MICROBIOLOGIA CLINICA 1 Manual de laboratorio

COLORACIONES
I. OBJETIVOS

Interpretar el fundamento de las coloraciones en la prctica microbiolgica. Ejercitar las tcnicas de coloracin simple y compuesta. Comprender los pasos necesarios para la realizacin de la Tincin de Gram y Zielh Neelsen para reconocer las bacterias grampositivas y las gramnegativas , as como las bacterias alcohol acido resistentes.(BAAR) , al igual que su aplicacin clnica.

II. INTRODUCCIN Un procedimiento til para el examen de muestras es el estudio microscpico de preparaciones fijas - extensiones o frotis - preparados a partir de ellas y coloreadas por el mtodo adecuado. Esto permite eliminar el movimiento que presentan los microorganismos en las preparaciones en fresco. La retencin de colorantes de alquitrn de hulla por las bacterias permite su fcil observacin bajo el microscopio. En general, las bacterias y otros microorganismos son transparentes, lo que dificulta su estudio cuando los exmenes se realizan en fresco. Por eso para distinguirlos del medio es necesario hacer una coloracin (tinciones simples), las cuales tambin sirven para contrastar o realzar distintas caractersticas morfolgicas o estructurales (tinciones diferenciales). La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por algn componente celular. Existen varios tipos de colorantes, pero los ms usados en microbiologa son: las sales colorantes y los colorantes liposolubles a) Sales colorantes: Los colorantes ms comnmente usados son sales que pueden ser de tipo cido o bsico, trminos que no indican necesariamente su pH en solucin, sino que una parte significativa de la molcula sea aninica o catinica. Los colorantes bsicos consisten en un catin coloreado unido a un anin incoloro. Ej: clorhidrato (-) de azul de metileno (+).Estos son los ms usados en microbiologa, ya que debido a la gran cantidad de ribosomas que contienen cido ribonucleico en todo el Protoplasma de la clula bacteriana, stas se tien fcilmente. Ej. Azul de metileno, fucsina bsica, cristal violeta. Los colorantes cidos tienen el catin incoloro unido a un anin coloreado. Ej: eosinato (-) de sodio (+).Estos colorantes tien material citoplasmtico, no son muy usados en Microbiologa. Por ejemplo: eosina, rojo congo, fucsina cida. Los colorantes neutros se obtienen cuando se mezclan colorantes cidos y bsicos, donde la carga elctrica de stos es cero. P ej. Giemsa, derivado de sal de amonio y eosina.

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Los colorantes se combinan qumicamente con el protoplasma bacteriano; si la clula no ha muerto, el proceso de tincin la mata. La clula bacteriana posee constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos, y ellos son los ms usados en citologa bacteriana. Las bacterias son ricas en cidos nucleicos que poseen cargas negativas en forma de grupos fosfatos. Los colorantes bsicos tien la clula bacteriana uniformemente, a menos que antes sea destruido el ARN del citoplasma. Los colorantes cidos no tien la clula bacteriana, y por lo tanto, pueden usarse para impartir al fondo un color de contraste (coloracin negativa). Desde el punto de vista prctico entonces, los colorantes bsicos tien estructuras de naturaleza cida, como la cromatina nuclear de las clulas eucariotas y procariotas; los colorantes cidos reaccionan con sustancias bsicas, como las estructuras citoplasmticas de las clulas eucariotas. b) Colorantes liposolubles Los colorantes liposolubles se combinan con los componentes lipdicos de la clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de los depsitos de grasa. Ej. Negro Sudn. En algunos casos se usan mordientes con la finalidad de engrosar estructuras muy finas, con el propsito de hacerlas visibles al microscopio ptico; uno de ellos es el cido tnico que se emplea en la coloracin de flagelos y espiroquetas. TIPOS DE TINCIONES Para la observacin microscpica existen diferentes tipos de coloraciones segn las caractersticas morfolgicas o estructuras que quieran ponerse de manifiesto. Se clasifican en simples y compuestas. TINCIN SIMPLE Se entiende por tincin (o coloracin) simple al teido de los microorganismos aplicando slo una solucin colorante. Este tipo de tinciones pueden ser positivas o negativas. La coloracin positiva es la tincin de los microorganismos, efectuada con colorantes bsicos que, como ya dijimos, poseen afinidad por los constituyentes celulares y se combinan qumicamente con el citoplasma microbiano. Esta tcnica de coloracin consiste en cubrir el frotis, despus de fijado, con la solucin colorante y se deja actuar el tiempo preciso. Luego se lava con agua y se deja secar. Con fucsina bsica: se diluye 1/10 la solucin de uso (fucsina fenicada de Ziehl) y se deja actuar 30 a 60 segundos. Con violeta de genciana: se diluye al 1/10 la solucin de uso y se deja actuar 30 a 60 seg. Con azul de metileno: se cubre el preparado con la solucin de uso (azul de metileno alcalino de Loeffler) sin diluir y se deja actuar 3 a 5 minutos. El azul de metileno es el colorante ms dbil de los tres, razn por la cual se usa ms concentrado y se deja actuar durante ms tiempo. Tambin a la solucin de azul de metileno de uso se le agrega un lcali (KOH) como intensificante, que acta haciendo ms rpida e intensa la reaccin de coloracin. Generalmente como intensificante se usa un lcali para un colorante bsico y un cido para un colorante cido. Debido a que el protoplasma bacteriano tiene una dbil carga negativa que aumenta al aumentar el pH, se explica que en medios alcalinos las coloraciones de bacterias se hagan ms intensas. En la coloracin negativa los microorganismos quedan sin teir y se colorea el medio que los rodea. Por lo tanto, lo que se ve es el perfil de las clulas. La sustancia usada para la tincin

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negativa es un colorante opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea a las clulas, tal como: Tinta china (suspensin de partculas de Carbono coloidal demasiado grandes como para penetrar en la bacteria) Colorantes cidos (no poseen afinidad por los constituyentes celulares). El ms utilizado es la nigrosina dado que ofrece un mayor contraste por ser negro. La coloracin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de los microorganismos en microscopa ptica, pero su mxima utilidad est en revelar estructuras como cpsulas tanto bacterianas como de levaduras, esporas que se observan como cuerpos refringentes y espiroquetas que, por su pequeo dimetro transversal, resulta difcil ponerlas en evidencia. Mtodo de Burri (con tinta china o nigrosina). Se coloca en un extremo del portaobjetos una gota de tinta china o nigrosina y otra de la suspensin microbiana y se mezclan bien con el asa. Luego, con otro porta se apoya sobre la mezcla y se hace un extendido a lo largo del porta. Con este procedimiento el espesor del frotis va disminuyendo a medida que se extiende, con lo cual se conseguir una zona donde el contraste sea el adecuado. Se deja secar bien y se observa con el objetivo de inmersin.

TINCIN COMPUESTA O DIFERENCIAL Aunque existen mltiples tipos de tinciones, aqu vamos a referirnos a los dos mtodos de coloracin compuesta ms comnmente empleados en la prctica corriente del laboratorio de microbiologa: la tincin de Gram y la de Ziehl-Neelsen. Estas coloraciones permiten diferenciar las bacterias incluso cuando tienen igual forma y tamao, por esta razn es una tincin diferencial. TINCIN DE GRAM La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva (con pared celular gruesa) a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa (con pared celular fina y membrana externa) a las que se visualizan de color rosa o rojo. La mayora de las bacterias presentan una de estas dos morfologas generales. Aunque no totalmente aclarada, la propiedad de la grampositividad depende de la naturaleza y composicin qumica de la pared o parte de ella. Se han propuesto varias teoras para su explicacin, pero la ms aceptada es la que sostiene que las bacterias gramnegativas son ms permeables al alcohol debido a su alto contenido en lpidos. Cuando la bacteria se tie con el complejo colorante bsico-mordiente, ste queda atrapado en las bacterias grampositivas y no puede ser arrastrado por el decolorante a causa de la naturaleza fsico-qumica de su pared, por el contrario, en las gramnegativas es arrastrado debido a su alto contenido lipdico. La clave es la capa de peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, las Grampositivas lo poseen en mucha mayor proporcin que las Gram negativas.

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TINCION DE ZIEHL NEELSEN La tincin de Ziehl-Neelsen es una tcnica de tincin diferencial que se basa en que las paredes celulares de ciertas bacterias contienen cidos grasos (cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracin con alcohol-acido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Las micobacterias absorben los colorantes solo muy lentamente debido a la elevada proporcin de ceras y lpidos en la pared celular. Para acelerar la absorcin del colorante fuscina y as la formacin del complejo micolato fuscina en la pared celular, se calienta la solucin de fuscina fenicada aplicada sobre el preparado normalmente hasta la formacin de vapores. Una vez que las micobacterias han absorbido el colorante, difcilmente lo ceden a pesar del tratamiento con solucin decolorante alcohol-cido clorhdrico. Por esto se denominan bacilos alcohol acido resistente o BAAR y aparecen en el preparado microscpico teidas de rojo, mientras que todos los microorganismos no resistentes a los cidos se tien de acuerdo con la contratincin.

III.

MATERIAL Y SUBSTANCIAS Portaobjetos. Mechero Bunsen. Lpiz graso. Hisopos. Aceite de inmersin. Lugol. Safranina. - Alcohol Acido 3% Cultivos bacterianos: A, B y C.

Gradilla. Asa bacteriolgica. Cerillos encendedor. Papel absorbente. Microscopio. Cristal violeta. Alcohol al 95%. - Fucsina fenicada bsica - Azul de metileno

IV.

TECNICA

Realizar un frotis o extendido a partir de los cultivos dados y proceder a las coloraciones de acuerdo a las tablas siguientes:

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1. TINCION DE GRAM Tabla 1. Etapas en la tincin de Gram Pasos Mtodo

Cristal Violeta (luego de minuto se lava con agua el exceso de colorante) 1 Se tie de violeta Se tie de violeta

Gram Positiva

Gram Negativa

Colorante bsico

Mordiente

Lugol (pasado 1 min. se lava con agua el exceso de lugol)

Permanece violeta

Permanece violeta

Decoloracin

Alcohol de 95% o Alcoholacetona (durante aprox. 30 seg. y luego lavar con agua para eliminar el resto de disolvente)

Permanece violeta

Se decolora

Contraste

Fucsina o Safranina (luego de 30 seg. Se lava con agua el exceso de colorante)

Permanece violeta

Se tie de rosa

Observar al Microscopios

Colocar sobre el frotis una gota de aceite de inmersin.

Se observa violeta

Se observa rosa

Dibujar lo observado:

CULTIVO

CULTIVO B

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2. TINCION ZIEHL NEELSEN Tabla 2. Etapas en la tincin de Ziehl Neelsen

Pasos

Mtodo

Acido-Alcohol Resistente

No Acido-Alcohol Resistente

Colorante bsico

Fucsina

Calor

Calentar la preparacin hasta que aparezcan humos blancos. Lavar con abundante agua el exceso de colorante

Se tie de rosa

Se tie de rosa

Decoloracin

Alcohol clorhdrico (aprox. 30 seg. Y lavar el resto de decolorante)

Permanece rosa

Se decolora

Contraste

Azul de metileno (luego de 30 seg. Se lava con agua el exceso de colorante)

Permanece rosa

Se tie de azul

Observar al Microscopios

Colocar sobre el frotis una gota de aceite de inmersin.

Se observa rosa

Se observa azul

Dibujar lo observado:

CULTIVO C