INGENIERIA BIOQUIMICA ASIGNATURA: BIOQUIMICA DE NITROGENO Y REGULACION GENETICA PRACTICA: OBTENCION DE ADN (VEGETALES) ALUMNOS(A): LESLIE E.

OSEGUERA GARCIA PABLO ARMANDO MENDOZA REGULES FELIMON MARTINEZ VEGA SILVIA ESTELA RAMOS MOJICA CATEDRATICO: IBQ. ROSALBA FERMAMDEZ VELASCO SEMESTRE: QUITO SEMESTRE GRUPO: A

INSTITUTO TECNOLGICO DE TUXTEPEC DEPARTAMENTO DE ING. QUMICA Y BIOQUMICA. PRACTICAS DE LABORATORIO M.C. Rosalba Fernndez Velasco BIOQUMICA II FUNDAMENTO La extraccin de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones salinos son atrados hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolucin y posterior extraccin de la clula. Se empieza por lisar (romper) las clulas mediante un detergente, vacindose su contenido molecular en una disolucin tampn en la que se disuelve el ADN. En ese momento, el tampn contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos, protenas y otras sustancias en menor proporcin. Las protenas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrn fraccionado en cadenas ms pequeas y separadas de l por accin del detergente. Slo queda, por tanto, extraer el ADN de esa mezcla de tampn y detergente, para lo cual se utiliza alcohol isoamlico.

MATERIAL Y REACTIVOS Muestra vegetal Agua (destilada o mineral) Sal de mesa Bicarbonato sdico Detergente lquido o shamp Alcohol isoamlico a 0C Batidora Nevera Colador o centrfuga Vaso Tubo de ensayo Varilla fina

REALIZACIN

1. Preparar el tampn con los siguientes ingredientes y mantener esta solucin en la nevera en un bao de hielo triturado: 120 ml de agua, si es posible destilada y si no mineral. (No usar agua del grifo.) 1,5 g de sal de mesa, preferiblemente pura, 5 g de bicarbonato sdico, 5 ml de detergente lquido o champ.

2. Elegir la muestra que va a proporcionar el ADN entre los vegetales (cebolla, ajo, tomates, etc.) y cortarla en cuadraditos.

3. Triturar la muestra con un poco de agua en la batidora accionando las cuchillas a impulsos de 10 segundos. As se rompern muchas clulas y otras quedarn expuestas a la accin del detergente.

4. Mezclar en un recipiente limpio 5 ml del triturado celular con 10 ml del tampn fro y agitar vigorosamente durante al menos 2 minutos. Separar despus los restos vegetales ms grandes del caldo molecular hacindolo pasar por un colador lo ms fino posible. Lo ideal es centrifugar a baja velocidad 5 minutos y despus pipetear el sobrenadante. 5. Retirar 5 ml del caldo molecular a un tubo de ensayo y aadir con pipeta 10 ml de alcohol isoamlico enfriado a 0C. Se debe dejar escurrir lentamente el alcohol por la cara interna del recipiente, teniendo ste inclinado. El alcohol quedar flotando sobre el tampn.

6. Se introduce la punta de una varilla estrecha hasta justo debajo de la separacin entre el alcohol y el tampn. Remover la varilla hacia delante y hacia atrs y poco a poco se irn enrollando los fragmentos de mayor tamao de ADN. Pasado un minuto retirar la varilla atravesando la capa de alcohol con lo cual el ADN quedar adherido a su extremo con el aspecto de un copo de algodn mojado.

7. Observar las fibras obtenidas al microscopio y realizar una tincin simple, comparar esta tcnica con la de obtencin de DNA de tejidos animales.

RESULTADOS

El producto filamentoso obtenido de la extraccin no es ADN puro ya que, entremezclado con l, hay fragmentos de ARN. Una extraccin "profesional" se realiza aadiendo enzimas que fragmentan las molculas de ARN e impiden que se unan al ADN.

REPORTE.

1.- Explique la funcin que desempea el alcohol isoamlico fro en la obtencin del DNA Reduce o imposibilita la formacin de interfaces durante la extraccin de ADN.

2.- Porque se considera necesario que las muestras y la solucin tampn estn en bao de hielo? Una manera de inactivar las enzimas que degradan al DNA (DNasas) es con la temperatura, a temperaturas menores de 4C se inactivan, por ello es que debe hacerse la extraccin en fro, para evitar que el ADN sea degradado, es decir, cortado por las DNasas en trozos pequeos. Las ADNasa no son el mayor problema ya que no son tan frecuentes como las ARNasas. El ADN ha evolucionado para ser una molcula estable que guarde la informacin gentica por generaciones. En el caso del ARN s hay que extraer a bajas temperaturas y con inhibidores de ARNasas ya que se degrada muy fcilmente. ARNasas hay hasta en la saliva porque el ARN es una molcula que debe producirse y degradarse de acuerdo a los requerimientos de expresin de la clula. En realidad cuando uno extrae ADN de cualquier organismo (no slo plantas) emplea bajas temperaturas porque eso disminuye la solubilidad del ADN y por ende facilita su separacin. Y eso es lo que se busca durante la extraccin, separar el ADN.

3.- Dibuje lo observado al microscopio

4.- Mencione que tipo de enzimas se pueden usar para obtener un ADN ms puro. Los siRNAs son molculas de ARN doble hebra de 20-21 nucletidos (nt) perfectamente complementarias, que se originan a partir de un ARN largo de doble hebra (dsRNA, double strand RNA). Los dsRNAs pueden ser de origen endgeno (por ejemplo los trnscritos generados a partir de secuencias de ADN repetidas en tndem), o de origen exgeno (como virus o transgenes). La enzima responsable del procesamiento del dsRNA en molculas de siRNAs es Dicer, una enzima citoplsmica de la familia ARNasa III, que procesa el dsRNA en fragmentos de ARN doble hebra con extremos 5' fosfato y 2 nucletidos libres con extremo hidroxilo (-OH) en 3'. Los siRNAs suprimen la expresin de los genes diana mediante el corte del ARN mensajero (ARNm) complementario en dos mitades, a travs de la interaccin de la hebra antisentido del siRNA con el complejo RISC (RNAinduced silencing complex). Las dos mitades del ARNm son posteriormente degradadas por la maquinaria celular, lo que conlleva la supresin de la expresin del gen. Por otro lado, los siRNAs promueven la modificacin del ADN, facilitando el silenciamiento de la cromatina, puesto que favorecen la expansin de los segmentos de heterocromatina, a travs del complejo RITS (RNA-induced transcriptional silencing). Se podran usar enzimas de restriccin, tambin conocidas como

endonucleasas, cortan los enlaces fosfodiester a partir de una secuencia que reconocen. La secuencia que reconocen es una secuencia palindrmica (secuencia que se lee igual en ambas direcciones). Son extradas de bacterias, donde actan como mecanismo de defensa para degradar material gentico extrao que entre en la clula. Las enzimas recomendadas son: BamHI, HindIII y EcoRI, toman el nombre de las bacterias que la producen: EcoRI: E = gnero Escherichia.

co = especie coli R = cepa RV 13 I = primera endonucleasa aislada de esta cepa

5.- Cmo podra asegurarse que la muestra extrada es ADN, mediante que prueba? Explique. Se podra usar el efecto hipercrmico, es decir, que al desnaturalizarse el ADN absorbe una mayor cantidad de luz. Tambin se podran hacer pruebas para identificar cada componente del ADN. El grupo fosfato se identifica por la reaccin para fsforo inorgnico, en medio cido, con el molibdato da fosfomolibdato, color amarillo, que es reducido luego por el cido ascrbico a azul de molibdeno, color azul verdoso. El reactivo (arsenito/citrato) se combina con el exceso de molibdato impidiendo su reaccin posterior con otros fosfatos.