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Biotechnologies animales et vgtales

Transgense vgtale et applications


Sommaire

Introduction! 1 - Une nouvelle approche: la transgnse vgtale! 2- Les diffrentes tapes de la transgnse! 3 - La construction gnique!
a - Gne d'intrt b - Marqueur de slection

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4 - Mthodologies de transfert de l'ADN chez les vgtaux!


a - Transfert indirect b - Vectorologie et protocole de transformation c - Transfert direct

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5 - Quelques applications!
a - Rsistance aux insectes b - Tolrance aux herbicides c - Ramolissement des fruits d - Riz enrichi en -carotne e - Modication de l'amidon f - Production de molcules d'intrt pharmaceutique

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Introduction
Amlioration des plantes: * Domestication des plantes sauvages L'homme la pratique depuis trs longtemps * Amlioration des plantes * Critres de slection Augmentation du rendement, de la qualit. Rsistance des stress biotiques et abiotiques Mais il y a des limites: * Barrires interspciques * Gnes intressants lis d'autres gnes prsentant des caractres non dsirs * Caractre polygnique

1 - Une nouvelle approche: la transgnse vgtale


* OGM: organisme dont le matriel gntique est modi d'une manire qui ne s'eectue pas naturellement par multiplication et/ou par recombinaison naturelle

* Transfrer une squence connue la plante Cette squence va tre introduite dans le gnome de la plante. On connat au pralable la squence qu'on introduit * Intgration de manire stable dans le gnome de la plante Obtenir des nouvelles varits avec des fonctions prdnies Apporter des fonctions nouvelles La transgense est possible, car tous les organismes vivants et les virus possdent le mme systme de codage et d'expression de l'information gntique

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Les cultures transgniques ont surtout des rsistances aux insectes et des tolrances aux herbicides Les 4 plantes les plus concernes par les OGM: - Coton - Soja - Maize - Canola Les tats-Unis remportent la palme du pays qui ralise le plus dOGM

2- Les direntes tapes de la transgnse


1re tape: identier le gne d'intrt On connait la squence, la fonction et ce que cela peut apporter la plante 2me tape: raliser une construction gnique 3me tape: transformation de la plante et rgnration par culture in vitro 4me tape: Caractrisation des transformants. Tri des individus ayant les meilleurs caractristiques. Transfert et analyse en serre et au champ. Demande d'autorisation. La caractrisation passe par une analyse molculaire

3 - La construction gnique
* Gne d'intrt fonction On part d'un eucaryote, on utilise l'ADNc (copie d'ADN double brin partir d'un ARNm). On utilise pour cela une enzyme (ADN polymrase ARN dpendante) qui va induire une "reverse transcription". On utilise l'ADNc, car il n'y a plus de squence intronique donc il est plus facile manipuler ou transfrer. Il n'y aura plus besoin d'pissage, car il pourrait tre aberrant sil a lieu dans un organisme autre que celui normalement destin * Marqueur de slection slection des cellules, tissus transforms Il faut trs vite slectionner les tissus transforms, car si on repique des plantes non transformes, les coups seront trs chers (main d'oeuvre) * Direntes parties sont clones dans un vecteur (E.Coli) - Enzymes de restriction, PCR... - Ligature dans un vecteur - Transformation de cellules E.Coli comptentes - Analyse des recombinants E.Coli

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a - Gne d'intrt

* Squence codante * Promoteur fort et constitutif Constitutif: sera actif dans tout les organes de la plante Exemple d'un promoteur fort : 35S du Virus de la Mosaique du Chou-eur (trs utilis pour la transformation de dicotyldones). C'est un virus ADN qui attaque les crucifres. Pour la multiplication, le virus passe par un intermdiaire ARN Promoteur d'un gne actine ou ubiquitine.: ce sont des promoteurs fort pour les monocotyldones On peut avoir des promoteurs tissu spcique, qui vont tre exprim que dans certains endroits de la plante (que dans le tubercule pour la pomme de terre par exemple) * Squence de terminaison * Peptide signal... On utilise un peptide signal si on veut adresser une protine un compartiment donn lorsque c'est ncessaire

b - Marqueur de slection

* Promoteur, squence codante, squence de terminaison * Gne de rsistance un antibiotique Exemple: nptII (nomycine phosphotransfrase) dtoxie des antibiotiques de la famille des aminoglycosides. Transfert d'un groupement phosphate sur l'antibiotique et lorsqu'il est phosphoryl, il n'a plus d'action. Il n'est plus utilis aujourd'hui, car on a peur des transferts de gnes dans le tractus digestif du btail du gne chez les bactries * Gne de tolrance un herbicide * Marqueur de slection positive Exemple: manA (phosphomannose isomrase). On met du mannose dans le milieu de culture, le mannose est absorb par la cellule et est transform en mannose-6-phosphate par l'action d'une hexokinase, mais l'inconvnient ensuite c'est que le man-6-phosphate, mais les plantes qui possdent le gne de la phosphomannose isomrase vont le mtaboliser en fructose-6-phosphate qui sera assimilable par l'organisme

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4 - Mthodologies de transfert de l'ADN chez les vgtaux


Transfert direct ou transfert indirect

a - Transfert indirect

* Bactrie - Agrobacterium tumefaciens - Agrobacterium rhizogne provoque un chevelu racinaire (hairy root). Utilisation de racines transformes scrtant molcules d'intrt * Virus Agrobacterium thumefaciens: provoque la formation de tumeur Bactrie phytopathogne tellurique de la famille des Rhizobiaces (elle infecte plus de 90 familles de dicotyldone, peu de monocotyldones) Le pouvoir pathogne est situ sur le plasmide pTi (Tumeur indicing): - Il se trouve en 1 ou 2 copies dans chaque bactrie - Il est trs grand 200 400 Kpb

On distingue plusieurs rgions: ADN-T: le T pour transfert, car c'est cette rgion qui va tre transfr depuis la bactrie jusqu' l'ADN du noyau vgtal. Il n'y a aucune fonction qui permet le transfert sur l'ADN vgtal et donc il est a distinguer d'un transposon 25 bp repeats (FD et FG): ce sont les frontires gauche et droite par rapport l'ADN-T. Ce sont des squences rptes imparfaites de petite taille (25 pb) qui dlimit l'ADN-T et donc c'est ce qu'il se trouve entre ces frontires qui va tre transfr la cellule vgtale
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Gnes de virulence: il se trouve soit sur le chromosome ou la rgion Vir Ce sont eux qui permettent le transfert de l'ADN-T dans la cellule vgtale

L'ADN-T contient des oncognes

* Gnes de synthse d'auxine (iaaM et iaaH) La synthse d'auxine se fait partir du tryptophane, grce au iaaM, le tryptophane donnera indolactamide qui subit l'indolactamide hydrolase et le gne iaaH pour donner l'acide indolactique * Gne de cytokinine (ipt) ipt: isopentmyltransfrase * Gnes modulant l'eet de l'auxine et/ou des cytokinines * Gnes de synthse d'opines On les retrouve que chez les organismes infects par les Agrobactrium. On classe les Agrobacteriums en souche selon le type d'opine qu'elles sont capables de faire exprimer la plante infecte Suite une blessure de la plante, A.tumefaciens transfre l'ADN-T dans le noyau de la cellule vgtale Le transfert de l'ADN-T s'eectue grce aux gnes de virulence

* L'ADN-T ne porte aucune fonction permettant son transfert vers la cellule vgtale * Les gnes de virulence sont localiss sur: - Le chromosome - La rgion Vir Le transfert de l'ADN-T

Initi lorsque la bactrie peroit des composs phnoliques (substances chimiotactiques; actosyringone) et des sucres relargus par les cellules vgtales blesses. La bactrie s'attache la cellule vgtale grce un rseau de bres de cellulose (synthtis par la bactrie) Transduction du signal et induction des gnes de virulence

* VirA est un chimiorcepteur membranaire de composs phnoliques s'autophosphoryle * VirA phosphoryle phosphoryle VirG * VirG phosphoryle induit sa propre expression et celle des autres gnes de virulence Formation d'un complexe multiprotique VirD4 et VirB1-11 qui constitue une structure en forme de pilus qui assure le transport de l'ADN-T Les protines VirD1 et VirD2 coupent l'ADN-T au niveau des frontires droite et gauche La protine VirD2 se lie de manire covalente l'extrmit5' du monobrin d'ADN-T
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L'ADN-T est transfr la cellule vgtale sous forme de monobrin

La bactrie gauche et la cellule vgtale droite Les protines Vir E2 se lient sur toute la longueur de l'ADN-T, dans les cellules vgtales Les gnes situs sur l'ADN-T sont exprims dans la cellule vgtale Les protines Vir D2 et Vir E2 permettent l'entre de l'ADN-t

b - Vectorologie et protocole de transformation

Systme binaire

* Clonage (dans E.Coli) du gne d'intrt et du marqueur de slection dans un vecteur d'expression contenant les squences frontire droite et gauche * L'agrobactrie contient un plasmide pTi dsarm sans l'ADN-T qui cause le cancer chez les plantes, mais qui conserver les gnes de virulence qui permettent le transfert de l'information gntique dans la cellule vgtale * Le vecteur d'expression est transfr de E.Coli jusqu' l'agrobactrie (conjugaison, lectroporation) * Les protines Vir agissent sur l'ADN-T situ sur le vecteur d'expression et permettent son transfert vers la cellule vgtale

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La transformation par Agrobactries

* Agrobactries en prsence des explants vgtaux (actosynragone) * Transfert sur milieu de culture in vitro adapt la plante * Coculture, car milieu de culture adapt la plante et/ou pousse aussi la bactrie * Transfert sur un milieu de slection contenant un antibiotique pour liminer les agrobactries et l'agent de slection * Rgnration de plantules par culture in vitro en prsence de l'agent de slection * Contrle de la transformation, est-ce que le transgne est prsent ? Est-ce qu'il s'exprime ? Est-ce
que la protine attendue est elle exprime? Quels sont les individus avec les meilleures caractristiques?

c - Transfert direct

* L'lectroporation

Elle est pratique sur des protoplastes. Ces protoplastes sont mis en prsence de l'ADN qu'on souhaite transfrer on place ensuite les protoplastes dans une cuvette d'lectroporation strile on place cette cuvette dans l'lectroporateur ensuite on fait de la culture in vitro formation de cals indirencis rgulateurs de croissance : auxine, cytokine rgnration in vitro de plantules * Impulsions lectriques (plusieurs centaines de volts, quelques millisecondes) * Dirence de potentiel dsorganisation de la membrane * L'ADN pntre par les pores forms dans la membrane plasmique * L'ADN s'intgre au hasard dans le noyau * La biolistique

Utilisation d'un canon particules. Bombardement de billes de tungstne ou d'or qui sont recouvertes de l'ADN qu'on souhaite transfr la cellule vgtale
Le bombardement sous un ux d'hlium sous vide partiel pour ne pas que les billes soient freines par l'air. L'avantage c'est qu'on peut utilis directement des explants vgtaux (feuilles, tiges...) et non pas forcement des protoplastes qui ne se rgnrent parfois pas en plantule

Les particules pntrent dans la cellule, plus ou moins profondment. L'ADN s'intgre dans le noyau. Rgnration de plantes in vitro

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5 - Quelques applications
! ! a - Rsistance aux insectes

La chenille de la pyrale du mas: mise en vidence d'une endotoxine de Bacillus thuringiensis lorsque la bactrie sporule. Protines Cry (endotoxine) spcique des coloptres, lpidoptres et diptres Mode d'action de l'endotoxine: La protine est ingre par l'insecte et dans le tube digestif se lient un rcepteur membranaire des cellules pithliales de l'insecte. La protine Cry sera active par une protase et suite cette activation, elle forme la formation de pore dans les membranes de ces cellules pithliales. La consquence c'est que l'insecte perde l'apptit et l'insecte meurt *Risques

* Flux de gne: dissmination non contrle des transgnes (pollen, semence) donc risque pour l'environnement * Choix de l'agriculteur et du consommateur pour la culture conventionnelle, OGM ou biologique * Toxicit vis--vis d'insectes non cibls Le papillon monarque est un emblme aux tats-Unis. On remarqu que le pollen de mas transgnique venait se poser sur d'autres plantes que venait butiner cet insecte, et il mourait * Apparition de rsistance chez les insectes Les plantes transgniques n'auraient plus d'effet

*Comment retarder l'apparition de rsistance?

* Utilisation d'une varit conventionnelle sur une partie des surfaces cultives de mas Bt zone refuge: rservoir d'insectes sensibles * Si refuge: insectes SS du refuge descendance SS ou SR tue dans champs transgniques (S = sensible ; R = rsistance) * Absence de refuge: individus SR et RR s'accouplent entre eux -> descendance SR et RR. Mais Bt sans eet ! *Bilan

* Hutchinson et al., 2010 (Science) * volution populations de pyrales et bnces agricoles en 1996 et 2009 * Culture du mas Bt prote aux agriculteurs n'ayant pas choisi mas transgnique, car le fait qu'il y a moins d'insectes, les plantes non transgniques ne se font plus dtruire par
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les insectes et ces semences non transgniques coute moins cher donc c'est plus rentable, mais ceci est grce aux agriculteurs qui ont fait de l'agriculture transgnique

b - Tolrance aux herbicides

Qu'attend-on d'un herbicide?


Il doit tre ecace Peu de risque pour l'environnement Il faut qu'il soit spcique (pas comme le round-up qui tue tout)

Tolrance au glyphosate (round up) Tolrance au glufosinate *Tolrance au glyphose

* Le glyphosate inhibe la 5-nol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) Le EPSPS intervient dans la synthse des acides amins aromatique * Enzyme chloroplastique code par un gne nuclaire (plantes) L'enzyme est synthtis dans le cytoplasme, mais est adress au chloroplaste * Mutant de Salmonella typhimurium tolrant au glyphosate Mutation qui donne une protine EPSPS qui montre une afnit moins grande pour le glyphosate Aaiblir la sensibilit de la plante l'herbicide Mas GA21 (Syngenta Seeds): * mEPSPSynthase de mas (99,3% d'homologie avec le gne sauvage) * Promoteur d'un gne d'actine du riz; squence d'adressage au chloroplaste; squence de terminaison: nos 3' * Bombardement de particules (fragment 3,4 kb) * Aucun marqueur de slection on applique directement le round up Mas NK603 (Mas Roundup Ready): EPSPS de A.tumefaciens : squence modie pour contenir codons prfrentiellement utiliss par la plante 2 cassettes d'expression: Promoteur 35 S avec rgion activatrice duplique; intron HSP70 de mas; peptide signal d'adressage au chloroplaste de EPSPS d'A.thaliana; nos 3' Promoteur d'actine 1 de riz avec intron associ; peptide signal de EPSPS d'A.thaliana; nos3' La transformation s'est faite par biolostique. Autorisation pour importation pour UE. Interdit la culture en UE
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tude toxicologique: Sralini et al, 2012. Food and Chemical Toxicology (available 19 semptember 2012 on line) Dispositif exprimental: 100 rats mles, 100 rats femelles rpartis en 10 groupes de 10 animaux 1 lot: nourris avec mas non OGM et eau du robinet 3 lots nourris avec 11, 22 ou 33% de mas OGM trait avec Roundup 3 lots nourris avec 11, 22 ou 33 % de mas OGM non trait avec Roundup 3 lots nourris avec mas non OGM et eau avec 3 concentrations direntes de Roundup Dure de l'exprimentation : 2 ans. valuation de mortalit, pathologies, caractres biochimiques Des rsultats et des critiques: - Augmentation de la mortalit - Dveloppement de tumeurs mammaires - Congestion, ncrose du foie, pathologies rnales chez mles Perturbations hormonales dues au Roundup et mas OGM Mais: - Faiblesse des tests statistiques, nombre d'animaux utiliss - Choix de la ligne de rats ligne de rat qui a tendance dvelopper des tumeurs
*Tolrance

au glufosinate

* Analogue du glutamate * Bialaphos (phyn, antibiotique produit par Streptomyces viridochromogenes. Inhibe la glutamine synthtase enzyme qu'on trouve chez les bactries, seul enzyme qui permet de mtaboliser l'ammonium. Cela dit l'excs d'ammonium est toxique donc la plante meurt * Gne-bar (bialaphos rsistance) codant une phosphinotricine actyltransfrase (permet de transfrer un groupement sur la phosphinotricine qui ne peut plus inhiber la glutamine synthtase * Phosphinotricine actyle est inactive sur le plan herbicide dtoxication de l'herbicide Risques: * Flux de gnes entre plantes transgniques et non transgniques dans parcelles voisines coexistence OGM, plantes conventionnelles ou bio * Flux de gnes vers les plantes adventices, autres espces * Repousse si on change de culture, l'ancienne rsistante ne pourra plus tre limin avec l'insecticide * Apparition de rsistance de ces plantes vis--vis de l'herbicide
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c - Ramolissement des fruits

* Tomates Flavr Savr ou Mac Gregor (1994) premier aliment transgnique mis sur le march * Cible: polygalacturonas produite au moment o le fruit commence murir. Elle dpolymrise les pectines et le fruit ramollit * Approche anti-sens * Tomate reste ferme (stockage, transport...) Production des lycopnes le transgne n'agit que sur le ramollissement du fruit

d - Riz enrichi en -carotne

* Envisag pour la dcience en vitamine A -carotne prcurseur de la vitamine A * Enrichir le riz en provitamine A * Approche impossible par slection classique * Riz ne contient pas de -carotne, mais contient son prcurseur (granyl-granylpyrophosphate) Biosynthse des carotnodes:

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Un prototype: synthse de -carotne dans l'endosperme de riz 2 x Granyl-granyl pyrophosphate (phytone synthase) Phytone (Phytone dsaturase) -carotne (Lycopne -cyclase) carotne (1,6microgramme de carotnodes/g) Amliorations du prototype: * Augmenter la quantit de -carotne * Enlever le gne de rsistance l'antibiotique * optimiser le choix des gnes * Validation dans d'autres varits de riz * Laboratoires publics et privs (Syngenta, Zeneca) Du prototype au Golden Rice I et II:

Analyse de dirents gnes psy dans cals de mas:

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Analyse de gnes psy dans le riz:

Essai aux champs (Louisiane) en 2004 et 2005 Rtrocroisements GR1 et GR2 dans le riz indica. Avril 2008: essai au champ aux Philippines

e - Modication de l'amidon
Amylose (20 30%): chaines linaires de glucose relies par des liaisons alpha-1,4 glucosidiques Amylopectine (70 80%): chanes ramies (liaisons alpha-1,6 glucosidique) *Biosynthse de l'amidon

AGPase : ADP-glucose pyrophosphorylase amidon synthase (SS) enzyme de branchement (SBE) amidon synthase lie au grain (GBSS) * Utilisations: colles, gliants, textiles, emballages, produits cosmtiques, enrobage des comprims * Direntes approches: - Augmentation de la quantit d'amidon (surexpression de AGPase) - Enrichissement en amylose ou en amylopectine (en utilisant l'approche antisens) Pomme de terre "Amora" * BASF Plant Science * Pomme de terre fculire Prvalent. EH92-527-1 * Amylopectine: 98 % ; amylose: 2% * Autorisation de la commission europenne le 2 mars 2010 pour - Utilisation des co-produits pour l'alimentation animale
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Culture et utilisation industrielle

Construction et transformation: * ARN antisens de BBSS. Provoque dgradation de lARNm * Rsistance kanamycine * Transsformation par A.tumefaciens * Protine GBSS non dtectable * Protine NPTII non dtectable dans amidon, ni bouilli 1 minute valuation de l'impact sur la sant humaine: * Risque associ NPTII: - Souris: administration de dose leve - Milieu digestif de ruminants - Simulation milieu digestif humain * Risque associ au transfert de rsistance NPTII - NPTII ubiquitiste (tube digestif de l'Homme et animaux, environnement) - Ncessit de franchissement de barrire gntique bactrienne - Systme d'expression eucaryote

f - Production de molcules d'intrt pharmaceutique


* Demande croissante de protines humaines, molcules d'intrt pharmaceutique, anticorps... * Production dans les microorganismes, mais certaine modications post-traductionnel sont direntes chez certaines bactries * Production dans les animaux transgniques ou cultures cellulaires animales mais les cots sont exorbitant et on n'est jamais l'abri de contaminer la culture par des virus, prions * Production dans les plantes, une alternative intressante, car pas de pathogne animaux chez les vgtaux (plus au niveau de la scurit sanitaire) Quelques exemples: * Avidine * Trypsine: protase utilise dans l'industrie pharmaceutique * Lipase gastrique (Meristem therapeutics): lipase recombinante canine Planticorps (anticorps) : Dirents types: igG, igA scrtoire... Pour avoir les 2 chaines. On transforme une plante qui synthtise la chaine lourde, une autre la chaine lgre ensuit on croise les 2 plantes
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Production dans les plantes, mais...: * N-glycosylation (dirente entre les protines des animaux et les protines des vgtaux). Elles sont ralises dans le rticulum endoplasmique qui sont communes aux 2 rgnes. C'est dans la dernire phase de l'appareil de Golgi que les 2 voies divergent. A partir de la N-actylglucosamine transfrase que les voies dire Prsence d'oligosaccharides typiquement vgtaux Dirences au niveau des N-glycosylations: * Addition de (1,2)-xylose et alpha (1,3)-fucose (alpha (1,6) fucose chez les mammifres) * Absence d'acide neuraminique chez les vgtaux (rsidu terminal x sur galactose chez les mammifres) Quels risques? * Quelle utilisation de la protine recombinante? * Allergnicit Quelles solutions? * Modier la squence peptidique pour supprimer les N-glycosylations * Retenir les protines au niveau du rticulum endoplasmique (KDEL, HDEL) * Inhiber la N-actylglucosaminyltransfrase * Exprimer de nouvelles glycosyltransfrases pour "humaniser" les protines produites dans les plantes (ex: galactosyltransferase animale)

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