Cámara cromatográfica

Fase Estacionaria

Muestra

Fase Móvil
  Muestras en disoluciones de 0.1 a 1% se aplican con micropipetas o
microjeringas de 10 a 100 ml de capacidad o con tubos capilares que
terminen en un orificio de 0.5 a 0.1 mm de diámetro.
  Manchas deben tener de 1 a 3 mm de diámetro y estar separadas por 1 a
2 cm Separaciones analíticas: aplicaciones de 5-100 mg.
  Desarrollo Unidimensional ascendente: permite el análisis simultáneo de
varias muestras. Permite mantener buena saturación de vapor.

  Desarrollo descendente: preferible para sustancias de desplazamiento lento.

  Desarrollo en cromatocaja: el papel es enrollado, separado por láminas de

teflón. Permite mayor desplazamiento.

  Desarrollo horizontal: Mejora la reproducibilidad de Rf.

  Desarrollo radial o circular: Permite un mayor flujo de disolvente en la zona

en que tienden a formarse colas, se obtiene mejor definición de zonas y Rf
mas reproducible (modificación croma cónica).

  Desarrollo múltiple: se permite el goteo del solvente al extremo del recorrido

  Desarrollo bidimensional
  Utilizar el agente revelador adecuado para los compuestos
separados
  Recomendable el rociado del papel con el reactivo. Hacerlo
en campana de extracción y a una distancia de 20 a 30 cm
de la cromatoplaca.
  Los cromatogramas deben examinarse con luz UV, tanto
corta (254nm) como larga (360 nm) antes y después de la
aplicación de los agentes cromógenos.
  Agentes cromógenos permiten localizar en el cromatograma
en papel de 1 a 10 mg de compuesto y en cromatogramas en
capa fina, de 0.1 a 1 mg.
Condiciones que favorecen la reproducibilidad de Rf:

  Cámara de desarrollo a temperatura cte.

  Fase móvil homogénea y sin gas (reposo 2 dias).

  Seleccionar y almacenar apropiadamente el papel.

  Utilizar compuestos de referencia.

  Equilibrar el papel 24 hrs. con los vapores de

solventes en la cámara.
Condiciones que favorecen la reproducibilidad de Rf:

  Cámara de desarrollo herméticamente cerrada

durante el desarrollo cromatográfico.

  Permitir que el frente recorra de 20 a 30 cm desde el

origen.

  Respetar los procedimientos de secado del papel y

visualización de manchas
 1) In situ

  Fluorescencia

  Radiocromatogramas

2) Espectrofotométricas

  Raspado y disolución

  Elución de las manchas

Condiciones que evitan la “multiplicación” o
“deformación” de manchas:

Aplicando disoluciones diluidas de las

muestras en el punto de origen.

Flujo constante de disolvente.

Utilizar papel liso.

Utilizar bufferes para evitar el “tailing”.

Agentes Cromógenos:

  Alcoholes:
  Nitrato cérico amónico al 6% en HNO3: Se rocía en
frío, produciendo manchas rojizas sobre fondo amarillo.
Los polialcoholes dan manchas amarillas.
  8-oxiquinolinato de vanadio: Produce manchas rojizas
sobre un fondo negro azulado.
  Vainillina/H2SO4: Luego de rociar el cromatograma, se
seca a 120 C. Alcoholes y cetonas producen manchas
verde-azuladas, aunque no es muy selectivo.
Agentes Cromógenos:

  Alcaloides:
  Yoduro de platino: Luego de rociar, se calienta el
cromatograma. Las manchas son azules, rojas o
violetas.
  Reactivo de Dragendorff Modificado: Se observan
manchas rojas o anaranjadas sobre fondo amarillo,
persisten por 24 hrs. En ocasiones debe calentarse
brevemente a 100 C. Las aminas terciarias tambien
reaccionan.
Agentes Cromógenos:

  Aminas:
  Alizarina: Las aminas alifáticas y aminoalcoholes dan
manchas violeta sobre un fondo amarillento.
  FeCl3/K3[Fe(CN)6]: Las manchas se observan con luz
natural y UV. Las aminas aromáticas y triptamina dan
manchas azules.
  Vainillina/KOH: Aminas y aminoácidos dan manchas
de fluorescencia característica.
  Fluoroborato de p-nitrofenildiazonio: Las aminas
aromáticas y los fenoles con posiciones orto y para
libres dan manchas rojas y azules, respectivamente.
Agentes Cromógenos:

  Aminoácidos:
  Morina (2´3,4´5,7-pentaoxiflavona): Los aminoácidos
aparecen como manchas fluorescentes oscuras o verde-
amarillentas. Tambien reacciona con otros tipos de
sustancia.
  Ninhidrina: Calentar luego de rociar por 10-15 min a
100 C. Manchas azules o violáceas.
Agentes Cromógenos:

  Azúcares y derivados:
  Acido p-aminobenzóico: Luego de rociar, calentar a 105 C
por unos minutos. Las pentosas dan manchas rojo oscuras.
Las manchas de hexosas son marrón oscuras.
  Cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio: Calentar de 5 a 10 min
a 105 C. Glicósidos, esteroides con grupo ceto y azúcares
reductores dan manchas rojas.
  p-anisidina/ácido ftálico: Calentar de 5 a 10 min a 105 C.
Las hexosas dan manchas verdes, las pentosas manchas
rojo-violáceas, las metilpentosas manchas verde-
amarillento, las 2-desoxipentosas manchas gris-marrón y
los ácidos urónicos manchas marrones.
Agentes Cromógenos:

  Azúcares y derivados:
  Antrona: Calentar de 4 a 6 min a 105-115 C. Los
carbohidratos forman manchas amarillas, verdes o
azules.
  Naftoresorcinol: Calentar de 5 a 10 min a 100-110 C.
Los azúcares dan color azul, las cetopentosas color
verde-marrón, y las cetohexosas color rojo-marrón.
Agentes Cromógenos:

  Aldehidos y cetonas:
  2,4-dinitrofenilhidracina: Manchas amarillas, naranjas
o rojas. Cuanto más insaturado o aromático es el
compuesto carbonílico, más rojo es el color.
  Acido Fosfomolíbdico: Las cetonas alifáticas con más
de ocho carbonos dan manchas color azul. También
dan color los ácidos biliares, los ácidos insaturados y
algunos alcaloides.
Agentes Cromógenos:

  Acidos grasos:
  Aceto cúprico/K3[Fe(CN)6]: Se obtienen manchas rojo-
marrón.
Agentes Cromógenos:

  Esteres:
  Nitroprusiato de Sodio/KOH (Prueba de Legal): Las
lactonas α,β insaturadas dan color entre rojo y
violeta.
  Hidroxamato férrico: Los ésteres dan manchas violetas.
Agentes Cromógenos:

  Esteroides:
  Cloruro de antimonio: Se observan bajo luz UV
manchas azules, rojas y violetas.
  Reacción de Libermann-Burchard: Produce manchas
azules, verdes, rosa-violáceas o grises.
Agentes Cromógenos:

  Flavonoides:
  Amoníaco: Los vapores de amoníaco dan manchas
amarillas o anaranjadas.
  Cloruro férrico: Produce manchas azules, rojas, verdes
y marrón.
Agentes Cromógenos:

  Glucósidos:
  Reactivo de Benedict: Se producen manchas rojas y
marrones.
  Acido tricloroacético/Cloroformo: Séquese por 30 min
a 120 C. Se obtienen manchas azules, violetas y verdes.
  Cloruro de Cobalto: Rocíese y calientese a 100-120 C
durante 5 min. Se obtienen manchas rojas, azules y
verde-violáceas.