LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI ISOLASI DNA KASAR

Disusun Oleh: Nama NIM Kelompok Asisten : Amilia Wahyu Agustin : 115040201111324 : Selasa, 11.00 : Husnul Khotimah

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Perkembangan ilmu biologi molekuler di dunia begitu pesat,hal ini dipengaruhi oleh perubahan pola fikir dan keadaan wilayah sehingga banyaknya ilmu-ilmu yang mempelajari bagaimana memaksimalkan DNA dan mempelajari perubahan DNA (genetik) karena perubahan lingkungan maupun karena hal lainnya. Sehingga berbagai pihak harus bisa mengerti dan paham akan fenomena ini,salah satunya para pemulia tanaman di Indonesia. DNA merupakan pembawa informasi genetik yang akan diturunkan kepada generasi penerusnya (Anonim, 2012), sehingga dengan memodifikasi informasi ini akan menghasilkan generasi baru yang bisa bersaing dan mendapatkan keuntungan berlimpah,baik dari segi budaya maupun ekonomi serta sosial. Sehingga ilmu ini sangatlah bermanfaat bagi umat manusia, khususnya dunia pertanian. Dan ilmu dasar yang harus dimiliki untuk bisa mengolah data genetik yaitu harus mengetahui dan memahami teknik Isolasi DNA. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat, dan pada beberapa tanaman kontaminasi sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Maka dari itu penting bagi mahasiswa untuk mempelajari teknik yang sudah sangat umum ini. 1.2 Tujuan Untuk mengetahui jenis detergen yang mempunyai daya rusak paling tinggi dalam merusak membran sel. 1.3 Manfaat Mahasiswa mengetahui teknik isolasi DNA dan mangetahui zat yang paling efektif untuk melisis atau merusak membran sel.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Definisi Isolasi DNA DNA isolation is the most important step in molecular biology analysis. Several DNA isolation techniques which are developed were expensive. Isolasi DNA merupakan tahap terpenting dalam analisis biologi molekuler. Teknik-teknik isolasi DNA yang telah dikembangkan sangat mahal dan memerplukan waktu yang lama. (Listanto,1996) Isolasi (DNA) adalah proses ekstraksi DNA dari berbagai sumber. Metode yang digunakan untuk mengisolasi DNA tergantung pada sumber, usia, dan ukuran sampel. (Anonimb, 2012) 2.2 Macam-macam Metode Isolasi DNA 1. Metode Ekstraksi Modifikasi Doyle & Doyle (1990) dengan Nitrogen Cair Metode I Daun temulawak sebanyak 1 gram digerus dengan PVP dannitrogen cair hingga menjadi tepung. Sebanyak 10 mL bufer ekstraksi hangat dan 2.5 mL 2-merkaptoetanol ditambahkanke dalam sampel dan diinkubasi sambil digoyang perlahan pada suhu 55 C, kecepatan 150 rpm selama 1 jam. Selanjutnya diekstraksi ulang dengan kloroform:isoamil alkohol (24:1) sebanyak 10 mL. Selanjutnya, dilakukan pemisahan dengan sentrifugasi pada kecepatan 1000 g selama 5 menit. Aliquot yang terdapat pada bagian atas dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan dengan isopropanol dingin sebanya 2/ volume. Kemudian diinversi dan diinkubasi dalam es selama 30 menit. Pelet dikoleksi dengan sentrifugasi pada kecepatan 12000 g selama 20 menit. Pelet dicuci dengan buffer pencucii (etanol 76% dan ammonium asetat). Sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 14000 g selama 10 menit. Pencucian dilakukan

sebanyak 2 kali. Pelet yang telah dicuci selanjutnya ditambahkan dengan bufer TE dan ditambahkan RNAse A dengan konsentrasi final 10 ug/mL. RNAse A diaktivasi pada suhu 37 C selama 30 menit. Selanjutnya, dipisahkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 12000 g selama 5 menit. Pelet yang dihasilkan diresuspensi dengan molecular water. Proteinase K ditambahkan dengan dua variasi penambahan.
2. Metode Ekstraksi Modifikasi Doyle & Doyle (1990) tanpa Nitrogen Cair Metode II Sampel daun sebanyak 0.2 gram dan digerus dengan PVP dan 0.75 mL buffer ekstraksi (2% b/v CTAB, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl (pH 8), 0.2% (v/v) 2merkaptoetanol). Inkubasi dilakukan dengan incubator shaker pada suhu 65C dengan 50 rpm selama satu jam. Sampel kemudian dibiarkan pada suhu ruang untuk proses cooling. Sampel ditambahkan 0.75 mL kloroform: isoamil alkohol (24:1) dan disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4oC. Supernatan berisi DNA dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan dengan 2/3 volume isopropanol dingin kemudian diinversi perlahan sebanyak 10 kali. Smapel tersebut disentrifugasi 11.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4oC. Pelet yang telah kering diberi 25 L molecular water dan disimpan pada suhu -20C. 3. Metode Ekstraksi Modifikasi Zheng et al (1995) Metode III Sampel daun 200 mg digerus hingga halus dan ditambahkan buffer ekstraksi (25 mM EDTA (pH 7.5), 50 mM TrisHCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, dan SDS 1%) sebanyak 400 L dalam mortar dingin. Sampel ditambahkan 100 L buffer ekstraksi di dalam tabung dingin dan ditambahkan 400 L kloroform kemudian diinversi. Sentrifugasi dilakukan 13.000 rpm selama 1 menit pada suhu 4C. Lapisan atas yang terbentuk ditambahkan 800 L etanol absolut dan diinkubasi pada suhu 20oC selama 1 jam. Sentrifugasi dilakukan 13.000 rpm selama 3

menit pada suhu 4C. Endapan berupa pellet DNAditambahkan 500 L Etanol 70% dan disentrifugasi kembali. Pellet yang telah kering diresuspensi dengan 50 L molecular water dan ditambahkan RNAse serta diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit. Sentrifugasi 10000 rpm dilakukan selama 5 menit. Pellet kering ditambahkan 50 L molecular water. Suspensi tersebut disimpan pada suhu -20oC. Ketiga metode tersebut di atas dimodifikasi untuk mendapatkan DNA genom dengan kualitas terbaik. Modifikasi dilakukan dengan variasi penambahan etanol 76%, buffer pencuci (etanol 76% dan ammonium asetat 3M), Proteinase K, RNAse A, kalium asetat 5M, dan PVP. Selain itu, modifikasi juga dilakukan dengan variasi penambahan larutan pada tahap yang berbeda. (Utami, 2012)

2.3 Tahapan Isolasi DNA Pada prinsipnya isolasi DNA sel harus dipecah terlebih dahulu dengan beberapa agensia, baik secara fisik kimia atau dengan mempergunakan enzim tertentu. Pemecahan dengan cara fisik misalnya dengan menggunakan alat sonikator, yaitu merupakan alatb yang menghasilkan suara ultra tinggi. Pemecahan dengan alat ini biasanya cukup fektif untuk memecah sel bacteri, tetapi kurang efektif untuk memecah sek eukaryote. Pemecahan sel juga dapat dilakukan dengan menggunakan enzim lisozim yang dapat memecah dinding sel. Seringkali penggunaan enzim ini dikombinasikan dengan perlakuan fisik, misalnya dengan pemansan sehingga sel lebih mudah pecah. Senyawa lain yang sering digunakan untuk memecah sel untuk isolasi DNA adalah CTAB (Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide). Setelah sel pecah selanjunya dilakukan isolasi dan pemurnian DNA. Untuk mengisolasi suatu fragmen DNA tertentu, DNA genom kemudian dipotong dengan menggunakan enzin endonuclease restriksi, enzim ini enzim yang dapat memotong molekul DNA di bagian tertentu. Hasil

potongan dengan enzim tertentu akan menghasilkan ujungujung DNA yang sama sesuai dengan titik potong oleh enzim. Selain dengan menggunkan enzin endonuclease restriksi, DNA genom juga dapat dipotong-potong secara mekanis, misalnya menggunakan alat sonikator.Hasil potongan dengan alat mekanis adalah molekul DNA yang ujungnya tidak beraturan. (Yuwono,2006) 2.4 Manfaat Isolasi DNA
Ada sejumlah tujuan dari isolasi DNA, antara lain: - Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel - Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara enzimatik melalui teknik Hibridisasi Southern - Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan pustaka genomic - Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan DNA - Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan (template) dalam prosedur perbanyakan DNA secara in vitro melalui teknik PCR Setiap maksud penggunaan DNA yang beragam membutuhkan persyarakan kualitas DNA yang berbeda. Kualitas DNA tersebut ditentukan oleh hal-hal berikut: - Kemurnian - Panjang DNA - Kemampuan untuk dipotong oleh sembarang enzim - Tidak mengalami modifikasi kimiawi selama proses isolasi berlangsung Oleh sebab itu, terdapat sejumlah teknik isolasi DNA, yang disesuaikan untuk berbagai maksud penggunaan dan kualitas minimum yang ingin dicapai. (Mustahib, 2009)

BAB III METODOLOGI 3.1 Alat dan Bahan 3.1.1 Alat - Mortar + pistil : menghaluskan bahan - Tabung reaksi : wadah bahan yang sudah di haluskan dan mengamati reaksinya - Spatula : Untuk mengaduk dan mengambil pasta sampel, detergen dan garam - Beaker glass : tempat mencampur detergen, garam, ekstrak buah mangga serta alcohol - Gelas ukur : mengukur volume larutan yang digunakan (alkohol) - Pipet : mengambil larutan - Pisau : memotong bahan menjadi lebih kecil agar mempermudah dalam menghaluskannya - Timbangan analitik : mengukur massa bahan - Cawan kecil (3 buah): wadah garam dan detergen - Rak tabung reaksi : meletakkan tabung reaksi 3.1.2 Bahan - Buah mangga matang : Sebagai sampel yang akan diamati DNAnya - Aquades : Untuk melarutkan detergen dan garam - Garam (2,5 gr) : untuk menghilangkan protein dan karbohidrat dengan cara presipitasi - Alkohol dingin : untuk mengikat strand DNA yang telah terkumpul - Deterjen (@2,5 gr) krim, bubuk, dan cair : untuk merusak dinding sel dan meluruhkan DNA

3.2 Langkah Kerja

Buah mangga Ambil @5 gr/ prlkuan Haluskan dengan mortar Masukkan ke dalam beaker glass Tambahkan aquades 50 ml Tambahkan 2,5 gr garam Tambahkan 2,5 gr deterjen Aduk hingga homogen Diamkan 15 menit Ekstrak bahan Ambil 5 ml dengan pipet + Alkohol dingin 0,6 ml Masukkan ke dalam tabung reaksi Amati sampai muncul gumpalan di permukaan selama 10 menit

3.3 Analisa Perlakuan Pasta daun dimasukkan kedalam gelas ukur yang berisi aquades sebanyak 50 ml., lalu tambahkan garam 2,5 gram. Adapun fungsi dari penambahan garam yaitu untuk menghilangkan protein dan karbohidrat dengan cara presipitasi. Penambahan garam juga dpat digunakan untuk melarutkan DAN, karena ion Na + yang diakndung oleh garam mampu memblikir dengan kutub negatif fosfat DNA. Dalam hal ini penambahan g a r a m b i s a d i k a t a k a n d a p a t membantu dalam hal pemekatan DNA. Setiap langkah diatas dilakukan sebanyak 3 kali sehingga pembuatan pasta terdapat 3 tabung reaksi. Pada botol pertama tambahkanlah deterjen bubuk, botol kedua di tambahkan deterjen krim, serta botol ketiga ditambahkan dengan deterjen cair, masingmasing sebanyak 2,5 gram. Fungsi dari penambahan deterj en yaitu untuk melisiskan barier sel secar kimia sebagai pengganti senyawa kimia yang mampu merusak dinding dan membran sel. Diadauk sampai rata hingga homogen lalu diamkan selama 15 menit agar lebih homogen. Kemudian dari hasil tadi dan di masukkan ke dalan tabung reaksi menggunakan pipet masing-masing sebanyak sebanyak 5 ml dan ditambahi dengan alkohol dingin 0,6 ml untuk mengikat strand DNA yang telah terkumpul. Strand strand DNA yang terikat oleh alkohol akan nampak sebagai benang benang putih yang terapung diatas filtrat. Alkohol yang ditambahkan dalam keadaan dingin, karena pada alkohol yang dingin dapat membantu mempercepat proses mempertifikasi DNA. Selain itu, konsentrasi DNA yang akan terikat oleh alkohol tersebut akan semakin pekat lalu tunggu 10 menit agar proses penggumpalan DNA berjalan optimal lalu amati hasilnya.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil

4.2 Pembahasan Dari gambar di atas dapat kita lihat deterjen yang paling banyak menampakkan benang-benang putih adalah detergen bubuk, kemudian disusul deterjen krim, dan yang paling sedikit menampakkan benang-benang putih adalah detergen cair. Hal ini dikarenakan bahan pembuat deterjen bubuk lebih keras, artinya konsentrasinya tinggi sehingga mempunyai daya rusak yang besar dibandingkan dengan deterjen krim atau pun cair. Menurut literatur yang didapat pada suatu jurnal penellitian, larutan deterjen berfungsi menurunkan tegangan permukaan cairan dan melarutkan lipid sehingga membran sel mengalami degradasi, dan organel-organel di dalamnya dapat keluar dari sel.

BAB V PENUTUP 4.3 Kesimpulan Jenis deterjen yang digunakan untuk isolasi DNA sangat berpengaruh tehadap hasil yang ditunjukkan dari segi jumlah benang putih yang tampak dan juga cepat tidaknya benang putih tersebut tampak. Deterjen yang berbentuk bubuk mempunyai pengaruh yang paling besar terhadap hasil yang ditunjukkan dari isolasi DNA karena terlihat benang putih paling banyak, jelas dan muncul dengan cepat. 4.4 Saran - Untuk praktikum Perlu pembaharuan beberapa alat praktikum, seperti pipet - Untuk asiten Praktikum tanpa asisten yang jelas membuat praktikan kebingungan, tetapi seru juga. :D

DAFTAR PUSTAKA Anonima.2012.Isolasi DNA.http://asris07.student.ipb.ac.id/ 2010/06/19/isolasi-dna/ diakses 6 Desember 2012 Anonimb.2012.DNA isolation methods.http://www.enotes.com/dnaisolation-methods-reference/dna-isolation-methods. Full copy right World of Forensic Science, 2006 Gale Cengage. All Rights Reserved. diakses 4 Desember 2012 Listanto, E; pardal,s.j; Wang, k.1996.Metode Sederhana Isolasi DNA dari Tanaman Jagung Transgenik untuk Polymerase Chain Reaction.Jurnal Bioteknologi Pertanian, Indonesian Journal of Agricultural Biotechnology. Balai penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan. Bogor Mustahib.2009.Isolasi DNA.http://biologi.blogsome.com/2009/ 11/02/isolasi-dna/ diakses 6 Desember 2012 Utami, Annisa; Riani Meryalita; Nur Aeny Prihatin; Laksmi Ambarsari; Popi Asri Kurniatin; Waras Nurcholis.2012. Variasi Metode Isolasi DNA Daun Temulawak (Cucurma xanthorrhiza). Prosiding seminar nasional kimia Unesa.Surabaya

Yuwono, Triwibowo.2006.Bioteknolgi Pertanian.Gadjah Mada University Press.Yogyakarta