I.

TUJUAN 1. Mahasiswa elektroforesis 2. Mahasiswa elektroforesis dapat melaksanakan pemisahan dengan metode memahami prinsip pemisahan dengan metode

II.

DASAR TEORI Molekul dalam larutan sering berupa partikel bermuatan. Apabila medan listrik diberikan pada larutan tersebut maka setiap ion bergerak menuju elektroda yang berlawanan muatannya. Ini yang mendasari konsep dasar elektroforesis (Hendayana, 2006). Elektroforesis adalah metode pemisahan, didasari atas kemampuan sampel yang bermuatan untuk melewati medium konduktor didalam larutan penyangga. sampel yang bermuatan positif menuju katoda dan sampel yang bermuatan negatif menuju anoda. Kecepatan sampel menuju katoda/anoda dipengaruhi oleh muatan yang dimiliki sampel dan ukuran sampel. Sampel yang memiliki muatan yang besar dan memiliki ukuran yang kecil akan berpindah menuju katoda/anoda lebih cepat (Harvey, 2000). Media tempat pemisahan yang digunakan masing-masing ujungnya tercelup dalam larutan buffer. sampel diteteskan pada bagian tengah media tersebut. Salah satu larutan buffer dihubungkan melalui elektroda negatif arus searah dan larutan buffer lainnya dihubungkan melalui elektroda positif arus searah. Hasil ditunjukkan dengan adanya noda berwarna di media pemisah. (Hendayana, 2006). Perpindahan sampel di media tergantung tanda dan besarnya muatan pada zat terlarut, permukaan, muatan, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kuat ion, pH, temperatur, viskositas, adsorptivitas zat terlarut. Lintasan yang ditempuh partikel bermuatan sesuai dengan:

U .t.e U t .V q.k L

Keterangan : V = Tegangan L = Panjang saluran K = Konduktivitas I = Arus listrik U = Mobilitas ion pada saat t Q = Luas penampang d = Lintas yang ditempuh Elektroforesis mudah dilakukan namun hasil pemisahan sering tidak memuaskan, noda sering tumpang tindih sehingga susah dibedakan, tidak dapat mendeteksi konsentrasi cuplikan yang rendah dan waktu yang dibutuhkan untuk melakukan satu analisis terlalu lama. Untuk

mempercepat dapat dilakukan dengan menambah tegangan listrik arus searah namun hasilnya tetap kurang efisien. Hal ini disebabkan tegangan listrik yang tinggi dapat menimbulkan panas sehingga menurunkan efisiensi pemisahan Sifat aliran pada elektroforesis ada 2. Aliran elektroforetik yaitu, sifat alamiah ion-ion selalu bergerak menuju kutub listrik yang berlawanan. Aliran elektroosmotik yaitu terjadi apabila arus listrik searah bertegangan tinggi dialirkan diantara ujung-ujung pipa kapiler sehingga anion yang melapisi permukaan pipa kapiler tersebut akan bergerak menuju anaoda (Hendayana, 2006). DNA yang telah dipisahkan diwarnai dengan ethidium bromida. Larutan ini mengandung planar yang dapat meresap pada setiap DNA sehingga DNA dapat berwarna merah-orange jika diamati dengan UV254 (Sambrook, 1990).

III.

ALAT DAN BAHAN 1. Alat : Stirer Bar UV transluminator Cetakan Comb Shaker

- Elektroforesis set - Pipet mikro 200 l dan 20 l - Chamber - Mikrowave - Tips (kuning dan kristal) - Magnetic Stirer

2.

Bahan : Loading buffer Sampel DNA EtBr Aquades

- Agarose 1,2 % - TAE (Trisacetic Edta) - Marker DNA Leader 1001500 bp

IV.

PROSEDUR KERJA a. Pembuatan Gel : Agarose gel dipanaskan dengan mikrowave sampai cair.

Diletakkan pada magnetic stirer hingga mencapai suhu sekitar 50oC

Agarose yang telah cair dituang ke dalam cetakan yang telah berisi comb.

Didiamkan hingga dingin dan memadat.

Ditambahkan TAE.

Comb diangkat sehingga terbentuk sumur pada gel.

Gel dipindahkan ke elektroforesis set.

b.

Elektroforesis Gel dicuci dengan pipet 200 l.

Dibuat campuran sampel yang terdiri dari 1 l loading buffer dan 5 l sampel DNA.

Sampel dimasukkan ke dalam sumur gel dengan pipet 20 l.

Run selama 30 menit (110 volt). Dimasukkan pada larutan EtBr 10 L/100 mL aquadest kemudian dihaker selama 25 menit

Dicuci di aquades.

Divisualisasi pada UV transluminator.

Hasil elektroforesis difoto.

V.

PEMBAHASAN Elektroforesis Gel adalah metode analisis berdasarkan kemampuan pergerakan protein di dalam medan listrik. Pergerakan tersebut dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari protein. Pergerakan dapat dimulai setelah protein yang sudah diletakan didalam penyangga dan diiisi dengan buffer di aliri arus listrik (Pratiwi, 2001). Adapun tahapan yang harus dikerjakan dalam praktikum elektroforesi gel adalah penyiapan gel, Penyiapan sampel, dan Elektroforesis. Tahap pertama yang dilakukan adalah penyiapan gel, gel yang digunakan yaitu agarosa. Agarosa dipilih karena rentang bp yang mampu dipisahkan cukup besar yaitu dari 50 bp 50 kbp (Sudjadi, 2008). Konsentrasi agarosa yang digunakan sebesesar 1,2 %. Besarnya konsentrasi yang digunakan tergantung ukuran fragmen DNA yang akan dipisahkan dimana semakin kecil fragmen yang akan dipisahkan maka konsentrasi agarose yang digunakan ditingkatkan agar agarosa semakin pekat dan kompak (David G. Watson, 2007). Sedangkan buffer yang digunakan adalah TAE. TAE digunakan karena memiliki pH 8,0, pH ini sesuai untuk mengionkan sampel disamping itu harganya lebih murah dibandingkan TBE (Tris-borate-EDTA) dan TPE (Tris-phosphate-EDTA) (Kumar and Garg, 2005). Karena larutan agarosa sudah disiapkan, maka kali ini agarosa hanya perlu di panaskan didalam oven dengan suhu 100oC sebanyak dua kali. Pemanasan ini bertujuan untuk melelehkan agarosa yang sudah memadat. Agarosa yang sudah meleleh diambil dari oven untuk di aduk dengan menggunakan magnetic stirer. Tujuan pengadukan ini agar komponen yang berada dalam larutan agarosa dapat bercampur merata. Setelah diaduk kemudian larutan agarosa dituangkan ke dalam cetakan, setelah dituangkan di dalam cetakan pada atas cetakan diletakkan comb yang berfungsi untuk membentuk tempat sampel yang akan dielektroforesis atau sering disebut dengan sumur atau well. Setelah agarosa mengeras maka comb diangkat perlahan dengan memegang kedua ujungnya sambil sedikit ditekan kedalam. Selanjutnya

tempat cetakan diangkat dari wadah dengan memegang kedua sisinya dimana bagian bawah cetakan dibersihkan dengan cara digesekkan pada wadah karena dapat mempengaruhi proses pemisahan. Agarosa yang sudah bersih dimasukan ke chamber elektroforesis yang berisi buffer TAE. Kutub yang paling dekat dengan sumur adalah kutub negatif. Sumur didekatkan dengan kutub negatif karena sampel yang digunakan bermuatan negatif dan untuk bermigrasi maka sampel perlu dijauhi dari kutub positif (Yuwono, 2008). Tahap selanjutnya adalah penyiapan sampel, sebelum sampel disiapkan sumur dicuci terlebih dahulu. Pencucian dilakukan dengan cara menyedot cairan di atas permukaan sumur dengan perlahan menggunakan pipet mikro 200 l. Tujuan pencucian ini untuk membersihkan sumur dari sisa-sisa agarosa yang masuk ke dalam sumur akibat pengangkatan comb. Pencucian dilakukan perlahan agar tidak merusak agarosa. Selanjutnya sampel dimasukkan ke dalam sumur. Sampel yang digunakan sudah dicampur dengan loading buffer. Loading buffer yang digunakan berfungsi untuk menambah bobot dari sampel agar sampel tidak hanyut ke larutan running buffer TAE. kemudian sampel di spin agar sampel dapat terkumpul di dasar wadah sehingga sampel yang akan diambil memiliki konsentrasi yang sama. Sampel yang sudah di spin dan DNA-marker kemudian ditempatkan di dalam sumur. Penempatan sampel harus dilakukan dengan hati-hati agar dasar sumur tidak lubang. Lubang dari dasar sumur dapat mengakibatkan hanyutnya sampel kedalam running buffer TAE sehingga proses elektroforesis tidak dapat dilaksanakan. Sampel 1 ditempatkan di sumur 1, sampel 2 ditempatkan di sumur 2, DNA Marker ditempatkan di sumur 3, sampel 3 ditempatkan di sumur 4 dan sampel 4 ditempatkan di sumur 5. Penempatan diatur seperti ini agar praktikan mudah untuk menentukan bp dari setiap sampel. Tahap terakhir adalah elektroforesis. Setelah seluruh sampel dan DNA-marker di masukan kedalam sumur maka elekroforesis dapat dijalankan dengan mengaliri listrik pada sistem elektroforesis. Pada

praktikum ini digunakan listrik sebesar 100 volt dalam 30 menit. Setelah dinyalakan maka sampel dan DNA marker akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Arah pergerakan menuju kutub positif karena sampel dan DNA-marker yang digunakan memiliki muatan negatif. Selama listrik dijalankan maka sampel dan DNA marker akan terus bergerak dengan jarak tempuh yang berbeda-beda pada setiap fragmennya. fragmen yang lebih besar akan bergerak lebih lambat karena terjadi gesekan yang lebih besar dengan medium penyangga (David G. Watson, 2007). Setelah 30 menit elektroforesis dihentikan lalu agarosa dikeluarkan dari chamber

elektroforesis. Selanjutnya agarosa diwarnai dengan EtBr (ethidium bromida) untuk memvisualisasi fragmen DNA yang terbentuk. EtBr dapat berikatan dengan asam nukleat dengan cara menyelip diantara basa nukleotida sehingga fragmen dapat berfluoresensi pada sinar UV. EtBr bersifat karsinogen maka harus diperlakukan dengan hati-hati (Sudjadi, 2008). Untuk mewarnai fragmen DNA dengan EtBr digunakan alat shaker dengan kecepatan 35 rpm dalam 15 menit. Selanjutnya sampel divisualisasi dengan UV transluminator. Hasil pengamatan di UV transluminator ditemukan pita-pita berwarna merah muda. Pada sumur tempat dimasukannya DNA-marker diperoleh pita-pita dengan jarak tertentu dimana setiap pita memiliki fragmen dengan bp antara 100 1500, Frgamen dari DNA marker yang paling mendekati kutub positif memiliki bp 100 dan fragmen dari DNA marker yang paling mendekati kutub negatif memiliki bp 1500, Fragmen DNA marker akan bertambah 100 bp mulai dari fragmen yang paling mendekati kutub positif. sehingga jika membandingkan pita sampel dengan pita DNA-marker maka dapat ditentukan bp dari setiap sampel.

Gambar 1. Hasil Elektroforesis Gel

1 2 Marker 3 4

arah elusi

Gambar 2. Perbesaran pada Hasi Elektroforesis

Hasil dari pengamatan elektroforesis gel yaitu pada sumur 1 tidak ada pita. Ketidak adaan pita ini disebabkan karena tidak ada sampel yang bermigrasi. Tidak adanya sampel yang bermigrasi diakibatkan oleh robeknya dasar sumur pada saat penempatan sampel sehingga sampel hanyut terbawa running buffer. Pada sumur 2, 3 dan 4 masing-masing berisi pita. Dapat dilihat di gambar 2, pita yang dihasilkan pada setiap sumur sampel dapat ditentukan banyak pasang basanya dengan cara membuat titik tengah pada setiap pita kemudian membandingkannya dengan DNA-marker. Dengan cara demikian didapat hasil berikut: pada sumur 2 terdapat 2 pita dimana pita yang terjauh migrasinya memiliki 200 bp sedangkan yang terdekat migrasinya memiliki 800 bp, pada sumur 3 dan 4 terdapat 4 pita dimana 2 pita yang migrasinya terjauh memiliki kurang dari 100 bp sedangkan pita yang terdekat migrasinya 300 bp dan yang migrasinya kedua terdekat memiliki 200 bp. Terbukti bahwa salah satu faktor yang mempengaruhi migrasi sampel adalah ukuran sampel atau besar kecilnya pasang basa fragmen sampel. Sampel yang memiliki pasang basa paling rendah selalu bermigrasi lebih jauh dan sebaliknya. Faktor ini juga yang akan digunakan sebagai bahan untuk mengidentifikasi sampel.

VI.

KESIMPULAN 1. Elektroforesis adalah metode analisis kimia yang berdasarkan pergerakan fragmen di dalam medan listrik, dimana protein akan bergerak didalam medium penyangga dari elektroda negatif menuju elektroda positif sampai jarak tertentu. Besarnya Jarak tempuh ditentukan oleh berbagai faktor salah satunya adalah bp setiap fragmen. Semakin kecil bp maka semakin jauh jarak yang ditempuh oleh protein, sebaliknya semakin besar bp maka semakin sedikit jarak yang ditempuh protein. 2. Elektroforesis dikerjakan dengan memasukan sampel pada sumur gel agarosa yang telah diberi buffer, kemudian diberi arus listrik untuk memisahkan setiap fragmen. Hasil yang didapat dari elektroforesi gel adalah Pada sampel 2 berisi protein dengan fragmen 200 bp dan 800 bp. Pada sampel 3 dan 4 berisi sampel dengan fragmen yang sama dimana terdapat 4 pita yaitu 2 pita yang migrasinya terjauh memiliki bp kurang dari 100, sedangkan pita yang migrasinya terdekat memiliki bp 300 dan yang migrasinya kedua terdekat memiliki bp 200.

10