Spektrofotometri UV-Vis Spektrofotometri UV-Vis adalah metode analisis spektroskopik yang memakai sumber radiasi elektromagnetik UV dekat (190-380

nm) dan sinar tampak (380 -780 nm) dengan memakai instrumen spektrofotometer. RadiasiUV jauh (100190 nm) tidak dipakai, sebab pada daerah tersebut, udara jugamengalami absorbs radiasi (Tim Penyusun, 2008).Radiasi di daerah UV/Vis diserap melalui eksitasi elektron-elektron yangterlibat dalam ikatan-ikatan antara atomatom pembentuk molekul sehinggaawan elektron menahan atom-atom bersama-sama mendistribusikan kembalia t o m - a t o m i t u s e n d i r i d a n o r b i t a l ya n g d i t e m p a t i o l e h e l e k t r o n - e l e k t r o n pengikat tidak lagi bertumpang tindih (Watson, 2007).Ketika sinar melewati suatu senyawa, energi dari sinar digunakan untuk mendorong perpindahan elektron dari orbital ikatan atau orbital non-ikatan kesalah satu orbital anti-ikatan yang kosong (Clark, 2007). Perpindahan/lompatanelektron yang mungkin terjadi akibat adanya sinar adalah:Lompatan yang lebih besar membutuhkan energi ya ng lebih besar danmenyerap sinar dengan panjang gelombang yang lebih pendek. Lompatan yangditunjukan dengan tanda panah abu-abu menyerap sinar UV dengan panjanggelombang yang lebih rendah dari 200 nm (Clark, 2007). Lompatan yang penting diantaranya adalah lompatan dari orbital pi ikatanke orbital pi antiikatan; dari orbital non-ikatan ke orbital pi anti-ikatan; dandari orbital non-ikatan ke orbital sigma anti-ikatan. Artinya untuk menyerapsinar pada daerah antara 200 800 nm (pada daerah dimana spektra diukur),molekul harus mengandung ikatan pi atau terdapat atom dengan orbital non-ikatan. Perlu diingat bahwa orbital non-ikatan adalah pasangan elektron bebas,misalnya pada oksigen, nitrogen, atau halogen (Clark, 2007).A n a l i s i s spektrofotometri UV-Vis kuantitatif dengan metode

d a p a t digolongkan atas tiga macam pelaksanaan

pekerjaan, yaitu: (1) analisis zattunggal atau analisis satu komponen; (2) analisis kuantitatif campuran duamacam zat atau analisis dua komponen; dan (3) analisis kuantitatif campurantiga macam zat atau lebih (analisis multi komponen) (Gandjar dan Rohman,2007).

Analisis Komponen Tunggal Jika absorpsi suatu seri konsentrasi larutan diukur pada panjang gelombang,suhu, kondisi pelarut yang sama; dan absorbansi masing-masing larutandiplotkan terhadap konsentrasinya maka suatu garis lurus akan teramati sesuaidengan persamaan A = bc. Grafik ini disebut dengan plot hukum Lambert-Beer dan jika garis yang dihasilkan merupakan suatu garis lurus maka dapatdikatakan

bahwa hukum Lambert-Beer dipenuhi pada kisaran konsentrasi yangteramati (Gandjar dan Rohman, 2007).Cara lain untuk absorbansi menetapkan sampel kadar dengan sampel absorbansi adalah baku, dengan atau

menggunakan perbandingan

denganmenggunakan persamaan regresi linier yang menyatakan hubungan konsentrasi baku dengan absorbansinya. Persamaan kurva baku digunakan untuk menghitung kadar dalam sampel (Gandjar dan Rohman, 2007).

Analisis Dua Campuran secara Bersama-sama Spektrofotometri merupakan metode relatif (bukan metode absolut), artinya perlu senyawa baku sebagai pembanding. Pengukuran absorbansi sampel maupun baku untuk campuran beberapa senyawa (multicomponent ) dapat diukur pada beberapa maksimum masing-masing senyawa. Selanjutnya konsentrasi masing-masing senyawa dihitung berdasarkan persamaan simultan sederhana (SSE = simple simultan equation). Determinasi secara simultan akan diasumsikan pada total absorbansi pada masing-masing panjang gelombang yang dijumlahkan (Khopkar, 2003). Kadar larutan campuran dua zat dapat ditentukan dengan metode spektrofotometri tanpa harus dipisahkan lebih dahulu. Kedua zat harus memiliki panjang gelombang maksimum yang tidak berimpit. Absorpsi larutan sampel atau campurannya pada panjang gelombang pengukuran merupakan jumlah absorpsi dari masing-masing zat tunggalnya. Kadar masing-masing zat ditentukan menggunakan metode simultan (Pitri Susanti, dkk, 2011). Jika absorbansi suatu seri konsentrasi larutan diukur pada panjang gelombang, suhu, kondisi pelarut yang sama, dan absorbansi masing-masing larutan diplotkan terhadap konsentrasinya, maka suatu garis lurus akan teramati sesuai dengan persamaam A=abc. Grafik ini disebut dengan plot hukumLambertBeer dan jika garis yang dihasilkan merupakan suatu garis lurus makadapat dikatakan bahwa hukum Lambert-Beer dipenuhi pada kisaran konsentrasiyang diamati (Gandjar dan Rohman, 2007).Bila diinginkan dua buah senyawa secara bersama-sama secaraspektrofotometri, maka dapat dilakukan pada dua panjang gelombang yang mana masing-masing komponen tidak saling mengganggu atau gangguan darikomponen yang lain paling kecil. Dua buah kromofor yang berbeda akan mempunyai kekuatan absorbsi cahaya yang berbeda pula pada satu daerah panjang gelombang. Pengukuran dilakukan pada masing-masing larutan padadua panjang gelombang sehingga diperoleh dua persamaan hubungan antara

absorbansi dengan konsentrasi pada dua panjang gelombang, akibatnya konsentrasi masing-masing komponen dapat dihitung. Mula-mula dipilih panjang gelombang yang mana perbandingan absorptivitas maksimum, yaitu :

.Gambar 2. Spektra dua buah senyawa, senyawa I dan senyawa II

Absorban jumlah suatu campuran beberapa senyawa yang mengabsorpsi pada masing-masing panjang gelombang merupakan jumlah absorban masing-masingnya. Pada campuran dua komponen akan terlihat absorban yang diukur pada 1serta 2 merupakan jumlah dari absorban komponen tunggal pada panjang gelombang tersebut. Hal ini memungkinkan untuk pemeriksaankemurnian senyawa obat secara spektrofotometri serta penentuan campuran beberapa komponen (Rot dan Blaschke, 1985).Dari hukum Lambert-Beer, dapat diketahui bahwa absorbansi berbandinglurus dengan absortivitas ( a ), tebal kuvet ( b ), dan konsentrasi (c). Supaya nilai b tetap maka selama pengukuran digunakan kuvet yang sama. Absorbansi senyawa 1, A1=a1b1c1......................(1) Absorbansi senyawa 1, A1=a2b2c2......................(2) Selama kuvet yang digunakan sama, maka nilai b tetap sehingga persamaan 1 dan 2 menjadi persamaan 3 dan 4. A1=a1c1.......................(3)

A2=a2c2.......................(4)

Pengukuran campuran 2 senyawa dilakukan baik pada panjang gelombang 1(1) maupun pada panjang gelombang 2 (2), oleh karena itu absorbansi padakedua panjang gelombang tersebut merupakan jumlah dari absorbansi senyawa1 dan absorbansi senyawa 2, yang secara matematis dapat dituliskan sebagai berikut: A 1= (a1c1) 1+ (a2c2) 2.......................(5) A 2= (a1c1) 2+ (a2c2) 1.......................(6) Keterangan: Nilai a (absortivitas) dapat juga diganti dengan absorptivitasmolar. Yang mana: C1: konsentrasi senyawa 1 C2: konsentrasi senyawa 2 (a1) : absorpsivitas senyawa 1 pada panjang gelombang pertama (a2) 2: absorpsivitas senyawa 1 pada panjang gelombang kedua (a2) 1: absorpsivitas senyawa 2 pada panjang gelombang pertama (a2) 2: absorpsivitas senyawa 2 pada panjang gelombang kedua A 1: absorbansi senyawa campuran pada panjang gelombang pertama A 2: absorbansi senyawa campuran pada panjang gelombang kedua (Gandjar dan Rohman, 2007). Data spektra UV-Vis secara tersendiri tidak dapat digunakan untuk identifikasi kualitatif obat atau metabolitnya. Sedangkan pada aspek kuantitatif, suatu berkas radiasi dikenakan pada cuplikan (larutan sampel) dan intensitassinar radiasi yang diteruskan diukur besarnya. Radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya.Intensitas atau kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu-satuan luas penampang per detik. Besarnya intensitas energi REM yang diabsorpsi proporsional dengan jumlah kromofornya (konsentrasinya).

Gandjar, Ibnu Gholib dan Abdul Rohman. 2007.Kimia Farmasi Analisis, PustakaPelajar : Yogyakarta