BAB I PENDAHULUAN

I.1 a) b)

Maksud Percobaan Mengetahui prinsip dasar pengujian ekstrak bahan alam. Melakukan uji bioassay dengan menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BST).

I.2 a) b)

Tujuan Percobaan Untuk mengetahui prinsip dasar pengujian ekstrak bahan alam. Untuk melakukan uji bioassay dengan menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BST).

I.3

Prinsip Percobaan Pengujian toksisitas dalam penelusuran senyawa bioaktif yang

toksik dari bahan alam dengan hewan uji Brine Shrimp (udang laut) dimana berdasarkan LD50 dan LC50 yaitu dosis dan konsentrasi yang dapat mematikan hewan uji sebanyak 50%.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

II.1

Teori Umum Brine Shrimp Lethality Test (BST) merupakan salah satu metode uji

toksisitas yang banyak digunakan dalam penelusuran senyawa bioaktif yang toksik dari bahan alam. Metode ini menunjukkan aktifitas

farmakologis yang luas, tidak spesifik dan dimanifestasikan sebagai toksisitas senyawa terhadap larva udang Arternia salina Leach. (1) Metode ini dapat dilakukan dengan cepat, murah, mudah dan cukup reproducible sehingga dapat digunakan sebagai Bioassay Guided Isolation yaitu isolasi komponen kimia berdasarkan aktifitas yang ditunjukkan oleh bioassay tersebut. Dengan mengetahui aktifitas dari suatu kelompok komponen kimia (fraksi), dapat dilakukan isolasi senyawa sehingga diperoleh senyawa tunggal aktif. (1) Toksisitas ilah efek berbahaya dari satu bahan obat pada organ target. Uji toksisitas dilakukan untuk mengetahui tingkat keamanan dan keberbahayaan zat yang akan diuji. Adapun sumber zat toksik dapat berasal dari bahan alam maupun sintetik. (1) Toksisitas diukur dengan mengamati kematian hewan percobaan. Kematian dari hewan percobaan di anggap sebagai respon dari pengaruh senyawa yang diuji, sehingga hubungan dari respon dengan

menggunakan kematian sebagai jawaban toksis adalah titik awal untuk mempelajari toksisitas. (1) Angka kematian dari hewan percobaan dihitung sebagai Median Letal Dose (LD 50) atau Median Concentration (LC 50). Penggunaan LC 50 dimaksudkan untuk pengujian ketoksikan dengan perlakuan terhadap hewan coba secara inhalasi atau dengan media air. (1) Median Letal Dose (LD 50) adalah dosis dari sampel yang diuji yang mematikan 50% dari hewan uji sedangkan Median Letal

Concentration (LC 50) adalah konsentrasi sampel yang diuji yang dapat mematikan 50% dari hewan uji. (1) Senyawa bioakti sering toksis terhadap larva Arternia salina Leach. Oleh karena itu, uji letal secara in vitro terhadap larva udang Arternia salina Leach dapat digunakan sebagai monitor yang bekerja dengan cepat dan sederhana untuk senyawa bioaktif selama isolasi dari bahan alam. Telur larva udang Arternia salina Leach ketika ditempatkan pada air laut, telur akan menetas setelah 48 jam, menghasilkan larva dalam jumlah banyak. (2) Pada percobaan BST, digunakan hewan uji yaitu Larva udang. Hal ini disebabkan karena larva udang sebelumnya telah digunakan dalam bermacam-macam uji hayati seperti uji pestisida, mikotoksin,

kekarsinogenikan dan toksikan dalam air laut. Uji dengan organisme ini sesuai untuk aktifitas farmakologi dalam ekstrak tanaman yang bersifat toksik. Penelitian menggunakan larva udang memiliki beberapa

keuntungan antara lain cepat, mudah, murah dan sederhana. Penelitian dengan larva udang telah digunakan oleh Pusat Kanker Purdue Universitas Purdue di Lafavette untuk senyawa akti tanaman secara umum dan tidak spesifik untuk zat antikanker. Namun demikian,

hubungan yang signifikan dari sampel yang bersifat toksik terhadap larva. Larva udang juga mempunyai aktifitas sitotoksik. Berdasarkan hal tersebut maka larva udang dapat digunakan untuk uji toksisitas. (2) Hubungan kanker dengan BST adalah, metode Brine Shrimp Test (BST) dengan menggunakan larva udang sebagai hewan uji merupakan salah satu metode yang banyak digunakan untuk pencarian senyawa antikanker baru yang berasaldari tanaman. Hasil uji toksisitas dengan metode ini telah terbukti memiliki korelasi dengan daya sitotoksis senyawa antikanker. Selain itu metode ini juga mudah dikerjakan, murah, cepat dan cukup akurat. Lebih dari itu larva udang ini juga digunakan untuk praskrining terhadap senyawa-senyawa yang diduga brkhasiat sebagai antitumor. Dengan kata lain, uji ini mempunyai korelasi yang positif dengan potensinya sebagai antikanker. (2) Suatu senyawa bahan alam dapat dikatakan memiliki aktivitas sebagai antikanker jika nilai LC50nya kurang dari 1000 ppm atau sekitar 10-100 ppm.

BAB III METODE KERJA

III.1

Alat Percobaan Alat-alat yang digunakan dalam percobaan adalah mikropipet,

lampu pijar, wadah penetas, aerator, pipet tetes. III.2 Bahan Percobaan Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan adalah ekstrak daun kemangi (Occinum sanctum), kloroform, methanol, larva Arternia salina Leach, suspense ragi, air suling, air laut. III.3 A. Cara Kerja Penetasan Larva 1. Ambil telur udang secukupnya dan direndam dalam air suling selama 10 menit. 2. Pisahkan telur udang yang terapung dan yang tenggelam. Telur udang yang terapung dibuang karena tidak berisi, sedangkan yang tenggelam digunakan untuk penetasan. 3. Telur tersebut dimasukkan dalam wadah plastic berbentuk kerucut, lalu ditambahkan air laut. 4. Masukkan aerator ke dalam wadah penetas dan berikan cahaya lampu pijar. 5. Setelah 48 jam larva siap digunakan untuk pengujian.

B.

Pembuatan Konsentrasi Uji 1. Larutkan ekstrak dalam pelarut kloroform : methanol (1 : 1) atau pelarut yang sesuai. 2. Buat seri kadar dengan konsentrasi 10 ppm, 100 ppm, dan 1000 ppm, uapkan pelarutnya hingga kering dan tidak berbau pelarut lagi kemudian ditambahkan air laut sebanyak 2 ml, 3. Selanjutnya diuji pada larva udang. 4. Sebagai control negative digunakan pelarut yang digunakan pada pengenceran ekstrak.

C.

Pelaksanaan Uji 1. Masukkan larva yang telah menetas dan telah diadaptasikan ke dalam masing-masing vial sebanyak 10 ekor. 2. Cukupkan volume tiap vial sampai 5 ml (batas tanda) dengan air laut. 3. Buat makanan larva yaitu suspense ragi dengan cara menimbang 3 mg ragi (fermipan) dan dilarutkan dalam 5 ml air laut. 4. Masukkan 1 tetes makanan (suspense ragi) ke dalam tiap-tiap vial. 5. Biarkan selama 24 jam kemudian hitung jumlah larva yang mati. 6. Hitung presentase jumlah larva yang mati dan tentukan LC 50 dengan analisis probit.

BAB IV HASIL PENGAMATAN

IV.1 Data Pengamatan Kelompok Perlakuan I II III IV V K (-) Konsentrasi Ekstrak (mg/ml) 10.000 5000 2400 1200 600 0 Jumlah awal larva udang 10 10 10 10 10 0 Jumlah mati tiap replikasi R1 10 5 4 1 0 0 R2 9 6 3 2 1 0 R3 7 4 2 1 0 0 R4 8 7 2 0 1 0 R5 8 3 3 1 0 0 Rata-rata Kematian 8,4 5 2,8 1 1,4 0

Log Konsentrasi 4 3,69 3,38 3,08 2,77 -

% Kematian 84 50 28 10 14 -

Probit 5,99 5 4,42 3,72 3,92 -

% Kematian =

x 100

IV.2 Perhitungan

a = -1,366 b = 1,766 r = 0,935 Nilai LC50 yaitu Y=5 Y = a + bx 5 = -1,366 + 1,766(x) 5 + 1,366 = 1,766x 6,366 = 1,766x X = 3,605 Sehingga nilai LC50 = antilog 3,605 = 4027,17 g/ml

BAB V PEMBAHASAN

Uji BST digunakan sebagai uji permulaan untuk mengetahui aktivitas dari suatuzat atau senyawa yang terkandung dalam suatu ekstrak atau suatu isolat murni. Pada uji BSLT digunakan larva udang Artemia salina yang telah berumur 48 jam.Pada saat penetasan setelah 24 jam larva udang yang telah menetas di pindahkanketempat lain hal ini bertujuan agar umur dari larva udang yang digunakan sama.Ditakutkan bila tidak dipindahkan ada larva udang yang baru menetas setelah 24 jam. Dan terbawa dalam percobaan sehingga usia dari larva udang tidak seragam. Pada pengujian BSLT dibuat larutan dengan konsentrsi yang berbeda-beda mulau dari 1000,100,dan 10g/ml. Ini bertujuan untuk melihat pengaruh konsentrasi dari ektrak terhadap aktivitasnya(LC50). Dari hasil data pengamatan diatas, berdasarkan regresi yang telah dilakukan didapatkan nilai LC50nya yaitu 4027,17 g/ml. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak dari tanaman ini memiliki > 1000 g/ml, jadi tidak memenuhi syarat sebagai anti kanker dimana batas konsentrasi suatu ekstrak dapat dikatakan sebagai antikanker apabila 10 g/ml.

BAB VI PENUTUP

VI.1

Kesimpulan Dari pengamatan di atas, dapat disimpulkan: LC50 = 4027,17 g/ml Tidak memenuhi syarat sebagai antikanker yang baik karena >10 g/ml.

VI.

Saran Alat-alat dan bahan di laboratorium harap dilengkapi lagi guna

memperlancar praktikum.

Skema Kerja Telur udang

Air Suling (10 menit)

Tampung

Tenggelam

Plastik Kerucut (air laut + aerator + lampu pijar) 48 jam

Uji larva 10 ekor + ekstrak

Vial

Air laut (5 ml)

+suspense ragi (1 tetes)

Diamkan (24 jam)

Larva mati (hitung) Ekstrak

Kloroform = MeOH K=1

1000 ppm 100 ppm

10 ppm kontrolnegatif

Uapkan

Air laut (2 ml)

Uji

Tabel Probit PROBIT 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

PROSENTASE 0 10 20 30

2,67 2,95 3,12 3,25 3,36 3,45 3,52 3,59 3,66

3,72 3,77 3,82 3,87 3,92 3,95 4,01 4,05 4,08 4,12 4,17 4,19 4,23 4,26 4,29 4,33 4,36 4,39 4,42 4,45 4,48 4,50 4,53 4,56 4,59 4,61 4,64 4,67 4,69 4,72

40 50 60 70 80 90 99

4,75 4,77 4,80 4,82 4,85 4,87 4,90 4,92 4,95 4,97 5,00 5,03 5,05 5,08 5,10 5,13 5,15 5,18 5,20 5,23 5,25 5,28 5,31 5,33 5,36 5,39 5,41 5,44 5,47 5,50 5,52 5,55 5,58 5,61 5,64 5,67 5,71 5,74 5,77 5,81 5,84 5,88 5,92 5,95 5,99 6,04 6,08 6,13 6,18 6,23 6,28 6,34 6,41 6,48 6,55 6,64 6,75 6,88 7,05 7,33 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

7,33 7,37 7,41 7,46 7,51 7,58 7,66 7,75 7,88 8,09