1.1.1 Penyiapan Media Dan Keselamatan Laboratorium.

Pengetahuan tentang karakteristik bahan kimia perlu diketahui agar praktikan paham bagaimana cara kerja bahan kimia tersebut dan penggunaan bahan kimia tersebut juga tindakan pertolongan yg akan dilakukan jika terkena bahan kimia berbahaya. Informasi yg tercantum dalam etiket dan label adalah deskripsi dan nama produk, nomor produk, informasi deskripsi tambahan, rekomendasi penanganan dan

penyimpanan,keterangan mengenai bahaya, informasi analisis sampel(lot) adalah aktifitas, kemurnian, derjad hidrasi.ukuran kemasan, nomor lot,pitokram bahaya, informasi tentang bahaya lebih lanjut,nomor CAS, rumus kimia dan berat molekul produk, asal usul negara, informasi MSDS, dan nomor EC. Tindakan yg harus dilakukan jika terjadi kecelakaan yg disebabkan bahan kimia berbahaya adalah menggunakan kotak P3K yg tersedia di laboratorium dan menelfon nomor penting seperti : dokter, polisi, pemadam kebakaran, ketua jurusan atau penanggung jawab laboratorium. Konsentrasi adalah ukuran untuk menyatakan berapa banyak zat yg bercampur dengan zat lainnya dlm satuan kuaantitatif. Molaritas adalah satuan yg menyatakan jumlah mol suatu zat dlm satu liter larutan. Molalitas adalah satuan konsentrasi yg menyatakan jumlah mol zat terlarut dlm 1 kg pelarut. Normalitas adalah gram ekuivalen zat terlarut dlm 1 liter larutan. Bagian per adalah fraksi atau bagian dr zat dlm 1 campuran zat. 1.1.2 Isolasi DNA. Ada 3 prinsip utama dalam melakukan isolasi DNA :

1.

Pemecahan sel-sel jaringan : pemecahan dengan cara mekanis dengan menggunakan mortar dengan bantuan nitrogen cair (N2),bola2 besi,butiran pasir atau kaca yang telah disterilkan dengan homogenisator,setelah itu lakukan proses lisis dengan bantuan SDS atau CTAB.

2.

Deproteinisasi molekul DNA : metode pengendapan protein kompleks atau untuk menghilangkan protein yang melekat pada DNA sehingga mendapatkan DNA murni dengan bantuan chloroform : isoamyl alkohol dan phenol.

3.

Pemanenan DNA : presipitasi DNA atau pengendapan Molekul DNA dengan bantuan isopropanol,dengan melakukan metode sentrifugasi. Keuntungan menggunakan nitrogen cair adalah : dapat memudahkan dlm proses

penggerusan,karena N2 punya suhu -80O C maka akan mengakibatkan tanaman menjadai rapuh tapi DNA tetap utuh,dan juga membebaskan sel-sel secara mekanis. Fungsi senyawa CTAB : untuk membantu proses lisis dan menjadi buffer ekstraksi yang dapat menghancurkan dan membuang protein yang masih melekat pada DNA tapi dengan prinsip tetap menjaga keutuhan molekul DNA. Sampah yang mengandung CTAB dan CI harus dibuang pada tempat khusus karena : dapat menyebabkan gangguan karena merupakan bahan berbahaya dan harus melakukan penanganan khusus. Fungsi deproteinisasi : menghilangkan protein yang melekat pada DNA,sehingga mendapatkan DNA murni. DdH20 digunakan untuk penggunaan dalam jangka pendek sedangkan buffer TE untuk penggunaan jangka panjang. 1.1.3 Elektrophoresis. Elektrophoresis adalah salah satu teknik pemisahan molekul dengan

mengggunakan arus listrik berdasarkan perbedaan besar atau berat molekul.

DNA dapat berpindah dari kutub positif ke kutub negatif karena DNA bersifat asam dan bermuatan negatif,maka pada elektrophoresis dia akan berpindah dr kutub negatif ke kutub positif. Pengaruh konsentrasi agar terhadap laju migrasi dan resolusi pemisahan elektrophoresis : semakin besar konsentrasi agarose maka porinya yang akan dilalui molekul DNA semakin kecil,akibatnya tingkat resolusi pemisahan molekul DNA pun rendah,dan pemisahan molekul DNA pun tidak begitu spesifik dan sebaliknya. DNA dalam gel diberi sinar UV dapat memancarkan cahaya berpendar karena : diberi pewarna yaitu senyawa ethidium bromida yang apabila disinari 312 nm maka akan menghasilkan cahaya berpendar. PAGE berfungsi untuk memisahkan molekul yang kecil dengan bantuan polyacrylamid biasanya digunakan pada proses sekuensing. PFGE berfungsi untuk memisahkan molekul yang besar dengan cara kerja mempunyai 3 kutub dan 3 kutup + untuk meluruskan laju migrasi molekul tersebut. Metaphor agar berfungsi untuk molekul DNA yg berukuran kecil sama dengan 0,3 kb. Faktor yang menentukan dalam penggunaan elektrophoresis adalah konsentrasi gel,berat molekul,bentuk konformasi molekul DNA,kekuatan arus listrik yang digunakan. 1.1.4 Restriksi DNA Genomik. Enzim restriksi adalah enzim pemotong, yang memotong rantai ganda DNA pada tempat tertentu, dengan cara mengenal sekuens tertentu pada DNA, lalu melakukan pemotongan. Prinsip kerjanya adalah mengenal sekuens tertentu pada DNA lalu melakukan pemotongan, enzim ini mempunyai kemampuan untuk berikatan dengan molekul-

molekul DNA dan menyebabkan terjadinya reaksi hidrolisa pada ujung 5 dari ikatan phosphodiester molekul-molekul DNA. Spesifitas yangg dimiliki enzim hanya memotong pada sisi pengenalnya dan tidak akan memotong dari sisi luar sisi pengenalnya. Sisi pengenalan (recognized site ) : sisi yg dapat dikenal oleh enzim restriksi. Sisi potong (cutting site) : tempat potong enzim restriksi pd sisi pengenal. Tetranucleotid mempunyai 4 nukleotida contoh : GATC. Hexanucleotida mempunyai 6 nukleotida ex : GTTAAC. Oktanukleotida mempunyai 8 nukleotida ex : GCGGCCGC Yang paling sering digunakan adalah tetranucleotid. Rarecutter adalah : enzim restriksi yg punya titik potong yg jarang Muncul DNA smear karena DNA berukuran kecil dan pada saat penggerusan yang terlampau halus DNA tersebut terpotong-potong dan rusak, lalu membentuk DNA smear. Isochizomer adalah senyawa enzim yang berbeda-beda tapi punya titik potong pengenalan yang sama contoh : tru1 dan MSE1 punya titik potong AATT dan MBOI (GATC) dan BamHI GGATCC. 1.1.5 Amplifikasi Dna In-Vitro. Amplifikasi DNA In-Vitro adalah suatu reaksi amplifikasi atau penggandaan molekul DNA secara In-Vitro dengan menggunakan Taq-polymerase. Prisnsip dasar kerja mesin PCR adalah perbanyakan molekul-molekul spesifik DNA dengan bantuan primer-primer yang berupa oligonokleotida secara In-Vitro. Oligonukleotida adalah sekuens nukleotida yang biasanya terdiri dari 15-35 basa nukleotida dan disintesis secara buatan. Denaturasi adalah pemutusan pita ganda menjadi pita tunggal pada suhu 94oC. Annealing : pengikatan/penempelan primer2 pd pita tunggal hasil denaturasi terjadi pada suhu 36oC. Ekstensi adalah pembentukan molekul suntesis DNA baru dengan bahan baku dNTPS dengan bantuan enzim taq-polymerase,disini

molekul DNA sintesis yang terbentuk ukurannya lebih pendek dr DNA templet.dan terjadi berulang2.pada suhu 76oC. Fungsi primer dalam amplifikasi DNA adalah sebagai titik start (awal) terjadinya proses perpanjangan molekul DNA dan juga untuk memudahkan pembacaan basa-basa nitrogen yang akan dikode. Fungsi Dntps dalam amplifikasi DNA adalah sebagai bahan baku pembentukan molekul sintesis DNA baru. Fungsi DNA templet adalah sebagai cetakan. Fungsi polymerase adalah membantu proses perpanjangan dan penggandaan. Binding site adalah tempat menempelnya templet DNA atau basa2 pengkode. Pada proses amplifikasi DNA dengan satu primer RAPD bisa dihasilkan beberapa fragmen dengan ukuran berbeda-beda karena RAPD bersifat mengamplifikasi secara acak pada sebuah templet DNA dan dengan ukuran yang beragam pula.