakukan untukmenghasilkan fraksi ammonium sulfat 45% (F3) dan60% (F4). Seluruh fraksi yang dihasilkan didialisismenggunakan selophan (Saxena
et al.,
2003). Fraksihasil dialisis dinamakan FHD1 (fraksi 15%), FHD2(fraksi 30%), FHD3 (fraksi 45%) dan FHD4 (fraksi 60%).Seluruh fraksi diuji aktivitas, kadar protein, aktivitasspesifik, tingkat kemurniannya.
Kromatografi Kolom Filtrasi Gel.
Fraksiendapan amonim sulfat yang memiliki unit aktivitasyang paling tinggi dilanjutkan pemurniannya denganmetode filtrasi gel sephadex G-150. Langkahlangkahnya adalah sebagai berikut (Subardjo
et al.,
1997).Pembuatan kolom sephadex G150. Tepungsephadex G150 sebanyak 7 g dikembangkan dengan400 ml akuades dan diinkubasi pada suhu kamar selama 72 jam. Suspensi ini dibiarkan sampaimengendap. Gel yang mengapung dibuang, sedangkangel yang mengendap dijaga agar tetap terendam dalamakuades. Gelembung-gelembung udara yang terdapatdi dalam partikel-partikel gel dikeluarkan dengan caramengurangi tekanan udara diatas permukaan suspensimenggunakan pompa vakum. Gel kemudian direndamdalam buffer tris HCl pH 7,2. Kelebihan buffer di atasgel yang mengendap disisakan lebih kurang 1 cm. Geldiaduk perlahan-lahan dan dimasukan lewat batangpengaduk ke dalam kolom gelas dengan panjang30 cm dan diameter 2,5 cm dan buffer tris HCl pH 7,2setinggi 5 cm. Gel dibiarkan mengendap semuanya.Pemurnian Lipase dengan Kolom SephadexG-150. Sebanyak 5 ml fraksi hasil dianalisis denganaktivitas tertinggi dimasukkan ke dalam kolom dengan
 
126
 Jurnal Natur Indonesia
12(2): 124-129
Zusfahair,
et al.
hati-hati agar gel tidak rusak. Kolom dihubungkandengan sumber eluen lewat pipa plastik. KolomSephadex G-150 yang terjadi dielusi dengan buffer pengembangnya dengan kecepatan tetesan 6 menitper tetes. Kran kolom kaca dibuka, eluat ditampungdalam botol ampul sebanyak 100 buah. Semua eluatditentukan aktivitas, aktivitas spesifik dan kadar proteinnya. Fraksi yang mempunyai aktivitas palingtinggi selanjutnya ditentukan tingkat kemurnian danbeberapa karakteristiknya meliputi pH optimum, suhuoptimum, pengaruh beberapa logam berat.
Pengukuran Aktivitas Lipase.
 Aktivitas lipasediukur dengan medium emulsi minyak olive. Campuranreaksi mengandung 2,5 mL emulsi 2 : 1 : 1 = gumarab : Bufer fosfat 0,2M (pH 8) : minyak olive), ditambah0,2 mL larutan enzim, diinkubasi pada 37
0
C selama30 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan 2,5ml aseton/etanol 1/1 (v/v). Asam lemak yangdibebaskan dititrasi dengan 0,05 N NaOHmenggunakan phenoptalin (pp) sebagai indikator.Pengukuran 1 unit enzim (U) adalah jumlah yangmenyebabkan perubahan 1
mol substrat (minyak olive)permenit pada keadaan pengukuran optimum (Kojima& Shimizu, 2003).
Penentuan Kadar Protein.
Sebayak 0,5 mlsampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudianditambah dengan 5 ml pereaksi C. Larutan-larutantersebut dikocok dan dibiarkan pada suhu kamar selama10 menit, kemudian ditambah Follin Ciocalteu sebanyak0,5 ml, dikocok dan dibiarkan selama 30 menit.Serapan larutan diukur pada panjang gelombang750 nm. Kontrol dibuat dengan cara yang sama, dengansampelnya akuades. Standar protein dibuat denganmemasukkan 0,5 ml kasein
Hamerstein 
dalam bufer Tris-HCl ke dalam 6 buah tabung reaksi dengankonsentrasi 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; dan 1,0 mg per ml,selanjutnya perlakuan sama seperti sampel(Lowry 1964 dalam Bollag
et al.,
1996).
Karakterisasi Enzim.
Karakterisasi enzimmeliputi pH optimum, suhu optimum dan penentuanpengaruh beberapa logam berat terhadap aktivitas lipase
Penentuan pH Optimum.
Posedur kerjapenentuan pH optimum sama seperti pada uji aktivitas,tetapi dengan variasi pH. Variasi pH yang dilakukanadalah 5, 6, 7, 8, dan 9. Nilai pH optimum merupakanpH pada saat enzim mempunyai aktivitas tertinggi. Ujiaktivitas untuk pH 5 digunakan 100 mM buffer natriumasetat- HCl, untuk pH 6-7 digunakan 100 mM buffer natrium fosfat, sedangkan untuk pH 8, dan 9 digunakanbuffer tris HCl.
Penentuan Suhu Optimum.
Penentuan suhuoptimum dilakukan seperti uji aktivitas dengan variasisuhu 30, 40, 50, 60 ,70, 80, dan 90
0
C . Pengujiandilakukan pada pH optimum yang telah diperoleh daritahap sebelumnya.
Pengaruh EDTA dan Logam terhadap AktivitasLipase.
Penentuan pengaruh penambahan EDTA danion logam (Ca
+2
, Zn
+2
Cu
2+
, Hg
+2
) ditentukan denganmenambahkan EDTA dan ion-ion logam masing-masingdengan konsentrasi 10
-2
M sebanyak 0,06 ml ke dalamlarutan sampel sehingga konsentrasi akhir larutan padasaat uji aktivitas dilakukan adalah 10
-3
M. Sebagaipembanding aktivitas dilakukan uji pada sampel enzimtanpa penambahan EDTA dan ion-ion logam.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi dan Identifikasi Bakteri PenghasilLipase dari Tanah TPA.
Sampel tanah diambil dari(TPA) Gunung Tugel, Purwokerto Selatan, Banyumas.Bakteri ditumbuhkan pada medium tributirin agar, dankoloni terpilih untuk produksi lipase adalah kolonidengan zona jernih terbesar, yang menunjukkan lebihbanyak trigliserida dari medium dihidrolisis enzim lipasebakteri tersebut. Isolat yang mempunyai zona jernihterbesar, selanjutnya diidentifikasi jenis bakterinya dandigunakan untuk memproduksi enzim lipase. Hasilidentifikasi koloni bakteri penghasil lipase yang terpilihuntuk produksi terlihat dalam Tabel 1.
Penentuan Waktu Produksi Optimum.
Waktuproduksi optimum ditentukan dengan mengisolasienzim yang dihasilkan dalam rentang waktu inkubasi
Tabel 1. Hasil identifikasi bakteri tanah TPA Gunung Tugel penghasil lipaseMorfologi koloniBentuk selGramUji katalaseUji oksidaseUji reduksinitrat Asam darikarbohidratPendugaan jenis M.OTumbuh di N
utrient Agar 
dengan ciri koloni : kolonikecil, bentuk teratur tepiberlekuk, ukuran kecil, warna jernih, permukaan mengkilap,elevasi cembung rendahCoccus(-)(+)(-)(-)Glucose (+)Fructose(+)
Acinetobacter,
sp.

You're Reading a Free Preview

Download
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->