UNIVERSIDADE DE SO PAULO INSTITUTO DE QUMICA

BIOQUMICA QBQ220N Biologia Noturno

Professores Alexander Henning Ulrich Hugo Aguirre Armelin

2006

NDICE

APRESENTAO................................................................................................................................5 INTRODUO E NORMAS GERAIS ..................................................................................................5 NORMAS E RECOMEDAES NO LABORATRIO ........................................................................6 GUIA PARA RELATRIO DE LABORATRIO ..................................................................................6 AVALIAO.........................................................................................................................................7 BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA ......................................................................................................7 CALENDRIO DE MDULOS E ATIVIDADES 2006 .........................................................................8 MDULO 1: REAO CIDO-BASE, PH E SISTEMA TAMPO....................................................10 Grupos de discusso 1 ....................................................................................................................11 MDULO 2: AMINOCIDOS.............................................................................................................12 Grupo de discusso 2 ......................................................................................................................12 MDULO 3: ESTRUTURA PRIMRIA DE PROTENAS ..................................................................15 Grupo de discusso 3 ......................................................................................................................16 MDULO 4: ESTRUTURA SECUNDRIA E TERCIRIA DE PROTENAS....................................17 Grupo de discusso 4 ......................................................................................................................20 MDULO 5: CINTICA E TERMODINMICA ..................................................................................21 Grupo de discusso 5 ......................................................................................................................25 MDULO 6: CINTICA ENZIMTICA...............................................................................................26 Grupo de discusso 6 ......................................................................................................................30 MDULO 7: MECANISMOS DE CATLISE ENZIMTICA ..............................................................32 Grupo de discusso 7 ......................................................................................................................34 MDULO 8: ACARES: ESTRUTURA E FUNO ......................................................................35 Grupo de discusso 8 ......................................................................................................................39

MDULO 9: GLICLISE ...................................................................................................................40 Grupo de discusso 9 ......................................................................................................................43 MDULO 10: CICLO DE KREBS ......................................................................................................44 Grupo de discusso 10 ....................................................................................................................45 MDULO 11: CADEIA RESPIRATRIA E FOSFORILAO OXIDATIVA .....................................46 Grupo de discusso 11 ....................................................................................................................48 MDULO 12: GLICONEOGNESE...................................................................................................49 Grupo de discusso 12 ....................................................................................................................50 MDULO 13. CIDOS GRAXOS: ESTRUTURA, FUNO E METABOLISMO .............................51 Grupo de discusso 13 ....................................................................................................................54 MDULO 14: LPIDES, MEMBRANA & TRANSPORTE ..................................................................55 Grupo de discusso 14 ....................................................................................................................58 MDULO 15: CICLO DAS PENTOSES ............................................................................................60 Grupo de discusso 15 ....................................................................................................................61 MDULO 16 E 17 FOTOSSNTESE...............................................................................................62 Grupo de discusso 16 ....................................................................................................................63 Grupo de discusso 17 ....................................................................................................................64 MDULO 18: METABOLISMO DO GLICOGNIO ...........................................................................65 Grupo de discusso 18 ....................................................................................................................67 MDULO 19: CONTROLE HORMONAL DO METABOLISMO ........................................................67 Grupo de discusso 19 ....................................................................................................................71 MDULO 20: METABOLISMO DE AMINOCIDOS .........................................................................72 Grupo de discusso 20 ....................................................................................................................73 MDULO 21: CICLO DO NITROGNIO ...........................................................................................73 Grupo de discusso 21 ....................................................................................................................74 MICROPIPETADORES ......................................................................................................................76 LABORATRIO 1: FOTOMETRIA E ESPECTROFOTMETRO .....................................................78

I. II. III. IV.

FUNDAMENTOS ....................................................................................................................78 OBJETIVOS............................................................................................................................80 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL......................................................................................80 RELATRIO DE LABORATRIO 1 ......................................................................................82

LABORATRIO 2: TITULAO E CROMATOGRAFIA DE AMINOCIDOS..................................84 I. II. III. IV. FUNDAMENTOS ....................................................................................................................84 OBJETIVOS............................................................................................................................87 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL......................................................................................87 RELATRIO DE LABORATRIO 2 .....................................................................................89

LABORATRIO 3: CINTICA ENZIMTICA ....................................................................................90 I. II. III. IV. FUNDAMENTOS ....................................................................................................................90 OBJETIVOS............................................................................................................................93 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL......................................................................................93 RELATRIO DE LABORATRIO 3 ......................................................................................96

LABORATRIO 4: PURIFICAO DE PROTENAS (SDS-PAGE E PONTO ISOELTRICO) .....97 I. II. III. IV. V. FUNDAMENTOS ....................................................................................................................97 OBJETIVOS............................................................................................................................99 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL......................................................................................99 RELATRIO DE LABORATRIO 4 ...................................................................................101 APNDICE...........................................................................................................................104

LABORATRIO 5: REAO DE TRANSAMINAO ...................................................................107 I. II. III. IV. FUNDAMENTOS ..................................................................................................................107 OBJETIVOS..........................................................................................................................109 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL....................................................................................109 RELATRIO DE LABORATRIO 5 ....................................................................................110

APRESENTAO PROFESSORES: Prof. Dr. Hugo Aguirre Armelin (coordenador) Prof. Dr. Alexander Henning Ulrich Bloco 9 Inf., Sala 924 Bloco 8 Sup., Sala 858

MONITORES: Doutorando Cleber Augusto Trujillo Doutoranda Katia Neves Gomes Bloco 8 Sup., Sala 858 Bloco 8 Sup., Sala 858

INTRODUO E NORMAS GERAIS A disciplina de Bioqumica (QBQ220-noturno) compreende o programa de mdulos mostrado no calendrio das pginas 8 e 9. Cada mdulo focaliza um tpico a ser desenvolvido em um dia de aula, envolvendo 3 atividades: a) Aula expositiva pelo professor; b) Grupos de discusso centrados em questes objetivas; c) Fechamento do tema pelo professor que analisar as questes discutidas em grupo. Alm destes mdulos, desenvolvidos em sala de aula, haver tambm um conjunto de mdulos de laboratrio, consistindo em 5 aulas prticas concentradas no ltimo ms de curso. Os grupos de discusso sero formados por 6 alunos, organizados no primeiro dia de aula permanecendo fixos por todo o curso. Para as aulas de laboratrio cada grupo ser dividido em 2: A e B. Cada mdulo de laboratrio consistir em 3 atividades: a) Execuo da aula prtica no laboratrio; b) Trabalho em sala de aula; c) Relatrio que ser realizado em sala de aula. No primeiro dia de cada modulo de laboratrio, o conjunto de subgrupos A trabalhar no laboratrio, enquanto os subgrupos B estaro na sala de aula. No perodo seguinte inverte-se: subgrupos B no laboratrio e subgrupos A na sala de aula. Finalmente, no ltimo perodo, os subgrupos se renem na sala de aula para discutir, conciliar resultado e fazer um relatrio de grupo, que deve ser entregue no mesmo dia.

NORMAS E RECOMEDAES NO LABORATRIO Em cada mdulo de laboratrio, os subgrupos da turma A trabalharo no laboratrio enquanto os subgrupos da turma B estaro na sala de aula para discutir e conciliar os resultados obtidos na aula prtica e para fazer um relatrio de grupo, que dever ser entregue no mesmo dia. No perodo seguinte, inverte-se: os subgrupos da turma B no laboratrio e subgrupos da turma A na sala de aula. Seguir rigorosamente as seguintes instrues:

PROIBIDO COMER, BEBER E FUMAR NO LABORATRIO. Leia com detalhe o procedimento experimental (protocolo) e preste ateno s instrues fornecidas antes de iniciar a experincia. Procure utilizar reagentes, vidraria e equipamentos disponveis com cuidado, para evitar desperdcio e quebra. Mantenha sua rea de trabalho organizada. Ao terminar a experincia passe gua na vidraria utilizada e a coloque no local indicado. Em caso de dvida ou acidente, pea auxlio aos monitores ou aos professores. Uso do avental nas aulas prticas obrigatrio!

GUIA PARA RELATRIO DE LABORATRIO OBJETIVOS: Colocar o(s) objetivo(s) da aula prtica de forma clara e concisa. INTRODUO: Deve conter os fundamentos bioqumicos da metodologia empregada (aspectos tericos da aula prtica encontrados na literatura). MATERIAIS E MTODOS: Descrever os procedimentos executados em laboratrio incluindo todos os reagentes, materiais e equipamentos utilizados. RESULTADOS E DISCUSSO: Colocar todos os dados obtidos (utilizar tabelas, caso julgue necessrio). Os grficos sero aceitos em papel milimetrado ou no Excel. Comentar os resultados comparando turma A e B, discutir possveis diferenas obtidas comparando com dados da literatura. CONCLUSO: Comentar quais as concluses da aula prtica. Ser claro e objetivo nas concluses. Esclarecer se os objetivos propostos foram atingidos ou no. BIBLIOGRAFIA: Colocar todos os livros e artigos consultados.

NO ULTRAPASSAR 5 PGINAS DE RELATRIO!

AVALIAO

A avaliao de desempenho ser composta dos seguintes itens: a) b) c) Provas em grupo (PG1 a PG6), que consistiro num trabalho em grupo para resoluo de questes objetivas por um perodo de 4 h; Relatrios de laboratrio (R1 a R5); Provas escritas individuais (P1, P2 e P3). A ltima prova escrita da matria ser sobre os temas abordados em laboratrio. O clculo da media final ser feito atravs da seguinte formula:

PGs + Rs x 2 + P1x 2,5 + P 2 x3,0 + P3x 2,5 11 MdiaFinal = 10

Haver uma nica prova substitutiva para substituir uma das provas individuais de avaliao. Reposies de PG ou relatrio de laboratrio esto vetados. A presena em todas as atividades obrigatria. Uma lista de presena ser passada em todas as aula. Alunos que alcanarem a mdia final 5,0 e mostrarem freqncia 70% estaro aprovados. Aqueles cuja mdia for no mnimo igual a 3,0 e apresentarem freqncia 70% podero fazer a prova de recuperao.

BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA A bibliografia recomendada envolve 2 livros textos em portugus: TORRES, B. B. & MARZZOCCO, A. Bioqumica Bsica. VOET, D. ; VOET, J. & PRATT, C. W. Fundamentos de Bioqumica. Contudo, outros excelentes textos de Bioqumica, em geral em ingls, podero ser usados com igual proveito: VOET, D. & VOET, J. Biochemistry. STRYER, L.; BERG, J. M. AND TYMOCZKO, J. L. Biochemistry. LEHNINGER, A. L. Principles of Biochemistry.

CALENDRIO DE MDULOS E ATIVIDADES 2006

DATA JULHO AGOSTO 31 3 4 7 10 11 14 17 18 21 24 25 28 31 SETEMBRO 1 4-8 11 14 15 18 21 22 25-29 OUTUBRO 2 5 6 9 12 13 16

MDULO/ ATIVIDADE 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

TTULO GUA; REAO CIDO-BASE, pH E SISTEMA TAMPO. AMINOCIDOS: Estrutura, Propriedades Qumicas. PROTENAS: Estrutura Primria. PROTENAS: Estrutura 3D e Conformao. PG-1. INTRODUO CINTICA E TERMODINMICA QUMICA. CINTICA ENZIMTICA. MECANISMOS DE CATLISE ENZIMTICA. PG-2. AVALIAO 1. AUCARES ESTRUTURA E FUNO. GLICLISE. ACETIL-CoA E CICLO DE KREBS CADEIA RESPIRATRIA E FOSFORILAO OXIDATIVA GLICONEOGNESE SEMANA DA PTRIA. .PG-3. AVALIAO 2 CIDOS GRAXOS:ESTRUTURA, FUNES E METABOLISMO. LIPDEOS, MEMBRANA E TRANSPORTE. PG-4. CICLO DAS PENTOSES. SEMANA TEMTICA DA BIOLOGIA. FOTOSSNTESE 1. FOTOSSNTESE 2. PG-5 METABOLISMO DO GLICOGNIO. FERIADO RECESSO CONTROLE HORMONAL DO METABOLISMO.

19 20 23 26 LABORATRIO* 27

20 21 L1-A B L1-B R1-A

METABOLISMO DE AMINOCIDOS. CICLO DO NITROGNIO. PG-6. AVALIAO 3. MTODOS COLORIMTRICOS E ESPECTRO DE ABSORO. AULA. MTODOS COLORIMTRICOS E ESPECTRO DE ABSORO. RELATRIO. FERIADO .RECESSO

30 NOVEMBRO 2 3 6

L2-A R1-B L2-B R2-A L3-A R2-B L3-B R3-A L4-A R3-B L4-B R4-A L5-A R4-B L5-B R5-A A R7-B

TITULAO E SEPARAO DE AMINOCIDOS. RELATRIO TITULAO E SEPARAO DE AMINOCIDOS RELATRIO. CINTICA ENZIMTICA, INVERTASE. RELATRIO. CINTICA ENZIMTICA, INVERTASE. RELATRIO. FRACIONAMENTO DE PROTENAS. RELATRIO. FRACIONAMENTO DE PROTENAS. RELATRIO. MECANISMOS DE CATLISE, TRANSAMINASES. RELATRIO. MECANISMOS DE CATLISE, TRANSAMINASES. RELATRIO. AULA. RELATRIO. AVALIAO INDIVIDUAL DO LABORATRIO.

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24 27 DEZEMBRO 7 18

SUBSTITUTIVA. RECUPERAO.

* L = laboratrio; R = relatrio; A e B = turmas.

MDULO 1: REAO CIDO-BASE, pH E SISTEMA TAMPO

1. A molcula de gua, H2O, apresenta um ngulo de 104,5 graus entre as duas ligaes O-H, dando-lhe um carter altamente polar. Alm disso, o tomo de O possui 2 pares de eltrons livres, permitindo a formao de ligaes (ou pontes) de H entre molculas vizinhas. Esta estrutura d gua propriedades fsicas e qumicas de enorme importncia biolgica. 2. A gua se ioniza atravs de uma reao cido-base: H2O + H2O H3O++ OHA reao cido-base se caracteriza pela troca de prtons entre pares conjugados de cidos e bases. A gua pode se comportar como cido e como base: AH + H2O B + H2O Por exemplo: K = [H3O+] [A-] [AH] [H2O] K mede a afinidade relativa das bases, de cada par cido-base conjugados (AH/ A- e H3O+/ H2O), por prtons. Fala-se comumente em constante de dissociao de um cido (Ka), significando: Ka = K [H2O] = [H+] [A-], onde [H2O] essencialmente constante (55 M). [AH] 3. [H ] a concentrao hidrogeninica e os valores de [H+] para a maioria das solues so muito baixos e difceis de serem comparados. Um valor mais prtico conhecido como pH: pH = - log [H+]. como pode-se obter por analogia e 1/[H+] = 1/K x [A-]/[AH] pH = - logK + log [A-]/[AH] - log K = pK pH = pK + log [A-]/[AH]
+

H3O+ + ABH + OH-

Estas so reaes de equilbrio, s quais correspondem constantes de equilbrio definidas.

Conclui-se que pK numericamente igual a pH da soluo na qual as concentraes molares do cido e sua base conjugada so iguais (ie log [A-]/[AH] = 0). A igualdade pH = pK + log [A-]/[AH] conhecida como Equao de HendersonHasselbach. 4. cidos so classificados de acordo com sua fora relativa, ou seja, de acordo com sua capacidade de transferir um prton para a gua. cidos com constantes de dissociao menores do que aquela de H3O+ (que, por definio, igual a 1 em solues aquosas (v se consegue confirmar porqu!)) so s parcialmente ionizados em solues aquosas e so conhecidos como cidos fracos (K < 1). J os cidos fortes tm constantes de dissociao maiores que a de H3O+, sendo quase completamente ionizados em solues aquosas (K>1).

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5. Tampes so sistemas aquosos que tendem a resistir a variaes no seu pH quando pequenas quantidades de cido (H+) ou base (OH-) so adicionadas. Um sistema tampo consiste de um cido fraco (o doador de prtons) e sua base conjugada (o aceptor de prtons). comum encontarr os seguintes smbolos para representar um cido (AH ou BH+) e sua base conjugada (A ou B:) 6. A adio de cido forte (H+) ou base forte (OH-) a uma soluo aquosa de um cido fraco, por exemplo, cido actico (pKa = 4,76), causa pequenas variaes de pH, se a soluo estiver a um pH prximo do pK do cido. Este comportamento define um tampo cido-base.
-

Grupos de discusso 1 1) Defina cidos e bases no conceito de Brnsted, mostrando exemplos. 2) a) Qual o pH das solues 0,1 M dos cidos fortes HCl e HNO3? b) Usar a equao HendersonHasselbach para calcular o grau de dissociao dos cidos fracos i) H2S (Ka=1x10-7) e ii) cido actico (Ka=2x10-5) em solues 0,1 M. Qual o respectivo pH dessas solues? 3) Esquematize a curva de titulao de 1 L de uma soluo de 0,1 M H3PO4 com uma soluo de 10 M NaOH, colocando pH (eixo y) em funo de volume de base adicional (eixo x). Indicar os pontos na titulao (volumes de NaOH) em que o pH equivale cada um dos pKas do cido. 4) Indique como se pode preparar 1 L de um tampo a pH=7,0, capaz de manter o pH estvel com adio de 10 mL de HCl 0,1M, dispondo-se das solues: a) 1M H3PO4 b) 1M cido actico c) 1M NaOH 5) Desenhe a estrutura do gelo, mostrando pontes de hidrognio entre molculas de gua. O que acontece quando o gelo derrete? Porque a gua lquida 4oC mais densa do que o gelo 0oC? 6) Desenhe a estrutura do NaCl no estado slido e tambm no estado aquoso, neste ltimo, destaque suas interaes com gua.

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MDULO 2: AMINOCIDOS

1. Aminocidos, bases purnicas e pirimidnicas, nucleosdeos e nucleotdeos, hexoses (como glicose), so componentes monomricos dos principais polmeros biolgicos, ou seja, protenas, cidos nuclicos (DNA e RNA) e polissacardeos (glicognio, amido e celulose). Aminocidos, bases, nucleosdeos e nucleotdeos so muito solveis em gua e possuem grupos funcionais que participam em reaes cido-base. Glicose tambm altamente solvel em gua, mas no participa em reaes cido-base. i. H 20 aminocidos que compem protenas (Tabela 1), todos mostrando a frmula geral: R
+

H3N

C H

COO-

on dipolar ou zwitterion encontrado em gua pH 7

2. Aminocidos podem ser agrupados em classes com base nas propriedades dos seus grupos radicais (R), em particular sua polaridade ou tendncia de interagir com gua em pH biolgico ( 7,0). 3. Todos os aminocidos livres comportam como cidos poliprticos. Quando um aminocido cristalino dissolvido em gua, ele pode agir como um cido ou como uma base. O grupo carboxlico mostra um pK em torno de 2,0, enquanto o grupo amino tem um pK entre 9,0 e 10,0. Portanto, no pH fisiolgico (pH 7,0), a maioria das molculas de todos os aminocidos est na forma de ons dipolares (zwitterions). Chama-se pI de um aminocido o pH da soluo na qual suas molculas possuem carga lquida nula. Na cadeia lateral (-R) os aminocidos apresentam grupos funcionais, entre os quais existem grupos cido-base. 4. O carbono dos aminocidos, excetuando-se a glicina, assimtrico, fazendo com que estas substncias tenham atividade ptica e, portanto, apresentem pares de ismeros pticos.

Grupo de discusso 2

1) Quais dos aminocidos tm dois carbonos quirais e qual deles no possui isomeria ptica? 2) Mostre porque a seguinte forma no-inica de um aminocido no pode ser encontrada em soluo aquosa. R H2N C H COOH

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3) O etanol no tem carter cido em gua, enquanto fenol e cido actico se dissociam em soluo aquosa, sendo o cido actico (pK=4,8) mais forte que o fenol (pK=10). Como se pode explicar o comportamento destes trs compostos em gua a partir de suas estruturas moleculares? 4) Esquematize a curva de titulao da glicina com NaOH a partir de pH=1 e do cido asprtico com HCl a partir de pH=11. Coloque o pH na ordenada e, na abscissa, a quantidade de equivalentes de cido ou base forte. 5) a) Quais os pontos isoeltricos de: glicina (pKs=2,5 e 9,5), cido asprtico (pKs=2,5; 4,0 e 9,5), lisina (pKs=2,5; 9,5 e 10) e histidina (pKs=2,5; 6,0 e 9,5)? b) Calcular as cargas lquidas (aproximadas) do cido asprtico, lisina ou histidina nos seguintes pHs: pH 1, pH 8, pH 11. 6) Tentar classificar os aminocidos em termos da natureza qumica dos seus grupos radicais: a) ionizveis ou no ionizveis, b) cidos ou bsicos, c) polares ou no polares, d) hidroflicos ou hidrofbicos, e) alifticos ou aromticos, f) lineares ou ramificados e g) pequenos e grandes. 7) Na Tabela 1 indicar: a) O cdigo de letra nica para cada aminocido e b) os pKR dos aminocidos com grupos radicais ionizveis.

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MDULO 3: ESTRUTURA PRIMRIA DE PROTENAS

1. A descrio da estrutura das protenas dividida em quatro nveis de organizao: estrutura primria, secundria, terciria e quartenria. 2. A estrutura primria se refere seqncia de aminocidos que compem a protena. Tratase, portanto, da estrutura de ligaes covalentes. A principal ligao covalente entre aminocios a ligao peptdica. Os aminocidos podem formar polmeros atravs da ligao do grupo carboxila de um aminocido com o grupo amino de outro. Esta ligao carbono-nitrognio chamada ligao peptdica, obtida por excluso de uma molcula de gua. Quimicamente, a formao da ligao peptdica pode ser representada pela seguinte equao:

Esta reao, como esta escrita, jamais ocorre nos seres vivos. A unio dos aminocidos por ligao peptdica no feita por reao direta entre eles, mas atravs de um complexo aparato de sntese protica, que inclui ribossomos, cidos ribonuclicos, vrias protenas e enzimas num processo chamado traduo. A equao mostra apenas o resultado liquido do processo. 3. As propriedades da ligao peptdica impem restries ao dobramento do polmero formado. A ligao peptdica apesar de ser representada por um nico trao de ligao, tem caractersticas intermediarias entre uma ligao simples e uma dupla ligao, devido as interaes entre duas formas de ressonncia.

A conseqncia desse carter parcial de dupla ligao que no h possibilidade de rotao em torno da ligao peptdica. Assim sendo, os quatro tomos dos grupamentos que participam da ligao peptdica ficam dispostos em um plano rgido, constituindo o que se costuma chamar de grupo peptdico ou unidade peptdica (vide retngulos) Notar tambm que os dois carbonos alpha (C) vizinhos de cada ligao peptdica tambm se encontram o plano.

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Marzzocco & Torres, Bioqumica Bsica.

O polmero formado pode, portanto, ser visualizado como uma cadeia constituda por unidades planares (unidades peptdicas), unidas entre si com uma articulao flexvel: o carbono . Esta cadeia chama-se cadeia polipeptdica. As protenas podem ser formadas por uma ou mais cadeias polipeptdicas. 4. Todavia, existem pontos de dobramento entre as unidades peptdicas rgidas, graas a possibilidade de rotao em torno das ligaes com o carbono alfa (N-C e C-C), que so ligaes efetivamente simples (vide figura acima). Estas ligaes so chamadas phi () e psi () respectivamente. 5. A cadeia polipeptdica pode ser dividida entre a cadeia principal e as cadeias laterais (grupos R) ligados aos carbonos alfa.

Grupo de discusso 3

1) Defina estrutura primria, secundria, terciria e quaternria de uma protena, dando exemplos. 2) Esquematize a estrutura de uma ligao peptdica.

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3) a) Desenhar o tripeptdeo Ala-Asp-His. b) Calcular o seu pI. c) Calcular sua carga lquida em pH 1, pH 6 e pH 12. 4) Com os dados abaixo, defina a seqncia do peptdeo analisado: a) hidrlise cida total resultou em: Arg, Tyr, Leu, Ala, Glu Lys, Ser e Pro; b) dansilao e hidrlise produziram: dansil-Leu; c) dois ciclos consecutivos de degradao de Edman liberaram, respectivamente Leu e Tyr; d) tripsina liberou 2 peptdeos cujas composies, aps hidrlise cida total, foram, respectivamente (Tyr, Leu, Arg) e (Ser, Glu, Pro, Ala Lys); e) carboxipeptidase A no liberou nada, mas carboxipeptidase C liberou Ser; f) endopeptidase V8 liberou o tripeptdeo Lys-Pro-Ser e um pentapeptdeo que, tratado com carboxipeptidase C, liberou Glu. 5) Mostre a reao de xido-reduo da cistena que importante na estrutura de peptdeos.

MDULO 4: ESTRUTURA SECUNDRIA E TERCIRIA DE PROTENAS

1. A estrutura secundria definida pela conformao local do esqueleto de ligaes peptdicas que compe o eixo da protena. Esta conformao local pode ser explicitamente expressa atravs dos ngulos phi () e psi () (vide Mdulo 3). Em geral, certas combinaes de ngulos phi () e psi () so permitidas enquanto outras no so permitidas devido a impedimentos estricos entre tomos de grupos vizinhos. Este princpio pode ser resumido numa diagrama de Ramachandran (Figura 1).

Figura 1: Diagramas de Ramachandran. Esquerda: Estruturas secundrias correpondentes s combinaes estericamente permitidas para angulos phi e psi. Direta: ngulos observados para todos as ligaes em 12 protenas com estruturas de alta resoluo determinadas por cristalografia.

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Figura 2: -hlice.

Figura 3: Folha pregueada.

2. H duas estruturas secundrias principais: -hlice (Figura 2) e folha pregueada (Figura 3), que so estruturas organizacionais regulares e repetitivas. Estas duas estruturas podem ser caracterizadas por combinaes de angulos phi e psi (Figura 1) adotadas pela cadeia principal. Alm de -hlice e folha , as protenas globulares mostram tambm alas de formas definidas, mas irregulares e no repetitivas. 3. A estrutura terciria descreve o arranjo tridimensional da cadeia principal da protena, incluindo a disposio espacial das cadeias laterais dos aminocidos. H muitas possibilidades de arranjos tridimensionais para a estrutura terciria das protenas. a. As propriedades bioqumicas e biolgicas de uma protena so determinadas pelo arranjo tridimensional de sua cadeia, isto , pela sua estrutura terciria. Logo, nas condies fisiolgicas a protena adquire uma estrutura terciria bem definida e necessria sua funo, que conhecida como estrutura nativa. O desarranjo da estrutura terciria leva perda de funo da protena, processo que genericamente chamado de desnaturao. b. Em protenas pequenas da estrutura primria define a estrutura terciria nativa da protena. Nestes casos os processos de desnaturao e renaturao da estrutura da protena so reversveis. A estrutura nativa a conformao da protena de menor nvel de energia livre (G) e alcanada espontaneamente (processo exergnico). O exemplo clssico desse comportamento dado pela protena Rnase A, uma enzima que no seu estado nativo catalisa a hidrlise de RNA. Para protenas grandes o processo de desnaturao irreversvel e o fenmeno de alcance da conformao nativa complexo e ainda mal entendido.

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c. A estrutura tridimensional das protenas mantida por ligaes fracas como pontes de H, ligaes inicas e interaes hidrofbicas. A exceo a ponte de dissulfeto (-S-S-) que, apesar de covalente, importante na manuteno da conformao nativa de protenas. d. Protenas possuem muitos grupos ionizveis atravs de reao cido-base, cujos pKs variam enormemente. O pI de uma protena definido como pH da soluo na qual a carga lquida da molcula de protena nula. 4. Existem muitas maneiras diferentes para apresentar estruturas tridimensionais de protenas.

Estrutura de mioglobina de baleia, uma protena globular tpica

Topografia de superfcie

Fita (azul = H)

modelo space-filling
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Grupo de discusso 4

1) Distinga estrutura secundria e terciria de uma protena. D exemplos. 2) Descreva -hlice e folha pregueada. Aponte as diferenas essenciais entre estas formas de estrutura secundria encontradas em peptdeos. 3) Discuta os dois diagramas de Ramachandran apresentados na Figura 1 e relacione-os com as estruturas apresentadas nas Figuras 2 e 3. 4) Descreva a experincia clssica de Anfinsen com a enzima ribonuclease A, indicando sua concluso principal. Qual o papel das pontes de dissulfeto na manuteno da estrutura nativa (terciria) da ribonuclease? Conceitue estrutura nativa e desnaturao de protenas, mostrando o que isso tem a ver com a atividade enzimtica da ribonuclase A. Que funo termodinmica promove espontaneamente a transio da ribonuclease de desnaturada para nativa? 5.) Duas protenas, apesar de terem diferenas quanto a alguns de seus aminocidos, so capazes de desempenhar a mesma funo. Explique como isto possvel. 6.) Pesquisar informaes sobre a estrutura de hemoglobina. Descrever a sua estrutura terciria e quartenria. Descrever as mudanas na estrutura quartenria que acontecem devido ligao de oxignio. 7) O que efeito hidrofbico e qual o seu papel na manuteno da estrutura terciria das protenas? Qual o fator preponderante no efeito hidrofbico: o entlpico ou o entrpico? Explique qualitativamente sua resposta. 8) Mostre porque uria desorganiza a -hlice.

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MDULO 5: CINTICA E TERMODINMICA

1. A variao de energia livre padro diretamente relacionada constante de equilbrio: Go = -2.3RT log Keq 2. A composio de um sistema de reao (uma mistura de reagentes e produtos) tende a uma variao contnua at que o equilbrio alcanado. No equilbrio, as taxas de reao para um lado e para outro so exatamente iguais. As concentraes de reagentes e produtos no equilbrio definem a constante de equilbrio. Na reao: A + B Keq = [C][D] / [A][B] 3. Quando um sistema no est em equilbrio, ele tende ao equilbrio, e a magnitude desta tendncia pode ser medida como a variao de energia livre da reao, G. A energia livre de Gibbs (G), uma propriedade termodinmica, definida pela equao: G = H TS, onde H, T e S so respectivamente entalpia, temperatura absoluta e entropia, todas tambm propriedades termodinmicas. 4. Numa transio de estado a temperatura (T) e presso constantes (condies comuns s reaes bioqumicas) a variao de G (G) : G = H - TS. Se se trata de uma reao bioqumica, H o calor de reao. Quando H positivo a reao endotrmica, se H for negativo a reao exotrmica. Nestas condies, a espontaneidade da reao definida pelo valor de G: se G negativo, a reao espontnea, sendo denominada exergnica. Se, ao contrrio, G for positivo, a reao no ocorre espontaneamente e denominada endergnica. Portanto, a reao ocorre no sentido em que a energia livre total diminui. 4. No equilbrio, G = 0. Logo, possvel demonstrar a validade das seguintes igualdades: G = G + 2,3 RT logB/A B/A = K G = - 2,3 RT logK C + D , a constante de equilbrio dada por:

5. Em condies padro, 25C (298K), com concentraes de reagentes e produtos iguais a 1M, pH = 0, a variao de energia livre considerada padro, ou G. Entretanto, a maioria das reaes bioqumicas ocorrem em pH 7,0, para as quais utiliza-se G. 6. A Figura 4 mostra esquematicamente como varia G com o desenvolvimento da reao, indicado no eixo das abcissas como coordenada de reao

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Energia Livre (G)

Estado de Transio

G*

Estado Inicial (S)

G'

Estado Final (P)

Coordenada de Reao
Figura 4. Variao de energia livre (G) no decorrer de uma reao genrica. Para que a reao ocorra, necessariamente tem-se Gfinal < Ginicial, isto , G negativo. Um ponto importante a ser destacado que o valor de G permite prever se a reao pode ocorrer, mas no a velocidade com que a reao atinge o equilbrio. A velocidade de reao depende da energia livre do Estado de Transio que maior que do que o dos reagentes no Estado Inicial, isto , G* positivo. Quanto maior o valor de G*, menor ser a velocidade de reao. 7. Na reao genrica A B a velocidade (v) proporcional a [A], isto , v1=k1[A]. A velocidade da reao inversa ser, consequentemente, v-1=k-1[B]. k1 e k-1 so constantes de velocidade e reaes como AB e BA so ditas de primeira ordem, porque as suas respectivas velocidades dependem de concentrao molar de um nico reagente elevado potncia 1. As constantes de velocidade k1 e k-1 so diferentes da constante de equilbrio da reao, K=[B]/[A]. No estado de equilbrio, por definio, v1=v-1 e, portanto, formalmente, K=k1/k-1. As reaes representadas pelas equaes seguintes: 2AB e A+BC so de segunda ordem, cujas velocidades so, respectivamente, v=kA[A]2 e v=kAB[A][B]. Notar que a ordem da reao no coincide necessariamente com a estequiometria da equao qumica. 8. As quinases formam uma classe muito importante e abundante de enzimas, que se caracterizam por catalisar a transferncia de um grupo fosfato de alta energia para uma outra substncia receptora. 9. So chamados compostos de alta energia substncias orgnicas com o grupo fosfato em ligaes anidrido ou fosfoenol, cuja hidrlise libera fostato inorgnico (Pi) com um G0 negativo e em valor absoluto superior a 8kcal/mol. Outros compostos fosforilados com o fosfato em ligaes ester ou tioester tambm mostram um G0 de hidrlise negativo, mas de valor absoluto

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da ordem de 3kcal/mol. Estas classes de compostos esto ilustradas na Tabela 2. O principal composto fosforilado da clula o ATP; cuja frmula estrutural est na Figura 5. O ATP possui fosfato em ligaes anidrido e ester, aos quais correspondem G0 de hidrlise de, respectivamente, -8kcal/mol e -3,5kcal/mol. Todas estas reaes so, portanto, muito voltadas para os produtos de hidrlise, sendo praticamente irreversveis. No entanto, nenhuma destas reaes ocorre na clula a velocidade significante se no houver catlise por uma enzima especfica, da classe das fosfatases.

NH2 N HC N OOOO H C C N C N C H Ad e n i n a

- O- P - O- P - O- P - O- C H 2 O O O H H HO

H OH

Ri b o s e

A MP ADP AT P

ATP = Adenosina 5-trifosfato Na clula: FIGURA 2

Figura 5. Frmula estrutural do ATP.

[ATP] + [ADP] + [AMP] = Constante

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Tabela 2. Compostos fosforilados.

R C O P + H2O R C O + Pi cido

Go' = - 13.000 cal/mol

CH2 Fosfoenol R C O P + H2O

CH3 cetona

R C OH O cido cido + Pi

Go' = - 8.000 cal/mol

O Anidrido fosfrico

R O

H2O

R OH lcool

Pi cido

Go' = - 3.000 cal/mol

ster fosfrico

R C S O Tioster

CoA

H2O

R C OH + HS-CoA O cido tiolcool

Go' = - 3.000 cal/mol

ATP Adenosina trifosfato ADP Adenosina difosfato AMP Adenosina monofosfato

H2O

ADP cido

Pi cido

Go' = - 8.000 cal/mol

H2O

AMP cido

Pi cido Pi cido

Go' = - 8.000 cal/mol

H2O

A OH + lcool (Adenosina)

Go' = - 3.500 cal/mol

Pi = fosfato inorgnico = HPO 2- (pH=7,4) 4 P = PO32-

Na clula: [ATP] + [ADP] + [AMP] = constante

10. No metabolismo muito importante a transferncia de fosfatos de um composto fosforilado de alta energia para outro. Uma das reaes chave deste tipo : fosfoenolpiruvato + ADP ATP + piruvato G0=-5kcal/mol Como esta reao no ocorre sem catlise, seu controle pela clula feito atravs de uma enzima quinase especfica.

24

11. Alm das quinases que catalisam a transferncia de grupo fosfato do ATP para metablitos, existem as quinases que tem como substratos protenas, genericamente referidas como quinases de protena ou, simplesmente, protena-quinases. H alguns milhares de protena-quinases diferentes em um organismo, que catalisam a transferncia de fosfato de ATP para o grupo OH da cadeia lateral de resduos especficos de serina e treonina formando um ster de fosfato. As reaes deste tipo so genericamente chamadas de fosforilaes e so modificaes covalentes que causam mudana de conformao das protenas, alterando sua atividade biolgica. Por exemplo, um grande nmero de enzimas so fosforiladas para sofrer uma transio do estado inativo ao ativo ou vice-versa. Mais raramente as protenas so fosforiladas no grupo enlico de resduos de tirosina.

Grupo de discusso 5

1) Defina reaes exotrmicas e endotrmicas. Qual a relao entre estes conceitos e a funo termodinmica entalpia? 2) Defina reaes exergnicas e endergnicas. Qual a relao destes conceitos com G0. 3) G0 caracterstico de cada reao (desde que a temperatura seja constante) e no varia com as concentraes de reagentes e produtos no equilbrio. G, por outro lado, no caracterstico da reao, podendo assumir qualquer valor em funo das concentraes iniciais de reagentes e produtos (quociente Q na expresso de G). Mostre por que estas afirmaes so verdadeiras discutindo a expresso que relaciona G0 e G. 4) Na reao genrica A B Keq=103. Qual o valor de G0? No ponto de equilbrio as concentraes molares de A e B podem variar? Como varia G com as concentraes molares iniciais de A e B? 5) Ainda para a reao A B (questo 4) proponha uma condio na qual a reao inversa seja espontnea. Mostre que a sua proposta possvel calculando o respectivo G. Esta questo possui mltiplas respostas ou apenas uma resposta nica? 6) Para a reao A B (questo 4), se a constante de velocidade de primeira ordem, k1 for igual a 10, qual deve ser o valor da constante k-1 para a reao inversa? Para um mesmo K, constante de equilbrio, pode haver mltiplos valores de k1 e k-1 ? Qual a interpretao termodinmica para a sua resposta?

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7) Considerando a equao G0 = -2,3 RT log K, sendo: R = 1,98 x 10-3 kcal/mol K; T = 298K e 2,3 RT = 1,36 kcal/mol. Calcule os valores de G0 quando K varia de 105 a 10-5. Faa uma tabela. 8) Porque a hidrlise de ATP necessita catlise enzimtica, sendo este um composto rico em energia? Utilize-se do grfico esquemtico de variao de G (energia livre) em funo de coordenada de reao para responder a esta questo, definindo estado de transio e energia de ativao.

MDULO 6: CINTICA ENZIMTICA

1. 2.

Enzimas so catalisadores biolgicos cuja natureza qumica proteica. A natureza proteica das enzimas lhes proporciona alto grau de especificidade. A grande maioria das reaes biolgicas no ocorre, ou ocorrem a velocidades baixssimas nas condies fisiolgicas de pH e temperatura. Logo, as reaes biolgicas, em geral, necessitam de catlise para ocorrer, isto , necessitam de enzimas. Para cada reao h uma enzima especfica.

3.

Na reao genrica A B a direo espontnea da reao dada pela variao de energia livre, .G0, conforme esquematizado no grfico da Figura 5.

Energia Livre (G)

*
G10# G0#-1

Estado de transio da reao no catalisada

Estado de transio da reao catalisada

Estado Inicial (S)

G0#1cat G0

G0#-1cat

Estado Final (P)

Coordenada de Reao
Figura 6. Variao de energia livre (G) na reao genrica A B.

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G0 uma constante que se relaciona com a constante de equilbrio da reao pela expresso G0=2.3 RTlogK. Por outro lado, as velocidades das reaes AB e BA ou, respectivamente, as constantes de velocidade k1 e k-1 no dependem do G0 da reao, mas dos, respectivos, G10 e G-10, que por sua vez s dependem da energia livre (G) do estado de transio (energias de ativao). A enzima (catalisador) no muda o G0 da reao, pois catalisadores no interferem com os estados inicial e final das reaes, mas mudam o caminho da reao e, por conseqncia diminuem a energia do Estado de Transio. 4. Uria uma substncia muito estvel em gua, mas que pode ser rapidamente decompostas por hidrlise se a reao for catalisada pela enzima urease: H2N C=O + H2O H2N Trata-se de reao de primeira ordem, onde v=k1[uria], apesar da equao estequiomtrica indicar a existncia de 2 reagentes. Esta reao pode ser acompanhada em tubo de ensaio no laboratrio. As Tabelas 3 e 4 mostram resultados obtidos na prtica.
UREASE

CO2 + 2 NH3

Tabela 3. Cintica da enzima urease.

Tubo no 1 2 3 4 5 6 Tempo (minuto) 0 2 4 6 8 10 NH3(moles) 0 0.084 0.168 0.252 0.336 0.420

Concentrao da uria: 5 mM; Concentrao da urease: 0,1 g/mL; Volume de reao: 1 mL; Temperatura: 30oC.

Os dados da Tabela 3 mostram que a velocidade da reao constante ao longo do tempo estudado. J os dados da Tabela 4 mostram variaes relativamente complexas da velocidade de reao em funo da concentrao da uria para um perodo de 10 minutos de reao.

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Os dados da Tabela 4 permitem medir experimentalmente duas constantes importantes das reaes enzimticas Vmax (velocidade mxima) e Km (constante de Michaelis) atravs da equao v = Vmax[S] / (Km + [S]).

Tabela 4. Cintica da enzima urease. Tubo n 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Uria (mM) 2,5 5,0 10 15 25 50 100 200 200 Urease (g) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 NH3 (moles) 0,21 0,42 0,59 0,67 0,73 0,78 0,79 0,78 0,00

Os significados de Vmax e Km so definidos no modelo de cintica enzimtica proposto por Michaelis e Menten no incio do sculo passado onde ES um complexo enzima substrato formado antes de converso do substrato em produtos.

E + S

k1 k-1

ES

kcat

E + P

A derivao da equao Michaelis Menten: v = Vmax[S] / (Km + [S]) = kcat[Et][S] / (Km + [S]) apresentada na prxima pgina.

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Velocidade naquela [S]

Velocidade mxima

Concentrao do substrato

Kdiss aparente do Complexo enzima-substrato

Frao de Etot na forma de ES = [S]/(Kdiss + [S])

29

5.

Substncias que reduzem a atividade de uma enzima so chamadas inibidores. Em termos gerais, inibidores podem atuar em vrias maneiras. Aqui vamos focalizar em inibidores que ligam reversivelmente com a enzima com constantes de dissociao KI. Estes tipos de inibidores podem atuar em duas maneiras diferentes: a) Eles podem competir com o substrato para o mesmo stio de ligao na superfcie da enzima livre. Neste caso so chamados inibidores competitivos ou b) Eles podem ligar em outro stio na enzima livre (E) e/ou no complexo enzima-substrato (ES). Estes inibidores so chamados inibidores mistos/nocompetitivos se podem ligar a E e ES e so chamados acompetitivos se ligam somente ao complexo ES.

6. 7.

A presena de um inibidor competitivo se manifesta em uma mudana no valor do Km: Km obs = Km(1+[I]/KI) = Km Km e no valor do Vmax: Km obs = Km(1+[I]/KI)/(1+[I]/KI) = Km / Vmax obs = Vmax / onde = (1+[I]/KI) A presena de um inibidor misto/no-competitivo se manifesta em uma mudana nos valores do

8.

A presena de um inibidor acompetitivo se manifesta em uma mudana nos valores do Km e no valor do Vmax: Km obs = Km / (1+[I]/KI) = Km / Vmax obs = Vmax /

Grupo de discusso 6

1) As velocidades de uma reao enzimtica foram determinadas para diversas concentraes de substrato, conforme a tabela abaixo: [S] (M) 5 10 20 50 100 200 V (mol/L.min) 22 39 65 102 120 135

Os grficos de, respectivamente, V em funo de [S] e 1/V em funo de 1/[S] podem servir para determinar Km e Vmax? Como?

30

2) Numa reao enzimtica, o valor de Vmax, mas no o de Km diretamente proporcional concentrao da enzima? Justifique. 3) A velocidade inicial de uma reao enzimtica em funo da concentrao do substrato S, na ausncia e na presena dos inibidores A e B segue os dados da tabela abaixo:

[S] (M) 1,25 1,67 2,5 5,0 10,0

VELOCIDADE (MOL/L X MIN) SEM I 1,72 2,04 2,63 3,33 4,17 Com Inibidor A 0,98 1,17 1,47 1,96 2,38 Com Inibidor B 1,01 1,26 1,72 2,56 3,49

a) Qual a classe dos inibidores A e B? b) Determine Vmax e Km na ausncia e presena dos inibidores. 4) Utilizando-se dos valores de Km e Vmax determinados nas questes 1 e 3, esquematize num mesmo grfico, para as duas reaes, V em funo da concentrao de substrato, expressa em mltiplos de Km. No eixo dos Y ajuste arbitrariamente as escalas para cada reao fazendo coincidir os pontos de V = Vmax. Como so as curvas para duas reaes? Justifique o resultado. 5) O que so enzimas alostricas? Defina utilizando-se de grficos esquemticos de V em funo de [S], compare uma enzima michaeliana (da questo 4) com uma enzima alostrica positiva e com uma enzima alostrica negativa.

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MDULO 7: MECANISMOS DE CATLISE ENZIMTICA

1. Catlise acido/base catlise por transferncia de protons. A catlise cida um processo no qual a transferncia parcial de prtons de um cido para o estado de transio diminui a energia livre do estado de transio de uma reao. A reao pode ser tambm estimulada por uma catlise bsica se a taxa de reao aumentar com a abstrao de um prton por uma base. Algumas reaes podem ser sujeitas simultaneamente a ambos os processos, caracterizando uma catlise cido-base. Em reaes catalisadas por enzimas os cidos e bases catalisadores so grupos especficos ionizveis da enzima localizados no seu stio ativo/stio cataltico. A mutarrotao da glicose (Figura 6) e a catlise da ribonuclease pancretica bovina A (RNase A) (Figura 7) so exemplos de catlise cido-base.

Figura 6. Mutarrotao da glicose.

32

Figura 7. Catlise da ribonuclease pancretica bovina A (RNase A).

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2. Catlise covalente envolve a acelerao da taxa de reao atravs da formao transiente de uma ligao covalente substrato-catalisador. A descarboxilao do acetoacetato um exemplo deste processo:

No primeiro estgio desta reao, a amina faz um ataque nucleoflico ao grupo carbonila do acetoacetato formando uma base de Schiff (ligao imina).

OH

O tomo de nitrognio protonado do intermedirio covalente atua como um receptor de eltrons reduzindo assim o carter de alta energia do enolato. A catalise covalente possui estgios nucleoflicos e eletroflicos. A catlise covalente pode ser dividida conceitualmente em trs estgios: 1) A reao nucleoflica entre o catalisador e o substrato formando uma ligao covalente. 2) A perda de eltrons do centro da reao pelo catalisador agora eletroflico. 3) A eliminao do catalisador que uma reao essencial para retornar ao estgio 1.

Grupo de discusso 7

1) Examine a reao de hidrlise de RNA catalisada pela RNase A para verificar que se trata de um mecanismo de catlise cido-base.

34

2) Faa o grfico da velocidade de uma reao enzimtica em funo do pH para uma enzima estvel entre pHs 3 e 12, considerando que o substrato no possui grupos ionizveis e a atividade enzimtica exige no centro ativo uma carboxila (pKa = 5) desprotonada e um grupo amino (pKa = 9) protonado. 3) Definir catlise eletrosttica. Procure um exemplo de uma enzima que utiliza esta estratgia. 4) Descrever o mecanismo empregado pelas serina proteases (tripsina, quimiotripsina, elastase, etc) para hidrolisar ligaes peptdicas. Descrever todas as etapas da reao. Quais tipos de catlise so empregados em cada uma das etapas?

MDULO 8: ACARES: ESTRUTURA E FUNO

1. Os carboidratos so compostos que apresentam a frmula emprica (CH2O)n (n> ou = 3), sendo funcionalmente poliidroxialdedos ou poliidroxicetonas. Os carboidratos mais simples so os monossacardeos, que se apresentam na formas de aldoses ou cetoses, conforme o grupo funcional carbonlico que possuem, isto , respectivamente, aldedo ou cetona. H duas trioses: o gliceraldedo, uma aldotriose, e a diidroxiacetona, uma cetotriose (Figura 8). O gliceraldedo apresenta um carbono (C2) assimtrico, dando origem a dois ismeros opticos, as formas D e L (Figura 9). J a diidroxiacetona no possui C assimtrico e, por isso, no mostra esse tipo de isomeria. Os outros monossacardeos podem ser derivados pelo crescimento da cadeia destas duas trioses. A Figura 10 mostra a famlia D derivada do Dgliceraldeido, cujas frmulas estruturais planares obedecem as regras de Fisher.

Figura 8. Gliceraldedo e diidroxiacetona.

Figura 9: Carbono quiral ou carbono assimtrico.

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Figura 10. Famlia D derivada do D-gliceraldedo.

Figura 11. Ciclizao da D-glicose.

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O aumento da cadeia do monossacardeo leva ao aparecimento de novos Cs assimtricos e, portanto mais ismeros estruturais, tambm chamados estereoismeros. O nmero de ismeros dado pela expresso 2n onde n o nmero de carbonos assimtricos. Por exemplo, em aldoexoses h 4 Cs assimtricos, logo o nmero de ismeros 24 =16, sendo 8 da forma D e 8 da forma L. Mas, as estruturas lineares como representadas na Figura 10 tanto para pentoses como para hexoses so poucos estveis em soluo, formando estruturas cclicas segundo a reao mostrada na Figura 11. Esta uma reao bem conhecida da qumica orgnica, pela qual um lcool (OH) faz uma adio nucleoflica a carbonila de um aldedo, formando um composto de condensao da conhecido como semiacetal. No caso do exemplo da Figura 11 a hexose a D-glicose e, como a figura mostra, a ciclizao leva ao aparecimento de uma outra isomeria estrutural devido s duas posies possveis do OH do C1 em relao ao plano do anel, gerando os ismeros e . importante enfatizar que o OH do C1 no quimicamente equivalente aos demais OHs que so alcolicos, sendo por isso chamado de OH glicosdico. A existncia do OH glicosdico permite que todos os monossardeos sejam oxidados em condies brandas pelo reagente de Fehling, uma reao de oxido-reao na qual os OHs alcolicos no participam.

Figura 12. Nomenclatura para estereoismeros.

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2. Conforme exemplificado na Figura 12 h uma nomenclatura especificamente designada para distinguir pares de estereoismeros. Enantimeros possuem estruturas isomricas que so uma imagem especular da outra, por exemplo, cada membro da famlia D de hexoses mostrada na Figura 10 tem um, e, somente um, enantimero na famlia L. So epmeros pares de estereoismeros que diferem apenas pela configurao de um C assimtrico. So anmeros os dois ismeros resultantes da posio do OH glicosdico do C1 na estrutura cclica da hexose. E, finalmente, so denominados diastereoismeros pares de ismeros que no caem em nenhuma das categorias anteriores. 3. Ligao glicosdica: os monossacardeos podem se apresentar na forma de oligo ou polissacardeos, onde os monmeros so ligados atravs de ligaes glicosdicas. Oligossacardeos so formados por um pequeno nmero de monossacardeos, resultantes da condensao de um OH glicosdico com um OH alcolico, como exemplificado abaixo pela dimerizao de duas molculas de -glicose por ligao 1-4, originando o dissacardeo maltose:

Caso a ligao glicosdica envolva a condensao dos dois OHs glicosdicos como o caso da trealose, uma 1-1-diglicose, o dissacardeo no pode ser oxidado pelo reagente de Fehling (dissacardeo no redutor). J a maltose, que possue um OH glicosdico livre um dissacardeo redutor, sendo oxidado pelo reagente de Fehling. 4. Polissacardeos so polmeros constitudos de centenas ou milhares de resduos de monossacardeos, geralmente glicose, formando cadeias lineares, como a celulose (1-4poliglicose), ou cadeias ramificadas, como o glicognio e o amido. O glicognio altamente ramificado, as suas cadeias lineares so formadas por ligaes 14-glicosdicas e suas ramificaes decorrem de ligaes 1-6-glicosdicas (Figura 13). O glicognio apresenta uma nica extremidade redutora livre (C1 no resduo final na ltima molcula de glicose da cadeia) e inmeras extremidades no redutoras. A partir das extremidades no redutoras h acrscimo ou retirada de resduos do polmero. Portanto, as molculas de glicognio no tm tamanhos definidos.

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Figura 13. Glicognio Poli (1-4) (1-6) glicose.

Grupo de discusso 8

1) Desenhe o conjunto dos ismeros de D-aldoses de 6 C, atravs das frmulas de projeo de Fisher. Quantos epmeros possue uma hexoaldose. Identifique todos os epmeros de D-glicose. Existem pares enantiomricos na famlia D de monossacardeos. Explique. 2) Descreva o fenmeno da mutarrotao de D-glicose, incluindo as reaes qumicas pertinentes com as respectivas frmulas estruturais dos reagentes. O que este fenmeno tem a ver com os conceitos de C anomrico e anmeros. 3) Compare os dissacardeos maltose e sacarose, identificando a ligao glicosdica em cada caso. Por que maltose redutora e sacarose no . 4) Analise a estrutura do glicognio. Procure destacar as vantagens e desvantagens da funo deste polmero como composto de reserva energtica. 5) Verifique as principais caractersticas dos polissacardeos estruturais, comparando celulose, quitina e glicosaminoglicanos (estes tambm chamados mucopolissacardeos). 6) A poro de natureza sacardica de algumas glicoprotenas pode servir como stio de reconhecimento celular. Para desempenhar esta funo, os oligossacardeos ou glicoprotenas devem ter a capacidade de formar um grande nmero de diferentes estruturas. Qual dos dois

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pode produzir uma maior variedade de estruturas: oligopeptdeos compostos de cinco resduos de diferentes aminocidos ou oligossacardeos compostos de cinco resduos de diferentes monossacardeos? Explique. 7) Frutose, o principal acar do mel, comumente usada como adoante de alimento. Este acar na forma -D-piranose provavelmente a substncia mais doce conhecida. A forma -Dfuranose muito menos doce. a) Quais so as estruturas da -D-frutopiranose e -D-frutofuranose? b) A doura do mel diminui ao deix-lo em repouso e ao mesmo tempo aumentando a temperatura. Explique. 8) Interconverso das formas de D-galactose. Uma soluo recm-preparada da forma de Dgalactose (1g/ml em um tubo polarimtrico de 1 dm) mostra uma rotao ptica de + 150,7o. Quando deixada em repouso por um longo perodo de tempo a rotao decresce gradualmente at atingir um valor de equilbrio igual a + 80,2o. Em contraste, uma soluo recm-preparada (1g/ml) da forma mostra rotao tica de apenas +52,8o . Quando esta soluo deixada em repouso por vrias horas a rotao aumenta at o valor de equilbrio igual a +80,2o , valor idntico quele observado para a -D-galactose. a) Escreva as frmulas de projeo de Haworth das formas e da D-galactose. Qual caracterstica distingue as duas formas? b) Por que a rotao de uma soluo recm-preparada da forma decresce gradualmente com o tempo? Explique por que solues das formas e (de concentraes iguais) atingem o mesmo valor de rotao ptica no equilbrio? c) Calcule a composio percentual das duas formas de galactose no equilbrio.

MDULO 9: GLICLISE

1. A gliclise a principal via catablica da glicose compreendendo as 10 reaes enzimaticamente

catalisadas que so mostradas na figura abaixo e cuja estequiometria total pode ser observada na equao qumica seguinte: Glicose + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi 2 Piruvato + 2 NADH + 2 ATP + 2 H2O + 2 H+ A gliclise, como todas as vias catablicas, exergnica e a equao acima corresponde a Go = -43,4 kJ/mol. Mas o dado da variao de energia livre mais interessante em termos de G, cujo valor exato depende de cada clula especfica, por exemplo, em msculo cardaco estima-se que seja igual a 74,0 kJ/mol.

40

2. A finalidade da gliclise obteno de energia, como a equao estequiomtrica indica, cada

molcula de glicose degradada a duas de piruvato e parte da energia livre liberada nesta degradao retida nos produtos na forma de 2 NADH e 2 ATP.

3. A reao que permite a obteno de NADH a nica de oxido-reduo da gliclise, pela qual
gliceraldedo-3-P oxidado a glicerato-1,3-bisP, atravs da ao oxidante de NAD+ catalisada pela enzima gliceraldedo desidrogenase. A manuteno da capacidade oxidante da gliclise exige que NADH seja re-oxidada a NAD+ , uma alternativa para isso apresentada na figura, atravs da reao pela qual NADH reduz piruvato a lactato, recuperando NAD+. Esta alternativa ocorre no msculo esqueltico com baixos nveis de O2.

4. J ATP produzido em duas reaes distintas pelas quais um radical fosforil transferido de,
respectivamente, glicerato-1,3-P e P-enolpiruvato para ADP, em transferncias catalisadas por glicerato-1,3-P-quinase e P-enolpiruvato-quinase. Esta maneira de fosforilao de ADP conhecida como fosforilao a nvel do substrato, para distingui-la da fosforilao oxidativa da mitocndria que ser vista mais adiante.

5. Na gliclise, h 3 reaes de fosforilao irreversveis catalisadas, respectivamente, pela

hexoquinase, fosfofrutoquinase e piruvato-quinase, que funcionam como marca-passos da via, cuja regulao se d por um elaborado sistema de controle alostrico das enzimas.

6. Diversas outras hexoses, como frutose, galactose e manose, tambm so metabolisadas pela via
glicoltica.

7. A gliclise em condies anaerbicas tem energtica e funes variadas, conforme o organismo.

Cabe fazer dois destaques importantes.

8. Em vertebrados, encontram-se msculos esquelticos muito pobres em mitocndria, que so

especializados para produzir ATP a partir de gliclise anaerbica, cuja energtica obedece a seguinte reao geral: Glicose 2Lactato + 2H+ ; Go = -196kJ/mol. Mas, parte dessa energia livre liberada que seria dissipada (61kJ/mol) retida na forma de 2ATP produzidos por mol de glicose degradada. Deve-se ainda enfatizar que o lactato no descartado, pois vai ser aproveitado no fgado, aonde reoxidado a piruvato, alternativa metablica importante a ser examinada mais frente.

9. Leveduras mostram um exemplo de gliclise anaerbica na forma da fermentao alcolica,

segundo a reao geral: Glicose 2Etanol + CO 2; Go = -235kJ/mol. Aqui tambm parte da energia livre, +61kJ/mol, mantida com a produo de 2ATP. A parte final da fermentao alcolica compreende duas reaes: a primeira envolve a descarboxilao de piruvato e liberao de acetaldedo, catalisada pela enzima piruvato-carboxilase, que no existe em animais. Na segunda reao a desidrogenase alcolica catalisa a reduo do acetaldedo por NADH.

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HOCH2 O OH HO OH ATP ADP P -OCH2 O OH HO OH OH ATP ADP OH

GLICLISE

Glicose

Glicose 6-fosfato

P -O-CH2 O CH2OH HO OH HO ATP

Frutose 6-fosfato

ATP ADP P -O-CH2 O CH2O- P ADP

HO OH HO

Frutose 1,6 bisfosfato

H2C-O- P C=O H2C-OH

HC=O HC-OH H2C-O- P Pi NAD+ NADH O=C-O- P HC-OH H2C-O- P ADP ATP O=C-OHC-OH H2C-O- P ADP ATP Pi NAD+ NADH

Diidroxiacetona fosfato

Gliceraldedo 3-fosfato

1,3 Bisfosfoglicerato

3-Fosfoglicerato

COOHC-O- P H2C-OH

2-Fosfoglicerato

H2O COOC-O- P CH2 ADP ATP COOHC-OH CH3 NAD+ NADH COOC=O CH3 ADP ATP

Fosfoenolpiruvato

Lactato
NAD+ NADH

Piruvato

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Grupo de discusso 9

1) Classifique as reaes da gliclise, destacando as que so de xido-reduo. 2) Equacione a reao de oxidao de gliceraldedo-3-fosfato, destacando o oxidante e o redutor. 3) Na reao do item 2) parte da energia utilizada para produzir ATP. Mostre como isso possvel, equacionando as etapas relevantes da reao. Defina fosforilao ao nvel do substrato. 4) Equacione a reao lquida da transformao de glicose em piruvato. Como regenerada a capacidade oxidante do sistema NAD+/NADH necessria atividade glicoltica nos glbulos vermelhos humanos (que no tm mitocndria) e na cultura de levedo sem O2 (fermentao). 5) Examine uma tabela com as 10 reaes da via glicoltica que contenha, respectivamente, o G0 e o G das reaes. Quais so as reaes irreversveis da gliclise? 6) Porque os valores de G0 e de G da mesma reao podem ser diferentes? Para decidir se a via glicoltica numa determinada clula reversvel ou irreversvel, que valor mais relevante, G0 ou G? 7) Uma pessoa incapaz de executar exerccios fsicos intensos e prolongados teve suas enzimas analisadas. Todas as enzimas da via glicoltica estavam em concentrao normal, com excesso da fosfoglicerato mutase muscular. a) Como ser afetada a produo de energia metablica em uma clula que apresenta baixos nveis desta enzima? b) Como ser afetada a produo de Lactato na ausncia desta enzima? [Referncia: Di Mauro, S.; Miranda, A.F.; Kahn, S.e Gitlin, K. - Human muscle phosphoglycerate mutase deficiency Science 1981, vol. 212, 1277-1279. 8) Calcular a porcentagem de energia armazenada pela clula ao degradar glicose pela via glicoltica. Sabe-se que:

Glicose 2 lactato

G ' = - 47.000 cal/mol

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MDULO 10: CICLO DE KREBS

1. Em condies aerbicas, o destino do piruvato produzido na gliclise sofrer uma

descarboxilao oxidativa catalisada pela piruvato desidrogenase, que um complexo multienzimtico existente no interior da mitocndria de eucariotos. Portanto, o piruvato precisa entrar na mitocndria para ser degradado por essa via. A reao geral a seguinte: Piruvato + CoA + NAD+ Acetil-CoA + NADH + CO2

2. O acetilCoA resultante da metabolizao do piruvato totalmente oxidado no ciclo do cido

ctrico, tambm chamado ciclo de Krebs, conforme a seguinte reao geral: Acetil-CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2 H2O 2 CO2 + 3 NADH + FADH2 + GTP + CoA + 2 H+ O ciclo de Krebs, esquematizado na figura, compreende 8 reaes, envolvendo 8 enzimas e 8 cidos carboxlicos, di e tri-cidos, todos dispersos na matriz da mitocondria. Portanto, comeando no piruvato e passando pelo acetilCoA, ocorre oxidao completa desses metabolitos liberando 3CO2 sem participao de O2 molecular. Os agentes oxidantes em todas as reaes so NAD+ ou FAD e as formas reduzidas destas co-enzimas (NADH + FADH2 ), resultantes do processo, s so reoxidadas na cadeia respiratria, uma via especializada que se localiza na membrana mitocondrial interna e ser considerada mais adiante. 3. O ciclo de Krebs, conforme sua reao geral indica, essencialmente catablico, pois promove a oxidao do radical acetil a 2CO2 e retm parte da energia livre desta reao na forma de coenzimas reduzidos que, posteriormente, serviro produo de ATP atravs da fosforilao oxidativa. Para cumprir esta funo basta que os 8 intermedirios do ciclo ocorram em concentraes catalticas. Mas, o ciclo possui outra funo, alm da catablica, diversos de seus intermedirios alimentam as vias de sntese de aminocidos, lipdeos e glicose, isto , o ciclo tem tambm funo anablica e, portanto, deve ser classificado como anfiblico. Para que o ciclo desempenhe concomitantemente ambas as funes, catablica e anablica, as concentraes dos intermedirios so mantidas e controladas atravs de um complexo sistema de reaes auxiliares, conhecidas como reaes anaplerticas. Um exemplo de reao anaplertica a carboxilao de piruvato para obter oxalacetato, catalisada pela enzima piruvato carboxilase. 4. A transformao de piruvato em acetil-CoA, uma reao para a qual convergem diversas vias catablicas e anablicas, alm da gliclise. Por esse motivo a piruvato desidrogenase est sujeita a um controle altamente elaborado, compreendendo dois nveis de regulao: a) controle alostrico atravs da inibio pelo produto, exercido por NADH e acetil-CoA; b) modificao covalente reversvel da subunidade E1 da enzima, por fosforilao/desfosforilao. 5. As enzimas citrato sintase, isocitrato desidrogenase e -cetoglutarato desidrogenase so as reguladoras do fluxo metablico atravs do ciclo de Krebs e esto sujeitas a controle alostrico, envolvendo NADH como inibidor e Ca+ e ADP como ativadores.

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Piruvato
CoASH + NAD+ CO2 + NADH

Acetil-CoA
H2O CoASH

Oxaloacetato
NADH + H+ NAD+ L-Malato H2O

Citrato
H2O

cis-Aconitato
H2O

Fumarato
FADH2 FAD

Ciclo de Krebs

Isocitrato
NAD+ NADH + H+

Succinato
GTP GDP + Pi CO2 CoASH CO2

Oxalosuccinato

Succinil-CoA
NADH + H+

a-Cetoglutarato
NAD+

Grupo de discusso 10

1) Escrever a reao de formao de acetil-CoA a partir de piruvato e indicar: a) as 5 coenzimas necessrias b) as vitaminas envolvidas c) a sua localizao celular 2) Como a equao qumica, estequiometricamente equilibrada, que representa a oxidao de acetil-CoA no ciclo de Krebs? Como se pode medir o rendimento do ciclo de Krebs em termos de coenzimas reduzidos (poder redutor) e ATP (ligaes de fosfato de alta energia). 3) Identifique os tipos de reaes que ocorrem no ciclo de Krebs, mostrando as respectivas equaes qumicas.

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4) Equacione a descarboxilao oxidativa de -cetoglutarato a succinato, respeitando a estequiometria da reao. Mostre as etapas que compem esta reao com as respectivas enzimas e coenzimas. 5) Quais so as enzimas do ciclo de Krebs sujeitas a regulao? Explique como cada uma delas regulada. 6) Explique porque piruvato estequiometricamente convertido a CO2 na respirao de fatias de msculo mantidas em soluo fisiolgica, enquanto oxalacetato e citrato tem efeito cataltico neste mesmo processo. Mostre porque a respirao pode ser sustentada pelo consumo estequiomtrico de citrato, mas no de acetato, quando o ciclo de Krebs inibido por malonato. 7) Dispondo das enzimas necessrias, a adio de que compostos far aumentar a concentrao de oxaloacetato em um sistema in vitro que contm mitocndrias: acetil-CoA, piruvato, glutamato, citrato ou cidos graxos? 8) Uma suspenso de mitocndrias, suplementada com acetil-CoA marcada com C14, produz CO2 marcado apenas quando suprida de oxignio. Em condies anaerbias, a adio de azul de metileno restaura a produo de CO2 marcado, observando-se tambm a descolorao do corante (azul de metileno reduzido incolor). Explique estes dados.

MDULO 11: CADEIA RESPIRATRIA E FOSFORILAO OXIDATIVA

1. Fosforilao oxidativa o processo bioqumico pelo qual a oxidao de NADH e FADH2

produzidos na gliclise e ciclo de Krebs, ocorre acoplada produo de ATP, a partir de ADP + Pi. Este processo se d na cadeia respiratria ou cadeia de transporte de eltrons, que compreende um conjunto ordenado de enzimas e transportadores de eltrons inseridos na membrana interna da mitocndria.

2. A cadeia respiratria contem 4 complexos, I,II, III e IV, ordenados por ordem crescente de
potencial redox, indo do potencial padro de NAD+/NADH (E0= -0,315V) ao do O2/H2O (E0= +0,815V). Os eltrons so transferidos do complexo I ou II para o complexo III pela coenzima Q (ou ubiquinona), e do complexo III para o complexo IV pelo citocromo C para chegar ao O2. NADH e FADH2
,

cedem eltrons, respectivamente, aos complexo I e II. A transferncia

exergnica de eltrons do nvel redox de NADH para o de O2 (E0= 1,130V) envolve uma diferena de energia livre liberada (G0= -218kJ/mol) que em parte retida pelo transporte de H+

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do lado interno para o externo da membrana, criando o gradiente eletroqumico de prtons que permitir empurrar o processo endergnico de fosforilao de ADP por Pi para gerar ATP, atravs da bomba de prtons que constitui a ATP sintase (tambm conhecida com F1F0ATPase).
Espao Intermembranar

2 H+

4 H+ Cit C

2 H+

Complexo I

Complexo III

Complexo IV

Matrix Mitocondrial

NAD+ NADH + H+ 1/2 O2 + 2H+ H2O

Complexo II FADH2

3. A ATP sintase distinta e fisicamente separada da cadeia de transporte de eltrons. A

transferncia de 2e de NADH at O2 envolve um G0= -218kJ/mol, que gera um incremento no gradiente de prtons suficiente para mover a ATP sintase, permitindo a produo de 3 moles de ATP (G0= +30,5kJ/mol). Nestas condies, a ATP sintase trabalha com uma eficincia termodinmica igual a 42%. , no entanto, necessrio destacar que quando os 2e saem do nvel redox de FADH2
,

formam-se apenas 2ATP. Naturalmente, para uma melhor medida da real

eficincia termodinmica da fosforilao oxidativa seria preciso estimar o G da transferncia de eltrons em vez do G0.

4. A grande quantidade de energia livre que seria dissipada na oxidao completa da glicose a CO2
e H2O [C6H12O6 + 6 O2 6 CO2 + 6 H2O; G0= -2823 kJ/mol] aproveitada para produo de ATP, graas quase exclusivamente ao processo de fosforilao oxidativa, rendendo 38ATP por mol de glicose (incluindo neste total 2ATP da gliclise e 2 do ciclo de Krebs).

5. Vrios mecanismos da cadeia de transporte de eltrons e de seu acoplamento sntese de ATP

foram elucidados atravs da utilizao de inibidores e desacopladores, entre os quais esto: rotenona, amital, antimicina A, cianeto e DNP. Rotenona e amital inibem a reduo dos complexo I e III por NADH. Antimicina A inibe o transporte de eltrons no complexo II. Cianeto inibe o transporte no complexo IV. DNP desacoplador, pois promove o vazamento de H+ ,levando dissipao do gradiente de prtons e contnuo transporte de eltrons, desacoplado da sntese de ATP.

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6. A sntese de ATP a partir de ADP e Pi na mitocndria, que catalisada pela ATP sintase,
dirigida pelo processo de transporte de eltrons. Mas como a ATP sintase fisicamente separada das protenas do transporte de eltrons, a energia livre liberada no transporte de eltrons deve ser conservada em uma forma que possa ser utilizada pela ATP sintase. A energia livre do transporte de eltrons conservada pelo bombeamento de H+ da matriz mitocondrial para o espao intermembranar, criando um gradiente de H+. A volta dos prtons ao interior da mitocndria termodinamicamente favorvel. A membrana interna da mitocndria impermevel a prtons em toda sua extenso, exceto na ATP sintase; e ento por este canal que os prtons atravessam a membrana, de volta matriz mitocondrial. A variao de energia livre associada ao transporte de um prton atravs da membrana interna da mitocndria pode ser determinada atravs de medidas da diferena de pH e do potencial de membrana estabelecidos em mitocndrias consumindo oxignio.

Grupo de discusso 11

1) Definir potencial de xido-reduo (E), potencial de xido-reduo padro (Eo) e potencial de xido-reduo padro bioqumico (Eo). 2) Entre os transportadores universais de eltrons da cadeia respiratria esto NAD+ e os nucleotdeos de flavina (FAD e FMN), quais so as diferenas entre estes transportadores de eltrons quanto a potencial redox e forma de interao com as enzimas com as quais atuam? 3) Classifique os seguintes inibidores quanto a seus mecanismos de ao na cadeia respiratria: a) rotenona; b) antimicina A; c) oligomicina e d) DNP (2,4-dinitrofenol). 4) Descreva o mecanismo de ao do DNP (2,4-dinitrofenol), mostrando porque o mecanismo de ao deste inibidor uma demonstrao experimental importante da hiptese quimiosmtica da fosforilao oxidativa. 5) Porque F1 e Fo so ambos necessrios para a sntese de ATP? 6) Em mitocndrias isoladas, o transporte de eltrons no ocorre na ausncia de ADP e Pi, mesmo que haja abundncia de succinato para fornecer eltrons. Como se explica que mitocndrias nessas condies passam a transportar eltrons e consumir oxignio se forem tratadas com DNP?

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7) A relao entre energia livre padro de uma reao e o potencial redox : Go = -nFE0onde n o nmero de eltrons transferidos F a constante de Faraday (F = 23.60 cal V-1) Eo' o, diferena de potencial padro da dupla redox. A uma soluo 1 M de NAD+, NADH, Piruvato e Lactato, adicionou-se lactato desidrogenase: Lactato + NAD+Piruvato + NADH + H+ Eo' (NAD+/NADH) = -0,32 V Eo' (Piruvato/Lactato) = -0,19 V a) Em que sentido a reao ocorrer? b) medida que a reao ocorre, como variam esses potenciais redox? 8) Na hiptese do acoplamento quimiosmtico, a energia que comea na forma de potencial qumico de reduo/oxidao, convertida na forma de potencial prton-motriz e finalmente convertida na forma de potencial qumico de ATP. Qual a diferena entre o potencial qumico (G) e o potencial eltrico ( ) de um soluto distribudo dos dois lados de uma membrana? Defina fora prton-motriz.

MDULO 12: GLICONEOGNESE

1. O fgado humano precisa manter nveis mnimos da glicose circulante, porque crebro e hemcias dependem quase exclusivamente de glicose para produo de energia. No entanto, a reserva de glicognio heptico no suficiente para essa finalidade. Por isso, o fgado sintetiza glicose de novo a partir de lactato, piruvato, glicerol, intermedirios do ciclo de Krebs e aminocidos, atravs de uma via anablica chamada de gliconeognese. No jejum, mesmo o jejum de poucas horas, a gliconeognese a principal fonte da glicose liberada pelo fgado na circulao. 2. A gliclise, como j foi visto, um a via catablica com a finalidade de produzir energia na forma de 2 NADH + 2 ATP a partir da degradao de glicose a piruvato de acordo com a equao qumica seguinte: Glicose + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi 2 Piruvato + 2 NADH + 2 ATP + 2 H2O + 2 H+ A gliconeognese tem a finalidade de sintetizar glicose a partir de piruvato, isto , faz o caminho metablico inverso ao da gliclise. Mas, a gliconeognese, contrariamente gliclise, muito

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endergnica. Para produzir glicose a partir de piruvato necessitam-se 2 NADH + 4 ATP +2 GTP, conforme a estequiometria indicada na equao abaixo: 2 Piruvato + 2 NADH + 4 ATP + 2 GTP + 2 H2O Glicose + 2 NAD+ + 4 ADP + 2 GDP + 6 Pi + 2 H+ 3. A gliconeognese utiliza enzimas glicolticas reversivelmente, mas trs dessas enzimas, a hexoquinase, a fosfofrutoquinase e a piruvato quinase, catalisam reaes com G- muito negativo, sendo essencialmente irreversveis. Estas reaes so substitudas na gliconeognese por reaes exergnicas, tornando termodinamicamente favorvel a sntese de glicose a partir de piruvato. Destas reaes, as duas primeiras correspondentes s enzimas hexoquinase e fosfofrutoquinase, so substitudas por reaes simples de hidrlise de ligao fosfo-ester, catalisadas, respectivamente, pelas enzimas glicose-6-P-fosfatase e frutose-1,6-bis-fosfatase. J a terceira reao, que permite a volta de piruvato para P-enolpiruvato mais complexa e se d em duas etapas catalisadas, respectivamente, por piruvato-carboxilase e P-enolpiruvatocarboxiquinase. 4. O balanceamento entre gliclise e gliconeognese coordenadamente controlado por um complexo sistema de regulao enzimtica, envolvendo interaes alostricas e modificaes covalentes. Todo esse controle est concentrado nas 3 reaes nas quais gliclise e gliconeognese seguem reaes independentes, irreversveis e opostas, que so: 1) glicose / glicose-6-P; 2) frutose-6-P / frutose-1,6-bisP; 3) P-enolpiruvato / piruvato.

Grupo de discusso 12

1) Explique como a hemcia mantm glicose a 5 mM e G6P a 0,0083 mM, se a converso de glicose em G6P muito exergnica. Como seriam afetadas as concentraes relativas dos intermedirios da gliclise se a glucoquinase (Km = 5mM) fosse colocada artificialmente na hemcia em lugar da hexoquinase (Km = 0,1mM)? 2) Na gliconeognese, como so revertidas as reaes de glicose G6P e F6P F-1,6-BP, que so altamente exergnicas. Conceitue ciclo ftil. 3) A reverso da reao de PEP + ADP piruvato + ATP no pode ocorrer por um processo relativamente fcil como a reverso de glicose + ATP G6P + ADP. Qual a soluo bioqumica que os sistemas biolgicos utilizam para ir de piruvato a PEP?

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4) Qual o consumo de energia na sntese de glicose a partir de piruvato, medido em equivalentes de ATP. Indique as reaes onde h consumo. Compare o rendimento da via glicoltica com o consumo da gliconeognese, so iguais ou diferentes? 5) Um procedimento comum para determinao da efetividade de compostos como precursores da glicose colocar um animal em jejum at que os estoques de glicognio do fgado sejam depletados e ento administrar o substrato em questo. Um substrato que leva a um aumento lquido no glicognio heptico chamado de glicognico pois ele deve primeiro ser convertido em glicose-6-fosfato. Mostre por meio de reaes enzimticas conhecidas quais das seguintes substncias so glicognicas: a) succinato, b) glicerol, c) acetil CoA, d) piruvato e e) butirato. Escreva as frmulas estruturais das substncias relacionadas de (a) a (e). 6) Citar os efetuadores alostricos positivos e negativos de fosfofrutoquinase e frutose 1,6 bisfosfatase no fgado. Quais so as consequncias destes efetuadores no fluxo relativo dos metabolitos atravs da neoglicognese e da gliclise? 7) O nvel de frutose 2,6 bisfosfato nos hepatcitos varia com a disponibilidade da glicose: baixo no jejum e alto aps as refeies. Como isso se explica em termos das reaes catalisadas por fosfofrutoquinase-2 e frutose 2,6 bisfosfatase.

MDULO 13. CIDOS GRAXOS: ESTRUTURA, FUNO E METABOLISMO

1. Lpides ou lipdeos so substncias biolgicas solveis em solventes orgnicos, como clorofrmio e metanol e, praticamente, insolveis em gua. Os lpides compreendem: a) cidos graxos, em geral na forma de triacilglicerois; b) glicerofosfolpides; c) esfingolpides; d) colesterol e derivados. Este mdulo se restringe a cidos graxos e triacilglicerois.

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2. cidos graxos so cidos carboxlicos com longas cadeias hidrocarbonadas, encontrados na forma de tri-esteres de glicerol. A maioria possui um nmero par de C, predominando os de 16 C (cido palmtico) e os de 18 C (cido olico). Grande parte apresenta dupla ligao (insaturado) e muitos so poli-insaturados. 3. As propriedades fsicas dos cidos graxos dependem do grau de insaturao da cadeia hidrocarbonada. As molculas dos cidos graxos saturados so muito flexveis, facilitando a atrao e coeso entre si. Duplas ligaes entre C impe rigidez cadeia, tornando-a menos flexvel e limitando a coesividade entre as molculas do cido graxo. Em conseqncia disso, a temperatura de fuso (transio de fase slido/lquido) diminui com o grau de insaturao dos cidos graxos. 4. Os triacilglicerdeos desempenham um papel de reserva de energia metablica. Algumas de suas propriedades fsico-quimicas so ideais para essa funo: a) elevado grau de reduo de seus C, maximizando a quantidade de energia livre liberada na oxidao e b) alta hidrofobicidade, permitindo estocagem livre de gua (estoques anidros). No por acaso que os triglicerdeos compe cerca de 90% da reserva de energia metablica e tambm da dieta lipdica dos humanos. 5. A reserva de triacilglicerdeos do tecido adiposo mobilizada atravs da hidrlise a glicerol e cidos graxos livres, catalisada por lpase especfica. Os cidos graxos livres so carregados pela corrente sangunea na forma de complexos com albumina, que representa 50% da protena do plasma. cidos graxos livres so muito insolveis, a ~1microM formam micelas, que so altamente txicas. 6. A via catablica de degradao de cidos graxos para produo de ATP ocorre na matriz mitocondrial e se chama beta-oxidao. Esta via leva clivagem sequencial da cadeia do cido graxo em pares de C, liberando a cada ciclo: 1 acetilCoA, 1 NADH e 1 FADH2 (ver reaes abaixo), que alimentaro, respectivamente, o ciclo de Krebs e a cadeia respiratria. Mas, a betaoxidao exige previamente uma ativao inicial que consome 1 ATP e libera o cido graxo na forma de acilCoA. Esta etapa preliminar de ativao se d associada membrana externa da mitocndria e, a transferncia da acilCoa para dentro da mitocndria, mediada pela carnitina.

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Reaes de um ciclo de beta-oxidao:

O R CH2 CH2 CH2 C S-CoA oxidao H H hidratao HO H H oxidao O O (ceto acil-CoA) CoA O R CH2 C S-CoA + O H3C C S-CoA (acetil-CoA) H NAD+ NADH R CH2 C CH2 C S-CoA tilise O (L-hidroxiacil-CoA) H2O O (enoil-CoA) FAD FADH2 R CH2 C = C C S-CoA (acil-CoA)

R CH2 C C C S-CoA

7. A oxidao completa de uma molcula de palmitato (16 C) a CO2 e H2O, atravs da betaoxidao, ciclo de Krebs e cadeia respiratria, rende 129 ATP. importante destacar que este rendimento, medido em ATP/mol-oxidado, muito superior ao da oxidao completa de aucares e protenas, pois a oxidao de um cido graxo leva liberao de 37,6 kJ/g de energia livre, enquanto oxidao de aucares ou protenas libera apenas 16,7 kJ/g. 8. Os cidos graxos so sintetizados no citosol por via anablica prpria que adiciona seqencialmente unidades de 2 C cadeia em crescimento. Esta via alimentada por acetilCoA, mas s a primeira unidade de 2 C entra como acetilCoA, as subseqentes so na forma de malonilCoA. Portanto, o acetilCoA precisa ser previamente ativado a malonilCoA, por carboxilao e consumo de 1 ATP, para permitir a reao de condensao, levando ao crescimento da cadeia do cido graxo de uma unidade de 2 C, por ciclo de sntese. A ativao de acetilCoA catalisada pela acetilCoA-carboxilase, uma enzima sujeita a controle complexo,

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envolvendo regulao alostrica e ativao / desativao por modificao covalente (fosforilao / desfosforilao). 9. A sntese de palmitato (16 C) altamente endergnica, obedecendo a sequinte estequiometria: AcetilCoA + 7 malonilCoA + 14 NADPH + 7H+ palmitato + 7 CO2 + 14 NADP+ + 8 CoA + 6H2O A elongao da cadeia alm de 16 C e a insero de duplas ligaes feita por outros sistemas enzimticos especializados, que se localizam na membrana do retculo endoplasmtico. Mas, mamferos no possuem enzimas para introduzir duplas ligaes em cadeias de cidos graxos acima do C9. Por isso, linoleato (18:2) e linolenato (18:3), so cidos graxos essenciais que precisam ser adquiridos pela dieta. 10. importante destacar que animais degradam eficientemente glicose at acetilCoA pela gliclise e assim podem converter C de acar em cadeias de lipdeo de reserva. Mas, estes organismos no podem fazer o caminho de volta de cadeias de cido graxo para glicose, pois no possuem reaes que convertam acetilCoA em piruvato ou oxalacetato.

Grupo de discusso 13

1) Ponto de fuso dos cidos graxos. Os pontos de fuso de uma srie de cidos graxos de 18 tomos de carbono so: cido esterico (69,9oC), cido olico (13,4oC), cido linolico(-5oC) e cido linolnico (-11oC). Que aspecto estrutural destes cidos graxos de 18 carbonos pode ser correlacionado com o ponto de fuso? Fornea uma explicao molecular para esta tendncia do ponto de fuso. 2) Mostre como os cidos graxos so ativados antes de serem degradados. Em que compartimento celular isso ocorre? 3) Aonde e sob que forma so estocados os cidos graxos? Como os cidos graxos da reserva metablica so mobilizados para serem oxidados na matriz mitocondrial? 4) Explique os passos da -oxidao dos cidos graxos, partindo de uma molcula de palmitato. Calcule o rendimento energtico da oxidao completa de palmitato a CO2 e H2O. 5) Na -oxidao, a cadeia de cidos graxos degradada aos pares de carbono. Na sntese de cidos graxos, a cadeia cresce tambm aos pares de carbono. No entanto, o precursor na elongao da cadeia, durante a sntese, malonil-CoA e no acetil-CoA. Explique porqu.

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6) Equacione as etapas que compem o conjunto de reaes que permitem adicionar acetil-CoA cadeia de cido graxo crescente durante a sntese de palmitato. Mostre que etapa torna o processo favorecido termodinamicamente. 7) Compare a -oxidao e a biossntese de palmitato, mostrando diferenas e semelhanas em: a) carregadores de grupos acila; b) reaes de xido-reduo; c) coenzimas de xido-reduo; d) gasto ou produo de energia em termos de equivalentes de ATP e de coenzimas redutoras. 8) Mostre como se d a oxidao do cido olico.

MDULO 14: LPIDES, MEMBRANA & TRANSPORTE

1. Molculas anfiflicas, como lipdeos com uma nica cauda hidrofbica, cidos graxos livres e detergentes, quando em soluo aquosa e acima de um limiar de concentrao (concentrao micelar crtica ou cmc) formam agregados globulares chamados micelas. 2. Por outro lado, lipdeos com duas caudas hidrofbicas, como glicerofosfolipdeos e esfingolipdeos, tendem a formar bicamadas lipdicas, que so a base estrutural das membranas biolgicas.

Micela

Bicamada

3. As membranas biolgicas so compostas por protenas associadas a uma matriz de bicamada lipdica. As protenas que compe as membranas pertencem a duas categorias: a) integrais ou intrnsecas e b) perifricas ou extrnsecas. Este arranjo estrutural foi originalmente proposto em 1972 por Singer e Nicholson como o modelo de mosaico fludo

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para as membranas biolgicas, que foi plenamente confirmado por resultados experimentais estruturais e funcionais.

Modelo de mosaico fludo para membranas biolgicas

4. As membranas so barreiras hidrofbicas que oferecem grande resistncia passagem de solutos hidroflicos, cuja permeao exige protenas transportadoras especficas, conforme esquematizado na figura abaixo. Desta maneira a membrana, atravs de transportadores especficos, regula o transporte de metabolitos entre compartimentos celulares.

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5. Um exemplo clssico de transporte a tomada de glicose pela hemcia mediada por um transportador especfico, cuja velocidade depende da concentrao externa de glicose e obedece a uma curva hiperblica de saturao j bem conhecida da cintica enzimtica, sendo Kt anlogo a Km: Esta forma de transporte conhecida como transporte passivamente mediado ou difuso facilitada. Trata-se de um processo exergnico, pelo qual o soluto, no caso a glicose, atravessa espontaneamente a membrana indo do compartimento de maior para o de menor concentrao. 6. Existem 5 transportadores conhecidos que mediam a difuso facilitada de glicose em humanos: GLUT1 a 5, cujos Kts so diferentes para atender as necessidades funcionais dos tecidos nos quais so expressos. GLUT1 o transportador em hemcias, j GLUT2 expresso no fgado e clulas beta do pncreas, enquanto GLUT4 aparece no msculo esqueltico, tecido adiposo etc. 7. Mas, no epitlio do intestino a glicose obtida da dieta transportada para dentro da clula contra o gradiente de concentrao, portanto atravs de um processo endergnico que exige consumo de energia metablica para ocorrer e referido como transporte ativo. Neste caso o transportador chamado simport, pelo qual a glicose transportada junto com Na+ e termodinamicamente possvel porque existe um gradiente eletroqumico de Na+ de fora para dentro da clula. H mltiplas formas de transporte ativo, das quais este exemplo da glicose apenas uma delas. Grande parte da energia metablica consumida pelas clulas se deve manuteno da enorme diversidade de transportadores que promovem a transferncia de metabolitos e ons contra gradientes de concentrao.

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Grupo de discusso 14

1) O que concentrao micelar crtica. Como varia tamanho e forma de micelas formadas por anfiflicos de uma nica cauda hidrocarbonada? Explique. 2) Uma hiptese central na pesquisa de membranas que os lipdeos da membrana devem ser fludos (em oposio a "congelados") a fim de que a membrana possa desempenhar suas funes. O apoio para esta hiptese fornecido pela observao de que a composio de cido graxo das membranas pode ser alterada pelas condies nas quais a bactria cresce. Por exemplo, se a bactria est crescendo em temperatura menor que a normal, as quantidades observadas de cidos graxos insaturados (relativas ao contedo de cido graxo saturado) esto acima do normal. Contrariamente, se a bactria est crescendo em temperatura acima da normal, as quantidades observadas de cidos graxos insaturados nos lipdeos da membrana (relativas aos cidos graxos saturados) esto abaixo do normal. a) Sugira razes para o fato de que o contedo lipdico na membrana bacteriana deve ser fluido para que a membrana intacta opere apropriadamente. b) Explique como a alterao observada nos nveis dos cidos graxos insaturados relativa aos nveis dos cidos graxos saturados, em diferentes temperaturas de crescimento, apia a hiptese da fluidez da membrana. 3) Fornea uma explicao termodinmica para o fato de que molculas de fosfolipdeo difundem rapidamente no plano da bicamada, mas muito lentamente mudam de uma face oposta. 4) Descreva os mecanismos pelos quais detergentes extraem protenas integrais de membrana, mantendo-as em soluo. 5) Explique porque soda funciona bem para desentupir pias entupidas com gordura animal. 6) Para saber se uma bactria tomava leucina e etileno glicol por transporte mediado ou no mediado, foram feitas medidas de velocidade inicial de tomada em funo da concentrao de ambas substncias, resultando na tabela fornecida abaixo. O que voc conclui do exame dessa tabela? Explique e calcule Kt e Vmax se encontrar evidncias de transporte mediado.

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Componente
Leucina

Concentrao [M]
1 x 10
-6 -6 -6 -5 -5 -4 -4 -3 -3 -3

Velocidade Inicial (unidades arbitrrias)

110 220 480 830 1700 2600 3100 3200 1 5 10 50 100 500 1000

2 x 10 5 x 10 1 x 10 3 x 10 1 x 10 5 x 10 1 x 10 Etileno glicol 1 x 10 0,01 0,05 0,1 0,5 1,0 5 x 10

7) Clulas epiteliais de intestino de camundongo isoladas em cultura transportam L-leucina e Dleucina mostrando Kt (mM) e Vmax, respectivamente iguais a: 0,24 e 420 para L-leucina e 4,7 e 310 para D-leucina, ambos em presena de Na+ no meio de cultura. Mas na ausncia de Na+ , Lleucina mostra 0,24 e 23 enquanto D-leucina mostra 4,7 e 5 para Kt (mM) e Vmax, respectivamente. Classifique esse transportador de leucina quanto ao tipo e mecanismos de ao. Que efeitos voc esperaria se nesse meio de cultura fosse colocada valinomicina (ionforo de Na+)? E se fosse dissolvida ouabana (inibidor da ATPase Na+/K+) no meio de cultura? Explique. 8) O pH e a absoro de drogas. A droga aspirina, intensamente receitada, um cido fraco com um pKa de 3,5. A aspirina absorvida para o sangue atravs das clulas de revestimento do estmago e do intestino delgado. Para uma substncia ser absorvida ela deve atravessar facilmente a membrana celular. A passagem atravs da membrana celular determinada pela polaridade da molcula: molculas inicas (carregadas) e molculas altamente polares passam lentamente, enquanto aquelas neutras e hidrofbicas passam rapidamente. Como o pH do suco gstrico cerca de 1 e o pH no intestino delgado, cerca de 6, pergunta-se: a) Escreva por frmulas estruturais a ionizao reversvel da aspirina. b) Onde a aspirina mais absorvida para a corrente sangunea, no estmago ou no intestino delgado? Justifique claramente a sua escolha.

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MDULO 15: CICLO DAS PENTOSES

1. Muitas funes celulares que envolvem reaes endergnicas so efetuadas graas hidrlise
exergnica de ATP. Outras reaes endergnicas, como a sntese de cidos graxos e colesterol e a fotossntese, requerem NADPH, que tem um grande poder redutor.

2. O grupo fosforila no carbono 2 de uma das unidades de ribose do NADPH o diferencia de NADH.
NADH oxidado pela cadeia respiratria para gerar ATP, enquanto que NADPH serve como um doador de eltrons em reaes biossintticas redutoras.

3. Na via das pentoses, NADPH gerado quando a glicose-6-fosfato oxidada a ribose-5-fosfato,

que um acar de 5 carbonos, componente de vrios compostos importantes, como ATP, CoA, NAD+, FAD, RNA e DNA.

4. A via das pentoses tambm catalisa a interconverso de acares de 3, 4, 5, 6 e 7 carbonos, em

uma srie de reaes no oxidativas que ocorrem no citosol.

5. As reaes da via das pentoses so as seguintes:

glicose-6-fosfato desidrogenado e convertido a ribulose-5-fosfato, em trs reaes, produzindo 2 NADPH + H+. ribulose-5-fosfato isomerizada a ribose-5-fosfato. Nestas reaes, 2 NADPH + H+ e uma ribose-5-fosfato so gerados para cada glicose-6-fosfato oxidada. ribose-5-fosfato convertida a gliceraldedo-3-fosfato e frutose-6-fosfato pela transcetolase e transaldolase. A transcetolase catalisa a transferncia de unidades de C2 de uma cetose para uma aldose. A transaldolase transfere unidades de C3 de uma aldose para uma cetose. As reaes de transcetolase e transaldolase criam uma ligao reversvel entre a via das pentoses e a via glicoltica. O resultado dessas reaes a formao de 2 hexoses e 1 triose a partir de 3 pentoses: C5 + C5 C7 + C3 C5 + C4 C3 + C7 C4 + C6 C3 + C6 Transcetolase Transaldolase Transcetolase

6. O excesso de ribose-5-fosfato formado pela vias das pentoses pode ser completamente
convertido em intermedirios da via glicoltica.

7. A primeira reao da via das pentoses, a desidrogenao da glicose-6-fosfato, praticamente

irreversvel. E essa a reao em que a via das pentoses controlada. O fator regulatrio mais importante o nvel de NADP+, o receptor de eltrons na oxidao da glicose-6-fosfato a 6fosfogluconolactona. Alm disso, NADPH compete com NADP+ pela ligao enzima. A parte no oxidativa da via das pentoses controlada principalmente pela disponibilidade de substratos.

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8. A via percorrida pela glicose-6-fosfato depende da necessidade celular de NADPH + H+, ribose-5fosfato e ATP: Quando muito mais ribose-5-fosfato requerida que NADPH + H+, a maior parte de glicose-6-fosfato convertida a frutose-6-fostato e gliceraldedo-3-fosfato pela via glicoltica, a transaldolase e a transcetolase convertem esses em ribose-3-fosfato. Quando a necessidade de NADPH + H+ e ribose-5-fosfato esto balanceadas, a reao predominante a formao de 2 NADPH e uma ribose-5-fosfato de glicose-6-fosfato pela fase oxidativa da via das pentoses. Quando muito mais NADPH + H+ requerido que ribose-5-fosfato, a glicose-6-fosfato completamente oxidada a CO2, ou convertida a piruvato.

Grupo de discusso 15

1) Mostre a parte oxidativa do ciclo das pentoses com as equaes das reaes envolvidas, indicando os agentes oxidantes e a origem do carbono presente no CO2 liberado. 2) Compare NADH e NADPH, indicando suas funes no metabolismo de carboidratos. Explique porque a via da pentose-fosfato muito mais ativa no tecido adiposo que no msculo. 3) Quando h necessidade de NADPH, o ciclo das pentoses pode funcionar dando um resultado lquido que equivale oxidao total de glicose a CO2. Explique este processo atravs das respectivas reaes estequiometricamente equilibradas. 4) Ribose 5-fosfato pode ser obtida para a sntese de nucleotdeos atravs da via das pentoses, com ou sem oxidao da glicose. Mostre como isso possvel com as respectivas equaes qumicas. 4.) Explique como a via da pentosefosfato controlada, tendo em vista que grande parte das reaes dessa via reversvel. 6) Compare as reaes catalisadas por transaldolases e transcetolases, indicando reagentes, produtos e a natureza das reaes.

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MDULO 16 E 17 FOTOSSNTESE

1. A fotossntese o processo pelo qual a energia luminosa transformada em energia qumica e

poder redutor, armazenada nas molculas de ATP e NADH +H+. Num segundo passo fase escura (na verdade, fase independente de luz) a energia armazenada utilizada para sntese de glicose a partir de CO2 +H2O. A fotossntese ocorre nos cloroplastos, uma organela que, como a mitocndria, possui uma membrana externa altamente permevel e uma membrana interna praticamente impermevel, separadas por um espao intermembranar. A equao geral da fotossntese : 6 CO2 + 6 H2O C6H12O6 + 6 O2 Go= +2.870 KJ x mol-1

3. As reaes dependentes de luz ocorrem na membrana tilacide e envolvem processos

semelhantes ao transporte de eltrons e fosforilao oxidativa da mitocndria. As reaes independentes de luz ocorrem no estroma.

4. Os primeiros estudos de fotossntese realizados levaram concluso de que CO2 era a fonte do
O2 gerado na fotossntese. Em 1931, entretanto, demonstrou-se que bactrias fotossintetizantes anaerbicas, sintetizam glicose a partir de CO2, sem gerar O2: CO2 + 2 H2S luz (CH2O) + 2 S + H2O

5. A reao geral da fotossntese pode ser demonstrada como segue:

CO2 + 2 H2A luz (CH2O) + 2 A + H2O Em cianobactrias, H2A H2S, e em plantas, H2O. Isso sugere que a fotossntese seja um processo de duas fases, nos quais a energia solar utilizada para oxidar H2A (fase clara): 2 H2A luz 2 A + 4[H] e o agente redutor resultante [H] subsequentemente reduz CO2 (fase escura): 4[H] + CO2
luz

(CH2O) + H2O

6. O principal fotorreceptor na fotossntese a clorofila. A luz absorvida pelas clorofilas antena e

pigmentos acessrios transferida para centros de reao fotossintticos, onde ocorrem as principais reaes da fotossntese.

7. Plantas e cianobactrias utilizam o poder redutor gerado pela oxidao de H2O dirigida pela luz
para produzir NADPH.

8. A produo de O2 na fotossntese requer 2 fotossistemas: Fotossistema I (P700) gera um forte

agente redutor, capaz de reduzir NADP+, e concomitantemente, um oxidante fraco; Fotossistema II (P680) gera um forte agente oxidante, capaz de oxidar H2O, e concomitantemente, um redutor fraco. O redutor fraco reduz o oxidante fraco. Assim, fotossistemas I e II precisam funcionar em srie para acoplar a oxidao da H2O com a reduo de NADP+ (transferncia de eltrons de H2O para NADP+, formando O2 e NADPH + H+).

9. Quando iluminado, o FS II passa para uma forma excitada e perde eltrons, os quais so
transportados por reaes de xido-reduo para o fotossistema I. O PS I iluminado fornece

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eltrons para a reduo de NADP+. Como resultado temos a oxidao do FS II e a reduo do FS I. A reposio de eltrons em PS II feita por eltrons provenientes da oxidao de gua e, em PSI, por eltrons emitidos por PSII.

10. Os componentes envolvidos no transporte de eltrons de H2O para NADP+ com produo de
NAPDPH + H+ esto organizados em trs partculas, que esto ligadas a membrana tilacide: (1) fotossistema II; (2) complexo do citocromo b6f; (3) fotossistema I (fotofosforilao no-ciclica).

11. Os cloroplastos geram ATP de maneira muito semelhante da mitocndria, ou seja, atravs do
acoplamento da dissipao de um gradiente de prtons sntese de ATP.

12. Na fotofosforilao cclica, os eltrons emitidos por P700 (PSI) so transferidos ao complexo
citocromo b6f, retornando finalmente a P700. No h sntese de NADPH + H+, nem liberao de oxignio.

13. Na fase clara da fotossntese, ATP e NADPH + H+ so sintetizados, e esses so utilizados na

fase escura para a sntese de carboidratos. A via pela qual as plantas incorporam CO2 em carboidratos denominada de Ciclo de Calvin.

14. O ciclo de Calvin engloba duas fases: (1) a fase de produo, na qual 3 molculas de ribulose-5fosfato reagem com 3 molculas de CO2, gerando 6 molculas de gliceraldedo-3-fosfato, com o gasto de 9 ATPs e 6 NADPH + H+; (2) a fase de recuperao, na qual os tomos de carbono de 5 gliceraldedo-3-fosfato entram em uma srie de reaes para dar origem a 3 ribulose-5-fosfato, com as quais o ciclo recomea.

Grupo de discusso 16

1) Porque as folhas das plantas so verdes? Explique em termos de composio e espectro de absoro dos pigmentos foliares. 2) H muito tempo, foi observado que a eficincia da fotossntese, medida em termos de O2 produzido por energia luminosa absorvida, cai drasticamente quando uma fonte de luz monocromtica alcana o comprimento de onda de 700 nm (queda no vermelho). Alm disso, observou-se tambm que a aplicao concomitante de um feixe de luz de baixa intensidade e comprimento de onda de 650 nm complementava a luz vermelha de 700 nm, recuperando a eficincia fotossinttica de liberar O2. Que importncia teve no passado a descoberta deste fenmeno e qual a explicao atual para sua existncia? 3) O que fotofosforilao cclica e no que difere da fotofosforilao no cclica? Quando o [NADPH + H+ / NADP+] alto, a produo de O2 durante fotofosforilao suprimida. Explique o fenmeno considerando os papis dos dois fotossistemas.

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4) Porque a descoberta da reao de Hill, em 1939, deu apoio hiptese anterior de Van Niel, propondo que o O2 da fotossntese vem da gua? 5) Compare a fase clara da fotossntese com o processo de respirao na mitocndria, indicando diferenas e semelhanas. 6) Sabe-se que a produo de O2 na fotossntese requer o funcionamento de dois fotossistemas. Explique resumidamente como ocorre a interao entre os dois fotossistemas, incluindo doador e receptor de eltrons no processo.

Grupo de discusso 17

1) Compare a fase clara da fotossntese com o processo de respirao na mitocndria, indicando diferenas e semelhanas. 2) Sabe-se que a produo de O2 na fotossntese requer o funcionamento de dois fotossistemas. Explique resumidamente como ocorre a interao entre os dois fotossistemas, incluindo doador e receptor de eltrons no processo. 3) Explique como algumas bactrias anaerbicas podem realizar a fotossntese. 4) Explique como organismos fotossintetizantes sintetizam carboidratos a partir de CO2 e H2O. 5) Explique a regulao do ciclo de Calvin, mencionado as enzimas-chave sujeitas a regulao e como as reaes da fase controlam o processo da fixao de CO2. 6) Quando uma suspenso de algas verdes iluminada na ausncia de CO2 e depois incubada no escuro com CO2 radiomarcado [14CO2], o
14

CO2 convertido em [14C]-glicose por um curto

14

tempo. Qual o significado dessa observao e como ele est relacionado com as reaes luminosas da fotossntese? Por que cessa a converso de tempo? CO2 depois um curto intervalo de

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MDULO 18: METABOLISMO DO GLICOGNIO

1. O glicognio um polissacardeo que funciona como forma de reserva de energia em animais e microrganismos. Em animais, o glicognio est depositado no fgado, um rgo central de reserva de energia, e, tambm, nos msculos, onde degradado localmente. O glicognio heptico exportado para manter a glicemia. 2. A natureza polimrica e semi-solvel do glicognio constitui-se numa maneira perfeita de armazenar energia na forma de glicose. O estoque de glicognio do fgado na forma de glicose causaria tamanha presso osmtica, que a viabilidade do hepatcito seria impossvel. 3. O glicognio um polmero de -D-glico-piranose altamente ramificado. Na cadeia os monmeros so interligados por ligaes glicosdicas (14); nos pontos de ramificao a ligao tambm glicosdica, mas (16). 4. A glicose, na forma de glicose-1-P, liberada da reserva de glicognio pela fosforlise da ligao (14) da extremidade no redutora do polmero. Esta reao catalisada pela glicognio fosforilase. 5. A glicognio fosforilase degrada at restarem 4 resduos antes de uma ramificao at que a enzima desramificadora transfere 3 dos 4 resduos para outra extremidade da cadeia de glicognio formando uma nova ligao (14). O resduo restante est ligado a cadeia pela ligao (16) que hidrolisada pela enzima desramificadora atravs de sua atividade (16) glicosidase. 6. Glicose-1-fosfato convertida a glicose-6-fosfato pela fosfoglicomutase, esta pode ser liberada pela circulao no fgado pela ao da glicose-6-fosfatase ou degradada pelo msculo. 7. A sntese do glicognio se d atravs de via uma diferente da de degradao. A glicose-1-P primeiro ativada uridinadifosfato-glicose, ou simplesmente UDP-G. UDP-G o substrato da glicognio sintase que catalisa a adio de um resduo de glicose ao carbono 4 da glicose de uma extremidade no redutora do glicognio, liberando ainda como produto UDP. Esta reao necessita de cadeias glicognicas pr-existentes que funcionam como PRIMER da reao, oferecendo extremidades no redutoras para reagir com UDP-G. Gli 6-P Gli 1-P Gli 1-P + UTP UDP-Gli + PPI (1-fosfato uridil transferase) UDP-Gli + glicognio (n) UDP + glicognio (n + 1) O UDP convertido a a UTP as custas da utilizao de ATP: PPI + H2O 2 PI (pirofosfatase) UDP + ATP UTP + ATP (nucleosdeo difosfato quinase)

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8. A glicognio fosforilase e glicognio sintase formam um ciclo que, respectivamente, libera e deposita glicose-1-P no estoque da glicognio: UTP + H2O Glicose-1P Glicognion Fosforilase Pi Glicognion+1 SintaseI UDP UDPG 2 Pi

fcil notar que se estas enzimas funcionarem concomitantemente o ciclo ser FTIL, cujo nico resultado lquido ser dissipao de energia atravs da reao: UTP + H2O UDP + Pi Conclui-se que, necessariamente, no hepatcito estas enzimas so coordenadamente reguladas, isto , quando a fosforilase ativada para mobilizar glicose-1-P, a sintase desativada, e vice-versa, conforme a necessidade celular. 9. Ambas fosforilase e sintase so reguladas por fosforilao (modificao covalente) em resduos especficos de serina, reaes catalisadas pela mesma protena-quinase que possui dupla especificidade, sendo por isso chamada de sintase-fosforilase quinase. A fosforilase e a sintase so espcies fosforiladas, portanto a fosforilao, catalisada pela sintase-fosforilase quinase, causa ativao da fosforilase e inativao da sintase. 10. A fosforilase a e a sintase I (formas ativas), por um lado, e a fosforilase b e a sintase D (formas no ativas), por outro, so, respectivamente interconversveis. Para tanto necessrio que fosforilase a e a sintase I sejam desfosforiladas, atravs de uma reao que requer catlise. A principal enzima, catalisadora comum destas desfosforilaes, a fosfoprotena fosfatase 1. 11. A integrao metablica requerida pelo bom funcionamento do organismo faz com que as interconverses coordenadas da fosforilase e sintase do glicognio no fgado, por fosforilao, sejam controladas extracelularmente por hormnios especficos, principalmente: adrenalina, glucagon e insulina. 12. As formas inativas fosforilase b e sintase D so intracelularmente estimuladas por fatores alostricos positivos, por razes de economia interna do metabolismo celular, independentemente de controle hormonal. So estimuladores alostricos da fosforilase b e sintase D, respectivamente, 5-AMP e glicose-6P.

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Grupo de discusso 18

1) A ativao de glicose-1-fosfato (G1-P), requer a clivagem de uma ligao de alta energia, liberando PPi. Considere os passos de ativao de G1-P e a reao de regenerao de UTP e analise o gasto de energia necessrio para a sntese de glicognio. Compare o gasto de energia para a adio de um resduo de glicose ao glicognio, com a obteno de energia a partir da liberao de glicose na degradao do glicognio. 2) Qual a finalidade das reservas de glicognio do fgado e msculo? Qual a principal diferena bioqumica entre esses tecidos? 3) Equacione as etapas de mobilizao da glicose a partir do glicognio no fgado e no msculo. Mostre: a) no fgado (desde a fosforlise at a liberao de glicose no plasma); b) no msculo (desde a fosforlise at o aproveitamento na gliclise). 4) Qual a funo da hidrlise de PPi no controle da sntese de glicognio? 5) Esquematize as etapas de degradao total do glicognio, indicando as enzimas envolvidas, reagentes e produtos da reao. 6) Mostre como so coordenadas sntese e degradao do glicognio. Restrinja-se ativao e inativao da fosforilase e da sintase, explicando a natureza do processo e as enzimas envolvidas (no considere o controle hormonal).

MDULO 19: CONTROLE HORMONAL DO METABOLISMO

1. A regulao metablica feita de interferncia direta de determinadas reaes qumicas que compem o metabolismo, aumentando ou reduzindo sua velocidade. O resultado direto deste processo a maior oferta de substratos ou acmulo de metablitos que acabar por influenciar outras vidas dependentes destes compostos e a forma mais eficiente de regulao desta rede aumentar a concentrao ou alterar a eficincia da enzima.

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2. Pode se controlar a sntese ou degradao enzimtica; tambm se pode modular a atividade enzimtica atravs de mudanas conformacionais da prpria enzima provocada atravs da ligao de compostos ou grupos na cadeia peptdica: regulao alostrica e regulao por modificao covalente. A concentrao enzimtica tambm pode variar conforme a oferta do substrato; alterao mediada atravs de hormnios. 3. Hormnios so sinais qumicos que permitem a comunicao entre clulas. So sintetizados em clulas glandulares para atingir clulas alvo atravs da circulao sangunea. As clulas alvo respondem a hormnios especficos por possurem os respectivos receptores hormonais. A ligao do hormnio ao receptor segue uma reao de equilbrio semelhante interao enzima-substrato: H + R [RH]: a constante de dissociao de RH (KD), correspondente reao inversa muito baixa - (10-12 a 10-9 M) - devido alta afinidade entre hormnio e receptor. 4. Uma parte importante dos receptores hormonais so protenas integrais de membrana, muitas da quais tem, atualmente, sua estrutura primria conhecida e sua estrutura tridimensional modelada, em conseqncia da clonagem e seqenciamento dos seus respectivos genes. Por exemplo, o receptor -adrenrgico do hormnio adrenalina, encontrado em hepatcito e outros tipos celulares, possui um peso molecular de 64 kD, compreendendo uma nica cadeia peptdica que, de maneira serpentiforme, atravessa a membrana 7 vezes, deixando do lado extracelular, a extremidade N-terminal e 3 alas, e do lado intracelular, outras 3 alas mais a extremidade C-terminal. A poro extracelular do receptor contm o stio de ligao da adrenalina, enquanto a poro intracelular se associa a um trmero de protenas conhecidas como protena-G, por ter um stio especfico para ligao do nucleotdeo GTP. So hoje conhecidos mais de 1000 receptores, de mltiplos hormnios, com esta estrutura bsica formando a superfamlia chamada dos receptores associados a protena-G. A funo deste receptor transduzir o sinal adrenalina de fora para dentro da clula, processo que mediado pelas protenas-G. H tambm receptores presentes no citoplasma nuclear e citoplasmtico e neste caso, o hormnio precisa ter alta solubilidade a lipdeos, atravessando a membrana plasmtica como os hormnios esterides para encontrar o seu receptor dentro da clula. 5. Os hormnios esto envolvidos no metabolismo em dois nveis: induo ou represso gnica de determinadas enzimas ou atravs da modificao covalente: A fosforilao mediada pelas protenas quinases que transferem o grupo fosfato do ATP para resduos especficos de serina, treonina e tirosina, formando uma ligao ster fosfrico ou a retirada do grupo fosfato catalisada pela ao de fosfoprotenas fosfatases atravs da hidrlise. 6. A ligao de adrenalina ao receptor -adrenrgico acoplado a protena G ativa a enzima adenilato ciclase atravs da ativao da subunidade (por ligao de GTP), presente na face interna da membrana citoplasmtica, qual ativa a adenilato ciclase, catalisando a formao de cAMP a partir de ATP e desencadeando a transduo de sinal. A descoberta de cAMP, por Sutherland e colaboradores h cerca de 40 anos, levou criao do conceito do segundo

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mensageiro da ao hormonal, sendo cAMP o primeiro a ser descrito, e permitiu dar incio progressiva compreenso dos mecanismos de ao do receptor de adrenalina. Devemos lembrar que os primeiros mensageiros qumicos extracelulares so os hormnios. cAMP tem efeito transiente e hidrolisada pela ao da fosfodiesterase. Na clula, o balano entre as reaes de sntese (a) e degradao (b) regula a concentrao intracelular do cAMP. a) ATP + H2O cAMP + 2 Pi; catalisada pela adenilato ciclase b) cAMP + H2O AMP; catalisada pela fosfodiesterase. 7. A base da ao metablica do cAMP a ativao alostrica de uma quinase cujos substratos so protenas, sendo conhecida como protena quinase dependente de cAMP, ou simplesmente PKA (Protein Kinase dependent on cAMP). A PKA, uma vez ativada, catalisa a fosforilao ativadora (modificao covalente) de uma cascata de protenas quinases que terminam na fosforilao da fosforilase a e da sintase do glicognio, causando, respectivamente, a ativao e a inativao dessas enzimas. O resultado final dessa seqncia de ativaes enzimticas, com alternncia de regulao alostrica e modificao covalente, a fosforlise do glicognio liberando glicose-1P, comandada por sinais hormonais extracelulares. 8. Os efeitos de ativao ou no da via dependem do receptor ativado, no caso dos receptores adrenrgicos, os efeitos de 1 so mediados atravs dos ons clcio e e a ativao de 2 leva a inibio da via de adenilato ciclase. H casos aonde a protena G do tipo Gs sendo ativadora de adenilato ciclase e do tipo GR inibindo a adenilato ciclase. Algumas toxinas podem ativar ou bloquear a via de transduo de sinal: toxina da clera e a toxina da coqueluche. 9. Dois hormnios so os principais responsveis pelo equilbrio da concentrao da glicose circulante: glucagon e insulina. 10. O glucagon um hormnio que tem efeitos equivalentes aos da adrenalina no controle do metabolismo do glicognio: possui um receptor da famlia dos receptores acoplados a protenaG e ativa a cascata que se inicia com cAMP/PKA. Este liberado em condies de hipoglicemia ativando processos degradativos para manuteno da glicemia sangunea. A PKA (protena quinase ativada por cAMP) fosforila a fosforilase quinase tornando-a ativa. A fosforilase quinase fosforila agora glicognio fosforilase. A glicognio fosforilase ativada (quando fosforilada, glicognio fosforilase b a) catalisa a hidrlise de resduos de glicose do glicognio liberando grupos de glicose-1-fosfato. No mesmo tempo, a fosforilase quinase, ativada pela cascata do receptor de glucagon-protena-G, cAMP/PKA, fosforila a glicognio sintase, a qual se torna inativa quando fosforilada (sntase I sintase D). 11. A insulina tem efeito oposto, promove a absoro de glicose pelo fgado e msculos e usa deposio nas reservas de glicognio. Mas importante notar que a insulina tem mecanismos de ao totalmente diferentes da adrenalina e do glucagon. Os receptores de insulina no pertencem famlia dos receptores acoplados a protena-G e no tm ao sobre a adenilato ciclase. Seus receptores so do grupo de receptores cujo domnio intracelular apresenta atividade intrnseca de protena-quinase de tirosina. A insulina estimula fosfoprotenas

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fosfatases. Para reverter a ao do glucagon, a insulina promove a ativao da fosfoprotena fosfatase que catalisa a desfosforilao da glicognio fosforilase e da glicognio sintase, levando a inativao da primeira (fosforilase a b) e ativao da segunda (sntase D sintase I). Desta forma o fluxo glicoseglicognio favorecido. O transporte da glicose no interior das clulas com a atuao da insulina um processo passivo mediado por uma famlia de permeases denominadas GLUT (glucose transporter). 12. Respostas celulares rpidas desencadeadas por hormnios s podem ser obtidas atravs da ativao, ou da inibio, de enzimas pr-existentes. Hormnios esterides (por exemplo cortisol) quando secretados difundem-se pela membrana citoplasmtica e ligam-se ao seus receptores intracelulares os quais, quando ativados, promovem no ncleo a regulao do metabolismo pela induo da transcrio de genes que codificam enzimas especficas, levando sntese de novo das protenas correspondentes, fenmeno conhecido como induo enzimtica. Mas o mecanismo de induo enzimtica desencadeado por hormnios resulta necessariamente numa resposta celular lenta, uma vez que os RNAs mensageiros (mRNAs) precisam ser transcritos, processados, transportados para o citoplasma e protenas enzimticas exigidas. 13. A adrenalina estimula uma resposta local no msculo. A liberao de adrenalina induzida por estmulo nervoso autnomo em situaes de perigo, exerccio fsico, e hipoglicemia e induz a degradao do glicognio com os fins de fornecer glicose-1-fosfato como fonte de energia para atividades musculares que permitem ao animal reagir a estas situaes. 14. Regulao da gliclise e gliconeognese. A gliclise uma das vias metablicas principais para o fornecimento de energia. No fgado, encontra-se tambm a gliconeognese, a qual , de forma geral, uma via antagnica da gliclise. A regulao das duas vias feita de forma reciproca, isto , quando uma delas est ativa, a outra est inibida. H trs vias sob controle metablico: as converses reversveis de: (i) glicose para glicose-6-fosfato (hexoquinase e glicose-6-fosfatase); (ii) frutose-6-fosfato e frutose-1,6-bisfosfato (fosfofrutoquinase e frutose-1,6-bisfosfatase; e (iii) fosfoenolpiruvato e piruvato (piruvato quinase e fosfoenolpiruvato carboxiquinase, piruvato carboxilase). A fosfofrutoquinase o principal ponto de regulao da gliclise. AMP e frutose2,6-bisfosfato agem como efetuadores alostricos positivos. A formao de frutose-2,6-bisfosfato est sob controle hormonal. Em condies de hipoglicemia, o glucagon estimula a produo de cAMP no fgado. Isso ativa a PKA a fosforilar e inativar a fosfofrutoquinase e ativar a frutosebisfosfatase-2, diminuindo a concentrao de frutose-2,6-bisfosfatase. Como resultado, o equilbrio entre as reaes de fosfofrutoquinase alterado, em favor da sntese de frutose-6fosfato, aumentado o fluxo gliconeognico e a sntese de glicose-6-fosfato. Ao contrrio, em condies de hiperglicemia, as concentraes de cAMP diminuram, e o conseqente aumento de frutose-2,6-bisfosfato ativa a fosfofrutoquinase e promove a gliclise. finalmente traduzidos para produzir as

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Grupo de discusso 19

1) Os hormnios podem ser de natureza qumica muito diferente, por exemplo, adrenalina, uma catecolamina, e glucagon, um peptdeo. Apesar disso, desencadeiam o mesmo processo metablico no fgado, isto , mobilizao de glicose da reserva de glicognio. Se um hormnio um sinal qumico, como possvel que substncias quimicamente to diferentes transmitam a mesma sinalizao metablica para o hepatcito? 2) O sinal hormonal, por exemplo, da adrenalina no hepatcito, rapidamente decodificado e amplificado numa cascata que alterna ativaes alostricas e reaes enzimticas. Mostre quais so os fundamentos desse processo que garantem essa rapidez e amplificao. 3) As vias metablicas clssicas como, por exemplo, a gliclise e a via de biossntese de cidos graxos, cuidam da grande massa do trabalho metablico, como, respectivamente, produo e armazenamento de energia. H, no entanto, vias ou circuitos, quantitativamente insignificantes, mas fundamentais, para o controle das vias metablicas massivas. Os circuitos, ou vias regulatrias, acionados pelos hormnios pertencem a este grupo. Que circuito regulatrio permite adrenalina promover a gliclise no msculo e a gliconeognese no fgado? 4) O nvel de glicose no sangue aps um perodo de jejum de aproximadamente 0,8 mg/ml (4 mM). Depois da ingesto de alimentos, o nvel de glicose passa a ser de aproximadamente 1,2 mg/ml (6 mM). Explique porque os nveis de glicose variam to pouco em situaes alimentares to diferentes. Como esses nveis so controlados? 5) A induo enzimtica uma importante forma de adaptao do hepatcito s necessidades metablicas do organismo, mas no serve para respostas ultra-rpidas como a mobilizao de glicose da reserva de glicognio. Explique porqu. 6) A concentrao de ATP na clula est em torno de 5 mM. A quantidade total de ATP pequena e fonte primria de energia para o funcionamento celular. Por outro lado, o ATP tambm o reagente que permite gerar cAMP, um dos mais importantes sinais qumicos intracelulares de regulao metablica. Alm disso, cabe lembrar que todos os efeitos regulatrios do cAMP decorrem da ativao da enzima quinase de protena dependente de cAMP, conhecida como PKA. Tendo em conta todos estes fatos conhecidos, qual deve ser a ordem de grandeza da constante de ativao (Ka, semelhante a Km) de PKA por cAMP? Justifique sua resposta.

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MDULO 20: METABOLISMO DE AMINOCIDOS

1. Em animais, o N do grupo amino dos aminocidos so eficientemente obtidos a partir de NH4+ pelas reaes catalisadas pelas enzimas desidrogenase glutmica e glutamina sintetase, fornecendo, respectivamente, glutamato e glutamina. 2. Ainda em animais de forma geral, os aminocidos alanina e aspartato podem ser obtidos a partir de, respectivamente, piruvato e oxalacetato, atravs da reao de transaminao tendo glutamato como doador de grupo amino. Outros aminocidos exigem reaes adicionais, alm da transaminao para sua sntese final. Mas, como regra, os esqueletos de C dos aminocidos so obtidos a partir dos intermedirios da gliclise, do ciclo de Krebs e do ciclo das pentoses. 3. H, no entanto, aminocidos que no podem ser sintetizados por animais devido a falta do precursor que fornece o esqueleto de C. Estes so ditos aminocidos essenciais e tem que ser obtidos na dieta. Por exemplo, humanos tem que conseguir da dieta 9 aminocidos essenciais. 4. Triglicerdeos e glicognio so compostos de reserva, mobilizados quando h necessidade de energia. Em animais, no existem espcies de protena com funes de reserva energtica, mas no jejum prolongado protenas so hidrolisadas para liberar aminocidos que sero catabolisados para produo de energia. O fgado o centro de catabolisao de aminocidos. 5. O catabolismo de aminocidos envolve a eliminao de N na forma de NH4+ e a transformao dos esqueletos de C em intermedirios da gliclise e do ciclo de Krebs. 6. Duas reaes principais permitem a eliminao do amino grupo. Diversos aminocidos podem transferir o grupo amino para o alfa-cetoglutarato numa reao catalisada por transaminases: aspartato + alfa-cetoglutarato oxalacetato + glutamato Por outro lado, glutamina e glutamato podem ser desaminados em reaes catalisadas pela glutaminase e desidrogenase glutmica, respectivamente: glutamina + H2O glutamato + NH4+ glutamato + NAD+ (ou NADP+) + H2O NH4+ + alfa-cetoglutarato + NADH (ou NADPH) + H+ O ction amnio txico, sendo utilizado para a sntese de glutamina ou convertido em uria no ciclo correspondente, para fins de excreo. 7. Aminocidos como alanina, aspartato e glutamato so ditos glicognicos porque podem ser convertidos em, respectivamente, piruvato, oxalacetato e alfa-cetoglutarato, que, por sua vez, podem ser transformados em fosfoenolpiruvato para sntese de glicose. J os aminocidos leucina e lisina so chamados cetognicos por produzirem exclusivamente acetilCoA como produto de degradao, portanto servindo sntese de corpos cetnicos, mas no de glicose.

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Grupo de discusso 20

1) Como a reao de transaminao e qual a sua importncia para o metabolismo de aminocidos? 2) A amnia pode ser txica para a mitocndria heptica? Como se explica bioquimicamente esta toxidez? Que reaes e respectivas enzimas protegem a mitocndria da toxidez de amnia? 3) Uma das duas principais reaes de entrada de NH3 no metabolismo a reao catalisada pela glutamina sintetase. Mostre a equao dessa reao. Qual a importncia da glutamina para o metabolismo? D exemplos. 4) O que so aminocidos glicognicos e cetognicos? D exemplos e explique mostrando as reaes relevantes do metabolismo. 5) Humanos sintetizam parte dos aminocidos que precisam, o restante obtido da dieta e por isso, chamados essenciais. Mostre, com as reaes pertinentes, porque e como alguns aminocidos so sintetizados por humanos e qual a limitao que impede a sntese dos essenciais. 6) Animais em geral no possuem reservas na forma de protenas ou qualquer outra macromolcula nitrogenada. Quais as conseqncias desse fato para o balano de nitrognio nesses organismos em condies de alimentao abundante e de jejum acentuado?

MDULO 21: CICLO DO NITROGNIO

1. Os gases mais abundantes no ar atmosfrico, O2 e N2, so essenciais para a existncia da vida biolgica no planeta Terra, mas divergem quanto reatividade qumica. O O2 tem propriedades de radical livre reagindo com relativa facilidade, da servir muito bem como oxidante final na respirao de todos os organismos. J o N2 possui uma tripla ligao altamente estvel que lhe confere baixssima reatividade qumica. Apesar disso, o N2 gasoso da atmosfera a fonte do elemento N que garante a vida na Terra. Por essas razes fsico-qumicas a reduo do N2 atmosfrico pelos sistemas biolgicos tem caractersticas muito peculiares. 2. A reduo qumica do N2 a NH3 exige condies drsticas, 500 graus Celsius de temperatura e 300 atm de presso, certamente incompatveis com a vida biolgica. Mas bactrias

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especializadas do gnero Rhyzobium, que so simbiontes de plantas leguminosas, reduzem eficientemente N2 a NH4+, uma espcie qumica totalmente compatvel com o metabolismo de todos os organismos. Portanto, o N2 fixado por essa simbiose entre planta e bactria garante a disponibilidade do elemento N para todas as formas de vida terrestre. As bactrias fixadoras de N2 possuem um complexo enzimtico singular, a nitrogenase. A reao de reduo do N2 a NH4+ (fixao de nitrognio), qual envolve um redutor poderoso a grande investimento de energia na forma de ATP, catalisado pela nitrogenase, qual usa NADPH + H+ como doador de eltrons: N2 + 8 H+ + 8 e- + 16 ATP + 16 H2O 2 NH3 + H2 + 16 ADP +16 Pi 3. A volatilidade do NH4+ (NH3 + H+) no favorece sua permanncia no solo, mas existem bactrias autotrficas de vida livre, muito abundantes e largamente disseminadas, que so especializadas na oxidao do ction amnio a nitrito e nitrato para fins de obteno de energia metablica. Desta maneira o elemento N estavelmente depositado no solo na forma de espcies qumicas, sais de nitrito e nitrato, que so eficientemente absorvidas pelas razes das plantas e prontamente reduzidas a NH4+ no interior da clula vegetal. As etapas sumariamente mencionadas compreendem o ciclo do nitrognio na natureza: a) reduo do N2 a NH4+; b) oxidao de NH4+ a nitrito e nitrato; c) reduo de nitrito e nitrato a NH4+ e d) transformao do elemento N de inorgnico para orgnico com a sntese de aminocidos a partir de NH4+, reao possvel em todas a formas de organismos biolgicos.

Grupo de discusso 21

1) CO2 e N2 existem na atmosfera e so fontes dos elementos C e N para os seres vivos. CO2 eficientemente fixado pelas plantas em geral atravs da fotossntese. N2 por outro lado, apesar de extremamente abundante, 70 a 80% do ar, no fixado pela grande maioria das plantas, que necessitam espcies reduzidas ou oxidadas de N2 para a sntese de compostos nitrogenados. Somente algumas poucas formas de bactrias tm a capacidade de fixao de N2. Compare o processo de fixao de CO2 com o de fixao de N2, e procure mostrar porque as plantas fixam muito bem CO2, mas no N2. 2) Equacione a reao da nitrogenase e mostre aonde ocorre. 3) Qual a funo de compostos nitrogenados na respirao anaerbica? Descreva a respirao anaerbica identificando doadores e aceptores de eltrons?

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4) Certas bactrias oxidam NH3 a nitritos e nitratos, enquanto plantas e bactrias em geral reduzem nitritos e nitratos a NH3. Qual a funo da reduo de nitritos e nitratos na vida desses organismos? 5) Cianobactrias conseguem fazer fotossntese e fixao de nitrognio no mesmo tempo. Explique como isso ocorre. 6) Compare as vias de assimilao de amnia em organismos ricos e deficientes em nitrognio.

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MICROPIPETADORES

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Fonte: http://www.analiticaweb.com.br/

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LABORATRIO 1: FOTOMETRIA E ESPECTROFOTMETRO

I.

FUNDAMENTOS A Colorimetria e a Espectrofotometria podem ser conceituadas como um procedimento

analtico atravs do qual se determina a concentrao de espcies qumicas mediante a absoro de energia radiante (luz). Fotometria uma tcnica de anlise quantitativa que envolve a medida de intensidade de absoro de luz monocromtica de um composto qumico em soluo. Serve para identificar o comprimento de onda caracterstico para cada composto e para quantificao do composto atravs de 1) absoro direta e 2) atravs de mtodo colorimtrico. Essa intensidade de absoro depende: 1) do comprimento de onda escolhido (normalmente usa o mx - onde o composto absorve mais luz), 2) do percurso que o feixe de luz percorrer na soluo e 3) da concentrao do composto nessa soluo. A lei de Lambert-Beer estabelece que a absorbncia diretamente proporcional concentrao da espcie absorvente. A frao de luz que passa por uma amostra (a transmitncia = It/I0) est relacionada logaritmicamente, e no linearmente, com a concentrao da amostra (figura 1). A lei de Lambert-Beer relaciona esses trs fatores e estabelece que: A = .l.c onde: A = absorbncia definida pela reao seguinte: A = - log It/I0, que por ser uma razo, no possui unidade (Io intensidade de luz incidente; It intensidade de luz transmitida); = absortividade molar (caracterstico de cada substncia), em L.(mol.cm)-1; l = caminho ptico (percurso da luz monocromtica na soluo), em cm; c = concentrao da substncia em mol/L.

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I0

It

Figura 1 Io intensidade de luz incidente; It intensidade de luz transmitida aps percorrer o caminho ptico (l) pela soluo da amostra. Desta forma, mantendo-se o caminho ptico constante, a absorbncia torna-se diretamente proporcional concentrao da substncia no respectivo mx. Nestas condies, podemos utilizar uma soluo de concentrao conhecida do composto a ser analisado (ou outra substncia de caractersticas qumicas semelhantes) para construir um diagrama de absorbncia em funo da concentrao da substncia em questo. Com este diagrama, denominada curva padro, podemos medir a quantidade do composto em amostras de concentrao desconhecida, pela simples medida de suas absorbncias desde que, estas estejam nas mesmas condies utilizadas para a construo da curva padro (mesmos reagentes, mesma temperatura, etc).

Um exemplo de uma curva padro:

*
Absorbncia

* * * *
Concentrao (mol/L)

Um dos mtodos utilizados para dosagem de protena chamado de mtodo do Biureto. Esse mtodo faz uso da propriedade de ons Cu2+ em meio alcalino de formar ligaes com o nitrognio das ligaes peptdicas. Desta reao (reao de biureto) resulta uma colorao prpura intensa. Este fato pode ser explorado para se determinar por colorimetria a quantidade de protena de uma soluo. A cor desenvolvida numa reao de ons de Cu2+ em meio alcalino com estas

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protenas deve-se exclusivamente s ligaes peptdicas e a sua intensidade proporcional a quantidade de tais ligaes. A absorbncia detectada no espectrofotmetro (figura 2). Um outro mtodo para determinar a quantidade de protena baseado no fato que certos aminocidos possuem anis aromticos o que os leva a absorver em comprimentos de onda especficos na regio de UV. Bases purnicas e pirimidnicas tambm possuem estas propriedades.

Figura 2 Modelo de um espectrofotmetro.

II.

OBJETIVOS 1) Determinao da concentrao de uma protena em soluo aquosa por fotometria. 2) Determinao do espectro de absoro de luz de aminocidos e bases purnicas e pirimidnicas.

III. 1) 1a)

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL Determinao da concentrao de uma protena em soluo aquosa por fotometria Determinao do mx do produto da reao de biureto Adicionar no tubo 1: 1,0 mL de padro de albumina (8 mg/mL), 0,5 mL de gua, 2,5 mL de reagente de biureto. Adicionar no tubo 2:

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1,5 mL de gua, 2,5 mL de reagente de biureto. Aps adio dos reagentes, agitar e incubar os tubos por 15 min a 37oC. Transferir contedo dos tubos para cubetas do espectrofotmetro e ler as absorbncias nos

comprimentos de onda 400, 420, 450, 470, 500, 520, 550, 580, 600, 630, 650, 680 e 700 nm. Usar a soluo de biureto como branco (tubo 2). Com isso, voc estar construindo a curva de absorbncia em funo do comprimento de onda. Estabelecer qual o mx do produto da reao de biureto. 1b) Determinao da concentrao de protena Preparar os tubos como descrito na tabela 1 utilizando uma soluo de 8 mg/mL de albumina (protena padro) e a soluo de protena desconhecida. No tubo branco no dever ser adicionada soluo de protena. A ordem de adio dos componentes da reao deve ser: primeiro soluo de protena, gua, por ltimo o regente biureto.

Aps adio do reagente, agitar e incubar os tubos por 15 min a 37oC. Transferir o contedo dos tubos para cubetas do espectrofotmetro e ler as absorbncias a 540 nm. Utilizando a curva padro (tubos de 1 a 5) e o valor medido de absoro a 540nm da amostra desconhecida, calcular a concentrao de protena nesta amostra.

Tabela 1 Dados para a construo da curva padro para determinao de concentrao de protenas.
Padro de tubos albumina (8mg/mL) branco 1 2 3 4 5 amostra desconhecida 0,1mL 0,2mL 0,4mL 0,7mL 1,0mL protena desconhecida 1,0 mL gua destilada reagente biureto 2,5 mL 2,5 mL 2,5 mL 2,5 mL 2,5 mL 2,5 mL 2,5 mL concentrao (mg/mL) absorbncia (540 nm)

1,5 mL 1,4 mL 1,3 mL 1,1 mL 0,8 mL 0,5 mL 0,5 mL

2) Determinao do espectro de absoro de luz de aminocidos e bases purnicas e pirimidnicas

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2a) Determinao do mx Pipetar 1 mL de cada soluo em uma cubeta de quartzo de espectrofotmetro: Leucina (0,2 mg/mL) Triptofano (0,004 mg/mL) Tirosina (0,1 mg/mL) Adenina (0,004 mg/mL) Timina (0,01 mg/mL)

Determinar nas diferentes solues fornecidas: a) mx, b) absorbncia obtida em mx, c) calcular de cada substncia. 2b) Determinao da curva de absorbncia x concentrao Para construo da curva de absorbncia em diferentes concentraes de triptofano, pipetar os seguintes volumes e medir a absorbncia em mx. (tabela 2).
Tabela 2 Absorbncia em mx. em diferentes concentraes de triptofano. concentrao Triptofano (0,01 absorbncia obtida gua destilada tubos (mg/mL) mg/mL) branco 1 2 3 4 0,1 mL 0,2 mL 0,4 mL 0,7 mL 2,0 mL 1,9 mL 1,8 mL 1,6 mL 1,3 mL

Fazer curva de absorbncia x concentrao e verificar se a mesma obedece a lei de Lambert-Beer.

IV.

RELATRIO DE LABORATRIO 1 Alm da apresentao e discusso dos dados obtidos no laboratrio, o relatrio deve incluir

as seguintes questes respondidas: 1. De acordo com a lei de Lambert-Beer, qual a unidade de absorbncia? 2. Na construo de uma curva padro (absorbncia por concentrao), percebeu-se que essa no passava pela origem das coordenadas. Aponte pelo menos uma causa para explicar esse fato. 3. Por que se deve esperar 15 minutos para ler a absorbncia aps a adio do biureto? 4. Qual a funo do branco?

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5. Na determinao da creatinina do sangue, 4,0 mL da soluo 1:10 de filtrado de sangue desproteinizado foram tratados com 2,0 mL de uma soluo recm preparada de cido pcrico meio saturada em NaOH 5%. Aps 5 min a leitura da cor formada em 530 nm foi de 0,085 de absoro. 4 mL de um padro contendo 0,03 mg de creatinina tratados semelhantemente mostraram uma leitura de 0,425. Qual a concentrao de creatinina em mg por 100 mL? 6. A transferrina uma protena transportadora de ferro encontrada no sangue. Possui um peso molecular de 81000 Da e tem dois ons Fe3+. A desferrioxamina B um potente quelante de ferro usado no tratamento de pacientes com excesso de ferro no organismo. A desferroxamina B possui um peso molecular de cerca de 650 Da e pode se ligar com um Fe+3. A desferrioxamina pode tirar o ferro de vrios locais de dentro do sangue e excretada (com o ferro ligado) pelos rins. As absortividades molares desses compostos (saturados com ferro) em dois comprimentos de onda esto apresentadas a seguir. Ambos os compostos so incolores (nenhuma absoro visvel) na ausncia de ferro. (nm) 428 470 Transferrina (M-1 cm-1) 3540 4170 Desferrioxamina (M-1 cm-1) 2730 2290

a) Uma soluo de transferrina exibe uma absorbncia de 0,463 em 470 nm em uma clula de 1 cm. Calcule a concentrao de transferrina em miligramas e a concentrao de ferro em microgramas por mililitro. b) Pouco tempo depois da adio de desferrioxamina (que dilui a amostra), absorbncia em 470 nm foi de 0,424 e a absorbncia em 428 nm foi de 0,401. Calcule a frao de ferro na desferrioxamina. Lembre-se de que a transferrina se liga a dois tomos de ferro, e a desferrioxamina se liga apenas a um. 7. Encontre a absorbncia e a transmitncia de uma soluo 0,00240 M de uma substncia com

coeficiente de absortividade molar de 313 M-1 cm-1 numa clula com 2 cm de caminho ptico.

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LABORATRIO 2: TITULAO E CROMATOGRAFIA DE AMINOCIDOS

I.

FUNDAMENTOS Aminocidos As unidades constituintes das protenas so os L--aminocidos. Como o prprio nome

indica, estes compostos apresentam pelo menos um grupo amino (-NH2) e um grupo carboxlico (COOH). Em conseqncia deste fato, ao serem dissolvidos em gua, os aminocidos apresentam carter anfotrico, ou seja, comportam-se como cido e como base. Os grupos amina e carboxila podem sofrer protonaes e desprotonaes reversveis, comportando-se como eletrlitos fracos. Se os considerarmos em suas formas de cidos conjugados: -NH3+ e -COOH, veremos que cada um deles apresentar um valor de pKa. Assim, um aminocido apresenta pelo menos dois valores de pKa e dependendo da natureza ionizvel ou no do grupo R (radical) ligado ao carbono a, pode ocorrer ou no um terceiro valor de pKa. Em pH 7,0 o amino grupo apresenta-se protonado (forma cida) e o grupo carboxila desprotonado (forma bsica) (figura 1).

Figura 1 Titulao com lcali de um aminocido. Cromatografia - Separao de aminocidos Um dos problemas que continuamente desafiam os bioqumicos a separao e a purificao de um ou mais compostos de uma mistura complexa. Uma grande variedade de tcnicas modernas, tanto analticas quanto preparativas, denominada de cromatografia. O que elas possuem em comum a propriedade de fracionar uma mistura complexa de substncias usando diferentes caractersticas qumicas entre os componentes da mistura, o que faz com que eles interajam diferencialmente com a fase estacionria e com uma fase mvel. Existem quatro tipos principais de cromatografia: cromatografia lquida, cromatografia gasosa, cromatografia de camada fina e cromatografia em papel. A seleo do tipo de cromatografia para realizar uma determinada etapa de separao dependente do material a ser isolado. Freqentemente, diversos mtodos cromatogrficos podem ser usados seqencialmente para que seja obtido um composto na forma pura. Um leito cromatogrfico pode ser construdo de vrias formas, mas ele sempre consistir, basicamente, de duas fases: a fase estacionria e a fase mvel. A fase estacionria pode ser slida, lquida ou pode consistir de uma mistura de um slido com um lquido. A fase mvel, que pode ser

84

lquida ou gasosa, preenche os interstcios da fase estacionria e deve ser capaz de fluir atravs desta. As fases mvel e estacionria devem ser escolhidas de forma que os compostos que sero separados durante o processo cromatogrfico possuam um coeficiente de partio definido entre as duas fases. Neste processo, vrios mecanismos de distribuio podem ser empregados: a distribuio pode ser uma simples partio entre dois lquidos imiscveis; um equilbrio de adsoro entre uma fase estacionria adsorvente e uma fase lquida mvel; ou um equilbrio de troca inica entre uma fase estacionria trocadora de on e uma fase mvel constituda por uma soluo de um eletrlito. Cromatografia de aminocidos em papel Neste protocolo emprega-se uma mistura de solventes que interagem com as fibras de celulose no papel de formas diferentes. O deslocamento do soluto pode ser explicado da seguinte forma: as fibras de celulose do papel possuem uma forte afinidade pela gua presente na mistura de solvente, mas muito pouca afinidade pela fase orgnica. O papel, assim, pode ser visto como um suporte inerte contendo uma fase estacionria aquosa (polar). Na medida em que o solvente flui atravs de uma seo do papel contendo o soluto, uma partio deste composto ocorre entre a fase mvel orgnica (pouco polar) e a fase estacionria aquosa (polar). Desta forma, parte do soluto deixa o papel e entra na fase mvel. Com o fluxo contnuo de solvente, o efeito desta partio entre a fase mvel e a fase estacionria a transferncia do soluto do seu ponto de aplicao ao papel para um outro ponto localizado a alguma distncia do local de aplicao, no sentido do fluxo de solvente. Aps o equilbrio do papel com o vapor de um solvente saturado com gua, o desenvolvimento do solvente produz a separao (figura 2).

Figura 2 Cromatografia em papel ascendente. Quanto mais apolar for o grupo R, maior a mobilidade do aminocido com a fase mvel. Conseqentemente a relao (RF) entre a distncia percorrida pelo aminocido no papel e a

85

distncia percorrida pela fase mvel ser tambm maior. A Tabela I apresenta valores de RF de alguns aminocidos nas condies descritas. RF = distncia percorrida pelo aminocido no papel distncia percorrida pela fase mvel Atravs da cromatografia em papel identificaremos um aminocido desconhecido em comparao com quatro outros conhecidos (denominados de aminocidos-padro). Com ajuda da Tabela II e dos valores de pKa obtidos na titulao, confirmaremos a identidade do aminocido. A solubilidade relativa dos aminocidos nestas duas fases pode ser mudada por alteraes na polaridade do solvente, ou no pH da soluo, o qual ir alterar o estado inico dos aminocidos. Sob um conjunto adequado de condies, ento, cada molcula de uma mistura ir se deslocar a uma diferente velocidade sobre a fase estacionria e estar a uma distncia especfica de um do ponto de origem, quando cessar o fluxo de solvente. Devido ao fato dos aminocidos no absorverem luz no comprimento de onda visvel, eles no podem ser vistos. Assim, algum mtodo deve ser usado aps a cromatografia para localiz-los. A reao de ninhidrina usada para este propsito por que reage com grupamentos amino livres produzindo um composto colorido (usualmente prpura) (figura 3). Diversos aminocidos, contudo, produzem diversas tonalidades de cores com a ninhidrina, o que pode ajudar em sua identificao. A reao da ninhidrina com prolina, por exemplo, gera um composto amarelo e a reao da ninhidrina com a tirosina produz uma colorao azul metlica.

Figura 3 Reao da ninhidrina com aminocidos. Titulao de aminocidos Nesta titulao adicionaremos lentamente uma base ou um cido a solues de aminocidos permitindo a obteno dos respectivos pKas. A curva de titulao mostra como varia o pH em funo de equivalentes do titulante (cido ou base forte) adicionados. Para um aminocido, deve-se observar no mnimo dois patamares nessa

86

curva correspondendo titulao dos grupos carboxilato e -amino, respectivamente. No meio de cada um desses patamares h um ponto de inflexo, cujo valor de pH numericamente igual ao pKa do grupo correspondente. Essa relao numrica entre pH e pKa facilmente compreensvel da anlise da equao de Henderson-Hasselbalch.

II.

OBJETIVOS 1) Identificao de um aminocido atravs de seu RF, determinado pela tcnica de cromatografia em papel. 2) a) Identificao de um aminocido atravs de seus pKas, determinados pela tcnica de titulao. b) Comparao da curva de titulao de um aminocido com a de um cido fraco monoprtico.

III. 1)

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL Cromatografia em papel Tomar uma folha (23 x 16 cm) de papel Whatman n 1 e fazer um trao a lpis ao longo do

comprimento maior a 2 cm da borda. Evitar tocar no papel durante toda a operao. Deixar uma margem de 1,5cm de cada lado. Marcar seis pontos sobre essa linha que distem 4 cm um do outro e numer-los a lpis de 1 a 6. As amostras devem ser aplicadas nos pontos numerados (3 uL) de tal modo que a mancha formada sobre o papel seja a menor possvel. Nos nmeros de 1 a 4 aplicar os padres e no nmero 6, a mistura de padres. A amostra desconhecida aplicada no nmero 5. Enrolar o papel de modo a transform-lo em um cilindro e prender as extremidades superiores com clips. Colocar 25 mL de solvente de Partridge (n-butanol/cido actico glacial/gua 4:1:1), em uma placa de Petri e mergulhar o cilindro de papel em seu interior de modo que este fique perfeitamente na vertical. Evitar que o papel toque na parede da placa. Cobrir o sistema com um bquer de 2 L e deixar o solvente migrar 10 cm. Retirar o papel e marcar imediatamente a linha de frente do solvente. Secar o papel na estufa. Mergulhar em soluo 0,1% de ninhidrina em acetona e levar estufa (80C-100C) por alguns minutos. Delimitar com lpis as manchas que aparecem no papel. Determinar o RF dos padres e do aminocido desconhecido e comparar com os dados fornecidos na tabela 1, para sua identificao.

87

Tabela 1 - RF de aminocidos determinados nas seguintes condies: solvente de Partridge, n-butanol/cido actico glacial/gua (4:1:1), papel Whatman no1 e 20oC.

Aminocido

RF

Aminocido

RF

Cys Lys His Arg Asp Gly Ser Glu Thr

2) Titulao

0,08 0,14 0,20 0,20 0,24 0,26 0,27 0,30 0,35

Ala Pro Tyr Trp Met Val Phe Ile Leu

0,38 0,43 0,45 0,50 0,55 0,60 0,68 0,72 0,80

Colocar 50 mL da soluo do aminocido (0,10 M) em pH 1,0 em um bquer e titular com soluo 0,5 M de KOH medindo o pH aps cada adio de 1 mL at atingir pH 11,0. Colocar 50 mL de cido actico 0,15 M em outro bquer e titular com soluo 0,5 M de KOH medindo o pH aps cada adio de 0,5 mL at pH 12,0. Determinar os pKs do aminocido desconhecido e do cido actico e comparar os pKs com os dados fornecidos na tabela 2, para sua identificao.
Tabela 2 - pK de aminocidos

Aminocido

pKa

Aminocido

pKa

Glu

Lys

His

Cys

2,19 4,25 9,67 2,18 8,95 10,53 1,82 6,00 9,17 1,71 8,33 10,78

Thr Asn Ala Leu Pro Gly

2,62 10,43 2,20 8,80 2,30 9,70 2,36 9,60 1,99 10,60 2,34 9,60

88

IV.

RELATRIO DE LABORATRIO 2 Alm da apresentao e discusso dos dados obtidos no laboratrio, o relatrio deve incluir a

cromatografia em papel anexada e a identificao do aminocido desconhecido. Alm disso, deve conter as seguintes questes respondidas. 1. Esquematize o grfico de titulao de 100 mL de 0,1 M de glicina, pH 1,72 com NaOH 2 M. Faa pH em funo de equivalentes de OH- e de volume de soluo de NaOH 2 M. 2. Quais so as concentraes das vrias espcies inicas de lisina a pHs 4, 8 e 10 (0,1 M)? 3. Deduza a equao que relaciona pI e pKs para um aminocido monoamino e monocarboxlico. Utilize a equao de Henderson-Hasselbalch. 4. Analise a tabela de RF dos aminocidos mostrado na apostila. Procure explicar as razes da ordenao dos aminocidos seguindo os valores crescentes de RF. De que depende RF? 5. D exemplos de outros tipos de cromatografia e suas aplicaes.

89

LABORATRIO 3: CINTICA ENZIMTICA

I.

FUNDAMENTOS A Cintica Enzimtica estuda os mecanismos de reaes qumicas catalisadas por enzimas.

H na estrutura da enzima, uma determinada regio diretamente responsvel pela ao cataltica. Essa regio denominada stio ativo e a sua conformao correta fundamental para a atividade enzimtica. Ali se localizam diversos resduos de aminocidos que podem desempenhar funes de orientao do substrato e de direta interao com este, permitindo que a reao ocorra. Em 1913, L. Michaelis e M. L. Menten, desenvolveram estudos considerando as principais propriedades das enzimas e aplicando as teorias conhecidas de Cintica Qumica para um modelo simplificado, o qual envolvia a enzima livre (E), o substrato (S), o complexo enzima-substrato (ES) e o produto (P). Esse modelo pode ser expresso pela equao qumica:

E + S

k1 k-1

ES

k2

E + P

Michaelis e Menten, com essas consideraes, desenvolveram a expresso de velocidade para uma reao catalisada enzimaticamente, onde V funo de [S] e Vmax e Km so constantes (figura 1):

Vmx . [S] v = Km + [S]

Na figura 2 est apresentada a curva de velocidade inicial de reao em funo da concentrao de substrato para uma enzima que siga o modelo proposto por Michaelis e Menten. Essa enzima dita de caractersticas michaelianas e obedece expresso de velocidade apresentada acima.

90

Figura 1 - Deduo da equao de Michaelis-Menten.

91

Vmx

Vel. Inicial Reaomol / min.l) (

Vmx / 2

Km

Concentrao de Substrato (M)

Figura 2 Velocidade de reao em funo da concentrao de substrato para uma enzima michaeliana.

Nesta curva pode-se facilmente identificar o efeito de saturao do substrato. Nestas circunstncias, o sistema tende a adquirir velocidade de reao mxima (Vmx), grandeza que funo da concentrao inicial da enzima livre (E). Podemos tambm definir uma concentrao de substrato na qual se obtm metade de Vmx. Esse valor de [S] numericamente igual ao Km, parmetro que dentro de certos limites mede a afinidade da enzima pelo substrato. O mtodo mais preciso para determinao grfica dessas grandezas num experimento de Cintica Enzimtica atravs do grfico de duplo-recproco ou de Lineweaver-Burk. Para tanto se deve plotar 1/V em funo de 1/[S]. A enzima escolhida para este estudo a invertase de levedura que catalisa a hidrlise da sacarose para produzir glicose e frutose:

C12H22O11 + H 2O
Sacarose

C 6H12O6 + C 6H12O6
Glicose Frutose

A determinao da velocidade da reao (ou da atividade enzimtica) pode ser feita atravs da dosagem dos acares redutores formados (frutose e glicose). A dosagem baseia-se na reao entre o cido 3,5-dinitro-saliclico (DNS) e os acares redutores. Estes monossacardeos reduzem o DNS fornecendo um produto de cor caracterstica, cuja formao pode ser acompanhada a 540 nm. Conhecendo-se por colorimetria a quantidade (mols) de acares redutores formada, por um clculo estequiomtrico simples, pode-se determinar a quantidade correspondente (mols) de sacarose hidrolisada. Nestas experincias as velocidades da reao sero expressas em mols de sacarose hidrolisada por minuto. Para estudos de velocidade, o tempo de reao deve ser medido com a maior exatido possvel. Para isso, o grupo dever organizar-se de maneira a no permitir que a reao se inicie em tempos diferentes nos vrios tubos. Para tal, importante manter os tubos em gelo durante a adio dos reagentes. Esses devem ser adicionados na ordem em que aparecem nos protocolos,

92

com a enzima sendo adicionada por ltimo. Leva-se ento os tubos, todos juntos, ao banho a 37C para reagir. Transcorrido o tempo determinado, os tubos devem voltar, todos juntos e simultaneamente, para o gelo. Neste ponto a reao pra. A atividade enzimtica medida em unidade (U), sendo que 1 U a quantidade de enzima necessria para a formao de 1 mol de produto por minuto.

II.

OBJETIVOS Estudar as influncias das concentraes de enzima e substrato nas velocidades de uma reao enzimtica, examinar as curvas obtidas experimentalmente, calcular os parmetros cinticos e discutir seus valores e importncia.

III.

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL Construo da curva padro Adicionar a seis tubos (180 X 20 mm) com volumes crescentes de soluo padro redutora

1)

(glicose 6 mM + frutose 6 mM), conforme indicado na tabela 1. Complete o volume em cada tubo para 2,0 mL com tampo. Adicionar em seguida 2 mL do reagente DNS. As quantidades esto indicadas na tabela 1.
Tabela 1 Curva padro da soluo redutora.

tubos branco 1 2 3 4 5

soluo padro redutora (mL)

soluo tampo (mL)

reagente DNS (mL)

absorbncia (540 nm)

sacarose hidrolisada(mols)

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0

2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

0,000

0,00

Anotar aqui a concentrao da soluo padro: ________ Aps a adio do DNS (cido 3,5-dinitro-saliclico), colocar os tubos em banho-maria fervente por 10 min. Aps este tempo, esfriar em gua corrente e adicionar 16 mL de gua destilada. Agitar com inverso da posio na vertical (3x). Ler as absorbncias a 540 nm contra o branco. Construir o grfico absorbncia versus concentrao de sacarose hidrolisada. Este grfico ser a curva padro.

93

2.

Efeito da concentrao da enzima Numerar sete tubos de ensaio (180 X 20 mm) e adicionar os reagentes conforme tabela 2.

Manter todos os tubos no gelo.

Tabela 2 Estudo da concentrao de enzima x velocidade de reao.

sacarose tubos 5% em tampo (mL) branco 1 2 3 4 5 6

tampo pH 4,77 (mL)

soluo enzima (mL)

Concentrao enzima (M)

sacarose Abs. 540 nm hidrolisada por min. (mol/min)

1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

1,0 0,9 0,7 0,5 0,3 0,1 -

0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 1,0

0,00

0,000

0,00

Aps a adio da enzima, agitar suavemente. Retirar os tubos do gelo e coloc-los imediatamente (e simultaneamente) em banho-maria a 37C por 5 min. Transcorrido este tempo, os tubos devem retornar imediatamente para o gelo. Assume-se que nesse instante a reao para. Ainda no gelo, adicionar a cada tubo 2 mL de DNS. Na presena de DNS, devido alcalinidade do reagente, a enzima para de funcionar. Transferir os tubos para banho-maria fervente e esperar 10 min. Findo este tempo, esfriar em gua corrente e adicionar 16 mL de gua destilada em cada tubo. Agitar com inverso da posio na vertical (3x). Ler as absorbncias a 540 nm. Fazer o grfico colocando a concentrao da enzima (M) nas abscissas e a velocidade de hidrlise expressa em mols de sacarose hidrolisada por minuto nas ordenadas. Durante a aula de laboratrio ser fornecido o valor da concentrao da enzima na soluo estoque.

94

3. Efeito da concentrao de substrato Numerar sete tubos de ensaio (180 X 20 mm) e adicionar os reagentes segundo a tabela 3. Manter todos os tubos no gelo.
Tabela 3 Estudo da concentrao de substrato x velocidade de reao.

sacarose tubos 5% em tampo (mL) branco 1 2 3 4 5 6

tampo pH 4,77 (mL)

soluo enzima (mL)

concentrao sacarose (M)

sacarose Abs. 540 nm hidrolisada por min. (mol/min)

1,0 0,05 0,1 0,3 0,5 0,7 1,0

1,0 1,45 1,4 1,2 1,0 0,8 0,5

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

0,000

0,00

Proceder exatamente como no caso do estudo da concentrao da enzima (item anterior). Aps a adio da enzima, agitar suavemente. Retirar os tubos do gelo e coloc-los imediatamente (e simultaneamente) em banho-maria a 37C por 5 min. Transcorrido este tempo, os tubos devem retornar imediatamente para o gelo. Assume-se que nesse instante a reao para. Ainda no gelo, adicionar a cada tubo 2 mL de DNS. Na presena de DNS, devido alcalinidade do reagente, a enzima (valor elevado de pH) pra de funcionar. Transferir os tubos para banho-maria fervente e esperar 10 min. Findo este tempo, esfriar em gua corrente e adicionar 16 mL de gua destilada em cada tubo. Agitar com inverso da posio na vertical (3x). Ler as absorbncias a 540nm. Fazer um grfico da velocidade versus concentrao inicial do substrato. Estimar os valores de Vmx e Km. Fazer o grfico de Lineweaver-Burk e calcular os valores de Vmx e Km. Comparar o valor de Km com o encontrado na literatura cientfica.

95

IV.

RELATRIO DE LABORATRIO 3 Alm da apresentao e discusso dos dados obtidos no laboratrio, as seguintes questes

devem estar respondidas no relatrio. 1. Qual o substrato utilizado nesta prtica? Qual a reao catalisada pela enzima a partir deste substrato? Qual(is) o(s) produto(s) da reao catalisada pela enzima a partir deste substrato? 2. Foi utilizado algum tubo controle? Qual a funo de um tubo controle? D exemplos. 3. Por que os tubos devem ser mantidos em banho de gelo? E porque os tubos devem ser transferidos ao mesmo tempo para o banho a 30C? 4. Por que a leitura da absorbncia feita a 540 nm? 5. Discutir as curvas obtidas para o efeito da concentrao da enzima e do substrato e elaborar um protocolo para estudar o efeito do pH sobre a atividade. 6. No item 2 do protocolo dito que, devido alcalinidade do reagente DNS, sua adio faz a reao parar (enzima perde atividade). Justifique essa afirmao. 7. Como se pode dosar uma enzima? Em que a dosagem de uma enzima difere da dosagem de uma substncia qualquer? Como determinar a atividade enzimtica (U) de uma enzima? 8. Sabe-se que para [E] = x, tem-se Vmx = 1 U, o que ocorrer com Vmx se [E] = 2x? Qual ser o valor de Km? 9. Definir Ki. O que o valor de Ki indica? Como se determina o Ki graficamente? Descreva um experimento simples que ajude a definir se uma substncia um inibidor competitivo ou nocompetitivo. 10. O que atividade especfica de uma enzima? Como se calcula a atividade especfica? 11. Uma soluo da enzima hexoquinase (atuante na via glicoltica), de caractersticas michaelianas, possui um valor de Km igual a 0,15 mM para a glicose e 1,5 mM para a frutose. A velocidade mxima da reao (Vmx) neste sistema a mesma para os dois substratos e igual a 50 mmols substrato.(min.L)-1. Plote os dois casos num mesmo grfico de velocidade reao em funo da concentrao de substrato. Faa tambm o grfico de duplo recproco de Lineweaver-Burk contendo os dois substratos. Comente as diferenas observadas entre os dois substratos nas duas curvas. 12. Uma soluo comercial de xantina oxidase (enzima que participa do metabolismo de purinas) possui, em seu rtulo, as seguintes informaes: Dosagem de protena: 2,4 mg/mL Atividade enzimtica : 150 U/mg protena De acordo com o protocolo do ensaio enzimtico, so necessrios 10 mL de uma soluo de xantina oxidase com atividade de 0,2 U/mL. Assim sendo, pergunta-se: a.) Como preparar esta soluo? b.) Se a minha concentrao de substrato (xantina) for 0,6 mM, quantos mols de xantina devem restar em soluo aps 10 min?

96

LABORATRIO 4: PURIFICAO DE PROTENAS SDS-PAGE E PONTO ISOELTRICO (pI)

I.

FUNDAMENTOS Mtodos de Purificao de Protenas possvel purificar e isolar protenas utilizando-se princpios fsico-qumicos, que levam em

conta as propriedades caractersticas dessas biomolculas. Uma dessas caractersticas est baseada na solubilidade das diferentes cadeias laterais dos aminocidos, que dependem da concentrao de sais dissolvidos no solvente (fora inica da soluo), da polaridade do solvente (constante dieltrica desse solvente), do pH do meio (ponto isoeltrico da protena) e da temperatura. Em uma soluo aquosa de baixa fora inica, a solubilidade de uma protena, em geral, aumenta com a concentrao salina. Esse fenmeno conhecido como salting in. Em solues com alta fora inica, entretanto, a solubilidade de uma protena em geral decresce, fenmeno que resulta da competio entre os ons salinos adicionados e o soluto (protena), diminuindo a capacidade de solvatao do solvente aquoso. Esse fenmeno conhecido como salting out, constituindo uma das tcnicas mais utilizadas para a purificao de protenas. Sulfato de Amnio [(NH4)2SO4] o sal mais utilizado para salting out, uma vez que sua solubilidade alta (3,9 M a 0C), permitindo gerar solues aquosas de alta fora inica. Protenas em geral possuem uma grande variedade de aminocidos com grupamentos ionizveis com diferentes pKs. A um pH caracterstico para cada protena, as cargas positivas da molcula so balanceadas pelas cargas negativas, conferindo protena carga total zero. Neste pH, denominado ponto isoeltrico (pI), a molcula torna-se imvel em presena de um campo eltrico. Como pode ser visto na figura 1, a solubilidade da lactoglobulina pode variar com a concentrao salina (NaCl). No entanto, em qualquer caso, ao se ajustar o pH para valores prximos ao pI da protena, ocorre uma solubilizao mnima e a maior frao de protenas ficar insolvel. Em muitas situaes, pode-se utilizar os conceitos de salting out e de precipitao no pI para purificar uma protena especfica.

97

Solubilidade mg/mL

pH

Figura 1 Solubilidade da lactoglobulina em funo do pH em diferentes concentraes de NaCl.

Eletroforese e Separao de Protenas Totais (SDS-PAGE) A separao de macromolculas (protenas, DNA e RNA) pode ser feita aplicando-se um campo eltrico numa matriz slida, como um gel ou papel, que contem a mistura de interesse. Esse mtodo, amplamente utilizado, denomina-se eletroforese e baseia-se na migrao das molculas em relao a um campo eltrico, devido sua carga. Normalmente se utiliza um gel, devido a supresso das correntes de conveno produzidas por pequenos gradientes de temperatura e tambm porque o gel funciona como uma peneira molecular, permitindo a separao das macromolculas por peso molecular. O gel de eletroforese constitudo de um polmero de acrilamida cuja estrutura est demonstrada na Figura 2. Esta polimerizao ocorre na presena de radicais livres, os quais so gerados por persulfato de amnio e estabilizados por TEMED (N,N,N,N-tetrametilenenodiamino). A polimerizao tambm depende da presena de um agente, o NNmetileno-bis-acrilamida, que facilita a ligao das cadeiras entre si, formando um gel cuja porosidade determinada pelo comprimento das cadeias e pelo grau de interligao entre estas.

98

Figura 2 Esquerda: ao de peneiramento de um gel poroso de acrilamida. Direita: formao de um gel de poliacrilamida. O tamanho do poro pode ser controlado pelo ajuste da concentrao do monmero ativado (acrilamida, em azul) e do interligante (bis-acrilamida, em vermelho).

A separao de protenas ocorre em condies desnaturantes. A mistura de protenas e dissolvida em tampo de amostra. Este tampo de amostra contm SDS (dodecil sulfato de sdio), que um detergente aninico que acaba rompendo as ligaes no covalentes existentes na protena nativa resultando na sua desnaturao. Neste tampo tambm temos -mercaptoetanol que reduz as pontes de dissulfeto existentes na protena.

II.

OBJETIVOS 1) Precipitar as protenas totais de uma soluo de leite em p, utilizando os conceitos de precipitao no pI. 2) Utilizar eletroforese em gel de poliacrilamida/SDS (SDS-PAGE) para separar as protenas de diferentes amostras e estimar sua concentrao.

III. 1)

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL Precipitao no pI Preparar uma srie de tubos de ensaio de acordo com a tabela 1

99

Tabela 1 Preparao dos tubos em diferentes pHs.

Tubo

cido Actico 0,1 mM cido Actico 1,0 mM cido Actico 50 mM cido Actico 1,0 M cido Actico 2,0 M PH Turvao (sim / no)

1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL 6,7 5,7 4,7 3,7 2,7

Adicionar, a cada um dos tubos, uma alquota (5,0 mL) de soluo de leite em p desnatado (5%, previamente centrifugado). Agitar os tubos e aguardar 5 minutos Separar alquotas de 1,0 mL, distribuir em tubos plsticos pequenos e centrifugar (5000 rpm, 5 minutos, temperatura ambiente). Descartar a fase sobrenadante e ressuspender o precipitado em NaOH 0,1M (1,0 mL) (Observao: utilizar o mesmo procedimento mesmo para os tubos que aparentemente no apresentam precipitado) Aps a dissoluo total do precipitado, separar uma alquota da soluo obtida (10,0 L) para SDS-PAGE.

2.

Eletroforese em gel de poliacrilamida/SDS (SDS-PAGE) Para este experimento, sero utilizadas como amostras: alquotas de protenas purificadas anteriormente, a partir de uma soluo de leite em p (5%) (amostras 1 a 5) a soluo contendo o extrato bruto de protenas totais de leite em p (5,0 L) para comparao (amostra 6) Soro bovino diludo a 10% (10,0 L) para comparao (amostra 7) Albumina bovina a 4,0 mg/mL (5,0 L) (padro de peso molecular: 66,0 KDa) Montar o aparato para eletroforese conforme figura 3 (o gel de eletroforese ser preparado

previamente de acordo com o apndice 1), adicionar na cuba o tampo de corrida at cobrir os poos do gel para eletroforese.

100

Adicionar tampo de amostra (10 L) a cada uma das amostras, e aquecer (2 minutos, 100C) para desnaturar as protenas. Resfriar (gelo) e aplicar 15 L nos poos do gel para eletroforese seguindo a ordem da tabela 2.
Tabela 2 Adio das amostras ao SDS-PAGE

poo n Amostra

padro

amostra 1 amostra 2 amostra 3 amostra 4 amostra 5 amostra 6 amostra 7

Aplicar a tenso nos eletrodos do aparato de eletroforese (150 V) e aguardar (30 minutos) at que o corante marcador (Azul de Bromofenol) se aproxime da base do gel Interromper a eletroforese e mergulhar o gel em uma soluo de colorao: Coomassie Blue R (0,25g) em metanol : cido actico : gua (45% : 10% : 45%). Aguardar (5-10 minutos) Substituir a soluo de colorao pela soluo de descolorao: metanol : cido actico : gua (45% : 10%: 45%) (15 minutos) Verificar as protenas coradas, e estimar por comparao, a purificao da amostra.

IV.

RELATRIO DE LABORATRIO 4 Alm da apresentao e discusso dos dados obtidos no laboratrio, as seguintes questes

devem estar respondidas no relatrio: 1. No primeiro experimento, em que condies a maior precipitao de protenas ocorreu? A que pH corresponde? 2. possvel estimar o peso molecular da protena majoritria precipitada a partir da soluo de

leite em p? Compare com a frao total de leite em p utilizada para fazer a eletroforese. Houve eficincia na separao dessa protena? 3. A tabela abaixo mostra valores de pI para diferentes protenas, com seus respectivos valores de

peso molecular (em kDa). Observe a banda de protena purificada corada no gel de poliacrilamida e a posio relativa ao padro de albumina bovina adicionado.

101

Protena

pI

Peso Molecular (kDa)

Casena Insulina Colgeno Hemoglobina Citocromo c Histona

de leite em p? 4.

4,7 5,4 6,6 7,1 10,6 10,8

20,0-23,0 6,0 130,0 64,5 13,0 12,0 a 20,0

De acordo com os valores de pI e de peso molecular, qual seria a protena purificada da soluo

Se houvesse contaminao da soluo de leite em p com albumina bovina, esse mtodo de

purificao seria eficiente? Como a albumina bovina poderia ser detectada? E se houvesse contaminao do leite em p com hemoglobina, esse mtodo de purificao seria eficiente? Consulte os dados de pI e justifique sua resposta. 5. O que eletroforese? Qual a funo do gel de empilhamento? E do gel de separao (ou de resoluo)? Observe os diferentes pHs das solues B e C (vide Apndice) utilizadas para fazer os gis de resoluo e de empilhamento, respectivamente. Por que o gel de empilhamento e o gel de resoluo possuem pHs diferentes? Porque h SDS no gel? 6. Conforme a figura abaixo, uma mistura de trs protenas cujos valores de pI so 4,0; 7,0 e 11,0 foi submetida a eletroforese. Usando-se tampes de valores de pH = 4,0; 7,0 e 11,0 esquematizar as posies relativas das trs protenas em cada tampo. Protenas de mesma carga correriam a mesma distncia numa eletroforese? Existe alguma possibilidade de se separar protenas diferentes s que de cargas iguais?

Equipamento para eletroforese em papel.

102

7. A mobilidade eletrofortica em pH = 8,6 de uma protena normal e de anlogas anormais (que tem um aminocido mutado) est representada abaixo. Identifique a que posio corresponde cada uma das protenas e diga o porqu. ProS substituio de glutamato por valina ProJ substituio de glicina por aspartato ProN substituio de lisina por glutamato ProC substituio de glutamato por lisina A (-) B Normal C D (+)

8. Uma protena com 40 kDa e outra com 90 kDa foram utilizadas como padro num gel de poliacrilamida com SDS. A motilidade relativa foi de 0,92 e 0,54 respectivamente. Qual seria a massa aparente de uma protena neste gel, com motilidade de 0,72. 9. Apesar de uma cromatografia em coluna de gel filtrao e uma eletroforese gel de poliacrilamida usarem princpios fsicos semelhantes, porque ao separamos uma protena de 40 kDa e outra de 15 kDa a de maior peso a primeira a ser eluda da cromatografia e a de menor peso a que mais se move na eletroforese do gel. Em que situaes voc usaria a cromatografia? E a eletroforese?

103

V.

APNDICE Preparao do gel de acrilamida / SDS Inicialmente montam-se as placas de vidro com os espaadores posicionados. Vedar o

espao entre as placas com agarose (1% aquecida em ebulio). Aguardar resfriamento. PRECAUES: Acrilamida neurotxica quando no polimerizada. Utilize sempre luvas descartveis para manipular solues contendo acrilamida. Evite inalar TEMED (mesmo diludo, pode ser txico) e butanol. Preparar a soluo para o gel de resoluo (de corrida): gua destilada (3,7 mL) soluo A (1,8 mL) soluo B (1,9 mL) APS (Persulfato de Amnio) (0,12 mL) (soluo a 10%) TEMED (0,45 mL) (diludo 40 vezes)

OBS: Adicionar o TEMED por ltimo, pois ele o agente polimerizante deste gel. Utilizar a soluo imediatamente aps o preparo (aplicando-a no espao entre as placas de vidro com uma pipeta. Sero necessrios aproximadamente 4,0 mL de soluo. Aguardar a polimerizao do gel (5 minutos). Ser necessrio deixar aproximadamente 1,0 cm de espao para aplicar o gel de empilhamento OBS: A soluo comea a polimerizar muito rapidamente, necessrio ateno e rapidez para aplicar a soluo no aparato de eletroforese. Preparar a soluo para o gel de empilhamento: gua destilada (1,66 mL) Soluo A (0,3 mL) Soluo C (0,75 mL) APS (Persulfato de Amnio) (0,05 mL) (soluo a 10%) TEMED (0,24 mL) (diludo 40 vezes)

OBS: Adicionar o TEMED por ltimo, pois ele o agente polimerizante deste gel. Utilizar a soluo imediatamente aps o preparo, aplicando-a sobre o gel de resoluo (deve preencher um espao de cerca de 1 cm de altura). Colocar um pente plstico para formar os poos onde as amostras sero aplicadas (de acordo com a demonstrao). Sero necessrios aproximadamente 1,60 mL de soluo. Aguardar a polimerizao do gel (15 minutos)

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OBS: A soluo comea a polimerizar muito rapidamente, necessrio ateno e rapidez para aplicar a soluo no aparato de eletroforese. Solues utilizadas Soluo A: Acrilamida e bis-acrilamida 45 g acrilamida 1,2 g bis-acrilamida gua destilada (at 100 mL) Soluo B: Tris-HCl pH 8,8 18,17 g Tris (em 50 mL de gua destilada) Ajustar o pH para 8,8 (com HCl) Adicionar SDS (4,0 mL, soluo a 10%) Completar o volume com gua destilada (at 100 mL) Soluo C: Tris-HCl pH 6,8 6,06 g Tris (em 50 mL de gua destilada) Ajustar o pH para 6,8 (com HCl) Completar o volume com gua destilada (at 100 mL) Tampo de corrida: 3,0 g de Tris, 14,4 g de Glicina e 10, 0mL de SDS (10%) Ajustar o volume de gua destilada para 1000 mL Tampo de amostra: SDS 10% (5,0 mL), 2-mercaptoetanol (0,5 mL), Glicerol (2,0 mL), EDTA 0,1M (0,1 mL), Azul de Bromofenol 1% (1,0 mL), Soluo C (2,5 mL) e gua destilada (at 20,0 mL).

105

Figura 3 Esquema do aparato para eletroforese.

106

LABORATRIO 5: REAO DE TRANSAMINAO

I.

FUNDAMENTOS Enzimas transaminases ou aminotransferases so importantes no metabolismo de

aminocidos, pois transferem o grupo NH3+ de um aminocido para um cetocido. Foram identificadas mais de 50 tipos de transaminases, presentes em todos os tipos de clulas e sendo encontradas tanto no citossol como em mitocndrias de clulas eucariticas. O grupo NH3+ de todos os aminocidos (com exceo de Lys, Arg e Thr) podem ser removidos por transaminases em diferentes organismos. As transaminases possuem especificidade diferenciada: relativamente especfica para o cetocido aceptor do grupo NH3+ e, numa menor intensidade, para o aminocido doador. A coenzima PLP (piridoxal-fosfato) essencial para as transaminaes e vrias outras enzimas envolvidas no catabolismo de aminocidos (figura 1). PLP derivada da vitamina B6, hidrossolvel, o piridoxal. A figura 2 mostra como os processos catablicos dos diversos aminocidos colaboram com o eficiente funcionamento do ciclo de Krebs pelo fornecimento de intermedirios desse ciclo. O cido glutmico (Glu), produzido em diversas transaminaes, pode tanto sofrer desaminao oxidativa, produzindo o - cetoglutarato e o on NH4+, que ser utilizado no ciclo da uria, como doar o grupo NH3+ para a biossntese de outros aminocidos. O Glu o principal doador de grupos NH3+ nesta funo. A figura 3 ilustra esses processos metablicos.

107

NH3+ R C H AMINOCIDO COOR

O C COO -CETOCIDO

O C HO H3C + N H

H CH2 O P HO H3C

NH3 CH2 CH2 + N H Piridoxamino-fosfato O P

Piridoxal-fosfato

O NH3+ -OOC -OOC CH2 CH2 C H COOCH2 CH2 C COO-

GLUTAMATO

-CETOGLUTARATO

Figura 1 - Reao de transaminao, mostrando a dependncia pela coenzima PLP no processo de transferncia dos grupos amino entre aminocidos e cetocidos.

Figura 2 - Os processos catablicos dos diversos aminocidos colaboram com o eficiente funcionamento do ciclo de Krebs pelo fornecimento de intermedirios desse ciclo.

108

Figura 3 Formao de -cetoglutarato e uria a partir de glutamato.

II.

OBJETIVOS

Estudar as reaes de transaminases e identificar os produtos e reagentes atravs da cromatografia em papel.

III. 1)

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL Preparao do homogeneizado de fgado

Essa etapa ser realizada previamente. Fgados de camundongos (5 a 7 animais) ou de galinha foram extrados e lavados com PBS (tampo fosfato: 0,05M, pH 7,4), picados e macerados para homogeneizao com PBS (at 10,0 mL de volume final). O homogeneizado foi centrifugado (800 g, 15 minutos) para eliminar clulas remanescentes, ncleos e debris celulares. O sobrenadante foi aliquotado para utilizao em sala de aula, mantido em gelo e em seguida mantido congelado (20C) at sua utilizao.

2)

Preparao da mistura reacional O sistema completo da reao composto por um aminocido, um cetocido, o preparado

enzimtico, arsenito de sdio e o tampo. O arsenito de sdio empregado com a finalidade de evitar a oxidao dos cetocidos pelo sistema enzimtico. Montar a seguinte reao: 0,3 mL de soluo de cetoglutarato 0,2M pH 7,4 0,3 mL de soluo de Alanina a 0,2M pH 7,4 0,3 mL de preparao enzimtica 0,5 mL de tampo fosfato 0,05M pH7,4 0,4 mL de soluo de arsenito de sdio 0,2M

109

E tambm um controle negativo (branco) contendo todos os componentes exceto a preparao enzimtica, que substituda por tampo: 0,3 mL de soluo de cetoglutarato 0,2M pH 7,4 0,3 mL de soluo de Alanina a 0,2M pH 7,4 0,8 mL de tampo fosfato 0,05M pH7,4 0,4 mL de soluo de arsenito de sdio 0,2M

Incubar os dois tubos (reao e controle negativo) a 37C por 30 minutos. Em seguida, inativar a reao em banho-maria fervente por 3 minutos. Centrifugar a 5000 rpm, 10 minutos (centrfuga Eppendorf). Decantar o sobrenadante transferindo para um segundo tubo Eppendorf e fazer a cromatografia com os padres adequados. 3. Cromatografia Em um papel de filtro Whatman nmero 1 (10 cm X 20 cm) traar com um lpis uma linha horizontal de 2,5 cm de altura a partir da origem (ponto de contato do papel com a soluo na cuba de cromatografia). Marcar 7 pontos com 2,5 cm de distncia entre si. Aplicar, com um capilar de vidro fino, sobre os pontos marcados, uma pequena alquota dos padres de alanina, glutamato, piruvato, e -cetoglutarato, a mistura de reao, o branco (controle negativo) e 2,4-dinitrofenil-hidrazina. Sobre os pontos onde foram aplicados os padres e as amostras, adicionar 3 uL de 2,4-dinitrofenil-hidrazina. O solvente utilizado para a cromatografia ser uma mistura de butanol/etanol/NH4OH 0,5 M na proporo 70:20:30 (v/v). Aps o solvente alcanar 1 cm do final do papel, secar o papel a 80C em estufa e marcar os produtos coloridos formados. Revelar os aminocidos do cromatograma com a soluo de ninhidrina, secando em seguida o papel. Marcar a posio das manchas que aparecerem.

IV.

RELATRIO DE LABORATRIO 5 O relatrio deve conter os resultados do procedimento experimental, com possveis

explicaes de erro experimental como tambm as seguintes questes resolvidas: 1. Explique, resumidamente, como a escolha do tipo de eluente (solvente de corrida) e do papel pode afetar a eficincia da separao de componentes pela tcnica de cromatografia em papel. 2. Procure nos livros a reao que ocorre entre a ninhidrina e os aminocidos e tambm qual a

reao de transaminao que ocorreu em seu experimento. 3. Dopamina uma amina biognica usada como neurotransmissor no crebro.

110

a) b) c) d) e)

Explique a reao geral que leva a formao de aminas biognicas a partir de aminocidos. De qual aminocido a dopamina pode ser sintetizada? Explique. Explique a sntese do aminocido que origina a dopamina. Crie uma hiptese de um defeito gentico que torne este aminocido em aminocido essencial. Imagine um possvel tratamento para a deficincia de dopamina na doena de Parkinson (note

que a dopamina por si s no pode ser usada, pois no passa pela barreira hematoenceflica e deste modo no pode chegar ao crebro). 4. a) b) c) Glutamato o principal neurotransmissor excitatrio no crebro. Explique como glutamato age como neurotransmissor (transmitindo um sinal qumico que se Explique como glutamato pode ser removido da fenda sinptica, mencionando o tipo de A phoneutriatoxina 3-4 do veneno da aranha Phoneutria niger inibe o transporte de glutamato

torna eltrico). transporte (ativo ou passivo). da fenda sinptica para o citoplasma do neurnio pre-sinptico. Explique quais so os efeitos da inibio do transporte de glutamato sobre a neurotransmisso. Sugira um tratamento. d) e) 5. Mencione as reaes que inativam o glutamato. Qual neurotransmissor inibitrio que sintetizado a partir do glutamato? Explique a reao. Fenilcetonria (PKU) uma doena gentica do metabolismo de aminocidos. Uma criana de

dois anos de idade foi levada ao hospital. Sua me indicou que ela vomitava freqentemente, especialmente aps as refeies. O peso da criana e o seu desenvolvimento fsico eram abaixo do normal. Seus cabelos, embora escuros, continham pores de cabelos brancos. Uma amostra de urina tratada com cloreto frrico (FeCl3) apresentou uma cor verde caracterstica da presena do cido fenilpirvico. A anlise quantitativa de amostras de urina apresentou os resultados mostrados na tabela abaixo. Substncia Fenilalanina Fenilpiruvato Fenilactato a) b) c) d) 6. Paciente (mmol/L) 7,0 4,8 10,3 Normal (mmol/L) 0,01 0 0

Sugira que enzima possa estar deficiente. Proponha um tratamento para esta condio. Por que a fenilalanina aparece na urina em grandes quantidades? Qual a fonte do fenilpiruvato e do fenilactato? Por que o cabelo da paciente apresentou pores brancas? Intoxicao de amnia resultante da deficincia de arginina da dieta (Morris e Roger, Science

199, 431, 1978).

111

Gatos, depois de jejum por uma noite, receberam uma nica refeio de uma dieta de aminocidos completa sem arginina. Dentro de duas horas, os nveis de amnia sanguneos aumentaram de nvel normal de 18 mg/l para 140 mg/l e os gatos apresentaram sintomas clnicos de intoxicao pela amnia. Um gato morreu 4,5 horas depois de ingerir apenas 8 g da dieta. Um grupo controle alimentado com a dieta completa de aminocidos ou com uma dieta de aminocidos ou com uma dieta de aminocidos onde arginina foi substituda pela ornitina no apresentou nenhum sintoma clnico anormal. a) b) c) Qual era o papel do jejum neste experimento? O que induziu o aumento dos nveis de amnia? Por que a ausncia de arginina levou Por que a ornitina pode substituir a arginina?

intoxicao por amnia? A arginina um aminocido essencial para gatos?

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