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Espectroscopia de impedancia electroquimica

Espectroscopia de impedancia electroquimica

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Espectroscopia de impedancia
Espectroscopia de impedancia

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10/14/2013

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#
 
 Autor de correspondencia
#
Nardo Ramírez
1
, Angel Regueiro
2
, Olimpia Arias
3
, Rolando Contreras
1
1
Dirección de Diagnóstico Microbiológico, Centro Nacional de Investigaciones Científicas, CNIC Ave. 25 esq. 158, Cubanacán, Playa, Ciudad de La Habana, Cuba
2
Centro de Bioingeniería, CEBIO
3
Instituto de Ciencia y Tecnología de Materiales,Universidad de La Habana, UHE-mail: nardo.ramirez@cnic.edu.cu
RESUMEN
La espectroscopia dieléctrica o espectroscopia de impedancia electroquímica es empleada tradicionalmente en elregistro y estudio de los procesos de corrosión y electrodeposición, en la evaluación de recubrimientos y en lacaracterización de muchos tipos de sensores y semiconductores. En la última década se han ampliado notablementesus aplicaciones en la Biotecnología para la caracterización de células biológicas, el diagnóstico de enfermedades y la caracterización del cultivo de células. Como principio de transducción, la técnica de impedancia ha sido aplicadaen el campo de la microbiología como un medio para detectar y cuantificar microorganismos patógenos. El presentetrabajo revisa el estado del arte de la microbiología de impedancia, el progreso y las aplicaciones en la detecciónde microorganismos patógenos incluido el uso de los microelectrodos interdigitados, el desarrollo de la miniaturizaciónde la microbiología de impedancia y la integración de los biosensores de impedancia con otras técnicas como ladielectroforesis y la electropermeabilización. Se hace referencia a conceptos básicos, definiciones y fundamentosde esta técnica, así como se abordan los componentes, principios para el diseño del medio de cultivo y uso decircuitos equivalentes para el análisis de los sistemas basados en esta alternativa.
Palabras clave
: detección de bacterias, diagnóstico, impedancia, microbiología
Biotecnología Aplicada 2009;26:65-71
 ABSTRACT 
Electrochemical impedance spectroscopy: an effective tool for rapid microbiologic diagnosis.
Dielectricspectroscopy, also called electrochemical impedance spectroscopy, is traditionally used in monitoring corrosion andelectro-deposition processes in the coating and characterization assessment of many kinds of sensors and semi-conductors. Its application in biotechnology for the characterization of cell cultures has, however, been notably expanded in the last decade. As a transductional principle, impedance has been applied in the field of microbiology as a means of detecting and quantifying pathogenic bacteria. This paper reviews the state-of-the-art of ImpedanceMicrobiology, its progress and its applications for the detection of foodborne pathogenic bacteria, including the useof interdigitated microelectrodes, the development of chip-based impedance microbiology and the integration of impedance biosensors along with other techniques such as dielectrophoresis and electropermeabilization. Referenceis made to basic components, definitions and principles of this technique, as well as to the explanation of thecomponents and principles for cell culture design and the use of equivalent circuits for the analysis of the systemsbased on this alternative.
Keywords
: bacteria detection, diagnosis, impedance, microbiology 
I
ntroducción
El uso creciente de los sensores electroquímicos enaplicaciones ambientales, en la industria y en el ámbitomédico ha creado la imperiosa necesidad de compren-der las propiedades de la superficie y del conjunto engeneral de tan importantes sistemas analíticos. Todoparece indicar que la comunidad científica ha seleccio-nado la espectroscopia de impedancia para caracterizarun gran número de sistemas electroquímicos. La in-formación obtenida a partir del empleo de esta técnicaha sido utilizada para la fabricación de sensores elec-troquímicos con excelentes propiedades (linealidad,estabilidad térmica y temporal, entre otros).La espectroscopia de impedancia constituye unaherramienta poderosa para lograr un rápido diagnósticobiomolecular y para el análisis en cultivos de células.Su superioridad sobre otras técnicas de laboratorio ra-dica en que utiliza una pequeña señal, generalmente enmodo de tensión, que minimiza las alteraciones de laspropiedades del medio, es decir, que el estímulo aplica-do no altera las condiciones de equilibrio del sistema.La señal aplicada a las muestras permite relacionarlas propiedades del líquido o sólido que se estudia,con las variaciones o cambios obtenidos en su impe-dancia característica. Ello se debe a la estructura físicadel material, a los procesos químicos que ocurren en élo a la combinación de ambos. Consecuentemente, laespectroscopia de impedancia electroquímica es unatécnica
no destructiva
que proporciona medicionesrobustas.
 M
icrobiología de impedanciaclásica: definición y conceptosbásicos
La impedancia eléctrica como principio de transduc-ción ha sido aplicada en una gran variedad de problemasbiológicos, fisiológicos y médicos [1, 2].Antes de comenzar a introducir en el tema de refe-rencia es importante analizar algunos conceptos bá-sicos. Se conoce que la resistencia eléctrica R, es lahabilidad de un elemento del circuito de resistir el flujo
     E     N     F     O     Q     U     E
1.Geddes LA, Baker LE. Principles oapplied biomedical instrumentation. New  York: John Wiley & Sons. 1989.2.Eden G, Eden R. Enumeration of mi-croorganisms by their dynamic AC con-ductance patterns. IEEE Trans Biomed Eng.1984;31(2):93-8.
 
Nardo Ramírez y col
.
Espectroscopía de impedancia para el diagnóstico microbiológico
Biotecnología Aplicada 2009; Vol.26, No.1
66
de la corriente eléctrica. La ley de Ohm define esta re-sistencia como la relación entre la tensión y la corriente.La MI es el registro temporal de la variabilidad de laimpedancia durante el crecimiento de microorganismosen una muestra y se realiza colocando un arreglo deelectrodos metálicos, los cuales son sumergidos en unmedio de cultivo inoculado (Figura 1A), de este modose logra la medición entre los electrodos (impedanciabipolar) mientras crecen los microorganismos pre-sentes. La técnica consiste en realizar mediciones delas componentes de impedancia, por ejemplo: conduc-tancia, capacidad, módulo de impedancia o ángulo defase y otras, mediante el método bipolar o el tetrapolar,con electrodos sumergidos en una celda que contieneun medio de cultivo inoculado mantenido a temperaturaconstante. Estas mediciones permiten registrar, detec-tar, cuantificar y aun identificar determinados micro-organismos presentes en las muestras provenientesde la industria o de la práctica clínica.
B
ases de la microbiología deimpedancia
En MI, los cambios de impedancia son medidos típi-camente con el empleo de un par de electrodos sumer-gidos en el medio de crecimiento o solución reactante(Figura 1A).La medición puede realizarse en dos formas, directao indirectamente. En la técnica directa, un par de elec-trodos metálicos son sumergidos en el medio inocula-do con la bacteria que se desea medir. Los productosmetabólicos creados durante el crecimiento de mi-croorganismos modifican la composición del medio,cambiando el contenido iónico, lo cual a la vez originaun cambio de la conductividad del medio de cultivo.Estos cambios son registrados en el tiempo al produ-cirse variaciones en la interfaz electrodo-electrolito-muestra. Tales modificaciones son proporcionales a laconcentración de microorganismos vivos, que puedeser registrada mediante técnicas impedimétricas.La liberación del ión por la bacteria a su medio decrecimiento (Figura 2) se debe a dos mecanismos prin-cipales [3]. El primer mecanismo está relacionado conel metabolismo energético (catabolismo) en el cual, labacteria consume oxígeno y carbohidratos, y producedióxido de carbono y ácidos orgánicos. Ejemplos sim-ples indican que la conversión de glucosa de un sustratoDonde:
se corresponde con el valor de la tensión e
 I 
, conel valor de la corriente eléctrica.El uso de la ecuación 1 se limita solamente a unelemento del circuito: el resistor ideal, el cual poseevarias condicionantes: 1) cumple con la ley de Ohm entodos los niveles de tensión y corriente, 2) su valor deresistencia es independiente de la frecuencia y 3) lasseñales de tensión y corriente a través de un resistorestán en fase.El mundo real contiene elementos que presentan uncomportamiento mucho más complejo. Estos elemen-tos obligan a desechar el simple concepto de resistencia.En su lugar se utiliza el de impedancia, que es un pa-rámetro del circuito mucho más general. Al igual que laresistencia, la impedancia es una medida de la habilidadde un circuito para resistir el flujo de la corriente eléc-trica. A diferencia de la resistencia, la impedancia noestá limitada por ninguna de las condicionantes ex-puestas anteriormente.La impedancia electroquímica usualmente se obtie-ne aplicando un potencial de corriente alterna a unacelda electroquímica y midiendo la corriente a travésde la celda. La respuesta a este potencial sinusoidal deexcitación es una señal de corriente alterna que puedeser analizada como la suma de funciones sinusoidales(series de Fourier).Otro concepto a tener presente es el de la capacidado capacitancia, la cual expresa la habilidad de un ca-pacitor para almacenar carga eléctrica. Esta propiedadrige la relación existente entre la diferencia de potencialexistente entre las placas del capacitor y la carga eléctri-ca almacenada en este,mediante la siguiente ecuación:(1)
C
=
 
Q
Donde:
es la capacidad, medida en faradios; unidad rela-tivamente grande que suele utilizarse en submúltiploscomo el microfaradio o picofaradio.
es la diferencia de potencial, medida en voltios.
Q
es la carga eléctrica almacenada, medida enculombios.Por otra parte, la conductancia está directamenterelacionada con la facilidad que ofrece un materialcualquiera al paso de la corriente eléctrica. La conduc-tancia
G
y la resistencia son inversamente propor-cionales. El valor de la conductancia de un material seindica en siemens y se identifica con la letra S. Unsiemens equivale a 1/ 
Ω
o también a ohm
-1
.Una aplicación, con auge creciente, es el registroautomático de impedancia en Microbiología. La mi-crobiología de impedancia (MI) está compuesta pordos grandes técnicas: la MI clásica basada en lasmediciones de impedancia bipolar o la resistencia delmedio (sin considerar el fenómeno de dispersión) y laespectroscopia de impedancia, también llamada es-pectroscopia dieléctrica, que basa sus mediciones pre-cisamente en la dispersión del medio.
Figura 1. (A) Configuración típica de dos electrodos para la medición de impedancia (B) Circuito equivalentesimplificado para un sistema de dos electrodos. C
dl
- Impedancia del electrodo; R 
s
- Resistencia delelectrodo. (C) Curva de impedancia vs. frecuencia.
3.Owicki J, Parce J. Biosensors based onthe energy metabolism of living cells: thephysical chemistry and cell biology of ex-tracellular acidification. Biosens Bioelec-tron 1992;7:257-72.
R
=
 
I
(2)
(A)(B)C
dl
s
C
dl
   I  m  p  e   d  a  n  c  e   (   O   h  m   )
1E+61E+51E+41E+31E+21E+11E+11E+21E+31E+41E+51E+6
(C)Frequency (Hz)
+ Measurement- AdjustmentC
dl
s
 
Nardo Ramírez y col
.
Espectroscopía de impedancia para el diagnóstico microbiológico
Biotecnología Aplicada 2009; Vol.26, No.1
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no ionizado en dos moléculas de ácido láctico incre-mentará la conductividad del medio de cultivo. Además,el metabolismo tomará el ácido láctico y tres moléculasde oxígeno para producir ácido carbónico. El máspequeño y móvil ión bicarbonato es un conductor ióni-co más efectivo que el ión lactato. Los iones hidrógenosson casi siete veces más efectivos como conductoriónico que los iones sodio todo lo cual propicia la va-riación de impedancia a causa de esta acción de labacteria [2]. El segundo mecanismo está relacionadocon el intercambio de iones a través de la membranacelular (transporte activo). Iones como el sodio y el po-tasio, son activamente transportados a través de loscanales iónicos de la membrana celular (doble capa delípidos), los cuales sirven para regular el potencial demembrana y la diferencia de presión osmótica entre elinterior y el exterior de las células.A pesar de que el metabolismo energético es la causaprincipal de la liberación de iones desde la célula a suambiente, el proceso de intercambio de iones tambiénaporta una pequeña contribución. Lo que sí está esclare-cido es que estos procesos de liberación de iones pro-ducen cambios en la composición iónica del medio decultivo y en su conductividad, los cuales constituyen lasbases para la medición de los cambios de impedancia.A diferencia de la técnica directa, la técnica indirectano mide directamente los cambios de impedancia en elmedio de crecimiento bacteriano. Los electrodos, enlugar de ser sumergidos en el medio de crecimientoinoculado, se introducen en una solución separada(usualmente una solución de hidróxido de potasio).Los gases producidos por el metabolismo bacteriano(principalmente el CO
2
) son absorbidos por la solu-ción de hidróxido de potasio, lo cual provoca un de-cremento en la conductancia de la solución alcalina.Para detectar bacterias, los sistemas de impedanciamiden los cambios absolutos o relativos en la conduc-tancia, capacitancia o impedancia, a intervalos regula-res de tiempo durante el crecimiento de las bacterias auna temperatura y humedad controlada. Las señaleseléctricas medidas son representadas gráficamente(amplitudes en el eje de las ordenadas vs tiempo deincubación en el eje de las abscisas) y se producen lascurvas de variabilidad de impedancia.La figura 3 muestra una curva de impedancia típicadonde se aprecia que el valor de impedancia es bastanteestable en la región inicial de la curva y luego, comienzaa decrecer. El tiempo correspondiente al punto en elcual el valor de impedancia decrece y cruza determinadovalor umbral se define como tiempo de detección, t
d
.Generalmente, el tiempo de detección no aparece hastaque el número de bacterias alcanza aproximadamenteentre 10
6
-10
7
u.f.c./mL. El valor de impedancia final-mente alcanza su límite, en este punto las bacteriashan alcanzado una alta concentración, aproximada-mente 10
8
u.f.c./mL o más, y todos los recursos delmedio han sido metabolizados y convertidos en pro-ductos finales. La forma de la curva de impedanciacorresponde muy bien con las tres fases de crecimientobacteriano típico: Fase I, donde la bacteria metabolizapero no se multiplica; Fase II de crecimiento expo-nencial o logarítmico, donde la bacteria se multipli-ca exponencialmente, y Fase III estacionaria, dondela concentración celular se mantiene relativamenteconstante [4].
Figura 2. Representación esquemática de los dos mecanismos principales responsables de la liberación deespecies iónicas por células vivas: metabolismo energético (catabolismo) e intercambio de iones a través dela membrana celular.
Un simple análisis teórico, confirmado por la ob-servación experimental, muestra que el tiempo de de-tección td (tiempo necesario para que la impedanciacruce un umbral arbitrario) se relaciona con la con-centración inicial de células C
o
por medio del modelorepresentado [5]:
log ( =
C
0
) - +
α β
t
d
(3)
Figura 3. Curva de crecimiento de impedancia con el umbral y eltiempo de detección conjuntamente con las fases típicas delcrecimiento bacteriano.
Fasede demora
   N   ú  m  e  r  o  s   d  e  c   é   l  u   l  a  s
10
6
t
d
Tiempo de crecimiento
10
7
10
8
10
9
10
10
Curva de impedanciaFaseestacionariaUmbralFaselogarítmicaFase demuerte
   I  m  p  e   d  a  n  c   i  a
4.Talaro KP. Foundations in microbio-logy. 5th ed. New York: McGraw-Hill. 2005.5.Gómez R, Bashir R, Bhunia A. Micro-scale electronic detection of bacterial me-tabolism. Sensor Actuators B. 2002;86:198-208.
CélulaOtrosprocesosEnergíametabólicaCanaliónico Azúcar Oxígeno Ácido carbónicoH
2
O
+
Na
+
 Ácido lácticoCO
2
 ATP
En esta expresión,
α
(t > 0) y
β
son constantes quedependen del tipo de microorganismo en particular,sus condiciones de crecimiento, etc. Eden y cola-boradores [2] obtuvieron valores experimentales deestas constantes:
α
 
= 0.96 y
β
 
= 7.75, para
en horas,y
o
en ufc/mL en el medio de incubación.La figura 4 muestra la representación del modelo(3) para los valores de las constantes anteriores, lacual indica que el intervalo del tiempo de detecciónva desde una hora para C
o
, aproximadamente igual a

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