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RECUENTO DE MICROORGANISMOS VIABLES EN MEDIOS LIQUIDOS:

TECNICA DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP).


Ctedra de Microbiologa General- Facultad de Ciencias Exactas- UNLP.

En muchas ocasiones, ya sea por un bajo nmero de microorganismos en las muestras a
analizar, por hallarse presentes microorganismos muy invasivos que se diseminan en la superficie de
medios slidos, o por poseer la muestra microorganismos que no desarrollen en medios slidos , se
hace necesario realizar recuentos en medios lquidos. La tcnica empleada se denomina nmero ms
probable (NMP) y tiene su fundamento matemtico en las distribuciones de Poisson y binomial.

Fundamento matemtico.

Para la aplicacin del mtodo deben cumplirse dos condiciones: que los microorganismos
estn distribuidos al azar y que la presencia de un solo microorganismo viable en el volumen
inoculado, d lugar a desarrollo visible luego de la incubacin.
Supongamos que de una muestra que posee "" microorganismos viables por ml se extrae una
alcuota de "v" ml, se inocula en un medio lquido apropiado y se incuba, el medio presentar
desarrollo visible si en el volumen "v" haba al menos un microorganismo viable. La probabilidad de
que el medio no presente desarrollo al cabo de la incubacin (p(0)) ser igual a la probabilidad de
que en la alcuota no haya ningn microorganismo viable. Utilizando la distribucin de Poisson
tendremos que:

(I)


Obviamente, cuanto mayor sea , menor ser la probabilidad de que la alcuota no contenga
ningn microorganismo viable. Si tenemos que v = 1 ml y = 1 microorganismo viable/ml entonces
p(0)=exp(-1)= 0,37 pero con = 10 microorganismos viables/ml se obtendr p(0)= 4,5 x 10
-5
.
Si se inocula una serie de 5 tubos con 1 ml de una muestra que contenga 1 microorganismo
viable/ml se tiene p(0)= 0,37 y, por lo tanto es de esperar que de los cinco tubos inoculados, 2 no
presenten desarrollo (5 x 0,37 ~ 2).
La probabilidad de obtener "s" tubos sin desarrollo sobre "n" tubos totales inoculados con un
volumen "v" de una muestra con microorganismos viables/ml, puede ser calculada utilizando la
distribucin binomial:




(II)


p(0)=e
-v.

P
\
|
.
|
n
s
=
n!
s!.(n-s)!
.e
-.v.s
.(1-e
-.v
)
n-s


2
La funcin II presenta un mximo. El valor de para el cual la probabilidad es mxima se
denomina nmero ms probable. Este valor representa el nmero de microorganismos que con ms
probabilidad dar la combinacin de tubos positivos y negativos obtenida.
El valor de no podra calcularse si todos los tubos resultaran positivos o negativos. Por ese
motivo en la prctica se inoculan distintas series de tubos con diferentes cantidades de muestra o
diluciones. Para cada serie habr una ecuacin como la II, y la probabilidad de obtener las
combinaciones de tubos positivos y negativos de todas las series ser:

(III)





Como se muestra en la figura 1, la ecuacin III tambin presenta un mximo y el
correspondiente a ese mximo ser el NMP.


0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,00 10,00 20,00 30,00
microorganismos/ml
p
r
o
b
a
b
i
l
i
d
a
d


Figura 1: Probabilidad, segn la distribucin binomial, de obtener un resultado 5 2 0 (tubos
positivos) para un ensayo donde se inoculen 3 series de 5 tubos cada una utilizando volmenes de 1,
0.1 y 0.01 ml.

Para hallar el NMP, debe derivarse la ecuacin III con respecto a , e igualar a cero la funcin
resultante. La ecuacin IV muestra el resultado de la derivacin:


(IV)


i i i i i
s n v s v
i i i
i
e e
s n s
n
i
k
P

=
=
[
) 1 .( .
)! ( !
!
1
. . . o o

0 .
) 1 (
. ). (
.
.
1
=

=
i i v
v
i i i
k
i
v s
e
e v s n
F
i
i
o
o


3



En la figura 2 se ha representado grficamente la funcin correspondiente a la ecuacin IV. El
valor del nmero de microorganismos, para el cual F se hace 0 es el nmero ms probable.















Figura 2: Grfico de F (ecuacin IV) en funcin del nmero de microorganismos por ml () para un
ensayo donde se obtuvo un resultado 5 2 0 (tubos positivos), inoculando 1, 0.1 y 0.01 ml de muestra
respectivamente.

Ntese que no puede despejarse de la ecuacin IV, por lo cual debe recurrirse a algn
mtodo para resolver ecuaciones no explcitas. Es por esto, que diversos autores han confeccionado
tablas donde se hallan los valores de NMP para distintas combinaciones de tubos positivos y
negativos. En las tablas se encuentra el nmero de tubos positivos aunque, como se mostr, los
clculos se realizan a partir de los tubos negativos.
Queda claro que para utilizar las tablas debe emplearse la misma combinacin de volmenes
y nmero de tubos que figura en las mismas. Si se utiliza una tcnica diferente, debe resolverse la
ecuacin IV. En la tabla 1 se muestran los valores de NMP para distintos resultados obtenidos
utilizando una tcnica particular.








Tabla 1: Valores de NMP para un ensayo con tres cantidades de muestra. n1=1, n2=5, n3=5; v1=45
ml, v2=10 ml, v3=1ml.
-1
0
1
2
3
4
5
0,00 10,00 20,00 30,00
microorganismos/ ml
d
e
r
i
v
a
d
a


4


Tubos positivos NMP/ml
---------------------------------------------------------
1 0 0 0.012
1 1 0 0.029
1 2 0 0.050
1 2 1 0.071
1 3 0 0.081
1 3 1 0.11
1 4 0 0.13
1 4 1 0.17
1 4 2 0.22
1 5 0 0.24
1 5 1 0.35
1 5 2 0.54
1 5 3 0.92
1 5 4 1.61
------------------------------------------------------



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BIBLIOGRAFIA

1-Meynell, G. G. y Meynell E. 1969. Aspectos cuantitativos de los experimentos microbiolgicos.
Captulo 6 en Bacteriologa experimental. Editorial Omega, Barcelona.

2-Guinea, J.; Sancho, J. y Pars, R. 1979. Enumeracin viable por el mtodo del NMP. Captulo 6 en
Anlisis microbiolgico de aguas. Aspectos aplicados. Editorial Omega, Barcelona.

3-Cochran, W. G. 1950. Estimation of bacterial densities by means of the "most probable number".
Biometrics 8: 370-379.

4-Best, D. J. 1990. Optimal determination of most probable numbers. Int. J. Food Microbiol. 11:
159-166.

5-Best, D. J. and Rayner, J. C. W. 1985. A comparison of MPN and Fisher- Yates estimators for the
density of organisms. 27: 167-172.