RODICA POP

STUDIUL VARIABILITII SOMACLONALE LA VIA DE VIE CU AJUTORUL MARKERILOR MOLECULARI STUDY OF SOMACLONAL VARIATION IN GRAPEVINES ASSISTED BY MOLECULAR MARKERS

ISBN 978-973-88929-6-5

Bioflux, Cluj-Napoca, 2008

Rodica Pop, 2008

Autor: Pop Rodica

Refereni tiinifici: Prof. Univ. Dr. Ing. Marin Ardelean Prof. Univ. Dr. Ing. Doru C. Pamfil

Director editur: Cercet. Dr. Ioan Valentin Petrescu-Mag Consilier editorial: Lector Dr. Ruxandra Mlina Petrescu-Mag

Editura Bioflux, Cluj-Napoca, 2008 ISBN 978-973-88929-6-5

Responsabilitatea coninutului lucrrii revine n exclusivitate autorului. Reproducerea acestor materiale prin orice mijloc, sau stocarea lor n orice baz de date, oblig pe cel care o face s citeze corect autorii/editorii, anul i editura.

Rodica Pop, 2008

CUPRINS
Cuvnt nainte...................................................................................................................... 9 Introducere......................................................................................................................... 11 CAP. I. Metode de producere a variabilitii la via de vie ................................................. 15 1.1. Metode convenionale...................................................................... .............15 1.1.1. Hibridarea sexuat ............................................................................... 15 1.1.2. Poliploidia ........................................................................................... 18 1.1.3. Consangvinizarea i heterozisul ........................................................... 19 1.1.4. Mutageneza.......................................................................................... 21 1.2. Metode neconvenionale de creare a variabilitii la plantele cultivate i la via de vie ............................................................................... 23 1.2.1. Variabilitate somaclonal. Cauze i frecvena de apariie ..................... 23 1.2.1.1. Tipuri de variabilitate somaclonal ...............................26 1.2.1.2. Importana variabilitii somaclonale .................. 28 1.2.1.3. Originea variabilitii somaclonale ...................... 30 1.2.1.4. Variaia preexistent .............................................. 30 1.2.1.5. Inducerea variabilitii somaclonale ........................ 32 1.2.1.6. Factorii care influeneaz spectrul i amplitudinea variabilitii somaclonale .......................................... 33 1.2.1.6.1. Modul de regenerare ........................... 33 1.2.1.6.2. Regulatorii de cretere .......................... 33 1.2.1.6.3. Cultivarul .................................................. 34 1.2.1.6.4. Vrsta cultivarului ................................. 35 1.2.1.6.5. Nivelul de ploidie ................................ 35 1.2.1.6.6. Sursa explantului .................................. 36 1.2.1.6.7.Genotipul ....................................................... 38 1.2.1.6.8. Durata timpului de cultur in vitro ..... 40 1.2.1.6.9. Rata de proliferare ................................. 41 1.2.1.6.10. Presiunea de selecie ................................. 41 1.2.1.6.11. Condiiile de cultur .......................... 42 1.2.1.6.12. Rata variaiei somaclonale ................ 43 1.2.1.7. Tipuri de modificri genetice asociate variabilitii somaclonle ...................................................................44 1.2.1.8. Mecanismele variabilitii somaclonale .................. 45 1.2.1.9. Metode de evideniere a variabilitaii somaclonale........45 1.2.1.10. Mutageneza in vitro ........................................... 47 1.2.1.11. Transformarea genetic ..................................... 50 1.3. Evidenierea variabilitii genetice cu ajutorul markerilor moleculari.................................................................................................... 51 1.3.1. Markerii RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)................... 51 1.3.2. Markerii AP-PCR (Arbitrary Primed PCR) ......................................... 58 1.3.3. Aplicaiile tehnicii RAPD i AP-PCR ................................................. 59 1.3.4. Markerii RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)............ 62 1.3.5. Markerii AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)............. 62 1.3.6. Markerii SSR (Simple Sequence Repeats).......................................... 64
3

Rodica Pop, 2008 CAP. II. OBIECTIVELE CERCETRII, MATERIALUL I METODA........................... 67 2.1. Scopul cercetrilor ................................................................................. ...... 67 2.1.1. Obiectivele urmrite n cercetrile aferente tezei de doctorat.............. 68 2.2. Materialul biologic ..................................................................................... 69 2.2.1. Materialul biologic utilizat n experienele de difereniere a soiurilor cu ajutorul markerilor moleculari........................................ 69 2.2.1.1. Descrierea soiurilor luate n studiu .................. .............69 2.2.1.2. Primerii utilizai n amplificarea ADN-ului ..................82 2.2.2. Materialul biologic utilizat n experienele de producere a variabilitii somaclonale n condiii de laborator.............................. 84 2.2.2.1. Medii de cultur folosite ..............................................84 2.2.2.2. Regulatorii de cretere utilizai, rol i funcii hormonale ....................................................................85 2.2.2.2.1. Auxinele ..............................................86 2.2.2.2.2. Citochininele ..............................................87 2.2.2.3. Prepararea soluiilor stoc pentru mediile de cultur ... 88 2.2.2.4. Primerii utilizai n amplificarea ADN-ului regeneranilor obinui ..............................................90 2.3. Metode de lucru...................................................................................... .91 2.3.1. Metode de lucru aplicate n experienele cu material biologic produs in vivo.................................................................................... 91 2.3.1.1. Extracia de ADN n vederea executrii analizelor RAPD ....................................................................91 2.3.1.2. Cuantificarea ADN-ului ..............................................96 2.3.1.3. Protocol de amplificare RAPD ...................................96 2.3.1.4. Electroforeza n gel de agaroz ...................................98 2.3.1.4.1. Prepararea gelurilor de agaroz i a probelor de ADN ...................................98 2.3.1.4.2. Migrarea electroforetic ........................99 2.3.1.5. Preluarea imaginilor ............................................100 2.3.1.6. Analiza imaginilor ............................................100 2.3.2. Metode de lucru aplicate n experienele cu material biologic produs in vitro................................................................................. 101 2.3.2.1. Metodele de multiplicare in vitro utilizate n experiene .......................................................101 2.3.2.2. Multiplicarea prin lstrire axilar ......................101 2.3.2.3. Cultura de calus .......................................................102 2.3.2.4. Multiplicarea prin muguri sau lstari adventivi ...........103 2.3.2.5. Sterilizarea materialului biologic, a recipientelor i mediilor de cultur utilizate n experienele in vitro....104 2.3.2.6. Organizarea experienelor realizate n condiii de cultur in vitro .......................................................105 2.3.2.6.1. Multiplicarea prin lstrire axilar .............105 2.3.2.6.2. Cultura de calus .................................106 2.3.2.6.3.Inducerea i dezvoltarea lstarilor multipli .107 2.3.2.6.4. Extracia ADN-ului .................................109
4

Rodica Pop, 2008 2.3.2.6.5. Cuantificarea, amplificarea ADN-ului i electroforeza n gel de agaroz ...........109 2.3.3. Metode statistice de calcul i interpretare a rezultatelor...................... 110 CAP.III. REZULTATE I DISCUII............................................................................ ..112 3.1. Rezultate privind extracia probele de ADN provenite din materialul biologic in vivo ........................................................................................ .112 3.1.1. Rezultate privind amplificarea i electroforeza produilor de reacie..126 3.1.2. Rezultate privind analiza imaginilor i interpretarea datelor............. 133 3.1.3. Analiza dendrogramei ...................................................................... 135 3.2.Rezultate obinute n experienele de multiplicare in vitro................... 139 3.2.1. Rezultate obinute n experienele de multiplicare prin lstrire axilar ................................................................................. 139 3.2.1.1. Numrul de lstari obinui prin micromultiplicare prin lstrire axilar ............................................141 3.2.1.2. Lungimea lstarilor obinui prin multiplicarea din segmente nodale ............................................146 3.2.1.3. Numrul de noduri/neoplantul observat n urma micromultiplicrii din segmente nodale la via de vie . 152 3.2.2. Rezultate obinute n experienele de inducere a calusogenezei ......... 159 3.2.2.1.Influena soiului i a mediului de cultur asupra cantitii de calus format n experienele de inducere a calusogenezei .................................165 3.2.3. Rezultate experimentale privind regenerarea de neoplantule din calus meninut timp ndelungat n cultur.................................... 167 3.2.3.1. Numrul de neoplantule regenerate ......................168 3.2.3.2. Lungimea lstarilor (neoplantulelor) regenerai ...........173 3.2.4. Rezultate privind identificarea, la nivel molecular, a variabilitii somaclonale indus prin regenerarea din calus meninut timp ndelungat n cultur.................................................. 176 3.2.4.1. Rezultate privind extracia i cuantificarea ADN-ului ...................................................................176 3.2.4.2. Rezultate privind amplificarea i electroforeza produilor de reacie ............................................177 CAP.IV. CONCLUZII ..................................................................................................... 185 4.1.Concluzii referitoare la variabilitatea, la nivel molecular a materialului biologic provenit in vivo............................ .185 4.2. Concluzii referitoare la materialul biologic obinut in vitro................... ...187 BIBLIOGRAFIE.............................................................................................................. 191 Anexa 1 ........................................................................................................................... 209 List abrevieri .................................................................................................................. 216 Rezumat........................................................................................................................... 217 Rezumat n limba englez ........................................................... .........245

Rodica Pop, 2008

TABLE OF CONTENTS
Foreword ............................................................................................................................. 9 INTRODUCTION ............................................................................................................. 11 CHAP. I. METHODS OF PRODUCING VARIABILITY IN THE GRAPEVINE. ................................................................................................... 15 1.1. Conventional methods ............................................................................... 15 1.1.1. Sexted hybridation ............................................................................ 15 1.1.2. Polyploidy......................................................................................... 18 1.1.3. Cosangvinization and heterosis ......................................................... 19 1.1.4. Mutagenesis ...................................................................................... 21 1.2. Unconventional methods of creating variability in culture plants and in grapevine ........................................................................................ 23 1.2.1. Somaclonal variability. Cause and occurrence .................................. 23 1.2.1.1. Types of somaclonal variability ..................................26 1.2.1.2. Importance of somaclonal variability ......................27 1.2.1.3. Origin of somaclonal variability .................................30 1.2.1.4. Pre-extant variation ............................................30 1.2.1.5. Induction of somaclonal variability ......................32 1.2.1.6. Factors influencing the spectre and amplitude in somaclonal variability ............................................33 1.2.1.6.1. Way of regeneration .................................33 1.2.1.6.2. Growth regulators .................................33 1.2.1.6.3. The Cultivar ............................................34 1.2.1.6.4. Age of cultivar ............................................35 1.2.1.6.5. Level of ploidy ............................................35 1.2.1.6.6. Source of explant .................................36 1.2.1.6.7. The Genotype ............................................38 1.2.1.6.8. In vitro culture term .................................40 1.2.1.6.9. Rate of proliferation .................................41 1.2.1.6.10. Selection pressure .................................41 1.2.1.6.11. Culture conditions .................................42 1.2.1.6.12. Rate of somaclonal variation ...........43 1.2.1.7. Types of genetic alterations associated to somaclonal variability ..................................................................44 1.2.1.8. Mechanisms of somaclonal variability ......................45 1.2.1.9. Methods of highlighting somaclonal variability 45 1.2.1.10. In vitro mutagenesis ............................................47 1.2.1.11. Genetic transformation ............................................50 1.3. Highlighting the genetic variability by means of molecular markers. ..... 51 1.3.1. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) markers .................. 51 1.3.2. AP-PCR (Arbitrary Primed PCR) markers ........................................ 58 1.3.3. Application of RAPD and AP-PCR techniques ................................. 59 1.3.4. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) markers) 62 1.3.5. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) markers............ 62 1.3.6. SSR (Simple Sequence Repeats) markers.................... 64
6

Rodica Pop, 2008 CHAP. II. OBJECTIVES OF THE REASEARCH, MATERIAL AND METHOD ....................................................................................................... 67 2.1. The goal of the reasearch work. ............................................................... 67 2.1.1. Objectives pursued in the research work pertaining to the Doctoral Disertation ...................................................................................... 68 2.2. Biological material................................................................................. ..69 2.2.1. Biological material used in experiments of differentiating the varieties by means of molecular markers.. 69 2.2.1.1. Description of varieties taken in study ..................... 69 2.2.1.2. Primers used in DNA amplification .......................82 2.2.2. Biological material used in experiments of producing somaclonal variability within laboratory conditions.. 84 2.2.2.1. Culture media used .............................................84 2.2.2.2. Growth regulators used, role and hormonal functions 85 2.2.2.2.1. Auxines ..............................................86 2.2.2.2.2. Citokinins ..............................................87 2.2.2.3. Preparation of stock solutions for culture media ..88 2.2.2.4. Primers used in amplification of DNA of obtained regenerants ..........................................................90 2.3. Work methods ..................................................................................... .91 2.3.1. Work methods applied in experiments with biological material produced in vivo ... 91 2.3.1.1. DNA - extraction in view of carrying out RAPD analyses ...................................................................91 2.3.1.2. DNA-quantification .............................................96 2.3.1.3. Protocol of RAPD amplification .......................96 2.3.1.4. Electrophoresis in agarose gel ..................................98 2.3.1.4.1. Preparation of agarose gel and DNA samples .............................................98 2.3.1.4.2. Electrophoretic migration .......................99 2.3.1.5. Taking over of images ............................................100 2.3.1.6. Image analysis ........................................................100 2.3.2. Work methods applied in experiments with biological material produced in vitro........101 2.3.2.1. Methods of multiplication in vitro utilized in experiments ........................................................101 2.3.2.2. Multiplication via axilary shooting ......................102 2.3.2.3. Callus culture .......................................................103 2.3.2.4. Multiplication via buds and adventive shoots ...........104 2.3.2.5. Sterilization of biological material, recipients and of culture media used in in vitro experiments......105 2.3.2.6. Organisation of experiments carried out in culture conditions In vitro ............................................105 2.3.2.6.1. Multiplication via axilary sooting ...........106 2.3.2.6.2. Callus culture ............................................107
7

Rodica Pop, 2008 2.3.2.6.3. Induction and development of multiple shoots ......................................................................................................................... 109 2.3.2.6.4. DNA extraction .................................109 2.3.2.6.5. Quantification, amplification of DNA and electrophoresis in gel agarose ...................................................................110 2.3.3. Statistical methods of calculation and interpretation of data ........... 112 CHAP.III. RESULTS AND DISSCUTIONS .................................................................. 112 3.1. Results regarding extraction of DNA samples coming from in vivo biological material ........................................................................................ 126 3.1.1. Results regarding amplification and electrophoresis of reaction products ....133 3.1.2. Results regarding image analysis and data interpretation...................... 135 3.1.3. Dendrogram analysis ........................................................................... 139 3.2. Results obtained with experiments of in vitro multiplication 139 3.2.1. Results obtained in experiments of multiplication via axilary shooting. ...................................................... 141 3.2.1.1. Numbers of shoots obtained through micromultiplication via axilary shooting ......................146 3.2.1.2. Length of shoots obtained by multiplication from nodal segments ...................................................................152 3.2.1.3. Numbers of nodes/neoplantule witnessed after micromultiplication from nodal segments in the grapevine.159 3.2.2. Results obtained in experiments of callusogenesis induction ......... 165 3.2.2.1. Influence of variety and culture medium on callus quantity formed in experiments of inducing callusogenesis.................................................................. 167 3.2.3. Experimental results on regeneration of neoplantules from callus maintained in culture for long time..168 3.2.3.1. Numbers of regenerated neoplantules ......................173 3.2.3.2. Length of regenerated shoots (neoplantules) ...........176 3.2.4. Results on identification at molecular level of somaclonal variability induced through regeneration from callus maintained in culture for long while... 176 3.2.4.1. Results on extraction and quantification of DNA 173 3.2.4.2. Results regarding amplification and electrophoresis of reaction products ........................................................177 CHAP. IV. CONCLUSIONS .......................................................................................... 185 4.1. Conclusions referring to variability at molecular level of biological material arising in vivo. ........ 185 4.2. Conclusions referring to biologic material obtained in vitro....................... 187 REFERENCES ................................................................................................................ 191 Appendix 1 ...................................................................................................................... 209 List of abreviations .......................................................................................................... 216 Romanian summary ......................................................................................................... 217 English summary ........................................................................... .....245

Rodica Pop, 2008

Cuvnt nainte

Caracterizarea molecular a soiurilor din genul Vitis luate n studiu s-a realizat cu ajutorul markerilor RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Toate experienele noastre s-au desfurat n cadrul Departamentului de Biotehnologii al Universitii de tiine Agricole i Medicin Veterinar Cluj-Napoca, avnd ca suport financiar grantul CNCSIS tip A nr. 51 Studiul variabilitii somaclonale la via de vie cu ajutorul markerilor moleculari, aprobat n anul 2003.

in s-mi exprim o mare recunotin fa de domnul profesor dr. Marin Ardelean, conductorul meu de doctorat care a manifestat bunvoin i m-a ghidat cu atenie deosebit n realizarea acestui studiu. Generozitatea sa, rigoarea, spiritul de cercetare, experiena i vastele cunotine n domeniu, mi-au trezit spiritul de cercetare i m-au ajutat n desvrirea mea profesional. mi exprim gratitudinea fa de domnul profesor dr. Pamfil Doru, de un profesionalism inestimabil, care m-a ndrumat i mi-a acordat ntreg sprijinul, contribuind nemijlocit la mbogirea cunotinelor mele n domeniul biotehnologiilor i al micropropagrii, implicndu-se n mod direct n definitivare prezentei teze de doctorat. Ii aduc sincere mulumiri pentru tot ceea ce a fcut pentru mine i pentru tot ce am nvat de la dnsul. Mulumesc mult prietenei mele Andreea Balogh pentru bunvoina artat n descifrarea tainelor biotehnologiilor i ajutorul acordat la realizarea primelor amplificrii de ADN. Recunotin i mulumiri aduc i colegilor mei de la departament: ing. Ioana Gaboreanu, profesor dr. Constantin Botez, asistent Paul Raica, ef de lucrri Mirela Cordea, ing. Monica Bodea, care m-au ajutat n realizarea multor experiene de laborator, acordndu-mi tot sprijinul. De asemenea, in s mulumesc tuturor colegilor i prietenilor de la Departament pentru suportul moral, ncurajri i nelegerea avut pentru mine.

Rodica Pop, 2008 Lucrarea este structurat n urmtoarele pri: Cuvnt nainte, Introducere, Obiectivele cercetrilor, Materialul i metoda de lucru, Rezultate i discuii, Concluzii, Bibliografie i Anexe.

Lucrarea are un numr de 258 de pagini, 37 de tabele, 43 de figuri i un numr de 196 referine bibliografice. Anexele cuprind lista cu soluiile stoc utilizate i lista de abrevieri.

Autoarea

10

Rodica Pop, 2008

INTRODUCERE

Cercetrile paleontologice au dovedit c via de vie a existat nainte de apariia omului pe pmnt. Protostrmoii viei de vie cultivai astzi se pare c ar fi aprut n perioada cretacic a planetei. Fosilele vitaceaelor din perioada cretacic a planetei au fost ns contestate de majoritatea cercettorilor, deoarece existau confuzii ntre presupusele frunze pietrificate de vi de vie i cele ale arborilor forestieri. Dovezi certe provin din era neozoic sau teriar - perioada paleogen. Din aceast perioad au fost scoase la iveal cele mai multe fosile ale vitaceaelor, raportate la patru genuri actuale Vitis, Ampelopsis, Cayratia, Tetrastigma. Procesul esenial, care a generat trecerea de la via slbatic la via cultivat, este variabilitatea natural, care a permis omului s aleag viele cele mai valoroase din flora spontan i s le cultive n mod contient (RDEA i colab., 1995). Soiurile de vi de vie sunt mai vechi dect oricare alte soiuri ale speciilor de plante domestice, unele perpetundu-se n timp, din antichitatea greac sau roman pn astzi. Apariia mutaiilor, selecia i nmulirea vegetativ a plantelor, purttoare de mutaii au constituit factorii diversificrii genetice n cadrul formelor cultivate, diversitate amplificat mai trziu de intensificarea crescnd a lucrrilor de creare de soiuri noi. Numeroase soiuri s-au rspndit n diferite ri i regiuni ale globului, aprnd clone sau selecii extrem de asemntoare ntre ele, denumite diferit, n timp ce alte soiuri vechi s-au pierdut, ne mai fiind nmulite (SESTRA, 2004). Studiul soiurilor de vi de vie a constituit o preocupare a oamenilor de tiin nc din antichitate. Studiile ampelografice ajut la aprecierea valorii soiurilor dup criterii unice, la compararea caracterelor i nsuirilor sortimentului cultivat, la evitarea confuziilor dintre unele soiuri apropiate i eliminarea numeroaselor sinonimii. n decursul veacurilor, metodologia folosit la descrierea soiurilor s-a perfecionat continuu, pe msura acumulrii de noi cunotine i a progreselor realizate n alte domenii. La nceput, majoritatea ampelografilor au folosit metoda descrierii botanice a organelor viei de vie. Astfel, se lua n considerare, n special, caracterele de specie: frunza, bobul i strugurele, aceste elemente fiind mai uor de sesizat.
11

Rodica Pop, 2008 n stadiul actual, ampelografia consider c descrierea botanic este incomplet, fiind necesar i studierea influenei condiiilor ecologice i de cultur asupra variabilitii caracterelor morfologice i a nsuirilor agrobiologice i tehnologice. Cercetrile efectuate la via de vie au stabilit centrele genetice de formare a genului Vitis i apartenena soiurilor la anumite grupe ecologo-geografice. La soiurile cu origine cert se cunosc prerile diferiilor ampelografi privind momentul cnd acestea au fost introduse n producie sau semnalate n literatura de specialitate. De asemenea se fac aprecieri asupra provenienei i modului de apariie la soiurile aprute i fixate pe cale vegetativ. n cazul soiurilor cu origine necunoscut sau incert se menioneaz date referitoare la vechimea n cultur rspndire (POENARU, 1970). n ameliorare, identificarea soiurilor n primele stadii de dezvoltare este extrem de dificil, elementele caracteristice soiului aprnd n mod treptat, n anii urmtori. La prima apariie, unele organe cum ar fi crceii i inflorescenele sunt slab dezvoltate devenind, apoi, tot mai tipice pe msura trecerii anilor (ARDELEAN, 1986). De asemenea, n cazul portaltoilor, metodele ampelografice de identificare nu pot fi folosite dect n plantaiile de portaltoi, nu i dup altoire. n ultimii ani, odat cu apariia markerilor moleculari, identificarea cultivarelor s-a realizat la nivel de proteine cu ajutorul izoenzimelor i la nivel de ADN prin metode RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) i SSR (Simple Sequence Repeats). Identificarea cultivarelor cu ajutorul polimorfismului la nivel de ADN este extrem de util, datorit faptului c rezultatul obinut reflect direct genotipul i nu este influenat de condiiile de mediu. De asemenea, sunt disponibile un numr foarte mare de secvene de ADN, care pot releva polimorfism, iar ADN-ul poate fi izolat aproape din orice esut (POP i colab., 2004). Datorit simplitii metodei RAPD Random Amplified Polymorphic DNA (WILLIAMS i colab., 1999), a faptului c necesit cantiti extrem de mici de ADN i a capacitii de a releva un grad nalt de polimorfism, aceasta a fost aplicat cu
12

a soiului, ipoteze cu privire la provenien,

Rodica Pop, 2008 succes la diferite specii de plante, inclusiv la Vitis vinifera (WOLF i colab., 2001, RYAN i colab., 2001, TESSIER i colab., 1999, FANIZZA i colab., 1999, BOHM i colab., 1998, PAMFIL, 1999). Cercetrile de genetic molecular la via de vie sunt orientate, n general, spre identificarea polimorfismului existent n cadrul speciilor de Vitis i spre stabilirea originii filogenetice a unor specii sau soiuri. Via de vie este o plant la care nmulirea se realizeaz cel mai frecvent vegetativ. Altoirea este o metod prin care se asigur transmiterea neschimbat a caracterelor i nsuirilor la descendeni. Pn nu demult, la baza identificrii a mai mult de 6000 de cultivare au stat caracterele ampelografice sau criteriile morfologice. Metodele clasice, fenotipice de identificare nu sunt totdeauna suficiente s rezolve aceste probleme, datorit instabilitii caracterelor morfologice precum i neputinei de a utiliza informaiile n identificarea plantelor tinere. Studiul izoenzimelor i tehnicile RFLPs, RAPD i a microsateliilor sunt folosite n tot mai mare msur pentru identificarea varietilor de vi de vie (TESSIER i colab., 1999). Originea i autenticitatea multor cultivare de vi de vie (Vitis vinifera), folosite pentru producia de vin n lume, este neclar i constituie subiectul multor controverse. n acest sens, ntr-un studiu, amprentele ADN generate cu ajutorul tehnicilor RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) i ISSR-PCR (Inter Simple Sequence Repeat Polymerase Chain Reaction) au fost folosite pentru a compara patru cultivare de Vitis vinifera folosite pe scar larg n Chile (Cabernet Sauvignon, Cabernet Franc, Merlot i Carmenere). Ca i referin extern a fost folosit material vegetal provenit din Frana. Ambele tehnici au fost capabile s evidenieze diferene ntre cultivarele studiate, chiar dac puterea de difereniere a metodei ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) a fost mai bun dect cea a metodei RAPD. Acest lucru sugereaz faptul c este de dorit utilizarea tehnicii ISSR-PCR atunci cnd se studiaz un numr mare de cultivare. n mod surprinztor, a fost observat variabilitate ntre clonele de Merlot, clona original din Chile i proveniena din Frana. Mai mult dect att, distana mare dintre cele dou proveniene (64% asemnare) sugereaz faptul c soiul Merlot franuzesc nu
13

Rodica Pop, 2008 este o rud chiar att de apropiat a provenienei din Chile. Este interesant faptul c, cel din urm, provine direct de la primul fondator francez al clonelor de Merlot. Nu s-a gsit nici o variaie n cadrul Merlot-ului din Chile folosind analizele ISSR sau RAPD. Aceste rezultate arat c varietile de Merlot cultivate n Frana i Chile reprezint genotipuri diferite. nrudirea genetic dintre cultivarele tradiionale de vi de vie a fost din totdeauna un motiv de polemic. Nici metodele clasice sau ampelografice, nici chimia analitic nu pot rezolva dezordinea existent n clasificarea cultivarelor de vi de vie sau s aduc informaii tiinifice despre gradul de heterozigoie al acestora, pentru a putea fi folosite n procesul de ameliorare la aceast specie. De mai muli ani, markerii moleculari sunt utilizai pentru caracterizarea genotipic. n timp ce metodele RFLP i RAPD permit o caracterizarea genetic limitat, metoda SSR (markeri microsatelit) este mai avantajoas pentru caracterizarea genotipic i are anumite avantaje, fa de primele dou metode. Pe baza celor constatate mai sus, n lucrarea prezentat ne-am propus ca prim obiectiv utilizarea metodei RAPD pentru testarea hetermorfismul molecular la zece cultivare de vi de vie provenite din cinci staiuni viticole. Un alt obiectiv a constat n inducerea variabilitii somaclonale i testarea, prin aceeai metod, a

hetermorfismului molecular la regeneranii obinui in vitro.

14

Rodica Pop, 2008

CAPITOLUL I

METODE DE PRODUCERE A VARIABILITII LA VIA DE VIE

1.1. METODE CONVENIONALE

1.1.1. Hibridarea sexuat

Dup cum se tie n cadrul fiecrei specii exist un numr de gene valoroase, acumulate n decursul evoluiei speciei respective. Pentru a se crea ecotipuri echilibrate, capabile de performane ct mai mari, ameliorarea caut s mbine armonios ct mai multe gene favorabile. Principala cale de realizare a acestui scop o constituie recombinarea, prin hibridare, a genelor existente n diferitele genotipuri disponibile. Prin hibridare se creeaz material iniial nou i se realizeaz o surs de variabilitate important pentru procesul ameliorrii. De cele mai multe ori formele hibride prezint o variabilitate sporit fa de formele parentale din care provin. Prin hibridare se obin forme hibride care cumuleaz ntr-un grad accentuat nsuirile genitorilor. Hibridarea poate fi definit ca o metod de ameliorare folosit pentru obinerea de noi genotipuri prin unirea, pe cale sexuat i parasexuat, a unor soiuri, linii, varieti, specii sau chiar genuri de plante, diferite n ceea ce privete una sau mai multe gene. Genitorii care se folosesc n hibridare pot fi apropiai sau ndeprtai genetic. Cnd se folosesc genitori din cadrul aceleiai specii se realizeaz o hibridare apropiat - intraspecific, iar cnd genitorii aparin la alte specii sau genuri se realizeaz o hibridare ndeprtat - interspecific sau intergeneric (SAVATTI, 1983). O nou perspectiv n procesul de ameliorare bazat pe hibrizi ndeprtai o are hibridarea somatic (parasexual) ce se realizeaz prin intermediul culturilor de esuturi i celule. Cercetrile efectuate pn n prezent demonstreaz c sistemul culturilor de esuturi i de celule, ndeosebi utilizarea protoplatilor, permite realizarea
15

Rodica Pop, 2008 unor hibrizi somatici ntre organisme care aparin la taxoane foarte diferite genetic i taxonomic, facilitnd transferul la plantele de cultur a informaiei genetice de la taxoanele supraspecifice. Fuziunea protoplatilor reprezint o metod cu totul nou de creare de hibrizi, la care problema incompatibilitii formelor parentale nu se pune (SAVATTI, 1983). Metoda hibridrii parasexuate a dat, pn n prezent, o serie de rezultate palpabile la nivelul plantelor monocotiledonate. Numrul de specii care se preteaz la hibridarea somatic este ntr-o continu cretere. Cu toate succesele obinute n acest domeniu, mai exist nc impedimente cum ar fi: - tehnica producerii, culturii i regenerrii protoplatilor nu este complet pus la punct; - acelai lucru se poate spune i referitor la tehnica fuziunii protoplatilor; - nu dispunem de metode adecvate pentru selecia hibrizilor somatici; - metoda se aplic la un numr nc relativ mic de specii; - n multe cazuri ADN-ul transferat este degradat de ctre enzimele plantei gazd; - mecanismul molecular al integrrii ADN-ului n ADN-ul gazdei nu este nc pe deplin elucidat (SAVATTI, 1983). La via de vie, procesul de ameliorare are la baz selecia natural, selecia cultural i selecia artificial. n obinerea de genotipuri noi, un rol important i revine seleciei artificiale. Dup gradul de nrudire a formelor genitoare n ameliorarea viei de vie se folosesc trei tipuri de hibridri dirijate: hibridri intraspecifice, interspecifice i intergenerice. Hibridarea intraspecific s-a dovedit eficient pentru realizarea unor obiective generale de ameliorare reprezentate de potenialul de producie i calitate, epoca de maturare a strugurilor, structura morfologic favorabil mecanizrii lucrrilor agrofitotehnice, rezistena la secet, plasticitatea ecologic etc., dar mai puin eficient n realizarea unor obiective speciale, ca de exemplu rezistena la unele boli criptogamice, rezistena la filoxer i la condiiile de iernare (OPREA i colab., 2007).

16

Rodica Pop, 2008 n lucrrile de ameliorare intreprinse pn acum n ara noastr pentru crearea de soiuri noi de struguri de mas se evideniaz genitorii Afuz Ali, Alphonse Lavalle, Coarn alb, Coarn neagr, Regina viilor etc. n obinerea soiurilor apirene genitori valoroi s-au dovedit soiurile: Braghin, Perlette, Sultanin, Maria Pirovano. La crearea de soiuri pentru vinuri albe buni genitori sunt soiurile: Aligote, Crmpoie, Chardonnay, Feteasc regal, Gras de Cotnari etc., iar soiurile pentru vinuri roii: Bbeasc neagr, Merlot, Negru vrtos, Pinot noire, Cabernet Sauvignon etc. (OPREA i colab., 2007). Hibridrile interspecifice au n vedere asocierea caracterelor i nsuirilor de producie i de calitate specifice soiurilor vinifera, formelor rezistente la boli criptogamice, la filoxer i la condiiile de iernare. Astfel, ca surs de germoplasm pentru rezistena la man i la filoxer se pot folosi biotipuri ale speciilor: Vitis riparia, Vitis cinerea, Vitis berlandierii, Vitis rotundifolia. Pentru sporirea rezistenei la condiiile de iernare se pot utiliza ca genitori biotipuri ale speciilor asiatice Vitis amurensis cu mare rezisten la ger sau a unor specii americane cum ar fi Vitis riparia i Vitis labrusca. Hibridrile interspecifice ntre soiuri vinifera cu specii americane i asiatice aparinnd subgenului Euvitis sunt compatibile, obinndu-se descendeni viabili i fertili. Nu acelai lucru se poate spune despre hibridrile interspecifice ntre soiuri vinifera i specii aparinnd subgenului Muscadinia, care au un numr diferit de cromozomi i calitatea diferit a genomurilor. n ara noastr, prin hibridri intraspecifice au fost create 57 de soiuri noi aparinnd grupei Vinifera, iar prin hibridri interspecifice complexe au fost create 11 genotipuri (soiuri noi cu rezisten biologic) valoroase, cumulnd caractere i nsuiri de producie i calitate, alturi de rezisten sau toleran sporit la unele boli criptogamice active i la condiii de iernare (OPREA i colab., 2007). Dintre soiurile obinute prin hibridari intraspecifice putem aminti: Crmpoie selecionat, Triumf, Regner, Select, Nobless, Osiris, Gloria, Faber etc. (ARDELEAN i colab., 2006).

17

Rodica Pop, 2008 1.1.2. Poliploidia Poliploidia a jucat un rol important n evoluia plantelor. Poliploidia a dat natere la noi specii care s-au extins dincolo de arealul de existen al speciilor diploide. (SAVATTI, 1983). Euploidia i aneuploidia sunt cele mai reprezentative tipuri de variaie a numrului de cromozomi, care afecteaz n mod pregnant cantitatea i calitatea informaiei genetice, caracteristic unei anumite specii. Dat fiind importana excepional a materialului genetic pentru existena individului, orice modificare ce apare n structura numeric a seturilor cromozomiale are repercusiuni majore, concretizate prin dobndirea unor noi nsuiri

morfoanatomice i ecofiziologice de ctre indivizii afectai de modificri numeric cromozomiale. Fenomene biologice cu larg rspndire n natur, euploidia i aneuploidia sunt consecina aciunii spontane a unor factori ecofiziologici, fizici, chimici i biologici ai mediului de via, care pot induce multiplicarea seturilor de baz sau a complementului haploid de cromozomi, pierderea din sau adugarea la garnitura standard a unuia sau mai multor cromozomi. Frecvena remarcabil a acestor fenomene, ndeosebi n lumea plantelor, constituie o dovad elocvent a rolului lor stabilizator, adaptativ, a importanei lor deosebite n evoluia natural a vieuitoarelor, n speciaie. Odat cu descoperirea fenomenelor de poliploidie i cu descifrarea cauzelor i a mecanismelor care duc la apariia natural a formelor euploide i aneuploide, oamenii de tiin au acionat n mod consecvent n sensul inducerii unor astfel de fenomene prin mijloace proprii. Dei au trecut mai multe decenii de la raportarea primului caz de poliploidie i aneuploidie, fenomenele merit i azi toat atenia, deoarece constituie nc o cale sigur, eficient i rapid de creare de forme noi, de sintez de noi specii. (SAVATTI, 1983). Poliploidia indus prezint perspective deosebite la speciile horticole ce se nmulesc vegetativ la care nu se pune problema fertilitii sczute sau chiar a lipsei de fertilitate a unor tipuri de poliploizi. La aceste specii sterilitatea unor poliploizi se
18

Rodica Pop, 2008 poate dovedi avantajoas deoarece duce la formarea de fructe fr semine sporindu-se astfel calitatea produciei. Primele cercetri privind poliploidia la via de vie Vitis vinifera, 2n = 28 au fost efectuate de NEBEL (1929), care semnaleaz pentru prima dat forme tetraploide, 2n = 56, la soiurile Sultanin i Muscat de Alexandria. BRANS (1930), citat de ANGHEL i colab. (1980) arat c soiul Cannon Hall este tetraploid. SCHERZ (1940), citat de ANGHEL i colab. (1980) descrie o form tetraploid la soiul Riesling de Mosela. De LATTIN, ALLEY, OLMO (citai de ANGHEL i colab., 1980) identific forme poliploide la soiurile Cabernet, Sauvignon, Carignon, Folleblanche, Olivette noir etc. MAGNER, descrie 48 forme tetraploide la via de vie, iar RIVES i PUGET stabilesc c renumitul soi Chasselas Gras Coulard este tetraploid (ANGHEL i

colab.,1980). n anul 1997 n Hiroima, Japonia, a fost obinut cultivarul tetraploid de vi de vie Sunny Rouge prin ncruciarea dintre Vitis labruscana x Vitis vinifera, iar n anul 1998 cultivarele tetraploide Dark Ridge i Honey Venus rezultate prin selecia hibrizilor provenii din aceeai combinaie parental (YAMADA i colab., 2003). Experiene de obinere experimental a poliploidiei la via de vie au efectuat i LELAKIS, DERMEN, EINSET, EVIN, iar n ara noastr NEAGU i LEPDATU (ANGHEL i colab., 1980). Printre caracterele afectate de poliploidie sunt: forma i mrimea frunzelor, ciorchinilor, boabelor, care caracterizeaz producie de must (ANGHEL i colab., 1980).

1.1.3. Consangvinizarea i heterozisul

Prin consangvinizare se nelege nmulirea, prin autofecundare forat, a plantelor alogame hermafrodite i monoice sau prin ncruciarea ntre indivizi apropiat nrudii la plantele dioice. Consangvinizarea a fost utilizat pentru prima dat n scopuri practice, de ctre EAST i SHULL (dup POTLOG i VELICAN, 1974), ndeosebi la porumb. Ea a fost utilizat pentru obinerea de linii consangvinizate (forme homozigote), ct i pentru desfacerea populaiilor existente n genotipurile lor componente.
19

Rodica Pop, 2008 Consangvinizarea ofer avantajul de a permite izolarea de genotipuri homozigote, deci stabile, care pot fi apoi utilizate n producerea de hibrizi comerciali. ntr-adevr, homozigotarea, care se produce n urma consangvinizrii, duce la apariia, prin segregare i recombinare, a unor noi genotipuri. Homozigoia complet apare dup un numr mare de consangvinizri repetate, n funcie de gradul de heterozigoie a materialului iniial i are ca urmare eliminarea genelor letale sau subletale. Genotipurile care apar pot fi homozigote recesive sau homozigote dominante. Majoritatea genotipurilor homozigote recesive prezint fenomene de nanism, defecte clorofiliene, malformaii, sterilitate parial sau total, dar i unele nsuiri valoroase pentru ameliorare, cum ar fi: tulpini scurte i rezistente la cdere (porumb i sorg), tulpini erecte i bogate n frunze (la trifoi), coninut ridicat de proteine, anumii aminoacizi i grsimi (la porumb), coninut sczut n alcaloizi (la lupin), rezisten la stresurile climatice, boli i duntori, precocitate. Formele homozigote recesive pot fi uor recunoscute i eliminate sau reinute din prima sau a doua generaie consangvinizat. Deosebit de valoroase sunt genotipurile homozigote dominante, deoarece, prin ncruciri, nsuirile i caracterele valoroase ale acestora se transmit descendenei, indiferent de constituia genetic a partenerului (SAVATTI, 1983). La via de vie, observaiile cu privire la studiul consangvinizrii i heterozisului au debutat odat cu nceputul ameliorrii ei pe cale generativ, n a doua jumtate a secolului al XIX-lea. n cazul viei de vie, pentru obinerea de linii consangvinizate, ntr-o prim faz se aleg prin selecie individual butuci elit din populaia fiecrui soi propus homozigotrii, genotipuri care s exprime fidel caracterele i nsuirile specifice urmrite. Prin autofecundri repetate la elitele alese n faza iniial, se obin generaii segregante, care vor fi supuse n continuare seleciei, n vederea identificrii pentru fiecare soi a liniilor pure (consangvnizate), cu valoare ameliorativ ridicat. Obinerea liniilor consangvnizate i apoi realizarea formelor heterozis, prin ncruciarea acestor linii constituie un proces anevoios i de lung durat, fapt pentru care consangvnizarea i heterozisului constituie metode de ameliorare mai puin aplicate, n forma clasic. Ca i la ale specii i la via de vie, au fost semnalate depresii pentru anumite
20

Rodica Pop, 2008 caractere, ncepnd cu generaia a treia, fiind necesar efectuarea de backros-uri cu genitori recureni, n vederea introducerii n recurent a caracterului dorit, urmate de autofecundri i de meninere n cadrul liniei, a caracterului homozigot. Aa dup cum preciza NEGRUL, 1955, citat de OPREA i colab. (2007), obinerea de genotipuri cu caractere i nsuiri superioare ca urmare a manifestrii heterozisului, se pot realiza prin ncruciri ntre linii consangvinizate, polenizri libere, hibridri dirijate ntre soiuri, n special cele aparinnd unor grupe ecologogeografice diferite, hibridri ntre soiuri i specii etc. Heterozisul apare n rndul hibrizilor din prima generaie i se remarc printr-o sporire a vitalitii, a vigorii plantelor, n general, al potenialului productiv i de calitate al strugurilor n special. Manifestarea heterozisului este important att pentru producie i productivitate ct i pentru calitatea recoltei de struguri. Un exemplu, l constituie soiul de struguri pentru mas Cardinal, obinut prin ncruciarea soiurilor Ahmed bon Ahmed x Alphonse Lavalle. Strugurii acestui soi se pot consuma i la un coninu sczut de zahr ca urmare a aciditii reduse (OPREA i colab., 2007).

1.1.4. Mutageneza

Definirea noiunii de mutaie Cercetarea mutaiilor a contribuit la dezvoltarea cunotinelor despre ereditate, la cunoaterea evoluiei i la elaborarea unor sisteme de clasificare a plantelor pe baze genetice. Apariia n natur a unor modificri brute a fost remarcat de muli cercettori i practicieni nc din secolul al XVI-lea. Pn la nceputul secolului nostru, termenul de mutaie se folosea ori de cte ori ntr-o populaie apreau indivizi cu caractere i nsuiri noi prin care se deosebeau de cei normali. Acest fenomen a fost explicat pentru prima dat, pe baze tiinifice, de ctre HUGO DE VRIES n lucrarea "Teoria mutaiei" (1901). BAUER (1964), care s-a ocupat timp ndelungat cu studiul mutaiilor, a artat c prin mutaie "se nelege orice variaie ereditar care nu este rezultatul unei ncruciri". Dup GUENOT (1967), "mutaia reprezint o variaie brusc de
21

Rodica Pop, 2008 amplitudine diferit i imediat ereditar ce poate s apar spontan sau ca rezultat al unei aciuni experimentale". Mai recent, ZOLYNEAK (1968), citat de CRCIUN i colab. (1979), arat c prin mutaie "se nelege orice modificare brusc ce i face apariia n constituia genetic a unui individ datorit unor schimbri care au loc n structura genelor". n natur mutaiile favorabile se pstreaz prin selecie natural. Mutaiile genice naturale nu manifest nici o specificitate evident fa de mediu sau de locusul afectat. Cu toate acestea, unele modificri ale condiiilor de mediu pot influena rata mutaiilor genice. De exemplu, schimbrile de temperatur modific rata mutaiilor genice (NICOLAE, 1978). Punerea la punct a diferitelor metode de inducere a mutaiilor, care sporesc cu mult frecvena acestora, a fcut posibil ca, alturi de hibridare, mutageneza s devin o metod de baz n sporirea variabilitii genetice. Pe lng mutaiile genice exist i schimbri survenite n structura cromozomilor. S-a constatat, de asemenea, existena mutaiilor i la materialul ereditar situat n afara nucleului, n citoplasm, ceea ce determin apariia plasmomutaiilor sau a mutaiilor citoplasmatice. Frecvena mutaiilor naturale se consider a fi de 2-5%, din care numai 1% sunt vizibile. Mutaiile artificiale, care au frecvena de circa 4-150 de ori mai mare dect cele naturale, realizeaz n proporie extrem de mare (99%) forme negative i un procent extrem de sczut de forme pozitive, utilizabile n procesul de ameliorare (SAVATTI, 1983). Mutantele naturale constituie i pentru via de vie o surs important de cretere a variabilitii genetice i prin aceasta, o cale de obinere de noi soiuri. Un exemplu l reprezint soiurile noi Furmint de Mini i Bbeasc gri, care au fost obinute prin identificarea i fixarea unor variaii mugurale aprute spontan (OPREA i colab., 2007). De asemenea, VIALA i VERMOREL, 1910, citai de OPREA i colab. (2007) consider c soiul Chardonnay musque este o variaie mugural a soiului Chardonnay. De-a lungul timpului, soiurile vinifera au evideniat variaii mugurale multiple pentru o gam larg de caractere i nsuiri, cum ar fi prezena seminelor n bob (soiul
22

Rodica Pop, 2008 Corint noir, cunoscut ca soi apiren), mrimea strugurelui i a bobului, desimea de inserare a boabelor pe ciorchine. COCIU, OPREA (1989), citai de OPREA i colab., 2007, consider c ntre mutantele naturale aprute spontan i cele induse pe cale artificial, nu exist diferene de fond. Mutaiile naturale ca de altfel i cele induse pe cale artificial, afecteaz n principal caractere i nsuiri cu ereditate simpl, cum ar fi forma i mrimea boabelor, culoarea pieliei, morfologia i funcionalitatea florilor, prezena sau absena seminelor n bob, culoarea, consistena i aroma pulpei boabelor etc. Coclchicina, utilizat pentru stimularea procesului de poliploidizare a fost folosit i la via de vie, obinndu-se forme tetraploide (4n = 76 cromozomi) cu valoare biologic, cum ar fi Kyoho i Pione sau aneuploidul Takao cu 75 de cromozomi, obinui n Japonia. Alturi de formele tetraploide pentru ameliorarea viei de vie prezint importan i formele triploide (3n = 57 cromozomi) care prezint vigoare sporit a creterilor anuale i o bun maturare a lemnului coardelor de un an, caractere utile pentru ameliorarea portaltoilor (OPREA i colab., 2007).

1.2. METODE NECONVENIONALE DE CREARE A VARIABILITII LA PLANTELE CULTIVATE I LA VIA DE VIE 1.2.1. Variabilitate somaclonal. Cauze i frecvena de apariie

Cultura de esuturi constituie o metod rapid i sigur de nmulire asexuat a plantelor. n prezent, multe specii ornamentale, lemnoase i plante de cultur sunt micropropagate in vitro i comercializate. Micropropagarea prin culturi de esuturi a revitalizat anumite sectoare ale industriei plantelor ornamentale i a facilitat introducerea rapid de noi cultivare. n ciuda succeselor nregistrate n nmulirea dar i n obinerea de noi cultivare prin micropropagare, muli comerciani se ndoiesc de valoarea acestei metode de nmulire a plantelor, deoarece multe cultivare prezint fenomenul de variaie somaclonal. Regenerarea plantelor din celule cultivate in vitro este un proces asexuat, care

23

Rodica Pop, 2008 implic numai diviziuni celulare mitotice. Procesul de regenerare a neoplantulelor poate fi considerat ca fiind sinonim cu clonarea, avnd n vedere c toate celulele somatice ale plantei donor provin din aceeai celul ou i ar trebui s fie identice din punct de vedere genetic. Deci, se poate presupune c toate plantele regenerate din celulele unei plante mam sunt clone. n alt ordine de idei, SCOWCROFT (1985) citat de SKIRVIN (1994), studiind variabilitatea somaclonal, afirm c uniformitatea clonal este recunoscut mai degrab ca o excepie, dect ca o regul. Variabilitatea somaclonal este neuniformitatea care apare ntre plantele regenerate prin cultura de esuturi. Variaia poate fi preexistent sau poate fi indus. Asupra populaia n care variabilitatea natural este asociat cu cultura de esuturi se poate aciona cu o anumit presiune de selecie pentru a izola clone. Valoarea variabilitii care poate fi ateptat variaz cu clona, vrsta culturii, utilizarea agenilor mutageni, aplicarea unei anumite presiuni de selecie n culturile de suspensii celulare, cultura de calus sau condiiile de stres, ca de pild concentraia de sare, erbicide, microorganisme sau alte bioproduse i metabolii specifici ai acestora (SKIRVIN, 1994). Exploatarea variabilitii naturale i induse pare special aplicabil cultivarelor lemnoase vechi. De exemplu, soiul de pr Barlett (Pyrus communis L.) ca i cel de mr Delicious (Malus domestica Borkh), introduse n 1770 i respectiv 1893 (SKIRVIN, 1994), se poate s fi acumulat multe celule mutante care s-au stabilizat n himere de complexiti variate. SHEPARD i colab.(1980), au demonstrat apariia unei mari variabiliti ntre plantele regenerate prin cultura de protoplati (protoclone) provenii din frunze de cartof. LARKIN i SCOWCROFT (1981), au fost primii care au sugerat folosirea termenului de variabilitate somaclonal, pentru descrierea variaiei fenotipice observat, dup mai multe pasri, la anumite plante regenerate din culturi de esuturi sau culturi de celule. Variaiile culturilor de esuturi au mai fost denumite caliclone (SKIRVIN i JANICK, 1976), fenovariante (SIBI, 1976) i protoclone (SEPARD i colab., 1980). Totui, se pare c termenul de variabilitate somaclonal descrie cel mai bine acest fenomen i de aceea a devenit un fel de termen standard.
24

Rodica Pop, 2008 Via de vie este una dintre principalele culturi horticole rspndite n toat lumea. Multe cultivare aparinnd unui numr mic de specii ale genului Vitis au fost comercializate n ultimele secole, dar industria necesit noi cultivare cu grad mrit de rezisten i productivitate. Metodele tradiionale de ameliorare sunt limitate din cauza duratei lungi a unei generaii i a naturii extrem de heterozigote a acestei culturi. Dezvoltarea metodelor biotehnologice, la plante, a dus la utilizarea tehnicilor in vitro n scopul ameliorrii culturilor. Variabilitatea somaclonal (LARKIN i SCOWCROFT, 1988) este considerat o surs de obinere de noi genotipuri de plante n ameliorare i perfecionarea tehnicilor, la nivel de culturi de esuturi, au deschis noi posibiliti pentru aplicaii n viticultur (ALLEWELDT i POSSINGHAM, 1988; MONETTE, 1988; DELOIRE i MAURO, 1991; PIVEN i colab., 1991; GRAY i MEREDITH, 1992). Unele publicaii au sugerat c, n principiu, embriogeneza somatic poate fi indus la diferite explante de vi de vie (KRUL i WORLEY, 1977; RAJASEKARAN i MULLINS, 1979; BOUQUET i colab., 1982; BESSIS i LABROCHE, 1985; HIRABAYASHI, 1985; REISCH i colab., 1985; MAURO i colab., 1986; MARCHEKO i colab., 1987; GRAY i MORTENSEN, 1987; GLEBA i colab., 1988; STAMP i MEREDITH, 1988; PIVEN i colab., 1991; COUTOSTHEVENOT i colab., 1992; GRAY 1992; MARTINELLI i colab., 1993; ZLENKO i TROSHNI, 1993; EMERSHAD i RAMMNING, 1994). Cu toate acestea, informaii despre variabilitatea la plantele regenerate sunt destul de puine, pn n prezent fiind raportate numai cteva exemple de variabilitate somaclonal la via de vie (BOUQUET, 1989; FALLOT i colab., 1990; DELOIRE i MAURO, 1991; PIVEN i colab., 1991). KUKSOVA i colab. (1997), citai de POPESCU i colab. (2004), au analizat variabilitatea caracterelor morfologice la 242 de plante, dintre care ase tetraploide, plante regenerate prin embriogenez somatic din fragmente de frunz. S-a constatat c majoritatea somaclonelor diploide au prezentat variaii minore ale morfologiei frunzelor. Totui, printre plantele regenerate din calus au fost identificate patru somaclone cu durat de vegetaie mai lung, trei cu o durat de vegetaie mai scurt i dou somaclone care au difereniat un numr mare de lstari fertili, comparativ cu
25

Rodica Pop, 2008 genotipul de origine Podarok Magaracha. Dintre somaclonele diploide au fost selecionate dou variante rezistente la Plasmopara viticola, opt variante rezistente la Botrytis cinerea i una foarte rezistent la ambii ageni patogeni. Plantele tetraploide s-au caracterizat printr-un fenotip atipic, prezentnd peiolul i internodiile mai scurte i mai subiri, frunze modificate, precum i o vigoare redus de cretere a butucilor. Variabilitatea caracterelor de rezisten la boli a plantelor regenerate in vitro din esuturi somatice, n vederea seleciei de noi genotipuri cu caliti superioare celor de origine, constituie un obiectiv important al unor staiuni de cercetare din ara noastr. Astfel, la staiunea tefneti au fost fcute observaii la un numr de 341 de plante, din care 32 obinute prin embriogenez somatic indirect din culturi de peiol, ovule i antere, 37 obinute prin embriogenez somatic direct din antere, 83 obinute prin organogenez din frunze i peiol, 97 obinute prin germinarea in vito a embrionilor zigotici imaturi, 92 obinute prin mutagenez in vitro. S-a constatat c majoritatea plantelor de vi de vie, indiferent de soiurile din care provin, de tipul de explant i de modelul de regenerare, s-au ncadrat n categoriile foarte rezistent i rezistent. Un exemplu l constituie plantele regenerate din calus difereniat din segmente de peiol aparinnd soiul Bezsemen. Acest soi era calificat mediu rezistent la man, iar plantele regenerate au intrat n categoria rezistent. De asemenea, plantele regenerate din fragmente de frunz i segmente de peiol, aparinnd soiurilor Aromat de Iai i Timpuriu de Pietroasa, sensibile la Plasmopara viticola, au manifestat un grad diferit de toleran la acest agent patogen, ncadrndu-se n categoriile rezistent i mediu rezistent (POPESCU, TEODORESCU, 2004). 1.2.1.1. Tipuri de variabilitate somaclonal Variabilitatea somaclonal se pare c rezult att datorit variabilitii genetice preexistente n plante, ct i ca o consecin a variaiei indus n timpul culturilor de esuturi. Exist dou tipuri de variabilitate somaclonal: variabilitatea ereditar, genetic (mutaional) i variabilitatea epigenetic (de expresie). Cnd nu se cunoate natura variaiei, dac este genetic sau epigenetic, se
26

Rodica Pop, 2008 accept folosirea termenului de variaie. Termenii variaie genetic i mutant se utilizeaz pentru desemnarea variaiei care se transmite sexuat conform legilor ereditii sau se menine timp de mai multe generaii obinute prin multiplicare vegetativ. Variaia heritabil rmne nemodificat pe parcursul ciclului sexuat sau prin nmulire asexuat. Explantele provenite de la prini maturi, prin multiplicare in vitro, se juvenilizeaz treptat. Culturile de esuturi se pot afla n orice stadiu al dezvoltrii, de la maturitate pn la juvenilitate. Plantele regenerate din aceste esuturi difer, depinznd de stadiul de dezvoltare pe care esutul l-a atins la acceptarea stimulului de regenerare. Uneori apar schimbri n necesitile nutriionale, schimbri cunoscute sub denumirea de habituaie celular. Alte schimbri epigenetice includ vigoarea extrem ex vitro care este probabil asociat fie cu revenirea juvenilitii fie cu eliminarea virusurilor realizat anterior in vitro (ABO i HILDEBRANDT, 1971). n timp, de cele mai multe ori, plantele cu variaii epigenetice revin la fenotipul parental. Vigoarea de scurt durat (temporar) a fost exploatat n culturile de esuturi pentru producerea de plante tinere viguroase care s fie transplantate uor, s creasc rapid i s devin stabile (SWARTZ i colab., 1981). Fenomenul de piticire este probabil epigenetic i poate fi datorat regulatorilor de cretere din mediul de cultur. Multe plante pitice revin ns la creterea normal dup unul sau doi ani de vegetaie normal n ser sau cmp. La via de vie, variabilitatea caracterelor i instabilitatea genetic a plantelor regenerate din antere a fost adesea semnalat i la plantele pe rdcini proprii transplantate n cmp. Astfel, plantele regenerate din antere prin embriogenez somatic, din hibridul interspecific Gloryvine (Vitis vinifera x Vitis rupestris), au prezentat anomalii de dezvoltare (piticire, albinism), variaii ale formei frunzei, ale sinusului peiolar i ale numrului de lobi foliari, caractere care s-au dovedit a fi tranziente. De asemenea, unele plantele obinute din embrioni somatici au prezentat tipuri diferite de floare, fiind hermafrodite, n timp ce Gloryvine este un genotip cu flori funcional mascule (POPESCU i TEODORESCU, 2004).

27

Rodica Pop, 2008 1.2.1.2. Importana variabilitii somaclonale Pentru ca variabilitatea somaclonal s aib un impact pozitiv n procesul de ameliorare este necesar s se urmeze o schem de multiplicare in vitro care s duc la obinerea unor plante care s manifeste variaii utile pentru procesul de ameliorare sau pentru producie (SKIRVIN i colab., 1994). Variaia somaclonal prezint avantaje i dezavantaje. Principalele dezavantaje sunt determinate de faptul c apariia i frecvena variaiilor depind de genotip. Foarte multe schimbri pot fi lipsite de importan, deci nedorite, iar altele sunt instabile epigenetice. De asemenea, unele variaii pot apare i spontan iar altele pot fi numai induse prin mutagenez. Mai mult, caracterele de interes economic pot s nu fie afectate de variaii. Se poate concluziona, deci, c nu exist certitudinea c parcurgerea unui ciclu de cultur in vitro va induce modificri ale unor nsuiri care prezint un interes specific. Un avantaj important const n faptul c variabilitatea somaclonal poate constitui o surs suplimentar de caractere utile, important mai ales pentru speciile care se nmulesc asexuat sau sunt apomictice i care au o baz genetic limitat. La unele specii, frecvena mare a modificrilor unor caractere face din variabilitatea somaclonal o surs de mutante utile. Rata mare de dublare a numrului de cromozomi prin cultura in vitro permite, la unele specii, diploidizarea haploizilor sau obinerea poliploizilor prin regenerarea plantelor in vitro. Incidena mare a rearanjamentelor structurale, mai ales a translocaiilor care au loc n timpul cultivrii in vitro, permite realizarea unor introgresii la hibrizii interspecifici i intergenerici. Multe schimbri se reflect favorabil asupra unor caractere importante din punct de vedere agronomic, cum sunt rezistena la boli sau la duntori, productivitatea, coninutul de proteine, tolerana la stress. Astfel de schimbri pot s apar la un singur regenerant sau la scara ntregii populaii de plante regenerate in vitro. Dei este un fenomen nou i care nu este pe deplin controlat, variabilitatea somaclonal a fcut posibil obinerea unor soiuri noi la unele specii cum ar fi:

28

Rodica Pop, 2008 Eustoma grandiflorum, Hemerocallis, Paulownia tomentosa, Pelargoniu, Torenia, Rubus, Apium, Ipomoea batata, Medicago sativa (BADEA i colab., 2001) (tabelul 1). Variaiile somaclonale pot reprezenta o metod de ameliorare superioar celei obinute prin transformrile genetice mediate de Agrobacterium, aceasta din urm implicnd dificulti tehnice mai mari ca n primul caz. Superioritatea variabilitii somaclonale pentru ameliorarea plantelor este dat de faptul c noile caractere se dezvolt la nivelul celor mai performante cultivare disponibile, n timp ce organismele transformate genetic sunt doar surse de gene favorabile ce trebuie, de regul, transferate celor mai productive cultivare. Tabelul 1 Cultivare horticole obinute din culturi de esuturi prin variabilitate somaclonal (dup SKIRVIN i colab., 1994) Horticultural cultivars derived from tissue culture via somaclonal variation (SKIRVIN et. al., 1994)
Cultivarul Cultivar Eustoma grandiflorum Hemerocallis Yellow Tinkerbell Paulownia tomentosa somaclona Snowstorm Pelargonium Velvet Rose Torenia Uconn White Sursa Source GRIESBACH i SEMENIUK, 1987; GRIESBACH i colab., 1988 GRIESBACH, 1989 MARCOTRIGIANO i JAGANNATHAN, 1988 SKIRVIN i JANICK, 1976b BRAND i BRIDGEN, 1989 HALL i colab., 1986b, 1986c HEATH-PAGLIUSO i colab., 1989 MOYER i COLLINS, 1983

Rubus Lincol Logan Apium somaclona UC-T3 Ipomoea batatas Scarlet

Variabilitatea somaclonal presupune inducerea expresiei genelor care sunt prezente n genom, dar care au fost reprimate ntr-un anumit stadiu de dezvoltare. Evident c trebuie s existe o certitudine c astfel de caractere sunt stabile de-a lungul a mai multor generaii de nmulire vegetativ, asexuat. De exemplu, MARETZKI (1987), citat de SKIRVIN i colab., 1994, a izolat o somaclon, la trestia de zahr (Saccharum officinarum L.), care prezenta rezisten la ptare (Pseudocercosporella heroptrichoides). Acest caracter a fost meninut stabil prin nmulire asexuat, timp de zece ani, dup care a fost pierdut, ceea ce sugereaz c
29

Rodica Pop, 2008 a fost fie o variaie epigenetic, fie c n cei zece ani a aprut o nou tulpin a ciupercii, pentru care variaia respectiv nu mai era rezistent.

1.2.1.3. Originea variabilitii somaclonale Cauzele apariiei variabilitii somaclonale nu sunt pe deplin cunoscute i elucidate. Cu toate acestea, se consider c variabilitatea somaclonal heritabil se datoreaz mai multor tipuri de variaii, cum ar fi modificri la nivelul unei singure perechi de baze azotate, deleiilor cromozomale, translocaiilor, modificrilor gradului de ploidie, variaiile nefiind limitate numai la nivelul ADN-ului nuclear. GENGENBACH i UMBECK (1982) au semnalat apariia variaiei mitocondriale n controlul androsterilitii utiliznd enzime de restricie pentru analiza ADN-ului mitocondrial izolat. ntregul spectru de variaii ereditare cunoscute, la nivel nuclear sau citoplasmatic, sugereaz c variabilitatea somaclonal care se bazeaz pe astfel de variaii, poate genera forme utile pentru mbuntirea cantitii i calitii produciei.

1.2.1.4. Variaia preexistent Explantele derivate provenite de la o singur clon, seminele sau puieii sunt uniformi din punct de vedere genetic, deci instabilitatea genetic spontan survine doar ca urmare a culturii in vitro (ORTON, 1983). Totui, aceast presupunere nu este ntodeauna ntemeiat deoarece explantele pot conine mai multe tipuri de celule, ca de pild floem, parenchim, cortex i xilem parenchimatic. Aceste celule pot fi, de asemenea, cu grade diferite de ploidie. Aceasta explic lipsa uniformitii explantelor multicelulare din punctul de vedere al gradului lor de ploidie. BRIGHT i colab. (1983) sugereaz ca explantele, provenite de la o alt surs dect protoplatii, s fie numite culturi complexe, datorit originii lor multicelulare. Himerele. Multe plante sunt cunoscute ca fiind himere. Ele sunt alctuite din sectoare de celule sau esuturi cu o constituie genetic diferit i acestea s-au dezvoltat din meristeme coninnd straturi sau sectoare cu esuturi mutante

30

Rodica Pop, 2008 (HARTMAN i KESTER, 1983). Plantele himere provenite din culturi de esuturi pot produce un procent mare de variaii ereditare. Mc PHEETERS i SKIRVIN (1983), citat de SKIRVIN (1994), au raportat c aproape jumtate din lstarii din murul himer fr spini, obinui din culturi de esuturi, au fost pitici i fr spini. O mare parte a variaiei a fost atribuit segregrii himerale. Dei multe tipuri de variaii somaclonale pot fi explicate cu termenul de himere segregate, regeneranii pot conine variaii somaclonale rezultate din diferite variaii, altele dect segregarea himeral simpl. Testarea variabilitii somaclonal preexistent se efectueaz prin supunerea plantelor obinute unei noi regenerri prin cultura in vitro. Clonele cu variaie preexistent, prezint variabilitate mai mare n prima generaie i mult mai mic n urmtoarele generaii. Dup a doua sau a treia generaie unele din variaiile preexistente pot fi eliminate sau stabilizate. Cea mai frecvent cauz a separrii himerelor o constituie producerea de lstari adventivi (MARCOTRIGIANO, 1990, citat de SKIRVIN i colab. (1994). Lstarii adventivi pot fi obinui in vivo sau in vitro. Acetia adesea apar de la o singur celul sau cteva celule, provenite din esuturi specifice (BROERTJES i KEEN, 1980, citai de SKIRVIN, 1994). Considernd c lstarii adventivi provin de la o singur celul, se poate afirma c orice sistem care produce lstari adventivi poate avea ca rezultat segregarea himeral. Formarea lstarilor adventivi, fiind rezultatul segregrii himerale, este corelat direct cu rata de inducere a variaiei somaclonale. (KARP, 1989). Este foarte bine cunoscut c lstarii cu origine preformat, de exemplu lstarii axilari, manifest mai puin variaie, dect aceia care apar de la muguri adventivi prin organogenez sau embriogenez (KARP, 1989). Cea mai mare parte a acestei variaii este, probabil, datorat variaiei preexistente sau variaiei induse n timpul formrii calusului, i nu procesului de formare a lstarului n sine. Invers, stabilitatea clonal este meninut cnd se evit formarea lstarilor adventivi (KARP, 1989). De aceea, n culturile de vrfuri de lstari moderat proliferative i bine ngrijite se ateapt o slab variaie, deoarece propagulele se dezvolt din muguri axilari i, n consecin, menin
31

Rodica Pop, 2008 integritatea stratului histogenic. Acesta a fost cazul murului non himeric. De fapt, utilizarea comercial a tehnicilor de nmulire prin culturi de esturi a murului non himeric, genetic fr spini, constituie o metod rapid, fr risc pentru producerea de plante uniforme, viguroase i productive. Studii recente arat c i la viaa de vie pot s apar himere. Astfel, cercetrile ntreprinse de BERTSCH i colab. (2005) la Vitis vinifera, evideniaz clona 96 a cultivarului Chardonnay ca fiind o himer periclinal care a fost testat i la nivel molecular cu markerii SSR VMC 6c10 i VMC 5g7. De asemenea, la cultivarul Meunier prin cultura in vitro de muguri adventivi au fost evideniate plantule considerate himere periclinale (POGANY i colab., 2006). 1.2.1.5. Inducerea variabilitii somaclonale Calusul este adesea asociat cu variabilitatea somaclonal, variaiile obinute din calus purtnd numele de caliclone. (SKIRVIN i colab., 1976, citat de SKIRVIN, 1994). La nceput cultivarele obinute in vitro, indiferent de specie, au fost numite caliclone. Variaia este asociat, n cazul caliclonelor, cu regenerarea direct din calus sau din suspensii de celule i nu cu micropropagarea sau cultura de meristeme (KARP, 1989). Legtura ntre calus i variabilitatea somaclonal este strns, cele mai multe laboratoare comerciale ncercnd s evite formarea calusului n oricare stadiu al micropropagrii. Iniierea calusului in vitro apare mai rapid la nivelul suprafeelor rnite, n zona de tiere a explantului n contact cu mediul de cultur. Formarea calusului este, probabil, analoag cu rspunsul la rnire, observat in vivo, care activeaz elementele transpozabile i stimuleaz apariia enzimelor i formarea produilor specifici indui de stress. (Mc CLINTOCK, 1984). Desigur, variaia nu este limitat doar la regenerarea calusului. EVANS (1988) relateaz, la regeneranii din frunze de Nicotiana alata Link x Otto, apariia variaiei unor caractere morfologice (forma florilor, forma frunzelor, nlimea plantelor, viabilitatea polenului) i a numrului de cromozomi. Variaia se observ, de asemenea, i printre plantele regenerate prin embriogenez.
32

Rodica Pop, 2008 1.2.1.6. Factorii care influeneaz spectrul i amplitudinea variabilitii somaclonale 1.2.1.6.1. Modul de regenerare Stabilitatea regeneranilor este mult mai mare n cazul cnd acetia se obin prin embriogenez somatic. Astfel, la Datura innoxia, plantele regenerate prin embriogenez somatic direct au fost diploide, n timp ce 70% dintre regeneranii obinui prin organogenez indirect au fost poliploizi. La via de vie, HIRABYASHI i colab., (1976), citai de POPESCU i TEODORESCU (2004) au obinut pentru prima dat regenerarea de lstari i rdcini din antere cultivate in vitro. Plantele regenerate au prezentat nivele variate de ploidie, observaiile microscopice efectuate pe materialul meristematic radicular recoltat de la regenerani au evideniat prezena celulelor cu numr diferit de cromozomi, cuprins ntre 19 i 38. Majoritatea lucrrilor publicate atest faptul c plantele de vi de vie regenerate din antere prezint caractere specifice de plant diploid. Determinri efectuate la soiul Grenache au relevat faptul c 86,5% din celulele radiculare prezentau un numr triploid de cromozomi (2n = 3x = 57). Numeroase lucrri care fac referiri la posibilitatea obinerii de calus cu celule haploide i celule cu diferite niveluri de ploidie i apoi de plante cu diferite niveluri de ploidie, dovedesc posibila origine gametic, iniial haploid, a structurilor regenerate. Instabilitatea extrem i capacitatea redus de supravieuire a haploizilor la via de vie a condus la ipoteza c patrimoniul genetic al speciilor de Vitis este bogat n gene letale recesive (POPESCU i TEODORESCU, 2004). 1.2.1.6.2. Regulatorii de cretere Regulatorii de cretere, n special 2,4-D (acidul 2,4 diclorfenoxiacetic) i 6benzilaminopurina (BAP), sunt implicai n inducerea variabilitii (EVANS, 1988; GRIESBACH i colab., 1988; SHOEMAKER i colab., 1991), dar relaia lor direct cu acest fenomen este nc discutat. Dei efectul specific al regulatorilor de cretere asupra frecvenei variaiei somaclonale rmne nc nesigur, n culturi de esuturi rata

33

Rodica Pop, 2008 variaiei crete, n general, n prezena unei concentraii mai mari de regulatori de cretere. Creterea amplitudinii variaiei manifestate la regenerani a fost observat la cpun, begonia, violete africane, la care s-a adugat o concentraie mare de hormoni n mediul de cultur. Se apreciaz c hormonii nu au un efect mutagen direct, ci ei acioneaz indirect, stimulnd creterea neorganizat sau selecionnd celule cu un anumit nivel de ploidie (BADEA i colab., 2001). De asemenea, concentraia mare a regulatorilor de cretere poate determina modificri n frecvena mutaiilor de ploidie, comparativ cu mutaiile punctiforme. Procesul fizic de excizare poate stimula rspunsul la rnire, pe care regulatorii de cretere l intensific (McCLINTOCK, 1984). Rezultatele experimentale ntreprinse cu scopul regenerrii de plante din esuturi somatice aparinnd unor genotipuri de Vitis au evideniat faptul c aportul exogen de regulatori de cretere constituie o cerin esenial pentru inducerea formrii de calus i/sau de muguri i lstari adventivi. Dintre auxine, acidul 2,4diclorfenoxiacetic (2,4-D), n concentraii cuprinse ntre 0,5-2,0 mg/l s-a dovedit foarte eficient pentru inducerea formrii de calus din variate tipuri de esuturi somatice (TANG i MULLINS, 1990). Rezultatele experimentelor realizate la diferite genotipuri de vi de vie au artat, de asemenea, c i acidul alfa-naftilacetic (ANA), n concentraii reduse, poate fi utilizat cu succes pentru inducerea formrii de calus i regenerarea de plante prin organogenez. Rezultatele obinute de TORREGROSA i BOUQUET (1996) arat c frecvena de regenerare de lstari este puternic condiionat de valoarea raportului cu citochinina prezenta n mediul de cultur. Astfel, cel mai ridicat nivel de exprimare a capacitii de organogenez a fost nregistrat la o balan hormonal citochinin/auxin de 100:1 (10M BA/0,1 M ANA). 1.2.1.6.3. Cultivarul Cantitatea variaiei ntlnit in vitro nu este aceeai pentru toate cultivarele unei specii (KURTZ i colab. 1983). Unele cultivare manifest o variaie n exces, dar majoritatea sunt relativ stabile. De exemplu, HWANG i KO (1986), citai de
34

Rodica Pop, 2008 SKIRVIN (1994), au raportat o rat a variabilitii de 3% la cultivarele de bananier, dar rata variaiei pentru cultivarul Cavendish al aceleai specii a fost de pn la 20%. 1.2.1.6.4. Vrsta cultivarului Dei la clonele vechi, nmulite asexuat timp ndelungat, este de ateptat o mai mare variaie preexistent dect la noile clone, se pare c exist o anumit corelaie ntre vrsta clonei (cultivarului) i cantitatea variaiei observat la somaclone. SHEPARD i colab. (1980) au fost printre primii care au raportat fenomene de variabilitate somaclonal. Ei au gsit mii de variante printre protoclonele (clone derivate din protoplati) de cartof ale cultivarului Russet Burbank. Din moment ce acest cultivar era vechi, o parte a variaiei ar fi putut fi datorat mutaiilor naturale preexistente, himerelor precum i condiiilor de cultur in vitro. Totui, este foarte dificil de explicat numrul mare al variaiilor observate la cultivarul de cartof Maris Bard (THOMAS i colab., 1982, citat de SKIRVIN i colab., 1994), care a fost lansat ca i cultivar, doar cu civa ani mai devreme (1974). n studiul cultivarului Maris Bard un singur regenerant a prezentat numrul caracteristic de cromozomi, n timp ce ceilali au manifestat o variaie neobinuit a numrului de cromozomi, ntre 49 i 95 fa de 48 ai tipului normal. 1.2.1.6.5. Nivelul de ploidie Se consider c frecvena variaiei somaclonale este mai mare la speciile poliploide i la cele nmulite vegetativ, dar variaii somaclonale au fost nregistrate i la specii care se reproduc sexuat fie poliploide, fie diploide (BADEA i colab., 2001). Din moment ce abilitatea regenerrii in vitro este o caracteristic heritabil la tomate, diferenele n rspunsul cultivarelor pot avea, de asemenea, o baz genetic. Un numr mare de relatri asupra variabilitii somaclonale se refer la izolarea, din culturi de calus ale unor linii de trestie de zahr, a unor plante cu un numr mare de cromozomi (HEINZ i colab., 1971, citat de SKIRVIN i colab., 1994). HEINZ i MEE (1971) au obinut linii de calus variate n ceea ce privete culoarea i creterea.
35

Rodica Pop, 2008 Fiecare din aceste linii au fost gsite mai trziu c aveau un numr diferit de cromozomi. Diferene similare de ploidie au fost observate i ntre plantele regenerate (SKIRVIN i colab., 1994). BINGHAM i MCCOY (1986), citai de SKIRVIN i colab. (1994), analiznd tipurile de variaie care pot s apar la trifoi, consider c acestea sunt n funcie de tipul de explant i nivelul de ploidie original. Cnd trifoiul diploid este regenerat, cel mai comun tip variaie cromozomal o constituie dublare spontan. Cnd tetraploizii sunt regenerai din calus sau protoplati, aneuploidia i duplicaiile sunt frecvente, ca i unele modificri n structura cromozomilor. S-a demonstrat c unele variaii identificate la nivelul ambelor tipuri de ploidie au fost heritabile (SKIRVIN i colab., 1994). 1.2.1.6.6. Sursa explantului Cnd se urmrete obinerea variabilitii somaclonale pentru o nou specie sau cultivar este bine s se utilizeze mai multe tipuri de explante i s se compare descendenii de la fiecare. Nu la toate tipurile de explante se presupune aceeai capacitate de manifestare a variaiei. n general, variaia este mai greu de observat la lstarii preformai (provenii din muguri axilari, vrfuri de lstari i meristeme), dect n cazul explantelor care nu au meristeme preformate, cum ar fi frunzele, rdcinile sau protoplatii. Plantele regenerate din protoplatii obinui la cultivarul de cartof Russett Burbank (SHEPARD i colab., 1980, citat de SKIRVIN i colab., 1994) au produs mii de descendeni diferii de soiul iniial, dintre care dou sau trei linii au fost selectate pentru o posibil utilizare. De asemenea, protoclonele de kiwi (Actinidia deliciosa) au prezentate variaii n ceea ce privete expresia sexului, creterea, vigoarea i morfologia frunzei (SKIRVIN i colab., 1994). Regeneranii obinui din explante organizate, cu meristeme preformate, sunt stabili din punct de vedere genetic. Explantele lipsite de meristeme preformate, care dedifereniaz, genereaz ns o mare variabilitate, pentru c sunt formate din tipuri celulare difereniate structural i funcional. La numeroase specii de plante, diferenierea celular este nsoit de modificri calitative i cantitative ale ADN-ului genomic: endopoliploidie, amplificarea sau deleia unor secvene etc. n consecin,
36

Rodica Pop, 2008 atunci cnd sunt folosite ca explante pentru obinerea calusului segmente de frunz sau rdcin, celulele difereniate dedifereniaz, adic ncep s se divid. Condiia nuclear in vivo se va reflecta astfel in vitro prin formarea unei populaii de celule cu modificri la nivelul genomului. Modificrile se vor regsi i la regenerani. Natura explantului influeneaz att frecvena ct i spectrul variaiilor. La somaclone i gametoclone de gru, a fost nregistrat un singur tip de modificare a gluteinelor cu greutate molecular mare, cu o frecven mai mare la plantele cu origine n microspori. n schimb, frecvena variaiilor enzimogramelor beta-amilazei a fost de numai 13% la gametoclone i de 59% la somaclone (BADEA i colab., 2001). La speciile de Vitis, culturi embriogene i regenerri de plante s-au obinut din numeroase tipuri de explante, cum ar fi antere, fragmente foliare, ovule, embrioni zigotici etc. Sunt ns i genotipuri de vi de vie la care s-a reuit regenerarea prin embriogenez somatic numai prin utilizarea unui anumit tip de explant (POPESCU i TEODORESCU, 2004). Embriogeneza somatic a fost observat la calusul iniiat din explante de crcel la Vitis vinifera L. cultivarele Thompson, Somaka i Tas-e-Gomesh, pe un mediu Emershad i Ramming suplimentat cu 1 mM 6 benzilaminopurin. n a treia i a patra subcultur pe acelai mediu s-a obinut un procent sczut de lstari. Lstarii aprui au dat natere ulterior la plntue ntregi pe un mediu lichid de nrdcinare care coninea 1 mM acid 3 indolil acetic. Este dezbtut posibila utilizare a crceilor ca noi explante pentru embriogeneza somatic la via de vie. (SALUNKHE, RAO, 1999). La via de vie, cercettorii chinezi ZOU i LI (1981), citai de POPESCU i TEODORESCU (2004), au fost singurii care au raportat regenerarea de plante haploide (n = 19) din cultura de antere a soiul Triumph. Dup doi ani de la plantarea n cmp, autorii au semnalat faptul c plantele au prezentat un aspect morfoanatomic normal, specific soiului de origine, iar numrul de cromozomi determinat a fost 2n = 38. ntr-un alt studiu s-a artat c anterele de Vitis latifolia L. (via slbatic) cultivate pe un mediu Nitsch i Nitsch suplimentat cu 20 mM 2,4-D i 9 mM BAP au produs calus dup 4-6 sptmni. Subcultivarea calusului pe un mediu Nitsch i Nitsch
37

Rodica Pop, 2008 cu un coninut de 10 mM NAA a produs embrioni somatici n decursul a ase sptmni. Pe un mediu de baz Nitsch i Nitsch, lipsit de regulatori de cretere embrionii somatici au evoluat n plntue dup 6-8 sptmni. Un gram de calus a produs mai mult de 400 de embrioni somatici, un procent de 13,7% din acetia, dnd natere la plntue care au fost ulterior transferate n sol. Plantele regenerate au avut grade diferite de ploidie fa de 2n = 38 i n = 19 (SALUNKHE, 1999). Cultura in vitro de antere i polen ofer posibilitatea manipulrii gradului de ploidie la plantele regenerate prin androgenez sau embriogenez. La plantele obinute prin androgenez au fost observate numeroase variaii morfologice, fiziologice, biochimice i cromozomale. O surs important de variaii somaclonale o constituie de asemenea i inducerea in vitro a haploidiei. Variaiile rezultate din procedurile de haploidizare, n majoritatea cazurilor, pot fi transmise prin reproducere sexuat, noile caractere putnd fi selectate la nivelul haploizilor dublai. Testarea i selecia variantelor somaclonale se poate realiza chiar la nivelul macrosporilor sau celulelor haploide, punnd n eviden gene utile, cum sunt cele care codific tolerana la stress sau rezistena la erbicide i fitotoxine specifice i care se pot exprima la acest nivel (POPESCU si TEODORESCU, 2004). 1.2.1.6.7. Genotipul Genotipul influeneaz att capacitatea de regenerare in vitro ct i amplitudinea variaiei somaclonale. De exemplu, la somaclone de gru provenite din dou soiuri i dou linii dublu haploide au fost evideniate diferene genotipice clare. Frecvena aberaiilor meiotice a fost de 27,77% la plantele provenite din cele dou soiuri i de 72,72% la regeneranii derivai din liniile dihaploide. Astfel de date sugereaz c plantele care au mai parcurs un ciclu de cultur in vitro, ciclu destinat obinerii haploizilor, sunt mai puin stabile dect soiurile, prezentnd cu o frecven mare (42,65%) restructurri cromozomale, ilustrate de anomaliile din meioz (BADEA i colab., 2001). ntr-un studiu al variabilitii somaclonale la plantele regenerate din culturile de

38

Rodica Pop, 2008 esuturi a dou specii cultivate de Xanthosoma sagittifolium i Xanthosoma violaceum, 18% din plantele regenerate la Xanthosoma sagittifolium au prezentat modificri morfologice stabile, n timp ce la Xanthosoma violaceum nu s-a constat nici o variabilitate semnificativ. S-a conchis c variabilitatea somaclonal, la Xanthosoma, se afl sub un control genetic (GUPTA, 1985). Rezultate similare pot fi gsite i n ceea ce privete variaia cromozomial. Frecvena regeneranilor tetraploizi, n cadrul a trei culturi provenite din protoplati de cartof, variaz ntre 12-65% (KARP, rezultate nepublicate). n mod asemntor, NAJARAN i WALTON (1987), citat de BEBELI i colab., 1990, au studiat cromozomii la regeneranii provenii din culturi de esuturi la patru genotipuri de Medicago media. Frecvena aneuploizilor difer semnificativ i a fost cea mai mare n cultivarul Heinrichs (64% din plante), intermediar la cultivarul Reaver (21%) i sczut la Br-1 i L-1 (10 i respectiv 9,4%). Diferene, privind frecvena i natura instabilitii cromozomiale, au fost, de asemenea, raportate la plantele regenerate din linii surori de secar (BEBELI i colab., 1990). La via de vie, rezultatele obinute n experimentele efectuate cu genotipuri aparinnd diferitelor specii de Vitis, experimente care au vizat regenerarea de plante din cultura in vitro de antere, indic c genotipul joac un rol determinant n exprimarea rspunsului embriogenic. RAJASEKARAN i MULLINS (1979), citai de POPESCU i TEODORESCU, 2004, arat c exist diferene mari ntre specii, soiuri i hibrizi ai genului Vitis, n ceea ce privete capacitatea de calusare i de difereniere a embrionilor somatici din anterele cultivate in vitro. Speciile Vitis rupestris i Vitis longii sunt creditate cu cea mai ridicat capacitate embriogen, fiind urmate de Vitis labrusca i Vitis champinii. Diferene mari au fost semnalate i ntre genotipurile aparinnd aceleai specii. Astfel, cercetrile au demonstrat c inducerea formrii de calus din antere a fost posibil numai la trei din 26 de genotipuri testate. Potenialul de regenerare din calusul difereniat n prima etap este de asemenea puternic dependent de genotip. Astfel, BOUQUET i colab. (1982), citai de POPESCU i TEODORESCU, 2004 au artat c au reuit s regenereze plante numai la 12 din 23 de genotipuri testate. De asemenea, se apreciaz c la Vitis vinifera, specia cea mai important din genul Vitis, potenialul de embriogenez, respectiv cel de regenerare de plante din
39

Rodica Pop, 2008 antere este foarte sczut i limitat la un numr mic de genotipuri, incluznd soiurile Gamay, Cabernet Sauvignon, Pinot Noir, Chardonnay, Mission, Valerien, Coarn neagr selecionat, Siegfried Rebe FS4 (POPESCU i TEODORESCU, 2004). 1.2.1.6.8. Durata timpului de cultur in vitro Lungimea intervalului dintre subculturile in vitro a fost considerat un factor important implicat n producerea variabilitii somaclonale. Pentru a menine stabilitatea clonal cele mai multe laboratoare comerciale cultiv ex vitro, n cmp sau ser exemplare din plantele obinute in vitro, pentru a verifica meninerea caracteristicilor cultivarelor. Multe laboratoare limiteaz numrul de subculturi ale unui explant, deoarece creterea numrului de cicluri de propagare este asociat cu frecvena mare a apariiei variantelor fenotipice. Cnd meninerea stabilitii clonelor este obligatorie (de pild n cazul pstrrii germoplasmei), culturile pot fi stocate n containere nchise n frigider sau n azot lichid (REED, 1990; REED i LAGERSTEDT, 1987, citai de SKIRVIN i colab., 1994). Un proiect pentru 100 de ani a fost nfiinat n Oregon pentru studiul efectului de pstrare pe termen lung a meristemelor de cpuni (Fragaria x ananassa Duch.). n general, pentru stabilitatea clonal, culturile in vitro se menin o perioad scurt de timp. n contrast, timpul lung de cultur poate fi o excelent surs de variaie. Calusurile i suspensiile celulare meninute n vitro timp ndelungat constituie i ele o surs de variabilitate. La via de vie, cercetrile ntreprinse de PAMFIL (1996) la 10 clone de Cabernet Sauvignon de provenien diferit cultivate n cmp, n condiii identice, timp de 3 ani i in vitro de peste 2 ani, au dus la evidenierea unui polimorfism evident la clona CS21 Australia, micropropagat in vitro. Evidenierea polimorfismului sugereaz existena unei variabiliti somaclonale care se datoreaz, cel mai probabil, micropropagrii prea ndelungate, respectiv 14 subculturi n decursul a peste doi ani (PAMFIL, 1996).

40

Rodica Pop, 2008 1.2.1.6.9. Rata de proliferare Culturile cu o rat de proliferare excesiv, manifest mai mult variaie dect acelea care au o rat de proliferare moderat. De exemplu, SMITH i DREW (1990), citai de SKIRVIN i colab., 1994, au raportat c ananasul poate fi nmulit prin metode convenionale, respectiv butai din care se pot separa patru sau cinci plante pe an. In vitro rata de multiplicare poate fi ntre 30 i 50 de plante pe lun. Datorit ratei de apariie a variaiei la culturile in vitro, metoda nu a fost acceptat. Cnd rata de proliferare n condiii in vitro a sczut la patru pe lun rata variaiei a sczut i ea la 5%. 1.2.1.6.10. Presiunea de selecie Presiunea de selecie in vitro este utilizat pentru alegerea unor linii celulare cu rezisten la boli, erbicide, la unii compui chimici. BINGHAM i McCOY (1986), citai de SKIRVIN i colab., 1994, au raportat selecia unei linii celulare de trifoi rezistent sau tolerant la etionin, sruri i la filtratul unor culturi de ciuperci. Totui, la plantele regenerate din aceste culturi cu rezisten la etionin, sruri i filtrantul de ciuperci, numai caracterul de rezisten la boal a fost exprimat la nivelul ntregii plante. WIDHOLM (1988) a trecut n revist utilizarea culturilor de esuturi n vederea selectrii liniilor celulare valoroase pentru cercetare i industrie. El afirm c selecia direct pentru caractere monogenice are mai mult succes dect cea pentru caractere poligenice (SKIRVIN i colab., 1994). Pentru ca selecia s aib valoare pe timp lung pentru ameliorarea plantelor, caracterul observat la nivel celular trebuie s se exprime la nivelul ntregii plante. Din pcate, nu este sigur c toate genele care se exprim la nivel celular se vor exprima, n aceeai manier, la nivelul ntregii plante. De exemplu, la tutun s-au raportat linii celulare care au produs cantiti mai mari de nicotin, dar regeneranii au produs nicotin la un nivel normal. Totui, producerea unui nivel mare de nicotin a fost restabilit n cultura de calus provenit de la plantele regenerate. Aceast diferen indic c gena pentru producerea unei cantiti mari de nicotin a fost prezent, dar
41

Rodica Pop, 2008 exprimarea ei nu are loc dect la nivel celular. Aceste date sugereaz c obinerea de compui farmaceutici din cultura de celule poate fi mai puin costisitoare dect meninerea plantelor ntregi n cultur. HAMMERSCHLAG (1990) i

HAMMERSCHLAG i colab. (1991), au izolat clone de piersic (Prunus persica L.) cu rezisten la Xanthomonas campestris pv. Pruni. Unele din aceste clone au continuat s manifeste rezisten la boal timp de doi ani, n timp ce pentru alte plante acest caracter a fost efemer. Colectarea seminelor de la aceste plante constituie un nou nceput pentru studiile de heritabilitate a caracterelor la somaclonele respective. Cercettorii trebuie s-i aminteasc faptul c, n cultura de esuturi, explantul este supus n mod constant unei presiuni de selecie. WIDHALEM (1981) de exemplu, a sugerat c condiiile de cultur in vitro sunt att de nenaturale pentru celulele plantelor, nct numai celulele care prezint cea mai rapid cretere pot supravieui subcultivrilor repetate. O dovad n acest sens o constituie observaia c suspensiile de celule de curnd nfiinate sunt aglomerate i au o cretere lent. n timp, rata creterii suspensiilor de celule se accelereaz i mrimea agregatelor scade. Mai mult se consider c aceste celule i culturi de esuturi nu cresc egal, la fel n toate laboratoarele, datorit seleciei neintenionate realizat de mediile de cultur i de condiiile specifice laboratorului (SKIRVIN i colab., 1994). 1.2.1.6.11. Condiiile de cultur Aberaiile genomice n celulele plantelor i animalelor cultivate in vitro apar, cel mai adesea, cnd acestea sunt scoase de sub influena controlului exercitat de organismul ntreg i sunt plasate n condiii nenaturale. Cnd o plant este excizat i rnit n vederea transferului n cultura in vitro, sistemele de control care regleaz ntreaga plant sunt ntrerupte. De exemplu, n planta ntreaga calusul este rspunsul la rnire i rareori dobndete un nivel de organizare celular suficient pentru a produce lstari sau rdcini. n culturile de esuturi, calusul este frecvent o faz comun prin care trec prile excizate din plant, nainte de organizarea meristematic care poate produce rdcini, lstari sau ambele. Regulatorii de cretere sau ali stimuli in vitro mediaz aceste evenimente, de aceea nu este surprinztoare apariia de lstari adventivi cu fenotipuri anormale.
42

Rodica Pop, 2008 1.2.1.6.12. Rata variaiei somaclonale Analizele vizuale ale regeneranilor au fost insuficiente pentru aprecierea magnitudinii variabilitii somaclonale. Cu ajutorul analizelor biochimice i cromozomale, s-a demonstrat o frecvena a variaiilor uneori de 100%, dar cel mai adesea aceasta a fost cuprins ntre 15-20% (EVANS, 1988). Astfel de constatri sunt n contrast cu rata mutaiilor naturale care apar ntre 1 la 100.000, pn la 1 la 1.000.000 pentru un anumit locus (SKIRVIN i colab., 1994). LARKIN (1984) a raportat o variabilitate ntre 3% i 26% pentru fertilitate la gru (Triticum aestivum L.); EVANS (1988), a raportat c frecvena unei singure gene mutante a fost de aproape o mutaie la fiecare 20-25 de plante regenerate (SKIRVIN i colab., 1994). ORTON (1987) arat c liniile de elin (Apium graveolens L.) izolate in vitro au variat cu 100% din punct de vedere cromozomal fa de prini. Dei rata variabilitii somaclonale pare mare, trebuie avut n vedere c apariia acesteia este un fenomen ntmpltor care poate apare n oricare locaie din genom. Aceste schimbri ntmpltoare sunt totalizate ca rat total a variabilitii, prezentat n cele mai multe lucrri tiinifice. Adevrata rat a variabilitii somaclonale este dificil de stabilit, datorit faptului c sunt multe gene individuale de examinat. Multe somaclone sunt identice, sugernd originea variaional comun. DAVIES i colab.(1986) au demonstrat c anumite tipuri de variaii au aprut repetat n cadrul grupurilor de plantule de Paspalum dilatatum Poir, derivate din aceeai surs de explant. Ei au postulat c anomaliile aprute cu o rat mare sunt datorate variaiei produse mai devreme n cultura de calus din care au fost selecionate neintenionat sectoare de calus i apoi subcultivate. LEE i colab. (1987) au fcut observaii asemntoare la porumb (Zea mays L.). Ei au gsit c aceleai culturi, adesea produc mai multe plante care au segregat pentru variante fenotipic identice. Aceast variaie a aprut, probabil, mai devreme n iniierea culturii, ducnd la o supraestimare a frecvenei variabilitii somaclonale. Bazat pe literatur i experiena profesional, autorii de mai sus consider c cel mai real nivel al variabilitii somaclonale ateptat in vitro este, probabil, ntre 1% i 3%. Aceasta nu

43

Rodica Pop, 2008 nseamn c, n experiene, ar trebui ateptat o rat ntre 1 i 3% a mutaiei la un anumit locus a plantelor regenerate, ci c 1% sau 3% din regenerani variaz fa de prini din punct de vedere fizic sau biochimic fr a ti, cu siguran, dac aceste variaii sunt ereditare sau nu. n concluzie, variabilitatea somaclonal este o surs de variaie valoroas pentru ameliorarea plantelor. Pn la ora actual, variabilitatea somaclonal este considerat un proces ntmpltor care poate deveni util cercettorilor, cu condiia ca acetia s-l poat controla i direciona n vederea atingerii elurilor propuse. Dezvoltarea protocoalelor pentru regenerarea speciilor recalcitrante va facilita accesul la variaia natural i indus prin culturile in vitro. 1.2.1.7. Tipuri de modificri genetice asociate variabilitii somaclonale n celula vegetal cultivat in vitro apar frecvent o serie de modificri la nivelul materialului genetic: poliploidii, aneuploidii, restructurri cromozomale, schimbri ale structurii i expresiei genelor etc. Unele modificri au fost observate i la plantele obinute prin mutageneza clasic. Poliploizi au fost obinui la orez, orz, porumb, tutun, prin cultura de celule i esuturi. La Nicotiana tabacum, din calusul obinut din mduv de tulpin de la plante haploide i diploide a regenerat plante dihaploide i tetraploide. Poliploidia poate preexista n explante sub forma celulelor cu nuclei endoreduplicai, dar poate s apar i in vitro, prin dou mecanisme: perturbarea funciei fusului mitotic endoreduplicarea cromozomilor.

Aneuploizii sunt mai frecveni n populaiile de plante regenerate la speciile poliploide dect la speciile diploide. Frecvena apariiei plantelor aneuploide este infleunat, de asemenea, de tipul de sistem de cultur in vitro i de durata culturii. La lucern, printre regeneranii din suspensii celulare s-au numrat hiper i hipoaneuploizii (BADEA i colab, 2001). Prin cultura in vitro de embrioni somatici la via de vie s-au regenerat plante diploide i tetraploide. Tetraploizii, obinui i cultivai n cmp au prezentat un fenotip diferit de cel normal: internodii i peioluri mai scurte i mai groase, modificri
44

Rodica Pop, 2008 morfologice ale frunzelor i cretere redus. Testul t a relevat diferene semnificative n ceea ce privete lungimea internodiilor la somaclonele diploide i cele tetraploide (KUKSOVA, 1997). Pe un mediu adecvat de cultur in vitro, din antere de Vitis latifolia L. (via slbatic) s-a obinut calus, care prin subcultivare a produs embrioni somatici.

Embrionii somatici obinui au evoluat n plntue care apoi au fost transferate n sol. S-a constatat c plantele regenerate au avut grade diferite de ploidie fa de 2n = 38 i n = 19 (SALUNKHE, 1999). 1.2.1.8. Mecanismele variabilitii somaclonale Pn n prezent au fost avansate trei ipoteze privind mecanismele variabilitii somaclonle. KARP (1991, 1994) consider c mecanismul care determin apariia, cu frecven mare, a variabilitii somaclonale ereditare const n schimbarea nivelurilor de metilare ale ADN-ului, ceea ce induce modificri n secvena bazelor i n structura cromatinei. Intensificarea metilrii determin heterocromatinizarea cromatinei, avnd ca efect o replicare ntrziat i apariia punilor n anafaz, ruperea cromozomilor i apariia rearanjamentelor (duplicaii, inversii, translocaii). BARBARA MCCLINTOCK (1984) sugereaz c apariia variabilitii genetice in vitro ar fi o reacie la stres. Ea consider c izolarea, cultivarea i obinerea calusului sunt experiene traumatizante pentru celule. 1.2.1.9. Metode de evideniere a variabilitii somaclonale Analiznd plantele regenerate in vitro din punct de vedere morfologic, fiziologic, biochimic, citogenetic i molecular s-a putut constata existena unor variaii evidente. Variabilitatea generat de cultura in vitro poate constitui o surs de caractere valoroase pentru ameliorare, cu condiia s fie stabil i s se transmit la descendeni. Stabilitatea regenerantelor este de dorit n micropropagare i inginerie genetic, n timp ce variabilitatea lor este util n ameliorare. n ambele cazuri populaia plantelor regenerate se evalueaz la nivel fenotipic, biochimic, citogenetic i molecular.
45

Rodica Pop, 2008 Studiul numrului i structurii cromozomilor permite corelarea modificrilor fenotipice cu schimbrile induse in vitro la nivelul genomului. Astfel, la lucern, prin analiza cariotipului unor protoclone ce prezenta modificri fenotipice, s-a evideniat existena unor protoclone cu numr aneuploid de cromozomi i dou translocaii. Metodele moleculare pot evidenia variaia metilrii ADN, modificri ale succesiunii bazelor sau a numrului de copii ale secvenelor repetate la plantele regenerate din celule care au parcurs unul sau mai multe cicluri de cultur in vitro. Utilizarea sondelor specifice a evideniat, la cartof, polimorfism la nivel ADN corespunztor genelor care codific ARN-ul ribozomal. Utilizarea markerilor moleculari a evideniat somaclone la gru, orez, tutun, usturoi, care prezentau polimorfism la nivelul ADN-ului nuclear i citoplasmatic. n cazul n care variaiile fenotipice ale somaclonelor nu pot fi asociate unor modificri ale structurii i sau numrului de cromozomi prin analize citogenetice se studiaz descendena obinut prin autofecundare. Se pot ntlni urmtoarele situaii: identitatea descendenei cu planta de origine; uniformitatea descendenei n privina unui caracter fenotipic nou mutaie homozigot, de o expresie genic nou sau ca rezultat al amplificrii ori deleiei unor regiuni cromozomale implicate n determinarea caracterului respectiv; segregarea descendenei conform rapoartelor mendeliene - mutaie la nivelul unui locus implicat n determinarea unui caracter alternativ. Mutaiile genice pot fi induse i prin transpoziie sau restructurri cromozomale minore, care nu pot fi detectate prin analiza cariotipului. Pentru a determina compartimentul celular implicat n apariia variabilitii i modul de transmitere a noului caracter, se poate recurge i la ncruciri dialele sau reciproce (BADEA i colab., 2001). La via de vie, variabilitatea somaclonal a fost identificat, pn n prezent, n majoritatea cazurilor, pe baza manifestrilor morfologice. Atunci cnd ele nu s-au etalat evident, au fost utilizate i analizele biochimice comparative ce includ de obicei electroforeza unor proteine. Analiza microscopic a cromozomilor, dei foarte laborioas a fost des utilizat fr ns ca ea s poat fi aplicat la nivelul ntregii
46

Rodica Pop, 2008 plante. Progresele fcute n ultimii ani n domeniul biologiei moleculare privind utilizarea markerilor genetici i n special dup perfecionarea reaciei PCR (Polimerase Chain Reaction) de amplificare a unor fragmente de ADN (SAIKI i colab., 1988, citai de Pamfil, 1999) au fcut ca identificarea variabilitii somaclonale pe baza polimorfismului ADN s devin o realitate. 1.2.1.10. Mutageneza in vitro Includerea, n mediul de cultur, a agenilor mutageni poate induce, n celulele plantelor superioare cultivate in vitro un spectru larg de mutaii biochimice i metabolice. Astfel se pot obine mutante rezistente la diferite substane chimice sau antimetabolii ca i la diverse condiii nefavorabile de mediu. De pild, au fost selecionate mutante rezistente la diferite antibiotice, erbicide, pesticide, toxine produse de ciuperci, derivai ai bazelor azotate purinice i pirimidinice, exces de sruri etc. Primele mutante in vitro au fost induse i detectate de CARLSON (1967, 1970), BINDING (1970). MALICA i colab. (1973) au obinut la Nicotiana tabacum, celule din care au regenerat plante rezistente la streptomicin, caracteristic transmis pe linie matern, fapt care indic o mutaie citoplasmatic. Un aspect practic important este obinerea de linii mutante ce manifest o producie mrit de aminoacizi. Astfel, HIBBERG (1978) a obinut linii celulare de porumb ce manifest o capacitate ridicat de sintetizare a metioninei, lizinei sau izoleucinei. CHALEFF i CARLSON (1975), folosind amino-etil-cisteina, au obinut linii celulare mutante de Oryza sativa, care au capacitatea de a acumula o cantitate dubl de lizin. Rezistena la boli a fost prima caracteristic de interes agrochimic cercetat la nivel celular in vitro i apoi la nivelul plantei ntregi. Pentru inducerea rezistenei la boli, mediul de cultur este suplimentat cu o concentraie letal din toxina bolii. Metoda a fost aplicat pentru selecia unor mutante de tutun rezistente la atacul
47

Rodica Pop, 2008 bacteriei Pseudomonas tabaci. Cu toate avantajele pe care le prezint, mutageneza in vitro are totui anumite limite. O serie de caracteristici agronomice nu pot fi manipulate n interaciunea genotip mediu aa cum ar fi manipulate la nivel celular (TMA, 1998). n general, selecia de mutante s-a realizat n culturi de celule obinute de la plante diploide. Dac mutantele observate sunt dominante ele se manifest ca atare. Utilizarea de celule haploide se pare c ar fi mai eficient deoarece n astfel de celule frecvena mutaiilor observate este mult mai mare (se manifest fenotipic i mutaiile recesive). Deocamdat nu exist culturi de celule hapolide perfect stabile, care s poat fi folosite n lucrri de inducere a mutaiilor. Obinerea unor mutante celulare i, pe aceast baz, a unor plante cu rezisten la erbicide, la toxinele unor ageni patogeni, la salinitatea solului, la temperaturi sczute, precum i a unor mutante cu producii mrite ale unor aminoacizi, prezint importan n ameliorarea plantelor. De asemenea, realizarea unor linii celulare mutante are importan aplicativ, ele putnd fi folosite n culturile industriale de celule n suspensie, ca o alternativ la cultura plantelor. Pe aceast cale, va fi posibil producia industrial a unor substane medicinale, primele rezultate obinute n aceast direcie fiind ncurajatoare. (CACHI, 1984). n vederea inducerii de mutaii in vitro la via de vie s-au utilizat radiaiile gamma 5-100 Gy. n urma iradierii, s-a constatat o cretere a frecvenei de apariie a plantelor tetraploide din calus primar (7%) i din cel embriogenic (7,6%), depistnduse totodat i plante aneuploide (KUKSOVA, 1997). n acest studiu tratamentul cu colchicin nu a avut ca efect obinerea de plante tetraploide. Variabilitatea plantelor regenerate a fost confirmat dup testarea acestora n cmp (KUKSOVA, 1997). Analizele citologice la plantele regenerate s-au efectuat din vrfuri de rdcin. Rdcinile tinere (de 10-14 zile au fost supuse unui pretratament cu soluie de

colchicin (0,03%) timp de 2 ore, apoi au fost fixate cu fixativ Carnoy (trei pri etanol absolut: o parte acid acetic glacial) timp de 4-5 ore la 40C i fixate cu orcein acetic 1%, timp de 5-6 zile la 40 C. Vrfurile de rdcin colorate au fost zdrobite n acid acetic 45% i apoi s-a realizat numrarea cromozomilor. La plantele tetraploide numrul de cromozomi a fost analizat i la celulele meristemelor apicale. La fiecare
48

Rodica Pop, 2008 plant s-au numrat cromozomii din 4-18 preparate metafazice (n medie 10 celule). n timp ce calusurile iradiate cu doza de 500 Gy nu au produs embrioni somatici, iradierea cu 10 Gy se pare c a grbit procesul de embriogenez somatic. Embrionii somatici au aprut n timp de dou sptmni de la pasarea calusului de pe mediul DB8 pe mediul NB7, fa de 3-4 luni care sunt necesare n mod obinuit. Acest efect a fost pentru prima oar descris de NOVAK i colab. (1985) la porumb, specie la care s-a observat c dozele mici de iradiere cu raze gamma stimuleaz embriogeneza somatic i capacitatea de regenerare n culturile de calus. Efectul iradierii n embriogeneza somatic la vi trebuie investigat din cauz c multe cultivare sunt recalcitrante la regenerare, iar asemenea noi abordri ale problemei pot fi utile (HBERT-SOUL i colab., 1995). n urma iradierii embrionilor somatici s-au regenerat plante diploide i tetraploide. Calusurile embriogene cu embrioni somatici n diferite stadii de dezvoltare au fost iradiate cu diferite doze. Doza de 500 Gy a fost letal pentru calusurile embriogene. Iradierea cu alte doze a dus la obinerea unor embrioni somatici secundari i de plntue. ntre plantele regenerate n urma experimentelor numrul de tetraploizi (7,6%) a fost acelai cu tetraploizii obinui n urma iradierii calusului primar (7%). S-a conchis c doza de 5 Gy a fost cea mai eficient pentru producerea de plante tetraploide. Rezultate surprinztoare s-au obinut la calusurile iradiate cu 40 Gy; aceast doz a dus la apariia unui procent mare de plante aneuploide (67,4%). n general, iradierea cu raze gamma, att a calusurilor primare ct i a celor embriogene (cu embrioni somatici) s-a dovedit a fi o metod eficient pentru sporirea numrului de plante tetraploide, iar diferenele ntre plantele tetraploide iradiate i cele neiradiate au fost statistic semnificative. Rezultatele sunt n concordan cu alte date descrise n care s-a dovedit c radiaiile gamma cauzeaz endopoliploidizarea n culturile de esuturi i celule la mai multe specii (HOWLAND i HART, 1977; CONSTANTIN, 1981). Rezultatele sugereaz c inducerea embriogenezei somatice, combinat cu iradierea cu raze gamma, duce la apariia variabilitii somaclonale la via de vie i n mod deosebit la apariia tetraploizilor. Dac aceast metod este acceptat de amelioratori, ea va constitui o alternativ a procesului clasic de producere a tetraploizilor de vi de vie (KUKSOVA, 1997).
49

Rodica Pop, 2008 1.2.1.11. Transformarea genetic Transformarea genetic constituie procesul prin care sunt transferate plantelor cultivate gene care confer caractere utile. Genele transferate poart numele de transgene, iar plantele transformate se numesc transgenice. Pentru obinerea de plante transgenice, trebuie identificat, izolat i amplificat gena care determin caracterul util. Gena exogen, numit i de interes, trebuie s fie transferat n planta supus transformrii genetice. Transformarea genetic prezint importan prin faptul c extinde sursele de biodiversitate, i uneori, accelereaz la unele specii procesul de ameliorare. La plante, transferul genelor de interes se poate realiza la nivelul protoplatilor, celulelor sau esuturilor, fie indirect prin intermediul vectorilor biologici, fie direct prin metode fizice i chimice. Vectorii biologici curent folosii sunt bacteriile (genul Agrobacterium) i virusurile. Metodele fizice i chimice includ: incubarea protoplatilor cu polietilen glicol; electroporarea protoplatilor, celulelor i eusturilor; microinjecia ADN exogen n protoplati, polen, embrioni; electroforeza embrionilor; bombardarea cu particule purttoare de ADN exogen; agitarea esuturilor n amestec cu fibre de carbid silicon i ADN exogen

(BADEA i colab., 2001). La via de vie, cu toate c s-au nregistrat progrese privind aplicarea metodelor de inginerie genetic prin transfer de gene exist unele cultivare recalcitrante la transformarea genetic (MULLINS i colab., 1990). Unele cercetri arat faptul c la Vitis vinifera transformarea genetic mediat de unele specii din genul Agrobacterium cum ar fi Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes sau Agrobacterium vitis se realizeaz cu dificultate. Dintre factorii implicai n transformarea genetic se pot aminti: sua bacterian, mediul de cultur utilizat pentru meninerea calusului embriogen i genotipul cultivarului de vi de vie (TORREGROSA i colab., 2002) .

50

Rodica Pop, 2008 La via de vie, un rol important n reuita transformrii genetice l are identificarea unor protocoale privind selecia potenialelor plante transformate genetic prin intermediul bacteriilor din genul Agrobacterium (PEROS i colab., 1998, BORNHOFF i colab., 2000). Plantele transgenice au fost regenerate in vitro prin organogenez i embriogenez. Ca i sur de explante s-au utilizat muguri apicali, limb i peiol de frunz i embrioni zigotici. Regenerarea din embrioni somatici a fost utilizat pentru transformarea genetic a unor cultivare importante att pentru producia de vin ct i pentru struguri de mas. Plantele transgenice de vi de vie pot fi obinute prin transformarea calusului embriogen provenit din diferite esuturi incluznd embrioni zigotitici, frunze, ovare i filamente staminale (MEZZETTI i colab., 2002). Studii mai recente arat faptul c la unele specii de vi de vie s-au nregistrat progrese privind transformarea genetic a culturilor in vitro de embrioni somatici folosind co-cultivarea cu Agrobacterium sp. Astfel, plante transgenice au fost obinute la Vitis rupestris, soiul St. George, la Vitis rotundifolia, soiurile Alachua i Carlos, la Vitis vinifera, soiurile Cabernet Franc, Chardonnay, Merlot, Pinot Noir, Sauvignon Blanc etc., precum i la unii hibrizi (DHEKNEY i colab., 2007).

1.3. EVIDENIEREA VARIABILITII GENETICE CU AJUTORUL MARKERILOR MOLECULARI 1.3.1. Markerii RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Polimorfisme de ADN amplificate aleator Tehnica PCR (Polymerase Chain Reaction), clonarea ADN-ului i secvenierea acestuia sunt tehnici folosite n mod curent n laboratoarele de biologie molecular. Aceast metod, descoperit n anul 1988 de ctre KARY MULLIS i colaboratorii lui (SAIKI i colab, 1985), constituie subiectul a peste 60 de cri i zeci de mii de articole din domeniul biologiei moleculare. n anul 1993, KARY MULLIS primete pentru descoperirea sa premiul Nobel pentru Chimie. Metoda se bazeaz pe amplificarea enzimatic a ADN-ului in vitro. Pornind de la o cantitate foarte mic din matria de ADN (la nivel de nanograme), se obin
51

Rodica Pop, 2008 milioane de copii ale unuia sau mai multor fragmente int de ADN, care pot fi apoi supuse electroforezei i vizualizate prin colorare sau prin autoradiografie. PCR-ul se caracterizeaz printr-o vitez mare, selectivitate i sensibilitate. Aplicaiile lui n diferite variante i scopuri au deschis o multitudine de noi posibiliti n biologia molecular (METZKER, 2001). Tehnica PCR permite amplificarea selectiv a unor secvene specifice de ADN ntr-un numr mare de copii, procedeul eliminnd clonarea molecular. Pentru amplificarea unui fragment int de ADN se concep dou secvene monocatenare oligonucleotidice de ADN (15-30 nt) denumite primeri sau amorse. Secvenele primerilor sunt concepute n aa fel nct ntr-o reacie de hibridizare molecular ei s se ataeze specific, pe baz de complementaritate, de secvenele situate de o parte i de alta a secvenei int ce urmeaz a fi amplificat. Amplificarea este eficient atunci cnd situsurile de fixare ale celor doi primeri nu sunt mai deprtate de 4 kb (cu toate c amplificarea produilor se poate face pn la 10 kb). n prezena unei ADN polimeraze termostabile i a celor patru dezoxiribonucleozid trifosfai (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), primerii iniiaz sinteza a dou noi catene de ADN, complementare catenelor din fragmentul de ADN- int (NEWTON, 1995). n anul 1990 n mai multe laboratoare s-a introdus o strategie nou pentru amplificarea PCR a unor secvene de ADN genomic. Ea utilizeaz unul sau doi primeri cu o secven arbitrar, bogai n G i C pentru a obine produi de amplificare PCR din ADN genomic. Aceste tehnici nu necesit informaii despre secvena de ADN i au fost denumite: analiza polimorfismelor ADN amplificate aleator (RAPD) (WILLIAMS i colab., 1990); amprenta obinut prin amplificarea ADN (DAF) (CAETANO-ANNOLS i colab., 1991); PCR cu primeri arbitrari (AP-PCR) (WELSH i McCLELLAND, 1990). Natura polimorf a secvenelor de ADN amplificate este, la rndul ei, redat de o nomenclatur polimorf. S-a propus un termen unic, MAAP (Multiple Arbitrary Amplicon Profiling), care s descrie caracteristicile comune tehnicilor menionate
52

Rodica Pop, 2008 (tabelul 2). Tabelul 2 Tehnicile MAAP (profilul ampliconilor aleatori multiplii) (dup DORDEA i colab., 2000) MAAP Techniques (Multiple Arbitrary Amplicon Profiling) (DORDEA et al., 2000) Caracteristici Characteristics Rezoluia fragmentelor Separarea fragmentelor Vizualizarea fragmentelor Lungimea primerului Concentraia primerului DAF mare poliacrilamida colorare cu azotat de argint 5-15 nt 3-30 mM AP-PCR intermediara poliacrilamida radioactivitate 20-34 nt 3 mM RAPD mic agaroza bromura de etidiu 9-10 nt 0,3 mM

Toate cele trei tehnici au n comun faptul c fragmentele de ADN necunoscute sunt amplificate cu primeri avnd o secven de nucleotide aleatoare. Fragmentele de ADN amplificate, numite n PCR ampliconi, rezult prin fixarea primerilor la situsuri parial sau total complementare fiecrei catene de ADN. Cu toate c nu se cunoate nimic despre identitatea i contextul secvenei din care provine un anumit produs de amplificare, prezena sau absena lui n diferite organisme constituie o informaie important pentru evaluarea diversitii genetice i a relaiilor de nrudire. n unele cazuri rezult modele caracteristice unui anumit genotip, care sunt o adevrat amprent genetic, reprezentat asemntor codului de bare. Analiza RAPD a fost prima oar descris de ctre WILLIAMS i colaboratorii lui n anul 1990. Tehnic este cea mai simpl variant a metodei PCR cu primeri arbitrari. n general se folosesc primeri cu 10 nucleotide i cu un coninut n GC de cel puin 50%. Produii de amplificare sunt separai ntr-un gel de agaroz i apoi sunt vizualizai prin colorare cu bromur de etidiu. Primerii cu un coninut sczut de GC nu determin apariia produilor de amplificare. Datorit faptului c legtura G-C const n trei puni de hidrogen i cea de A-T din numai dou, un hibrid primer/ADN cu mai puin de 50% G-C nu va suporta temperatura la care are loc polimerizarea (72 0C). n consecin, hibridul primer/ADN se va topi nainte ca polimeraza s nceap procesul de polimerizare. Din moment ce
53

Rodica Pop, 2008 ordinea nucleotidelor din cadrul primerului decamer este arbitrar, nu sunt necesare cunotine prealabile despre secvena de ADN care urmeaz s fie amplificat, primerii putnd fi utilizai n mod universal att la eucariote ct i la procariote. Optimizarea protocolului RAPD poate fi o problem extrem de dificil, modificarea componentelor de reacie sau a programului utilizat la amplificare putnd avea consecine imprevizibile. Cel mai mare impact asupra rezultatelor l au att tipul de polimeraz i thermocycler-ul utilizat ct i primerul i temperatura de fixare a acestuia. Concentraia primerilor n amestecul de reacie este n general optim ntre 0,12 M. Exist o larg varietate de polimeraze termostabile care pot fi utilizate pentru amplificare, cele mai folosite fiind Taq polimeraza (Promega) i AmpliTaq (Perkin Elmer). n 1988 SAIKI i colab., utilizeaz pentru prima dat o ADN polimeraz termostabil (ADN polimeraza Taq), extras din bacteria termofil Thermus aquaticus, fapt ce a permis automatizarea PCR, marcnd nceputul unei noi ere n genetica molecular. Taq-Polimeraza este o ADN-polimeraz cu greutatea molecular de 94.000 dal, termostabil, acionnd eficient la 75-800C. Aceast polimeraz necesit pentru activitate prezena unei secvene de nucleotide ca primer (MOLDOVEANU i colab., 2001). Amprenta ADN difer frecvent n funcie de polimeraza folosit. Din aceast cauz alegerea iniial este foarte important, schimbarea enzimei determinnd, cel mai probabil, imposibilitatea comparrii rezultatelor. Utilizarea aceluiai program de amplificare la thermocycler-uri diferite poate duce la obinerea unor amprente ADN diferite. Fenomenul se datoreaz, probabil, temperaturii diferite care se realizeaz n tuburile de reacie : Programul tipic PCR pentru RAPD este (www.cgr.wageningen-ur.sl, 2002) : 1 minut la 950 C denaturarea urmat de 45 de cicluri; 2 minute la 350C - fixarea primerilor; 2 minute la 720C elongaia (extensia). Temperatura de denaturare, desface legturile de hidrogen i separ cele dou catene de ADN, acestea avnd apoi rol de matrie. Temperatura sczut (350C) permite amorselor s se ataeze la secvenele lor
54

Rodica Pop, 2008 omoloage de pe matri, iar n etapa de elongaie sau extensie se asigur funcionarea Taq polimerazei, respectiv sinteza ADN-ului. Profilul de temperatur propus de WILLIAMS i colab. (1990) este urmtorul: 1 minut la 940C, 1 minut la 360C i 2 minute la 720C. Timpul de tranziie ntre temperaturi nu trebuie s fie foarte scurt mai ales la trecerea de la etapa fixrii la cea a extensiei. Cel mai frecvent omologia ntre primer i secvena int este de 80-90%. Dac temperatura crete prea brusc atunci este posibil s aib loc din nou denaturarea hibridului primer/ADN matri nainte ca polimeraza s poat extinde capetele 3 ale primerilor pe o lungime suficient de mare ca s suporte temperatura de 72 0C. n mod obinuit pentru amplificare se realizeaz 45 de cicluri. Optimizarea concentraiei de ADN matri este, de asemenea, un factor important. Modificri ale amprentei ADN se constat, n special, atunci cnd se folosesc concentraii foarte mici de ADN matri. Concentraia ADN matri este, n general, cuprins ntre 5-500 ng/50 l volum de reacie, optimul fiind ntre 10-50 ng/50 l volum de reacie. Studiile au artat c modificarea amprentelor are loc atunci cnd concentraia de ADN matri scade sau crete de 200 de ori. Concentraia de Mg din amestecul de reacie influeneaz, de asemenea, calitatea amprentelor rezultate. n general se recomand testarea unor concentraii ntre 2 10 mM. Metoda RAPD a fost foarte mult criticat n privina reproductibilitii ei. Ca i n cazul altor metode bazate pe tehnica PCR, RAPD necesit meninerea constant a condiiilor de reacie. Uneori, pentru mrirea specificitii i eficienei reaciei n amestecul de reacie, se poate aduga DMSO, Tween, BSA sau gelatin. Polimorfismele depistate prin analiza RAPD pot rezulta teoretic din mai multe cauze: inseria unui element mare de ADN ntre cele dou situsuri de fixare ale primerului poate face ca fragmentul original s fie prea mare pentru a mai putea fi amplificat, determinnd astfel pierderea lui; deleia unui fragment de ADN purttor de unul sau mai multe situsuri de fixare ale primerilor determin absena produsului de amplificare; substituia unei nucleotide poate afecta fixarea unuia sau ambilor primeri la un
55

Rodica Pop, 2008 anumit situs datorit schimbrilor n omologie, ceea ce poate duce la prezena/absena polimorfismelor sau la o schimbare a mrimii fragmentului; inseria sau deleia unui mic fragment de ADN poate duce la schimbarea mrimii fragmentului amplificat. Cu toate acestea n practic se observ rar schimbri ale mrimii fragmentelor. n schimb se constat, de obicei, prezena (alela A) sau absena (alela a) unui anumit fragment RAPD. Aceast distribuie a alelelor este tipic pentru un marker dominant. Fragmentul apare att n cazul homozigoilor dominani (AA) ct i n cazul heterozigoilor (Aa), dar lipsete n cazul homozigoilor recesivi (aa). n cazul markerilor codominani, heterozigoii Aa pot fi deosebii de homozigoii AA i aa. n urma cercetrilor s-a descoperit c cel puin 95% din fragmentele RAPD se comport ca markeri dominani, n timp ce procentul rmas de 5% se comport codominant, ca dou alele de mrimi diferite Nivelul polimorfismelor depistate prin analiza RAPD este n general similar cu acela obinut prin analiza RFLP (polimorfisme de lungime ale fragmentelor de restricie). Avantajele analizei RAPD constau n: relevarea unui numr relativ mare de polimorfisme; posibilitatea automatizrii analizei; costuri sczute; utilizarea metodelor de vizualizare prin fluorescen n locul celor bazate pe radioactivitate; analizarea unui numr mare de probe ntr-o singur zi; nu implic un grad foarte ridicat de pregtire al personalului din laborator. Dezavantaje: Comportamentul dominant al markerilor RAPD. De exemplu, n genetica populaiilor frecvena alelelor nu poate fi exprimat din moment ce homozigoii (AA) nu pot fi deosebii de heterozigoi (Aa). Acelai lucru este valabil pentru studiile de cartare genic n care se analizeaz generaiile de segregare F1 sau F2. Din moment ce indivizii AA nu pot fi deosebii de cei Aa o informaia valoroas se pierde.
56

Rodica Pop, 2008 Sensibilitatea mrit a tehnicii. n general s-a ajuns la un consens n ceea ce privete reproductibilitatea analizei RAPD, acceptndu-se c aceasta este mare n cadrul aceluiai laborator. Rezultatele devin neconvingtoare atunci cnd datele trebuie transferate de la un laborator la altul. Din aceast cauz trebuie acordat o deosebit atenie standardizrii analizei ntre colaboratori aflai n laboratoare diferite. STAUB i colab. (1996) arat c sursa unor erori n analizele RAPD pot fi datorate vrstei esutului vegetal testat, infeciei cu microorganisme i contaminrilor intrapopulaionale, precum i modificrilor condiiilor de reacie. Via de vie a fost deseori investigat cu ajutorul metodologiei RAPD, majoritatea analizelor fiind efectuate n scopul identificrii i caracterizrii unor varieti de Vitis vinifera. Recent au nceput s fie utilizate i alte metode bazate pe markerii moleculari pentru identificarea unor soiuri de vi de vie i pentru analiza unor specii de Vitis (LOUREIRO i colab., 1998, citat de PAMFIL, 1999). Utilizarea reaciei PCR i a unei amorse (primer) cu secvene arbitrare de nucleotide s-a constatat c poate evidenia, relativ uor, polimorfismul din structura amplificat a ADN-ului. Noua metod (WILLIAMS i colab., 1990) denumit RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) a gsit rapid largi aplicaii n: studiul genomului, gene tagging, chromosome tagging, studiul populaiilor, cel filogentic i identificarea varietal (CAETANO-ANOLLS i colab., 1991). MULCAHY i colab. (1995), au utilizat tehica RAPD pentru identificarea unor varieti de vi de vie din Italia. Ei au analizat 58 de accesiuni, provenite de la 15 varieti de vi de vie. Tehnica RAPD a permis ca varietatea cunoscut cu numele de Montepulciano s fie reclasificat i denumit Sangiovese, completnd caracterizarea ampelografic. Tehnica RAPD a fost utilizat i de VIDAL i colab. (1999), pentru determinarea relaiilor genetice ntre varieti de vi de vie provenite din regiuni diferite ale Franei i Spaniei. n acest studiu, se arat c varietile catalogate ca aparinnd la Proles pontica (Clairatte, Vermentino) au fost ncadrate lng varietile ce aparin la Proles occidentalis (respectiv Albillo i Bourbulenc). Aceast clasificare a fost considerat de ctre GALET (1956) (citat de VIDAL i colab., 1999), ca fiind nedemonstrat geografic i morfologic din cauza datelor
57

Rodica Pop, 2008 tiinifice foarte puine cu privire la originea adevrat a speciilor. n 1967, GALET (citat de VIDAL i colab., 1999) arat c Negrul ncadrat la Proles orientalis (caracterizat teoretic ca fiind cu lstari tineri glabrii) este ncadrat alturi de varieti cu densitate medie spre mare (Muscat petit graines, Muscat d'Alexandrie, Khalili) sau mare (Cinsault) a periorilor de pe vrful lstarilor. Pe lng aceasta, grupurile ecogeografice desemnate de BISSON au separat varieti care sunt strns nrudite n studiile ampelografice (Aligot, Melon, Chardonnay). Rezultatele sugereaz c apartenena unor varieti la un grup sau altul trebuie s fie bine revizuit prin prisma analizelor genetice i moleculare. Existena unei relaii apropiate ntre varieti cu stabilitate genetic (Chenin i Gewurtztraminer) pot de asemenea sugera c principala difereniere genetic dintre cele trei grupuri principale definite n acest studiu a aprut de timpuriu n istoria cultivrii viei de vie (VIDAL i colab., 1999). NAZHAD i colab. (2005) au utilizat de asemenea, tehnica RAPD pentru a studia polimorfismul genetic evideniat la ase soiuri autohtone de vi de vie (Fakhri, Lal, Sangak, Red Yaghooti, White Yaghooti i Cheshm Gavi) provenite din estul Iranului. Dendrograma obinut evideniaz patru grupe, autorii considernd c soiurile Red Yaghooti, White Yaghooti i Lal au fost folosite n trecut ca genotipuri parentale n hibridri intraspecifice care au dus la formarea celorlalte soiuri analizate. Aceste rezultate dovedesc faptul c tehnica RAPD poate fi utilizat cu succes pentru studiul variabilitii intraspecifice la via de vie. Tehnica RAPD a fost utilizat i pentru caracterizarea unor accesiuni de vi de vie incluse n bncile de gene. Rezolvarea problemelor de identificarea a unor cultivare a constituit o prioritate pentru multe laboratoare de cercetare. Astfel de preocupri au avut i BOWERS i colab., 1993; STAVRAKAKIS i colab., 1997; YE i colab., 1998; BOHM i colab., 1998; FANIZZA i colab., 1999 etc.

1.3.2. Markerii AP-PCR (Arbitrary Primer PCR) Metoda a fost descris de ctre WELSH i McCLELLAND n anul 1990 i se bazeaz pe amplificarea unor secvene de ADN cu ajutorul unor primeri arbitrari

58

Rodica Pop, 2008 alctuii din peste 20 de nucleotide. Amplificarea secvenelor are loc n condiii speciale, separarea produilor realizndu-se n geluri de poliacrilamid, iar evidenierea lor prin autoradiografie. Este cea mai complicat metod din cadrul MAAP datorit faptului c utilizeaz izotopi radioactivi i probabil din acelai motiv este cel mai puin utilizat n comparaie cu alte tehnici. Exist posibilitatea simplificrii ei prin utilizarea gelurilor de agaroz i colorarea fragmentelor cu bromur de etidiu (EtBr). Se deosebete de metoda RAPD prin: Reacia de amplificare are loc n trei etape distincte fiecare avnd un alt grad de specificitate: n primele dou cicluri temperatura de fixare a primerilor determin o specificitate redus a reaciei (400C); n urmtoarele 10 cicluri temperatura de fixare este ridicat la 600C ceea ce asigur mrirea specificitii reaciei. Urmtoarele 20-30 de cicluri au loc n condiii de specificitate mare n prezena dezoxinucleotidelor marcate radioactiv. Folosirea unei concentraii mari de primer n primele cicluri de amplificare. Primerii folosii au fost concepui iniial pentru alte scopuri (pentru secveniere) i alei n mod arbitrar pentru aceast metod. Tehnica AP-PCR i gsete mai puine aplicaii la via de vie. YE i colab. (1996), au utilizat primeri cu lungimi cuprinse ntre 17-24 baze pentru amprentarea genetic a unor soiuri de vi de vie i pr. Rezultatele obinute la via de vie, au relevat faptul c nu exist o corelaie pozitiv ntre lungimea primerilor i numrul de benzi polimorfice/primer. Primerii decameri cu un coninut n CG ntre 50-80% sunt de preferat n analizele moleculare la aceast specie.

1.3.3. Aplicaiile tehnicii RAPD i AP-PCR Depistarea diversitii genetice i a gradului de nrudire ntre populaiile de plante din flora spontan Datorit capacitii ei unice de a detecta i cele mai mici niveluri de variaie genetic, amprenta ADN obinut prin tehnica RAPD poate deveni una dintre cele mai folositoare metode pentru astfel de cercetri.
59

Rodica Pop, 2008 Stabilirea relaiilor taxonomice la plante Cercetrile din cadrul taxonomiei plantelor se bazeaz pe un numr mare de caracteristici care definesc taxonii i care sunt folosite la studiul relaiilor filogenetice. Amprenta ADN completeaz metodele taxonomice deja existente, mai ales n situaiile care implic niveluri taxonomice foarte apropiate. Identificarea cultivarelor i estimarea gradului de nrudire ntre acestea Identificarea cultivarelor se poate realiza cu mare acuratee prin amprenta ADN mai ales atunci cnd variabilitatea genetic este mare ntre diferite cultivare dar absent n interiorul lor. Asemenea exemple sunt caracteristice plantelor care se nmulesc vegetativ dar au provenit prin ncruciri ntre specii diferite, aa cum este cazul majoritii arborilor i arbutilor fructiferi. Identificarea exact a cultivarelor de plante este o cerin important att pentru scopurile practice ale ameliorrii ct i pentru domeniile apropiate acesteia cum ar fi de exemplu protecia drepturilor de proprietate asupra soiurilor nou create. n ceea ce privete identificarea cultivarelor (unde problema const n determinarea apartenenei unei probe de smn la un anumit cultivar sau la stabilirea identitii unei probe necunoscute prin compararea ei cu varietile existente ntr-o colecie de referin) tehnicile de analiz molecular vor constitui metode rapide i cu un cost rentabil. Situaia este alta atunci cnd se nregistreaz un nou cultivar, fiind necesar stabilirea identitii i descrierea noilor selecii pentru prima oar precum i verificarea uniformitii i stabilitii acestora. Potenialul tehnicilor de analiz la nivel molecular nu a fost pe deplin exploatat iar utilizarea lor de ctre Uniunea Internaional Pentru Protecia Noilor Varieti de Plante (UPOV) este nc n discuie. Din aceast cauz, ele nu au fost nc acceptate pentru caracterizarea noilor cultivare, cu toate c este recunoscut faptul c vor avea foarte probabil un rol important n viitor pentru determinarea diversitii genetice. Estimarea diversitii genetice ntre cultivare i rudele lor din flora spontan a atras de asemenea o atenie sporit n cadrul efortului depus pentru a face fa fenomenului de reducere a diversitii n procesul de ameliorare. Cu toate acestea, pentru ca markerii moleculari s poat fi acceptai ntr-un

60

Rodica Pop, 2008 cadru legal, ei trebuie s ndeplineasc unele criterii cum ar fi de exemplu: (1) capacitatea mare de a deosebi ntre ele diferite genotipuri, (2) interaciunea minim cu mediul nconjurtor (inclusiv n timpul procedurilor de laborator), (3) posibilitatea de a oferi rezultate care pot fi echivalate ntre diferite laboratoare, (4) capacitatea de a estima distanele genetice dintre cultivare, (5) informaii despre localizarea lor n cadrul genomului i posibilitatea verificrii acestor poziii i (6) disponibilitatea metodologiei. Dac primul criteriu legat de capacitatea mare de a deosebi ntre ele diverse genotipuri este ndeplinit de metodele de obinere ale amprentei ADN, nu se poate spune acelai lucru i despre celelalte cinci. Astfel echivalarea unor modele RAPD ntre diferite laboratoare s-a dovedit un lucru extrem de dificil. Evidenierea variabilitii somaclonale la materialul vegetal nmulit in vitro Culturile in vitro se practic n mod obinuit la multe specii de plante. Este cunoscut faptul c o parte din plantele regenerate pot s difere de tipul parental, fenomen cunoscut sub denumirea de "variabilitate somaclonal". Se presupune c aceast variabilitate provine fie din diversitatea genetic preexistent n explant, fie din variabilitatea nou dobndit n timpul dediferenierii celulare sau n timpul meninerii calusului in vitro. Cu toate c exist numeroase exemple asemenea variaii sunt rar evideniate prin amprenta ADN. La via de vie tehnica RAPD i-a gsit cele mai mari aplicaii n identificarea i estimarea gradului de nrudire a unor cultivare, identificarea unor varieti autentice din diferite zone i mbuntirea clasificrii ampelografice. Prin metoda amprentei ADN, la via de vie s-a descoperit recent, c soiul Cabernet Sauvignon a aprut n urma unei ncruciri spontane ntre Cabernet Franc i Sauvignon Blanc. Cele dou soiuri fac parte din specia Vitis vinifera, Cabernet Sauvignon fiind considerat un hibrid intraspecific (BRATTSTEN, 2000). Amprentele ADN generate cu ajutorul tehnicilor RAPD au fost folosite i pentru compararea altor cultivare de Vitis vinifera, cum ar fi Cabernet Franc, Merlot, Carmenere, Chardonnay, Sauvignon Blanc, Traminer, Regina, Sangiovese etc. (MULCAHY i colab., 1995; VIDAL i colab., 1999; FANIZZA i colab., 1999; HERRERA i colab., 2002).
61

realizate pe baza criteriilor

Rodica Pop, 2008 n ultimii ani, tehnicile RAPD i-au gsit aplicaii pentru evidenierea variabilitii genetice a materialului vegetal nmulit in vitro. Astfel, se remarc cercetrile efectuate de PAMFIL (1996), PEROS i colab. (1998), REGNER i colab. (2000), AKBA i colab. (2004), IBANEZ i colab. (2005), XU i colab. (2005) etc.

1.3.4. Markerii RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Primele ncercri de diagnosticare a variabilitii somaclonale pe baza markerilor genetici au fost fcute prin metodologia RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), creia autorul (POTTER, 1991) i-a modificat scopul iniial, de urmrire a distribuiei polimorfice a alelelor ntr-o populaie segregat, pentru a pune n eviden mutaiile ntr-o populaie clonat. Ulterior, detectarea variabilitii somaclonale a nceput s fie fcut i pe baza analizelor RAPD. Aceast metod prezint numeroase avantaje comparativ cu RFLP: tehnica este mai simpl, mult mai rapid, necesit o cantitate mic de material iniial, esutul poate fi prelevat direct in vitro, absena radioactivitii i repetabilitatea destul de bun a analizelor RAPD.

1.3.5. Markerii AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Polimorfisme de lungime ale fragmentelor amplificate AFLP reprezint o tehnic elaborat de VOS i colab. (1995) i reprezint o combinaie ntre metoda RFLP i PCR. Tehnica const n digestia ADNului cu enzime de restricie, iar la capetele fragmentelor rezultate se ataeaz secvene dublu catenare specifice (adapters) cu ajutorul ADN ligazelor. Aceste secvene mpreun cu secvenele alturate, reprezentnd situsul de restricie al enzime, vor constitui locurile de fixare ale primerilor n vederea amplificrii prin PCR. La capetele 3 ale primerilor se vor aduga anumite nucleotide care vor permite amplificarea selectiv unei categorii de secvene din setul de fragmente de restricie. Nu vor fi amplificate dect acele fragmente de restricie care au nucleotidele ce flancheaz situsul de restricie complementare cu nucleotidele selective ale primerilor. Separarea produilor de amplificare se realizeaz prin electroforez n geluri de
62

Rodica Pop, 2008 poliacrilamid i evideniere prin autoradiografie. Mai recent se utilizeaz i marcajul cu fluorescen i utilizarea secveniatoarelor automate. Fragmentele de restricie care urmeaz s fie amplificate se obin cu ajutorul a dou enzime de restricie, EcoRI i MseI (la una dintre ele situsul de restricie apare cu o frecven redus n cadrul genomului - rare cutter, la cealalt frecvena este mare frequent cutter). Prin metoda AFLP are loc amplificarea predominant a acelor fragmente de restricie care au la unul din capete o secven rezultat ca urmare a fragmentrii cu o enzim frequent cutter i la cellalt capt cu o enzim rare cutter . Numrul fragmentelor amplificate poate fi controlat prin alegerea enzimei i prin numrul bazelor care se adaug la captul trei al primerului. Cu o singur combinaie de enzime (una care taie la ase baze iar cealalt la patru baze) este posibil amplificarea a 100.000 de fragmente din care se pot selecta pentru fiecare reacie AFLP ntre 50 i 100 de fragmente. Ca i n cazul markerilor RAPD fragmentele de interes pot fi extirpate din gel, purificate, clonate, secveniate i transformate n markeri SCAR cu ajutorul unor primeri specifici. Spre deosebire de metoda RAPD metoda AFLP are un grad mai ridicat de reproductibilitate, iar rezoluia fragmentelor este mult mai bun. Cel mai mare avantaj al metodei este sensibilitatea cu care poate depista polimorfismele ADN. La via de vie, metoda AFLP au fost aplicat n special pentru identificarea unor clone i a diferenelor genetice existente la nivel molecular ntre acestea, avnd n vedere c un aspect important n producia i calitatea vinului l reprezint caracterizarea clonelor. Astfel, BELLIN i colab. (2000), au utilizat 50 de perechi de primeri cu scopul de a compara diferite clone de Pinot. VIGNANI i colab. (1996) i SENSI i colab. (1996) au aplicat metoda AFLP i SSR pentru stabilirea relaiilor genetice ntre clonele de Sangiovese. Rezultatele ncurajatoare obinute au dus la concluzia c tehnicile bazate pe aceti markeri moleculari pot fi utilizate pentru diferenierea i/sau identificarea unor clone. De asemenea, se remarc i studiile intreprinse de IMAZIO i colab. (2002), asupra a 24 de clone de Traminer de provenien diferit. Ei au analizat comparativ clonele de Traminer utiliznd tehnica SSR (Simple Sequence Repeats), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
63

Rodica Pop, 2008 i MSAP (Methyl-sensitive Amplified Length Polymorphsim). Rezultatele obinute arat c cea mai adecvat tehnic pentru evidenierea polimorfismului ntre clone s-a dovedit a fi tehnica AFLP. Tehnica MSAP a fost utilizat pentru evaluarea diferenelor calitative privind gradul de metilare a ADN-ului ntre clonele analizate. Cercetrile lor sugereaz c diferenele morfologice ntre clone sunt probabil, datorate efectului sinergic al modificrilor genetice i epigenetice. Variabilitatea genetic clonal la soiul Pinot noir a fost pus n eviden de asemenea, tot prin tehnica AFLP, constatndu-se faptul c n acest caz exist variabilitate att intra ct i interclonal (BLAICH i colab., 2007). Tehnica AFLP fiind relativ ieftin, iar rezultatele obinute avnd

reproductibilitate ntre diferite laboratoare de analiz molecular constituie un instrument valoros pentru identificarea i analiza unor clone, facilitnd eforturile de patentare clonal la via de vie.

1.3.6. Markerii SSR (Simple Sequence Repeats) Secvenele microsatelit constituie repetiii n tandem ale unor secvene di, tri sau tetra nucleotidice. Cele mai frecvente repetiii sunt cele dinucleotidice, cum ar fi (CA)n, (CT)n, (AT)n. La plantele superioare exist o secven microsatelit nucleotidic, care se repet dup 30-100 kb, cea mai frecvent fiind secvena (AT)n (NYBOM i colab., 1989, 1990; HOEPFNER i colab., 1993; BOTTA i colab., 1995). Polimorfismul microsateliilor este dat de numrul de secvene nucleotidice care se repet. n msura n care se cunoate ordinea nucelotidelor la secvenele nvecinate microsateliilor, se pot concepe primeri specifici, care vor permite amplificarea fragmentelor de ADN, ce nglobeaz microsateliii. Lungimea acestor fragmente se determin apoi prin migrare n gel de poliacrilamid. Variabilitatea markerilor microsatelii se datoreaz diferenelor de lungime a fragmentelor de ADN amplificate. n cazul secvenelor automatizate, primerii specifici fiecrei secvene microsatelit sunt marcai cu o substan fluorescent, profilul benzilor fiind citit cu ajutorul unui fascicul de laser, care va depista fiecare produs de amplificare n funcie de substana fluorescent cu care a fost marcat.
64

Rodica Pop, 2008 Markerii microsatelii au fost introdui mai recent pentru identificarea viei de vie. THOMAS i SCOTT (1993), citai de ULANOVSKY i colab. (2001) au reuit s caracterizez 20 de varieti de vi de vie utiliznd markeri microsatelii. Eu au propus utilizarea microsateliilor pentru stabilirea unei baze de date internaionale referitoare la descrierea varietilor de vi de vie, datorit nivelului mare de polimorfism, a codominanei, simplicitii i repetabilitii analizelor moleculare SSR. BOTTA i colab. (1995), citai de ULANOVSCY i colab. (2001), au dovedit c markerii microsatelii posed o buna capacitate pentru identificarea varietilor, dar nu i a clonelor de vi de vie, concluzie la care au subscris i SILVESTRONI i colab. (1997) care au analizat la nivel molecular clone din cultivarele Sangiovese i Fortana. SEFC i colab. (1998) utiliznd 10 loci microsatelitari au obinut diferite benzi paterne pentru fiecare dintre cele 60 de varieti de vi de vie din colecia de germoplasm analizat. LOUREIRO i colab. (1998), au utilizat de asemenea, tehnica SSR pentru identificarea varietii Albario. HERRERA i colab. (2002) au folosit amprentele ADN generate cu ajutorul tehnicilor RAPD i ISSR-PCR (Inter Simple Sequence Repeat Polymerase Chain Reaction) pentru a compara patru cultivare de Vitis vinifera folosite pe scar larg n Chile, respectiv Cabernet Sauvignon, Cabernet Franc, Merlot i Carmenere. Referina extern a fost constituit din material vegetal provenit din Frana. Cele dou tehnici au evideniat diferene ntre cultivarele studiate, metoda ISSR avnd o putere de difereniere mai mare dect RAPD, ceea ce sugereaz utilizarea tehnicii ISSR-PCR atunci cnd se lucreaz cu numr mare de cultivare. Astfel, a fost observat variabilitate ntre clonele de Merlot, clona original din Chile i proveniena din Frana, rezultatele sugernd c cele dou clone reprezint genotipuri diferite. n schimb, pentru celelalte cultivare, cele dou tehnici demonstreaz populaiilor din Chile. Tehnica SSR i AFLP a fost utilizat n amprentarea genetic a unor varieti de vi de vie, pentru rezolvarea cazurilor de omonimie i sinonimie, precum i pentru identificarea genotipurilor parentale la unele varieti remarcabile, cum este de exemplu soiul Cabernet Sauvignon (BOWERS, MEREDITH, 1997). ntr-un alt studiu AKKAK i colab. (2005), au analizat diversitatea genetic a
65

uniformitatea

Rodica Pop, 2008 unor soiuri i varieti de vi de vie autohtone provenite din bazinul Mrii Mediterane i Algeria, folosind 12 markeri SSR. Dintre cele 60 de cultivare analizate au fost identificate 34 de genotipuri diferite, ceea ce arat faptul c tehnica SSR poate fi utilizat cu succes i n studiul relaiilor intraspecifice la aceast specie. Tehnicile RAPD, AFLP i SSR au fost utilizate cu succes i n studiile de cartare genetic la via de vie. Astfel, n anul 2002, THIS i colab. s-au preocupat de ntocmirea unei hri genetice de referin n cazul descendenilor obinui n cazul ncrucirii dintre soiurile Syrah x Grenache. ntocmirea hrii genetice s-a bazat pe utilizarea markerilor microsatelii polimorfi VNI i VMC. Hrile genetice ntocmite pe baza markerilor SSR sunt extrem de interesante, deoarece permit evidenierea grupelor de linkage la nivelul unor combinaii hibride. De asemenea, markerii SSR VMC au fost testai att n cazul unor soiuri de Vitis vinifera, ct i Vitis riparia. Aproximativ 80% dintre locusurile identificate cu ajutorul markerilor SSR la Vitis vinifera fiind reproductibile i la Vitis riparia. Aceti markeri sunt interesani pentru studiile filogenetice la unele specii nrudite.

66

Rodica Pop, 2008

CAPITOLUL II OBIECTIVELE CERCETRII, MATERIALUL I METODA

2.1. SCOPUL CERCETRILOR Via de vie (Vitis vinifera) constituie una dintre culturile horticole larg rspndite att n Romnia ct i pe plan mondial. Utilizarea metodele tradiionale de ameliorare, dei au dat rezultate spectaculoase, are anumite limite din cauza duratei lungi a unei generaii i a naturii extrem de heterozigote a acestei culturi. Pentru clasificarea genurilor i a speciilor familiei Vitaceae s-a folosit, cel mai adesea, criteriul asemnrilor morfologice, iar pentru identificarea acestora s-au ntocmit chei de determinare. Exist ns opinii dup care criteriul morfologic de clasificare al genului Vitis nu este suficient, fapt care a generat opinii controversate. Pentru eliminarea acestora s-a recurs la analize de ordin genetic i biochimic. Progresele fcute n ultimii ani n domeniul biologiei moleculare privind utilizarea markerilor genetici i n special dup perfecionarea reaciei PCR (Polimerase Chain Reaction) de amplificare a unor fragmente de ADN au fcut ca identificarea variabilitii somaclonale pe baza polimorfismului ADN s devin o realitate. Variabilitatea somaclonal este considerat o surs de obinere de noi genotipuri n scop de ameliorare deschiznd noi posibiliti pentru aplicaii n viticultur. Cu toate acestea, informaii despre variabilitatea la plantele regenerate sunt destul de puine, pn n prezent fiind raportate numai cteva exemple de variabilitate somaclonal la via de vie. Avnd n vedere aceste deziderate, s-a considerat util abordarea unor cercetri n domeniul biotehnologiilor i al micropropagrii la specia Vitis vinifera. Scopul principal al cercetrilor noastre a constat n caracterizarea i stabilirea relaiilor filogenetice ntre zece soiuri de vi de vie, cu ajutorul metodologiei RAPD,
67

Rodica Pop, 2008 precum i inducerea variabilitii somaclonale i testarea heteromorfismului molecular a somaclonelor obinute din cinci soiuri de vi de vie larg cultivate n Transilvania i chiar n Romnia. Cercetrile iniiate de noi, constituie, probabil, primele ncercri de identificare a variabilitii somaclonale la via de vie prin metoda RAPD.

2.1.1. Obiectivele urmrite n cercetrile aferente tezei de doctorat Obiectivele principale s-au concretizat n urmtoarele aspecte: Stabilirea procolului de extracii de ADN i utilizarea tehnicii RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) n vederea identificrii polimorfismului genetic in vivo la zece soiuri de vi de vie provenite din cinci staiuni horticole amplasate n areale geografice diferite. Identificarea primerilor capabili s determine polimorfismul la nivel molecular ntre soiurile analizate. Stabilirea compoziiei mediilor de cultur, a tipului de hormoni i a concentraiilor acestora care s favorizeze obinerea de neoplantule, creterea i proliferarea lstarilor in vitro n urma multiplicrii prin lstrire axilar. Alegerea tipului de explant i a mediilor de cultur adecvate pentru inducerea variabilitii somaclonale, respectiv obinerea de calus. Subcultivarea calusului pe un mediu de cretere. Stabilirea mediilor de cultur pentru regenerarea plantelor prin transferul calusului pe medii de inducere a organogenezei. Punerea n eviden a eventualelor diferene genetice aprute ntre regenerani, respectiv ntre somaclone i plantele mam din care au provenit prin analiza RAPD.

68

Rodica Pop, 2008 2.2. MATERIALUL BIOLOGIC

2.2.1. Materialul biologic utilizat n experienele de difereniere a soiurilor cu ajutorul markerilor moleculari Materialul biologic studiat a fost constituit din zece soiuri de vi de vie, provenite din cinci staiuni viticole din ara noastr amplasate n condiii pedoclimatice total diferite. Au fost analizate cinci soiuri de vi de vie pentru vin alb, dou soiuri pentru vin rou i trei soiuri pentru struguri de mas. Soiurile pentru vin alb au fost: Feteasc alb, Feteasc regal, Riesling italian, Muscat Ottonel, Traminer roz. Soiurile pentru vin rou au fost: Cabernet Sauvignon, Merlot. Soiurile pentru struguri de mas au fost: Napoca, Timpuriu de Cluj, Cetuia. Staiunile viticole din care s-a recoltat materialul biologic au fost: Reca, Blaj, Valea Clugreasc, Odobeti i Iai. Din cele cinci staiuni viticole s-au recoltat lstari de vi de vie n anul 2000 i 2001. Recoltarea s-a fcut primvara, iar lstarii au fost transportai n geant frigorific pentru evitarea pierderii turgescenei. De la aceti lstari s-au recoltat frunzele tinere care au fost pstrate, pn la prelucrare, n frigider la o temperatur de 700C. Toate analizele au fost efectuate n cadrul laboratorului de Biotehnologii de la Facultatea de Horticultur.

2.2.1.1. Descrierea soiurilor luate n studiu Feteasc alb Sinonime: Feteasc alb, Fetioar, Psreasc alb, Poam psreasc, Poama fetei, Leanka. Origine. Soiul Feteasc alb era cunoscut la noi n ar cu mult nainte de invazia filoxerei. Asupra originii acestui soi nu se cunosc date precise. Se presupune c acest soi s-a nscut ntr-o perioad vitreg din istoria poporului romn i anume n mileniul de migraie a popoarelor, ntre anii 275-1241. Unii autori susin c acest soi
69

Rodica Pop, 2008 ar fi fost adus n Ardeal, din Germania sau din Boemia, de ctre coloniti, dar acest lucru nu s-a dovedit istoric. Dup ampelografii maghiari, soiul Feteasc alb ar fi originar din Ardeal. Dar, acest soi este tot aa de vechi i n podgoriile noastre de la est i sud de Carpai, fiind socotit ca soi local. Este menionat de la ntemeierea vestitelor podgorii ale Moldovei, descris de Dimitrie Cantemir, intrnd ca soi de baz n compunerea sortimentului pentru vinuri fine la Cotnari, mpreun cu Grasa, Frncua i Tmioasa, la Hui i la Odobeti. Soiul Feteasc alb este cultivat pe importante suprafee n Transilvania i n Muntenia, unde d cele mai bune rezultate. De remarcat c soiul Feteasc alb s-a impus n timp, fiind luat n cultur de toate rile viticole vecine cu Romnia, iar n Germania este cultivat sub numele de Mdchentraube (www.ro.wikipedia.org/wiki/Feteasc_Alb). Caractere ampelografice. La deschiderea mugurilor rozeta este uor scmoas, de culoare verde, cu nuan armie-roiatic. Lstarul este glabru, striat, colorat n rou-castaniu pe partea nsorit. Frunza adult este mijlocie, mai mult lat dect lung, pentalobat, cu lobul terminal scurt i lit; sinusurile laterale sunt adnci deschise n form de lir sau de U; sinusul peiolar, larg deschis n form de acolad, constituie caracterul de baz n recunoaterea soiului. Limbul frunzei este de culoare verde, subire i lucios, glabru pe ambele fee cu dinii rari i lungi dispui neuniform. Floarea este hermafrodit normal, pe tipul 5, prezentnd uneori abateri ctre tipul ase, cu polen abundent i fertil. Strugurii mici spre mijlocii (90-110 g n medie), cilindrici sau cilindro-conici, aripai, dei n boabe neuniforme ca mrime. Bobul este mic, sferic, de culoare verde glbuie cu pielia subire, acoperit cu un strat fin de pruin, cu punctul pistilar aparent, constituind un caracter de soi. Miezul este zemos, cu gust plcut, armonios, nearomat (fig. 1). Lstarii au vigoare mare de cretere, meritale mijlocii (12-14 cm lungime), de culoare verde cu nuane slabe rocate la noduri. Coarda prezint striuri fine, de culoare galben brun.
70

Rodica Pop, 2008

Fig. 1. Caracterele ampelografice ale frunzei i ciorchinelui la soiul Feteasc alb Ampelographic characters of leaf and cluster in Feteasca alba

Feteasc alb este unul din cele mai viguroase soiuri romneti de vin, avnd o putere ridicat de acumulare a zaharurilor n struguri i o bun adaptare la condiiile pedoclimatice din nordul rii. Vinurile de calitate deosebit ce se obin sunt superioare seci, demiseci sau dulci-licoroase, armonios constituite i cu buchet specific soiului

(CONSTANTINESCU, 1959). Feteasc regal Sinonime: Dnean, Galben de Ardeal, Feteasc de Ardeal. Origine. Soiul a fost identificat, n jurul anilor 1920, n podgoria Trnave, mai exact n comuna Dane Sighioara (jud. Mure). De aceea, localnicii l-au botezat: Dnan, Dneana, Dneana sau Dunana. n literatura de specialitate a fost denumit i Galben de Ardeal. Exist i ipoteza c soiul identificat n comuna Dane ar fi fost cultivat de mult timp n Transilvania, fiind ntlnit sub diferite nume. Majoritatea viticultorilor sunt de prere c soiul Feteasc regal Dnan este rezultatul ncrucirii naturale ntre dou soiuri romneti ce se gseau de mult timp n zon Feteasc alb i Grasa de Cotnari. La nceput, acesta soi Dnan a fost nmulit i cultivat numai n podgoria Trnave, fiind foarte apreciat de localnici.
71

Rodica Pop, 2008 La Expoziia Naional de Vinuri i Fructe ce a avut loc la Bucureti, n 1928, vinul obinut din soiul identificat n comuna Dane a fost prezentat sub numele de Feteasc regal. Caractere Dezmugurire scmoas, ampelografice. cu rozeta de

culoare verde albicios; primele frunzulie i vrful lstarului sunt de culoare verde cu nuane albicioase datorate perilor rari i lungi. Frunza adulta este mijlocie (11-13 cm lungime), ceva mai lat dect lung, ntreag cu un nceput uor de trilobie; sinusurile laterale superficiale deschise n form de U; sinusul peiolar deschis n lir sau U. Limbul frunzei este de culoare verde nchis, lucios, cu marginile involute, scmos pe faa inferioar. La fel ca i la soiul Gras prezint pe faa superioar a mezofilului adncituri, mai nchise la culoare sub forma unor "lovituri de ciocan. Floarea este hermafrodit, normal pe tipul cinci, soiul fiind autofertil. Strugurii mijlocii (n medie 110-130 grame), cilindro-conici, deseori aripai, cu boabele aezate des pe ciorchine. Bobul mijlociu, sferic, cu pielia subire, de culoare verde glbui, uor pruinat; pulpa zemoas, nearomat. Lstarii sunt de vigoare mijlocie, colorai n verde, uor bronzai pe partea nsorit. Coardele n toamn au culoare galben brun, fin striate (fig. 2). Feteasc regal este un soi semiaromat, vinul tnr degajnd o arom original, elegant, de tip floral, uor de recunoscut. Gustul plcut, bine conturat, plin de finee, este acrior, i aduce cu cel al unui mr romanesc de var, ceea ce i confer o personalitate aparte. Vinurile obinute din acest soi sunt seci dar se pot obine i vinuri demiseci sau chiar dulci. Fig. 2. Caracterele ampelografice ale frunzei i ciorchinelui la soiul Feteasc regal Ampelographic characters of leaf and cluster in Feteasca regala

72

Rodica Pop, 2008 Riesling italian Sinonime: Riesling italian, Riesling de Italia, Riesling blanc Origine. Locul de origine al soiului Riesling italian nu este bine stabilit. Unii ampelografi susin c ar fi originar de pe malurile Rinului, alii consider c ar fi originar din provincia Styria (Austria) sau din Italia, dup nume. Face parte din Proles occidentalis. Riesling italian este unul din soiurile cu rspndire larg, cosmopolit, cunoscut aproape n toate rile viticole din Europa. n ara noastr soiul Riesling italian a fost introdus nc nainte de invazia filoxerei i astzi are cea mai larg rspndire, fiind prezent n toate podgoriile. Pe suprafee mai ntinse se cultiv n podgoriile din Transilvania i Dealul Mare, unde d i cele mai bune rezultate. Caractere deschiderea ampelografice. rozeta La este

mugurilor,

pufoas, alb-verzuie, cu uoar nuan roz-violacee (CONSTANTINESCU,

1960). Frunza este mijlocie, cinci lobat, cu mezofilul subire, de culoare verde-glbui, caracteristic. Dinii sunt mari alungii i ascuii Lstarul este verde, glabru, cu striuri cafenii deschis, la vrf i la noduri uor scmos. Floarea este hermafrodit Fig. 3. Caracterele ampelografice ale frunzei i ciorchinelui la soiul Riesling italian Ampelographic characters of leaf and cluster in Riesling italian

normal, de tipul cinci, rareori ase. Strugurii sunt cilindrici, prima

ramificare a rahisului fiind transformat ntr-o aripioar ce caracterizeaz acest

soi (OLOBEANU i colab., 1980). Pedunculul este subire, semilignificat. Boabele sunt dese, mici sau mijlocii, sferice,

73

Rodica Pop, 2008 btute, cu diametrul de 12-14 mm, de culoare verde-glbuie, mai auriu pe partea expus la soare, cu punctul pistilar aparent sub form de pat mic negricioas, care constituie caracter de soi. Miezul este zemos, nearomat. Pielia este acoperit cu un strat subire de pruin (fig. 3). Coarda este de culoarea cojii de nuc, cu nuane glbui, mai roiatic la noduri, pronunat striat i punctat (CONSTANTINESCU,1959). Soiul Riesling italian este utilizat pentru producerea vinurilor de calitate superioar, fiind unul din soiurile cele mai rspndite i apreciate din ara noastr. Vinurile sunt superioare seci, demiseci sau dulci licoroase

(CONSTANTINESCU, 1959).

Muscat Ottonel Sinonime: Muscat Ottonel, Ottonel, Tmioas Ottonel, Mottonel, Muscats, Muscat de Crciunel Trnave, Muscat Ottonel blanc. Origine. Muscat Ottonel este un soi originar din Frana, obinut din semine i introdus n cultur n anul 1852 de ctre Robert Moreau, un horticultor din Angers. Acest soi exist n numeroase varieti cu struguri de culoare galben pal pn la albastru-negru.Toate varietile au un grad variabil de parfum i gust muscat, o caracteristic inimitabil. Face parte din Proles orientalis - subproles caspica. Soiul Muscat Ottonel are o rspndire larg n cultur, fiind cultivat aproape n toate rile viticole. La noi n ar, este rspndit n majoritatea podgoriilor, n special ntlnindu-se n podgoriile Dealul Mare, Odobeti i Drgani (CONSTANTINESCU, 1960). Caractere ampelografice. La deschiderea mugurilor, rozeta este scmoas, de culoare verde-roiatic, mai pronunat colorat spre margini (fig. 4). Frunza normal are n general dimensiuni cuprinse ntre 14-18 cm lungime i 14-16 cm lime, fiind glabr i neted, n mod frecvent cu trei sau cinci lobi. Marginea frunzei prezint dini mruni, rotunjii i mucronai, aezai de regul alternativ, un dinte mare i unu-doi mici (CONSTANTINESCU, 1960). Marginile frunzei sunt rsucite spre partea superioar, formnd o plnie, care conduce ctre
74

Rodica Pop, 2008 punctul peiolar (OLOBEANU i colab., 1980). Floarea este hermafrodit normal, de tipul cinci sau ase, cu staminele nclinate normal, mai lungi dect pistilul. Ovarul este verde, cu 2-3 loji i respectiv 4-6 ovule. Polenul are conformaie normal i este fertil, soiul fiind autofertil.

Fig. 4. Caracterele ampelografice ale frunzei i ciorchinelui la soiul Muscat Ottonel Ampelographic characters of leaf and cluster in Muscat Ottonel variety Strugurii sunt de form cilindric, uniaxiali, uneori aripai, cu boabele dese sau btui, avnd n medie 12-14 cm lungime. Bobul este sferic, de culoare galben-aurie, cu diametrul mediu de 12-14 mm, avnd miezul zemos, cu gust discret de muscat i caracteristic, foarte plcut i mustul necolorat. Lstarii n iunie-iulie sunt glabri, de culoare verde-castanie, cu primele trei frunze verzi-armii, uor scmoase, care, pe msur ce cresc devin verzi i glabre. Coarda este striat, cu caneluri superficiale, rotund sau uor turtit n seciune, de culoare roie-cafenie, cu nodurile vineii. Culoarea roie a coardei este caracteristic pentru acest soi. Traminer roz Sinonime: Traminer roz, Traminer roiu, Tramini, Traminer. Origine. Este un soi originar din Tirolul italian, din mprejurimile orelului Tramin, de unde i vine i numele. Este un soi foarte vechi, citat cu 500 de ani n urm
75

Rodica Pop, 2008 de ctre Tragus, ca fiind cultivat n Bavaria. Se pare c are aceeai vechime pe care o are i n provincia Franche Compt din Frana. Face parte din Proles occidentalis. Soiul Traminer roz este rspndit n majoritatea rilor viticole din Europa, unde se cultiv pe suprafee ntinse. La noi n ar este rspndit mai mult n Banat i Transilvania, n special n podgoriile Alba Iulia i Trnave. Pe suprafee mai mici este rspndit i n podgoriile din Odobeti i Dealul Mare. Caractere ampelografice. n faza de dezmugurire rozeta este pufoas, de culoare verde-albicioas, cu slabe nuane roiatice-liliachii. Floarea este hermafrodit normal, de tipul cinci, uneori ase, cu staminele normal nclinate. Polenul are o constituie normal, este fertil i slab abundent, soiul fiind autofertil. Frunza normal este de 12,514,5 cm lungime i 13-15 cm lime, cu trei sau cinci lobi, uneori ntreag. Limbul este gros, gofrat, cu marginile uor ndoite n jos, glabru pe partea superioar, cu peri i scam pe partea inferioar. Marginea frunzei prezint dini scuri, rotunjii, vizibil mucromai; dinii din vrful lobilor sunt puin evideni. Strugurii au form cilindric sau cilindro-conic, uneori sunt

uniaripai, de 7-12 cm lungime, cu boabele dese i neomogene, cu pielia groas i de culoare roz, acoperit cu mult pruin. Bobul este sferic, cu diametrul de 12-15 mm, de culoare rozcenuie, cu miezul zemos, nearomat i
76 Fig. 5 Caracterele ampelografice ale frunzei i ciorchinelui la soiul Traminer roz

Ampelographic characters of leaf and cluster in Traminer rose variety

Rodica Pop, 2008 mustul incolor (fig. 5). Lstarul n iunie-iulie este verde, cu striuri roiatice-vineii. Coarda este de culoare castanie-roiatic, striat, pronunat punctat. Scoara lignificat se exfoliaz n fii. Traminer roz este unul din cele mai apreciate soiuri pentru producerea de vinuri superioare seci sau licoroase, strugurii putnd fi culei la supracoacere. Ei pot fi vinificai singuri sau n amestec cu alte soiuri (CONSTANTINESCU, 1960).

Cabernet Sauvignon Sinonime: Cabernet Sauvignon, Bordeaux, Caberne. n unele zone este cunoscut i sub numele de Petit Cabernet, Sauvignon Rouge sau Vidure. Origine. Soiul este originar din provincia Gironde Frana, unde se cultiv pe suprafee mari, fiind apreciat nc de pe vremea cardinalului Richelieu (1600). Face parte din Proles occidentalis. Soiul Cabernet Sauvignon are o larg rspndire n cultur. n Frana, n regiunile Medoc i Bordeaux se cultiv n sortiment tehnologic cu Malbec i Merlot, dnd un vin cu renume mondial. Cabernet Sauvignon poate fi socotit un soi cosmopolit, fiind unul dintre cele mai bune soiuri negre, depind cu mult soiul Cabernet franc. n ara noastr este cunoscut nc dinainte de invazia filoxerei, fiind rspndit n podgoriile Drgani, Smbureti, Segarcea, Dealul Mare, Odobeti. Caractere ampelografice. n faza de dezmugurire, rozeta este pronunat scmoas, de culoare verde-albicioas, cu nuan roz-violacee pe margini (fig. 6). Floarea este hermafrodit, normal, de tipul cinci, uneori prezint abateri ctre tipul ase. Are 5-6 stamine, normal nclinate. Frunza normal este aproape izodiametric, de mrime mijlocie, avnd ntre 13,5 i 18,5 cm lungime i 13,5 i 19 cm lime; caracteristic cu cinci lobi, cu limbul uor bicat cu urme de scame pe partea superioar i vizibil scmos pe partea inferioar. Marginea frunzei prezint dini uor rotunjii i mucronai, cu intervale mari ntre ei, alternnd neuniform cei mari cu cei mici.

77

Rodica Pop, 2008

Fig. 6. Caracterele ampelografice ale frunzei i ciorchinelui la soiul Cabernet Sauvignon Ampelographic characters of leaf and cluster in Cabernet Sauvignon variety Strugurii sunt de mrime submijlocie sau chiar mai mic, avnd 10-15 cm lungime, uniaxiali sau adesea uniaripai, avnd boabele potrivit de dese. Pedunculul este foarte scurt, de 2-3 cm, puternic lignificat. Bobul este mic, sferic, cu diametrul de 12-14 mm, negru, zemos, cu gust ierbos, mustul i pensula necolorate. Lstarul n iunie-iulie este rocat la baz, cu vrful i prima frunzuli albverzui, scmoase. Coarda este rotund n seciune i uor turtit, de vigoare mijlocie, cu diametrul ntre nodurile 4 i 11 de 7/8-9/10 mm. Are culoarea cafenie-armie, cu nodurile colorate mai intens. Din strugurii soiului Cabernet Sauvignon se obin cele mai bune vinuri roii superioare. Vinul, aspru la nceput, dobndete prin nvechire caliti excepionale, fiind bine echilibrat, fin, intens colorat i cu buchet caracteristic

(CONSTANTINESCU, 1959).

78

Rodica Pop, 2008 Merlot Origine. Acest soi este originar din Frana, regiunea Mdoc, fiind cunoscut nainte de invazia filoxerei. Se presupune c face parte din familia Cabernet (DEBUIGNE, 1992). De asemenea, cercettorii de la Universitatea Davies din California consider c soiul Merlot provine din soiul Cabernet Franc, care la rndul lui este o varietate a soiului foarte vechi franuzesc Carmenere.

(www.en.wikipedia.org/wiki/Merlot). Face parte din Proles occidentalis. Este rspndit pe suprafee mari n regiunea Bordeaux, n Frana. Se cultiv n Rusia, Italia, Germania, Bulgaria, Ungaria. Extinderea n cultur dateaz din a doua jumtate a secolului al XIX-lea (DEBUIGNE, 1992). La noi n ar este mai rspndit n podgoriile din Moldova i Dealul Mare. Caractere ampelografice. Frunza este mijlocie, 5-lobat, gofrat, verdenchis, uor scmoas pe faa interioar. Marginile sunt curbate spre faa Fig. 7. Caracterele ampelografice ale frunzei i ciorchinelui la soiul Merlot Ampelographic characters of leaf and cluster in Merlot variety

superioar (fig. 7).

Strugurii sunt lungi, conici sau cilindro-conici, cu primele dou ramificaii mai mari. Boabele mijlocii, dese, sferice, cu pielia colorat n albastru-violaceu nchis (OLOBEANU i colab., 1980). Este un soi apreciat pentru vinurile roii superioare (CONSTANTINESCU, 1959). Napoca Origine. Napoca este un soi de struguri pentru mas, omologat n anul 1984, fiind obinut la Staiunea de Cercetri Horticole Cluj, de ctre Oprea tefan i tefan Hontil, prin selecie individual, dintr-o populaie rezultat din hibridare sexuat a soiurilor Alphonse Lavalle x elita F1 (Regina Viilor x Muscat Hamburg). Se poate cultiva cu rezultate bune n zonele cu favorabilitate ecologic pentru
79

Rodica Pop, 2008 cultura economic a viei de vie, cu precdere n Transilvania, n partea de vest a rii, n Moldova i chiar n podgoriile de pe dealurile Subcarpailor Meridionali (OPREA i colab., 2007). Caractere ampelografice. Frunzele adulte au mrime mijlocie cu trei lobi, iar florile sunt hermafrodite normale de tipul cinci, soiul fiind autofertil. Strugurii de form cilindro-conic sunt mijlocii-mari, cu desime mijlocie de inserare a boabelor pe ciorchine, iar procesele de meiere i mrgeluire n mod practic lipsesc (fig. 8). Bobul este mijlociu-mare, de form oval, cu pielia de culoare neagr-violacee mijlociu groas, elastic, neaderent la pulp i este acoperit cu un strat uniform de pruin. Pulpa este de culoare alb cu nuan roz, crocant, cu suculen echilibrat, arom fin specific i gust dulce-acrior plcut (OPREA i colab., 2007).

Fig. 8. Caracterele ampelografice ale frunzei i ciorchinelui la soiul Napoca Ampelographic characters of leaf and cluster in Napoca variety Soiul Napoca se remarc prin fertilitate i productivitate ridicat, timpurietate, calitate superioar a strugurilor i toleran sporit la condiiile de iernare. Timpuriu de Cluj Origine. Soiul Timpuriu de Cluj a fost obinut la Staiunea de Cercetri Horticole Cluj de ctre Oprea tefan, prin hibridare sexuat ntre soiurile Crmpoie x Frumoas de Ghioroc, fiind omologat n anul 1979. Se poate cultiva cu rezultate bune n zonele de favorabilitate ecologic pentru

80

Rodica Pop, 2008 cultura economic a viei de vie, cu precdere n Transilvania i n partea de vest a rii, n zona central i de sud a Moldovei, pentru satisfacerea nevoilor de consum local cu struguri pentru mas. Caractere ampelografice. Frunzele adulte au mrime mijlocie cu trei i cinci lobi, iar florile sunt hermafrodite normale de tipul cinci, soiul fiind autofertil. Strugurii de form cilindro-conic, au mrime mijlocie, cu desime mijlocie de inserare a boabelor pe ciorchine (fig. 9). Bobul este mijlociu, de form sferic-oval, cu pielia de culoare alb-glbuie, mijlociu groas i elastic, neaderent la pulp i este acoperit cu un strat fin de pruin. Pulpa este semicrocant cu arom fin specific i gust dulceacrior plcut (OPREA i colab., 2007).

Fig. 9. Caracterele ampelografice ale frunzei i ciorchinelui la soiul Timpuriu de Cluj Ampelographic characters of leaf and cluster in Timpuriu de Cluj variety Este un soi pentru consum n stare proaspt, dar se preteaz i la prepararea vinurilor. Are rezisten bun la secet i boli. Este recomandat pentru cultura n podgoriile din Podiul Transilvaniei i cea a dealurilor Crianei i Maramureului. Cetuia Origine. Acest soi a fost obinut la Staiunea de Cercetri Horticole Cluj, de ctre Oprea tefan, prin hibridare sexuat ntre Crmpoie x Frumoas de Ghioroc, fiind omologat n anul 1979.
81

Rodica Pop, 2008 Soiul se poate cultiva cu rezultate bune n toate zonele cu favorabilitate ecologic pentru cultura viei de vie, mai ales n Transilvania, partea de vest a rii, n Moldova i chiar pe dealurile Subcarpailor Meridionali (OPREA i colab., 2007). Caractere ampelografice. Frunzele adulte au mrime mijlocie cu trei i cinci lobi, iar florile sunt hermafrodite normale de tipul cinci, soiul fiind autofertil.

Fig. 10. Caracterele ampelografice ale frunzei i ciorchinelui la soiul Cetuia Ampelographic characters of leaf and cluster in Cetatuia variety Strugurii de form cilindro-conic, au mrime mijlocie-mare i desime mijlocie de inserare a boabelor pe ciorchine, iar procesele de meiere i mrgeluire sunt absente (fig. 10) . Bobul este mijlociu-mare, de form ovoidal, cu pielia de culoare neagr, mijlociu de groas, elastic, neaderent la pulp i este acoperit cu un strat uniform de pruin, care i d un aspect plcut. Pulpa de culoare alb cu nuane verzui este semicrocant, cu arom fin specific i gust dulce acrior plcut. Cetuia este un soi de struguri pentru masa, remarcndu-se prin calitatea superioar a strugurilor i productivitatea ridicat. 2.2.1.2. Primerii utilizai n amplificarea ADN-ului Pentru amplificarea probelor de ADN s-au utilizat un numr de 39 de primeri decanucleotidici, unul dintre primeri avnd 21 de nucleotide.
82

Rodica Pop, 2008 Proveniena primerilor a fost diferit, astfel: 15 primeri decanucleotidici sunt produi de University of British Columbia (UBC), ase primeri de Pharmacia Biotech (PB), 18 de Mycroshinth (OPAB, OPA, OPE, OPAL, OPX, AB, GY169) (tabelul 3).

Tabelul 3 Primerii utilizai n amplificarea ADN Primers used in DNA amplification

Nr. No. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. Primer Primer UBC 228 UBC 241 UBC 245 UBC 285 UBC 286 UBC 421 UBC 436 UBC 537 UBC 538 UBC 563 UBC 564 UBC 570 UBC 571 UBC 584 UBC 599 PB 1 PB 2 PB 3 PB 4 PB 5 Secvena (5 3) Sequence (5 3) GCT GGG CCG A GCC CGA CGC G CGC GTG CCA G GGG CGC CTA G CGG AGC CGG C ACG GCC CAC C GAG GGG GCC A CGA AAG GAC T TGA TCT CTC C CGC CGC TCC T CGG CGT TAC G GGC CGC TAA T GCG CGG CAC T GCG GGC AGG A CAA GAA CCG C GGT GCG GGA A GTT TCG CTC C GTA GAC CCG T AAG AGC CCG T AAC GCG CAA C Nr. No. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. Primer Primer PB 6 OPAB 11 OPAB 18 OPE 14 AB 11 OPA 04 OPA 03 OPAL 20 OPX O3 OPA 01 GY 169 OPC-14 OPC 15 OPA 11 OPA 17 70.08 OPA 20 70.03 MIC 07 Secvena (5 3) Sequence (5 3) CCC GTC AGC A GTG CGC AAT G CTG GCG TGT C TGC GGC TGA G GTG CGC AAT G AAT CGG GCT G AGT CAG CCA C AGG AGT CGG A TGG CGC AGT C CAG GCC CTT C CTA AGC TGC TTT TGT TTG AGC TGC GTG CTT G GAC GGA TCA G CAA TCG CCG T GAC CGC TTG T CTG TAC CCC C GTT GCG ATC C ACG GTG CCT G TGT CTG GGT G

Primerii utilizai pentru amplificarea secvenelor de ADN au avut un coninut de G-C ntre 50 i 80%. Primerii au fost alei aleatoriu sau pe baza datelor din literatura de specialitate (MULCAHY i colab., 1995; VIDAL i colab., 1999; LIN i colab., 1997; ULANOWSKY. i colab., 2001; YE i colab., 1996; ROUT i colab., 2002; BELLIN i colab., 2001; WOLF i colab., 2001; PAMFIL, 1999). Cei 39 de primeri au fost utilizai pentru amplificarea soiurilor provenite de la toate cele cinci staiuni viticole. Primerii care au dat polimorfism au fost utilizai, apoi, i pentru compararea acelorai soiuri, dar care au provenit din staiuni viticole diferite.
83

Rodica Pop, 2008 2.2.2. Materialul biologic utilizat n experienele de producere a variabilitii somaclonale n condiii de laborator Materialul biologic utilizat pentru iniierea culturilor in vitro a fost constituit din lstarii aparinnd celor zece cultivare de vi de vie din cele cinci staiuni viticole menionate mai sus. Pentru recoltarea de lstari s-au ales plantele cele mai viguroase i mai tipice soiului, cu aspect aparent sntos i fr urme caracteristice de boli sau duntori. In studiile privind inducerea calusogenezei s-au utilizat plantulele

micropropagate in vitro. Materialul biologic folosit pentru studierea variabilitii somaclonale a fost reprezentat de regeneranii obinui din cultura de calus, respectiv cte zece somaclone din fiecare soi (tabelul 4).

2.2.2.1. Medii de cultur folosite Explantele vegetale, reprezentate de organe, esuturi, celule sau protoplati, pot fi meninute n via dup detaarea lor de organismul matern prin cultivarea i creterea acestora pe medii aseptice, cu o compoziie chimic complex. Reuita cultivrii in vitro a explantelor vegetale depinde foarte mult de realizarea unor compoziii nutritive care s corespund cel mai bine cerinelor vitale ale esuturilor cultivate. Unul din mediile de cultur cel mai des utilizat este Murashige-Skoog (MS). In toate experienele noastre, mediul de baz utilizat a fost Murashige Skoog (1962) (a crui compoziie este prezent detaliat n Anexa 1), suplimentat cu diferii hormoni, n funcie de scopul propus. Acest mediu a fost folosit de majoritatea autorilor n micropropagare la via de vie (NAKANO i colab., 1997; HELOIR i colab., 1998; SIVRITEPE i colab., 1999; KIM i colab., 2002; OLAH i colab., 2003; AKBAS i colab., 2004; BERTSCH i colab., 2005; XU i colab., 2005; IBANEZ i colab., 2005). Mediul MS (1962) are, ca i componente de baz, macroelemente, microelemente, vitamine, aminoacizi.
84

Rodica Pop, 2008 Tabelul 4 Somaclonele analizate de la cele zece cultivare de vi de vie n scopul evidenierii apariiei variabilitii somaclonale Vine somaclones analysed in order to evidentiate somaclonal variability
Soiul Cultivar Somaclona Somaclone Fa 1 Fa 6 Fa 2 Fa 7 Fa 3 Fa 8 Fa 4 Fa 9 Fa 5 Fa 10 Fr 1 Fr 6 Fr 2 Fr 7 Fr 3 Fr 8 Fr 4 Fr 9 Fr 5 Fr 10 Ri 1 Ri 6 Ri 2 Ri 7 Ri 3 Ri 8 Ri 4 Ri 9 Ri 5 Ri 10 Mus 1 Mus 6 Mus 2 Mus 7 Mus 3 Mus 8 Mus 4 Mus 9 Mus 5 Mus 10 Mr 1 Mr 6 Mr 2 Mr 7 Mr 3 Mr 8 Mr 4 Mr 9 Mr 5 Mr 19 Soiul Cultivar Cabernet Sauvignon Somaclona Somaclone CR 1 CR 6 CR 2 CR 7 CR 3 CR 8 CR 4 CR 9 CR 5 CR 10 Tr 1 Tr 6 Tr 2 Tr 7 Tr 3 Tr 8 Tr 4 Tr 9 Tr 5 Tr 10 TCj 1 TCj 6 TCj 2 TCj 7 TCj 3 TCj 8 TCj 4 TCj 9 TCj 5 TCj 10 N1 N6 N2 N7 N3 N8 N4 N9 N5 N 10 Ce 1 Ce 6 Ce 2 Ce 7 Ce 3 Ce 8 Ce 4 Ce 9 Ce 5 Ce 10

Feteasc alb

Feteasc regal

Traminer roz

Riesling italian

Timpuriu de Cluj

Muscat Ottonel

Napoca

Merlot

Cetuia

Ca surs de hidrai de carbon s-a utilizat zaharoza (Sigma) n concentraie de 23%. Ca agent de gelificare s-a utilizat agargel (Sigma) n concentraie de 0,75%.

2.2.2.2. Regulatorii de cretere utilizai, rol i funcii hormonale Regulatorii de cretere sunt compuii organici, alii dect substanele nutritive, care n cantiti mici stimuleaz, inhib sau modific procesele fiziologice din plante. S-a constat c hormonii vegetali nu acioneaz separat, ci se intercondiioneaz reciproc, astfel c reacia plantelor, n toate fazele de cretere i dezvoltare, reprezint
85

Rodica Pop, 2008 rezultatul unui echilibru ntre compuii stimulatori i inhibitori. Substanele biostimulatoare cuprind trei grupe mari de compui cunoscui: auxine, gibereline, citokinine, iar dup MITCHELL i colab. (1970) i brasinosteroizii. La prepararea mediilor de cultur, n experienele noastre s-au folosit auxina, acidul alfa naftil acetic (ANA) i citochinele, reprezentate de benzil aminopurina (BAP) i tidiazuron (TDZ). n funcie de etapa parcurs n procesul de multiplicare in vitro s-a utilizat o anumit gam de concentraii pentru fiecare tip de hormon. Tipurile de hormoni vegetali i concentraiile utilizate sunt prezentate n tabelul 5. Tabelul 5 Substane biostimulatoare utilizate n cultura in vitro la via de vie (mg/l) Cluj-Napoca, 2003-2006 Types of regulators used in vitro culture for grapewine (mg/l) Cluj-Napoca 2003-2006 Iniierea culturii in vitro Initiated culture in vitro 0,5 0,5; 1,0; 2,5 Inducerea calusogenezei Callus induction 5,0; 10,0 1,0 Regenerarea din calus Regeneration of callus 0,5 0,5; 1,0; 2,0

Tipul de hormon Type of regulator ANA (mg/l) BAP (mg/l) TDZ (mg/l)

2.2.2.2.1. Auxinele Auxinele sunt compui naturali care, n doze extrem de mici, direct sau indirect, pot stimula att creterea ct i dezvoltarea plantelor, respectiv formarea organelor vegetative i generative. Fitohormonii auxinici ndeplinesc numeroase funcii biologice, avnd un rol multiplu i complex n organismele vegetale. Rolul esenial al auxinelor const n alungirea i creterea celulelor, prin mrirea plasticitii i permeabilitii membranelor i a pereilor celulari. Avnd i o puternic aciune rizogen, auxinele sunt folosite n nmulirea vegetativ pentru stimularea nrdcinrii butailor. Cele mai utilizate auxine sunt acidul alfa naftil acetic (ANA), acidul 3- indolil

86

Rodica Pop, 2008 butiric (AIB), acidul beta indolilacetcic (AIA), iar pentru inducerea formrii calusului, cel mai adesea literatura citeaz utilizarea acidul 2,4 diclorfenoxiacetic (2,4-D). Se cunosc i numeroase exemple n care, pentru inducerea calusului, s-au utilizat concentraii mai mari de auxine sau combinaii ntre auxine i citochinine (HUTTEMAN i colab., 1993; NAKANO i colab., 1997; OLAH i colab., 2003). Se apreciaz c, pentru diferenierea i alungirea celulelor din tulpini, concentraia de auxin trebuie s fie ntre 10-5 M - 10-6 M. Concentraia de auxine care acioneaz pentru stimularea mugurilor se apreciaz la 10 -8 M, iar pentru alungirea celulelor din rdcini de la 10-10 pn la 10-12 M. Concentraiile mai mari de auxine duc la producerea unor tulburri morfologice, apariia de hipertrofii i de hiperplastii care const n formarea de esuturi tumorale (MILIC i colab., 1983).

2.2.2.2.2. Citochininele Citochininele sunt adenine substituite cu un nucleu purinic. Ele stimuleaz diviziunea celular i au un rol important i n stimularea celulelor vegetale mature nemeristematice (CACHI, 2000). La plantele superioare, biosinteza citochininelor are loc n esutul meristematic din vrful rdcinii, de unde sunt transportate prin esuturile conductoare ctre celelalte esuturi i organe ale plantei. Activitatea fitohormonal de baz a citochininelor n cadrul metabolismului, const n stimularea biosintezei acizilor nucleici (ARNr, ARNm) i a activitii proteinelor sau inhibarea activitii unor enzime (HIGGINS i colab., 1978), procese care inhib mbtrnirea celulelor i a esuturilor vegetale. Citochininele au un rol important n procesul de morfogenez al plantelor (BUTIUC i colab., 1996). Un coninut mai mare de kinetin n mediul nutritiv, fa de cel al auxinei, determin formarea de muguri pe calus, muguri din care se vor forma tulpini. Dac ns se mrete coninutul auxinei, pe cnd cel al kinetinei rmne la acelai nivel, pe esutul medular apar rdcini adventive (HUSSEY, 1977, PAMFIL, 1983, LOYD i colab., 1988). Pentru inducerea apariiei centrilor meristematici, care s genereze mugurai i
87

Rodica Pop, 2008 apoi tulpinie, cel mai adesea n mediile de cultur este necesar prezena unei citochinine, n concentraii de 1-5 mg/l. Caulogeneza este stimulat de prezena n substratul de cultur a unui anumit raport ntre auxine i citochinine. nainte de descoperirea citochininelor, a fost mult apreciat combinaia dintre auxina 2,4-D i laptele de nuc de cocos, ca fiind eficient n inducerea formrii calusului. Dup descoperirea citochininelor, pentru inducerea calusogenezei kinetina a fost mult utilizat, dei nu n toate cazurile cu aceleai rezultate. Treptat laptele de nuc de cocos a fost nlocuit de citochinine. Abia mai trziu s-a demonstrat c efectul benefic al laptelui de nuc de cocos s-a datorat faptului c el conine muli compui derivai ai citochininei. Realitatea c auxinele i citochininele sunt eseniale pentru calus a fost acceptat unanim dup descoperirea prezenei citochininei n laptele de nuc de cocos (PIERIK, 1987). Tidiazuronul este considerat printre cele mai active citochinine. Aceast citochinin induce in vitro o proliferare mult mai mare la multe specii, n comparaie cu alte citochinine. De asemenea, s-a constat c este eficient n micropropagarea multor specii recalcitrante, cum sunt speciile lemnoase (HUTTEMAN i colab., 1992).

2.2.2.3. Prepararea soluiilor stoc pentru mediile de cultur Mediile de cultur se compun din substane anorganice: macroelemente, microelemente i fier chelatizat (FeEDTA) i dintr-o serie de substane organice: vitamine, aminoacizi, glucide, hormoni, i un agent gelificant. n general, se prepar soluii stoc separat pentru: macroelemente,

microelemente, FeEDTA, vitamine, aminoacizi i pentru fiecare tip de hormon utilizat. La prepararea soluiilor stoc, s-a inut seama de cteva reguli: dizolvarea substanelor s-a fcut numai n solventul adecvat (ap bidistilat, alcooli, hidroxizi, acizi etc.); compuii anorganici au fost dizolvai succesiv, n ordinea indicat de protocol; atunci cnd substana s-a solubilizat mai greu, amestecul s-a nclzit uor, pe o plit cu agitator magnetic.
88

Rodica Pop, 2008 Soluiile stoc de macroelemente au fost preparate n concentraie de 10 ori mai mare dect cea prevzut n reeta mediului de cultur. Soluiile stoc de microelemente au avut o concentraie de 100 de ori mai mare dect cea prevzut n formula de baz a mediului. Fierul, un microelement necesar n mediile de cultur, a fost utilizat sub form de chelat (Na2FeEDTA). n cazul chelatului de fier nu s-au pregtit soluii stoc, acesta fiind cntrit n momentul utilizrii. Soluiile stoc de vitamine, aminoacizi i hormoni necesare au fost preparate n concentraie de 10%. Avnd n vedere c soluiile stoc se recomand s fie rennoite periodic la circa trei luni de zile, pentru vitamine, aminoacizi i hormoni s-a ales un volum de 100 ml. Hidrolizatul de cazein a fost dizolvat n momentul utilizrii ntr-o soluie 1 N NaOH (hidroxid de sodiu). Aa dup cum recomand literatura de specialitate, hormonii au fost dizolvai n alcool etilic sau hidroxid de sodiu. Auxina utilizat, respectiv acidul alfa naftil acetic (ANA) a fost dizolvat ntro mic cantitate de alcool etilic 960 i apoi s-a diluat cu ap bidistilat pn la obinerea soluiei de concentraie 10%. Citochinina, respectiv benzil aminopurina (BAP), a fost dizolvat, de asemenea, ntr-o mic cantitate de soluie 1 N de NaOH i apoi diluat cu ap bidistilat pn la obinerea soluiei finale stoc cu concentraia de 10%. TDZ - thidiazuron (N-phenyl-N1,2,3,-thidiazol-5-yl urea) a fost dizolvat n DMSO (dimetil sulf oxid) pentru a obine soluia stoc (10%). Pentru toate soluiile stoc aducerea la volum final s-a realizat n baloane cotate. Via de vie este una din plantele care necesit cantiti mari de azot organic. Ca surs de aminoacizi dar i ca surs de azot organic se utilizeaz adesea hidrolizatul de cazein n concentraie de 0,1 1,0 g/l, peptona 0,25-3,0 g/l, triptona 0,25-2,0 g/l i extractul de mal 0,5-1,0 g/l. Pentru a suplini aportul de azot organic din mediul de cultur s-a utilizat hidrolizatul de cazein. Hidrolizatul de cazein a fost solubilizat ntr-o soluie 1 N de NaOH n momentul utilizrii. Cantitate de hidrolizat de cazein utilizat a fost de 100
89

Rodica Pop, 2008 mg/l mediu de cultur. Soluiile stoc au fost pstrate n frigider la temperatura de 2-40C i au stat la baza preparrii mediului propriu-zis de cultur.

2.2.2.4. Primerii utilizai n amplificarea ADN-ului regeneranilor obinui Primerii utilizai pentru amplificarea ADN-ului regeneranilor obinui din cultura de calus au fost cei care au dat polimorfism n cazul amplificrii ADN-ului la cultivarele de vi de vie in vivo. Proveniena celor 22 de primeri a fost diferit, astfel: 5 primeri decanucleotidici produi de University of British Columbia (UBC), 5 primeri de Pharmacia Biotech (PB), 12 de Mycroshinth (OPAB, OPA, OPE, OPAL, OPX, AB) (tabelul 6). Tabelul 6 Primerii utilizai n amplificarea ADN a regeneranilor obinui Primers used in DNA amplification of regenerants obtained
Nr. No 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. Primer Primer UBC 228 UBC 245 UBC 563 UBC 584 UBC 599 PB 1 PB 3 PB 4 PB 5 PB 6 OPAB 11 OPAB 18 OPE 14 AB 11 OPA 04 OPA 03 OPAL 20 OPX O3 OPA 01 70.08 70.03 Secvena (5 3) Sequence (5 3) GCT GGG CCG A CGC GTG CCA G CGC CGC TCC T GCG GGC AGG A CAA GAA CCG C GGT GCG GGA A GTA GAC CCG T AAG AGC CCG T AAC GCG CAA C CCC GTC AGC A GTG CGC AAT G CTG GCG TGT C TGC GGC TGA G GTG CGC AAT G AAT CGG GCT G AGT CAG CCA C AGG AGT CGG A TGG CGC AGT C CAG GCC CTT C CTG TAC CCC C ACG GTG CCT G 90

Rodica Pop, 2008

Nr. No 22. Primer Primer MIC 07 Secvena (5 3) Sequence (5 3) TGT CTG GGT G

2.3. METODE DE LUCRU 2.3.1. Metode de lucru aplicate n experienele cu material biologic produs in vivo 2.3.1.1. Extracia de ADN n vederea executrii analizelor RAPD Metodele de izolare a ADN-ului au ca i criterii de baz puritatea, integritatea i cantitatea de ADN obinut. S-a demonstrat c puritatea ADN-ului este unul dintre cei mai importani factori n reproductibilitatea metodei RAPD. Utilizarea matriei de ADN cu o puritate mare asigur reproductibilitate prin metoda RAPD. Amprentele RAPD vor fi identice n repetiii numai dac ADN-ul are o calitate adecvat. Multe din aceste metode urmresc eliminarea polifenolilor i a polizaharidelor care determin izolarea unor extracte de ADN cu o culoare brun, inaccesibile enzimelor de restricie. Extracia ADN-ului la via de vie este dificil datorit prezenei polifenolilor i a poliglucidelor n cantitate mare. De aceea, n experienele noastre s-a ncercat optimizarea unui protocol de extracie a ADN-ului prin care s se obin o puritate ct mai mare. In acest sens, a fost adugat n tamponul de extracie polivinilpirolidona (PVP), mercaptoetanol, acid ascorbic i acidul dietilditiocarbamic (DIECA). De asemenea, prin adugarea soluiei apoase de clorur de sodiu (NaCl) 5M i etanol s-a mrit solubilitatea polizaharidelor, mpiedicnd totodat i precipitarea concomitent a polizaharidelor cu ADN-ul. Pentru a obine un ADN de calitate care s poate fi utilizat n tehnica RAPD au fost testate trei metode de izolare: Protocolul A descris de ROGER i colab. 1988 Protocolul B descris de ROGER i colab., 1988 modificat

91

Rodica Pop, 2008 Protocolul C descris de LODHI i colab., 1994, modificat (POP i colab., 2003). Protocol A extracie ADN dup ROGER i colab., 1988 Soluii necesare pentru izolarea ADN-ului: 2 x CTAB 2% - 100 ml 2 % CTAB 100 mM Tris HCl 20 mM EDTA 1,4 M NaCl 1% PVP Soluie salin CTAB 5% - 100 ml 5% CTAB 0,7 M NaCl Tampon TE salin 100 ml 10 mM Tris pH8 1 mM EDTA pH 8 1 M NaCl Tampon 0,1 x TE 100 ml 1,0 mM Tris pH 8 0,1 mM EDTA pH 8 Cloroform : alcool izoamilic 24 : 1 - 100 ml Alcool etilic 95% - 100 ml Alcool etilic 80% - 100 ml RNA-az 1 mg/1 ml

Izolarea ADN-ului s-a realizat din 500 mg esut foliar, mojarat n azot lichid. Etapele de extracie a ADN-ului au fost: Materialul biologic se mojareaz n azot lichid. Mojarul se rcete n prealabil cu azot lichid. Se adaug 700 l tampon de extracie (2 x CTAB) nclzit la temperatura de 650C i se continu nclzirea ntr-o baie marin la aceast temperatur nc 1-5 minute. PVP-ul se adaug n tamponul de extracie doar n momentul folosirii. Se transfer circa 100 mg din pudr (fr a o lsa s se topeasc) ntr-un tub Eppendorf de 1,5 ml. Se adaug 700 l cloroform : alcool izoamilic (24:1) i se agit uor. Se centrifugheaz 5 minute la 11.000 rotaii/minut. Se transfer faza apoas de la suprafa ntr-un nou tub Eppendorf. Se ndeprteaz faza cu cloroform de la baz. Se adaug 1/10 din volum soluie 5% CTAB (sau 1/5 din volumul soluie) i se amestec prin inversare.
92

Rodica Pop, 2008 Se realizeaz o nou extracie cloroform alcool izoamilic (24:1) repetnd paii de la punctele 4-6. Se adug tampon de precipitare, n volum egal i se amestec uor. Tuburile se pun n ghia sau la frigider (2-40C) pentru 5-30 de minute. Se centrifugheaz 10-60 secunde la 10.000 rotaii/minut. Se ndeprteaz supernatantul. Se rehidrateaz pellet-ul n tampon TE salin. Se adug dou volume de alcool etilic 95% rece (-200C) i se amestec uor. Se centrifugheaz 15 minute la 10.000 rotaii/minut. Se ndeprteaz supernatantul. Se adug alcool etilic 80% pn la volumul original i se centrifugheaz 5 minute la 10000 rotaii/minut. Se ndeprteaz supernatantul. Se ateapt pn la evaporarea complet a lichidului. Se rehidrateaz pellet-ul n soluie tampon 0,1 TE. Se trateaz cu RNA-az 1 l /100 l ADN la 370C, o or pentru eliminarea ARN-ului. Materialul se poate pstra n congelator la 200C sau 700C. Protocol B extracie ADN dup ROGER S.O. i colab., 1988, modificat Soluii necesare pentru izolarea ADN-ului: 2 x CTAB 2% - 100 ml 2 % CTAB 100 mM Tris HCl 20 mM EDTA 1,4 M NaCl 2% PVP 2% mercaptoetanol Tampon 0,1 x TE - 100 ml Soluie salin CTAB 5% - 100 ml 5% CTAB 0,7 M NaCl Tampon TE salin - 100 ml 10 mM Tris pH 8 1 mM EDTA pH 8 1 M NaCl Cloroform : alcool izoamilic 24 :1- 100 ml Alcool etilic 95% - 100 ml RNA-az 1 mg/1ml

1 mM Tris pH 8 0,1 mM EDTA pH 8

n cazul acestui protocol, n tamponul de extracie s-a adugat o cantitate mai

93

Rodica Pop, 2008 mare de PVP, respectiv 2% i 2% mercaptoetanol. Etapele de extracie au fost aceleai ca i n cazul protocolului A. Protocol C extracie ADN dup LODHI i colab., 1994 modificat Soluii necesare pentru izolarea ADN-ului: 2 x CTAB 2% - 100 ml 2 % CTAB 100 mM Tris HCl 20 mM EDTA 1,4 M NaCl 2% PVP 10 mM acid ascorbic 4 mM DIECA Tampon TE 100 ml 10 mM Tris HCl pH 8 1 mM EDTA phH 8 Pentru obinerea extractului de ADN s-au parcurs urmtoarele etape: Se mojareaz 0,5 g material biologic n azot lichid pn se obine o pulbere. Este important ca prin mojarare s nu se obin o pulbere foarte fin. n tuburile Eppendorf se pipeteaz cte 700 l tampon de extracie. n momentul utilizrii n tamponul de extracie se adaug PVP, acid ascorbic i DIECA. Se transfer circa 100 mg din pudra obinut prin mojarare i se amestec cu grij, prin inversarea tuburilor Eppendorf. Se incubeaz tuburile pentru 25 de minute la temperatura de 65 0C i apoi se las s se rceasc la temperatura camerei. Se adaug 700 l cloroform : alcool izoamilic i se omogenizeaz bine prin inversarea tuburilor de 20-25 ori pentru obinerea unei emulsii. Se centrifugheaz pentru 15 minute la 11.000 rotaii/minut la temperatura camerei. Se transfer faza apoas ntr-un nou tub eppendorf. Tampon de precipitare - 100 ml 5 M NaCl Cloroform : alcool izoamilic 24 : 1 100 ml Alcool etilic 95% - 100 ml Alcool etilic 80 % - 100 ml RNA-az 1 mg/1 ml

94

Rodica Pop, 2008 Pentru o extracie mai bun, respectiv pentru asigurarea unei puriti superioare a soluiei de ADN se repet paii 5-6-7. Se adaug 0,5 volume soluie apoas de NaCl 5 M i se omogenizeaz bine. Se adaug dou volume de alcool etilic 95% rece (-200C) i se pstreaz tuburile la frigider 15-30 de minute (4-60C). Soluia poate fi inut la frigider o or sau mai mult, dac este necesar. Se centrifugheaz 3 minute la 3000 rotaii/minut apoi se crete turaia la 11.000 rot/minut pentru 5 minute, la temperatura camerei. Aceast diferen de centrifugare ajut la sedimentarea ADN-ului n tubul de centrifugare. Se ndeprteaz supernatantul. Se adaug 700 l alcool etilic 80% rece (0-40C), pentru splarea pellet-ului. Se centrifugheaz 5 minute la 10.000 rotaii/minut. Se ndeprteaz supernatantul. Se ateapt pn la evaporarea complet a alcoolului etilic , circa 20-30 de minute. Se rehidrateaz pellet-ul n soluie de TE 50 l/tub. Se trateaz cu 1 l RNA-az/100 l ADN soluie i se incubeaz la 370C timp de 15 minute. ADN-ul se pstreaz n soluie TE (Tris EDTA) sau n ap steril deionizat. Probele de ADN se pot pstra pe o perioad mare de timp n frigider sau congelator. Dac se are n vedere meninerea probelor pentru o perioad mai scurt de timp se recomand pstrarea la temperatura de 200C, iar pentru o perioad ndelungat de timp (luni sau ani) se recomand temperatura de 700C. In cazul protocolului C, modificarea a constat n adugarea, n tamponul de extracie, a urmtoarelor componente: 2% polivinilpirolidon (PVP), 10 mM acid ascorbic i 4 mM acid dietilditiocarbamic (DIECA). Aceste substane au fost adugate nainte de utilizare. Soluiile necesare pentru extracia ADN-ului au fost preparate n soluii stoc (100 ml) i pstrate n frigider sau la temperatura camerei (Vezi anexa 1).

95

Rodica Pop, 2008

2.3.1.2. Cuantificarea ADN-ului Dup extracia ADN-ului, probele au fost cuantificate spectofotometric cu ajutorul aparatului BioPhotometer Eppendorf. Metoda spectofotometric se bazeaz pe faptul c majoritatea substanelor biologice au o rat de absorbie caracteristic n domeniul radiaiilor ultraviolete. Astfel, rata de absorbie de 260 nm corespunde acizilor nucleici, cea de 280 nm proteinelor, iar 230 nm diferiilor contaminani. Densitatea optic a fost msurat la rata de absorbie A 260 nm i A 280 nm, fcnd raportul dintre cele dou rate de absorbie. ADN-ul este considerat suficient de pur, dac raportul celor dou citiri, respectiv A260/A280, are valori cuprinse ntre 1,7 i 2,0. Valorile mai mici de 1,7 indic impurificri cu proteine, iar cele mai mari de 2,0 impurificri cu ali contaminani. Aparatul BioPhotometer Eppendorf red att concentraia ADN-ului, ct i cantitatea de ADN exprimat n ng/l sau g/ml. Legea lui Beer-Lambert arat c exist o relaie de liniaritate ntre concentraia unui compus i absorbana sa la o anumit lungime de und. Pe acest fapt se bazeaz calcularea concentraiei de ADN, dar se fac i aprecieri asupra puritii ADN-ului n raport cu proteinele. Intre cele trei metode de extracie a ADN-ului au rezultate diferene att n ceea ce privete puritatea ADN-ului ct i cantitatea acestuia (tabelul nr. 4 i 8). Datele obinute au fost interpretate prin analiza varianei, testul comparaiilor multiple.

2.3.1.3. Protocol de amplificare RAPD Concentraia ADN matri trebuie s fie, n general, cuprins ntre 5-500 ng/50 l volum de reacie, cu un optim ntre 10-50 ng/50 l volum de reacie. Pentru obinerea soluiei de ADN de lucru cu aceast concentraie, ADN-ul a fost diluat cu TE (Tris HCl EDTA).
96

Rodica Pop, 2008 Componena reaciei PCR Amestecul de reacie RAPD a avut un volum de 25 l/tub eppendorf, cu urmtoarea compoziie: 50 ng ADN 200 M amestec dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) (Promega) 0,2 M primer 2,5 mM MgCl2 2,5 mM 10 x buffer 1 U Taq DNA Polymerase (Promega) 2% PVP (Sigma) ap bidistilat steril

Prepararea amestecului de reacie s-a realizat n hota cu flux laminar, n condiii sterile. Proba martor (control) conine toate componentele amestecului de reacie cu excepia ADN-ului. Amplificarea probelor s-a realizat n aparatul Eppendorf Mastercycler gradient programat astfel: 3 minute la 950C predenaturare, urmat de 45 de cicluri cu urmtorul profil de temperatur : 1. 1 minut la 930C denaturare 2. 1 minut la 340C fixarea primerilor 3. 1 minut la 720C extensie 4. extensia final 10 minute la 720C. Temperatura de denaturare desface legturile de hidrogen i separ cele dou catene de ADN, conferindu-le rol de matrie. Temperatura de hibridare, respectiv de fixare a primerilor, permite amorselor s se ataeze la secvenele lor omoloage de pe matri. Temperatura de extensie, asigur funcionarea optim a Taq polimerazei, respectiv sinteza ADN-ului. Pentru amplificare s-au utilizat 39 de primeri decanucleotidici, un primer avnd 21 de nucleotide (tabelul 3). Primerii au fost utilizai pentru amplificarea soiurilor

97

Rodica Pop, 2008 provenite de la toate cele cinci staiuni viticole. Primerii care au dat polimorfism au fost utilizai apoi i pentru compararea acelorai soiuri, dar care au provenit din staiuni viticole diferite.

2.3.1.4. Electroforeza n gel de agaroz

2.3.1.4.1. Prepararea gelurilor de agaroz i a probelor de ADN Ca metod standard de separe, identificare i purificare a fragmentelor de ADN se utilizeaz electroforeza n gel de agaroz i poliacrilamid. Gelurile de agaroz au o putere de rezoluie mai mic dect cele de poliacrilamid, dar au o gam mult mai larg de separare: fragmente de la 200 pb pn la aproximativ 50 Kb, n funcie de concentraia de agaroz. Prepararea gelurilor a constat n topirea agarozei n cuptorul cu microunde, n tampon de electroforez Tris-borat 0,5 x (TBE) i turnarea acestora, dup rcire la circa 550C, n cuva de electroforez. Migrarea gelurilor s-a realizat n cuva de electroforez orizontal, n tamponul Tris-borat 0,5x (TBE). Pentru obinerea gelurilor s-a utilizat agaroza (Sigma) n concentraie de 1,4%. Amplificarea probelor s-a fcut n trei repetiii pentru fiecare primer analizat. Cantitatea maxim de ADN, care poate fi ncrcat ntr-un godeu, depinde de numrul de fragmente i de mrimea lor. Cantitatea minim de ADN care poate fi detectat prin fotografiere, ntr-un gel colorat cu bromur de etidiu, este de 2 ng, ntr-o band lat de 5 mm. Dac o asemenea band conine mai mult de 500 ng, de ADN, nseamn c godeul a fost suprancrcat, din care cauz rezult formarea unei benzi continue, fr individualizare de-a lungul gelului (smearing, trailing). Cnd sunt analizate relativ puine fragmente de lungimi diferite n aceeai prob, este recomandat ncrcarea cu 100-500 ng ADN ntr-un godeu cu limea de 5 mm. Dac sunt analizate un numr mare de fragmente, cu lungimi diferite, este posibil ncrcarea cu o cantitate mult mai mare de ADN, de 20-30 g/godeu. Volumul maxim de ncrcare este determinat de volumul godeului (de exemplu 5 mm x 5 mm x 1,5 mm) adic aproximativ 37,5 l (DORDEA i colab., 2000).
98

Rodica Pop, 2008 Probele de ADN amplificate au fost preparate n tampon de ncrcare colorat cu albastru de bromfenol. n fiecare tub eppendorf s-a adugat cte 5 g de colorant. n fiecare godeu al gelului s-au pipetat cte 12 l din produsul de amplificare. Primul godeu a fost ncrcat cu 12 l marker ADN standard (100 pb DNA Step Ladder, Promega). 2.3.1.4.2. Migrarea electroforetic Electroforeza este un fenomen fizico-chimic de deplasare a particulelor purttoare de sarcini electrice sub influena unui cmp electric. ntr-un cmp electric uniform generat de doi electrozi, particulele ncrcate electric se deplaseaz nspre electrozii de sarcin electric opus. In condiii standardizate ale mediului de migrare i ale cmpului electric, mobilitatea electroforetic depinde n mod esenial de mrimea i forma moleculelor. Particulele de mrime mai mic se deplaseaz mai repede dect cele de mrime mai mare. Sursa de putere a fost programat la 0,57 V, respectiv 0,56 mA, iar durata de migrare a fost de 2 ore i 30 minute. Sursa de putere asigur curent continuu la bornele sale. Pstrarea constant a tensiunii i intensitii curentului electric, de-a lungul ntregului proces, este esenial pentru o electroforez corect. In timpul migrrii, bromura de etidiu migreaz spre catod, n sens opus fa de ADN. Dac migrarea dureaz foarte mult, o cantitate semnificativ de bromur de etidiu este ndeprtat din gel, fcnd dificil vizualizarea benzilor srace n ADN. Timpul de migrare este mrit n prezena EtBr, deoarece mobilitatea ADN-ului dublu catenar liniar este micorat cu circa 15% fa de ADN-ul fr molecule de EtBr intercalate. Pentru a nu contamina cuva de electroforez cu bromur de etidiu, gelurile au fost colorate dup migrare. n plus, exist i prerea c benzile formate n absena bromurii de etidiu (EtBr) sunt mai precise. De aceea se prefer colorarea ulterioar a gelurilor, dei aceast procedur prezint dezavantajul c benzile nu pot fi urmrite n diferite stadii n cursul migrrii (prin oprirea migrrii i examinarea n UV). In experienele noastre, dup separare, gelul a fost imersat n 150 ml 0,5x TBE

99

Rodica Pop, 2008 la care s-a adugat o soluie de bromur de etidiu 0,5 g/ml. n aceast soluie gelul a fost meninut pe o platform agitatoare, timp de 30 de minute. 2.3.1.5. Preluarea imaginilor Bromura de etidiu i pierde relativ repede fluorescena n UV, astfel c gelurile colorate cu acest colorant nu se pot pstra, fotografierea gelului, expus la UV fcnduse imediat dup migrare. Vizualizarea produilor de amplificare s-a realizat n lumin UV, imaginea gelurilor fiind achiziionat cu o camer video Alpha Innotech. Preluarea imaginilor s-a realizat cu ajutorul programului Alfa Imager.

2.3.1.6. Analiza imaginilor In analiza statistic s-au inclus doar benzile cu o intensitate luminoas mare. Benzile au fost detectate automat cu ajutorul programului Total Lab TL 100. Acest program stabilete mrimea fragmentelor de ADN prin compararea acestora cu un ADN standard (Ladder ADN 100 pb). ADN-ul standard utilizat const din 40 de fragmente cuprinse ntre 100 i 4000 pb. In urma comparrii cu ADN-ul standard s-a putut stabili mrimea fiecrui fragment amplificat. Prezena benzii cu aceeai mrime a fost notat cu 1, iar absena ei din cultivarele analizate s-a notat cu 0. Analiza gelurilor s-a fcut cu ajutorul programului Total Lab TL 100, obinndu-se matricea binar. Matricea binar s-a utilizat apoi pentru calcularea distanelor genetice. Pentru calcularea distanelor genetice i realizarea dendrogramei s-a utilizat programul RAPDistance 1.04, utiliznd coeficientul Jaccarrd pentru distanele genetice, respectiv metoda Neighbor Joining Tree pentru dendrogram. Formula utilizat pentru calculul coeficientului Jaccard (Jij) este urmtoarea:

Jij = C ij / (ni + nj - Cij unde:

100

Rodica Pop, 2008 Cij genotipuri; nj respectiv j. Distanele genetice calculate cu ajutorul coeficientului lui Jaccard au fost analizate pentru realizarea dendrogramei prin metoda Neighbor Joining. Prezentarea grafic a dendrogramei s-a realizat cu pachetul de programe RAPDistance 1.04. - reprezint numrul total de benzi identificate la genotipul i i - reprezint numrul de benzi identice prezente la cele dou

2.3.2. Metode de lucru aplicate n experienele cu material biologic produs in vitro

2.3.2.1. Metodele de multiplicare in vitro utilizate n experiene nmulirea asexuat in vitro se poate realiza prin mai multe procedee: inducerea i accelerarea proliferrii mugurilor axilari sau lstrirea axilar multipl; inducerea formrii mugurilor adventivi; inducerea diferenierii embrionilor somatici identici cu cei zigotici; inducerea formrii organelor de rezerv bulbi, bulbili, microtuberculi etc.

Alegerea unei metode de micropropagare are n vedere anumii factori cum ar fi: rata multiplicrii i posibilitile de meninere a acesteia la un anumit nivel; diferenele genotipice; posibilitatea obinerii unor variante sau mutante. Pentru iniierea culturilor in vitro, la cele 10 cultivare de Vitis vinifera, n experienele noastre s-a utilizat sistemul de multiplicare prin lstrire axilar.

2.3.2.2. Multiplicarea prin lstrire axilar Prin acest sistem de micropropagare se poate asigura o mare uniformitate genetic a descendenilor, deoarece lipsete faza de calus. Se consider c fiecare
101

Rodica Pop, 2008 lstar este o potenial plant, fapt ce poate asigura o rat de multiplicare foarte mare care poate fi meninut la un nivel constant pe parcursul unui numr mare de pasaje. Literatura de specialitate arat c rata de multiplicare poate ajunge la 10 4 - 108/ an. Multiplicarea prin lstrire axial suprim dominana apical, ceea ce va determina funcionarea meristemelor mugurilor care sunt formai pe plant n alte poziii dect apical. Ca i tipuri de explante se pot utiliza vrfurile de lstari, meristeme, muguri terminali sau axilari, apexuri de lstari, noduri sau inflorescene. Etapele multiplicrii prin lstrire sunt: Iniierea culturii pornind de la diferite tipuri de explante. Stimularea reactivrii meristemelor i formarea lstarilor, n acest scop fiind necesar alegerea unui mediu adecvat, cel mai adesea cu o concentraie mic de citochinine. Utilizarea neoplantulelor ca surs de explante, de la acestea prelevndu-se nodurile i apexurile care vor constitui noi lstari. Inducerea lstririi axilare multiple i formarea de tufe de lstari, fenomen ce poate fi obinut prin utilizarea unui mediu bogat n citochinine. Multiplicarea prin divizarea tufelor de lstari. nrdcinarea lstarilor in vitro i aclimatizarea plantelor obinute. n cazul n care lstrirea este foarte intens se poate provoca alungirea lstarilor nainte de nrdcinare. Cultura in vitro, la toate soiurile de vi de vie studiate, a fost iniiat din segmente nodale, cu cel puin un mugure axilar, detaate de pe lstarii recoltai din cmp.

2.3.2.3. Cultura de calus Utilizarea altor tipuri de explante dect meristemul, n scopul regenerrii de neoplantule, necesit parcurgerea obligatorie a unui stadiu de cultur de calus.

102

Rodica Pop, 2008 Calusul este o mas neorganizat, inform, de celule parenchimatice proliferate care, prin cultivare, formeaz focare de celule meristematice, elemente de sisteme conductoare, celule pigmentate etc. Pentru obinerea de calus este nevoie de un mediu agarizat care s susin masa celular, n cretere. Periodic, calusul trebuie fragmentat i subcultivat pentru a nu intra n senescen. Formarea calusului poate fi indus i acesta prolifereaz, n special pe medii de cultur cu 2,4-D. De asemenea, i ali regulatori de cretere, fie auxine, fie citochinine aflai n concentraii mari n mediul de cultur, pot genera calus. Operaiunile care trebuie efectuate n scopul obinerii de calus sunt (CACHI, 1984): alegerea materialului vegetal, din care se va executa prelevarea explantelor, acesta putnd fi reprezentat de: semine, embrioni, rdcini, esut de rezerv, frunze, ramuri, antere, ovare etc.; prepararea mediilor de cultur i alegerea tipului de mediu adecvat; sterilizarea vaselor i a mediilor de cultur; pregtirea materialului vegetal n vederea dimensionrii explantelor; dimensionarea explantelor; inocularea explantelor; incubarea inoculilor fie la ntuneric, fie la lumin; observarea proceselor de formare a calusului i urmrirea creterii acestuia; repicarea periodic i transferarea fragmentelor de calus pe medii proaspete, de obicei la circa 4-6 sptmni; urmrirea proceselor de organogenez sau embriogenez.

2.3.2.4. Multiplicarea prin muguri sau lstari adventivi Prin acest sistem de micropropagare se induce indirect, n calusuri, sau direct pe explante formarea mugurilor. Se consider c fiecare mugure poate fi o potenial plant nou. Acest tip de multiplicare a fost utilizat n experienele noastre de propagare in vitro a regeneranilor i n cele de formare a calusului i subcultivarea repetat a acestuia.
103

Rodica Pop, 2008 Ca i tip de explante se utilizeaz frunze, tulpini sau calusul. Etapele multiplicrii prin inducerea formrii lstarilor adventivi sunt: iniierea culturii folosind fragmente de organe, esuturi, protoplati, polen; inducerea formrii mugurilor adventivi din celulele explantului, utiliznd un mediu de cultur adecvat; creterea lstarilor obinui din muguri fie pe acelai tip de mediu fie pe un mediu diferit pentru a stimula alungirea; formarea calusului primar prin inducerea diviziunii i dediferenierea celulelor explantului iniial; subcultivarea calusului pe un mediu de cretere; regenerarea plantelor prin transferul calusului pe un mediu de inducere a organogenezei, meninerea calusului pe medii fcndu-se prin pasri succesive; nrdcinarea lstarilor in vitro prin utilizarea unui mediu bogat n auxine sau un mediu fr hormoni. Acest sistem de multiplicare poate duce la obinerea unor variaii genetice sau epigenetice. Metoda este indicat n cazul speciilor la care stabilitatea genotipic nu este obligatorie sau atunci cnd ea poate fi evaluat n stadiul de plantul. n cazul n care obiectivul principal l reprezint meninerea stabilitii genetice, acest sistem de multiplicare este contraindicat. Pentru a obine plante care pot prezenta variaii genetice sau epigenetice este necesar creterea numrului de subcultivri i monitorizarea concentraiei regulatorilor de cretere, regenerarea indirect din calus i identificate. a pstrrii variaiilor

2.3.2.5. Sterilizarea materialului biologic, a recipientelor i mediilor de cultur utilizate n experienele in vitro Materialul biologic donator de explante a fost constituit din lstari tineri provenii de la zece soiuri de vi de vie, recoltai din cinci staiuni viticole din ar.

104

Rodica Pop, 2008 Pentru iniierea culturii in vitro s-au folosit lstari de vi de vie recoltai direct din cmp de la care s-au prelevat apoi segmente nodale. Lstarii de vi de vie au fost fasonai n fragmente cu dimensiuni cuprinse ntre 6-8 cm dup ce n prealabil au fost ndeprtate frunzele. Aceste fragmente nodale au fost sterilizate cu o soluie de hipoclorit de sodiu (NaOCl) 5%, la care s-au adugat cteva picturi de Tween-20. Fragmentele nodale au fost meninute n soluia dezinfectant timp de 20 minute cu agitare periodic. Pentru a evita aciunea remanent a agentului de dezinfectare, segmentele nodale au fost imersate n ap distilat steril, unde au fost meninute timp de cinci minute, dup care au urmat trei splri repetate cu ap distilat steril. Pentru a prentmpina apariia infeciilor, sticlria utilizat, respectiv eprubetele i borcanele pentru inoculare, diverse recipiente au fost sterilizate nainte de introducerea mediului de cultur. Sterilizarea s-a realizat prin autoclavare la 1340C, timp de 15 minute. Toate mediile de cultur utilizate au fost sterilizate prin autoclavare, la 121 0C, timp de 20 de minute. De asemenea, toate operaiile de prelevare, inoculare, pasare sau executat n condiii sterile, n hota cu flux laminar.

2.3.2.6. Organizarea experienelor realizate n condiii de cultur in vitro 2.3.2.6.1. Multiplicarea prin lstrire axilar Pentru studierea capacitii regenerative la vi de vie, au fost utilizate ca surs de explante segmentele nodale provenite de pe lstarii recoltai din cmp. Segmentele nodale au fost sterilizate, apoi fasonate la dimensiunea de 0,5 cm i inoculate pe mediile de cultur. Sterilizarea i prelevarea explantelor s-a fcut n hota cu flux laminar. Inocularea explantelor s-a fcut n eprubete. Mediul pentru iniierea culturii in vitro a fost Murashige Skoog (1962) suplimentat cu concentraii diferite de hormoni, realiznd trei variante de medii de cultur:
105

Rodica Pop, 2008 V1 = Mediul MS 0,5 mg/l BAP, 0,5 mg/l ANA, 100 mg/l hidrolizat de cazein V2 = Mediul MS - 1,0 mg/l BAP, 0,5 mg/l ANA, 100 mg/l hidrolizat de cazein V3 = Mediul MS 2,5 mg/l BAP, 0,5 mg/l ANA, 100 mg/l hidrolizat de cazein Mediul bazal MS a fost suplimentat cu zaharoz 30 g/l i agar 7,5 g/l pentru toate cele trei variante de concentraii hormonale. pH-ul mediului a fost ajustat la 5,8, nainte de adugarea agarului. Mediul a fost repartizat n eprubete care apoi au fost sterilizate prin autoclavare la 1210C timp de 15 minute. Dup inoculare, explantele au fost meninute n camera de cretere la o fotoperioad de 16/8 ore, intensitate luminoas de 2500 luci i la o temperatur de 22-240C. Dup primele trei zile de la inoculare s-au ndeprtat eprubetele cu explante infestate sau necrozate. Evaluarea in vitro a culturii de segmente nodale a fost efectuat la 8 sptmni de la incubare i a constat n determinarea urmtorilor parametri: numrul de lstari formai, lungimea lstarilor, i numrul de noduri/lstar. In continuare plantulele obinute in vitro pe varianta V3 de mediu au fost divizate i repicate periodic (la circa opt sptmni) pe acelai tip de mediu. Inocularea explantelor s-a fcut n borcane. n fiecare borcan au fost inoculate 4-5 explante. 2.3.2.6.2. Cultura de calus Cultura de calus a fost iniiat att din segmente nodale ct i din frunze, de la plantulele obinute in vitro pe mediul de cultur MS (1962), varianta V3. n vederea iniierii culturii de calus, segmentele nodale au fost cultivate pe mediul bazal MS (Murashige Skoog, 1962), suplimentat cu acid naftil acetic (ANA) n dou concentraii: MS1 - cu 10 mg/l ANA i 1,0 mg/l BAP MS2 cu 5,0 mg/l ANA i 1,0 mg/l BAP

Ambele variante de mediu au fost suplimentate cu zaharoz 20 g/l i agargel (Sigma) 7,5 g/l. pH-ul mediului a fost ajustat la 5,8, nainte de adugarea agarului.

106

Rodica Pop, 2008 Frunzele au fost detaate de pe plantulele obinute in vitro. Acestea au fost secionate perpendicular pe axa nervurii principale i plasate n vasele de cultur cu partea inferioar a frunzei n contact cu mediul de cultur. Inocularea explantelor s-a fcut n eprubete. La ase sptmni calusul a fost subcultivat pe mediu proaspt n vase de cultur mai mari, respectiv n borcane autoclavabile. Culturile au fost incubate n aceleai condiii experimentale ca i pentru etapa de iniiere a culturii in vitro. Meninerea calusului n cultur, respectiv multiplicarea acestuia cu meninerea celulelor viabile i totipotente, necesit transferarea i subcultivarea pe medii proaspete. Astfel, periodic, la interval de circa patru sptmni, calusul a fost fragmentat i subcultivat pe medii proaspete. Fragmentarea calusului const n divizarea inoculului i nlturarea prilor necrozate sau senescente. Pentru a testa creterea calusului i meninerea lui n cultura in vitro, a fost iniiat un nou experiment care a constat din pasarea calusului pe trei variante de medii: MS fr regulatori de cretere, dar suplimentat cu 100 mg/l hidrolizat de cazein; MS suplimentat cu 1,0 mg/l ANA, 1,5 mg/l TDZ, 100 mg/l hidrolizat de cazein; MS suplimentat cu 2,5 mg/l BAP, 1,0 mg/l ANA, 100 mg/l hidrolizat de cazein. Mediul cel mai favorabil a fost utilizat n continuare pentru subcultivarea calusului i meninerea lui n cultur in vitro. 2.3.2.6.3. Inducerea i dezvoltarea lstarilor multipli Pentru inducerea formrii lstarilor multipli, calusul morfogenetic obinut din segmentele nodale a fost transferat pe mediul MS suplimentat cu concentraii variate de TDZ - thidiazuron (N-phenyl-N-1,2,3,-thidiazol-5-yl urea) n combinaie cu acidul alfa naftil acetic, n concentraie de 0,5 mg/l. Concentraia de zaharoz a fost de 3%. Cele trei variante de mediu au fost:

107

Rodica Pop, 2008 MS TDZ 0,5 mg/l TDZ, 0,5 mg/l ANA MS TDZ 1,0 mg/l TDZ, 0,5 mg/l ANA MS TDZ 2,0 mg/l TDZ, 0,5 mg/l ANA Din masa de calus obinut pe mediul MS suplimentat cu ANA n concentraie de 10 mg/l s-a prelevat calusul care prezenta caracteristici embriogene. Fragmentele de calus detaate au fost inoculate n borcane coninnd cele trei variante de mediu. n fiecare borcan s-au inoculat cte patru fragmente de mas calusal. Apariia primilor lstari a fost observat dup circa 14 zile. Efectul variantelor de mediu, ilustrat prin media numrului de lstari i media lungimii lstarilor formai, a fost calculat la 45-50 de zile. Experimentul a fost realizat n trei repetiii, msurtorile fiind executate pe cte 30 de explante/repetiie. Pe un fragment de calus s-au regenerat mai muli lstari care au fost separai i fragmentai, urmnd s fie subcultivai pe medii proaspete. Regeneranii obinui n vitro au fost pasai pe mediul MS suplimentat cu TDZ 0,5 mg/l. Pe acest mediu s-a format un numr mare de lstari scuri, cu frunze mici, cu aspect de tuf. Neoplantulele formate au fost pasate periodic, la interval de 8 sptmni, pe mediu proaspt. n general, lstraii neoformai la nivelul calusurilor au un aspect diferit de acela al tulpinielor formate din meristeme, fapt constat i de ali autori (CACHI, 1984). TDZ - thidiazuron (N-phenyl-N-1,2,3,-thidiazol-5-yl urea) este un derivat al difenilureei. TDZ, fenilurea, este considerat ca fiind una dintre cele mai active citochinine pentru inducerea lstarilor n culturile de esuturi (HUETTEMAN i colab., 1993; MURTHY i colab., 1999). Activitatea acestei citochinine a fost raportat n anul 1982, de atunci dovedindu-se foarte eficient n stimularea multiplicrii i proliferrii lstarilor axilari sau pentru formarea mugurilor adventivi. S-a constatat c TDZ induce regenerarea de lstari la diferite explante provenite de la specii recalcitrante, cum ar fi cele medicinale i lemnoase. De asemenea, muli autori sugereaz c TDZ are rezultate mai bune n regenerarea lstarilor dect alte citochinine. Morfogeneza indus de TDZ probabil depinde de nivelul endogen al regulatorilor de cretere i poate avea capacitatea de a modula nivelul endogen de auxin. Combinaia sinergetic a auxinei i citochininei promoveaz regenerarea
108

Rodica Pop, 2008 lstarilor (GREL i colab., 2001; KHAWAR i colab., 2004; YOUMBI i colab., 2006). 2.3.2.6.4. Extracia ADN-ului De la plantulele regenerate din calus s-au detaat frunzulie care apoi au fost supuse extraciei de ADN. Extracia de ADN s-a fcut din frunzele neoplantulelor obinute dup a 5-a, a 10-a i a 15-a pasare pe medii noi de cultur. De la fiecare cultivar s-au analizat cte zece somaclone. Notarea somaclonelor de la fiecare soi este prezentat n tabelul 4. Extracia ADN-ului s-a fcut, n toate cazurile, aplicnd protocolul lui LODHI i colab., 1994 modificat de noi (POP i colab., 2003), protocol care a dat cele mai bune rezultate i n cazul extracie ADN-ului de la plantele in vivo. Protocolul de lucru i materialele necesare au fost prezentate n capitolul anterior (subcapitolul 2.3.1.).

2.3.2.6.5. Cuantificarea, amplificarea ADN-ului i electroforeza n gel de agaroz Ca i n cazul altor metode bazate pe tehnica PCR, metoda RAPD necesit meninerea constant a condiiilor de reacie (profilul de temperatur al termocyclerului, temperatura de fixare a primerilor, concentraia polimerazei, concentraia primerilor, matria de ADN etc.). Uneori, pentru mrirea specificitii i eficienei reaciei n amestecul de reacie se poate aduga DMSO, Tween, BSA sau gelatin. Avnd n vedere aceste considerente probele de ADN obinute din regeneranii in vitro au fost cuantificate spectofotometric cu acelai aparat folosit i pentru probele in vivo, respectiv BioPhotometer Eppendorf. De asemenea, pentru amplificare s-a pstrat acelai volum de reacie, respectiv de 25 l/tub eppendorf i aceeai compoziie ca i n cazul probelor obinute la materialul in vivo. Pentru amplificarea probelor s-a utilizat tot aparatul Eppendorf Mastercycler gradient.
109

Rodica Pop, 2008 Gelurile pentru electroforez a fost de asemenea preparate ca i n cazul precedent n soluie de 0,5 TBE cu concentraia de 1,4%. Vizualizarea produilor de amplificare s-a realizat n lumin UV, imaginea gelurilor fiind achiziionat cu sistemul Biospectrum AC Imaging (UPV Inc.).

2.3.3. Metode statistice de calcul i interpretare a rezultatelor In cazul experienelor efectuate cu material biologic provenit in vivo valorificarea rezultatelor experimentale s-a fcut prin analiza varianei, modelul variabilitii trifactoriale. Aceste modele trifactoriale au fost utilizate pentru rezultatele privind puritatea i cantitatea de ADN. Au fost redate tabelele varianei, cu proba F, iar interpretarea rezultatelor s-a fcut prin testul comparaiilor multiple (Duncan sau Tuckey), doar pentru factorii i combinaiile de factori pentru care F calculat a avut valori semnificative pentru P 5%. Interpretarea gelurilor obinute s-a fcut prin analiza statistic a imaginilor. Mrimea fragmentelor amplificate a fost stabilit cu ajutorul programului Total Lab TL 100, program care a redat i matricea binar. n cazul gelurilor cu regeneranii obinui in vitro, datele primare obinute cu programul Total Lab TL 100 au fost prelucrate cu programul FreeTree (HAMPL i colab., 2001). Matricele binare obinute a servit apoi pentru calcularea distanelor genetice i realizarea dendrogramelor utiliznd programul RAPDistance 1.04 cu aplicarea coeficientului Jaccarrd metodei Neighbor Joining Tree. Pentru experienele de micromultiplicare, valorificarea rezultatelor i a

experimentale s-a fcut prin analiza varianei caracteristic modelelor trifactoriale i bifactoriale. Modelele trifactoriale au fost utilizate n experienele de

micromultiplicare, pentru rezultatele referitoare la numrul de neoplantule obinute, lungimea acestora i numrul de noduri/neoplantul. Modelele bifactoriale au fost utilizate n experienele de calusogenez i regenerare ale calusului, obinut de la cele zece soiuri de vi de vie. n toate cazurile n care au fost implicate experienele trifactoriale i bifactoriale au fost redate tabelele varianelor cu probele F prin care se justific prezentarea
110

Rodica Pop, 2008 rezultatelor finale n tabele bilaterale cuprinznd efectele a doi factori i a interaciunii dintre acetia. Interpretarea rezultatelor s-a fcut prin testul comparaiilor multiple (Duncan sau Tuckey). Semnificaia diferenelor dintre efectele factorilor experimentali este realizat prin notarea cu litere majuscule, iar a interaciunilor dintre factori prin notarea cu litere minuscule.

111

Rodica Pop, 2008

CAPITOLUL III REZULTATE I DISCUII

3.1. REZULTATE PRIVIND EXTRACIA PROBELE DE ADN PROVENITE DIN MATERIALUL BIOLOGIC IN VIVO n cazul viei de vie, izolarea ADN-ului, i ulterior, utilizarea acestuia n vederea obinerii produilor PCR este foarte dificil datorit abundenei polifenolilor, polizaharidelor, a prezenei ARN-ului i a altor produi secundari (ROUT i colab., 2002). Polifenolii i ali compui secundari din plante degradeaz ADN-ul i, de asemenea, inhib activitatea Taq polimerazei. Aceti compui nsoesc ADN-ul cnd are loc liza celulei. Liza celulelor prin mojarare n azot lichid, urmat de incubarea n tamponul de extracie, determin i liza organitelor celulare. La un numr considerabil de specii de plante ADN-ul obinut are o culoare brun datorit oxidrii polifenolilor i a compuilor chinonici. Oxidarea puternic degradeaz ADN-ul i proteinele. In consecin, cantitatea i puritatea ADN-ului la aceste specii este foarte mic. Chiar i n prezena PVP-ului i a altor absorbani polifenolici n tamponul de extracie, n concentraie de 1-4%, fenolii pot s rmn n extractul de ADN, colorndu-l. Includerea n tamponul de extracie a inhibitorilor de fenoloxidaz, cum ar fi acidul dietilenditiocarbamic (DIECA) i a antioxidanilor (acidul ascorbic sau a mercaptoetanolului) reduce brunificarea extractului. Avnd n vedere aceste considerente s-a urmrit obinerea unui ADN de puritate ct mai mare dar i a unei cantiti corespunztoare pentru a putea fi utilizat apoi n reacia de amplificare PCR. Primul protocol de extracie a ADN-ului folosit de noi a fost dup ROGER S.O. i colab., 1988, protocol care utilizeaz CTAB-ul (Cetyl trimethylammonium Bromide). La plante, cantitile mari de metabolii secundari nu pot fi extrase cu fenol sau cloroform i pot ngreuna considerabil purificarea ADN-ului. De aceea, pe lng
112

Rodica Pop, 2008 extracia proteinelor, se procedeaz la precipitarea ADN-ului i separarea sa prin centrifugare. CTAB este folosit, la plante, att pentru liza membranelor celulare ct i pentru formarea de complexe insolubile, reversibile cu ADN. Aceste complexe sedimenteaz la centrifugare. Moleculele de CTAB au capacitatea de a forma complexe insolubile cu ADN-ul la concentraii sczute de sruri (aproximativ 0,5 M NaCl), de a se disocia de ADN i a resolubiliza la concentraii crescute de sruri. Bazndu-se pe aceste proprieti, metoda permite separarea ADN-ului precipitat cu CTAB prin centrifugare i ndeprtarea supernatantului, mpreun cu marea majoritate a contaminanilor. Eficiena metodei este de 100 pn la 500 g ADN izolat/gram de esut proaspt, n fragmente de 50 kb sau mai mult (DORDEA i colab., 2000). La speciile lemnoase izolarea ADN este foarte dificil, datorit coninutului ridicat de polifenoli i polizaharide care contamineaz ADN-ul interfernd cu analizele ulterioare (CHENG i colab., 1997). Un alt aspect important n procesul de izolare a ADN-ului este acela de a elimina polizaharidele, compui care determin izolarea de ADN cu o consisten vscoas. O modalitate de eliminare a polizaharidelor este acela de a mri concentraia de CTAB n tamponul de izolare (WEISING i colab., 1995). Polizaharidele i polifenolii interfereaz n reacia n lan a polimerazei prin inhibarea activitii Taq polimerazei. Polifenolii, n form oxidat, se fixeaz de ADN prin legturi covalente, mpiedicnd analizele ulterioare. O modalitate de a evita problemele create de polifenoli este aceea de a congela esutul, att nainte ct i n timpul mojarrii. (STANGE i colab., 1998, KOONJUL i colab., 1999). Dei protocolul cu CTAB este des utilizat, n cazul viei de vie nu a dat rezultate corespunztoare. Puritatea ADN-ului a fost foarte mic (tabelul 11) iar extractul, la cele mai multe soiuri, a avut o culoare brun. Cel de-al doilea protocol (B) a constat ntr-o mbuntire a metodei de extracie a ADN-ului. In acest sens, n tamponul de extracie s-a mrit cantitatea de PVP, respectiv la 2%, i n plus s-a mai adugat i 2% mercaptoetanol. Acest protocol a mbuntit calitatea ADN-ului, dar numai la unele soiuri (tabelul 11), Feteasc alb, Feteasc regal, Muscat Ottonel, Riesling italian, Traminer roz avnd cele mai sczute puriti i dup parcurgerea acestui protocol. La aceste soiuri puritatea ADN-ului a
113

Rodica Pop, 2008 avut valori cuprinse ntre 1,2 1,5, indiferent de staiunea de la care au provenit. Amplificarea slab a secvenelor de ADN, ne-a determinat s recurgem la un nou protocol de extracie deoarece este cunoscut faptul c puritatea ADN-ului este unul dintre cei mai importani factori n reproductibilitatea metodei RAPD. Numai utilizarea matriei de ADN cu o puritate mare asigur rezultate reproductibile prin metoda RAPD. Dac ADN-ul are o calitate adecvat, amprentele RAPD vor fi identice n repetiii (McCLELAND i WELSH, 1994). Cel de-al treilea protocol de extracie (C) utilizat de noi a fost dup LODHI i colab., 1994, protocol cruia i s-au adus unele modificri (POP i colab., 2003). Modificarea a constat n primul rnd n adugarea unor noi componente n tamponul de extracie. Astfel, tamponul de extracie a fost mbuntit prin adugarea de 10 mM acid ascorbic i 4 mM acid dietilditiocarbamic (DIECA). Aceste substane au fost adugate n tamponul de extracie doar n momentul utilizrii. Protocolul standard prezentat de LODHI i colab. (1994) coninea n tamponul de extracie 2% PVP i 0,2% beta mercaptoetanol. Polivinilpirolidona solubil (PVP 40) adugat n tamponul de izolare, n concentraie de 2%, a avut rol de absorbant al polifenolilor. Acidul dietilditiocarbamic (DIECA) adugat n tamponul de izolare a avut rol de inhibitor al fenoloxidazei. Inhibarea oxidrii polifenolilor s-a realizat prin includerea unei concentraii mari de antioxidant, respectiv acidul ascorbic 4 mM, n tamponul de extracie. Rolul acidului ascorbic ca inhibitor al oxidrii polifenolilor a fost constatat i de ali autori (WEISING i colab., 1995). Adugarea acidului ascorbic i a acidului dietilditiocarbamic s-a dovedit a fi benefic, puritatea ADN-ului mbuntindu-se semnificativ, ajungnd la valori mult mai mari (1,7-1,9) la toate soiurile analizate din toate cele cinci staiuni. Extracia de ADN prin aceast metod a dus la obinerea unei soluii de ADN incolore la toate probele analizate. De asemenea, un efect favorabil asupra puritii ADN-ului l-a avut i utilizarea soluiei de clorur de sodiu 5 M i a alcoolului etilic, care au favorizat mrirea solubilitii polizaharidelor, mpiedicnd totodat precipitarea concomitent a polizaharidelor i a ADN-ului. LODHI i colab., (1994) arat c adugarea de clorur
114

Rodica Pop, 2008 de sodiu n concentraie mare a avut un efect sporit n ndeprtarea polizaharidelor la speciile de Vitis (ROUT i colab., 2002). Cantitatea de ADN obinut prin cele trei variante de extracie a fost corespunztoare (77,5-4518,6 ng/l), avnd n vedere c pentru amplificare s-au utilizat 50 ng. Cea mai mic cantitate de ADN s-a obinut la soiul Cetuia provenit de la Valea Clugreasc, atunci cnd pentru extracie s-a aplicat protocolul A (77 ng/l). Cea mai mare cantitate de ADN respectiv de 4518,6 ng/l, s-a obinut tot la soiul Cetuia, provenit de aceast dat de la Blaj, prin utilizarea protocolului C. Datele privind cantitile de ADN obinute sunt prezentate n tabelul 7. Tabelul 7 Cantitatea de ADN obinut prin cele trei metode de extracie DNA concentration determined in three extraction metods
Soiul Cultivar Localitatea Provenance Blaj Reca Odobeti Iai Valea Clugreasc Blaj Reca Odobeti Iai Valea Clugreasc Blaj Reca Odobeti Iai Valea Clugreasc Blaj Reca Odobeti Iai Valea Clugreasc Blaj Reca Cantitatea de ADN ng/l DNA concentration ng/l Protocol A Protocol B Protocol C 449,50 202,00 2111,30 387,50 92,30 1328,50 1100,50 257,20 1487,40 403,00 557,00 1088,90 1395,00 108,00 1377,30 1054,00 218,30 3447,20 575,80 95,00 701,20 440,00 286,20 2112,10 434,00 563,20 2289,20 1550,00 287,00 670,30 604,50 189,90 2101,90 682,00 246,60 1289,50 759,50 175,30 958,30 217,00 599,20 768,00 1302,00 349,00 1068,60 992,00 256,20 3549,90 449,50 287,00 2254,00 759,50 185,20 1113,70 496,00 634,00 1068,30 449,50 371,20 1208,00 372,00 420,10 2958,60 542,50 139,00 3756,90

Feteasc alb

Feteasc regal

Muscat Ottonel

Riesling italian

Traminer roz

Odobeti Iai Valea Clugreasc

115

186,00 232,50 372,00

538,20 93,30 290,00

3028,50 1285,90 2064,10

Rodica Pop, 2008 Tabelul 7 continuare Cantitatea de ADN obinut prin cele trei metode de extracie DNA concentration determined in three extraction metods
Cantitatea de ADN ng/l DNA concentration ng/l Protocol A Protocol B Protocol C 780,60 802,20 833,90 790,50 820,20 1025,20 765,50 810,50 856,70 775,00 815,60 4276,80 1317,50 868,60 1226,50 475,60 726,30 4518,60 468,50 595,60 733,50 449,50 625,80 728,60 139,50 736,50 1349,00 77,50 379,40 723,80 146,60 325,70 1022,50 150,70 360,60 3750,50 139,50 325,90 1040,40 248,00 425,60 4482,00 279,50 385,70 2340,10 1612,20 1825,30 3746,70 225,80 457,50 1886,80 232,50 458,70 1894,70 217,00 745,90 3485,90 212,00 455,70 2026,50 850,50 835,90 1650,90 1038,50 1234,20 1353,60 403,00 645,70 2767,70 93,00 847,30 3339,50 775,00 863,20 1643,60

Soiul Cultivar

Localitatea Provenance

Blaj Reca Cabernet Sauvignon Odobeti Iai Valea Clugreasc Blaj Reca Cetuia Odobeti Iai Valea Clugreasc Blaj Reca Napoca Odobeti Iai Valea Clugreasc Blaj Reca Timpuriu de Cluj Odobeti Iai Valea Clugreasc Blaj Reca Merlot Odobeti Iai Valea Clugreasc

Rezultatele, prelucrate prin analiza varianei (tabelul 8), au fost interpretate cu ajutorul testului comparaiilor multiple (testul Duncan) i sunt prezentate n tabelele 9 i 10, doar pentru interaciunile soi x metod de extracie i localitate de provenien x metod de extracie. Din datele tabelului 8 se observ c toi cei trei factori experimentali (soiul, metoda de extracie i localitatea de provenien), au influenat distinct semnificativ cantitatea de ADN extras.

116

Rodica Pop, 2008 Tabelul 8 Analiza varianei pentru experiena trifactorial de tipul 10 x 3 x 5 (soi x metod de extracie x localitate de provenien) (Influena soiului, a metodei de extracie i a localitii asupra cantitii de ADN obinut la via de vie) Three way ANOVA experiment 10 x 3 x 5 (influence of cultivars x extraction methods x provenance upon quantity of DNA extracted)
Cauza variabilitii Cause of variability Total Parcele mari Repetiii Factorul A (soiul de vi de vie) Eroare (a) Parcele mijlocii Factorul B (metoda de extracie) Interaciunea A x B Eroare (b) Parcele mici Factorul C (localitatea de provenien) Interaciunea A x C Interaciunea B x C Interaciunea A x B x C Eroare (c) SP SS 429205404,32 13054135,48 106624,98 12546370,29 401140,199 238711388,47 201849801,59 36521235,78 340351,10 177439880,37 12721038,74 54962768,60 21469055,66 87481979,72 805037,63 GL DF 449 29 2 9 18 60 2 18 40 360 4 36 8 72 240 s2 Proba F F test

1394041,14 62,55**>1,92; 2,50 22285,56 100924900,8 11861,27**>3,04; 4,71 2028957,5 8508,75 238,45**>1,62; 2,09

3180259,68 1526743,57 2683631,96 1215027,50 3354,32

948,11**>2,41; 3,41 455,16**>1,45; 1,69 800,05**>1,98; 2,60 362,23**>1,35; 1,53

ntruct n aceast faz interesul nostru s-a ndreptat n principal spre gsirea celui mai eficient protocol de extracie a ADN-ului, din punctul de vedere al cantitii de ADN obinute, datele experimentale au fost interpretate prin testul Duncan doar pentru interaciune soi x metod de extracie i localitate de provenien x metod de extracie. n tabelul 9 se prezint influena soiului i a metodei de extracie asupra cantitii de ADN obinut. Se observ c ntre soiuri exist diferene asigurate statistic privind cantitatea de ADN obinut, indiferent de metoda de extracie, ceea ce sugereaz c genotipul, la via de vie, influeneaz n mod hotrtor cantitatea de ADN ce poate fi extras prin metode curent folosite n acest scop. In ceea ce privete metoda

117

Rodica Pop, 2008 de extracie (tabelul 9) i aceasta a avut o influen semnificativ asupra cantitii de ADN obinut. Tabelul 9 Influena soiului (A), a metodei de extracie (B) i a interaciunii (A x B) asupra cantitii de ADN obinut Effect of cultivar (A), method for DNA extraction (B) and interaction (A x B) upon quantity of DNA obtained
Soiul Cultivar Feteasc alb Feteasc regal Muscat Ottonel Riesling italian Traminer roz Cabernet Sauvignon Napoca Cetuia Timpuriu de Cluj Merlot Media metodei de extracie Mean of extraction method Metoda de extracie Method for DNA extraction Protocol A 747,10 jk 810,76 i 713,00 k 629,30 l 341,00 no 885,83 h 192,83 r 322,12 nop 499,90 m 632,00 l 577,38 N* Protocol B 243,30 q 289,94 p 312,00 op 346,72 n 296,12 op 823,43 i 364,71 n 612,72 l 788,62 ij 885,26 h 496,28 P Protocol C 1478,68 f 1844,00 d 1237,26 g 1838,78 d 2618,80 a 1643,84 e 2527,10 b 1610,70 e 2608,12 a 2151,06 c 1955,83 M Media soi Mean of cultivar 823,03 G 981,57 EF 754,09 H 938,27 F 1085,31 CD 1117,70 C 1028,21 DE 848,51 G 1298,88 A 1222,77 B

DS 5% pentru doua medii soi (SD 5% for two means of variety) = 66,08 - 75,87 DS 5% pentru doua medii metoda de extracie (SD 5% for two means of culture medium) = 21,54 26,13 DS 5% pentru doua medii soi x metoda de extracie (SD 5% for two means of interaction) = 37,8145,87 * Diferenele dintre oricare dou variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative * The differences between any two values followed by at least a commom letter are not significant

Cea mai mare cantitate de ADN a fost realizat la extracia cu ajutorul protocolului C, iar cea mai redus cantitate a rezultat prin extracia cu protocolul B. Interaciunea soi x metod de extracie a nregistrat, la rndul ei, diferene semnificative ntre valorile prezentate n interiorul tabelului 9, dar acest lucru interesa mai puin, ntruct, indiferent de soi, ADN-ul trebuia extras n cantiti ct mai mari
118

Rodica Pop, 2008 posibile din proba respectiv. Aceeai concluzie se desprinde i din analiza datelor privind interaciunea localitate x metoda de extracie (tabelul 10). i n acest caz, ntre localiti sunt diferene semnificative din punctul de vedere al cantitii de ADN extrase de la cele zece soiuri. De asemenea, diferenele ntre media cantitii de ADN obinut prin cele trei metode de extracie se menin semnificative, ordinea metodelor rmnnd aceeai: cea mai mare cantitate de ADN s-a obinut prin protocolul C i cea mai mic cantitate prin protocolul B. Tabelul 10 Influena localitii (B), a metodei de extracie (C) i a interaciunii (B x C) asupra cantitii de ADN extrase Effect of provenance (B), method for DNA extraction (C) and interaction (A x B) upon quantitative of DNA obtained
Localitatea Provenance Blaj Reca Odobeti Iai Valea Clugreasc Media metodei de extracie Mean of extraction method Protocol de extracie Protocol extraction B 580,19 h 432,80 j 430,87 j 601,76 h 435,78 j 496,28 P Media localitii Mean of provenance 1302,70 A 923,97 C 851,08 E 1090,20 B 881,22 D

733,74 g 531,13 i 523,55 i 325,50 k 773,00 f 577,38 N*

2594,15 a 1807,97 c 1598,82 d 2343,35 b 1434,88 e 1955,83 M

DS 5 % pentru dou medii localitate (SD 5% for two means of provenance) = 16,90-22,81 DS 5% pentru dou medii metoda de extracie (SD 5% for two means of method) = 21,54-26,13 DS 5% pentru dou medii localitate x metoda de extracie (SD 5% for two means of interaction) = 27,34-36,91 * Diferenele dintre oricare dou variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative * The differences between any two values followed by at least a commom letter are not significant

Deoarece n analizele de polimorfism la nivel molecular intereseaz, pentru amplificarea PCR, nu doar cantitatea ci i puritatea ADN-ului obinut, n tabelele 11, 12, 13 i 14 sunt prezentate datele referitoare la acest caracter. Puritatea ADN-ului obinut n experienele noastre se prezint sub form de
119

Rodica Pop, 2008 date brute n tabelul 11. Interpretarea statistic a datelor s-a fcut ca i n cazul cantitii de ADN obinute, respectiv prin testul comparaiilor multiple (Duncan sau Turckey). Tabelul 11 Puritatea ADN-ului obinut prin cele trei metode de extracie DNA purity obtained with three methods for DNA extraction
Soiul Cultivar Staiunea Provenance Blaj Reca Odobeti Iai Valea Clugreasc Blaj Reca Odobeti Iai Valea Clugreasc Blaj Reca Odobeti Iai Valea Clugreasc Blaj Reca Odobeti Iai Valea Clugreasc Blaj Reca Odobeti Iai Valea Clugreasc Blaj Puritate ADN (A260/A280) Ratio absorbance (A260/A280) Protocol A Protocol B Protocol C 1,6 1,6 1,9 1,4 1,4 1,9 1,2 1,4 1,9 1,6 1,3 1,7 1,5 1,2 1,9 1,5 1,5 1,9 1,4 1,4 2,0 1,2 1,3 2,0 1,6 1,3 1,9 1,2 1,2 2,0 1,5 1,4 1,8 1,2 1,1 1,9 1,2 1,4 1,7 1,5 1,3 1,9 1,2 1,2 2,0 1,7 1,5 1,9 1,6 1,3 1,9 1,2 1,4 1,6 1,7 1,3 2,0 1,3 1,4 1,7 1,5 1,7 1,9 1,2 1,3 2,0 1,3 1,2 2,0 1,5 1,4 1,9 1,6 1,3 1,9 1,5 1,5 1,9

Feteasc alb

Feteasc regal

Muscat Ottonel

Riesling italian

Traminer roz

Reca
Cabernet Sauvignon Odobeti Iai Valea Clugreasc Blaj Reca Cetuia Odobeti Iai Valea Clugreasc 120

1,5
1,5 1,7 1,2 1,3 1,3 1,3 1,5 1,2

1,6
1,5 1,7 1,5 1,6 1,6 1,5 1,6 1,6

2,0
1,9 1,9 1,9 1,9 1,6 1,6 1,7 1,9

Rodica Pop, 2008 Tabelul 11 continuare Puritatea ADN-ului obinut prin cele trei metode de extracie DNA purity obtained with three methods for DNA extraction
Puritate ADN (A260/A280) Ratio absorbance (A260/A280) Protocol A Protocol B Protocol C 1,4 1,5 1,8 1,3 1,5 1,8 1,3 1,5 1,9 1,7 1,7 1,9 1,4 1,6 1,8 1,7 1,7 1,9 1,3 1,5 1,9 1,4 1,5 1,9 1,5 1,6 1,9 1,3 1,6 1,9 1,5 1,6 1,9 1,6 1,6 1,9 1,6 1,7 1,9 1,5 1,6 2,0 1,2 1,6 1,9

Soiul Cultivar

Staiunea Provenance Blaj Reca Odobeti Iai Valea Clugreasc Blaj Reca Odobeti Iai Valea Clugreasc Blaj Reca Odobeti Iai Valea Clugreasc

Napoca

Timpuriu de Cluj

Merlot

In tabelul 12 se prezint analiza varianei pentru experiena trifactorial, rezultatele fiind interpretate cu ajutorul testului comparaiilor multiple. Analiznd datele acestui tabel se observ c cei trei factori experimentali au influenat distinct semnificativ puritatea ADN-ului. Aceast semnificaie se pstreaz i n cazul interaciunilor duble soi x metod de extracie, localitate x metod de extracie, localitate x soi, ca i pentru interaciunea tripl soi x metod de extracie x localitate. Testul Duncan s-a folosit i n acest caz pentru interaciunile soi x metod de extracie i localitate x metod de extracie. In tabelul 13 se prezint influena soiului i a metodei de extracie asupra puritii ADN-ului. Se poate observa c ntre soiuri exist diferene asigurate statistic, indiferent de metoda de extracie folosit, genotipul avnd influene evidente asupra puritii ADN-ului. Metoda de extracie a avut, de asemenea, o influen semnificativ asupra puritii ADN-ului, protocolul C dnd cele mai bune rezultate, pe ultimul loc situndu-se, de aceast dat, protocolul A.
121

Rodica Pop, 2008 Interaciunea soi x metod de extracie a nregistrat diferene semnificative ntre valorile prezentate n interiorul tabelului Tabelul 12 Analiza varianei pentru experiena trifactorial de tipul 10 x 3 x 5 (soi x metod de extracie x localitatea de provenien) (Influena soiului, metodei de extracie i a localitii asupra puritii ADN-ului obinut) Three way ANOVA experiment 10 x 3 x 5 (influence of cultivars x methods for DNA extraction x provenance upon DNA purity)
Cauza variabilitii Cause of variability Total Parcele mari Repetiii Factorul A (soiul de vi de vie) Eroare (a) Parcele mijlocii Factorul B (metoda de extracie) Interaciunea A x B Eroare (b) Parcele mici Factorul C (localitatea de provenien) Interaciunea A x C Interaciunea B x C Interaciunea A x B x C Eroare (c) SP SS 32,57 1,49 0,02 1,35 0,136 23,18 20,76 1,88 0,538 7,90 1,45 1,62 1,02 2,30 1,507 GL DF 449 29 2 9 18 60 2 18 40 360 4 36 8 72 240 s2 Proba F F test

0,15 0,008 10,38 0,10 0,0134 0,36 0,05 0,13 0,03 0,0063

19,77**>1,92; 2,50

772,07**>3,04; 4,71 7,78**>1,62; 2,09

57,70**>2,41; 3,41 7,18**>1,45; 1,69 20,34**>1,98; 2,60 5,08**>1,35; 1,53

Din analiza datelor privind interaciunea localitate x metod de extracie (tabelul 14), se observ c apar diferene semnificative att ntre localiti, ct i n ceea ce privete metoda de extracie, privind caracterul analizat. Se poate observa c, n acest caz, spre deosebire de analiza caracterului cantitate, ntre localiti, datele sunt mai puin difereniate ntre ele, dou localiti (Iai i Blaj) avnd valori foarte apropiate, respectiv 1,69 i 1,68. Diferenele ntre media puritii ADN-ului obinut prin cele trei protocoale se menin semnificative, cel mai eficient protocolul fiind C, protocolul A situndu-se pe ultimul loc.

122

Rodica Pop, 2008 Tabelul 13 Influena soiului (A), a metodei de extracie (B) i a interaciunii (A x B) asupra puritii ADN-ului obinut Effect of cultivars (A), methods for DNA extraction (B) and interaction (A x B) upon DNA purity
Soiul Cultivar Feteasc alb Feteasc regal Muscat Ottonel Riesling italian Traminer roz Cabernet Sauvignon Napoca Cetuia Timpuriu de Cluj Merlot Media metodei de extracie Mean of extraction method Metoda de extracie Method for DNA extraction Protocol A Protocol B Protocol C 1,46 k 1,38 m 1,92 c 1,42 l 1,38 m 1,97 ab 1,34 n 1,34 n 1,89 d 1,53 h 1,36 mn 1,87 d 1,43 l 1,38 m 1,98 a 1,50 i 1,61g 1,96 ab 1,47jk 1,60 g 1,87 d 1,35 n 1,59 g 1,81e 1,46 k 1,49 ij 1,44 P* 1,60 g 1,65 f 1,49 N 1,94 bc 1,98 a 1,92 M Media soi Mean of cultivar 1,59 D 1,59 D 1,52 E 1,58 D 1,59 D 1,69 AB 1,65 C 1,58 D 1,67 BC 1,71 A

DS 5% pentru dou medii soi (SD 5% for two means of variety) = 0,03 DS 5% pentru dou medii metoda de extracie (SD 5% for two means of method) = 0,03 DS 5% pentru dou medii soi x metoda de extracie (SD 5% for two means of interaction) = 0,03 * Diferenele dintre oricare dou variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative * The differences between any two values followed by at least a commom letter are not significant

Deoarece n aceast experien metodologic obiectivul principal urmrit a fost acela al identificrii celui mai adecvat protocol de extracie ADN, att din punctul de vedere al cantitii ct i din cel al puritii extractului, s-a procedat la calcularea ecuaiei de regresie i a coeficientului de corelaie dintre cantitatea de ADN i puritatea acestuia. In figura 11 este prezentat linia i ecuaia de regresie, precum i coeficientul de corelaie dintre cantitatea de ADN i puritatea acestuia, determinate din datele interaciunii soi x metod de extracie. Din datele prezentate n aceast figur se observ c relaia dinte cantitate i puritate este liniar, datele individuale grupndu-se destul de strns n jurul liniei de regresie.

123

Rodica Pop, 2008 Tabelul 14 Influena localitii de provenien (C), a metodei de extracie (B) i a interaciunii (B x C) asupra puritii ADN-ului obinut Effect of provenance (C), methods for DNA extraction (B) and interaction (B x C) upon DNA purity
Localitatea Provenance Blaj Reca Odobeti Iai Valea Clugreasc Media metodei de extracie Mean of extraction method Protocol de extracie ADN Protocol for DNA extraction A B C 1,55 f 1,41j 1,33 k 1,61 d 1,33 k 1,44 P* 1,58 e 1,45 i 1,46 h 1,50 g 1,44 i 1,49 N 1,94 a 1,93 ab 1,89 c 1,92 ab 1,91 bc 1,92 M Media localitii Mean of provenance 1,69 A 1,60 B 1,56 C 1,68 A 1,56 C

DS 5% pentru dou medii localitate (SD 5% for two means of provenance) = 0,03 0,04 DS 5% pentru dou medii metoda de extracie (SD 5% for two means of methods) = 0,03 DS 5% pentru dou medii localitate x metod (SD 5% for two means of interaction) = 0,03 - 0,04 * Diferenele dintre oricare dou variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative * The differences between any two values followed by at least a commom letter are not significant

Corelaia dintre cele dou variabile este direct i pozitiv, creterea cantitii de ADN ducnd la o cretere a puritii acestuia. Valoarea r = 0,89** indic o semnificaie a dependenei puritii ADN de cantitatea extras. In figura 12 este prezentat linia i ecuaia de regresie a puritii ADN fa de cantitatea de ADN extras, calculate pe baza datelor medii ale interaciunii localitate x metod de extracie. Se observ c i de aceast dat avem de a face cu o regresie liniar simpl exprimat prin ecuaia de gradul nti y = 1,3 + 0,0003x, datele individuale grupnduse relativ strns n jurul liniei de regresie. Coeficientul de corelaie r = 0,86** indic, i de aceast dat, o legtur direct ntre cele dou variabile, sugernd c i pe media localitilor creterea cantitii de ADN duce n mod automat la sporirea semnificativ a puritii acestuia.
124

Rodica Pop, 2008

2,5
y = 0,0003x + 1,3 r = 0,89**

2
Puritatea ADN (A260/A280)

1,5

0,5

0
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000

Cantitatea de ADN (ng/ul)

Fig. 11. Linia i ecuaia de regresie a puritii ADN n funcie de cantitatea acestuia, determinat din datele interaciunii soi x metod de extracie Regression line and equation for DNA quantity and purity in genotype x extraction method interaction
2,5
Puritatea ADN (A260/A280)

2 1,5 1 0,5 0
0 20 0 4 00 6 00 8 00 1 000 1 200 140 0 160 0 18 00 20 00 22 00 24 00 26 00

y = 0,0003x + 1,3 r = 0,86**

2 800

3 000

Cantitatea de ADN (ng/ul)

Fig. 12. Linia i ecuaia de regresie a puritii ADN n funcie de cantitatea acestuia, determinat din datele interaciunii localitate de provenien x metoda de extracie Regression line and equation for DNA quantity and purtiy in provenance x extraction method interaction
125

Rodica Pop, 2008 Ca o concluzie a celor discutate pe baza rezultatelor de mai sus, recomandm aplicarea protocolului C de extracie a ADN-ului, protocol prin care i pe media soiurilor i pe media localitilor s-au obinut cantitile cele mai mari de ADN i nivelul cel mai nalt de puritate ale acestuia. Poate nu este lipsit de semnificaie faptul Ca o concluzie a celor discutate pe baza rezultatelor de mai sus, recomandm aplicarea protocolului C de extracie a ADN-ului, protocol prin care i pe media soiurilor i pe media localitilor s-au obinut cantitile cele mai mari de ADN i nivelul cel mai nalt de puritate ale acestuia. Poate nu este lipsit de semnificaie faptul c, pe baza unor rezultate anterioare obinute la alte specii (porumb, mur, mr, zorele, salat), date confirmate i de cele expuse anterior, colectivul de la disciplina de genetic i biotehnologii ale USAMV Cluj-Napoca folosete aproape n exclusivitate protocolul C de extracie a ADN-ului, cu modificrile aduse de POP i colab., 2003.

3.1.1. Rezultate privind amplificarea i electroforeza produilor de reacie n literatura de specialitate, de dat mai recent (KOONJUL i colab., 1999; IANDOLINO i colab., 2004), se arat c o mai bun amplificare a fragmentelor de ADN, mai ales pentru metoda RAPD, este dat de includerea n amestecul de reacie a PVP-ului. Se apreciaz c polifenolii rmai n soluia de ADN matri pot inhiba amplificarea ADN-ului, dar prin adugarea PVP-ului, acetia pot fi absorbii. Concentraia de PVP adugat de noi n amestecul de reacie a fost de 2%. Influena PVP-ului asupra intensitii benzilor din gel este important avnd n vedere faptul c rezultatele finale ale studiului RAPD depind de marcarea corect a benzilor. In literatura de specialitate (LODHI i colab., 1997; HERRERA i colab., 2002; NAZHAD i colab., 2005; SOLOKI i colab., 2005) se arat c puritatea ADN are un efect major asupra amplificrii i rezoluiei benzilor n gelul de agaroz. Contaminarea ADN-ului cu polizaharide, polifenoli sau ali contaminani duc la apariia unor benzi difuze sau de o intensitate slab i foarte dificil de interpretat. Cu toate c se recomand marcarea benzilor cu o intensitate luminoas puternic, exist cazuri n care lipsa marcrii benzilor difuze influeneaz considerabil rezultatele finale (GABOREANU, 2002).
126

Rodica Pop, 2008 n amestecul de reacie s-au folosit diluii de ADN care au fost rennoite la dou luni, deoarece prin meninerea acestora la o temperatur de 4 0C ADN-ul se degradeaz i se constat o slab amplificare a probelor prin metoda RAPD. Amplificarea probelor s-a fcut n trei repetiii pentru fiecare primer. De asemenea, acelai primer a fost folosit pentru amplificarea tuturor probelor din fiecare staiune n parte, obinndu-se de fiecare dat acelai profil electroforetic. Ordinea probelor din gelurile de agaroz a fost ntotdeauna aceeai, notaiile din imagini fiind urmtoarele: Fa (Feteasc alb), Fr (Feteasc regal), MO (Muscat Ottonel), Ri (Riesling italian), Tr (Traminer roz), Ce (Cetuia), Ca (Cabernet Sauvignon), Me (Merlot), Na (Napoca), TCj (Timpuriu de Cluj). Pentru a evidenia posibilele diferene existente ntre acelai soi dar care a provenit din staiuni diferite, probele au fost amplificate concomitent i ulterior migrate alturat n acelai gel de agaroz (fig. 13).

Fig. 13. Produii de amplificare obinui cu primerul UBC 584, la soiuri de vi de vie din staiunile viticole Blaj i Reca Amplification products obtained with primer UBC in cultivars of Vitis vinifera from Blaj and Recas

127

Rodica Pop, 2008 Din analiza gelurilor se observ c nu exist diferene ntre provenienele aceluiai soi. Acest lucru se poate explica prin faptul c via de vie se nmulete cel mai adesea vegetativ, prin altoire, soiurile fiind nmulite n staiuni sau centre de cercetare unde este controlat riguros proveniena acestora. Repetarea amplificrilor, n cazul metodei RAPD, cel puin de dou ori, este de o importan fundamental datorit sensibilitii evidente a metodei. Din totalul de 39 de primeri utilizai iniial, s-au obinut polimorfisme cu un numr de 22 primeri, primeri care au fost utilizai i pentru amplificarea somaclonelor obinute n experienele in vitro (tabelul 6). Separarea fragmentelor de ADN s-a realizat n geluri de agaroz cu o concentraie de 1,4% i la tensiuni ale curentului de 0,57 V, respectiv 0,56 mA, iar durata de migrare a fost de 2,30 ore. Pentru o mai uoar ncrcare a gelului, probele de ADN au fost preparate n tampoane de ncrcare colorate cu albastru de bromfenol. Tampoanele de ncrcare sunt mai dense dect tamponul de migrare, ceea ce creeaz un avantaj deosebit n timpul ncrcrii probelor n godeuri. Datorit densitii mai mari, probele de ADN colorate nlocuiesc treptat volumul de tampon din godeu care este mai uor. Soluia tampon de electroforez utilizat de noi a fost Tris-borat 0,5x (TBE). Colorarea probelor de ADN ne-a facilitat i urmrirea vizual a procesului de migrare, avnd n vedere c gelurile au fost imersate n soluia de bromur de etidiu numai dup migrare. Colorantul folosit, ca de altfel toi coloranii migreaz electroforetic spre anod. Prin urmrirea fronturilor colorate s-a putut estima stadiul migrrii. Pentru o corect apreciere a mrimii fragmentelor din diferite benzi ale gelului i markerul ADN utilizat a fost preparat n acelai tampon de ncrcare. Fragmentele rezultate prin amplificarea cu primerii polimorfici au avut lungimea cuprins ntre 200 i 2000 pb, majoritatea avnd ntre 300 i 1200 pb (fig. 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21).

128

Rodica Pop, 2008

Fig. 14. Produii de amplificare obinui cu primerul OPAL 20, la cele zece soiuri de vi de vie Amplification products obtained with primer OPAL 20 in ten cultivars of Vitis vinifera tested

Fig. 15. Produii de amplificare obinui cu primerul OPX 03, la cele zece soiuri de vi de vie Amplification products obtained with primer OPX 03 in ten cultivars of Vitis vinifera tested
129

Rodica Pop, 2008

Fig. 16. Produii de amplificare obinui cu primerul 70.08 la cele zece soiuri de vi de vie analizate Amplification products obtained with primer 70.08 in ten cultivars of Vitis vinifera tested

Fig. 17. Produii de amplificare obinui cu primerul PB 5 la cele zece soiuri de vi de vie analizate Amplification products obtained with primer PB 5 in ten cultivars of Vitis vinifera tested
130

Rodica Pop, 2008

Fig. 18. Produii de amplificare obinui cu primerul OPA 04 la cele zece soiuri de vi de vie analizate Amplification products obtained with primer OPA 04 in the ten cultivars of Vitis vinifera tested

Fig. 19. Produii de amplificare obinui cu primerul PB 3 la cele zece soiuri de vi de vie analizate Amplification products obtained with primer PB 3 in the ten cultivars of Vitis vinifera tested
131

Rodica Pop, 2008

Fig. 20. Produii de amplificare obinui cu primerul PB 6 la cele zece soiuri de vi de vie analizate Amplification products obtained with primer PB 6 in ten cultivars of Vitis vinifera tested

Fig. 21. Produii de amplificare obinui cu primerul PB 1 la cele zece soiuri de vi de vie analizate Amplification products obtained with primer PB 1in the ten cultivars of Vitis vinifera tested
132

Rodica Pop, 2008 3.1.2. Rezultate privind analiza imaginilor i interpretarea datelor Notarea benzilor s-a realizat direct pe fotografiile gelurilor, prin raportarea la markerul ADN. Benzile polimorfice au fost notate cu 1, iar cele monomorfice cu 0. Prezena benzilor (notate cu 1) i absena benzilor (notate cu 0) au fost nscrise ntr-un tabel sub form de matrice binar. Numrul total de benzi generate a fost de 192, dintre care 165 de benzi au fost polimorfice (tabelul 15), benzile monomorfice fiind excluse din interpretarea statistic a datelor. Tabelul 15 Date obinute din analiza imaginilor RAPD RAPD primers used to analyze genetic variation in Vitis vinifera cultivars
Nr. de benzi Nr. de benzi polimorfice monomorfice % polimorfism No. of polymorphic No. of monomorphic Percent polymorphism bands bands 10 0 100,0 4 1 80,0 5 1 83,3 6 2 75,0 10 1 90,9 13 1 92,8 12 2 85,7 10 0 100,0 13 1 92,8 15 3 83,3 7 1 87,5 2 2 50,0 6 0 100,0 9 0 100,0 5 2 71,4 4 2 66,6 7 1 87,5 7 2 77,7 2 2 50,0 5 1 83,3 9 1 90,0 4 1 80,0 165 27

Primer Primer UBC 228 UBC 245 UBC 563 UBC 584 UBC 599 PB 1 PB 3 PB 4 PB 5 PB 6 OPAB 11 OPAB 18 OPE 14 AB 11 OPA 04 OPA 03 OPAL 20 OPX O3 OPA 01 70.08 70.03 MIC 07 Total benzi

Nr. total de benzi No. of bands 10 5 6 8 11 14 14 10 14 18 8 4 6 9 7 6 8 9 4 6 10 5 192

133

Rodica Pop, 2008

Numrul total de benzi generate ne-au permis o bun interpretare a rezultatelor, fapt confirmat i de literatura de specialitate, n care se menioneaz c un numr mai mare de benzi polimorfice determin o mai bun interpretare a modului de grupare a datelor experimentale n dendrograme, prin utilizarea aceleai metode de analiz (HANSEN i colab., 1998; CALDERINI i colab., 1999). Din datele prezentate n tabelul 15 rezult c toi primeri utilizai au generat un numr de minim dou benzi polimorfice. Procentul de polimorfism a avut valori cuprinse ntre 100% (n cazul primerul UBC 228) i 50% (pentru primerii OPAB 18 i OPA 01), valori care conform metodei de analiz a datelor pot fi considerate asigurate statistic (CALDERINI i colab., 1999). Analiza gelurilor din experienele organizate de noi relev faptul c numrul cel mai mare de benzi polimorfice au fost obinute cu primerul PB 6, respectiv 15 benzi (fig. 20), urmat de primerul PB 5 (13 benzi polimorfice) (fig. 17). Numrul cel mai mic de benzi au fost generate de primerul OPA 01 3 benzi. Datele primare, obinute cu ajutorul programul Total Lab 100 au fost prelucrate cu programul RAPDistance 1.04, care a calculat distanele genetice pe baza coeficientului Jaccard. Distanele genetice calculate sunt prezentate n tabelul 16. Cu ct valorile distanelor genetice din tabel sunt mai mici, cu att speciile sunt mai strns nrudite.

134

Rodica Pop, 2008 Tabelul 16 Distanele genetice calculate pentru cele zece soiuri de vi de vie Genetic distances established for ten cultivars of Vitis vinifera
Fa 0,0000 0,4421 0,6783 0,5158 0,6364 0,7217 0,6900 0,7113 0,7059 0,7158 Fr 0,0000 0,6667 0,5248 0,6250 0,7184 0,6887 0,7087 0,7037 0,6458 M R Tr Ce Ca Me Na TCj

Fa Fr MO Ri Tr Ce Ca Me Na TCj

0,0000 0,6216 0,6132 0,7048 0,6881 0,7431 0,6909 0,6990

0,0000 0,6263 0,7113 0,6531 0,7525 0,6566 0,6484

0,0000 0,6629 0,6000 0,5882 0,6771 0,6395

0,0000 0,7222 0,7326 0,7111 0,6053

0,0000 0,6024 0,6774 0,7303

0,0000 0,7283 0,6951

0,0000 0,7609

0,0000

Datele din interiorul tabelului arat c cea mai mic valoare a distanei genetice (0,4421) s-a nregistrat ntre soiurile Feteasc alb i Feteasc regal, ceea ce denot o strns nrudire ntre ele, fapt confirmat i n dendrograma din figura 22. Din puntul de vedere al distanei genetice considerm c cele mai ndeprtate soiuri analizate sunt Napoca i Timpuriu de Cluj, valoarea distanei genetice fiind de 0,7609. Acest fapt poate fi datorat originii hibride a acestor soiuri, pentru hibridri fiind folosite forme parentale diferite.

3.1.3. Analiza dendrogramei

Apropierea genetic ntre cele zece soiuri de vi de vie analizate, stabilit pe baza matricei distanelor genetice i a algoritmului Neighbor Joining Tree sunt prezentate n figura 22 sub forma unei dendrograme. Distanele genetice calculate pe baza matricei distanelor i a algoritmului Neighbor Joining Tree au fost prezentate n tabelul 16, iar indicii de similaritate sunt notai direct n figura dendrogramei obinute. In cadrul dendrogramei se evideniaz dou grupuri principale, A i B. Primul grup cuprinde soiurile Feteasc alb, Feteasc regal, Riesling italian, Cetuia,

135

Rodica Pop, 2008 Timpuriu de Cluj i Muscat Ottonel, iar cel de al doilea grup soiurile Merlot, Cabernet Sauvignon, Traminer roz i Napoca. Grupul A este constituit, la rndul lui, din alte dou subgrupuri, notate cu A1 i A2. Subgrupul A1 cuprinde soiurile Feteasc alb, Feteasc regal, Riesling italian, Cetuia i Timpuriu de Cluj. Soiurile Feteasc alb i Feteasc regal sunt n aceeai ramur, distana genetic dintre ele fiind de 0,4421. Din punct de vedere ampelografic cele dou soiuri sunt considerate apropiate datorit particularitilor lor morfologice. De asemenea, n literatura de specialitate se arat c soiul Feteasc regal ar fi un hibrid natural ntre Feteasc alb i Gras de Cotnari, ceea ce denot apropierea genetic dintre cele dou soiuri. Apropierea genetic dintre cele dou soiuri rezultat prin analiza RAPD, confirm deci rezultatele anterioare conform crora soiurile respective au o origine comun.

136

Rodica Pop, 2008

Fig. 22. Dendrograma obinut la cele zece soiuri de vi de vie analizate Dendrogram of the ten cultivars of Vitis vinifera tested

137

Rodica Pop, 2008 Soiurile Cetuia i Timpuriu de Cluj au un printe comun, n dendrogram fiind situate n acelai subgrup. i n acest caz analiza RAPD a confirmat originea comun a acestor dou soiuri. Grupul B este mprit i el n dou subgrupuri, respectiv B1 i B2. Grupul B1 cuprinde soiurile Merlot, Cabernet Sauvignon i Traminer roz. Rezultatele experienelor noastre confirm faptul c soiul Cabernet Sauvignon i Merlot sunt apropiate din punct de vedere genetic. Aa dup cum se arat n literatura de specialitate, soiul Merlot este considerat ca fcnd parte din familia Cabernet (DEBUIGNE, 1992; BELLIN i colab., 2001). Mai mult, cercettorii de la Universitatea Davies din California consider c soiul Merlot provine din soiul Cabernet Franc. De altfel, ambele soiuri din punct de vedere ecologo-geografic fac parte din Proles occidentalis. Soiul Traminer roz, dei este un soi de struguri pentru vinuri albe, se pare c este mult mai apropiat genetic de soiurile roii. O explicaie ar consta n faptul c acest soi, din punctul de vedere al clasificrii pe grupe ecologo-geografice, face parte din Proles occidentalis, la fel ca i soiurile Cabernet Sauvignon i Merlot. De asemenea, bobul are o culoare roz-cenuie. In subgrupul B2 este prezent un singur soi i anume Napoca, ceea ce sugereaz un grad mai ndeprtat de nrudire cu celelalte soiuri analizate. Din analiza matricei distanelor genetice se poate observa c cele mai apropiate cultivare, din punct de vedere genetic. sunt Feteasc alb i Feteasc regal, distana genetic dintre acestea fiind de 0,4421. Distana genetic cea mai mare s-a constatat ntre soiul Napoca i Timpuriu de Cluj, aceasta fiind de 0,7609. Aceast deprtare genetic sugereaz existena unui grad ndeprtat de nrudire, la originea formrii acestor soiuri existnd prini total diferii.

138

Rodica Pop, 2008 3.2. REZULTATE OBINUTE N EXPERIENELE DE MULTIPLICARE IN VITRO 3.2.1. Rezultate obinute n experienele de multiplicare prin lstrire axilar

Studierea variabilitii somaclonale presupune existena unui numr mare de explante. Pentru a asigura o mai mare uniformitate genetic a descendenilor s-a ales ca sistem de micropropagare multiplicarea prin lstrire axilar. Pornind de la premisa c fiecare lstar este o potenial plant, rata de multiplicare mare poate fi meninut la un nivel constant pe parcursul unui numr mare de subculturi. Inducerea caulogenezei, respectiv formarea de mugurai i tulpinie, este stimulat de prezena n mediul de cultur a citochininelor. Adeseori este necesar asocierea citochininelor cu auxinele. Un rol important n neoformarea de mugurai l are natura i concentraia regulatorilor de cretere utilizai Pentru a obine un numr ct mai mare de clone, ne-am propus testarea a trei variante de mediu care au fost suplimentate att cu auxine ct i cu citochinine. De asemenea, avnd n vedere faptul c via de vie are nevoie de un aport mai mare de azot organic, mediul a fost suplimentat, n fiecare din cele trei variante, cu hidrolizat de cazein. Variabilitatea reaciei cultivarelor de Vitis vinifera micropropagate in vitro a fost raportat de numeroi cercettori, ca de exemplu GALZY (1964), citat de AKBAS i colab., 2004, HARRIS i colab., (1982), CHEE i colab. (1983), GALZY i colab. (1990), (PEROS i colab., 1998). Datele obinute din cercetrile noastre i prezentate n tabelele 17-28 relev o larg variabilitate a reaciei la multiplicarea prin lstrire axilar la cele zece cultivare de vi de vie pe cele trei variante de mediu de cultur i cinci proveniene testate. Trebuie remarcat faptul c apariia lstarilor in vitro, ca urmare a multiplicrii prin lstrire axilar, a fost notat la 20 de zile dup iniierea culturii, dar numrarea lstarilor i msurtorile privind lungimea acestora i numrul de noduri/lstar au fost executate la opt sptmni de la iniierea culturii. n figura 23 se observ formarea in vitro a neoplantulelor de vi de vie la circa

139

Rodica Pop, 2008 20 de zile de la inocularea explantelor provenite din segmente nodale detaate de pe lstarii recoltai din cmp.

Cabernet Sauvignon

Riesling italian

Feteasc regal

Fig. 23. Neoplantule obinute din segmente nodale la soiurile de vi de vie Cabernet Sauvignon, Riesling italian i Feteasc regal micropropagate prin lstrire axilar In vitro plant regeneration from nodal segment in cultivars Cabernet Sauvignon, Riesling italian and Feteasca regala micropropagated from axillary shoot
140

Rodica Pop, 2008

3.2.1.1. Numrul de lstari obinui prin micromultiplicare prin lstrire axilar Datele privind influena soiului, a mediului de cultur i a localitii asupra numrului de lstari obinui prin multiplicarea din segmente nodale la via de vie au fost prelucrate statistic, fiind prezentate sub forma tabelului varianelor n tabelul 17. Din proba F prezentat n tabelul 17 rezult c toi factorii experimentali (soi, mediu de cultur, localitatea de provenien), precum i interaciunile simple, duble i cea tripl dintre acetia au avut influene semnificative asupra numrului de lstari obinui prin multiplicarea din segmente nodale. Datorit acestui fapt sintezele rezultatelor obinute sunt prezentate sub form de tabele bilaterale. Tabelul 17 Analiza varianei pentru experiena trifactorial de tipul 10 x 3 x 5 (soi x mediu de cultur x localitatea de provenien)
(Influena soiului, mediului de cultur i a localitii asupra numrului de lstari obinui prin multiplicarea din segmente nodale la via de vie)

Analysis of variant three way Anova experiement 10 x 3 x 5 (cultivars x culture medium x provenance)
Cauza variabilitii Cause of variability Total Parcele mari Repetiii Factorul A (soiul de vi de vie) Eroare (a) Parcele mijlocii Factorul B (mediul de cultur) Interaciunea A x B Eroare (b) Parcele mici Factorul C (localitatea de provenien) Interaciunea A x C Interaciunea B x C Interaciunea A x B x C Eroare (c) SP SS 1855,76 171,74 0,81 169,06 1,866 1632,86 1435,78 194,65 2,432 51,16 19,61 4,86 3,56 11,03 12,105 141 GL DF 449 29 2 9 18 60 2 18 40 360 4 36 8 72 240 18,78 0,104 717,89 10,81 0,0608 4,90 0,13 0,44 0,15 0,0504 11807,37**>3,04; 4,71 177,86**>1,62; 2,09 181,21**>1,92; 2,50 s2 Proba F F test

97,18** >2,41;3,41 2,68** >1,45;1,69 8,82**>1,98; 2,60 3,04**>1,35; 1,53

Rodica Pop, 2008 Analiznd influena soiului i a mediului de cultur asupra numrului de lstari obinui prin micropropagare din lstari axilari la via de vie, datele prezentate n tabelul 18 relev faptul c att soiul ct i mediul de cultur au avut efecte semnificative asupra acestui caracter.
Tabelul 18

Influena soiului (A), a mediului de cultur (B) i a interaciunii (A x B) asupra numrului de lstari de vi de vie obinui prin micropropagare Effects of cultivars (A), culture medium (B) and interaction (A xB) upon the number shoots of Vitis vinifera micropropagated
Soiul Cultivar Feteasc alb Feteasc regal Muscat Ottonel Riesling italian Traminer roz Cabernet Sauvignon Napoca Cetuia Timpuriu de Cluj Merlot Media mediu de cultur Mean of culture medium Mediul de cultur Culture medium Media soi MS-0,5 mg/l MS 1,0 mg/l MS 2,5 mg/l Mean of cultivar BAP BAP BAP 1,18 t 2,76 lm 6,09 e 3,34 DE 1,60 p 3,09 j 5,57 g 3,42 D 1,46 r 3,04 j 6,58 c 3,69 B 1,46 r 2,74 m 7,12 b 3,77 B 1,40 r 4,82 h 6,30 d 4,17 A 1,49 r 2,91 k 7,70 a 4,03 A 1,42 r 2,52 n 5,65 g 3,20 E 1,30 s 2,07 o 2,83 kl 2,07 G 1,46 r 2,49 n 3,78 i 2,58 F 1,68 p 3,13 j 5,95 f 3,59 C 1,45 P* 2,96 N 5,76 M

DS 5% pentru dou medii soi (SD 5% for two means of variety) = 0,15-0,17 DS 5% pentru dou medii mediu de cultur (SD 5% for two means of culture medium) = 0,06-0,07 DS 5% pentru dou medii soi x mediu de cultur (SD 5% for two means of interaction) = 0,09-0,10 * Diferenele dintre oricare dou variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative *The differences between any two values followed by at least a common letter are not significant

Se observ, din ultima coloan a tabelului 18 c cel mai mare numr de lstari s-a obinut la soiul de vin alb Traminer roz i la soiul de vin rou Cabernet Sauvignon. Celelalte soiurile de vin alb nregistreaz un numr de lstari semnificativ inferior, dintre soiurile albe cele mai bune rezultate nregistrndu-se la Muscat Ottonel i Riesling italian. Strugurii de mas s-au plasat la diferene semnificative fa de

142

Rodica Pop, 2008 strugurii de vin, n ceea ce privete numrul de lstari obinui prin micropropagare din segmente nodale. Exceptnd soiul Napoca, care se apropie ca valoare a acestui caracter de soiurile de vin albe, celelalte soiuri de struguri de mas au o capacitate semnificativ mai mic de producere de neoplantule prin lstrire axilar. Se poate conchide, pe baza acestor date, c genotipurile de vi de vie analizate prezint capaciti semnificativ diferite de formare a lstarilor prin cultura in vitro de segmente nodale. Rezultatul nu constituie o noutate ntruct, la majoritatea plantelor lemnoase, influena genotipului asupra succesului culturii in vitro este ntotdeauna notabil (YOUMBI i colab., 2006; DE SILVA, 2006). Influena mediului de cultur asupra numrului de lstari obinui prin cultura in vitro de segmente nodale este, de asemenea, semnificativ, cel mai mare numr de lstari obinndu-se pe mediul MS 2,5 mg/l BAP, la diferene semnificative de celelalte dou medii. Mediul MS 1,0 mg/l BAP, dei este semnificativ superior mediului MS cu doar 0,5 mg/l BAP, are capacitatea de a produce un numr de lstari redus la jumtate fa de cel mai productiv mediu de cultur din experien (MS 2,5 mg/l BAP). Analiznd datele din interiorul tabelului 18 privind influena interaciunii soi x mediu de cultur asupra numrului de lstari obinui prin cultura in vitro de segmente nodale se poate constata c cele mai ridicate valori ale acestui caracter se nregistreaz la soiurile Cabernet Sauvignon, Riesling italian, Muscat Ottonel i Traminer roz atunci cnd se utilizeaz mediul de cultur MS 2,5 mg/l BAP. Toate celelalte combinaii dintre soi i mediu de cultur duc la scderi foarte semnificative ale numrului de lstari, aceste scderi putnd s ajung la mai mult de 6,5 ori. Influena localitii de provenien a materialului biologic (cultivarele de vi de vie) i a mediului de cultur asupra numrului de lstari obinui prin micropropagarea prin lstari axilari este prezentat n datele cuprinse n tabelul 19. Analiza mediei localitilor de provenien, relev faptul c ntre acestea diferenele nu sunt foarte mari, dar datorit omogenitii datelor, ele sunt semnificative. Trecnd peste aceast inadverten aparent, trebuie s admitem c diferenele semnificative ntre localitile de provenien n ceea ce privete numrul de lstari obinui n cultura in vitro s-ar putea datora, foarte probabil, condiiilor
143

Rodica Pop, 2008 diferite de recoltare i transport a probelor de material biologic (lstari de un an). Astfel de date sunt publicate i de AKBA, 2004, care evideniaz faptul c, la soiul Perle de Csaba, succesul micropropagrii a depins n mod semnificativ de luna n care au fost recoltai lstarii care au furnizat explantele.
Tabelul 19

Influena localitii de provenien (C), a mediului de cultur (B) i a interaciunii (B x C) asupra numrului de lstari obinui prin micropropagare la via de vie Effect of provenance (C), culture medium (B) and interaction (B x C) upon the number of shoots of Vitis vinifera micropropagated
Localitatea de provenien Provenance Blaj Reca Odobeti Iai Valea Clugreasc Media mediu de cultur Means of culture medium Mediul de cultur Culture medium MS-0,5 mg/l MS 1,0 mg/l MS 2,5 mg/l BAP BAP BAP 1,30 j 2,59 g 5,47 c 1,36 j 1,46 ij 1,55 h 1,54 h 1,45 P* 2,60 g 3,06 f 3,20 e 3,34 d 2,96 N 5,51 c 5,86 b 5,95 a 5,99 a 5,75 M Media localitii Means of provenance 3,12 C 3,16 C 3,46 B 3,57 A 3,62 A

DS 5% pentru dou medii localitate (SD 5% for two means of provenance) = 0,06-0,07 DS 5% pentru dou medii mediu de cultur (SD 5% for two means of culture medium) = 0,06-0,07 DS 5% pentru dou medii localitate x mediu (SD 5% for trwo means of interaction) = 0,08-0,11 * Diferenele dintre oricare dou variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative *The differences between any two values followed by at least a common letter are not significant

n tabelul 20 sunt prezentate rezultatele experimentale privind influena soiului i a localitii de provenien a acestora asupra numrului de lstari obinui n cultura in vitro de segmente nodale. Deoarece influena soiului a fost discutat anterior, iar influena localitii, dei semnificativ nu este ilustrat prin diferene marcante ntre proveniene nu vom insista asupra datelor privind aceast interaciune. Concluzionnd datele discutate n acest subcapitol se poate conchide c, n mod sigur, genotipul i mediul de cultur influeneaz hotrtor numrul de lstari obinui

144

Rodica Pop, 2008 la micropropagarea prin lstrire axilar la via de vie. Soiurile cu cea mai ridicat capacitate de reacie la cultura in vitro din segmente nodale par a fi soiurile Cabernet Sauvignon, i Traminer roz, iar mediul de cultur cel mai adecvat acestui scop s-a dovedit a fi MS 2,5 mg/l BAP. Tabelul 20 Influena soiului (A), a localitii de provenien (C) i a interaciunii (A x C) asupra numrului de lstari obinui prin micropropagare la via de vie Effect of cultivars (A), provenance (C) and interactions (A x C) on number shoots of Vitis vinifera micropropagated
Soiul Cultivar Localitatea de provenien Provenance Blaj Reca Odobeti 3,32 lmno 3,68 ghi 3,87 def 3,73 fgh 4,43 a 3,97 cde 3,27 no 2,14 u 2,63 rs 3,57 hij 3,46 N Iai 3,62 hij 3,64 ghij 3,87 def 3,87 def 4,43 a 4,04 cdef 3,40 klmn 2,21 u 2,78 qr 3,81 efg 3,57 M Valea Clugreasc 3,71 fgh 3,50 ijkl 3,93 cde 4,10 bc 4,37 a 4,23 b 3,48 jkl 2,23 tu 2,81 q 3,88 def 3,62 M Media soi Mean of cultivar 3,34 DE 3,42 D 3,69 BC 3,77 B 4,17 A 4,03 A 3,20 E 2,07 G 2,58 F 3,59 C

Feteasc alb 2,98 p 3,09 op Feteasc 3,18 no 3,10 op regal Muscat 3,43 klmn 3,37 lmno Ottonel Riesling 3,47 jklm 3,70 fgh italian Traminer roz 3,57 hij 4,07 cd Cabernet 4,00 cd 3,92 cde Sauvignon Napoca 2,90 q 2,93 pq Cetuia 1,89 v 1,86 v Timpuriu de 2,40 st 2,27 tu Cluj Merlot 3,39 klmn 3,29 mno Media localitii 3,12 P* 3,16 P Mean of provenance

DS 5% pentru dou medii soi (SD 5% for two means of variety) = 0,15-0,17 DS 5% pentru dou medii localitate (SD 5% for two means of provenance) = 0,06-0,07 DS 5% pentru doua medii soi x localitate (SD 5% for two means of interaction) = 0,17-0,22

* Diferenele dintre oricare dou variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative
*The differences between any two values followed by at least a common letter are not significant

Deoarece mediul de cultur are cea mai puternic influen asupra numrului de neoplantule obinut la micropropagarea prin lstrire axilar, se ntlnesc i cazuri de

145

Rodica Pop, 2008 interaciuni ntre factori care duc la rezultate ce aparent contrazic cele spuse mai sus (exemplu, la soiul Riesling italian, soi pentru vinuri albe, micropropagat pe MS-2,5 mg/l BAP numrul de lstari obinui este imediat n apropierea celui realizat la soiul Cabernet Sauvignon). Aceasta este o dovad n plus c interaciunea soi x mediu de cultur influeneaz n mod decisiv caracterul analizat.

3.2.1.2. Lungimea lstarilor obinui prin multiplicarea din segmente nodale Analiza varianei pentru experiena trifactorial privind influena soiului, a mediului de cultur i a localitii asupra lungimii lstarilor obinui prin multiplicarea din segmente nodale este prezentat n tabelul 21. Tabelul 21 Analiza varianei pentru experiena trifactorial de tipul 10 x 3 x 5 (soi x mediu de cultur x localitatea de provenien) (Influena soiului, mediului de cultur i a localitii asupra lungimii lstarilor (cm) obinui prin multiplicarea din segmente nodale la via de vie) Analysis of variant of three way Anova experiment 10 x 3 x 5 (cultivars x culture medium x provenance)
Cauza variabilitii Cause of variability Total Parcele mari Repetiii Factorul A (soiul de vi de vie) Eroare (a) Parcele mijlocii Factorul B (mediul de cultur) Interaciunea A x B Eroare (b) Parcele mici Factorul C (localitatea de provenien) Interaciunea A x C Interaciunea B x C Interaciunea A x B x C Eroare (c) SP SS 886,16 200,36 0,55 197,44 2,369 626,28 485,68 139,26 1,342 59,52 9,79 16,37 3,05 19,47 10,830 GL DF 449 29 2 9 18 60 2 18 40 360 4 36 8 72 240 146 s2 Proba F F test

21,94 0,132 242,84 7,74 0,0335 2,45 0,45 0,38 0,27 0,0451

166,6**8>1,92; 2,50

7238,86**>3,04; 4,71 230,62**>1,62;2,09

54,26** >2,41;3,41 10,08** >1,45;1,69 8,46**>1,98; 2,60 5,99** >1,35;1,53

Rodica Pop, 2008

Ca i n cazul numrului de lstari, i pentru lungimea lstarilor obinui prin culturi in vitro de segmente nodale, la cele zece soiuri de vi de vie, pe trei medii de cultur diferite, se observ din datele prezentate n tabelul 21, c toi factorii experimentali i toate interaciunile dintre acetia (duble i tripl) au efecte semnificative asupra acestui caracter. Asemntor cazului anterior, rezultatele de sintez vor fi prezentate sub form de tabele bilaterale n care influena factorilor i a interaciunii dintre acetia asupra caracterului analizat ies mai bine n eviden. Influena soiului i a mediului de cultur asupra lungimii lstarilor de vi de vie obinui prin micropropagare din segmente nodale este prezentat n tabelul 22. Ca i n cazul caracterului studiat anterior, pe primele dou locuri se situeaz dou soiuri pentru vin alb (Traminer roz: 5,55 cm i Riesling italian: 4,98) urmat de data aceasta, la diferene semnificative, de un soi pentru vinuri roii (Cabernet Sauvignon: 4,84 cm). Celelalte soiuri nregistreaz valori mult mai mici ale caracterului studiat, ce ajung pn la 3,40 cm la soiul de struguri de mas Timpuriu de Cluj. Este evident, din datele cuprinse n tabelul 22, c i n cazul lungimii lstarilor genotipurile de vi de vie reacioneaz diferit la cultura in vitro de segmente nodale. Rezultatul era previzibil, deoarece o serie de lucrri anterioare semnalau reacia diferit a soiurilor de vi de vie n condiii de cultur in vitro (IONESCU i colab., 1992; SIVRITEPE i colab., 1999). Cel mai adecvat mediu de cultur, din punctul de vedere al lungimii lstarilor obinui prin micropropagare din segmente nodale, este MS 2,5 mg/l BAP. Celelalte medii de cultur cu coninut de BAP de 0,5-1,0 mg/l, dau rezultate mult mai slabe n ceea ce privete lungimea neoplantulelor obinute, diferenele fa de cel mai bun mediu fiind semnificative. Dac se analizeaz interaciunea ntre cei doi factori, cele mai bune rezultate se obin la soiurile Traminer roz i Cabernet Sauvignon, micromultiplicate pe mediul MS 2,5 mg/l BAP, cu lungimi ale lstarilor de aproape 8 cm. Toate celelalte variante de interaciune sunt inferioare acestor dou soiuri la diferene semnificative i foarte semnificative. Foarte interesant, c n ceea ce privete lungimea lstarilor, soiurile de
147

Rodica Pop, 2008 struguri de mas Timpuriu de Cluj i Cetuia dau cele mai slabe rezultate indiferent de mediul de cultur utilizat.

Tabelul 22 Influena soiului (A), a mediului de cultur (B) i a interaciunii (A x B) asupra lungimii lstarilor (cm) de vi de vie obinui prin micropropagare Effect of cultivars (A), culture medium (B) and interaction (A x B) upon the length (cm) of Vitis vinifera shoob obtained micropropagated
Soiul Cultivar Feteasc alb Feteasc regal Muscat Ottonel Riesling italian Traminer roz Cabernet Sauvignon Napoca Cetuia Timpuriu de Cluj Merlot Media mediu de cultur Mean of culture medium Mediul de cultur Culture medium MS-0,5 mg/l MS 1,0 mg/l MS 2,5 mg/l BAP BAP BAP 3,08 o 3,40 m 4,52 gh 3,26 n 3,55 lm 4,57 gh 3,70 k 3,94 j 4,76 f 3,54 lm 4,50 h 6,89 c 3,22 n 5,22 e 8,22 a 3,58 l 3,79 k 7,14 b 3,72 k 3,99 j 4,54 gh 2,58 q 3,48 m 4,60 g 2,13 r 2,93 p 5,14 e 2,95 p 4,13 i 6,13 d 3,18 C* 3,89 B 5,65 A Media soi Mean of cultivar 3,67 IJ 3,79 I 4,13 H 4,98 E 5,55 D 4,84 F 4,08 H 3,55 J 3,40 K 4,40 G

DS 5% pentru dou medii soi (SD 5% for two means of variety) = 0,15-0,17 DS 5% pentru dou medii mediu de cultur (SD 5% for two means of culture medium) = 0,03 DS 5% pentru dou medii soi x mediu cultur (SD 5% for two means of interaction) = 0,09-0,10 * Diferenele dintre oricare dou variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative *The differences between any two values followed by at least a common letter are not significant

Analiza influenei soiului i a localitii de provenien a acestuia (tabelul 23) asupra lungimii lstarilor obinui prin culturi in vitro de segmente nodale, relev faptul c ntre localiti, dei exist diferene semnificative, acestea sunt exprimate n zecimi sau sutimi de mm ceea ce n mod practic, are o relevan mult mai sczut. Aceast afirmaie este susinut de faptul c pentru toate localitile, lungimea neoplantulelor obinute prin culturi in vitro de segmente nodale este cuprins ntre 4,1 i 4,4 cm.

148

Rodica Pop, 2008 Lund, totui, n considerare faptul c, ntre localiti exist diferene semnificative n ceea ce privete lungimea lstarilor obinui, se poate presupune c interaciunea dintre genotip i condiiile mediului specific fiecrei localiti are consecine evidente din punct de vedere statistic nu numai asupra numrului de lstari obinui n cultura in vitro de segmente nodale ci i asupra lungimii acestora. Natural c aceste consecine tiinifice sunt rezultatul unor diferene reale a reaciei genotipurilor n strict dependen de originea lor. Tabelul 23 Influena soiului (A), a localitii de provenien (C) i a interaciunii (A X C) asupra lungimii (cm) lstarilor de vi de vie obinui prin micromultiplicare Effect of cultivars (A), provenance (C) and interaction (A x C) upon the length (cm) of shoots of Vitis vinifera by micropropagation
Localitatea de provenien Provenance Blaj Reca 3,15 w 3,51 vz 3,94 rst 4,89 gh 5,68 c 4,87 gh 3,97 prs 3,53 vz 3,13 w 4,16 klm 4,08 C Odobeti 3,47 vz 3,86 rst 4,05 nopr 4,88 gh 5,08 ef 4,64 ij 4,20 mno 3,57 vz 3,43 z 4,42 kl 4,16 B Iai 3,97 prs 3,65 uv 4,16 mnop 5,10 ef 6,09 a 5,16 de 4,07 nopr 3,53 vz 3,58 vz 4,66 gh 4,40 A Valea Clugreasc 3,83 stu 3,91 rst 4,20 mno 5,27 d 5,92 b 4,94 fgh 4,22 mn 3,57 vz 3,77 tu 4,78 hi 4,44 A Media soi Mean of cultivar 3,67 IJ 3,79 I 4,13 H 4,98 E 5,55 D 4,84 F 4,08 H 3,55 J 3,40 K 4,40 G

Soiul Cultivar

Feteasc alb 3,91rst Feteasc regal 4,03 nopr Muscat 4,32 lm Ottonel Riesling italian 4,75 hij Traminer roz 4,99 fg Cabernet 4,59 jk Sauvignon Napoca 3,97 prs Cetuia 3,57 vz Timpuriu de 3,1 w Cluj Merlot 4,01 oprs Media localitate 4,12 C* Mean of provenance

DS 5% pentru dou medii soi (SD 5% for two means of variety) = 0,15-0,17 DS 5% pentru dou medii localitate (SD 5% for two means of provenance) = 0,06-0,07 DS 5% pentru dou medii soi x localitate (SD 5% for two means of interaction) = 0,17-0,23 * Diferenele dintre oricare dou variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative *The differences between any two values followed by at least a common letter are not significant

149

Rodica Pop, 2008 Analiza influenei mediului de cultur i a localitii de provenien a materialului biologic (cultivarelor) asupra lungimii lstarilor obinui prin

micropropagarea din segmente nodale (tabelul nr. 24) este mult simplificat de faptul c, pe baza datelor din tabelele anterioare, att efectele mediului de cultur ct i cel al localitii au fost analizate. Din aceste motive ne vom mrgini s relevm doar efectul interaciunii celor doi factori artnd c, pentru toate localitile luate n studiu, cele mai ridicate valori ale lungimii lstarilor s-au obinut pe mediul MS 2,5 mg/l BAP, la diferene asigurate statistic fa de oricare alt combinaie ntre cei doi factori. Tabelul 24 Influena mediului de cultur (B), a localitii de provenien (C) i a interaciunii (B x C) asupra lungimii (cm) lstarilor de vi de vie obinui prin micromultiplicare Effect of culture medium (B), provenance (C) and interaction (B x C) upon the length of shoots (cm) of Vitis vinifera obtained by micropropagation
Localitatea de provenien Provenance Blaj Reca Odobeti Iai Valea Clugreasc Media mediu de cultur Mean of culture medium Mediul de cultur Culture medium MS-0,5 mg/l MS 1,0 mg/l MS 2,5 mg/l BAP BAP BAP 3,08 j 3,85 g 5,44 c 3,00 k 3,20 i 3,30 h 3,30 h 3,18 P* 3,86 f 3,72 g 3,96 e 4,08 d 3,89 N 5,39 c 5,56 b 5,93 a 5,95 a 5,65 M Media localitii Mean of provenance 4,12 C 4,08 C 4,16 B 4,40 A 4,44 A

DS 5% pentru dou medii localitate (SD 5% for two means of provenance) = 0,06-0,07 DS 5% pentru dou medii mediu de cultur (SD 5% for two means of culture medium) = 0,03 DS 5% pentru dou medii localitate x mediu cultur (SD 5% for two means of interaction) = 0,080,11 * Diferenele dintre oricare dou variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative *The differences between any two values followed by at least a common letter are not significant

150

Rodica Pop, 2008 Concluzionnd datele din acest subcapitol se poate afirma c: Soiul, mediul de cultur i localitatea de provenien ale soiului au influenat n mod semnificativ lungimea lstarilor obinui prin cultura in vitro de segmente nodale, la via de vie. - Cea mai accentuat influen asupra caracterelor menionate o are mediul de cultur, de departe mediul MS 2,5 mg/l BAP ducnd la obinerea celor mai bine dezvoltate neoplantule obinute prin cultura in vitro de segmente nodale, la diferene semnificative de oricare alte variante de mediu. - Faptul c i ntre localitile de provenien ale cultivarelor exist diferene semnificative n ceea ce privete lungimea lstarilor obinui prin micromultiplicarea din segmente nodale poate fi explicat prin nivelele diferite de interaciune dintre genotip i mediul su specific, diferene ce se concretizeaz n probabilitatea de dezvoltare mai accentuat sau mai puin accentuat a neoplantulelor n culturile in vitro (fig. 24).

T ram iner roz

B laj 4 ,9 9 cm

Iai 6,09 cm

O dob eti 5,08 cm

V alea C lugreasc Reca 5 ,9 2 cm 5 ,6 8 cm

Fig. 24. Lungimea medie a lstarilor la soiul de vi de vie Traminer roz obinui prin multiplicarea din segmente nodale Average shoot length (cm) of cultivar Traminer rose obtained from micropropagated nodal segements

151

Rodica Pop, 2008

3.2.1.3. Numrul de noduri/neoplantul observat n urma micromultiplicrii din segmente nodale la via de vie Ca i n cazul celor dou caractere analizate anterior, tabelul varianei pentru influena soiului, mediului de cultur i a localitii asupra numrului de noduri/neoplantul obinute prin micromultiplicare din segmente nodale, la via de vie, arat o prob F ce scoate n eviden aciunea distinct semnificativ a tuturor factorilor i interaciunilor dintre factori (tabelul 25). Prezentarea rezultatelor de sintez se face, i n cazul acestui caracter, prin tabele de contigen ntre doi factori. Tabelul 25 Analiza varianei pentru experiena trifactorial de tipul 10 x 3 x 5 (soi x mediul de cultur x localitate de provenien) (Influena soiului, mediului de cultur i a localitii asupra numrului de noduri obinui prin micromultiplicare din segmente nodale la via de vie) The three way Anova type experiment 10 x 3 x 5 (cultivars x culture medium x provenance)
Cauza variabilitii Cause of variability Parcele mari Repetiii Factorul A (soiul de vi de vie) Eroare (a) Parcele mijlocii Factorul B (mediul de cultur) Interaciunea A x B Eroare (b) Parcele mici Factorul C (localitatea de provenien) Interaciunea A x C Interaciunea B x C Interaciunea A x B x C Eroare (c) SP SS 531,47 1,03 525,96 4,478 1557,29 1091,20 458,05 8,034 78,57 14,37 19,13 2,99 26,29 15,789 GL DF 29 2 9 18 60 2 18 40 360 4 36 8 72 240 545,60 2716,53**>3,04;4,71 25,45 126,70**>1,62;2,09 0,2008 3,59 0,53 0,37 0,37 0,0658 54,62**>2,41;3,41 8,08**>1,45;1,69 5,69**>1,98;2,60 5,55**>1,35;1,53 58,44 0,249 234,93**>1,92; 2,50 s2 Proba F F test

152

Rodica Pop, 2008 In tabelul 26 se prezint influena soiului i a mediului de cultur asupra numrului de noduri prezentat de neoplantulele obinute prin cultura in vitro din segmente nodale. Rezultatele urmeaz ndeaproape modelul descris la lungimea lstarilor, lucru absolut firesc dac se ine cont de faptul c, n general, lstarii de lungimi mai mari au i noduri mai multe.

Tabelul 26 Influena soiului (A), a mediului de cultur (B) i a interaciunii (A x B) asupra numrului de noduri/neoplantule obinut prin micromultiplicare din segmente nodale la via de vie The effect of cultivar (A), culture medium (B) and interaction (A x B) upon the number of nodes/neoplants obtained in Vitis vinifera by micropropagation from nodal semgments
Soiul Cultivar Feteasc alb Feteasc regal Muscat Ottonel Riesling italian Traminer roz Cabernet Sauvignon Napoca Cetuia Timpuriu de Cluj Merlot Media mediu de cultur Mean of culture medium Mediul de cultur Culture medium MS 1,0 mg/l MS 2,5 mg/l BAP BAP 2,20 o 6,80 b 3,03 lj 5,73 d 4,59 f 4,81 e 4,45 g 6,48 c 4,94 e 12,16 a 2,84 kl 3,35 k 3,07 l 2,22 o 3,84 i 3,45 N 6,73 b 4,17 h 3,66 j 4,28 h 5,83 d 6,07 M

Media soi
Mean of cultivar 4,14 C 3,72 D 3,83 D 4,61 B 6,65 A 4,10 C 3,38 E 2,71 F 2,54 F 3,88 D

MS-0,5 mg/l BAP 3,42 k 2,42 n 2,09 op 2,91 jk 2,84 kl 2,72 lm 2,63 m 1,41 r 1,11 s 1,98 p 2,35 P*

DS 5% pentru dou medii soi (SD 5% for two means of variety) = 0,21-0,24 DS 5% pentru dou medii mediu de cultur (SD 5% for two means of culture medium) = 0,11-0,14 DS 5% pentru dou medii soi x mediu de cultur (SD 5% for two means of interaction) = 0,14-0,17 * Diferenele dintre oricare dou variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative *The differences between any two values followed by at least a common letter are not significant

153

Rodica Pop, 2008 Analiznd influena soiului asupra numrului de noduri/neoplantul se observ c, ntre cele zece soiuri luate n studiu, exist diferene semnificative privind acest caracter. Cel mai mare numr de noduri/neoplantul se nregistreaz la soiul Traminer

10
Numar de noduri/neoplantula

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 2 4 6 8 10

y = 0,5706x + 1,982 r = 0,90**

12

14

Lungimea lastarilor (cm)

roz (6,65 noduri/neoplantul) urmat, la diferene semnificative, de soiul Riesling italian (4,61 noduri/neoplanutul). Ordinea variantelor celor mai bune pentru acest caracter este identic cu cea nregistrat la lungimea neoplantulelor fapt ce vine n sprijinul afirmaiei anterioare privind corelaia direct i pozitiv (r = 0,90**) ntre lungimea neoplantulei i numrul de noduri pe care l formeaz, aa cum reiese din figura 25. Fig. 25. Linia i ecuaia de regresie a numrului de noduri/neoplantul n funcie de lungimea (cm) lstarilor de vi de vie obinui prin micropropagare Regression line and equation for number of nodes/neoplants and length of shoots (cm) obtained by micropropagated Numrul cel mai sczut de noduri/neoplantul se nregistreaz la soiurile de struguri de mas Cetuia i Timpuriu de Cluj, inferior tuturor celorlalte soiuri testate la diferene asigurate statistic. Mediul de cultur a influenat n mod i mai evident dect soiurile numrul de noduri/neoplantul nregistrat n experien. Mediul MS 2,5 mg/l BAP duce la
154

Rodica Pop, 2008 formarea unor neoplantule cu cel mai mare numr de noduri (6,07) celelalte dou medii plasndu-se mult sub valoarea menionat mai sus (mediul MS 0,5 mg/l BAP = 2,35 noduri/neoplantul, iar mediul MS 1,0 mg/l BAP = 3,45 noduri/neoplantul). Analiza datelor din interiorul tabelului 26 privind interaciunea celor doi factori (soi x mediu de cultur) i influena acesteia asupra numrului de noduri/neoplantul, scoate n eviden un lucru foarte interesant: la soiul Traminer roz pe mediul MS - 2,5 mg/l BAP s-au obinut neoplantule cu 12,2 noduri/neoplantul, valoare ce este practic dubl fa de cele ale efectului soiului (6,65 noduri/neoplantul) i mediului (6,07 noduri/neoplantul) asupra respectivului caracter. Aceste date sugereaz clar c, prin alegerea atent a soiurilor i a mediului de cultur pot fi obinute, n procesul de micropropagare la via de vie, variante de lucru n care numrul de noduri s fie foarte mare asigurndu-se astfel o rat de multiplicare superioar. Datele din tabelul 27 relev faptul c, ntre provenienele cultivarelor care au furnizat explantele, exist diferene semnificative n ceea ce privete numrul de noduri/neoplantul. Foarte probabil aceast difereniere semnificativ a reaciei soiurilor n funcie de proveniena lor se datorete, n cazul numrului de noduri/neoplantul, dimensiunilor diferite ale neoplantulelor, nregistrate n funcie de originea cultivarelor. Fr a ncerca s explicm cauzele reale ale acestei variaii, vom arta c cel mai mare numr de noduri/neoplantul s-a obinut, la toate soiurile, atunci cnd acestea proveneau din staiunile Iai i Valea Clugreasc. Provenienele de Odobeti, Reca i Blaj dau neoplantule cu numr semnificativ mai mic de noduri dect provenienele de Iai i Valea Clugreasc, cu meniunea c aceste diferene sunt de ordinul zecimilor. Datele din interiorul tabelului 27 privind analiza interaciunii soiului i localitii asupra numrului de noduri/neoplantul evideniaz, din nou, un soi pentru vinuri albe i anume Traminer roz care, la neoplantulele formate prin micromultiplicare din segmente nodale, a realizat neoplantule cu mai mult de apte noduri/neoplantul valoare ce este aproape dubl sau chiar mai mult dect dubl fa de majoritatea celorlalte valori din interiorul tabelului, aceste diferene fiind asigurate statistic.

155

Rodica Pop, 2008 Din tabelul 28 care prezint influena interaciunii dintre localitate i mediu de cultur asupra numrului de noduri/neoplantul, se vor analiza doar datele din interiorul tabelului, dat fiind faptul c influena factorului mediu de cultur i influena factorului provenien au fost discutate la tabelele anterioare. Tabelul 27 Influena soiului (A), a localitii de provenien (C) i a interaciunii (A x C) asupra numrului de noduri/neoplantul obinut prin micromultiplicare din segmente nodale la via de vie The effect of cultivar (A), provenance (C) and interaction (A x C) upon the number of nodes/neoplantlet in Vitis vinifera obtained by micropropagation from nodal segments
Localitatea de provenien Soiul Cultivar Blaj Feteasc 4,30 i alb Feteasc 3,87 jklmn regal Muscat 4,02 j Ottonel Riesling 4,34 hi italian Traminer 5,83 d roz Cabernet 3,74 klmno Sauvignon Napoca 3,16 q Cetuia 2,71 lmno Timpuriu de 2,26 u Cluj Merlot 3,49 op Media localitii 3,77 P* Mean of provenance Reca 3,63 nop 3,50 op 3,67 mno 4,64 efg 6,70 b 4,02 j 3,11 qr 2,61 t 2,29 u 3,71 lmno 3,79 P Odobeti 3,97 jk 3,92 jklm 3,63 nop 4,56 fgh 6,23 c 3,98 jk 3,57 op 2,72 st 2,53 t 3,70 mno 3,88 N Iai 4,47 fghi 3,63 nop 3,87 jklmn 4,69 ef 7,30 a 4,42 ghi 3,40 p 2,77 st 2,71 st 4,24 i 4,15 M Provenance Valea Clugreasc 4,33 hi 3,70 mno 3,96 jkl 4,82 e 7,17 a 4,32 hi 3,68 mno 2,74 st 2,90 rs 4,28 i 4,19 M

Media soi Mean of cultivar 4,14 C 3,72 D 3,83 D 4,61 B 6,65 A 4,10 C 3,38 E 2,71 F 2,54 F 3,88 D

DS 5% pentru dou medii soi (SD 5% for two means of variety) = 0,21-0,24 DS 5% pentru dou medii localitate (SD 5% for two means of provenance) = 0,08-0,09 DS 5% pentru dou medii soi x localitate (SD 5% for two means of interaction) = 0,22-0,29 * Diferenele dintre oricare dou variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative *The differences between any two values followed by at least a common letter are not significant

156

Rodica Pop, 2008 Tabelul 28

Influena localitii de provenien (C), a mediului de cultur (B) i a interaciunii (B x C) asupra numrului de noduri/neoplantul obinut prin micromultiplicare din segmente nodale la via de vie The effect of provenance (C), culture medium (B) and interaction (B x C) upon the number of nodes/neoplantlet in Vitis vinifera obtained by micropropagation of nodal segments
Mediul de cultur Localitatea de provenien Provenance Blaj Reca Odobeti Iai Valea Clugreasc Media mediu de cultur Mean of culture medium MS-0,5 mg/l BAP 2,31 h 2,09 i 2,34 gh 2,47 fg 2,55 f 2,35 P* Culture medium MS 1,0 mg/l BAP 3,27 e 3,41 e 3,31 e 3,59 d 3,68 d 3,45 N MS 2,5 mg/l BAP 5,74 c 5,87 bc 5,99 b 6,38 a 6,34 a 6,07 M Media localitii Mean of provenance 3,77 C 3,79 C 3,88 B 4,15 A 4,19 A

DS 5% pentru dou medii localitate (SD 5% for two means of provenance) = 0,08-0,09 DS 5% pentru dou medii mediu de cultur (SD 5% for two means of culture medium) = 0,11-0,14 DS 5% pentru dou medii localitate x mediu de cultur (SD 5% for two means of interaction) = 0,140,18 * Diferenele dintre oricare dou variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative *The differences between any two values followed by at least a common letter are not significant

Interaciunea dintre mediul de cultur i localitatea de provenien a cultivarului care a furnizat explantul evideniaz valori mari i foarte mari (6,34-6,38 noduri/plant) obinute pentru numrul de noduri/neoplantul la provenienele de Iai i Valea Clugreasc, atunci cnd acestea sunt micropropagate din segmente nodale pe mediul MS 2,5 mg/l BAP. Deoarece pe acest mediu toate soiurile au reacionat extrem de pozitiv n ceea ce privete numrul de noduri/neoplantul recomandm utilizarea acestuia n micropropagarea viei de vie prin segmente nodale (fig. 26).

157

Rodica Pop, 2008

Fig. 26. Plante de vi de vie obinute din segmente nodale pe mediul de cultur MS 2,5 mg/l BAP, la opt sptmni de la inoculare Plants regenerated from nodal segments of Vitis vinifera on MS 2,5 mg/l BAP, 8 weeks after inoculation

Sintetiznd rezultatele prezentate n acest subcapitol se pot conchide urmtoarele: - Soiul de vi de vie, mediul de cultur utilizat i locul de provenien al cultivarului ce a furnizat explantul, precum i interaciunile dintre aceti trei factori au influenat n mod semnificativ numrul de noduri/explant obinut n urma micromultiplicrii prin segmente nodale. - n toate cazurile analizate, att pentru influenele factorilor ct i pentru influenele interaciunilor dintre acetia, numrul de noduri/neoplantul a reprodus fidel modelul de variaie nregistrat pentru lungimea lstarilor (neoplantulelor). - Aceste rezultate confirm observaia general c, la via de vie, numrul de noduri/neoplantul este corelat direct i pozitiv cu dimensiunile (lungimea) neoplantulelor respective, lstarii mai lungi avnd tendina de a forma un numr mai mare de noduri.

158

Rodica Pop, 2008 3.2.2. Rezultate obinute n experienele de inducere a calusogenezei Variabilitatea somaclonal este asociat adesea cu regenerarea direct din calus sau din suspensii de celule (KARP, 1989). Se apreciaz c exist o strns legtur ntre parcurgerea fazei de calus i variabilitatea somaclonal, fapt ce a determinat ca, n micropropagare n scop de nmulire fidel a materialului iniial, s se evite formarea calusului. Cu toate acestea, n literatura de specialitate se menioneaz c apariia variabilitii somaclonale nu este limitat la regenerarea din calus, ci ea poate s se produc i la plantele regenerate prin embriogenez direct (EVANS, 1988). Avnd n vedere c unul din obiectivele tezei a fost acela al studierii variabilitii somaclonale la via de vie, n experienele executate n acest sens a fost indus etapa de formare a calusului. Pentru inducerea calusogenezei s-au utilizat, ca i surs de explante, segmente nodale i fragmente de frunze (fig. 27). Segmentele nodale au fost dimensionate la circa 0,5 cm i au fost plasate orizontal pe suprafaa mediului. Att segmentele nodale, ct i fragmentele de frunze au fost prelevate de la plantulele obinute in vitro. n cazul culturilor de fragmente de organe pe medii corespunztoare i n anumite condiii de lumin, temperatur, umiditate, se induce dediferenierea celulelor difereniate care vor intra n diviziune. Treptat, structura organului fragmentat se pierde i se transform n calus, respectiv ntr-o mas de celule de tip parenchimatic (BADEA i colab., 2001). Cantitatea de calus produs i natura calusului depind de specie, tipul de explant, de regulatorii de cretere utilizai n mediul de cultur i, uneori, de condiiile de incubare (XU i colab., 2005; DE SILVA i colab., 2006). Nu se cunosc exact nutrienii necesari pentru formarea calusului, deci i ali componeni mai pot fi adugai n mediu: hidrolizatul de cazein, extract de mal, extract de drojdii sau lapte de nuc de cocos (PIERIK, 1987). Mediul standard MS (1962) sau modificat este cel mai adesea utilizat. Zaharoza i glucoza, n concentraie de 2-4%, sunt cel mai adesea folosite ca surs de carbon.

159

Rodica Pop, 2008

Fig. 27. Iniierea in vitro a calusului la via de vie din fragmente de frunze Initiation in vitro culture of Vitis vinifera from leaf explants

Un calus friabil, morfogenetic, a fost bine dezvoltat dup 45 de zile de la inocularea in vitro a segmentelor nodale. Explantele dimensionate din poriunea limbului foliar n care nervura principal a frunzei a fost bine reprezentat au generat o cantitate mai redus de calus. De asemenea, multe explante s-au necrozat sau au dat natere unui calus moale, nefriabil care nu a mai putut fi utilizat n continuare (tabelul 29). n concluzie, putem meniona faptul c, pentru continuarea experienelor de inducere a variabilitii somaclonale, sursa de explant cea mai bun pentru producia de calus a fost reprezentat de segmentele nodale. Rata de inducere a calusului a variat n funcie de concentraia de ANA utilizat. Similar, i ali autori au observat o cretere a masei calusului prin adugarea n mediul de cultur a unei concentraii mai mari de auxin, respectiv 21,5 M ANA i a citochininei izopentiladenina (2 iP) n concentraie de 0,25 M (CACHI, 1984). Concentraia de ANA 10 mg/l, utilizat de noi n mediile de cultur, a dat natere unui calus friabil, n timp ce concentraia mai mic, respectiv de 5 mg/l ANA a dus la obinerea unui calus nefriabil i n cantitate foarte mic.

160

Rodica Pop, 2008 Tabelul 29 Comportare segmentelor nodale i a poriunilor de frunz utilizate ca explante n experienele de inducere a calusogenezei la zece soiuri de vi de vie Behaviour of nodal and leaf segments used as explants in callus induction in ten vine cultivars Tip explant Type explant Segmente nodale Poriuni de frunz Nodal segments Leaf segments foarte sporadic verry sporadic n mod frecvent frequent general pentru toate soiurile general for all varieties mic i foarte mic small and verry small

Specificare Specification Formarea de calus moale, friabil Soft and friable callus Necrozarea n mas a explantelor Mass necrosis of explants Cantitatea de calus format Callus quantity obtained

Variabil Variable

esutul calusal a crescut la suprafaa mediului nutritiv formnd o mas amorf de celule parenchimatice cu perei subiri, fr o anumit structur anatomic. Masa de calus a avut diferite culori: alb, glbuie, galben-verde, roie, cenuie. Adesea peste aceste culori s-au suprapus pigmentri de culoare roie, violacee, roz (fig. 28). De obicei, n cultura de repicare de lung durat, pe mediile care includ auxina 2,4 D, esuturile de calus i pierd pigmentarea i devin mai poroase (PALII, 2004). Formarea, creterea i aspectul calusului sunt dependente de natura i concentraia regulatorilor de cretere prezeni n mediul de cultur (CACHITA, 1984). Astfel, celulele esutului calusal pot fi de consistene diferite, dar n experienele noastre acestea s-au ncadrat n urmtoarele trei categorii: calusuri afnate (laxe), pline cu ap, nefriabile, grunjoase care se desfac uor n celule independente; calusuri de constituie medie, cu zone meristematice bine evideniate; calusuri compacte, cu zone de cambiu redus i vase conductoare.

161

Rodica Pop, 2008

Fig. 28. Culoarea masei de calus obinut pe mediul de inducere a calusogenezei MS suplimentat cu ANA 10 mg/l Callus color obtained on MS medium fortified with NAA 10 mg/l

Calusul embriogen are, de obicei, o culoare alb-glbuie, aspect friabil, microglomerular, cloroplastelor nisipos. Microsocopic, calusului culoarea deschis denot absena friabil,

caracteristice

embriogen.

Consistena

microglomerular este dat de conglomeratele de celule izodiametrice cu caracter meristematic (meristemoizi) i de embrioni glomerulari. Dimensiunile mici, aspectul de celule meristematice i forma izodiametric sunt nsuiri care permit recunoaterea precoce a calusurilor embriogene (PALADA, 2004). Pe mediul de cultur suplimentat cu 5,0 mg/l ANA, calusul a fost de culoare alb, alb-brunie, mai puin friabil. Masa de calus a avut o cretere lent (fig. 29). Pe mediul de cultur suplimentat cu 10 mg/l ANA, calusul a avut o consisten compact, cu mare densitate optic. Calusul a avut, de asemenea, mai multe culori: alb-lptoas, galben, galben-verde cu pigmentare roie, violacee (fig. 30).

162

Rodica Pop, 2008

Fig. 29. Cultur de calus obinut pe mediul MS 5,0 mg/l ANA Callus culture on medium MS 5,0 mg/l NAA

Fig. 30. Aspectul morfogenetic al calusului indus pe mediul de calusogenez MS suplimentat cu ANA n concentraie de 10 mg/l ANA Morphogenetic aspects of callus induction on MS medium fortified with NAA 10 mg/l Literatura menioneaz c, de regul, se genereaz mai mult calus din inoculi cultivai la ntuneric dect din cei crescui la lumin. Regiunile cu calus regenerativ sunt ns mai greu de depistat pe calusurile crescute la ntuneric. Pe baza acestor considerente, n experienele noastre de inducere a calusogenezei, formarea calusului s-a realizat la fotoperioda de 18 ore lumin/6 ore ntuneric, la temperatura de 22-240C.
163

Rodica Pop, 2008 Prima subcultur de calus a fost obinut dup patru sptmni. n masa de calus obinut pe mediul de cultur cu 10 mg/l ANA s-a observat formarea unui calus mixt, coninnd att calus regenerativ ct i neregenerativ. Din zona de calusul regenerativ s-au detaat fragmente care au fost pasate pe medii proaspete. Din poriunile de calus de tip regenerativ, pasate pe mediu adecvat s-au difereniat apoi plante (fig. 31).

Fig. 31. Organogeneza la nivelul calusului. A- calus lipsit de organogenez; B calus cu caulogenez Organogenesis of callus A non-organogenetic calli; B organogenetic calli

Pentru a evita pierderea capacitii de diviziune i moartea celulelor, calusul, a fost transferat, periodic, pe medii proaspete. Transferul s-a realizat la intervalul de 5-6 sptmni. n acest fel, rata de multiplicare i numrul de plante regenerate din calus sunt practic meninute, la acelai nivel n primele ase subculturi. ncepnd cu cea de a aptea subcultur, rata de regenerare exprimat prin numrul de plante regenerate/calus a manifestat o scdere evident. La unele specii cum sunt gramineele (CACHI, 1984), pierderea potenialului regenerativ al calusului survine mult mai devreme, adesea dup 1-2 pasri ale acestuia.

164

Rodica Pop, 2008 3.2.2.1. Influena soiului i a mediului de cultur asupra cantitii de calus format n experienele de inducere a calusogenezei Din titlul acestui subcapitol reiese clar c, n acest tip de experiene de calusogenez, s-a folosit un model bifactorial n care factorul A = soiul (cu zece graduri reprezentate de cele zece soiuri) iar factorul B = mediul de cultur (cu trei graduri reprezentate de mediul MS fr adaos de citochinine i MS cu dou tipuri de citochinine). Tabelul varianei pentru greutatea calusului (tabelul 30) relev, prin proba F, c soiurile au influenat uniform i semnificativ creterea masei calusului dup inducerea calusogenezei. n schimb mediul de cultur a avut un efect foarte semnificativ asupra creterii masei calusului n experienele de inducere a embriogenezei. Tabelul 30 Tabelul varianei. Greutatea calusului (g) n experiena bifactorial (10 x 3) cu soiuri de vi de vie i medii de cultur folosite n inducerea calusogenezei prin cultura in vitro de segmente nodale Table of variance in two way type of experiment (10 x 3). Influence of cultivar and culture medium upon induced callusogenesis
Cauza Cause Total Repetiia Variana Factorul A (soiul) Factorul B (mediul cultur) Interaciunea A x B Eroare SPA SS 0,35 0,001696 0,335985 0,006359 0,323421 0,006205 0,013 GL DL 89 2 29 9 2 18 58 s2 Proba F F test

de

0,001 0.162 0,018 0,0002

3,187* > 2,04; 2,72 729,341**>3,15; 4,98 1,555<1,81; 2,32

Analiza rezultatelor propriu-zise privind greutatea calusului obinut la cele zece soiuri de vi de vie pe cele trei medii de cultur sunt prezentate n tabelul 31. Datele din tabelul 31 pun n eviden faptul c, ntre cele zece soiuri testate exist diferene semnificative n ceea ce privete greutatea calusului format n urma inducerii calusogenezei pe trei medii de cultur. Soiurile Cabernet Sauvignon i
165

Rodica Pop, 2008 Riesling italian au cea mai mare cantitate de calus format la patru sptmni dup prima pasare, la cealalt extrem plasndu-se soiurile Napoca i Timpuriu de Cluj cu cele mai mici cantiti de calus observate (0,152-0,153 grame). Celelalte soiuri ocup poziii intermediare din punctul de vedere al acestui caracter. Tabelul 31 Greutatea calusului (g) n experiena bifactorial (10 x 3) cu soiuri de vi de vie i medii de cultur folosite n inducerea calusogenezei prin cultura in vitro de segmente nodale Quantity of callus (g) in two way experiments (10 x 3) with cultivars of Vitis vinifera and culture medium used in inducted callusogenesis from in vitro culture of nodal segments
Soiul Cultivar Feteasc alb Feteasc regal Riesling italian Muscat Ottonel Merlot Cabernet Sauvignon Traminer roz Timpuriu de Cluj Napoca Cetuia Media mediu cultur Mean of culture medium Mediul de cultur Culture medium MS 1,5 mg/l TDZ 0,170 de 0,168 de 0,175 de 0,179 de 0,178 de 0,185 d 0,173 de 0,159 e 0,162 de 0,170 de 0,172 N Media soi Mean of MS 2,5 mg/l cultivar BAP 0,070 g 0,157 CD 0,090 fg 0,166 B 0,080 fg 0,168 B 0,090 fg 0,165 BC 0,080 fg 0,166 B 0,100 f 0,182 A 0,103 f 0,162 BC 0,080 c 0,153 D 0,070 g 0,152 D 0,090 fg 0,157 CD 0,085 P

MS fr citochinine 0,230 bc 0,240 ab 0,250 a 0,225 bc 0,240 ab 0,262 a 0,210 c 0,220 bc 0,225 bc 0,212 c 0,231 M*

DS 5% pentru dou medii soi (SD 5% for two means of variety) = 0,008-0,010 DS 5% pentru dou medii mediu de cultur (SD 5% for two means of culture medium) = 0,014-0,015 DS 5% pentru dou medii soi x mediu de cultur (SD 5% for two means of interaction) = 0,025-0,031 *Diferenele dintre oricare dou variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative *The differences between any two values followed by at least a common letter are not significant

Mediului de cultur a avut cea mai mare influen asupra greutii calusului format. La mediul trei, MS cu adaos de BAP, greutatea medie a calusului format este semnificativ mai mic dect la primele dou medii. Rezultatele sunt normale dac se are n vedere faptul c citochininele, n mod general, induc caulogeneza i nu
166

Rodica Pop, 2008 favorizeaz creterea calusului dect atunci cnd sunt folosite n concentraii foarte mari. Analiza datelor din interiorul tabelului 31 confirm semnificaia ridicat, din punct de vedere statistic, a efectului interaciunii asupra greutii masei calusului la patru sptmni dup prima pasare. Se observ, din aceste date, c cele mai mari cantiti de calus se obin pe mediul de cultur MS fr citochinine. Astfel, pe acest mediu de cultur soiul Cabernet Sauvignon formeaz un calus cu greutatea de 0,262 grame, urmat de soiul Riesling italian cu un calus cu greutate de 0,250 grame. Cele mai mici cantiti de calus s-au obinut la soiul Traminer roz, greutatea calusului fiind de 0,210 grame. Se poate concluziona, din analiza datelor prezentate n acest capitol, c greutatea calusului format n urma primei pasri pe medii calusogene, la cele zece soiuri de vi de vie studiate, depinde n mod decisiv de mediu de cultur i ntr-o mic msur de interaciunea soi x mediu de cultur. Adugarea n mediu de cultur MS a 1,5 mg TDZ/l duce la diferene semnificative n greutatea calusului format, dar i la deosebiri evidente de calitate a calusului. Pe mediul MS cu TDZ, calusul format este mai friabil i are o capacitate calusogen mai ridicat. 3.2.3. Rezultate experimentale privind regenerarea de neoplantule din calus meninut timp ndelungat n cultur Capacitatea organogen sau embriogen a esutului calusal este dependent de factorii endogeni i exogeni, de numrul pasrilor, de condiiile de cultur i de vrsta calusului. Literatura citeaz cazuri n care calusurile repicate periodic, chiar i dup o perioad de cinci ani i-au meninut potenialitatea ridicat de a regenera plante. n cazul calusului obinut de noi la via de vie, capacitatea regenerativ s-a meninut pentru o perioad mult mai scurt, de circa 7-8 luni. NABORS (1982), citat de CACHI (2000), distinge un calus de tip regenerativ, embriogen care d natere la noi plante i un calus de tip neregenerativ, neembriogen care are o cretere luxuriant, din el difereniindu-se rdcini, uneori mugurai, dar niciodat plante ntregi.
167

Rodica Pop, 2008 Calusul embriogen, regenerativ este dens optic, translucid sau opac, de culoare alb-lptoas, spre galben sau galben-verde. Citologic, se remarc zone compacte, cu celule nedifereniate, ce pot genera embrioni sau embrioizi, din care apoi se vor dezvolta plante complet conformate. Calusul neembriogen este constituit dintr-o mas cristalin, transparent, de culoare alb, brunie sau verde. Acest tip de calus are o consisten mai lax, fiind mai friabil, desfcndu-se mai uor n pachete de celule. Regiunile friabile prezint celule mari, mult vacuolizate. Din aceste regiuni pot apare rdcini, mai rar mugurai, dar nu i plante. S-a constat c tipul de calus regenerativ embriogen tinde s devin neregenerativ neembriogen. Dup producerea acestei schimbrii procesul este definitiv, ntruct cele dou forme sau tipuri de calus, diferite funcional, nu sunt interconvertibile. De asemenea, cele dou tipuri de calus necesit hormoni diferii, n doze variate, att pentru impulsionarea i susinerea creterii ct i pentru difereniere. In experienele noastre, dup circa 7 8 luni, de pasri repetate, calusul regenerativ a devenit neregenerativ. Dup acest moment calusul i-a meninut creterea abundent la fiecare pasare pe mediu proaspt. Creterea acestui tip de calus a fost continuat pe o durat de circa patru ani n cultura in vitro (fig. 32). Dei n literatura se citeaz cazuri cu totul izolate n care calusul neregenerativ poate forma regiuni regenerative n anumite condiii de mediu, acest lucru nu a fost semnalat de noi n experienele de inducere a variabilitii somaclonale la via de vie prin regenerarea de neoplantule din calus meninut timp ndelungat n cultur.

3.2.3.1. Numrul de neoplantule regenerate Experienele de regenerare de neoplantule din calus meninut timp ndelungat n cultur (3-4 pasri) au fost i ele de tip bifactorial cuprinznd cele zece soiuri de vi de vie menionate anterior i trei medii de cultur MS la care s-au adugat cantiti diferite de TDZ: 0,5 mg/l, 1,0 mg/l i 2,0 mg/l. Aceste variante de mediu au fost alese pe baza datelor din literatura de specialitate care menioneaz faptul c adaosul de cantiti mici i moderate de TDZ n mediul de cultur stimuleaz regenerarea de

168

Rodica Pop, 2008 neoplantule din calusul organogen, mai ales la speciile lenoase i recalcitrante.

Fig. 32. Creterea luxuriant a calusului neregenerativ Luxuriantly growing of non regenerative callus

Din tabelul 32 (tabelul varianelor) se observ c toi factorii experimentali (soi, mediu de cultur), precum i interaciunea soi x mediu de cultur au avut influene semnificative asupra numrului de neoplantule regenerate. Cel mai puternic efect asupra numrului de neoplantule regenerate l-a avut factorul B, respectiv mediul de cultur, cu F calculat = 21484,8, foarte semnificativ. Sinteza rezultatelor obinute privind numrul de lstari regenerai este prezentat n tabelul 33. Analiznd influena soiului asupra numrului de lstari regenerai se observ, din datele tabelului 33, c aceasta este relativ omogen, toate soiurile regenernd un numr de 8,13 pn la 9,60 lstari/calus regenerativ. Dei la prima vedere acest numr pare mare, trebuie menionat faptul c, n comparaie cu numrul de regenerani din calus nregistrat la alte specii (de exemplu la Kigelia pinnata L, THOMAS i colab., 2004; la Saintpaulia ionantha Wendl., MITHILA i colab., 2003; la Lisianthus

russelianus Hook, POP i colab., 2007), aceste valori pot fi considerate ca mici sau moderate.

169

Rodica Pop, 2008

Tabelul 32 Tabelul varianei. Numrul de neoplantule regenerate n experiena bifactorial (10 x 3) cu soiuri de vi de vie i medii de cultur folosite n regenerarea de neoplantule din calus Table of variance. Number of plant regenerated from callus in two way experiment (10 x 3) with cultivars of Vitis vinifera on culture media
Cauza Cause Total Repetiii Variante Factorul A Factorul B Interaciunea A x B Eroare SPA SS 3233,42 5,56 3223,57 16,90 3177,12 29,55 4,29 GL DF 89 2 29 9 2 18 58 1,9 1588,6 1,6 0,1 25,4** > 2,04; 2,72 21484,8**> 3,15; 4,98 22,2**> 1,81; 2,32 s2 Proba F F test

Dei ntre soiuri exist diferene semnificative, acestea nu afecteaz omogenitatea datelor, ele bazndu-se pe valori ale DS 5% foarte reduse pentru un caracter cum este numrul de regenerani (0,14-0,17). Situaia este cu totul alta n ceea ce privete efectul mediului asupra numrului de regenerani. De la nceput trebuie menionat faptul c adaosul de TDZ de 2,0 mg/l mediu de cultur are un efect negativ asupra numrului de regenerani format datorit faptului c, la aceast concentraie de TDZ, mediul favorizeaz formarea de calus i nu formarea de neoplantule (fig. 33). Cel mai stimulativ efect asupra numrului de neoplantule regenerate l-a avut mediul cu adaos mic de TDZ (0,5 mg/l) la care se obin cele mai mari valori ale numrului de regenerani (fig. 34).

170

Rodica Pop, 2008 Tabelul 33 Numrul de neoplantule regenerate n experiena bifactorial (10 x 3) cu soiuri de vi de vie i medii de cultur folosite n regenerarea de neoplantule din calus Number of plants regenerated in two way experiment (10 x 3) with Vitis vinifera cultivars and culture media
Mediul de cultur Culture medium MS 2,0 mg/l TDZ 4,20 gh 3,70 h 4,50 g 3,80 h 3,90 gh 4,30 gh 4,50 g 3,80 h 4,50 g 3,97 gh 4,12 P

Soiul Cultivar Feteasc alb Feteasc regal Muscat Ottonel Riesling italian Traminer roz Cabernet Sauvignon Napoca Cetuia Timpuriu de Cluj Merlot Media mediu cultur Mean of culture medium

MS 1,0 mg/l TDZ 4,50 g 6,50 d 5,30 f 5,40 f 4,50 g 6,30 d 5,50 ef 5,70 def 5,80 def 6,10 de 5,56 N*

MS - 0,5 mg/l TDZ 15,70 c 18,60 a 18,70 a 18,60 a 17,50 b 17,50 b 15,80 c 17,30 b 16,80 b 17,30 b 17,38 M

Media soi Mean of cultivar 8,13 F 9,60 A 9,50 AB 9,27 C 8,63 E 9,37 BC 8,60 E 8,93 C 9,03 CD 9,12 D

DS 5% pentru dou medii soi (SD 5% for two means of variety) = 0,14-0,17 DS 5% pentru dou medii de cultur (SD 5% for two means of culture medium) = 0,28-0,30 DS 5% pentru dou medii soi x mediu de cultur (SD 5% for two means of interaction) = 0,57-0,69 * Diferenele dintre oricare dou variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative *The differences between any two values followed by at least a common letter are not significant

Mediul cu concentraie moderat de TDZ (1,0 mg/l) are valori ale numrului de regenerani mai mari dect cele obinute pe mediul doi, dar nedifereniate statistic de acestea. Se poate afirma c, la via de vie, concentraiile moderate i mari de TDZ ale mediului de cultur influeneaz negativ numrul de neoplantule regenerate din calus organogen.

171

Rodica Pop, 2008

Fig. 33. Influena concentraiei de TDZ (2,0 mg/l) asupra numrului de neoplantule regenerate in vitro Influence of concentration TDZ (2,0 mg/l) upon number of plants regenerated in vitro

Fig. 34. Influena concentraiei de TDZ (0,5 mg/l) asupra numrului de neoplantule regenerate in vitro Influence of concentration TDZ (0,5 mg/l) upon the number of plants regenerated in vitro
172

Rodica Pop, 2008 3.2.3.2. Lungimea lstarilor (neoplantulelor) regenerai Datele tabelului 34 (tabelul varianelor) prezint semnificaia aciunii celor doi factori experimentali i a interaciunii dintre acetia asupra lungimii regeneranilor. Se observ c, statistic, doar factorul B (mediul de cultur) a avut aciune semnificativ asupra lungimii lstarilor regenerai, soiul i interaciunea dintre soi i mediu avnd F calculat mai mic dect F teoretic. Tabelul 34 Tabelul varianei. Lungimea regeneranilor (cm) n experiena bifactorial (10 x 3) cu soiuri de vi de vie i medii de cultur folosite n regenerarea calusului Table of variance. Length of regenerated plants (cm) in two way experiment (10 x 3) with cultivars of Vitis vinifera and culture media used in callus regeneration
Cauza Cause Total Repetiii Variante Factorul A (soiul) Factorul B (mediul de cultur) Interaciunea A x B Eroare SPA SS 59,74 0,03467 57,9773 0,27956 57,0127 0,68511 1,7 GL DF 89 2 29 9 2 18 58 s2 Proba F F test

0,03 28,51 0,04 0,03

1,04 < 2,04; 2,72, 954,60**>3,15; 4,98 1,27<1,81, 2,32

Tabelul 35 prezint sinteza rezultatelor experimentale privind lungimea lstarilor regenerai din calus la cele zece soiuri de vi de vie pe trei medii de cultur. Dei conform probei F soiul i interaciunea soi x mediu de cultur nu ar fi trebuit analizate n acest tabel de sintez, s-a preferat totui prezentarea lor, deoarece conform testului de semnificaie folosit (Duncan), ntre mediile soiurilor precum i ntre valorile individuale ale variantelor reieite din combinarea gradurilor soiului cu gradurile mediului exist diferene semnificative. Acestea se datoresc, cu precdere tipului de test de semnificaie folosit care a dus la calcularea unor valori DS 5% exprimate n sutimi de centimetru.

173

Rodica Pop, 2008 Tabelul 35 Lungimea (cm) a neoplantulelor regenerate n experiena bifactorial (10 x 3) cu soiuri de vi de vie i medii de cultur folosite n regenerarea de neoplantule din calus Length (cm) of plants in the two way experiment (10 x 3) with cultivars of Vitis viniffera and culture media used in plant regeneration from callus
Mediul de cultur Media soi Culture medium Mean of MS 1 mg/l TDZ MS 2 mg/l TDZ MS- 0,5 mg/l TDZ cultivar Feteasc alb 1,47 bc 0,80 def 2,60 a 1,62 B Feteasc regal 1,37 c 0,70 ef 2,80 a 1,62 B Muscat Ottonel 1,60 bc 0,80 def 2,73a 1,71 A Riesling italian 1,60 bc 0,60 f 2,73 a 1,64 B Traminer roz 1,57 bc 0,57 f 2,60 a 1,58 C Cabernet Sauvignon 1,70 b 1,00 d 2,60 a 1,77 A Napoca 1,63 bc 0,63 ef 2,53a 1,60 B Cetuia 1,60 bc 0,60 f 2,67 a 1,62 B Soiul Cultivar Timpuriu de Cluj Merlot Media mediu cultur Mean of culture medium 1,60 bc 1,50 bc 1,56 N* 0,70 ef 0,87 de 0,73 P 2,67 a 2,77 a 2,67 M 1,66 B 1,71 A

DS 5% pentru dou medii soi (SD 5% for two means of variety) = 0,08-0,110 DS 5% pentru dou medii de cultur (SD 5% for two means of culture medium) = 0,17-0,18 DS 5% pentru dou medii soi x mediu de cultur (SD 5% for two means of interaction) = 0,28-0,35 * Diferenele dintre oricare dou variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative *The differences between any two values followed by at least a common letter are not significant

Analiza influenei mediului asupra lungimii lstarilor regenerai urmeaz aproape acelai model ca i cel descris la numrul de lstari regenerai. Concret, cea mai mare lungime a lstarilor regenerai se nregistreaz la mediul cu cea mai sczut concentraie de TDZ (0,5 mg/l). Mediile cu concentraii moderate (1,0 mg/l) i mari (2,0 mg/l) de TDZ duc la obinerea unor lstari scuri i foarte scuri comparativ cu varianta trei de mediu. Pe baza acestor date se poate conchide c, la via de vie, cel mai stimulativ mediu de cultur pentru obinerea din calus a unui numr mare de regenerani i de dimensiuni mari l constituie mediul cu adaos redus de TDZ (0,5

174

Rodica Pop, 2008 mg/l). n figura 35 se observ diferenierea lstarilor cu lungimi cuprinse ntre 2,532,80 cm pe mediul de cultur menionat anterior.

Fig. 35. Diferenierea lstarilor de vi de vie pe mediul de cultur MS suplimentat cu TDZ - 0,5 mg/l Shoot differentation on MS medium fortified with 0,5 mg/l TDZ

n finalul acestui subcapitol considerm necesar s accentum urmtoarele aspecte: La via de vie, concentraiile moderate i mari de TDZ ale mediului de

cultur influeneaz negativ numrul de neoplantule regenerate din calusul organogen. Trebuie menionat faptul c efectul cel mai stimulativ asupra numrului de

regenerani i a lungimii acestora l are mediul cu adaos sczut de TDZ (0,5 mg/l). Pe un astfel de mediu neoplantulele formate sunt n numr foarte mare, de lungimi apreciabile, dar total lipsite de rdcini (fig. 36). Soiul de vi de vie nu a avut, practic, influene semnificative asupra

numrului regeneranilor obinui i nici asupra lungimii acestora ceea ce ne permite s afirmm c modul de comportare al calusului regenerativ, pe medul de cultur cu adaos de TDZ, este general valabil pentru toate soiurile de vi de vie ncercate.

175

Rodica Pop, 2008

Fig. 36. Neoplantule de vi de vie formate pe mediul MS + 0,5 mg/l TDZ, dup opt sptmni de cultur in vitro Neoplantlets formed in vitro in Vitis vinifera on MS + 0,5 mg/l TDZ medium, 8 weeks after initiation of culture

3.2.4. Rezultate privind identificarea, la nivel molecular, a variabilitii somaclonale indus prin regenerarea din calus meninut timp ndelungat n cultur 3.2.4.1. Rezultate privind extracia i cuantificarea ADN-ului

Extracia de ADN s-a realizat pe baza protocolului elaborat de LODHI i colab, modificat (POP i colab., 2003). Cantitatea de ADN obinut a fost corespunztoare (220 ng/l i 1947 ng/l), avnd n vedere c pentru amplificare s-au utilizat 50 ng. Puritatea ADN-ului a fost, de asemenea, corespunztoare fiind cuprins ntre 1,7 i 2,0. Rezultatele numerice privind cantitatea de ADN i puritatea acestuia la neoplantulele regenerate din calus care au prezentat variabilitate somaclonal, sunt prezentate n tabelul nr. 36. Extracia de ADN s-a fcut, la neoplantulele regenerate, din calus din subcultura a 5-a, a 10-a i a 15-a, n tabelul 36 fiind prezentate rezultatele privind cantitatea i puritatea ADN-ului extras din neoplantulele regenerate din calus la a 15-a subcultur. ADN-ul extras la a 5-a i a 10-a subcultur nu a prezentat nici un fel de polimorfism la nivel molecular, ceea ce denot c, n fazele respective de regenerare,
176

Rodica Pop, 2008 nu se manifestase variabilitatea somaclonal. Tabelul 36 Cantitatea i puritatea ADN la somaclonele identificate la cinci soiuri de vi de vie The concentration and purity of DNA in somaclones identified in five Vitis vinifera cultivars
Somaclona Somaclon variation CR1 CR2 CR3 F1 Mr1 Mr2 Mr3 Mr4 Mr5 T1 Ri1 Ri2 Ri3 Cantitatea de ADN ng/l Concentration of DNA ng/l 317 245 449 210 244 602 1091 1947 633 228 250 339 220 Puritate ADN (A260/A280) Ratio of absorbance (A260/A280) 1,7 1,8 1,7 1,7 1,7 1,9 1,9 2,0 1,9 1,7 1,9 1,8 1,9

Soiul Cultivar Cabernet Sauvignon Feteasc alb

Merlot

Traminer roz Riesling italian

3.2.4.2. Rezultate privind amplificarea i electroforeza produilor de reacie Pentru amplificarea probelor s-au folosit cei 22 primeri care au dat benzi polimorfice n cazul extracie de ADN pentru soiurile de vi de vie recoltate din cmp (tabelul 6 ). Amplificarea probelor s-a fcut n trei repetiii pentru fiecare primer. Aa cum s-a mai menionat, n subculturile cinci i zece regeneranii nu au prezentat variabilitate la nivel molecular. S-a constatat c neoplantule regenerate la subcultura a 15-a prezint variabilitate la nivel molecular. Aceast variabilitatea a fost observat la un numr mic de soiuri (cinci), acestea prezentnd un numr mic de somaclone. Cele mai multe somaclone au fost identificate la soiul Merlot (cinci).

177

Rodica Pop, 2008 n gelurile de agaroz mai nti au fost pipetate probele de ADN aparinnd plantei mam, urmate apoi de probele de ADN ale somaclonelor. Notaiile din imagini fiind urmtoarele: Cabernet Sauvignon CR (planta mam), CR1, CR2, CR3; Feteasc alb - F (planta mam), F1; Merlot Mr (planta mam), Mr1, Mr2, Mr3, Mr4, Mr5; Traminer roz T (planta mam), T1 i Riesling italian Ri (planta mam) Ri1, Ri2, Ri3. Fragmentele rezultate prin amplificarea cu primerii polimorfici au avut lungimea cuprins ntre 200 i 2000 pb, majoritatea avnd ntre 300 i 1400 pb. Numrul cel mai mare de benzi polimorfice au fost obinute cu primerul OPX 03 (12 benzi) (fig. 37), cu primerul OPE 14 (11 benzi polimorfice), OPA 04 (10 benzi polimorfice), PB 6 (10 benzi polimorfice), (fig. 38), PB 1 (9 benzi polimorfice) (fig. 39), primerul PB 3 (7 benzi polimorfice) (fig. 40), primerul PB 5 (8 benzi polimorfice) (fig. 41), primerul 70.08 (6 benzi polimorfice) (fig. 42). Ceilali primeri utilizai au format de asemenea ntre ase i nou benzi polimorfice.

Fig. 37. Produii de amplificare obinui cu primerul OPX 03 la somaclonele de vi de vie analizate
178

Rodica Pop, 2008 Amplification products obtained with primer OPX 03 in somaclones of Vitis vinifera analysed

Fig. 38. Produii de amplificare obinui cu primerul PB 6 la somaclonele de vi analizate Amplification products obtained with primer PB 6 im somaclones of Vitis vinifera analysed

Fig. 39. Produii de amplificare obinui cu primerul PB 1 la somaclonele de vi de vie de vie analizate

179

Rodica Pop, 2008 Amplification products obtained with primer PB 1 in somaclones of Vitis vinifera analysed

Fig. 40. Produii de amplificare obinui cu primerul PB 3 la somaclonele de vi de vie analizate Amplification products obtained with primer PB 3 in somaclones of Vitis vinifera analysed

Fig. 41. Produii de amplificare obinui cu primerul PB 5 la somaclonele de vi de vie analizate

180

Rodica Pop, 2008 Amplification products obtained with primer PB 5 in somaclones of Vitis vinifera analysed

Fig. 42. Produii de amplificare obinui cu primerul 70.08 la somaclonele de vi de vie analizate Amplification products obtained with primer 70.08 in somaclones of Vitis vinifera analysed

Din figurile prezentate reiese n mod clar c, la toate somaclonele analizate, exist diferene notabile de structur genetic, relevate de markeri RAPD. Dendrograma realizat pe baza distanelor genetice dintre soi i somaclonele sale ilustreaz i mai clar msura n care, la nivel molecular, somaclonele se deosebesc de soiurile din care provin. Datele primare, obinute cu ajutorul programului Total Lab 100 au fost prelucrate cu programul FreeTree (HAMPL i colab., 2001), care a calculat distanele genetice pe baza coeficientului Jaccard i a generat dendrograma.

181

Rodica Pop, 2008 Distanele genetice calculate sunt prezentate n tabelul 37. Cu ct valorile distanelor genetice din tabel sunt mai mici, cu att speciile i somaclonele sunt mai strns nrudite. Apropierea genetic ntre soiurile de vi de vie i somaclonele identificate n aceste soiuri, stabilit pe baza matricei distanelor genetice i a algoritmului Neighbor Joining Tree, sunt prezentate n figura 43 sub forma unei dendrograme. n cadrul dendrogramei se evideniaz faptul c soiul de vi de vie i somaclonele obinute din acel soi sunt apropiat grupate. De asemenea, se constat c soiurile Cabernet Sauvignon i Merlot, mpreun cu somaclonele lor sunt reprezentate n acelai subgrup, la fel ca i n cazul dendrogramei obinute pentru cele zece soiuri de vi de vie analizate in vivo (vezi fig. 22). Un alt subgrup este format din soiurile i somaclonele de Feteasc alb i Riesling italian, similar cu grupul reprezentat n dendrograma celor zece soiuri de vi de vie analizate. Faptul c somaclonele fiecrui soi sunt strict reprezentate n acelai grup atest acurateea rezultatelor experimentale obinute. Pe de alt parte, analiza dendrogramei n cadrul fiecrui grup relev faptul c somaclonele sunt cu adevrat diferite din punctul de vedere al structurii genetice, att n interiorul grupului ct i ntre grupe. Se poate afirma, pe baza rezultatelor discutate n acest subcapitol c analizele RAPD reprezint un instrument sensibil de identificare, la nivel molecular, a variabilitii somaclonale aprut la via de vie n condiiile meninerii ndelungate a calusului prin subculturi in vitro. Este evident c somaclonele identificate cu ajutorul analizelor RAPD vor trebui, n mod obligatoriu, verificate n condiii in vivo pentru a vedea dac variabilitatea observat la nivel molecular poate fi observat i la nivel fenotipic. De asemenea, este important de vzut dac variabilitatea fenotipic eventual observat se refer la caractere cantitative sau calitative de interes n ameliorarea viei de vie i n ce msur aceast variabilitate se transmite ereditar prin nmulire sexuat sau, descendenilor vegetativi, prin altoire.

182

Tabelul 37 Distanele genetice calculate pentru cele cinci soiuri de vi de vie i somaclonele lor Genetic distances established for cultivars and theise somaclones of Vitis vinifera

CR CR1 CR2 CR3 F F1 Mr Mr1 Mr2 Mr3 Mr4 Mr5 T T1 Ri Ri1 Ri2 Ri3

CR 0,00 0,75 0,804 0,722 0,600 0,381 0,684 0,548 0,571 0,581 0,565 0,523 0,638 0,338 0,500 0,174 0,250 0,270

CR1 0,00 0,00 0,782 0,800 0,619 0,409 0,645 0,457 0,641 0,576 0,609 0,567 0,656 0,368 0,548 0,208 0,303 0,284

CR2 0,00 0,00 0,00 0,860 0,655 0,450 0,655 0,574 0,623 0,581 0,565 0,523 0,638 0,318 0,579 0,266 0,290 0,311

CR3 0,00 0,00 0,00 0,00 0,672 0,443 0,644 0,492 0,639 0,597 0,581 0,538 0,655 0,294 0,542 0,242 0,328 0,306

F 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,492 0,639 0,538 0,689 0,729 0,712 0,689 0,650 0,338 0,541 0,250 0,355 0,355

F1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,422 0,468 0,516 0,500 0,484 0,469 0,452 0,344 0,417 0,288 0,316 0,339

Mr 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,587 0,717 0,700 0,772 0,689 0,650 0,379 0,541 0,214 0,313 0,235

Mr1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,609 0,672 0,603 0,561 0,500 0,379 0,469 0,288 0,400 0,273

Mr2 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,750 0,891 0,767 0,619 0,343 0,590 0,239 0,381 0,338

Mr3 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,807 0,750 0,683 0,388 0,574 0,261 0,365 0,344

Mr4 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,793 0,667 0,394 0,583 0,211 0,393 0,308

Mr5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,594 0,403 0,540 0,275 0,359 0,299

T 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,324 0,576 0,217 0,317 0,361

T1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,250 0,288 0,250 0,250

Ri Ri1 Ri2 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,254 0,00 0,00 0,322 0,353 0,00 0,322 0,302 0,388

Ri3 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Fig. 43. Dendrograma obinut la soiurile i somaclonele de vi de vie analizate Dendrogram of cultivars and somaclones of Vitis vinifera analysed

Rodica Pop, 2008

CAPITOLUL IV

CONCLUZII

4.1. CONCLUZII REFERITOARE LA VARIABILITATEA, LA NIVEL MOLECULAR A MATERIALULUI BIOLOGIC PROVENIT IN VIVO In urma cercetrilor noastre efectuate la nivel molecular la cele zece soiuri de vi de vie provenite din cinci localiti, se desprind urmtoarele concluzii:

4.1.1. n analizele RAPD o condiie esenial o constituie obinerea unui ADN n cantiti corespunztoare i de puritate mare. Dintre cele trei protocoale de extracie utilizate s-a dovedit c protocolul C a dat cele mai bune rezultate. Cu ajutorul acestui protocol, puritatea ADN-ului a avut valori cuprinse ntre 1,7 i 2, puritate ce a permis utilizarea lui n manipulrile ulterioare. Includerea n tamponul de extracie a inhibitorilor de fenoloxidaz, cum ar fi acidul dietilenditiocarbamic (DIECA), a antioxidanilor acidul ascorbic sau a polivinil pirolidonei (PVP) au eliminat brunificarea extractului. 4.1.2. Din analiza varianei, aplicat rezultatelor de extracie a ADN, a reieit c toi cei trei factori experimentali (soiul, metoda de extracie i localitatea), au influenat distinct semnificativ cantitatea de ADN extras. 4.1.3. ntre soiuri exist diferene asigurate statistic n ceea ce privete cantitatea de ADN obinut, indiferent de metoda de extracie aplicat, ceea ce sugereaz c genotipul, la via de vie, influeneaz n mod hotrtor cantitatea de ADN ce poate fi extras prin metode curent folosite n acest scop. Metoda de extracie a avut, de asemenea, o influen semnificativ asupra cantitii de ADN ce se poate obine, indiferent de localitatea de experimentare. 185

Rodica Pop, 2008

4.1.4. Datele rezultate din analiza varianei pentru experiena trifactorial arat c cei trei factori experimentali au influenat distinct semnificativ i puritatea ADNului. Aceast semnificaie se pstreaz i n cazul interaciunilor duble soi x metod de extracie, localitate x metod de extracie, localitate x soi, ca i pentru interaciunea tripl soi x metod de extracie x localitate. 4.1.5. Calcularea ecuaiei de regresie relev faptul c relaia dintre cantitate i puritate este liniar, datele individuale grupndu-se destul de strns n jurul liniei de regresie, n ambele cazuri: r calculat pe baza criteriului soi x metod de extracie i pe baza criteriului localitate x metod de extracie. Corelaia dintre cele dou variabile este direct i pozitiv, creterea cantitii de ADN ducnd la o cretere a puritii acestuia (r = 0,89**). 4.1.6. Coeficientul de corelaie r = 0,86** indic, de asemenea, o legtur direct ntre mediile localitilor i cantitatea de ADN extras, ceea ce duce n mod automat la sporirea semnificativ a puritii acestuia. 4.1.7. Alegerea primerilor s-a dovedit destul de dificil, deoarece din cei 39 de primeri utilizai numai 22 au dat benzi polimorfice distincte.

4.1.8. Adugarea PVP-ului n concentraie de 2% n tamponul de amplificare a probelor s-a dovedit, de asemenea, benefic. PVP-ul a redus efectul inhibitor al polifenolilor i a facilitat marcarea benzilor necesare analizei statistice. 4.1.9. Soiurile analizate se difereniaz la nivel molecular, respectndu-se clasificarea sistematic a acestora pe baza caracteristicilor lor morfo-fiziologice (precocitate, culoarea boabelor, pubescen) i a clasificrii din punct de vedere ecologo-geografic, respectiv prolesuri. 4.1.10. Distanele genetice cele mai mari au fost nregistrate ntre soiurile total nenrudite, n timp ce distanele genetice mici arat o nrudire mai mult sau mai puin

186

Rodica Pop, 2008 apropiat ntre soiurile respective, analiza RAPD fiind n general n concordan cu datele din taxonomia clasic. 4.1.11. Dendrograma obinut relev faptul c soiul Feteasc regal este foarte apropiat din punct de vedere genetic de soiul Feteasc alb, confirmnd ipoteza c cele dou soiuri au o origine comun. Soiul Cabernet Sauvignon i Merlot sunt, de asemenea, foarte apropiate din punct de vedere genetic, lucru confirmat i de ali autori. 4.1.12. Analiznd acelai soi dar care a provenit din staiuni diferite s-a constat c nu exist diferene ntre ele, acestea fiind omogene, ceea ce sugereaz c producerea materialului sditor s-a fcut n mod corespunztor.

4.1.13. Analizele RAPD s-au dovedit un instrument valoros de determinare a polimorfismului genetic intraspecific la Vitis vinifera.

4.2. CONCLUZII REFERITOARE LA MATERIALUL BIOLOGIC OBINUT IN VITRO

4.2.1. Numrul de lstari obinui la micropropagarea prin lstrire axilar la via de vie este influenat hotrtor de genotip i mediul de cultur. 4.2.2. Soiurile cu cea mai ridicat capacitate de reacie la cultura in vitro din segmente nodale par a fi Cabernet Sauvignon i Traminer roz, iar mediul de cultur cel mai adecvat acestui scop s-a dovedit a fi MS 2,5 mg/l BAP. 4.2.3. Deoarece mediul de cultur are cea mai puternic influen asupra numrului de neoplantule obinut la micropropagarea prin lstrire axilar, se ntlnesc i cazuri de interaciuni ntre factori care duc la rezultate ce aparent contrazic cele spuse mai sus (exemplu, la soiul Riesling italian, soi pentru vinuri albe, micropropagat pe MS-2,5 mg/l BAP numrul de lstari obinui este imediat n apropierea celui

187

Rodica Pop, 2008 realizat la soiul Cabernet Sauvignon). Aceasta este o dovad n plus c interaciunea soi x mediu de cultur influeneaz n mod decisiv caracterul analizat 4.2.4. Soiul, mediul de cultur i localitatea de provenien a soiului au influenat n mod semnificativ lungimea lstarilor obinui prin cultura in vitro de segmente nodale la via de vie. 4.2.5. Cea mai accentuat influen asupra caracterului menionat mai sus o are mediul de cultur, de departe mediul MS 2,5 mg/l BAP ducnd la obinerea celor mai bine dezvoltate neoplantule obinute prin cultura in vitro de segmente nodale, la diferene semnificative de oricare alte variante. 4.2.6. Faptul c i ntre localiti exist diferene semnificative n ceea ce privete lungimea lstarilor obinui prin micromultiplicarea din segmente nodale poate fi explicat prin nivelele diferite de interaciune dintre genotip i mediul su specific, diferene ce se concretizeaz n probabilitatea mai accentuat sau mai puin accentuat la culturile in vitro. 4.2.7. Soiul de vi de vie, mediul de cultur utilizat i locul de provenien al cultivarului ce a furnizat explantul, precum i interaciunile dintre aceti trei factori au influenat n mod semnificativ numrul de noduri/explant obinut n urma micromultiplicrii prin segmente nodale. 4.2.8. n toate cazurile analizate, att pentru influenele factorilor, ct i pentru influenele interaciunilor dintre acetia, numrul de noduri/neoplantul a reprodus fidel modelul de variaie nregistrat pentru lungimea lstarilor (neoplantulelor). 4.2.9. Rezultatele noastre confirm observaia general c, la via de vie, numrul de noduri/neoplantul este corelat direct i pozitiv cu dimensiunile (lungimea) neoplantulelor respective, lstarii mai lungi avnd tendina de a forma un numr mai mare de noduri.

188

Rodica Pop, 2008 4.2.10. Din analiza datelor privind influena soiului i a mediului de cultur asupra cantitii de calus format n experienele de inducere a calusogenezei, se poate concluziona c greutatea calusului format n urma primei pasri pe medii calusogene, la cele zece soiuri de vi de vie studiate, depinde n mod decisiv de mediu de cultur i ntr-o mic msur de interaciunea soi x mediu de cultur. 4.2.11. Adugarea n mediu de cultur MS a 1,5 mg TDZ/l nu duce la diferene semnificative n greutatea calusului format, dar duce la deosebiri evidente de calitate a calusului. Pe mediul MS cu TDZ, la aceeai greutate a calusului ca i n cazul mediului fr TDZ, calusul format pe mediul cu TDZ este mai puin friabil i are o capacitate calusogen mai ridicat. 4.2.12. La via de vie concentraiile moderate i mari de TDZ ale mediului de cultur influeneaz negativ numrul de neoplantule regenerate din calusul organogen. Dimpotriv, un efect stimulativ asupra numrului de regenerani i a lungimii acestora l are mediul cu adaos sczut de TDZ (0,5 mg/l). Pe un astfel de mediu neoplantulele formate sunt n numr foarte mare, de lungimi apreciabile, dar total lipsite de rdcini. 4.2.13. Soiul de vi de vie nu a avut, practic, influene semnificative asupra numrului regeneranilor obinui i a lungimii acestora ceea ce ne permite s afirmm c modul de comportare al calusului regenerativ pe medul de cultur cu adaos de TDZ este general valabil pentru toate soiurile de vi de vie ncercate. 4.2.14. Analiza benzilor formate prin migrarea n gel a ADN-ului amplificat cu primeri RAPD, arat clar c, la toate somaclonele analizate, exist diferene notabile de structur genetic fa de soiurile din care provin.

4.2.15. n cadrul dendrogramei se evideniaz faptul c soiul de vi de vie i somaclonele obinute din acel soi sunt strns grupate. De asemenea, se constat c soiurile Cabernet Sauvignon i Merlot, mpreun cu somaclonele lor sunt reprezentate n acelai subgrup, la fel ca i n cazul dendrogramei obinute pentru cele zece soiuri de vi de vie analizate in vivo. Soiurile i somaclonele de Feteasc alb i Riesling

189

Rodica Pop, 2008 italian formeaz un subgrup similar cu cel reprezentat n dendrograma celor zece soiuri de vi de vie analizate.

4.2.16. Se poate afirma, pe baza rezultatelor prezentate c analizele RAPD reprezint un instrument sensibil de identificare la nivel molecular a variabilitii somaclonale aprut la via de vie n condiiile meninerii ndelungate a calusului i subculturilor in vitro. 4.2.17. Este evident c somaclonele identificate cu ajutorul analizelor RAPD vor trebui, n mod obligatoriu verificate n condiii in vivo pentru a vedea dac variabilitatea observat la nivel molecular poate fi observat i la nivel fenotipic. De asemenea, este important de vzut dac variabilitatea fenotipic eventual observat se refer la caractere cantitative sau calitative de interes n ameliorarea viei de vie i n ce msur aceast variabilitate se transmite ereditar prin nmulire sexuat sau descendenilor vegetativi prin altoire.

190

Rodica Pop, 2008

BIBLIOGRAFIE

1. ABO El-Nil, M.N, A.C. HILDEBRANDT, 1971, Differentiation of virussymptomless granium plants from anther callus. Plant Dis. Rptr. 55 pag. 10171020. 2. AHLOOWALIA B.S., 1983, Spectrum of variation somaclones of triploid reygrass. Crop Sci, 23, pag. 1141-1147. 3. AKBAS F.A., C. ISIKALAN, Y. KARA, D. BASARAN, 2004, The Comparison on the Proliferation of Lateral Buds of Vitis vinifera L. cv. Perle de Csaba during Different Periods of the Year in In vitro Conditions, International Journal of Agriculture and Biology, 1560-8530, pag. 328-330. 4. AKKAK A., P. BOCCACCI, T. LACOMBE, R. BOTTA, 2005, Relationships and genetic diversity of grapevine (Vitis vinifera L.) grown in Algeria and in Mediterranean Basin. FAO: Biotechnology in Food an agriculture Conference 13. 5. ANGHEL I., TOMA N., 1980, Poliploidia i aneuploidia, Editura tiinific i Enciclopedic, Bucureti. 6. ARDELEAN M., 1986, Ameliorarea plantelor horticole, Tipo Agronomia, ClujNapoca. 7. ARDELEAN M., R. SESTRA, MIRELA CORDEA, 2006, Ameliorarea plantelor horticole, Editura AcademicPres, Cluj-Napoca. 8. ARMSTRONG, C.L., R.L. PHILLIPS, 1988, Genetic and cytogenetic variation in plants regenerated from organogenic and friable embriyogenic tissue culture of maize. Crop Sci. 28, pag. 363-369. 9. BADEA ELENA MARCELA, DANIELA SNDULESCU, 2001, Biotehnologii vegetale, Fundaia Biotech, Bucureti. 10. BLAICH R. H. KONRADI, E. RUHL, A. FORNECK, 2007, Assessing Genetic Variation among Pinot noir (Vitis vinifera L.) Clones with AFLP Markers. Am. J. Enol. Vitis, 58:4, pag. 526-529. 11. BAHATIA, C.R., JOSHUA, D.C., MATHEWS, H, 1985, Somaclonal variation: a 191

Rodica Pop, 2008 genetic interpretation based on the rates of spontaneous chromosomal aberrations and mutations. Trends in Plant Research, pag. 317-326. 12. BEBELI, P., ANGELA KARP, P.J. KALTSIKES, 1990 Somaclonal variation from cultured immature embryos of rye differing in heterochromatin content. Genome. 22, pag. 173-183. 13. BELLIN D.R., VELASCO, M.S. GRANDO, 2001, Intravarietal DNA

Polymorphisms in grapevine (Vitis vinifera L.), Acta Hort. 546, ISHS, pag. 343349. 14. BERTSCH, C., F. KIEFFER, P. MAILLOT, S. FARINE, GISELE BUTTERLIN, D. MERDINOUGLU, B. WALTER., 2005, Genetic chimerism of Vitis vinifera cv. Chardonay 96 is maintained through organogenesis but not somatic embryogenesis, BMC Plant Biol., pag. 5-20. 15. BHASKARAN, S., R.H. SMITH, S. PALIWAL, K.F. SCHERTY, 1987, Somaclonal variation from Sorghum bicolor (L). Moench cell culture. Plant Cell Tissue Organ Culture, pag. 189-195. 16. BHATIA, C.R., D.C. JOSHUA, H. MATHEWS, 1985, Somaclonal variation: a genetic interpretation based on the rates of spontaneous chromosomal aberrations and mutations. Trends in Plant Research, pag. 317-326. 17. BOHM A., E. ZYPRIAN, 1998, RAPD marker in grapevine (Vitis spp.) similar to plant retrotransposoms, Plant Cell Reports. 18. BOUQUET A., 1989, Intrt des techniques de culture in vitro pour lamelioration gntique de la vigne. Bull. O.I.V., 697-698, pag. 179-192. 19. BLAICH R., J. KONRADI, E. RHL, A. FORNECK, 2007, Assessing Genetic Variation among Pinot noir (Vitis vinifera L.) Clones with AFLP Markers, Am. J. Enol. Vitic, 58:4, pag. 526-529. 20. BRATTSTEN L.B., 2000, Vintage, Supplemental Notes for lecture, 5, Rutgers Wine Course. 21. BREIMAN, A., D. ROTEM, ANGLEA KARP, H. SHASKIN, 1987, Heritable somaclonal variation in wild barley (Hordeum spontaneum), Theor. Appl. Genet., 77, pag. 809-814.

192

Rodica Pop, 2008 22. BRIGHT S.V., R.J. NELSON, G. CREISSEN, A. KARP, J. FRANKON, P. NORBURY, J. KUEH, S. ROGNES, B. MIFLIN, 1983, Modification of agronomic traits using in vitro technology, pag. 251-265. In: S.H. Mantell i H. Smith Plant biotechnology. Cambridge University Press, New York. 23. BOHM A., E. ZYPRIAN, 1996, RAPD marker in grapevine (Vitis spp.) similar to plant retrotransposoms, Plant Cell Reports, 17, pag. 415-421. 24. BORNHOFF B.A., M. HARST, E. ZYPRIAN, R. TPFER, C. IANNINI, 2000, Transformation studies on Vitis vinifera L., via Agrobacterium tumefaciens, Acta Horticulturae, 528, VII International Symposium on Grape Genetics and Breeding. 25. BOTTA R., N.S. SCOTT, I. EYNARD, M.R. THOMAS, 1995, Evaluation of microsatellite sequence-tagged site markers for characterizing Vitis vinifera cultivars. Vitis 2, pag. 99-102. 26. BOWERS J., E.B. BANDMAN, C.P. MEREDITH, 1993, DNA fingerprint characterization of some wine grape cultivars. Am. J. Enol. Viticult., 44, pag. 266274. 27. BOWERS J., C. MEREDITH, 1997, The parentage of a classic wine grape. Cabernet Sauvignon. Nature Genetics 16, pag. 84-87. 28. BUTNIUC, A. L., ZPRAN, M., DELIU, C., 1995-1996, Influena unor citochinine n procesele de regenerare, morfogenez i organogenez in vitro la Sequoia sempervirens (D.Don.) i Chrysanthemum morifolium Ramat., Contrib. Bot., pag. 161-164. 29. CACHI COSMA, DORINA, 1984, Culturi de celule i esuturi vegetale, aplicaii n agricultur, Editura Ceres, Bucureti. 30. CACHI C. DORINA, 2000, Biotehnologie vegetal. Vol. I Baze teoretice i practice, Editura Mira Design, Sibiu. 31. CAETANO-ANOLLS G., B.J. BASSAN P.M.. GRESSHOFF, 1991, DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers. Bio/Technology, 9, pag. 553-557. 32. CALDERINI D.F., G.A. SLAFER, 1999, Has yield stability changed with genetic improvement of wheat yield?, Euphytica 107, pag. 51-59. 33. CHEE R., R.M. POOL, 1983, In vitro vegetative propagation of Vitis: Application 193

Rodica Pop, 2008 of previously defined culture conditions to a selection of genotypes. Vitis, 22, pag. 363-374. 34. CHENG, F.S. S.K. BROWN, N.F. WEEDEN, 1997, A DNA Extraction Protocol from Various Tissues in Woody Species, HortScience 32(5); pag. 921-922. 35. CONSTANTIN G., 1959, 1960, Ampelografia Republicii Socialiste Romnia, vol. II, III. 36. CORLEY, R.H.V., C.H. LEE, I.H. LAW, C.Y. WONG, 1986, Abnormal flower development in oil palm clones. Plantet. 62, pag. 233-240. 37. CORNEANU G., 1989, Elemente de radiobiologie vegetal, Ed. Ceres, Bucureti. 38. COUCH, J.A., P.J. FRITZ, 1990, Isolation of DNA from plants high in polyphenolics, Plant Mol. Biol. Rptr, 8, pag. 8-12. 39. CRCIUN, T. i colab., 1979, Haploidia n genetic i ameliorarea plantelor. Editura Ceres, Bucureti. 40. DAMATO, F., 1989, Polyploidy in cell differentiation. Caryologia, 42, pag. 183211. 41. DAUB, M.E., A.E. JENNS, 1989, Field and greenhouse analysis of variation for disease resistance in tabacco somaclones. Phytopathology, 70, pag. 600-605. 42. DEBUIGNE, 1992, Les vins, Larousse. 43. DELOIRE A., M.C. MAURO, 1991, Amelioration de la vigne par la voie des biotechnologies: realites et perspectives. Rev. Cytol. Biol., Veget. Bot., 14, pag. 265-269. 44. DE SILVA M., W. SENERATH, K. SUGATHADASA, 2006, In vitro callus production of Pterocarpus santalinus L. (Red Sandal) through nodal cuttings shoot tips and leaf discs, Forestry and Environment Symposium, Sri Lanka: In vitro callus production. 45. DHEKNEY S.A., Z.T. LI, M. VAN AMAN, M. DUTT, J. TATTERSALL, K.T. KELLEY, D.J. GRAY, 2007, Genetic transformation of embryogenic cultures and recovery of transgenic plants in Vitis vinifera, Vitis rotundifolia and Vitis hybrids, ASHS Acta Horticulturae, 738, International Symposium on Biotechnology of Temperate Fruit Crops and Tropical Species. 46. DENTON, I.R., WESTCOTT, R.J., FORD-LLOYD, B.V., 1977, Phenotypic 194

Rodica Pop, 2008 variation of Solanum tuberosum L., cv. Dr. McIntosh regenerated directly from shoot tip culture, Potato Res., 20, pag. 131-136. 47. DORDEA MANUELA, N. COMAN, CORNELIA CRCIUNA, C. ANDRA, 2000, Genetic general i molecular, Presa Universitar Clujean. 48. EVANS, D.A., SHARP, W.R., 1986, Applications of somaclonal variation. Biotechnology, 4, pag. 528-534. 49. EVANS D.A., 1988, Applications of somaclonal variation, pag. 203-223. In: A Mizrahi. Biotechnology in agriculture. Allan R. Liss, New York. 50. EMERSHAD R.L., D.W. RAMMING, 1994, Somatic embryogenesis and plant development from immature zygotic embryos of seedless grapes (Vitis vinifera L.), Plant Cell. Rep. 14, pag. 6-12. 51. FALLOT J., P. TEY-RULH, P. COUTOULY, M. PETITPREZ, J.P. ROUSTAN, I. PHILIPPE, 1990, Cultures in vitro, etude de leutypiose et strategies des creation de somaclones de vigne tolerants. Les calliques dINRA, 51, pag. 151-159. 52. FANIZZA G., G. COLONNA, P. RESTA, G. FERRARA, 1999, The effect of the number of RAPD markers on the evaluation of genotypic distances in Vitis vinifera, Euphytica 107, pag. 45-50. 53. GABOREANU IOANA, N.W. BLACKHALL, C. ANDRA, M.R. DAVEY, D. PAMFIL, C. PANFIL, 2001, Genetic relationships of Mentha species evaluated by RAPD analysis, Bull. USAMV-CN 55-56, pag. 149-153. 54. GABOREANU IOANA, 2002, Identificarea i caracterizarea unor specii de Mentha cu ajutorul markerilor genetici RAPD, tez de doctorat. 55. GABOREANU IOANA, D. PAMFIL, C. ANDRA, 2003, An improved method for RAPD amplification of DNA from mints (Mentha sp.), Bul. USAMV-CN, nr. 59, pag. 251-255. 56. GALZY R. V. HAFFNER, D. COMPAN, 1990, Influence of three factors on the growth and nutrition of grapevine microcuttings. Journal of Experimental Botany 41, pag. 295-301. 57. GENGENBACH B.G., P. UMBECK, 1982, Characteristics of T-cytoplasm revertants from tissue culture. Maize Genet. Coop. Nwsl. 56, pag. 140-142.

195

Rodica Pop, 2008 58. GOULD, A.R., 1986, Factors controlling generation of variability in vitro. In: Vasil, I.K. (ed). Cell Culture and Somatic Cell Genetics in Plants. 3. Plant Regeneration and Genetic Variability. Academic Press. Orlando, pag. 549-567. 59. GRAY D.J., 1992, Somatic embryogenesis and plant regeneration from immature zygotic embryos of muscadine grape (Vitis rotundifolia) cultivars. Amer. J. Bot., 79, pag. 542-546. 60. GREIESBACH, R.J., P. SEMENIUK, 1987, Use of somaclonal variation in the improvement of Eustoma grandiflorum. J. Heredity, 78, pag. 114-116. 61. GRIESBACH R.J., P. SEMENIUK, M. ROTH, R.H. LAWSON, 1988, Tissue cuture in the improvement of Eustoma. HortScience 23, pag. 791. 62. HAMMERSCHLAG F.A., 1990, Somaclonal variation in peach, pag. 170-183. In: Y.P.S. Bajaj (ed). Biotechnology in agriculture and forestry, vol. 1. Trees I. Springer-Verlag, Berlin. 63. HAMMERSCHLAG F.A.D. RITCHIE, D. WEAVER, 1991, Phenotypic stability of bacterial leaf spot resistance in peach regenerants under greenhouse and field conditions. HortScience 26, pag. 725. 64. HAMPL V., PAVLCEK A., FLEGR J., 2001, Construction and bootstrap analysis of DNA fingerprinting-based phylogenetic trees with a freeware program FreeTree: Application to trichomonad parasites. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51, pag. 731-735. 65. HANNA, W.W., C. LU, I.K. VASIL, 1984, Uniformity of plants regenerated from somatic embryos of Panicum maximum Jacq. (Guinea grass) Theor. Appl. Genet. 67, pag. 155-159. 66. HANSEN M., C. HALLDN, T. SLL, 1998, Error Rates and Polymorphism Frequencies for Three RAPD Protocols, Plant Molecular Biology Reporter, nr. 16, pag. 139-146. 67. HARRIS R.E. J.H. STEVERNSON, 1982, In vitro propagation of Vitis, Vitis, 21, pag. 22-23. 68. HARTMAN H. T., D.E. KKESTER, 1983, Plant propagation. Prenticee-Hall, Englewood Cliffs N.J. 69. HBERT-SOUL D., J.R. KIKKERT, B.I. REISCH, 1995, Phosphinotricin 196

Rodica Pop, 2008 stimulates somatic embryogenesis in grape (Vitis sp.L.). Plant Cell. Rep. 14, pag. 380-384. 70. HELOIR M.C., J.C. FOURNIOUX, M. BARBIER, P. HEANDET, R. BESSIS, 1998, Endogenous polyamine concentration in juvenile, adult and micropropagated grapevine (Vitis vinifera L. cv. Pinot noir), Vitis 37 (1), pag. 61-62. 71. HERRERA R., V. CARES, M.J. WILKINSON, P.D.S. CALIGARI, 2002, Characterization of genetic variation between Vitis vinifera cultivars from central Chile using RAPD and Inter Simple Sequence Repeat markers, Euphytica 124: pag. 139-145. 72. HOEPFNER A.S., H. NYBOM, U. CARLSSON, R. FRANZEN, 1993, DNA fingerprinting useful for monitoring cell-line identity in micropropagated raspberries. Acta Agric. Scandinavica, B. 43, pag. 53-57. 73. HOSSAIN M.B., S. HAQUE, H. KHAN, 2002, DNA Fingerprinting of Jute Germplasm by RAPD, Journal of Biochemistry and Molecular Biology, vol. 35, nr. 4, pag. 414-419. 74. HOWLAND G.P., R.W. HART, 1977, Radiation biology of cultured plant cells. In: Reinert J and Bajaj YPS (eds) Applied and Fundamental Aspects of Plant Cell, Tissue and Organ Culture, pag. 731-756. 75. HUSSEY, G., 1977 In vitro propagation of Gladiolus by precocious axillary shoot formation, Scientia Hort., 6, pag. 287-296. 76. IANDOLINO A.B., F. G. SILVA, H. LIM, H. CHOI, L.E. VILLIAMS, D.R. COOK, 2004, High-Quality RNA, cDNA, and Derived EST Libraries from Grapevine (Vitis vinifera L.), Plant Molecular Biology Reporter 22, pag. 269-278. 77. IBANEZ A., M. VALERO, A. MORTE, 2005, Establishment and in vitro clonal propagation of the Spanish autochthonous table grapevine cultivar Napoleon: an improved system where proliferating cultures alternate with rooting ones. Annales de Biologia 27, pag. 211-220. 78. IMAZIO S., M. LABRA, F. GRASSI, M. WINFIELD, M. BARDINI, A. SCIENZA, 2002, Molecular tools for clone identification: the case of the grapevine cultivar Traminer, Plant Breeding, 121, pag. 531-535.

197

Rodica Pop, 2008 79. INNIS A.M., H.D. GELFAND, J.J. SNINSKY, J.T. WHITE, 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. San Diego, CA, pag. 3-12. 80. IONESCU MARIANA, ELENA BRNDUE, 1992, Posibiliti de utilizare a micromultiplicrii in vitro la via de vie, Cercetri de Genetic Vegetal i Animal, vol. II, S.C. Agris Redacia Revistelor Agricole S.A., pag. 193-205. 81. KARP, ANGELA., BRIGHT, S.W.J., 1985, On the causes and origins of somaclonal variation. Ox. Surv. Pl. Mol. And Cell Biol. 2, pag. 199-234. 82. KARP ANGELA, 1989, Can genetic instability be controlled in plant tissue cultures? Nwsl. Intl. Assn., Plant Tissue Culture 58, pag. 2-11. 83. KARP ANGELA, 1999, On the current understanding of somaclonal variation. Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biology Volume 7, pag 1-58. 84. KHAWAR K.M., C. SANCAK, S. URBANBEY, S. ZCAN, 2004, Effect of Thidiazuron on Shoot Regeneration from Different Explants of Lentil (Lens culinaris Medik.) via Organogenesis, Turk J. Bot. 28, pag. 421-426. 85. KIM C.S., C.H. LEE, J.S. SHIN, Y.S. CHUNG, N.I. HYUNG, 1997, A simple and rapid method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP, Nucleic Acids Research, Vol. 25, No. 5, pag. 1085-1086. 86. KIM H. S., J.H JEONG, S.K. KIM, 2002, Parentage Identification of Deabong Grape (Vitis spp.). Using RAPD Analysis, Journal of Plant Biotechnology, vol. 4(2), pag. 67-70. 87. KIM S.H., S. K. KIM, 2002, Effects of Auxins and Cytokinins on Callus Induction from Leaf Blade, Petiole, and Stem Segments of In Vitro-grown Sheridan Grape Shoots, J. Plant Biotechnology, vol. 4 (1), pag. 17-21. 88. KOONJUL P.K.,W.F., BRANDT, J.M. FARRANT, G.G. LINDSEY, 1999, Inclusion of polyvinylpyrrolidone in the polymerase chain reaction reverses the inhibitory effects of polyphenolic contamination of RNA, Nucleic Acids Research, vol. 27, Nr. 3. 89. KUKSOVA, B.VALERIA, M.N. PIVEN, Z.Z. GLEBA, 1997, Somaclonal variation and in vitro induced mutagenesis in grapevine. Plant Cell. Tissue and Organ Culture, 49, pag. 17-27. 198

Rodica Pop, 2008 90. KURTZ S.M., R.D. LINEBERGER, 1983, Genotypic differences in morphogenetic capacity of cultured leaf explants of tomato. J. Amer. Soc.Hort.Sci. 108, pag. 710714. 91. LAPITAN, N.L.V., R.G. SEARS, B.S. GILL, 1988, Amplification of repeated sequences in wheat x rye hybrids regenerated from tissue culture. Theor. Appl. Genet, 75, pag. 381-388. 92. LARKIN, P.J., W.R. SCOWCROFT, 1981, Somaclonal variation A Novel Source of Variability from Cell Cultures for Plant Improvement. Theor. Appl. Genet, 60, pag. 197-214. 93. LARKIN, P.J., SCOWCROFT, W.R., 1983, Somaclonal variation and eyespot toxin tolerance in sugarcane. Plant Cell Tissue Organ Culture. 2, pag. 111-122. 94. LARKIN, P.J., 1987, Somaclonal variation, history, method and meaning. Iowa State Genet, 75, pag. 381-388. 95. LAZAR, M.D., T.H.H. CHEN, L.V.GUSTA, K.K. KARTHA, 1988, Somaclonal variation for freezing tolerance in a population derived from norstar winter wheat. Theor. Appl. Genet. 75, pag. 480-484. 96. LEE, M., R.L. PHILLIPS, 1987, Genetic variants in progeny of regenerated maize plants. Genome. 29, pag. 834-838. 97. LETHAM, S.D., 1978, Phytohormones and Related Compounds A

Comprehensive Treatise (ed. Letham, Goodwin i Higgins), Elsevier-North Holland Biomedical Press, vol. I. 98. LIN H., M.A. WALKER, 1997, Extracting DNA from Cambium Tissue for Analysis of Grape Rootstocks, HortScience 32(7), pag.1264-1266. 99. Ling M.M., 2001, DNA methods for preparation, Encyclopedia of life sciences, pag. 1-3. 100. LODHI M.A., N.F. WEEDEN, B.I. REISCH, 1997, Characterization of RAPD

markers in Vitis, Vitis 36, pag. 133-140. 101. LODHI M. A., GUANG-NING Z., F. N. F. WEEDEN, B.I. REISCH, 1994, A

simple and efficient method for DNA extraction from grapevine cultivars, Vitis species and Ampelopsis, Plant Molecular Biology Reporter 12(1), pag. 6-13.

199

Rodica Pop, 2008 102. LOUREIRO M.D., M.C. MARTINEZ, J.M. BOURSIQUOT, P. THIS, 1998,

Molecular marker analysis of Vitis vinifera Albario and some similar grapevine cultivars. J. Am. Soc. Hortic. Sci., 123, pag. 842-848. 103. LOURENS, A.G., F.A. MARTIN, 1987, Evaluation of in vitro propagated sugarcane hybrids for somaclonal variation. Crop. Sci. 27, pag. 93-796. 104. LOYD, D., ROBERTS, A. v., SHORT, K. C., 1988 The induction in vitro of adventitious shoots in Rosa, Euphytica, 37, pag. 31-36. 105. MARTINELLI L., P. BRAGAGNA, V. POLLETTI, A. SCIENZA, 1993, Somatic embryogenesis from leaf-and petiole-derived callus of Vitis rupestris. Plant Cell. Rep., 12, pag. 207-210. 106. MATHUR, A.K., P.S. AHUJA, S. MANDAL, 1988, Screening and evaluation of somaclonal variation for quantitative and qualitative traits in an aromatic grass, Cymbopogon winterianus Jowitt. Plant Breeding. 101, pag. 321-334. 107. MCCLELAND M., J. WELSH, 1994, RNA fingerprinting by arbitrarily primed PCR. PCR Methods Appl. 4(1), pag. 66-81. 108. METZKER, M.L, T.C. CASKEY, 2001, Polymerase Chain Reaction (PCR), Encyclopedia of Life Sciences, Nature Publishing Group/www.els.net. 109. MEZZETTI B., TIZIANA PANDOLFINI, O. NAVACCHI, LUCIA LANDI, 2002, Genetic transformation of Vitis vinifera via organogenesis, BMC Biotechnology, pag. 2-18. 110. MINGFU, M., L., 2001, DNA: Methods for Preparation, Encyclopedia of Life Sciences, Nature Publishing. 111. MITHILA J., J.C. HALL., J.M.R. VICTOR, P.K. SAXENA, 2003, Thidiazuron induces shoot organogenesis at low concentration and somatic embryogenesis at high concentrations on leaf and petiole explants of African violet (Saintpaulia ionantha Wendl.), Plant Cell. Resp., 21, pag. 408-414. 112. MITRA, G.C., 1985, Somaclonal variation a strategy for plant improvement. Cell Chromosome Res. 8, pag. 59-68. 113. MOLDOVEANU D., C. MILITARU, IULIA MOLDOVEANU, 2001,

Microbiologie i inginerie genetic, Fiat Lux, pag. 205-206. 114. MULCAHY D.L., M. CRESTI, H.F. LINSKENS, C. INTRIERI, O. 200

Rodica Pop, 2008 SILVESTRONI, R. VIGNANI, M. PANCALDI, 1995, DNA fingerprinting of italian grape varieties: a test of reliability in RAPDs, Adv. Hort. Sci., 9, pag. 185187. 115. MURATA, M., 1989, Effects of auxin and cytokinin on induction of sister chromatid exchanges in cultured cells of wheat (Triticum aestivum L.). Theor. Apl. Genet. 78, pag. 521-524. 116. NAKANO M. T. SAKAKIBARA, Y. WATANABE, M. MII, 1997, Establishment of embryogenic cultures in several cultivars of Vitis vinifera and V. x labruscana, Vitis, vol. 36, nr. 3, pag. 141-145. 117. NAZHAD, N.R., M. SOLOKI, R. VIGNANI, B. SIAHSAR, H. KAMALDINI, 2005, Study of Genetic variation native varieties of sistan grape using molecular marker RAPD, 9th International Conference on Agricultural Biotechnology: Ten Years After. 118. NESTICY, M., A.HERICHOVA, G.J. NOVAK, M. DOLEZELOVA, 1987, Somaclonal variation in plants derived from somatic embryos of maize Zea mays L. Sci. Agric. Bohemoslov. 19, pag. 253-260. 119. Newton C.R., 1995, PCR Essential data, John Wiley and Sons LTD, Baffins Lane Chichester, West Sussex. 120. NICOLAE I., 1978, Mutageneza experimental, Editura Ceres, Bucureti. 121. NOVAK, F.J., S. DASKALOV, 1988, Somatic embryogenesis in maize and comparison of genetic variability induced by gamma radiation and tissue culture techniques. Plant Breeding. 101, pag. 66-79. 122. NYBOM H., S.H. ROGSTAD, B.A. SCHAAL, 1990, Genetic variation detected by use of the M13 DNA fingerprint probe in Malus, Prunus and Rubus (Rosaceae). Theoretical and Applied Genetics, 79, pag. 153-156. 123. OGIHARA, V., 1981, Tissue culture in Haworthia. Part 4: Genetic characterization of plants regenerated from callus. Theor. Appl. Genet. 60, pag. 353-363. 124. OLAH R. E. SZEGEDI, S. RUTHNER, J. KORBULY, 2003, Thidiazuroninduced regeneration and genetic transformation of grapevine rootstock varieties, Vitis, vol. 42, nr. 3, pag. 133-136. 201

Rodica Pop, 2008 125. OONO, K, 1985, Putative homozygous mutations in regenerated plants of rice. Mol. Gen. Genet. 198, pag. 377-385. 126. OPREA t., S.D. MOLDOVAN, 2007, Ameliorarea viei de vie n Romnia, Editura Poliam Cluj-Napoca. 127. ORTON, T.J., 1980, Chromosomal variability in tissue cultures and regenerated plants of Hordeum. Theor. Appl. Genet. 56, pag. 101-112. 128. PALADA-NICOLAU, MAGDALENA, 2004, Curs de variabilitate somaclonal, USAMV Cluj-Napoca. 129. PALII A., GALINA COMAROV, ANGELA LOYAN, V. SCORPAN, 2004, Biotehnologii moderne n fitotehnie i biosecuritate, Ed. Tipografia Central, Chiinu. 130. PAMFIL D., 1983, Producerea prin cultur meristematic a materialului sditor cu valoare biologic ridicat la garoafele de ser, Horticultura, 5, pag. 12-15. 131. PAMFIL D., 1996b, Utilizarea markerilor RAPD pentru detectarea variabilitii somaclonale la via de vie. Simpozionul naional 10 ani de biotehnologie, 23 octombrie, Timioara, pag. 246-254. 132. PAMFIL D.C., 1999, The use of RAPD markers for the identification of somaclonal variation of the micro propagated grapevine, Proc Symp. Present and Prospects in Horticulture, pag. 247-254 133. PARK, C.H., P.D. WALTON, 1989, Embryo callus regenerated hybrids and their cochicine-induced amphiploids between Elymus canadensis and Secale cereale. Theor. Appl. Genet. 78, pag. 721-727. 134. PIVEN N.M., V.B. KUDSOVA, L.U. YUZEPHOVICH, O.K. MAKHORINA, 1991, Utilization of some cell technologies in grape breeding process. Biopolimers & Cell. 7, pag. 66-72. 135. PEROS J. P., L. TORREGROSA, G. BERGER, 1998, Variability among Vitis vinifera cultivars in micropropagation, organogenesis and antibiotic sensitivity, Journal Experimental Botany, Vol. 49, Nr. 319, pag. 171-179. 136. PICKERING, R.A., 1989, Plant regeneration and variants from calli derived from imature embryos of diploid barley (Hordeum vulgare) and H. vulgare x H. bulbosum L. crosses. Theor. Appl. Genet. 78, pag. 105-112. 202

Rodica Pop, 2008 137. POENARU I., 1970, Ampelografia Republicii Socialiste Romnia, vol. I. 138. POGANY F. MARY, R. D. LINEBERGER, 2006, Plant chimeras in tissue culture. E-magazine Cultivar ISSUE 3 (36). 139. POP RODICA, M. ARDELEAN, D. PAMFIL, IOANA MARINA

GABOREANU, 2003, The Efficiency of Different DNA Isolation and Purification in Ten Cultivars of Vitis vinifera, Bul. Nr. 59 USAMV, seria ZB, pag. 259-261. 140. POP RODICA, M. ARDELAN, IOANA MARINA GABOREANU, D. PAMFIL, MIRELA CORDEA, P. RAICA, MONICA BODEA, MARIA CANTOR, 2005, RAPD analyses used in revealing molecular polymorphism of several grape varieties from vineyards of Romania, XL Croatian Symposium on Agriculture, pag. 229. 141. POP RODICA, M. ARDELEAN, IOANA GABOREANU, P. RAICA, D. PAMFIL, MIRELA CORDEA, 2006, Analiza RAPD utilizat n determinarea polimorfismului la nivel molecular a cultivarelor de vi de vie de la S.D.E. Iai, Lucrri tiinifice, anul XLVII, vol. 1 (49), Seria Horticultur, Universitatea de tiine Agricole i Medicin Veterinar Ion Ionescu de la Brad Iai, ISSN 14547376, pag. 389-394. 142. POP RODICA, MARIA CANTOR, DOINA CLAPA, MONICA BODEA, 2007, Effect of thidiazuron on shoot organogenesis induction in Lisianthus russelianus Hook, Lucrrile simpozionului internaional Conservarea germoplasmei horticole Realizri i perspective, Ed. Todesco, Cluj-Napoca. 143. POPESCU CARMEN FLORENTINA, AL. TEODORESCU, 2004,

Biotehnologii, Regenerarea in vitro la via de vie cu aplicaii n ameliorarea sortimentului. Editura Ceres, Bucureti. 144. REGNER F., A. STADLBAUER, C. EISENHELD, 2001, Molecular markers for genotyping grapevine and for identifying clones of traditional varieties, Acta Hort. 546, ISHS, pag. 331-336. 145. ROGER S.O., A.J. BENEDICH, 1988, Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues, Plant Mol. Biol., 5, pag. 69-76.

203

Rodica Pop, 2008 146. ROUT G.R., S. SAMAL, S. NAYAK, RASHMI.M. NANDA, P.C. LENIKA, P. DAS, 2002, An Alternative Method of Plant DNA Extraction of Cashew (Anacardium occidentale L.) for Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD) analysis, Gartenbauwissenschaft, 67 (3). S., pag. 114-118, ISWSN 0016-478X. 147. RYAN, S.A., W.R. SCHWCROFT, 1987, A somaclonal variant of wheat with additional -amylase isozymes. Theor. Appl. Genet. 73, pag. 459-464. 148. RYAN F.J., C.A. LEDBETTER, D.W. RAMMING, D.E. PALMQUIST, D.E. BEL, S.J. PETERSON, 2001, Challenges in developing molecular markers for almond (Prunus amygdalus) and Grape (Vitis species), Acta Hort. 546, ISHS, pag. 629-638. 149. SAIKI R.K., S. SCHARF, F. FALOONA, K.B. MULLIS, G.T. HORN, H.A. ERLICH, N. ARNHEIM, 1985, Enzymatic amplification of beta-globulin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia, Science, 230, pag. 1350-1354. 150. SALA, F, M.G., BIASINI, 1987, Heritable variability induced by the in vitro culture and genetic improvement of cultivated plants. G. Bot. Italia 120, pag. 43-45. 151. SALUNKHE CK. P.S RAO, 1997, Induction of somatic embryogenesis and plantlets in tendrils of Vitis vinifera L. Plant Cell Reports. 17 (1), pag. 65-67. 152. SALUNKHE CK. P.S, RAO, 1999, Plantlet regeneration via somatic embryogenesis in anther callus of Vitis latifolia L. Plant Cell. Raports. 18 (7-8), pag. 670-673. 153. SAVATTI M., 1983, Ameliorarea plantelor i producerea de smn, curs, Tipo Agronomia Cluj-Napoca. 154. SESTRA R., 2004, Ameliorarea speciilor horticole, Editura AcademicPres ClujNapoca 155. SEFC K.M. F. REGNER, J. GLOSSL, H. STEINKELLNER, 1998, Genotyping of grapevine and rootstock cultivars using microsatellite markers. Vitis, 37, pag. 1520. 156. SENSI E., R. VIGNANI, W. ROHDE, S. BIRICOLTI, 1996, Characterisation of genetic biodiversity with Vitis vinifera L. Sangiovese and Colorino genotypes by AFLP and ISTR DNA marker technology. Vitis 35, pag. 183-188. 204

Rodica Pop, 2008 157. SHARMA, H.C., B.S. GILL, R.G. SEARS, 1984, Inflorescence culture of wheat Triticum aestivum Agropyron hybrds. Callus induction, plant regeneration and potential in overcoming sterility barriers. Plant Cell Tissue Organ Culture. 3, pag. 247-256. 158. SHEPARD, J.F., D. BIDNEY, E. HAHIN, 1980, Potato protoplasts in crop improvement, Science, 208, pag. 17-24. 159. SILVESTRONI, O.P., D. PIETRO, C. INTRIERI, R. VIGNANI, I. FILIPPETTI, C. DEL CASIO, M. SCALI, M. CRESTI, 1997, Detection of genetic diversity among clones of cultivar Fortana (Vitis vinifera L.) by microsatelites DNA polymorphism analysis. Vitis, 35, pag. 147-150. 160. SIVRITEPE N., A. ERIS, 1999, Determination of Salt Tolerance in Some Grapevine Cultivars (Vitis vinifera L.) under in vitro conditions, Turk. J. of Biology 23, pag. 473-485. 161. SKIRVIN M.R., K.D. MCPHEETERS, MARGARET NORTON, 1994, Sources and Frequency of Somaclona Variation, HortScience, vol. 29(11), pag. 1231-1237. 162. SOLOKI M., N. R. NAHZAD, R. VIGNANI, B. SIAHSAR, H. KAMALADINI, 2005, Study of polymorphism some native varieties of sistan grape using molecular marker RAPD, Interantional Consortium on Agricultural Biotechnology Research (ICABR), Italia. 163. STANGE CLAUDIA, DORIS PREHN, PATRICIO A. JOHNSON., 1998, Isolation of Pinus radiata Genomic DNA Suitable for RAPD Analysis, Plant Molecular Biology Reporter 16, pag. 1-8. 164. STAUB J., J. BACHER, K. POETTER, 1996, Sources of Potential Errors in the Application of Random Amplified Polymorphic DNAs in Cucumber, HortScience 31 (2), pag. 262-266. 165. STNESCU Z, 1969, Poliploidia la plantele de cultur, Editura Agrosilvic Bucureti. 166. STAVRAKAKIS M.N., K. BINIARI, P. HATZOPOULOS, 1997, Identification of eight Greek grape cultivars (Vitis vinifera L.) by Random Amplified Polymorphic DNA markers. Vitis, 36, pag. 175-178.

205

Rodica Pop, 2008 167. TMA ELENA, 1998, Cercetri privind influena mutagen a unor ageni fizici i chimice n vederea obinerii de mutaii utile pentru procesul de ameliorare a bobului (Vicia faba L.), Tez de doctorat. 168. TANG F.A., M.G. MULLINS, 1990, Adventitious bud formation in leaf explants of some grapevine rootstock and scion cultivars. Vitis 29, pag. 151-158. 169. TESSIER C., J. DAVID, P. THIS, J.M. BOURSIQUOT, A. CHARRIER, 1999, Optimization of the choice of molecular markers for varietal identification in Vitis vinifera L. Theor Appl Genet, 98: pag. 171-177. 170. THIS, P. A-F. ADAM-BLONDON, G. BUTTERLIN, V. CHIQUET, D. CLAUX, S. DECROOCQ, A. DOLIGNEZ, V. DUMAS, D. MERDINOGLU, F. PELSY, C. ROUX, S. WIEDEMANN-MERDINOGLU, 2002, Dveloppment dune carte gntique de rfrence de Vitis vinifera laide de marqueurs microsatellites, 12me Colloque sur les Rechercehes Fruitires, Les apports de la biologie molculaire en arboriculture fruitire, Bordeaux. 171. THOMAS M.R., N.S. SCOTT, R. BOTTA, J.M.H. KIJAS, 1998, SequenceTagged site markers in grapevine and citrus, Journal of the Japanese Society for Horticulural Science, vol. 67, nr. 6, pag. 1189-1192. 172. THOMAS T. D., J.T. PUTHUR, 2004, Thidiazuron induced high frequency shoot organogenesis in callus from Kigelia pinnata L., Bot. Bull. Acad. Sin., 45, pag. 307-313. 173. TORREGROSA L, A. BOUQUET, 1996, Adventitious bud formation and shoot development from in vitro leaves of Vitis x Muscadinia hybrids. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 45, pag. 245-252. 174. TORREGROSA L., P. IOCCO, M.R. THOMAS, 2002, Influence of Agrobacterium Strain, Culture Medium and Cultivar on the transformation efficiency of Vitis vinifera L. Am. J. Enol. Vitic., 53, pag. 183-190. 175. RDEA C., L. DEJEU, 1995, Viticultur, Editura Didactic i Pedagogic R.A., Bucureti. 176. ULANOWSKY S., Y.GOGORCENA, F. MARTINEZ-DE-TODA, J.

BORREGO, J. IBEZ, J.M. ORTIZ, 2001, Characterization of grapevine

206

Rodica Pop, 2008 accessions at germplasm banks with RAPD and microsatellite markers, Acta Horticulturae 546, pag. 271-279. Frana. 177. VASIL, I.K. 1988, Progress in the regeneration and genetic manipulation of cereal crops. Biotechnology 6, pag. 397-402. 178. VIGNANI R. J.E. BOWERS, C.P. MEREDITH, 1996, Microsatellite DNA polymorphism analysis of clones of Vitis vinifera Sangiovese. Sci. Hort, 65, pag. 163-169. 179. VIDAL J.R., M. COARER, A. DEFONTAINE, 1999, Genetic relationships among grapevine varieties grown in different French and Spanish regions based on RAPD markers, Euphytica 109: 161-172, pag. 161-172. 180. VOS P., R. HOGERS, M. BLEEKER, M. REIJANS, T. LEE, MIRANDA HORNES, A. FRIJTERS, JERINA POT, J. PELEMAN, M. KUIPER, M. ZABEAU, 1995, AFLP: a new technique for DNA fingerprinting, Nucleic Acids Research, vol. 23, nr. 21, pag. 4407-4414. 181. WAKASA, K. J.M. WIDHOLM, 1987, A 5-methyltryptophan resistant rice mutant, MTR1, selected in tissue culture. Theor. Appl. Genet. 74, pag. 49-54. 182. WEISING K., H. NYBOM, K. WOLFF, W. MEYER, 1995, DNA Fingerprinting in Plants and Fungi, CRC Press, Inc., Boca Raton, USA, pag. 54. 183. WELSH J., M. MCCLELLAND, 1990, Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucl. Acids. Res. 18, pag. 7213-7218. 184. WILLIAMS J.G.K., KUBELIK A.R., LIVAK K.J., RAFLASKI J.A., TINGEY S.V., 1990, DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 18, pag. 6531-6535. 185. WOLF T., C. ORTLIEB.,K. EIMERT, R. RIES, 2001, Routine Extraction of DNA from Grapevine (Vitis ssp.) Canes and Roots for Variety Identification by RAPD-PCR, Acta Hort. 547, pag. 527-533. 186. www.cgr.wageninger-ur.nl/pgr/research/molgen/rapds.htm 187. www.en.wikipedia.org/wiki/Merlot 188. www.ro.wikipedia.org/wiki/Feteasc_Alb

207

Rodica Pop, 2008 189. XU H., A.T. BAKALINSKY, 1996, Identification of Grape (Vitis) rootstocks using sequence characterized amplified region DNA Markers, HortScience 31(2) pag. 267-268. 190. XU X., J. LU, Z. REN, H. WANG, S. LEONG, 2005, Callus induction and somatic embryogenesis in muscadine and seedless bunch grapes (Vitis) from immature ovule culture, Proc. Fla. State Hort, Soc. 118, pag. 260-262. 191. YAMADA M., H. YAMANE, H. YOSHINAGA, K. HIRAKAWA, N. KURIHARA, A. IWANAMI, H. NAGATA, K. SATO, A. OZAWA, T. SUMI, 2003, New grape cultivar Honey Venus, Bulletin of the National Institute of Fruit Tree Science, Japan, (2), pag. 53-63. 192. YE G.N., M. HEMMAT, M, A. LODHI, N.F. WEEDEN, B.I. REISCH, 1996, Long primers for RAPD mapping and fingerprinting of grape and pear, BioTechniques 20, pag. 368-371 193. YE G.N., G. SOYLEMEEZOGLU, N.F. WEEDEN, W.F. LAMBOY, R.M. POOL, B.I., REISCH 1998, Analysis of the relationship between grapevine cultivars, sports and clones via DNA fingerprinting, Vitis. 37, pag. 33-38. 194. YE G.N., G. SOYLEMEEZOGLU, N.F. WEEDEN, W.F. LAMBOY, R.M. POOL, B.I., REISCH, 1998, Analysis of the relationship between grapevine cultivars and clones via DNA fingerprinting, Plant Molecular Biology Reporter, cap.3.1., pag. 135-143. 195. YOUMBI E., B. ELLA, K. TOMEKPE, 2006, Effect of thidiazuron on in vitro proliferation capacities of some banana (Musa spp.) cultivars with weak multiplication potential, Akdeniz Universitesi Ziraat Facultesi Dergisi, 19 (2) pag. 255-259. 196. ZHENG, K.L., Z.M. ZHOU, G.L. WANG, Z.M. XIONG, 1989, Somatic cell cultures of rice cultivars with different grain types: Somaclonal variation in some grain and quality characters. Plant Cell Tissue Organ Culture. 18, pag. 201-208.

208

Rodica Pop, 2008

ANEXA 1

Preparare soluii stoc

Soluie stoc 1 M Tris HCl 100 ml M Tris HCl = 157,6 g se dizolv la cald 15,76 g n 80 ml ap distilat se rcete la temperatura camerei se ajusteaz pH-ul la 8,00 cu HCl concentrat se ajusteaz volumul soluie pentru 100 ml cu ap distilat se autocleaveaz

Dac soluia are culoarea galben, se reface, deoarece Tris nu este de calitate.

Soluie stoc acid etilendiamin tetraacetat disodic (EDTA) 0,5 M 100 ml M EDTA = 372,24 g se dizolv 18,61 g EDTA n 80 ml ap distilat se agit puternic pe plita cu agitator magnetic se ajusteaz pH-ul la 8,0 cu hidroxid de sodiu (aproximativ 0,2 g NaOH granule) se ajusteaz volumul soluie la 100 ml cu ap distilat se autoclaveaz

EDTA nu se dizolv dac pH-ul nu ajunge la 8,0

Soluie stoc clorur de sodiu (NaCl) 1,4 M - 100 ml M NaCl = 58,44 se dizolv 8,19 g NaCl n 80 ml de ap distilat se ajusteaz volumul la 100 ml se sterilizeaz prin autoclavare

209

Rodica Pop, 2008 Soluie stoc clorur de sodiu (NaCl) 5 M 100 ml se dizolv 29,22 g NaCl n 80 ml ap distilat se ajusteaz volumul la 100 ml cu ap distilat se sterilizeaz prin autoclavare

Soluie stoc cloroform : alcool izoamilic 24 : 1 100 ml la 96 ml cloroform se adaug 4 ml alcool izoamilic

Soluie stoc 2 x CTAB 2% (bromur de cetiltrimetilamoniu) - 100 ml n 80 ml ap distilat se dizolv 2 g CTAB se adaug 10 ml 1 M Tris, 4 ml 0,5 M EDTA i 8,2 g NaCl se ajusteaz volumul soluie la 100 ml cu ap distilat

Soluie de lucru 2 x CTAB 2% pentru protocolul B (se prepar n momentul utilizrii) ntr-un vas Berzelius se pun 15 ml soluie 2 x CTAB 2% se nclzete la circa 650C se adaug treptat 0,400 g PVP i 400 l mercaptoetanol se ajusteaz volumul soluie la 20 ml cu ap distilat se sterilizeaz prin autoclavare

Soluie de lucru 2 x CTAB 2% - 10 ml (se prepar n momentul utilizrii) ntr-o eprubet gradat se pun 8 ml 2 x CTAB 2% din soluia stoc se adaug la cald (650C) - 0,022 g PVP
DIECA din sol stoc 0,5 M - se ajusteaz volumul soluie la 10 ml cu ap distilat

- dup completa dizolvare se adaug 200 l acid ascorbic din sol stoc 0,5 M i 0,08 ml

Soluie salin CTAB 5% 100 ml se dizolv n 80 ml ap distilat 4,1 g NaCl se adaug apoi treptat 5 g CTAB se ajusteaz volumul soluie la 100 ml cu ap distilat se sterilizeaz prin autoclavare 210

Rodica Pop, 2008

Soluie stoc tampon TE salin 100 ml

n circa 80 ml de ap distilat se adaug 1 ml 1 M Tris, 2 ml 0,5 M EDTA i 5,85 g NaCl

se ajusteaz volumul soluie la 100 ml cu ap distilat se sterilizeaz prin autoclavare

Soluie stoc tampon 0,1 x TE 100 ml n circa 80 ml ap distilat se dizolv 0,1 ml 1 M Tris i 0,2 ml 0,5 M EDTA se ajusteaz volumul soluie la 100 ml cu ap distilat se sterilizeaz prin autoclavare

Soluie stoc acid ascorbic 0,5 M 10 ml M acid ascorbic = 176,1 g se dizolv 0,88 g acid ascorbic n 10 ml de ap distilat n tamponul de extracie acidul ascorbic are concentraia de 10 mM

Soluie stoc DIECA 0,5M 10 ml M DIECA = 255,3 g/l se dizolv 1,12 g DIECA n ap distilat se adaug n tamponul de extracie nainte de utilizare

Soluie stoc alcool etilic 80% - 100 ml la 84,21 ml alcool etilic 96% se adaug 15,79 ml ap distilat

Soluie tampon Tris-acetat (TAE)

Soluie stoc concentrat 50 x 1000 ml 242 g Tris HCl 57,1 ml acid acetic glacial 100 ml EDTA 0,5M (pH 8.0)
Soluie de lucru 1 x:

Tris-acetat 0,04M 211

Rodica Pop, 2008 EDTA 0,001 M Soluie tampon Tris-fosfat (TPE)

Soluie stoc concentrat 1000 ml 10 x

108 g Tris 15,5 ml acid fosforic 85% (1,679 g/ml) 40 ml EDTA 0,5 M (pH 8,0)
Soluie de lucru 1 x:

Tris-fosfat 0,09 M EDTA 0,002 M Soluie tampon Tris-borat (TBE)

Soluie stoc concentrat 5 x TBE 1000 ml

54 g Tris 27,5 g acid boric 20 ml EDTA 0,5 M (pH 8,0) se dizolv n 1000 ml ap bidistilat
Soluie de lucru 0,5 x Tris-borat Intr-un balon cotat de 1000 ml se pun 100 ml 5xTBE i se aduce la semn cu ap distilat steril.

Soluie tampon alcalin (folosit numai preparat proaspt) Soluie stoc concentrat 1 x: 5 ml NaOH 10 N 2 ml EDTA 0,5 M (pH 8,0) Soluie de lucru 1 x: NaOH - 50 mM
EDTA - 1mM

212

Rodica Pop, 2008 Compoziia mediului Murashige-Skoog (1962) utilizat n cultura in vitro de segmente nodale la via de vie
Compoziia mineral i ionic n macroelemente (mg/l)

Nr crt

Compoziia mineral n macroelemente (mg/l) Specificare Masa molecular 80,04 101,04 147,02 264,50 136,09 mg/l 1650 1900 400 370 170 4490,0

Compoziia ionic a macroelementelor

m echivaleni/l)

Anioni NO3H2PO4SO4Cl-

mE/l 39,41 1,25 3,00 6,00

Cationi K+ Mg++ Ca++ NH4++

mE/l 20,06 3,00 6,00 20,01

1. 2. 3. 4. 5.

NH4 NO3 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4 Total (mg/l)

49,6

49,6

213

Rodica Pop, 2008

Compoziia mineral i ionic n microelemente (mg/l)

Nr. crt.

Compoziia mineral n microelemente (mg/l) Masa mg/l 22,3 8,6 0,025 0,025 0,83 0,25 Anioni SO42Cl-

Compoziia ionic a microelementelor

(m echivaleni/l)

Specificare
1. 2. MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O CuSO4.5H2O 3. 4. 5. CoCl2.6H2O KI Na2MoO4 H2O 6. 7. H3BO3 FeSO4 . 7 H2O . 2

molecular 223,01 287,54 249,68 237,93 166,01 241,95

mE/l 324,03 0,21

Cationi Mn++ Zn++ Cu++ Co++ K+ Na+

mE/l 263,90 59,82 0,20 0,21 5,00 2,07

61,83 278,03

6,2 27,8

8.

Na2 H2O

EDTA.

372,25

37,3

Total (mg/l)

103,33

324,24

331,2

214

Rodica Pop, 2008

Vitamine i aminoacizi componeni ai mediului de cultur Murashige Skoog (1962)

Concentraia n soluia normal Denumire mg/l

Acid nicotinic Piridoxin HCl Tiamin HCl Mezo-inozitol Glicin

0,5 0,5 0,1 100 2

215

Rodica Pop, 2008

List abrevieri

ADN acid dezoxiribonucleic AFLP - Amplified Fragment Length Polymorphism AIA - acid beta indolil- acetcic AIB - acid 3- indolil butiric ANA - acid alfa naftil acetic AP-PCR -Arbitrary Primed PCR BAP- benzil aminopurin CTAB - Cetyltrimethyl ammonium bromide DIECA - acid dietilditiocarbamic 2,4-D - 2,4 acid diclorfenoxiacetic DMSO - dimetil sulf oxid DNTP - dezoxiribonucleozid trifosfat EtBr bromur de etidiu FeEDTA Fier chelatizat (fier etilen diamin tetracetic acid) ISSR-PCR - Inter Simple Sequence Repeat Polymerase Chain Reaction)MAAP Multiple Arbitrary Amplicon Profiling MSAP - Methyl-Sensitive Amplified Length Polymorphsim NaCl clorur de sodiu NaOCl - hipoclorit de sodiu NaOH - hidroxid de sodiu PCR Polymerase Chain Reaction PVP - polivinilpirolidon RADP - Random Amplified Polymorphic DNA RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism SSR - Simple Sequence Repeats TDZ - thidiazuron (N-phenyl-N-1,2,3,-thidiazol-5-yl urea)

216

Rodica Pop, 2008

REZUMAT

Cercetrile paleontologice au dovedit c via de vie a existat nainte de apariia omului pe pmnt. Protostrmoii viei de vie cultivai astzi se pare c ar fi aprut n perioada cretacic a planetei. Fosilele vitaceaelor din perioada cretacic a planetei au fost ns contestate de majoritatea cercettorilor, deoarece existau confuzii ntre presupusele frunze pietrificate de vi de vie i cele ale arborilor forestieri. Dovezi certe provin din era neozoic sau teriar - perioada paleogen. Din aceast perioad au fost scoase la iveal cele mai multe fosile ale vitaceaelor, raportate la patru genuri actuale Vitis, Ampelopsis, Cayratia, Tetrastigma. Procesul esenial, care a generat trecerea de la via slbatic la via cultivat, este variabilitatea natural, care a permis omului s aleag viele cele mai valoroase din flora spontan i s le cultive n mod contient (RDEA i colab., 1995). Studiile ampelografice ajut la aprecierea valorii soiurilor dup criterii unice, la compararea caracterelor i nsuirilor sortimentului cultivat, la evitarea confuziilor dintre unele soiuri apropiate i eliminarea numeroaselor sinonimii. n stadiul actual, ampelografia consider c descrierea botanic este incomplet, fiind necesar i studierea influenei condiiilor ecologice i de cultur asupra variabilitii caracterelor morfologice i a nsuirilor agrobiologice i tehnologice. Cercetrile efectuate la via de vie au stabilit centrele genetice de formare a genului Vitis i apartenena soiurilor la anumite grupe ecologo-geografice. La soiurile cu origine cert se cunosc prerile diferiilor ampelografi privind momentul cnd acestea au fost introduse n producie sau semnalate n literatura de specialitate. De asemenea se fac aprecieri asupra provenienei i modului de apariie la soiurile aprute i fixate pe cale vegetativ. n cazul soiurilor cu origine necunoscut sau incert se menioneaz date referitoare la vechimea n cultur a soiului, ipoteze cu privire la provenien, rspndire (POENARU, 1970). n ameliorare, identificarea soiurilor n primele stadii de dezvoltare este extrem

217

Rodica Pop, 2008 de dificil, elementele caracteristice soiului aprnd n mod treptat, n anii urmtori. La prima apariie, unele organe cum ar fi crceii i inflorescenele sunt slab dezvoltate devenind, apoi, tot mai tipice pe msura trecerii anilor (ARDELEAN, 1986). De asemenea, n cazul portaltoilor, metodele ampelografice de identificare nu pot fi folosite dect n plantaiile de portaltoi, nu i dup altoire. n ultimii ani, odat cu apariia markerilor moleculari, identificarea cultivarelor s-a realizat la nivel de proteine cu ajutorul izoenzimelor i la nivel de ADN prin metode RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) i SSR (Simple Sequence Repeats). Datorit simplitii metodei RAPD Random Amplified Polymorphic DNA (WILLIAMS i colab., 1999), a faptului c necesit cantiti extrem de mici de ADN i a capacitii de a releva un grad nalt de polimorfism, aceasta a fost aplicat cu succes la diferite specii de plante, inclusiv la Vitis vinifera (WOLF i colab., 2001; RYAN i colab., 2001; TESSIER i colab., 1999; FANIZZA i colab., 1999; BOHM i colab., 1998; PAMFIL, 1999). Cercetrile de genetic molecular la via de vie sunt orientate, n general, spre identificarea polimorfismului existent n cadrul speciilor de Vitis i spre stabilirea originii filogenetice a unor specii sau soiuri. Originea i autenticitatea multor cultivare de vi de vie (Vitis vinifera), folosite pentru producia de vin n lume, este neclar i constituie subiectul multor controverse. n acest sens, ntr-un studiu, amprentele ADN generate cu ajutorul tehnicilor RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) i ISSR-PCR (Inter Simple Sequence Repeat Polymerase Chain Reaction) au fost folosite pentru a compara patru cultivare de Vitis vinifera folosite pe scar larg n Chile (Cabernet Sauvignon, Cabernet Franc, Merlot i Carmenere). Ca i referin extern a fost folosit material vegetal provenit din Frana. Ambele tehnici au fost capabile s evidenieze diferene ntre cultivarele studiate, chiar dac puterea de difereniere a metodei ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) a fost mai bun dect cea a metodei RAPD.

218

Rodica Pop, 2008

1. OBIECTIVELE CERCETRII, MATERIALUL I METODA

1.1. SCOPUL CERCETRILOR Variabilitatea somaclonal este considerat o surs de obinere de noi genotipuri n scop de ameliorare deschiznd noi posibiliti pentru aplicaii n viticultur. Cu toate acestea, informaii despre variabilitatea la plantele regenerate sunt destul de puine, pn n prezent fiind raportate numai cteva exemple de variabilitate somaclonal la via de vie. Avnd n vedere aceste deziderate, s-a considerat util abordarea unor cercetri n domeniul biotehnologiilor i al micropropagrii la specia Vitis vinifera. Scopul principal al cercetrilor noastre a constat n caracterizarea i stabilirea relaiilor filogenetice ntre zece soiuri de vi de vie, cu ajutorul metodologiei RAPD, precum i inducerea variabilitii somaclonale i testarea heteromorfismului molecular a somaclonelor obinute din cinci soiuri de vi de vie larg cultivate n Transilvania i chiar n Romnia. Cercetrile iniiate de noi, constituie, probabil, primele ncercri de identificare a variabilitii somaclonale la via de vie prin metoda RAPD.

1.2. OBIECTIVELE URMRITE N CERCETRILE AFERENTE TEZEI DE DOCTORAT Obiectivele principale s-au concretizat n urmtoarele aspecte: Stabilirea procolului de extracii de ADN i utilizarea tehnicii RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) n vederea identificrii polimorfismului genetic in vivo la zece soiuri de vi de vie provenite din cinci staiuni horticole amplasate n areale geografice diferite. Identificarea primerilor capabili s determine polimorfismul la nivel molecular ntre soiurile analizate. Stabilirea compoziiei mediilor de cultur, a tipului de hormoni i a concentraiilor acestora care s favorizeze obinerea de neoplantule, creterea i proliferarea lstarilor in vitro n urma multiplicrii prin lstrire axilar. 219

Rodica Pop, 2008 Alegerea tipului de explant i a mediilor de cultur adecvate pentru inducerea variabilitii somaclonale, respectiv obinerea de calus. Subcultivarea calusului pe un mediu de cretere. Stabilirea mediilor de cultur pentru regenerarea plantelor prin transferul calusului pe medii de inducere a organogenezei. Punerea n eviden a eventualelor diferene genetice aprute ntre regenerani, respectiv ntre somaclone i plantele mam din care au provenit prin analiza RAPD.

2. MATERIALE I METODE DE LUCRU

2.1. MATERIALUL BIOLOGIC

2.1.1. Materialul biologic utilizat n experienele de difereniere a soiurilor cu ajutorul markerilor moleculari Materialul biologic studiat a fost constituit din zece soiuri de vi de vie, provenite din cinci staiuni viticole din ara noastr amplasate n condiii pedoclimatice total diferite. Au fost analizate cinci soiuri de vi de vie pentru vin alb, dou soiuri pentru vin rou i trei soiuri pentru struguri de mas.
Soiurile pentru vin alb au fost: Feteasc alb, Feteasc regal, Riesling italian, Muscat Ottonel, Traminer roz.

Soiurile pentru vin rou au fost: Cabernet Sauvignon, Merlot. Soiurile pentru struguri de mas au fost: Napoca, Timpuriu de Cluj, Cetuia. Staiunile viticole din care s-a recoltat materialul biologic au fost: Reca, Blaj, Valea Clugreasc, Odobeti i Iai. 2.1.1.1. Primerii utilizai n amplificarea ADN-ului Pentru amplificarea probelor de ADN s-au utilizat un numr de 39 de primeri decanucleotidici, unul dintre primeri avnd 21 de nucleotide.

220

Rodica Pop, 2008 Proveniena primerilor a fost diferit, astfel: 15 primeri decanucleotidici sunt produi de University of British Columbia (UBC), 6 primeri de Pharmacia Biotech (PB), 18 de Mycroshinth (OPAB, OPA, OPE, OPAL, OPX, AB, GY169) (tabelul 1).

Tabelul 1 Primerii utilizai n amplificarea ADN Primers used in DNA amplification

Nr. No. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. Primer Primer UBC 228 UBC 241 UBC 245 UBC 285 UBC 286 UBC 421 UBC 436 UBC 537 UBC 538 UBC 563 UBC 564 UBC 570 UBC 571 UBC 584 UBC 599 PB 1 PB 2 PB 3 PB 4 PB 5 Secvena (5 3) Sequence (5 3) GCT GGG CCG A GCC CGA CGC G CGC GTG CCA G GGG CGC CTA G CGG AGC CGG C ACG GCC CAC C GAG GGG GCC A CGA AAG GAC T TGA TCT CTC C CGC CGC TCC T CGG CGT TAC G GGC CGC TAA T GCG CGG CAC T GCG GGC AGG A CAA GAA CCG C GGT GCG GGA A GTT TCG CTC C GTA GAC CCG T AAG AGC CCG T AAC GCG CAA C Nr. No. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. Primer Primer PB 6 OPAB 11 OPAB 18 OPE 14 AB 11 OPA 04 OPA 03 OPAL 20 OPX O3 OPA 01 GY 169 OPC-14 OPC 15 OPA 11 OPA 17 70.08 OPA 20 70.03 MIC 07 Secvena (5 3) Sequence (5 3) CCC GTC AGC A GTG CGC AAT G CTG GCG TGT C TGC GGC TGA G GTG CGC AAT G AAT CGG GCT G AGT CAG CCA C AGG AGT CGG A TGG CGC AGT C CAG GCC CTT C CTA AGC TGC TTT TGT TTG AGC TGC GTG CTT G GAC GGA TCA G CAA TCG CCG T GAC CGC TTG T CTG TAC CCC C GTT GCG ATC C ACG GTG CCT G TGT CTG GGT G

2.1.2. Materialul biologic utilizat n experienele de producere a variabilitii somaclonale n condiii de laborator

Materialul biologic utilizat pentru iniierea culturilor in vitro a fost constituit din lstarii aparinnd celor zece cultivare de vi de vie din cele cinci staiuni viticole menionate mai sus. n studiile privind inducerea calusogenezei s-au utilizat plantulele

micropropagate in vitro.

221

Rodica Pop, 2008 Materialul biologic folosit pentru studierea variabilitii somaclonale a fost reprezentat de regeneranii obinui din cultura de calus, respectiv cte zece somaclone din fiecare soi.

2.1.2.1. Medii de cultur folosite In toate experienele noastre, mediul de baz utilizat a fost Murashige Skoog (1962), suplimentat cu diferii hormoni, n funcie de scopul propus. Substanele biostimulatoare utilizate n cultura in vitro la via de vie au fost reprezentate de: auxin, acidul alfa naftil acetic (ANA) i citochinine, respectiv benzil aminopurina (BAP) i tidiazuronul (TDZ). n funcie de etapa parcurs n procesul de multiplicare in vitro s-a utilizat o anumit gam de concentraii pentru fiecare tip de hormon. 2.2. METODE DE LUCRU

2.2.1. Metode de lucru aplicate n experienele cu material biologic produs in vivo 2.2.1.1. Extracia de ADN n vederea executrii analizelor RAPD Extracia ADN-ului la via de vie este dificil datorit prezenei polifenolilor i a poliglucidelor n cantitate mare. De aceea, n experienele noastre s-a ncercat optimizarea unui protocol de extracie a ADN-ului prin care s se obin o puritate ct mai mare. In acest sens, a fost adugat n tamponul de extracie polivinilpirolidona (PVP), mercaptoetanol, acid ascorbic i acidul dietilditiocarbamic (DIECA). Pentru a obine un ADN de calitate care s poate fi utilizat n tehnica RAPD- lui au fost testate trei metode de izolare: Protocolul A descris de ROGER i colab. 1988 Protocolul B descris de ROGER i colab., 1988 modificat Protocolul C descris de LODHI i colab., 1994, modificat (POP i colab., 2003).

222

Rodica Pop, 2008 2.2.1.2. Cuantificarea ADN-ului Dup extracia ADN-ului, probele au fost cuantificate spectofotometric cu ajutorul aparatului BioPhotometer Eppendorf. 2.2.1.3. Protocol de amplificare RAPD Amplificarea probelor s-a realizat n aparatul Eppendorf Mastercycler gradient programat astfel: 3 minute la 950C predenaturare, urmat de 45 de cicluri cu urmtorul profil de temperatur : 5. 1 minut la 930C denaturare 6. 1 minut la 340C fixarea primerilor 7. 1 minut la 720C extensie 8. extensia final 10 minute la 720C. 2.2.1.4. Analiza imaginilor Analiza gelurilor s-a fcut cu ajutorul programului Total Lab TL 100, obinndu-se matricea binar. Matricea binar s-a utilizat apoi pentru calcularea distanelor genetice. Pentru calcularea distanelor genetice i realizarea dendrogramei s-a utilizat programul RAPDistance 1.04, utiliznd coeficientul Jaccarrd pentru distanele genetice, respectiv metoda Neighbor Joining Tree pentru dendrogram.

2.2.2. Metode de lucru aplicate n experienele cu material biologic produs in vitro 2.2.2.1. Multiplicarea prin lstrire axilar Pentru studierea capacitii regenerative la vi de vie, au fost utilizate ca surs de explante segmentele nodale provenite de pe lstarii recoltai din cmp.

223

Rodica Pop, 2008 Mediul pentru iniierea culturii in vitro a fost Murashige Skoog (1962) suplimentat cu concentraii diferite de hormoni, realiznd trei variante de medii de cultur: V1 = Mediul MS 0,5 mg/l BAP, 0,5 mg/l ANA, 100 mg/l hidrolizat de cazein V2 = Mediul MS - 1,0 mg/l BAP, 0,5 mg/l ANA, 100 mg/l hidrolizat de cazein V3 = Mediul MS 2,5 mg/l BAP, 0,5 mg/l ANA, 100 mg/l hidrolizat de cazein.

2.2.2.2. Cultura de calus Cultura de calus a fost iniiat att din segmente nodale ct i din frunze, de la plantulele obinute in vitro pe mediul de cultur MS (1962). n vederea iniierii culturii de calus, mediul bazal MS (Murashige Skoog, 1962) a fost suplimentat cu acid naftil acetic (ANA) n dou concentraii: MS1 - cu 10 mg/l ANA i 1,0 mg/l BAP MS2 cu 5,0 mg/l ANA i 1,0 mg/l BAP

2.2.2.3. Inducerea i dezvoltarea lstarilor multipli Pentru inducerea formrii lstarilor multipli, calusul morfogenetic obinut din segmentele nodale a fost transferat pe mediul MS suplimentat cu concentraii variate de TDZ - thidiazuron (N-phenyl-N-1,2,3,-thidiazol-5-yl urea) n combinaie cu acidul alfa naftil acetic, n concentraie de 0,5 mg/l.

2.2.2.4. Extracia, cuantificarea, amplificare ADN-ului i electroforeza n gel de agaroz Extracia de ADN s-a fcut din frunzele neoplantulelor obinute dup a 6-a, a 10-a i a 15-a pasare pe medii noi de cultur. De la fiecare cultivar s-au analizat cte zece somaclone. Metodele de cuantificare, amplificare i electroforez n gel de agaroz au fost similare cu cele aplicate n experienele cu material biologic produs in vivo.

224

Rodica Pop, 2008

3. REZULTATE I DISCUII
3.1. REZULTATE PRIVIND EXTRACIA PROBELE DE ADN PROVENITE DIN MATERIALUL BIOLOGIC IN VIVO Din datele obinute s-a constatat c toi cei trei factori experimentali (soiul, metoda de extracie i localitatea de provenien), au influenat distinct semnificativ cantitatea de ADN extras. Cantitatea de ADN obinut prin cele trei variante de extracie a fost corespunztoare (77,5-4518,6 ng/l), avnd n vedere c pentru amplificare s-au utilizat 50 ng. Cea mai mic cantitate de ADN s-a obinut la soiul Cetuia provenit de la Valea Clugreasc, atunci cnd pentru extracie s-a aplicat protocolul A (77 ng/l). Cea mai mare cantitate de ADN respectiv de 4518,6 ng/l, s-a obinut tot la soiul Cetuia, provenit de aceast dat de la Blaj, prin utilizarea protocolului C. In ceea ce privete puritatea de AND obinut, din analiza datelor se constat c cei trei factori experimentali au influenat distinct semnificativ puritatea ADN-ului. Aceast semnificaie se pstreaz i n cazul interaciunilor duble soi x metod de extracie (F = 7,78**>1,62; 2,09), localitate x metod de extracie (F = 20,34**>1,98;
2,60), localitate x soi (F = 7,18**>1,45; 1,69), ca i pentru interaciunea tripl soi x

metod de extracie x localitate (F = 5,08**>1,35; 1,53). Diferenele ntre media puritii ADN-ului obinut prin cele trei protocoale se menin semnificative, cel mai eficient protocolul fiind C, protocolul A situndu-se pe ultimul loc. 3.1.1. Rezultate privind amplificarea i electroforeza produilor de reacie Din totalul de 39 de primeri utilizai iniial, s-au obinut polimorfisme cu un numr de 22 primeri, primeri care au fost utilizai i pentru amplificarea somaclonelor obinute n experienele in vivo. 3.1.2. Rezultate privind analiza imaginilor i interpretarea datelor Notarea benzilor s-a realizat direct pe fotografiile gelurilor, prin raportarea la markerul ADN. Benzile polimorfice au fost notate cu 1, iar cele monomorfice cu 0. Prezena

225

Rodica Pop, 2008 benzilor (notate cu 1) i absena benzilor (notate cu 0) au fost nscrise ntr-un tabel sub form de matrice binar. Numrul total de benzi generate a fost de 192, dintre care 165 de benzi au fost polimorfice, benzile monomorfice fiind excluse din interpretarea statistic a
datelor.

Din datele obinute de noi a rezultat faptul c toi primeri utilizai au generat un numr de minim dou benzi polimorfice. Procentul de polimorfism a avut valori cuprinse ntre 100% (n cazul primerul UBC 228) i 50% (pentru primerii OPAB 18 i OPA 01), valori care conform metodei de analiz a datelor pot fi considerate asigurate statistic (CALDERINI i colab., 1999). Analiza gelurilor din experienele organizate de noi relev faptul c numrul cel mai mare de benzi polimorfice au fost obinute cu primerul 6 PB, respectiv 15 benzi (fig. 1), urmat de primerul 5 PB (13 benzi polimorfice). Numrul cel mai mic de benzi au fost generate de primerul OPA 01 3 benzi. Datele primare, obinute cu ajutorul programul Total Lab 100 au fost prelucrate cu programul RAPDistance 1.04, care a calculat distanele genetice pe baza coeficientului Jaccard.

Fig. 1. Produii de amplificare obinui cu primerul PB 6 la cele zece soiuri de vi de vie analizate Amplification products obtained with primer PB 6 in ten cultivars of Vitis vinifera tested

226

Rodica Pop, 2008

3.1.3. Analiza dendrogramei Apropierea genetic ntre cele zece soiuri de vi de vie analizate, stabilit pe baza matricei distanelor genetice i a algoritmului Neighbor Joining Tree sunt prezentate n figura 2 sub forma unei dendrograme. In cadrul dendrogramei se evideniaz dou grupuri principale, A i B. Primul grup cuprinde soiurile Feteasc alb, Feteasc regal, Riesling italian, Cetuia, Timpuriu de Cluj i Muscat Ottonel, iar cel de al doilea grup soiurile Merlot, Cabernet Sauvignon, Traminer roz i Napoca. Grupul A este constituit, la rndul lui, din alte dou subgrupuri, notate cu A1 i A2. Subgrupul A1 cuprinde soiurile Feteasc alb, Feteasc regal, Riesling italian, Cetuia i Timpuriu de Cluj. Soiurile Feteasc alb i Feteasc regal sunt n aceeai ramur, distana genetic dintre ele fiind de 0,4421. Din punct de vedere ampelografic cele dou soiuri sunt considerate apropiate datorit particularitilor lor morfologice. Apropierea genetic dintre cele dou soiuri rezultat prin analiza RAPD, confirm deci rezultatele anterioare conform crora soiurile respective au o origine comun.

227

Rodica Pop, 2008 Soiurile Cetuia i Timpuriu de Cluj au un printe comun, n dendrogram fiind situate n acelai subgrup. i n acest caz analiza RAPD a confirmat originea comun a acestor dou soiuri.

Fig. 2. Dendrograma obinut la cele zece soiuri de vi de vie analizate Dendrogram of the ten cultivars of Vitis vinifera tested

Grupul B este mprit i el n dou subgrupuri, respectiv B1 i B2. Grupul B1 cuprinde soiurile Merlot, Cabernet Sauvignon i Traminer roz. Rezultatele experienelor noastre confirm faptul c soiul Cabernet Sauvignon i Merlot sunt apropiate din punct de vedere genetic. Soiul Traminer roz, dei este un soi de struguri pentru vinuri albe, se pare c este mult mai apropiat genetic de soiurile roii. O explicaie ar consta n faptul c acest 228

Rodica Pop, 2008 soi, din punctul de vedere al clasificrii pe grupe ecologo-geografice, face parte din Proles occidentalis, la fel ca i soiul Cabernet Sauvignon i Merlot. In subgrupul B2 este prezent un singur soi i anume Napoca, ceea ce sugereaz un grad mai ndeprtat de nrudire cu celelalte soiuri analizate.

3.2. REZULTATE OBINUTE N EXPERIENELE DE MULTIPLICARE IN VITRO

3.2.1. Rezultate obinute n experienele de multiplicare prin lstrire axilar Studierea variabilitii somaclonale presupune existena unui numr mare de explante. Pentru a asigura o mai mare uniformitate genetic a descendenilor s-a ales ca sistem de micropropagare multiplicarea prin lstrire axilar. Trebuie remarcat faptul c apariia lstarilor in vitro, ca urmare a multiplicrii prin lstrire axilar, a fost notat la 20 de zile dup iniierea culturii, dar numrarea lstarilor i msurtorile privind lungimea acestora i numrul de noduri/lstar au fost executate la opt sptmni de la iniierea culturii. 3.2.1.1. Numrul de lstari obinui prin micromultiplicare prin lstrire axilar Datele privind influena soiului, a mediului de cultur i a localitii asupra numrului de lstari obinui prin multiplicarea din segmente nodale la via de vie au fost prelucrate statistic, fiind prezentate sub forma tabelului varianelor. Din proba F rezult c toi factorii experimentali (soi, mediu de cultur, localitatea de provenien), precum i interaciunile simple, duble i cea tripl dintre acetia au avut influene semnificative asupra numrului de lstari obinui prin multiplicarea din segmente nodale. Analiznd influena soiului i a mediului de cultur asupra numrului de lstari obinui prin micropropagare prin lstari axilari la via de vie, datele prezentate n tabelul 2 relev faptul c att soiul ct i mediul de cultur au avut efecte semnificative asupra acestui caracter.

229

Rodica Pop, 2008 Tabelul 2 Influena soiului (A), a mediului de cultur (B) i a interaciunii (A x B) asupra numrului de lstari de vi de vie obinui prin micropropagare Effects of cultivars (A), culture medium (B) and interaction (A xB) upon the number shoots of Vitis vinifera micropropagated
Soiul Cultivar Feteasc alb Feteasc regal Muscat Ottonel Riesling italian Traminer roz Cabernet Sauvignon Napoca Cetuia Timpuriu de Cluj Merlot Media mediu de cultur Mean of culture medium Mediul de cultur Culture medium MS-0,5 mg/l MS 1,0 mg/l MS 2,5 mg/l BAP BAP BAP 1,18 t 2,76 lm 6,09 e 1,60 p 3,09 j 5,57 g 1,46 r 3,04 j 6,58 c 1,46 r 2,74 m 7,12 b 1,40 r 4,82 h 6,30 d 1,49 r 2,91 k 7,70 a 1,42 r 2,52 n 5,65 g 1,30 s 2,07 o 2,83 kl 1,46 r 2,49 n 3,78 i 1,68 p 3,13 j 5,95 f 1,45 P* 2,96 N 5,76 M Media soi Mean of cultivar 3,34 DE 3,42 D 3,69 B 3,77 B 4,17 A 4,03 A 3,20 E 2,07 G 2,58 F 3,59 C

DS 5% pentru dou medii soi (SD 5% for two means of variety) = 0,15-0,17 DS 5% pentru dou medii mediu de cultur (SD 5% for two means of culture medium) = 0,06-0,07 DS 5% pentru dou medii soi x mediu de cultur (SD 5% for two means of interaction) = 0,09-0,10 * Diferenele dintre oricare dou variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative *The differences between any two values followed by at least a common letter are not significant

3.2.1.2. Lungimea lstarilor obinui prin multiplicarea din segmente nodale Ca i n cazul numrului de lstari, i pentru lungimea lstarilor obinui prin culturi in vitro de segmente nodale, la cele zece soiuri de vi de vie, pe trei medii de cultur diferite, se observ din datele obinute, c toi factorii experimentali i toate interaciunile dintre acetia (duble i tripl) au efecte semnificative asupra acestui caracter. Influena soiului i a mediului de cultur asupra lungimii lstarilor de vi de vie obinui prin micropropagare din segmente nodale este prezentat n tabelul 3. Ca i n cazul caracterului studiat anterior, pe primele dou locuri se situeaz dou soiuri pentru vin alb (Traminer roz: 5,55 cm i Riesling italian: 4,98) urmat de data aceasta, 230

Rodica Pop, 2008 la diferene semnificative, de un soi pentru vinuri roii (Cabernet Sauvignon: 4,84 cm). Celelalte soiuri nregistreaz valori mult mai mici ale caracterului studiat, ce ajung pn la 3,40 cm la soiul de struguri de mas Timpuriu de Cluj. Tabelul 3 Influena soiului (A), a mediului de cultur (B) i a interaciunii (A x B) asupra lungimii lstarilor (cm) de vi de vie obinui prin micropropagare Effect of cultivars (A), culture medium (B) and interaction (A x B) upon the length (cm) of Vitis vinifera shoob obtained micropropagated
Soiul Cultivar Feteasc alb Feteasc regal Muscat Ottonel Riesling italian Traminer roz Cabernet Sauvignon Napoca Cetuia Timpuriu de Cluj Merlot Media mediu de cultur Mean of culture medium Mediul de cultur Culture medium MS-0,5 mg/l MS 1,0 mg/l MS 2,5 mg/l BAP BAP BAP 3,08 o 3,40 m 4,52 gh 3,26 n 3,55 lm 4,57 gh 3,70 k 3,94 j 4,76 f 3,54 lm 4,50 h 6,89 c 3,22 n 5,22 e 8,22 a 3,58 l 3,79 k 7,14 b 3,72 k 3,99 j 4,54 gh 2,58 q 3,48 m 4,60 g 2,13 r 2,93 p 5,14 e 2,95 p 4,13 i 6,13 d 3,18 C* 3,89 B 5,65 A Media soi Mean of cultivar 3,67 IJ 3,79 I 4,13 H 4,98 E 5,55 D 4,84 F 4,08 H 3,55 J 3,40 K 4,40 G

DS 5% pentru dou medii soi (SD 5% for two means of variety) = 0,15-0,17 DS 5% pentru dou medii mediu de cultur (SD 5% for two means of culture medium) = 0,03 DS 5% pentru dou medii soi x mediu cultur (SD 5% for two means of interaction) = 0,09-0,10 * Diferenele dintre oricare dou variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative *The differences between any two values followed by at least a common letter are not significant

3.2.1.3. Numrul de noduri/neoplantul observat n urma micromultiplicrii din segmente nodale la via de vie Ca i n cazul celor dou caractere analizate anterior, tabelul varianei pentru influena soiului, mediului de cultur i a localitii asupra numrului de noduri/neoplantul obinute prin micromultiplicare din segmente nodale, la via de vie, arat o prob F ce scoate n eviden aciunea distinct semnificativ a tuturor factorilor i interaciunilor dintre factori (tabelul 4). Tabelul 4 231

Rodica Pop, 2008 Analiza varianei pentru experiena trifactorial de tipul 10 x 3 x 5 (soi x mediul de cultur x localitate de provenien) (Influenta soiului, mediului de cultur i a localitii asupra numrului de noduri obinui prin micromultiplicare din segmente nodale la via de vie) The three way Anova type experiment 10 x 3 x 5 (cultivars x culture medium x provenance)
Cauza variabilitii Cause of variability Parcele mari Repetiii Factorul A (soiul de vi de vie) Eroare (a) Parcele mijlocii Factorul B (mediul de cultur) Interaciunea A x B Eroare (b) Parcele mici SP SS 531,47 1,03 525,96 4,478 1557,29 1091,20 458,05 8,034 78,57 14,37 19,13 2,99 26,29 15,789 GL DF 29 2 9 18 60 2 18 40 360 4 36 8 72 240 58,44 0,249 545,60 2716,53**>3,04;4,71 25,45 126,70**>1,62;2,09 0,2008 3,59 0,53 0,37 0,37 0,0658 54,62**>2,41;3,41 8,08**>1,45;1,69 5,69**>1,98;2,60 5,55**>1,35;1,53 234,93**>1,92; 2,50 s2 Proba F F test

Factorul C (localitatea de provenien)

Interaciunea A x C Interaciunea B x C Interaciunea A x B x C Eroare (c)

Analiznd influena soiului asupra numrului de noduri/neoplantul se observ c, ntre cele zece soiuri luate n studiu, exist diferene semnificative privind acest caracter. Cel mai mare numr de noduri/neoplantul se nregistreaz la soiul Traminer roz (6,65 noduri/neoplantul) urmat, la diferene semnificative, de soiul Riesling italian (4,61 noduri/neoplanutul). Ordinea variantelor celor mai bune pentru acest caracter este identic cu cea nregistrat la lungimea neoplantulelor fapt ce vine n sprijinul afirmaiei anterioare privind corelaia direct i pozitiv (r = 0,90**) ntre lungimea neoplantulei i numrul de noduri pe care l formeaz. Mediul de cultur a influenat n mod i mai evident dect soiurile numrul de noduri/neoplantul nregistrat n experien (tabelul 5). Mediul MS 2,5 mg/l BAP duce la formarea unor neoplantule cu cel mai mare numr de noduri (6,07) celelalte dou medii plasndu-se mult sub valoarea menionat mai sus (mediul MS 0,5 mg/l

232

Rodica Pop, 2008 BAP = 2,35 noduri/neoplantul, iar mediul MS 1,0 mg/l BAP = 3,45 noduri/neoplantul).
Tabelul 5

Influena soiului (A), a mediului de cultur (B) i a interaciunii (A x B) asupra numrului de noduri/neoplantule obinut prin micromultiplicare din segmente nodale la via de vie The effect of cultivar (A), culture medium (B) and interaction (A x B) upon the number of nodes/neoplants obtained in Vitis vinifera by micropropagation from nodal semgments
Soiul Cultivar Feteasc alb Feteasc regal Muscat Ottonel Riesling italian Traminer roz Cabernet Sauvignon Napoca Cetuia Timpuriu de Cluj Merlot Media mediu de cultur Mean of culture medium Mediul de cultur Culture medium MS-0,5 mg/l MS 1,0 mg/l MS 2,5 mg/l BAP BAP BAP 3,42 k 2,20 o 6,80 b 2,42 n 3,03 lj 5,73 d 2,09 op 4,59 f 4,81 e 2,91 jk 4,45 g 6,48 c 2,84 kl 4,94 e 12,16 a 2,72 lm 2,84 kl 6,73 b 2,63 m 3,35 k 4,17 h 1,41 r 3,07 l 3,66 j 1,11 s 2,22 o 4,28 h 1,98 p 3,84 i 5,83 d 2,35 P* 3,45 N 6,07 M

Media soi
Mean of cultivar 4,14 C 3,72 D 3,83 D 4,61 B 6,65 A 4,10 C 3,38 E 2,71 F 2,54 F 3,88 D

DS 5% pentru dou medii soi (SD 5% for two means of variety) = 0,21-0,24 DS 5% pentru dou medii mediu de cultur (SD 5% for two means of culture medium) = 0,11-0,14 DS 5% pentru dou medii soi x mediu de cultur (SD 5% for two means of interaction) = 0,14-0,17 * Diferenele dintre oricare dou variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative *The differences between any two values followed by at least a common letter are not significant

3.2.2. Rezultate obinute n experienele de inducere a calusogenezei Variabilitatea somaclonal este asociat adesea cu regenerarea direct din calus sau din suspensii de celule (KARP, 1989). Se apreciaz c exist o strns legtur ntre parcurgerea fazei de calus i variabilitatea somaclonal, fapt ce a determinat ca, n micropropagare n scop de nmulire fidel a materialului iniial, s se evite formarea calusului.

233

Rodica Pop, 2008 Avnd n vedere c unul din obiectivele tezei a fost acela al studierii variabilitii somaclonale la via de vie, n experienele executate n acest sens a fost indus etapa de formare a calusului. Concentraia de ANA 10 mg/l, utilizat de noi n mediile de cultur, a dat natere unui calus friabil, n timp ce concentraia mai mic, respectiv de 5 mg/l ANA a dus la obinerea unui calus nefriabil i n cantitate foarte mic. 3.2.3. Rezultate experimentale privind regenerarea de neoplantule din calus meninut timp ndelungat n cultur Capacitatea organogen sau embriogen a esutului calusal este dependent de factorii endogeni i exogeni, de numrul pasrilor, de condiiile de cultur i de vrsta calusului. Literatura citeaz cazuri n care calusurile repicate periodic, chiar i dup o perioad de cinci ani i-au meninut potenialitatea ridicat de a regenera plante. n cazul calusului obinut de noi la via de vie, capacitatea regenerativ s-a meninut pentru o perioad mult mai scurt, de circa 7-8 luni.

3.2.3.1. Numrul de neoplantule regenerate Experienele de regenerare de neoplantule din calus meninut timp ndelungat n cultur (3-4 pasri) au fost i ele de tip bifactorial cuprinznd cele zece soiuri de vi de vie menionate anterior i trei medii de cultur MS la care s-au adugat cantiti diferite de TDZ: 0,5 mg/l, 1,0 mg/l i 2,0 mg/l. Aceste variante de mediu au fost alese pe baza datelor din literatura de specialitate care menioneaz faptul c adaosul de cantiti mici i moderate de TDZ n mediul de cultur stimuleaz regenerarea de neoplantule din calusul organogen, mai ales la speciile lenoase i recalcitrante. Din tabelul varianelor se constat c toi factorii experimentali (soi, mediu de cultur), precum i interaciunea soi x mediu de cultur au avut influene semnificative asupra numrului de neoplantule regenerate (tabelul 6).

234

Rodica Pop, 2008 Tabelul 6 Tabelul varianei. Numrul de neoplantule regenerate n experiena bifactorial (10 x 3) cu soiuri de vi de vie i medii de cultur folosite n regenerarea de neoplantule din calus Table of variance. Number of plant regenerated from callus in two way experiment (10 x 3) with cultivars of Vitis vinifera on culture media
Cauza Cause Total Repetiii Variante Factorul A Factorul B Ineraciunea A x B Eroare SPA SS 3233,42 5,56 3223,57 16,90 3177,12 29,55 4,29 GL DF 89 2 29 9 2 18 58 1,9 1588,6 1,6 0,1 25,4** > 2,04; 2,72 21484,8**> 3,15; 4,98 22,2**> 1,81; 2,32 s2 Proba F F test

Analiznd influena soiului asupra numrului de lstari regenerai se observ, din datele tabelului 7, c aceasta este relativ omogen, toate soiurile regenernd un numr de 8,13 pn la 9,60 lstari/calus regenerativ.

3.2.3.2. Lungimea lstarilor (neoplantulelor) regenerai Tabelul 8 prezint sinteza rezultatelor experimentale privind lungimea lstarilor regenerai din calus la cele zece soiuri de vi de vie pe trei medii de cultur. Analiza influenei mediului asupra lungimii lstarilor regenerai urmeaz aproape acelai model ca i cel descris la numrul de lstari regenerai. Concret, cea mai mare lungime a lstarilor regenerai se nregistreaz la mediul cu cea mai sczut concentraie de TDZ (0,5 mg/l). Mediile cu concentraii moderate (1,0 mg/l) i mari (2,0 mg/l) de TDZ duc la obinerea unor lstari scuri i foarte scuri comparativ cu varianta trei de mediu.

235

Rodica Pop, 2008 Tabelul 7 Numrul de neoplantule regenerate n experiena bifactorial (10 x 3) cu soiuri de vi de vie i medii de cultur folosite n regenerarea de neoplantule din calus Number of plants regenerated in two way experiment (10 x 3) with Vitis vinifera cultivars and culture media
Mediul de cultur Culture medium MS 1,0 mg/l MS 2,0 mg/l MS - 0,5 mg/l TDZ TDZ TDZ 4,50 g 4,20 gh 15,70 c 6,50 d 3,70 h 18,60 a 5,30 f 4,50 g 18,70 a 5,40 f 3,80 h 18,60 a 4,50 g 3,90 gh 17,50 b 6,30 d 4,30 gh 17,50 b 5,50 ef 5,70 def 5,80 def 6,10 de 4,50 g 3,80 h 4,50 g 3,97 gh 15,80 c 17,30 b 16,80 b 17,30 b Media soi Mean of cultivar 8,13 F 9,60 A 9,50 AB 9,27 C 8,63 E 9,37 BC 8,60 E 8,93 C 9,03 CD 9,12 D

Soiul Cultivar Feteasc alb Feteasc regal Muscat Ottonel Riesling italian Traminer roz Cabernet Sauvignon Napoca Cetuia Timpuriu de Cluj Merlot Media mediu cultur Mean of culture medium

5,56 N*

4,12 P

17,38 M

DS5% pentru dou medii soi (SD 5% for two means of variety) = 0,14-0,17 DS5% pentru dou medii de cultur (SD 5% for two means of culture medium) = 0,28-0,30 DS 5% pentru dou medii soi x mediu de cultur (SD 5% for two means of interaction) = 0,57-0,69 * Diferenele dintre oricare dou variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative *The differences between any two values followed by at least a common letter are not significan

3.2.4. Rezultate privind identificarea, la nivel molecular, a variabilitii somaclonale indus prin regenerarea din calus meninut timp ndelungat n cultur 3.2.4.1. Rezultate privind extracia i cuantificarea ADN-ului Extracia de ADN s-a realizat pe baza protocolului elaborat de LODHI i colab, modificat (POP i colab., 2003). Cantitatea de ADN obinut a fost corespunztoare (220 ng/l i 1947 ng/l), 236

Rodica Pop, 2008 avnd n vedere c pentru amplificare s-au utilizat 50 ng. Puritatea ADN-ului a fost, de asemenea, corespunztoare fiind cuprins ntre 1,7 i 2,0. Extracia de ADN s-a fcut, la neoplantulele regenerate, din calus din subcultura a 5-a, a 10-a i a 15-a. Tabelul 8 Lungimea (cm) a neoplantulelor regenerate n experiena bifactorial (10 x 3) cu soiuri de vi de vie i medii de cultur folosite n regenerarea de neoplantule din calus Length (cm) of plants in the two way experiment (10 x 3) with cultivars of Vitis viniffera and culture media used in plant regeneration from callus
Mediul de cultur Media soi Culture medium Mean of MS 1 mg/l TDZ MS 2 mg/l TDZ MS- 0,5 mg/l TDZ cultivar Feteasc alb 1,47 bc 0,80 def 2,60 a 1,62 B Feteasc regal 1,37 c 0,70 ef 2,80 a 1,62 B Muscat Ottonel 1,60 bc 0,80 def 2,73a 1,71 A Riesling italian 1,60 bc 0,60 f 2,73 a 1,64 B Traminer roz 1,57 bc 0,57 f 2,60 a 1,58 C Cabernet Sauvignon 1,70 b 1,00 d 2,60 a 1,77 A Napoca 1,63 bc 0,63 ef 2,53a 1,60 B Cetuia 1,60 bc 0,60 f 2,67 a 1,62 B Soiul Cultivar Timpuriu de Cluj Merlot Media mediu cultur Mean of culture medium 1,60 bc 1,50 bc 1,56 N* 0,70 ef 0,87 de 0,73 P 2,67 a 2,77 a 2,67 M 1,66 B 1,71 A

DS5% pentru dou medii soi (SD 5% for two means of variety) = 0,08-0,110 DS5% pentru dou medii de cultur (SD 5% for two means of culture medium) = 0,17-0,18 DS 5% pentru dou medii soi x mediu de cultur (SD 5% for two means of interaction) = 0,28-0,35 * Diferenele dintre oricare dou variante urmate de cel puin o liter comun sunt nesemnificative *The differences between any two values followed by at least a common letter are not significan

3.2.4.2. Rezultate privind amplificarea i electroforeza produilor de reacie Pentru amplificarea probelor s-au folosit cei 22 primeri care au dat benzi polimorfice n cazul extracie de ADN pentru soiurile de vi de vie recoltate din cmp. S-a constatat c neoplantule regenerate la subcultura a 15-a prezint variabilitate la nivel molecular. Aceast variabilitatea a fost observat la un numr mic de soiuri (cinci), acestea prezentnd un numr mic de somaclone. Cele mai multe 237

Rodica Pop, 2008 somaclone au fost identificate la soiul Merlot (cinci). n gelurile de agaroz mai nti au fost pipetate probele de ADN aparinnd plantei mam, urmate apoi de probele de ADN ale somaclonelor. Notaiile din imagini fiind urmtoarele: Cabernet Sauvignon CR (planta mam), CR1, CR2, CR3; Feteasc alb - F (planta mam), F1; Merlot Mr (planta mam), Mr1, Mr2, Mr3, Mr4, Mr5; Traminer roz T (planta mam), T1 i Riesling italian Ri (planta mam) Ri1, Ri2, Ri3. Fragmentele rezultate prin amplificarea cu primerii polimorfici au avut lungimea cuprins ntre 200 i 2000 pb, majoritatea avnd ntre 300 i 1400 pb. Numrul cel mai mare de benzi polimorfice au fost obinute cu primerul OPX 03 (12 benzi) (fig. 2), cu primerul OPE 14 (11 benzi polimorfice), OPA 04 (10 benzi polimorfice), PB 6 (10 benzi polimorfice), PB 1 (9 benzi polimorfice), primerul PB 3 (7 benzi polimorfice), primerul PB 5 (8 benzi polimorfice), primerul 70.08 (6 benzi polimorfice). Ceilali primeri utilizai au format de asemenea ntre ase i nou benzi polimorfice.

Fig. 2. Produii de amplificare obinui cu primerul OPX 03 la somaclonele de vi de vie analizate Amplification products obtained with primer OPX 03 in somaclones of Vitis vinifera analysed 238

Rodica Pop, 2008 Din figurile obinute i analizate reiese n mod clar c, la toate somaclonele analizate, exist diferene notabile de structur genetic, relevate de markeri RAPD. Dendrograma realizat pe baza distanelor genetice dintre soi i somaclonele sale ilustreaz i mai clar msura n care, la nivel molecular, somaclonele se deosebesc de soiurile din care provin. Apropierea genetic ntre soiurile de vi de vie i somaclonele identificate n aceste soiuri, stabilit pe baza matricei distanelor genetice i a algoritmului Neighbor Joining Tree, sunt prezentate n figura 3 sub forma unei dendrograme.

Fig. 3. Dendrograma obinut la soiurile i somaclonele de vi de vie analizate Dendrogram of cultivars and somaclones of Vitis vinifera analysed n cadrul dendrogramei se evideniaz faptul c soiul de vi de vie i somaclonele obinute din acel soi sunt apropiat grupate. De asemenea, se constat c

239

Rodica Pop, 2008 soiurile Cabernet Sauvignon i Merlot, mpreun cu somaclonele lor sunt reprezentate n acelai subgrup, la fel ca i n cazul dendrogramei obinute pentru cele zece soiuri de vi de vie analizate in vivo. Un alt subgrup este format din soiurile i somaclonele de Feteasc alb i Riesling italian, similar cu grupul reprezentat n dendrograma celor zece soiuri de vi de vie analizate. Faptul c somaclonele fiecrui soi sunt strict reprezentate n acelai grup atest acurateea rezultatelor experimentale obinute. Pe de alt parte, analiza dendrogramei n cadrul fiecrui grup relev faptul c somaclonele sunt cu adevrat diferite din punctul de vedere al structurii genetice, att n interiorul grupului ct i ntre grupe.

4. CONCLUZII
4.1. CONCLUZII REFERITOARE LA VARIABILITATEA, LA NIVEL MOLECULAR A MATERIALULUI BIOLOGIC PROVENIT IN VIVO
In urma cercetrilor noastre efectuate la ni vel molecular la cele zece soiuri de vi de vie provenite din cinci localiti, se desprind urmtoarele concluzii:

4.1.1. n analizele RAPD o condiie esenial o constituie obinerea unui ADN n cantiti corespunztoare i de puritate mare. Dintre cele trei protocoale de extracie utilizate s-a dovedit c protocolul C a dat cele mai bune rezultate. Cu ajutorul acestui protocol, puritatea ADN-ului a avut valori cuprinse ntre 1,7 i 2, puritate ce a permis utilizarea lui n manipulrile ulterioare. Includerea n tamponul de extracie a inhibitorilor de fenoloxidaz, cum ar fi acidul dietilenditiocarbamic (DIECA), a antioxidanilor acidul ascorbic sau a polivinilpirolidonei (PVP) au eliminat brunificarea extractului. 4.1.2. Din analiza varianei, aplicat rezultatelor de extracie a ADN, a reieit c toi cei trei factori experimentali (soiul, metoda de extracie i localitatea), au influenat distinct semnificativ cantitatea de ADN extras. 4.1.3. ntre soiuri exist diferene asigurate statistic n ceea ce privete cantitatea de ADN obinut, indiferent de metoda de extracie aplicat, ceea ce sugereaz c 240

Rodica Pop, 2008 genotipul, la via de vie, influeneaz n mod hotrtor cantitatea de ADN ce poate fi extras prin metode curent folosite n acest scop. Metoda de extracie a avut, de asemenea, o influen semnificativ asupra cantitii de ADN ce se poate obine, indiferent de localitatea de experimentare.
4.1.4. Datele rezultate din analiza varianei pentru experiena trifactorial arat

c cei trei factori experimentali au influenat distinct semnificativ i puritatea ADNului. Aceast semnificaie se pstreaz i n cazul interaciunilor duble soi x metod de extracie, localitate x metod de extracie, localitate x soi, ca i pentru interaciunea tripl soi x metod de extracie x localitate. 4.1.5. Calcularea ecuaiei de regresie relev faptul c relaia dintre cantitate i puritate este liniar, datele individuale grupndu-se destul de strns n jurul liniei de regresie, n ambele cazuri: r calculat pe baza criteriului soi x metod de extracie i pe baza criteriului localitate x metod de extracie. Corelaia dintre cele dou variabile este direct i pozitiv, creterea cantitii de ADN ducnd la o cretere a puritii acestuia (r = 0,89**). 4.1.6. Coeficientul de corelaie r = 0,86** indic, de asemenea, o legtur direct ntre mediile localitilor i cantitatea de ADN extras, ceea ce duce n mod automat la sporirea semnificativ a puritii acestuia. 4.1.7. Alegerea primerilor s-a dovedit destul de dificil, deoarece din cei 39 de primeri utilizai numai 22 au dat benzi polimorfice distincte. 4.1.8. Adugarea PVP-ului n concentraie de 2% n tamponul de amplificare a probelor s-a dovedit, de asemenea, benefic. PVP-ul a redus efectul inhibitor al polifenolilor i a facilitat marcarea benzilor necesare analizei statistice. 4.1.9. Soiurile analizate se difereniaz la nivel molecular, respectndu-se clasificarea sistematic a acestora pe baza caracteristicilor lor morfo-fiziologice (precocitate, culoarea boabelor, pubescen) i a clasificrii din punct de vedere ecologo-geografic, respectiv prolesuri.

241

Rodica Pop, 2008 4.1.10. Distanele genetice cele mai mari au fost nregistrate ntre soiurile total nenrudite, n timp ce distanele genetice mici arat o nrudire mai mult sau mai puin apropiat ntre soiurile respective, analiza RAPD fiind n general n concordan cu datele din taxonomia clasic. 4.1.11. Dendrograma obinut relev faptul c soiul Feteasc regal este foarte apropiat din punct de vedere genetic de soiul Feteasc alb, confirmnd ipoteza c cele dou soiuri au o origine comun. Soiul Cabernet Sauvignon i Merlot sunt, de asemenea, foarte apropiate din punct de vedere genetic, lucru confirmat i de ali autori. 4.1.12. Analiznd acelai soi dar care a provenit din staiuni diferite s-a constat c nu exist diferene ntre ele, acestea fiind omogene, ceea ce sugereaz c producerea materialului sditor s-a fcut n mod corespunztor. 4.2. CONCLUZII REFERITOARE LA MATERIALUL BIOLOGIC OBINUT IN VITRO 4.2.1. Numrul de lstari obinui la micropropagarea prin lstrire axilar la via de vie este influenat hotrtor de genotip i mediul de cultur. 4.2.2. Soiurile cu cea mai ridicat capacitate de reacie la cultura in vitro din segmente nodale par a fi Cabernet Sauvignon i Traminer roz, iar mediul de cultur cel mai adecvat acestui scop s-a dovedit a fi MS 2,5 mg/l BAP. 4.2.3. Deoarece mediul de cultur are cea mai puternic influen asupra numrului de neoplantule obinut la micropropagarea prin lstrire axilar, se ntlnesc i cazuri de interaciuni ntre factori care duc la rezultate ce aparent contrazic cele spuse mai sus (exemplu, la soiul Riesling italian, soi pentru vinuri albe, micropropagat pe MS-2,5 mg/l BAP numrul de lstari obinui este imediat n apropierea celui realizat la soiul Cabernet Sauvignon). Aceasta este o dovad n plus c interaciunea soi x mediu de cultur influeneaz n mod decisiv caracterul analizat.

242

Rodica Pop, 2008 4.2.4. Soiul, mediul de cultur i localitatea de provenien a soiului au influenat n mod semnificativ lungimea lstarilor obinui prin cultura in vitro de segmente nodale la via de vie. 4.2.5. Cea mai accentuat influen asupra caracterului menionat mai sus o are mediul de cultur, de departe mediul MS 2,5 mg/l BAP ducnd la obinerea celor mai bine dezvoltate neoplantule obinute prin cultura in vitro de segmente nodale, la diferene semnificative de oricare alte variante. 4.2.6. Faptul c i ntre localiti exist diferene semnificative n ceea ce privete lungimea lstarilor obinui prin micromultiplicarea din segmente nodale poate fi explicat prin nivelele diferite de interaciune dintre genotip i mediul su specific, diferene ce se concretizeaz n probabilitatea mai accentuat sau mai puin accentuat la culturile in vitro. 4.2.7. Soiul de vi de vie, mediul de cultur utilizat i locul de provenien al cultivarului ce a furnizat explantul, precum i interaciunile dintre aceti trei factori au influenat n mod semnificativ numrul de noduri/explant obinut n urma micromultiplicrii prin segmente nodale. 4.2.8. n toate cazurile analizate, att pentru influenele factorilor, ct i pentru influenele interaciunilor dintre acetia, numrul de noduri/neoplantul a reprodus fidel modelul de variaie nregistrat pentru lungimea lstarilor (neoplantulelor). 4.2.9. Rezultatele noastre confirm observaia general c, la via de vie, numrul de noduri/neoplantul este corelat direct i pozitiv cu dimensiunile (lungimea) neoplantulelor respective, lstarii mai lungi avnd tendina de a forma un numr mai mare de noduri. 4.2.10. Din analiza datelor privind influena soiului i a mediului de cultur asupra cantitii de calus format n experienele de inducere a calusogenezei, se poate concluziona c greutatea calusului format n urma primei pasri pe medii calusogene, la cele zece soiuri de vi de vie studiate, depinde n mod decisiv de mediu de cultur 243

Rodica Pop, 2008 i ntr-o mic msur de interaciunea soi x mediu de cultur. 4.2.11. La via de vie concentraiile moderate i mari de TDZ ale mediului de cultur influeneaz negativ numrul de neoplantule regenerate din calusul organogen. Dimpotriv, un efect stimulativ asupra numrului de regenerani i a lungimii acestora l are mediul cu adaos sczut de TDZ (0,5 mg/l). Pe un astfel de mediu neoplantulele formate sunt n numr foarte mare, de lungimi apreciabile, dar total lipsite de rdcini. 4.2.12. Soiul de vi de vie nu a avut, practic, influene semnificative asupra numrului regeneranilor obinui i a lungimii acestora ceea ce ne permite s afirmm c modul de comportare al calusului regenerativ pe medul de cultur cu adaos de TDZ este general valabil pentru toate soiurile de vi de vie ncercate. 4.2.13. Analiza benzilor formate prin migrarea n gel a ADN-ului amplificat cu primeri RAPD, arat clar c, la toate somaclonele analizate, exist diferene notabile de structur genetic fa de soiurile din care provin. 4.2.14. n cadrul dendrogramei se evideniaz faptul c soiul de vi de vie i somaclonele obinute din acel soi sunt strns grupate. De asemenea, se constat c soiurile Cabernet Sauvignon i Merlot, mpreun cu somaclonele lor sunt reprezentate n acelai subgrup, la fel ca i n cazul dendrogramei obinute pentru cele zece soiuri de vi de vie analizate in vivo. Soiurile i somaclonele de Feteasc alb i Riesling italian formeaz un subgrup similar cu cel reprezentat n dendrograma celor zece soiuri de vi de vie analizate. 4.2.15. Se poate afirma, pe baza rezultatelor prezentate c analizele RAPD reprezint un instrument sensibil de identificare la nivel molecular a variabilitii somaclonale aprut la via de vie n condiiile meninerii ndelungate a calusului i subculturilor in vitro. 4.2.16. Este evident c somaclonele identificate cu ajutorul analizelor RAPD vor trebui, n mod obligatoriu verificate n condiii in vivo pentru a vedea dac variabilitatea observat la nivel molecular poate fi observat i la nivel fenotipic. 244

Rodica Pop, 2008

SUMMARY
Paleonthologic research has it that grapevine had been in existence before mans advent. The proto-ancestors of the grapevine in cultivation nowadays seem to have come up in the Cretaceous system of the planet Earth. However, fossils of Vitaceae from the Cretaceous system of the planet were refuted by most of scientist as there existed mix-ups between the supposed petrified grapevine leaves and those of forest arbours. Reliable proof comes from the Neozoic or Tertiary eras the Paleogenic period. This period provided for most of the Vitaceae fossils as to the four current generaVitis, Ampelopsis, Cayratia, Tetrastigma. The core process generating the passage from the wild vine to the cultivated one is the natural variability which allowed man to select the most valuable vines from the spontaneous flora and grow these in full awareness (RLEA et. al., 1995). In the present state, however, ampelography asserts that the botanical description is faultythus, it has also become necessary the study of ecologic- and of culture influence on the variation in the morphological characters and the agrobiologic and technologic traits. Research on vine has established the genetic centres where the genus Vitis is formed, as well as the belonging of genera to certain ecologic-geographic group. In the case of the genera of unknown- or unsure origin there are mentioned data referring to the oldness in cultivation of the genus as well as hypotheses regarding the provenance , spread (POENARU, 1970). In plant improvement, the identification of genera in their first stages of development is extremely difficult as the elements characteristic to the genus are coming up gradually, during the following years. At first advent, some organs, such as tendrils and inflorescences, are poorly developed, becoming later more and more typical with lapse of time (ARDELEAN, 1986). During these last years, with the coming out of molecular markers, the identification of cultivars has been carried out at protein level with the aid of isoenzymes as well as at DNA level assisted by RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) methods; RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism); AFLP (Amplified 245

Rodica Pop, 2008 Fragment Length Polymorphism); and SSR (Simple Sequence Repeats). Due to the easiness of RAPD-method Random Amplified Polymorphic DNA (WILLIAMS et .al., 1999), i.e., it needs very low quantities of DNA as well as its ability to reveal high degree of polymorphism, it has successfully been applied with various plant species, including Vitis vinifera (WOLF et. Al., 2001; RYAN et al., 2001; TESSIER et al.,1999; FANIZZA et al., 1999; BOHM et al., 1998; PAMFIL, 1999). Research on the molecular genetics in grapevine is directed in general- toward the identification of polymorphism extant within the frames of the genera Vitis and toward the determination of the phylogenetic origin of certain species or genera.

1. RESEARCH OBJECTIVES, MATERIAL AND METHOD

1.1. SCOPE OF RESEARCH Somaclonal variation is taken for one source of obtaining new genotypes having the scope of plant improvement, thus paving the way to new possibilities of application in viticulture. Against all odds, information on variation in regenerated plants is rather scarce and, so far there have been reported only a few examples of somaclonal variation in the vine. In view of such desiderata, it has been considered beneficial to start up an investigation in the domain of biotechnologies and micropropagation with the genus Vitis vinifera. The main scope of our research consisted in the characterization and determination of phylogenetic connections among ten vine cultivars aided by RAPD-methodology, as well as inducing somaclonal variation and testing the molecular heteromorphism in somaclones obtained from five vine cultivars widely cultivated in Transylvania and even in Romania. The research work initiated by us probably means the first attempts in identifying somaclonal variation in vine by the RAPD method.

246

Rodica Pop, 2008 1.2.OBJECTIVES PURSUED WITHIN THE INVESTIGATIONS APPERTAINING TO THE THESIS The main objectives took shape in the following : Laying down the protocol of DNA-extractions and applying the RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA)-techniques in view of identifying in vivo genetic polymorphism with ten vine cultivars coming from five horticultural stations in differing geographic areas. Identification of primers capable to establish polymorphism among the varieties analyzed at molecular level. Determination of composition of culture media, of the type of hormones and their concentration which would favour securing of neoplantules; growth and proliferation of sprouts in vitro after multiplication through axillary shooting. Selection of explant type and culture media adequate for inducing somaclonal variation and obtaining calluses, respectively. Subcultivation of the callus on growth medium. Determination of culture media for plant regeneration through transferring the callus on to media inducing organogenesis. Highlighting of possible genetic differences appearing between regenerants, between somaclones and female plants in which they originated through RAPDanalysis, respectively.

2. MATERIALS AND METHODS OF WORK

2.1. BIOLOGICAL MATERIAL 2.1.1. Biological material in experiments meant to differentiate cultivars aided by molecular markers The biological material studied was made up of ten grapevine cultivars coming from five vine-growing stations - in this country - located within pedoclimatic conditions differing altogether. There were analyzed five vine cultivars for white wine, two for 247

Rodica Pop, 2008 claret/red wine, and three for table grapes. Those for white wine were: Feteasc alb, Feteasc regal, Italian Riesling, Muscat Ottonel, Traminer rose. Those for claret: Cabernet Sauvignon, Merlot. Those for table grapes: Napoca, Timpuriu (early) de (of) Cluj, Cetuia. The stations providing the biological-material are located at Reca, Blaj, Valea Clugreasc, Odobeti and Iai.

2.1.1.1. Primers utilised for DNA amplification To amplify the DAN samples, a number of 39 decanucleotid primers were used, one of the primers having 21 nucleotides. The provenance of the primers differed; thus, 15 decanucleotid primers produced by the University of British Columbia (UBC), 6 by Pharmacia Biotech (PB), 18 by Mycroshinth (OPAB, OPA, OPE, OPAL, OPX, AB, GY 169) (see Table 1).

Table 1 Primers used in DNA amplification

No. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. Primer UBC 228 UBC 241 UBC 245 UBC 285 UBC 286 UBC 421 UBC 436 UBC 537 UBC 538 UBC 563 UBC 564 UBC 570 UBC 571 UBC 584 UBC 599 PB 1 PB 2 PB 3 PB 4 PB 5 Sequence (5 3) GCT GGG CCG A GCC CGA CGC G CGC GTG CCA G GGG CGC CTA G CGG AGC CGG C ACG GCC CAC C GAG GGG GCC A CGA AAG GAC T TGA TCT CTC C CGC CGC TCC T CGG CGT TAC G GGC CGC TAA T GCG CGG CAC T GCG GGC AGG A CAA GAA CCG C GGT GCG GGA A GTT TCG CTC C GTA GAC CCG T AAG AGC CCG T AAC GCG CAA C No. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. Primer PB 6 OPAB 11 OPAB 18 OPE 14 AB 11 OPA 04 OPA 03 OPAL 20 OPX O3 OPA 01 GY 169 OPC-14 OPC 15 OPA 11 OPA 17 70.08 OPA 20 70.03 MIC 07 Sequence (5 3) CCC GTC AGC A GTG CGC AAT G CTG GCG TGT C TGC GGC TGA G GTG CGC AAT G AAT CGG GCT G AGT CAG CCA C AGG AGT CGG A TGG CGC AGT C CAG GCC CTT C CTA AGC TGC TTT TGT TTG AGC TGC GTG CTT G GAC GGA TCA G CAA TCG CCG T GAC CGC TTG T CTG TAC CCC C GTT GCG ATC C ACG GTG CCT G TGT CTG GGT G

248

Rodica Pop, 2008 2.1.2. Biological material used in experiments of producing somaclonal variation within laboratory conditions The biological material used to initiate cultures in vitro has been made up of shoots pertaining to the ten vine cultivars of the five vine-growing stations aforementioned.

In the studies regarding the inducement of callus genesis plantules micropropagated in vitro were used. The biological material used to study the somaclonal variation was represented by regenerants gained via callus cultures, i.e., ten somaclones each from every variety, respectively. 2.1.2.1.Culture media used With all of our experiments the main medium used was the Murashige-Skoog (1962) one, supplemented with varied hormones, according to the scope in view. Biostimulating substances used in in vitro culture with vine were represented by: auxin, naftil acetic alpha acid (NAA) and cytokins, benzyl aminopurine (BAP) and tidiazurone (TDZ), respectively. Depending on the stage covered within the process of in vitro multiplication, a certain concentration span for each type of hormone was used.

2.2. WORK METHODS 2.2.1. Work methods applied in the experiments with biological material produced in vivo 2.2.1.1. The Extraction of DNA in view of carrying out the RAPD analyses The extraction of DNA in the vine is difficult due to the presence of polyphenols and of polyglucides in large quantities. Therefore, our experiments were trying to optimize a protocol of DNA extraction possessing an as high degree of purity as possible. Thus, mercaptoethanol, ascorbic acid and diethylditiocarbamic acid (DIECA) were added in the polivinilpirolidon extraction buffer. In order to obtain quality DNA allowing for utilization in RAPD-techniques there were tested three methods of isolation: 249

Rodica Pop, 2008 Protocol A described by ROGER et al., 1988 Protocol B described by ROGER et al., 1988 modified Protocol C described by LODHI et al., 1994, modified (POP et al., 2003). 2.2.1.2. Amplifying- RAPD Protocol Samples were amplified by means of an Eppendorf Master cycler gradient programmed as follows: 95o C for 3 minutes - predenaturation, followed by 45 cycles with the following temperature profile : 1. 930C for 1 minute - denaturation 2. 340C for 1 minute - fixing of primers 3. 720C for 1 minute - extension 4. 720C for 10 minutes final extension.

2.2.1.3. Image analysis The analysis of gels has been carried out by means of the program Total Lab TL 100 and the binary matrix was obtained , which was later used in calculating the genetic distances. To calculate the genetic distances and fulfill the dendrogram we have used the RAPD Distance l.04 program and the Jaccard coefficient for the genetic distances and the Neighbor Joining Tree method for the dendrogram, respectively.

2.2.2. Work methods applied in the experiments with biologic material produced in vitro 2.2.2.1. Multiplication by axillary shooting To study the regenerating ability of vine, there have been used as explant source the nodal segments originating in shoots harvested in field. The medium for initiating the in vitro culture was the Murashige-Skoog (1962) one, supplemented with varying concentrations of hormones, having been obtained three variations of culture media: 250

Rodica Pop, 2008 V1 = MS medium - 0.5 mg/1 BAP, 0.5mg/1 NAA , 100 mg/1 hydrolyzed casein; V2 = MS medium 1.0 mg/1 BAP, 0.5 mg/1 NAA , 100 mg/1 hydrolyzed casein; V3 = MS medium 2.5.mg/ 1 BAP, 0.5 mg/1 NAA, 100 mg/1 hydrolyzed casein. 2.2.2.2. Callus culture The callus culture has been initiated both from nodal segments and from leaves, from the plants obtained in vitro in MS culture medium (1962). In view of initiating the callus culture the MS (Murashige Skoog, 1962) basic medium has been supplemented with naftil acetic acid (NAA) in two concentrations: MS1 - with 10 mg/l NAA and 1.0 mg/BAP MS2 - with 5mg/1 NAA and 1.0 mg/1 BAP.

2.2.2.3. Induction and development of multiple shoots

In order to induce the formation of multiple shoots, the morphogenetic callus obtained from nodal segments has been transferred on to MS medium supplemented with various concentrations of TDZ thidiazuron (N-phenyl- N-1,2,3,-thidiazol-5-yl urea) in combination with the acetic naftil alpha acid, in concentration of 0.5 mg/l.

2.2.2.4. Extraction, quantification, amplification of DNA and electropohoresis on agarose gel

DNA - extraction was from leaves of neoplantules obtained after the 6 th, 10th and 15th passage on to new culture media. From each of the cultivars there were analyzed ten somaclones. The methods of quantification, amplification and agarose-gel electrophoresis were similar to those applied in the experiments on biologic material produced in vivo.

251

Rodica Pop, 2008

3. RESULTS AND DISCUSSIONS

3.1. RESULTS REGARDING THE EXTRACTION OF DNA SAMPLES COMING FROM IN VIVO BIOLOGIC MATERIAL The data obtained revealed that all the three experimental factors i.e., variety, extraction method and provenance, did significantly and distinctly influenced the extracted DNA. The DNA quantity obtained through the three extractions variations was adequate (77.5 4518.6 ng/l), considering that for amplification 50 ng. was needed. The largest amount of DNA, i.e., 4518.6 ng/l, was obtained from Cetuia grape cultivar coming from Blaj, by utilising protocol C. In so far as DNA-purity is concerned, the data obtained revealed that the three experimental factors have distinctly and significantly influenced DNA-purity. Such significance is being kept also with the double-variety interactions x extraction method (F = 7.78**>1.62; 2.09), location x extraction method (F = 20.34**>1.98; 2.60), location X cultivar (F = 7.18**>1.45; 1.69), as well as for triple-variety interaction x extraction method x location (F = 5.08**>1.35; 1.53). Differences in DNA- purity means, obtained with the three protocols, maintain themselves on significant levels, the most efficient protocol being the C one; protocol A placed itself on the lowest position.

3.1.1. Results concerning amplification and electrophoresis of reaction products Of the 39 primers initially utilized, there were obtained polymorphisms with a number of 22 primers which were also used to amplify somaclones obtained with in vitro experiments. 3.1.2. Results regarding the analysis if images and interpretation of data Band markings were performed directly on the gel photos, by reporting to the DNA-marker. The polymorphic bands were marked with 1, and the monomorphic ones with 0. The presence of bands (marked with 1) and the absence of bands (marked 0) were inscribed in a table as binary matrix . The total number of the generated bands was of 192; of these, 165 were polymorphic, the monomorphic ones being ousted from the statistic 252

Rodica Pop, 2008 interpretation of data. 3.1.3. Dendrogram analysis The closeness of the ten types of vine varieties checked, based on the matrix of the genetic distances and on Neighbor Joining Tree algorithm are introduced in Fig.1 as a dendrogram. Within the dendrogram one can notice two main groups, i.e., A and B. The former includes Feteasc alb, Feteasc regal, Italian Riesling, Cetuia, Timpuriu de Cluj and Muscat Ottonel cultivars and, the latter, Merlot, Cabernet, Traminer Rose and Napoca cultivars.

Fig. 1. The dendrogram of the ten cultivars of tested Vitis vinifera

253

Rodica Pop, 2008 Group A is made up - at its turn - of other two subgroups, marked A1 and A2. Subgroup A1 includes the varieties Feteasc alb and Feteasc regal which are from the same branch, the genetic distance between them being of 0.4421. The genetic closeness between the two varieties, resulting from RAPD-analysis, thus stands witness to the previous results confirming the common ancestry of the respective varieties. The Cetuia and Timpuriu de Cluj cultivars have a common parent, being situated within the same group in the dendrogram. With this case too, the RAPD-analysis confirmed the common ancestry of these two varieties. Group B is also divided into two subgroups, B1 and B2, respectively. Group B1 includes Merlot, Cabernet Sauvignon and Traminer Rose. The results obtained in our experiments confirm the fact that Cabernet Sauvignon and Merlot stand close from genetic point-of-view. Traminer Rose - in spite of being a variety for white wines, it seems that it is much more close genetically to the red cultivars. One explanation would consist in the fact that this cultivar - from the point-of-view of classification per ecologic-geographic groupsbelongs to Proles occidentalis, like the other two. 3.2. RESULTS OBTAINED WITH IN VITRO MULTIPLICATION EXPERIMENTS 3.2.1. Results obtained in experiments of multiplication through axillary shooting 3.2.1.1. Numbers of shoots obtained in multiplication through axillary shooting The data on soil , culture medium and location influence on numbers of shoots obtained by multiplying vine nodal segments were statistically processed and displayed in the variation table. Sample F reveals that all the experimental factors (cultivars, culture medium, location of the provenance), as well as the simple, double and triple interactions among these have had significant influences upon the numbers of shoots obtained by multiplication from nodal segments. The analysis of data on variety- and culture medium influence on the numbers of shoots obtained with micropropagation through vine axillary shooting presented in Table 2, reveal that both variety and culture medium have had significant effects on this trait. 254

Rodica Pop, 2008 Table 2 Effects of cultivar (A), culture medium (B) and of the interaction (A x B) upon the numbers of shoots of micropropagated Vitis vinifera
Culture medium MS 1,0 mg/l MS 2,5 mg/l Mean of cultivar BAP BAP 2,76 lm 6,09 e 3,34 DE 3,09 j 5,57 g 3,42 D 3,04 j 6,58 c 3,69 B 2,74 m 7,12 b 3,77 B 4,82 h 6,30 d 4,17 A 2,91 k 7,70 a 4,03 A 2,52 n 5,65 g 3,20 E 2,07 o 2,83 kl 2,07 G 2,49 n 3,78 i 2,58 F 3,13 j 5,95 f 3,59 C 2,96 N 5,76 M

Cultivar Feteasc alb Feteasc regal Muscat Ottonel Riesling italian Traminer roz Cabernet Sauvignon Napoca Cetuia Timpuriu de Cluj Merlot Mean of culture medium

MS-0,5 mg/l BAP 1,18 t 1,60 p 1,46 r 1,46 r 1,40 r 1,49 r 1,42 r 1,30 s 1,46 r 1,68 p 1,45 P*

SD 5% for two means of variety =0.15 0.17 SD 5% for two means of culture medium = 0.06 0.07 SD 5% for two means of interaction = 0.09 0.10 *Differences between any two values followed by at least one common letter are not significant

3.2.1.2. Length of shoots obtained through multiplication from nodal segments Similarly with the numbers of shoots, the length of shoots obtained in in vitro cultures of nodal segments, with the ten vine cultivars , on three differing culture media, one can deduce from the data introduced by Table 3 that all of the experimental factors and all interactions among these (double and triple) have significant effects upon this character. Cultivar - and culture-medium influence on vine length obtained through

micropropagation from nodal segments is introduced by Table 4. As with the previously studied trait, the first two places are taken by two white-wine cultivars (Traminer rose: 5.55 cm and Italian Riesling: 4.98 cm) followed this time with significant differences, by a red-wine cultivar (Cabernet Sauvignon: 4.84 cm). The other cultivars record much lower values of the checked trait, reaching up to 3.4o cm with the table-grapes cultivar, i.e., Timpuriu de Cluj. 255

Rodica Pop, 2008 Table 3 Analysis of the three-way Anowa type 10 x 3 x 5 (cultivar x culture medium x provenance)
Cause of variability Total Large plots Repeats Factor A (vine cultivar) Error (a) Midplots Factor B (culture medium) Interaction A x B Error (b) Small plots Factor C (provenance) Interaction A x C Interaction B x C Interaction A x B x C Error (c) SS 886,16 200,36 0,55 197,44 2,369 626,28 485,68 139,26 1,342 59,52 9,79 16,37 3,05 19,47 10,830 DF 449 29 2 9 18 60 2 18 40 360 4 36 8 72 240 s2 F test

21,94 0,132 242,84 7,74 0,0335 2,45 0,45 0,38 0,27 0,0451

166,6**8>1,92;2,50

7238,86**>3,04;4,71 230,62**>1,62;2,09

54,26** >2,41;3,41 10,08** >1,45;1,69 8,46**>1,98;2,60 5,99** >1,35;1,53

Table 4 Effects of cultivar (A), culture medium (B) and of interaction (A x B) upon length (cm) of Vitis vinifera shoots obtained via micropropagation
Cultivar MS-0.5 mg/l BAP 3,08 o 3,26 n 3,70 k 3,54 lm 3,22 n 3,58 l 3,72 k 2,58 q 2,13 r 2,95 p 3,18 A* Culture medium MS 1.0 mg/l MS 2.5 mg/l BAP BAP 3,40 m 4,52 gh 3,55 lm 4,57 gh 3,94 j 4,76 f 4,50 h 6,89 c 5,22 e 8,22 a 3,79 k 7,14 b 3,99 j 4,54 gh 3,48 m 4,60 g 2,93 p 5,14 e 4,13 i 6,13 d 3,89 B 5,65 C Mean of cultivar 3,67 IJ 3,79 I 4,13 H 4,98 E 5,55 D 4,84 F 4,08 H 3,55 J 3,40 K 4,40 G

Feteasc alb Feteasc regal Muscat Ottonel Riesling italian Traminer roz Cabernet Sauvignon Napoca Cetuia Timpuriu de Cluj Merlot Mean of culture medium

SD 5% for two means of variety = 0.15-0.17 SD5% for two means of culture medium =0,03 SD5% for two means of interaction =0,09-0,10 *Differences between any two values followed by at least one common letter are not significant

256

Rodica Pop, 2008 3.2.1.3. Number of nodes/neoplantules noticed after micromultiplication from vine nodal segments As with the other two traits previously analyzed, the table of variance for the influence of cultivar, culture medium and location upon the numbers of

nodes/neoplantules obtained by multiplication from nodal segments in the vine, shows one F-sample highlighting the distinctly significant action of all factors as well as interactions among factors (Table 5). Table 5 Analysis of the three Anowa type 10 x 3 x 5 (cultivar x culture medium x provenance)
Cause of variability Large plots Repeats Factor A (vine cultivar) Error (a) Middplots Factor B (culture medium) Interaction A x B Error (b) Small plots Factor C (provenance) Interaction A x C Interaction B x C Interaction A x B x C Error (c) SS 531,47 1,03 525,96 4,478 1557,29 1091,20 458,05 8,034 78,57 14,37 19,13 2,99 26,29 15,789 DF 29 2 9 18 60 2 18 40 360 4 36 8 72 240 s2 F test

58,44 0,249 545,60 25,45 0,2008 3,59 0,53 0,37 0,37 0,0658

234,93**>1,92;2,50

2716,53**>3,04;4,71 126,70**>1,62;2,09

54,62**>2,41;3,41 8,08**>1,45;1,69 5,69**>1,98;2,60 5,55**>1,35;1,53

3.2.2. Experimental results regarding neoplantule regeneration from callus maintained in culture for long time The organic ability, or embryogenesis, of the callus tissue depends on both endogenous and exogenous factors, on the number of passages, on culture conditions and, the age of the callus. 3.2.2.1. Numbers of regenerated neoplantules The Table of Variance reveals that all of the experimental factors (cultivar, culture medium), as well as the interaction cultivar x culture medium had significant influence on the numbers of regenerated neoplantules (Table 6). 257

Rodica Pop, 2008 Table 6 Table of Variance. Numbers of neoplantules regenerated in the bifactorial experience (10 x 3) with vine cultivars and culture media used in the regeneration of neoplantules from callus Cause Overall Repeats Variants Factor A Factor B Interaction A x B Error SS 3233,42 5,56 3223,57 16,90 3177,12 29,55 4,29 DF 89 2 29 9 2 18 58 s2 F test

1,9 1588,6 1,6 0,1

25,4* > 2,04; 2,72 21484,8**> 3,15; 4,98 22,2**> 1,81; 2,32

By analyzing the influence of the cultivar upon the numbers of regenerated shoots, one can notice from the data in Table 7 that this is relatively homogenous, i.e., all cultivars will regenerate a number of 8.13 up to 9.60 shoots/regenerating callus.

Table 7 Numbers of plants regenerated in the two-way experiment (10 x 3) with cultivars of Vitis vinifera and culture media
Cultivar Feteasc alb Feteasc regal Muscat Ottonel Riesling italian Traminer roz Cabernet Sauvignon Napoca Cetuia Timpuriu de Cluj Merlot Mean of culture medium Culture medium MS 1.0 mg/l MS 2.0 mg/l MS 0.5 mg/l TDZ TDZ TDZ 4,50 g 4,20 gh 15,70 c 6,50 d 3,70 h 18,60 a 5,30 f 4,50 g 18,70 a 5,40 f 3,80 h 18,60 a 4,50 g 3,90 gh 17,50 b 6,30 d 4,30 gh 17,50 b 5,50 ef 4,50 g 15,80 c 5,70 def 3,80 h 17,30 b 5,80 def 4,50 g 16,80 b 6,10 de 3,97 gh 17,30 b 5,56 N* 4,12 P 17,38 M Mean of cultivar 8,13 F 9,60 A 9,50 AB 9,27 C 8,63 E 9,37 BC 8,60 E 8,93 C 9,03 CD 9,12 D

SD5% for two means of variety = 0.14-0.17 SD 5% for two means of culture medium = 0.28-0.30 SD 5% for two means of interaction = 0.57-0.69 *Differences between any two values followed by at least one common letter are not significant

258

Rodica Pop, 2008 3.2.2.2. Length of regenerated shoots (neoplantules) The data in Table 8 (Table of variances) presents the significance of the action of the two experimental factors and of the interaction between these upon the length of the regenerants. One can notice that statistically only factor B (culture medium) had significant impact upon the length of the regenerated shoots and, the cultivar and the interaction between cultivar and medium, had the F- calculated smaller than the theoretical F. Table 8 Variance table. Length of regenerated plants (cm) in two-way experiment (10 x 3) with cultivars of Vitis vinifera and culture media utilized in callus regeneration
Cause Overall SS 59,74 0,03467 57,9773 0,27956 57,0127 0,68511 1,7 DF 89 2 29 9 2 18 58 s2 F test

Repeats
Variants Factor A (cultivar) Factor B (culture medium) Interaction A x B Error

0,03 28,51 0,04 0,03

1,04 < 2,04; 2,72, 954,60**>3,15; 4,98 1,27<1,81, 2,32

The longest regenerated shoots were recorded with the medium of the lowest concentration of TDZ (0.5 mg/l). Media of average concentrations (1.0 mg/l) and high (2.0 mg/l) of TDZ will lead to short- and very short shoots in comparison with mediumvariant three. 3.2.3. Results regarding identification on molecular level of somaclonal variability induced by regeneration from callus maintained for long in culture 3.2.3.1. Results regarding amplification and electrophoresis of reaction products In amplifying the samples. 22 primers displaying polymorphic bands in vinecultivar DNA extraction harvested in field were used. It was found that the neoplantules regenerated with the 15 th subculture display 259

Rodica Pop, 2008 molecular-level variability. Such variability was noticed with a small number of cultivars, i.e., five, showing a small number of somaclones, too. The most somaclones were identified in Merlot (five). The image markings were the following : Cabernet Sauvignon CR (female plant), CR1, CR2, CR3; Feteasc alb F (female plant), F1; Merlot (female plant), Mr1, Mr2, Mr3, Mr4, Mr5; Traminer Rose T (female plant) , T1, and Italian Riesling - R1 (female plant) Ri1, Ri2, Ri3. Fragments resulting from amplification with polymorphic primers displayed lengths comprised between 200 and 2000-pb, most having it between 300 and 1400 pb. The highest numbers of polymorphic bands were obtained with primer OPX03 (12 bands), primer OPE 14 (11 polymorphic bands), OPA 04 (10 polymorphic), PB 6 (10 polymorphic bands), PB 6 (10 polymorphic bands), PB 1 (9 polymorphic bends), primer PB 3 (7 polymorphic bands), primer PB 5 (8 polymorphic bands), primer 70.08 (6 polymorphic bands). The figures obtained and analysed tells obviously that, with all somaclones

checked, one can notice that there are noteworthy differences in the genetic structure revealed by the RAPD-markers. The dendrogram drawn on the basis of the genetic distances between cultivars and their somaclones illustrates even more clearly the extent to which, at molecular level, somaclones differ from the cultivar they originate in. The genetic closeness between vine cultivars and somaclones identified with these cultivars, established on the matrix of genetic distances, and of the Neighbor Joining Tree algorithm, are displayed in Figure 2, in the shape of a dendrogram. Within the frames of the dendrogram one can notice that the Vitis vinifera cultivar as well as the somaclones obtained from this are closely grouped . Also, there is to be seen that Cabernet Sauvignon and Merlot, together with their somaclones are represented within the same group just like with the dendrogram obtained for the ten vine cultivars analyzed ex vitro. Another subgroup is made up of cultivars and somaclones of Feteasc alb and Italian Riesling similar to the group represented in the dendrogram of the ten vine cultivars analyzed. That the somaclones of each cultivar are represented within the same group is proof of the accuracy of the experimental results obtained. 260

Rodica Pop, 2008

Fig. 2. Dendrogram of cultivars analyzed, with Vitis vinifera cultivars and somaclones.

4. CONCLUSIONS

4.1. CONCLUSIONS TO VARIABILITY ON MOLECULAR LEVEL OF THE BIOLOGICAL MATERIAL OBTAINED IN VIVO Following the results of our research work at molecular level with the ten vine cultivars coming from five locations, some conclusions are possible to draw: 4.1.1. In the RAPD analyses one essential condition is that of obtaining a fair quantity of DNA of high purity. Of the three extraction protocols used the C one provided for the most satisfactory results. With this, DNA-purity displayed values between 1.7 and 2, purity allowing for later manipulations. The incorporation in the extraction buffer of phenoloxidase inhibitors , such as the diethyleneditiocarbamic acid (DIECA), and of the antioxidants ascorbic acid or polyvinyl pirolidone (PVP) , have prevented the browning of the extract. 261

Rodica Pop, 2008 4.1.2. There are differences among cultivars statistically granted regarding the DNA quantity obtained, no matter the extraction method applied , suggesting that the genotype in the vine, decisively influences the quantity of DNA that can be extracted by means of currently used methods for such purpose. The method of extraction also had a significant influence on obtainable DNA-quantity, regardless of the experimentation location. 4.1.3. Data resulting from the variance analysis for the three-way Anova type 10 x 3 x 5 experiment show that the three experimental factors have distinctly and significantly influenced the purity of DNA. 4.1.4. The selection of primers has proved to be rather difficult , as of the 39 primers used only 22 produced distinct polymorphic bands. 4.1.5. Addition of PVP - 2% concentration in the amplification buffer of samples had also proved beneficial. PVP reduced the inhibitory effect of polyphenols and facilitated the marking bands necessary in the statistical analysis. 4.1.6. The cultivars analyzed differentiate at molecular level and their systemic classification based on their morpho physiological traits (precocity, grape colour, pubescence) respected, as well as the classification from ecologic-geographic point-ofview and, proles, respectively. 4.1.7. The largest genetic distances were recorded among varieties totally unrelated, whereas the small distances point to relations more or less close in the respective varieties and the RAPD-analysis agrees with data in the classical taxonomy. 4.1.8. The dendrogram obtained reveals the fact that Feteasca regala very close genetically to Feteasca alba, thus confirming the hypothesis that the two varieties have a common ancestry. Cabernet Sauvignon and Merlot very close genetically, also confirmed by other authors , too. 4.1.9. The analysis of the same variety but of differing provenance has revealed

262

Rodica Pop, 2008 that there are no differences between them, as they are homogenous, which suggests that the production of planting stock was correctly carried out. 4.1.10. RAPD analyses proved valuable instruments in establishing the intraspecific genetic polymorphism with Vitis vinifera.

4.2. CONCLUSIONS REFERRING TO THE BIOLOGICAL MATERIAL OBTAINED IN VITRO 4.2.1. The numbers of shoots obtained with axillary-shooting micropropagation in vine is decisively influenced by genotype and culture medium. 4.2.2. Cultivars of the highest reaction ability to the in vitro culture from nodal segments seem to be Cabernet Sauvignon and Traminer Rose, and the culture medium best adequate to such a purpose proved to be MS 2.5 mg/1 BAP. 4.2.3. The cultivar, culture medium and provenance of the variety have influenced significantly the length of shoots obtained in vitro of vine nodal segments. 4.2.4. The highest degree of influence upon the aforementioned trait has the culture medium, by far the medium MS 2.5 mg/1 BAP, leading to securing the best developed neoplantules obtained in in vitro cultivation of nodal segments, to significant differences as to all other variants. 4.2.5. Vine cultivar, culture medium applied and provenance of cultivar providing for the explant, as well as the interactions between these three factors have significantly influenced the numbers of nodes/explant obtained following micromultiplication via nodal segments. 4.2.6. With all cases analysed , both for factor influence and of interaction between these, the numbers of nodes/neoplantule have reproduced with fidelity the variation pattern recorded for the length of shoots (neoplantules). 4.2.7. From the data analysis regarding the influence of cultivar and culture 263

Rodica Pop, 2008 medium on the callus quantity in the experiments of inducing callus genesis, on can reach the conclusion that the weight of callus formed after the first passage on to callusgenerating media, with the ten vines under study, decisively depends on medium culture and, to a lesser extent on the interaction between cultivar and culture medium. 4.2.8. The addition in the MS-culture medium of 1.5 mg TDZ/l does not lead to significant differences in the weight of callus formed, but it certainly leads to obvious quality differences in the callus. 4.2.9. With grape vines the moderate- and high concentrations of TDZ in the culture media, negatively influence the numbers of regenerated plantules from the organogenic callus. As to the contrary, however, a stimulating effect on the numbers of regenerants and their length has the medium with low addition of TDZ (0.5 mg/l). 4.2.10. Vine variety did not have practically significant influence on regenerant numbers obtained and on their length; thus, allowing us the assertion that the behavioural pattern of the regenerative callus on culture medium with TDZ supplement is generally true with all the vines tested. 4.2.11. Band analysis formed through migration on gel of DNA amplified with RAPD primers shows obviously that, with all somaclones checked, there are noteworthy differences of genetic structure, as to the cultivars they come from. 4.2.12. Within the frames of the dendrogram there shows up that the cultivars and somclones obtained from that variety are closely grouped. Also, one can discern that Cabernet Sauvignon and Merlot, together with their somaclones are represented in the same subgroup, similarly to the dendrogram obtained for the ten vine cultivars analysed ex vitro. Cultivars and somaclones of Feteasca alba and Italian Riesling make up one subgroup similar to that featured in the dendrogram of the ten vines analysed. 4.2.13. It is possible to assert that, based on the results introduced, the RAPDanalyses represent one sensible instrument of identification at molecular level of the somaclonal variability, coming up in the grape vine, within the conditions of maintaining of callus and subcultures in vitro for long time. 264