Manual de Prcticas de Microbiologa Blgo. Luis Cartagena S.

Prctica:

Accin de los Agentes Qumicos sobre los Microorganismos

Las sustancias qumicas pueden actuar sobre los microorganismos en varias formas, dependiendo de la composicin fsico-qumica del medio ambiente, la concentracin, la temperatura y el tiempo que dura el contacto. Pueden actuar mostrando una accin bactericida mediante la eliminacin total de los microorganismos, o accin bacteriosttica mediante inhibicin temporal del crecimiento bacteriano. Objetivo: Determinar la accin de algunos agentes qumicos sobre los microorganismos. Muestra Biolgica:

Cultivo bacteriano en Staphylococcus aureus.

caldo

de:

Escherichia

coli,

Pseudomonas

sp.

Material y Medio de cultivo: Guantes, Mechero con ron de quemar y fsforo Placas de Petri con Agar Mller-Hinton Discos de papel de filtro estriles en una placa Torundas estriles dentro de un tubo Pinza de metal estril Plumn de tinta indeleble. Reactivo: Frascos con agentes qumicos: Alcohol al 70 % Fenol al 1 % Mercurio cromo al 2 % Cristal Violeta 1/1000 Merthiolate 1/1000, Leja 10%, Tintura de Yodo 10%, etc. Procedimiento: Encienda el mechero, protjase (guantes), acerque los materiales necesarios Introduzca una torunda estril dentro del cultivo microbiano y al retirar presione el algodn sobre las paredes del tubo para evitar que salga chorreando Siembre en toda la superficie del medio en la placa Luego de unos 5 minutos, previa sealizacin de los lugares donde se colocaran los discos (promedio entre 5 6 por placa) Con la pinza estril coja un disco de papel de filtro e introduzca en un agente qumico (tenga cuidado de no impregnar los discos demasiado), luego colquelo sobre el lugar predestinado y presione suavemente (no reubicar el disco desplazndolo) Haga lo mismo con los dems desinfectantes o agentes qumicos

Manual de Prcticas de Microbiologa Blgo. Luis Cartagena S.

Incube las placas a 37 C por 24 48 horas y observe lo obtenido. Resultados: Realice la medicin del dimetro de los halos de inhibicin formados y registre en la siguiente tabla:
AGENTE QUMICO TAMAO DE DIMETRO DEL HALO DE INHIBICIN DE CRECIMIENTO BACTERIANO

Escherichia coli

Pseudomonas sp

Staphylococcus aureus

Alcohol al 70 % Fenol al 1 % Mercurio cromo al 2 % Cristal Violeta 1/1000 Merthiolate 1/1000 Leja 10% Tintura de Yodo 10% Interpretacin: Generalmente el agente qumico desinfectante que muestre mayor dimetro de halo de inhibicin de crecimiento ser el que tenga mayor efectividad. Haga el esquema de lo observado.

Cuestionario: Mencione cual es el mecanismo de accin del Alcohol, Fenol, Mercurio Cromo, Cristal Violeta y Merthiolate? Mencione 3 sustancias colorantes de accin antibacteriana y 3 antimictica?

Manual de Prcticas de Microbiologa Blgo. Luis Cartagena S.

Cmo organizara un enfrentamiento de agentes qumicos pero frente a hongos? Prctica:

El Antibiograma
En los ltimos aos se ha observado diferentes comportamientos de resistencia bacteriana a los antibiticos, por ello es necesario establecer programas nacionales e internacionales de vigilancia de la resistencia de las bacterias a los antibiticos, utilizando pruebas de sensibilidad fidedignas que proporcionen datos comparables. La informacin microbiolgica y epidemiolgica disponible ayudar a los clnicos a seleccionar el agente antimicrobiano ms apropiado para tratar cada infeccin. Objetivo: Evaluar la capacidad de los antibiticos para inhibir in vitro el desarrollo bacteriano, tanto por el mtodo de difusin como por el mtodo de dilucin. Muestra Biolgica:

Cultivo bacteriano en caldo de: Escherichia coli, Pseudomonas sp. y Staphylococcus aureus comparables con el Tubo N 3 de la escala de Mc. Farland.

Material y Medio de cultivo: Guantes, Mechero con ron de quemar y fsforo Asa bacteriolgica o de Kolle Placas de Petri con Agar Mller-Hinton (con aproximadamente 20 ml de medio) Caldo Nutritivo Discos de sensibilidad impregnados con antibiticos y quimioterpicos. Torundas estriles dentro de un tubo Pinza de metal estril Tubos de ensayo de 13 x 100 mm estriles (10 tubos por microorganismo) Pipetas de 5 mL Gradillas Plumn de tinta indeleble. Reactivo: Solucin de antibiticos. MTODO DE DIFUSIN: El mtodo de disco-difusin en agar es una manera sencilla, prctica y rpida para realizar el antibiograma. El recomendado es el estandarizado por Kirby-Bauer, con el que se ha logrado uniformizar criterios que toman en cuenta los conceptos de concentracin mnima inhibitoria (MIC o CIM) y de concentracin promedio en sangre de las drogas frecuentemente usadas. Procedimiento: Encienda el mechero, protjase (guantes), acerque los materiales necesarios Introduzca una torunda estril dentro del cultivo microbiano y al retirar presione el algodn sobre las paredes del tubo para evitar que salga chorreando

Manual de Prcticas de Microbiologa Blgo. Luis Cartagena S.

Siembre en toda la superficie del medio Mller-Hinton en la placa Luego de unos 5 minutos, previa sealizacin de los lugares donde se colocaran los discos (promedio entre 5 6 por placa) Con la pinza estril coja un disco de sensibilidad impregnado con antibitico, luego colquelo sobre el lugar predestinado y presione suavemente (no reubicar el disco desplazndolo) Haga lo mismo con los dems discos con antibiticos o quimioterpicos Incube las placas a 37 C por 24 horas y observe lo obtenido.

Resultados: Despus del periodo de incubacin, realice la medicin del dimetro de los halos de inhibicin formado para cada antibitico ensayado y compare con la Tabla patrn. TABLA DE INTERPRETACIN DE LOS HALOS DE INHIBICIN DIMETRO EN mm DE LA CONCENTRA ZONA INHIBIT. CIN ANTIBITICO DEL DISCO RESISTEN INTERMED SENSIB (g) TE IO LE AMICACINA 10 < 11 12 - 13 14 > AMPICILINA 10 < 11 12 - 13 14 > Gram y 10 < 20 21 - 28 29 > enterococos Estafilococos y resistentes a penicilina. BACITRACINA 10 <8 9 - 12 13 > CARBENICILINA 50 < 17 18 - 22 23 > Proteus sp, E. coli 50 < 12 13 - 14 15 > P. aeruginosa CAFELOTINA 30 < 14 15 - 17 18 > CLORANFENICOL 30 < 12 13 - 17 18 > CLINDAMICINA 2 < 14 15 - 16 17 > COLISTINA 10 <8 9 - 10 11 > ERITROMICINA 15 <13 14 - 17 18 > GENTAMICINA 10 < 12 13 > KANAMICINA 30 < 13 14 - 17 18 > NEOMICINA 30 < 12 13 - 16 17 > NOVOBIOCINA 30 < 17 18 - 21 22 > PENICILINA G 10 < 20 21 - 28 29 > Estafilococos < 11 12 - 21 22 > Otros grmenes POLIMIXINA B 300 <8 9 - 11 12 > RIFAMPIN (slo para N. 5 < 24 25 > meningitidis) ESTREPTOMICINA 10 < 11 12 - 14 15 > TETRACICLINA 30 < 14 15 - 18 19 >

Manual de Prcticas de Microbiologa Blgo. Luis Cartagena S.

VANCOMICINA 30 <9 10 - 11 12 > AGENTE QUIMIOTERAPICO NITROFURANTOINA 300 < 14 15 - 16 17 > * AC. NALIDIXICO * 30 < 13 14 - 18 19 > AC. OXOLINICO TRIMETROPRIN / 1.25 / 23.75 < 10 11 - 15 16 > SULFAMETOXAZOL TRIPLE SULFA ** 300 < 12 13 - 16 17 > * Solamente para infecciones urinarias ** Solamente para infecciones urinarias. Todos los discos de sulfanilamidas de 250 300 g pueden ser interpretados similarmente. Interpretacin: La tabla patrn permitir considerar al germen como: SENSIBLE, INTERMEDIO o RESISTENTE a la accin del antibitico segn corresponda su medida de halo de inhibicin. Se reportan la valoracin de los antibiticos si sus medidas han cado en ese orden. Haga el esquema de lo observado.

Manual de Prcticas de Microbiologa Blgo. Luis Cartagena S.

Manual de Prcticas de Microbiologa Blgo. Luis Cartagena S.

MTODO DE DILUCIN: Para evaluar cuantitativamente la actividad de un antibitico puede agregarse diluciones de este a un caldo de cultivo o a un medio slido en el que luego se siembra el microorganismo problema. La concentracin ms baja que impide el crecimiento bacteriano se considera concentracin inhibitoria mnima (CIM o MIC) del frmaco. Procedimiento: Encienda el mechero, protjase (guantes), acerque los materiales necesarios Diluir el antibitico a la concentracin adecuada para trabajo (200 unidades por mL 500 g por mL segn sea el antibitico) Colocar 10 tubos de 13 x 100 mm estriles, numerados del 1 al 10 Con una pipeta de 5 mL estril, colocar 0,5 mL de caldo nutritivo en los tubos marcados del 2 al 10 Agregar 0,5 mL del antibitico al tubo 1 y 2, mezcle el contenido del tubo 2 y trasvasar (transferir) 0,5 mL al tubo 3, continuando hasta el tubo 9. Retirar 0,5 mL del tubo 9 y descartar; el tubo 10 no recibe antibitico y sirve como control Agregar a todos los tubos 0,5 mL de la cepa bacteriana (cultivo bacteriano en caldo) Incubar a 37C por 18 a 24 horas, observar lo sucedido.

Manual de Prcticas de Microbiologa Blgo. Luis Cartagena S.

Resultados: Realice la lectura e interpretacin de los resultados teniendo en cuenta la concentracin del antibitico que va desde la mitad de la concentracin dispuesta en la dilucin obtenida y en forma decreciente desde el tubo 1 al 10. Observar si hay o no crecimiento bacteriano. BACTERIA 1 CRECIMIENTO BACTERIANO EN EL TUBO N (indicar con + -) 2 3 4 5 6 7 8 9

10

Interpretacin: El tubo con la menor concentracin del antibitico que haya impedido el crecimiento bacteriano representar el MIC o CIM (Mnima Concentracin Inhibitoria), es decir la concentracin mnima del antibitico que inhibe el crecimiento bacteriano. Haga el esquema de lo observado.

Manual de Prcticas de Microbiologa Blgo. Luis Cartagena S.

Manual de Prcticas de Microbiologa Blgo. Luis Cartagena S.

Cuestionario: Citar 5 enfermedades microbianas y el antibitico utilizado en la actualidad? Los antibiticos muestran actividad eficaz contra infecciones virales, por que? Qu es la hipersensibilidad a la penicilina? Cul es el mecanismo de accin del cido nalidixico, cloranfenicol y de las cefalosporinas?

Manual de Prcticas de Microbiologa Blgo. Luis Cartagena S.

Prctica:

Actividad antimicrobiana de plantas medicinales (mtodo de difusin en placa excavada)

Ante la creciente demanda de productos naturales como productos energticos, suplementarios, nutricionales o de uso mdico y las evidencias de resistencia a los antibiticos con el poco acceso a estos, se hace necesario contar con alternativas efectivas contra los microorganismos, para ello es necesario determinar su capacidad antimicrobiana comparada con productos bioqumicos conocidos (antibitico) que puedan servir como opciones inmediatas para el tratar cada infeccin. Objetivo: Evaluar la capacidad antimicrobiana in vitro de extractos de plantas medicinales por el mtodo de difusin en placa escavada. Muestra Biolgica:

Cultivo bacteriano en caldo de: Escherichia coli y Staphylococcus aureus comparables con el Tubo N 5 de la escala de Mc. Farland.

Material y Medio de cultivo: Guantes, Mechero con ron de quemar y fsforo

Placas de Petri con Agar Mller-Hinton (con aproximadamente 20 mL de medio) Torundas estriles dentro de un tubo Sacabocado estril Pipetas de 2 mL Matraz con medio de cultivo fundido (agar Mller Hinton) Plumn de tinta indeleble Regla.

Reactivo: Solucin de antibitico

Extracto de planta medicinal.

Mtodo de Difusin en Placa Excavada: El mtodo de difusin en placa escavada es una manera sencilla, prctica y rpida para realizar la determinacin de la actividad antimicrobiana de un extracto de planta, proceso que tambin se puede evaluar mediante la tcnica de difusin simple en superficie de agar, pero permite un mejor manejo de los productos naturales a ensayar; as mismo, evaluar el efecto comparativo con un antibitico estndar. Procedimiento: Encienda el mechero, protjase (guantes), acerque los materiales necesarios Introduzca una torunda estril dentro del cultivo microbiano y al retirar presione el algodn sobre las paredes del tubo para evitar que salga chorreando

Manual de Prcticas de Microbiologa Blgo. Luis Cartagena S.

Siembre en toda la superficie del medio Mller-Hinton en la placa Luego de unos 5 minutos, realizar sealizacin de los lugares donde se realizarn las excavaciones (promedio entre 5 6 por placa) Con el sacabocado retirar medio de cultivo en las zonas pre-sealadas y luego colocar una gota del medio fundido en el fondo de cada excavacin, permitir que enfre y endurezca. Rellene cada pocillo o excavacin con un tipo de extracto de planta diferente o con diferentes concentraciones de un mismo tipo de extracto. Haga lo mismo con la solucin de antibitico referencial en uno de los pocillos. Incube las placas a 37 C por 24 horas y observe lo obtenido.

Resultados: Despus del periodo de incubacin, realice la medicin del dimetro de los halos de inhibicin formados y comprelo con el del antibitico patrn. Interpretacin: La presencia de halos de inhibicin del crecimiento microbiano indicar actividad antimicrobiana, y al avaluar comparativamente con la medida del halo de inhibicin formado con el antibitico patrn se determinar el porcentaje de inhibicin relativa (PIR) que evidenciara una similar o desigual actividad, permitiendo ser considerado con alternativa para el tratamiento de infecciones microbianas. Haga el esquema de lo observado.

Manual de Prcticas de Microbiologa Blgo. Luis Cartagena S.

Cuestionario: diferenciar agente bactericida de bacteriosttico? describa como se puede obtener el extracto de una planta medicinal mediante diferentes tcnicas?