FEAD Centro de Gesto Empreendedora

CITOMETRIA DE FLUXO

Belo Horizonte 2012

Introduo A citometria de fluxo um recurso emergente na medicina veterinria que permite uma anlise rpida, objetiva e quantitativa de clulas em suspenso (manuteno de clulas em meio de cultura lquido em fluxo). As clulas da amostra em suspenso so marcadas com anticorpos monoclonais especficos ligados a fluorocromos (substncias que absorvem luz ultravioleta e emitem luz visvel, ou seja, ficam fluorescentes), que permitem a identificao e a quantificao de clulas pelo tamanho, granulosidade e intensidade de fluorescncia (parmetros 3, 4 e 5). METODOLOGIA DA CITOMETRIA DE FLUXO Citmetro de fluxo Possui 5 principais componentes: Um fluxo de clulas; Uma fonte de luz: normalmente so usadas lmpadas (mercrio, xnon); lasers de alto poder (argon, Kripton); lasers de baixo poder (argon (488nm), red-HeNe (633nm), green-HeNe, HeCd (UV)) e lasers de diodo (azul, verde, vermelho e violeta); Um detector e conversor de sistema analgico para digital (ADC): gerando parmetros de tamanho e complexidade, assim como sinais fluorescentes; Um sistema de amplificaes: linear ou logartmico; Um computador para anlise de sinais. O citmetro de fluxo um aparelho utilizado para avaliao da emisso de fluorescncia das clulas. Alguns aparelhos so capazes de separar fisicamente as clulas, de acordo com as caractersticas citomtricas. As clulas da amostra em suspenso so marcadas com reagentes fluorescentes especficos para deteco de molculas de superfcie e so introduzidas numa cmara de fluxo vibratria. As clulas, uma vez em suspenso, so orientadas em um fluxo laminar e interceptadas uma a uma por um feixe de luz (LASER). Um nmero de detectores so apontados ao local onde o fluxo passa atravs do feixe de luz; um na linha do feixe de luz (Forward Scatter ou FSC) e vrios perpendiculares a este (Side Scatter ou SSC) alm de um ou mais detectores fluorescentes. Cada partcula suspensa passando atravs do feixe dispersa a luz de uma forma, e os fluorocromos fluorescentes encontrados na partcula podem ser excitados emitindo luz de menor frequncia do que o da fonte de luz. Esta combinao de luz dispersa e fluorescente melhorada pelos detectores, e analisando as flutuaes de brilho de cada detector (uma para cada pico de emisso fluorescente) possvel explorar vrios tipos de informao sobre a estrutura fsica e qumica de cada partcula. O citmetro de fluxo dividido em 3 sistemas: sistema fluido, sistema ptico e sistema eletrnico. Sistema Fluido: introduz e alinha as partculas em um fluxo contnuo;

 Sistema ptico: gera e coleta sinais de luz. O sistema composto por um laser e lentes para moldar e alinhar o feixe do laser. A coleo de lentes serve para captar a disperso e a luz fluorescente emitida pelas partculas que interagem com o feixe de laser. Um sistema de espelhos pticos e filtros direcionam os comprimentos de ondas da luz para os detectores pticos especficos; Sistema Eletrnico: converte os sinais pticos em sinais eletrnicos, disponibilizando-os para anlise no computador. A medida de cada detector determinada por parmetro: Parmetro 1 (Forward scatter FSC): avalia o tamanho relativo da clula. Parmetro 2 (Side Scatter SSC): avalia a granulosidade ou complexidade interna da clula. Parmetro 3 (FL1 fluorescncia 1): capta luz de comprimento de onda 530nm, que coresponde a luz verde. Parmetro 4 (FL2 fluorescncia 2): capta luz de comprimento de onda 570nm, que coresponde a luz laranja. Parmetro 5 (FL3 fluorescncia 3): capta luz de comprimento de onda 650nm, que coresponde a luz vermelha. Obs: Fluorescncia o comprimento de onda gerado pela excitao dos fluorocromos, aps atingir a absoro mxima da luz do laser, onde a avaliao da intensidade de fluorescncia ocorre para deteco de antgenos de superfcie diferentes marcados com anticorpos monoclonais especficos ligados a compostos qumicos fluorescentes ou fluorocromos. Preparao da amostra A coleta e o processamento da amostra variam de acordo com o tipo celular a ser analisado, o local de onde proveniente e o mtodo de ensaio. Vrios anticoagulantes como o EDTA, citrato de sdio e heparina tm sido utilizados com sucesso. O volume de amostra necessrio para anlise, geralmente, de 100L de sangue perifrico ou medula ssea. Clulas danificadas ou mortas alteram as propriedades de tamanho e granulosidade nos grficos e ligao inespecfica de anticorpos monoclonais. Portanto, o sangue deve ser refrigerado e processado at 24 horas aps a coleta da amostra. O mtodo bsico do processamento de amostras por meio da citometria de fluxo comum na maioria dos ensaios. Geralmente, as clulas so incubadas por 30 a 60 minutos com um anticorpo marcado com fluorocromo ou somente com um anticorpo monoclonal especfico. Marcadores: Antgenos superfcie celular (marcadores CD) Cluster of differentiation (CD) o conjunto de molculas marcadores da superfcie celular usado para diferenciar variados tipos de clulas. Cada CD refere-se a uma determinada molecula de superficie celular caracterizada por um conjunto de anticorpos monoclonais padronizado pelos comits internacionais. ALGUNS MARCADORES: CD3 - Presente no citoplasma e posteriormente na membrana de 95% dos timcitos.

 CD4 - 55% a 65% das clulas T perifricas maduras, especialmente no subtipo auxiliar, mas tambm em moncitos, macrfagos e clulas dendrticas CD8 - 25% a 35% das clulas T maduras do subtipo citotxica. CD19 - Presente em mais de 95% das clulas B. CD20 - Assim como o CD19, esto presente em todas as clulas B maduras do tecido linfide e sangue perifrico. CD45 - Expresso quase exclusivamente em clulas hematopoiticas podendo apresentar as formas: CD45RA ou CD45RO. CD56 - Marcador de NK, no est expresso em clulas B, moncitos ou granulcitos. Antgeno CD CD3 Expresso Celular Timcitos, clulas T. Funes Associado com o receptor de clulas T antgeno; Domnios citoplasmticos. Co-receptor para molculas MHC classe II. Co-receptor para molculas MHC classe I. Formas complexas com CD21 (CR2) e CD81 (TAPA-1) Aumenta a sinalizao atravs do receptor de antgeno de clulas B e T. Isoforma da molcula de adeso celular neuronal (NCAM), molcula de adeso. Outros Nomes T3

CD4

CD8

Subpopulaes de timcitos, clulas T auxiliares e inflamatrios. Clulas T citotxicas

T4, L3T4

T8, Lyt2, 3

CD19 e CD20

Clulas B, clulas dendrticas foliculares.

CD45

Todas as clulas hematopoiticas.

CD56

Clulas NK

Antgeno leucocitrio comum (LCA), T200, B220 NKH-1

Aplicaes clnicas Ampla aplicao na hematologia veterinria, incluindo a identificao de clulas-tronco hematopoiticas (A quantificao das clulas-tronco CD34+ pela citometria de fluxo nos animais domsticos possvel apenas na espcie canina, devido produo de anticorpos monoclonais especficos para CD34 canino), contagens celulares diferenciais da medula ssea (As tcnicas de citometria de fluxo tm sido utilizadas para determinar a contagem diferencial de clulas da medula ssea e a maturao de megacaricitos, quantificar a taxa de proliferao celular e detectar e diferenciar leucemias e sndromes mielodisplsicas. A contagem diferencial de clulas da medula ssea de ces e gatos por meio da citometria de fluxo permite a identificao de populaes de neutrfilos segmentados e bastonetes, metamielcitos, clulas mielides imaturas, clulas eritrides

imaturas e clulas eritrides maduras), quantificao de reticulcitos, pesquisa de eritroparasitas, deteco de anticorpos anti-eritrocitrios, contagem diferencial de leuccitos, imunofenotipagem de linfcitos e contagem de plaquetas reticuladas.