Jos Ral Prez Gmez

Dra. Maria Azucena Mrquez Lucio

Ing. Bioquimca

Genetica Microbiana

IS08110075

Microbiologa

Las bacterias son microorganismos con una extraordinaria capacidad de adaptacin a diferentes condiciones ambientales. Para comprender la esencia de esta capacidad es importante conocer las bases de su gentica, es decir como esta organizada la informacin gentica, como realizan y regulan su expresin, que mecanismos de variacin gnica poseen. Entre otras, la capacidad infecciosa de las bacterias patgenas, radica en que poseen la informacin gnica necesaria para colonizar los tejidos de un husped, invadirlos y/o producir sustancias txicas que en definitiva causarn la enfermedad. EL ADN COMO MATERIAL GENETICO El ADN constituye el principal componente del material gentico de la inmensa mayora de los organismos, junto con el ARN, siendo el componente qumico primario de los cromosomas y el material con el que los genes estn codificados. La funcin principal del ADN es mantener a travs del cdigo gentico, la informacin gentica necesaria para crear un ser vivo idntico a aquel del que proviene (o casi similar, en el caso de mezclarse con otra cadena como es el caso de la reproduccin sexual o de sufrir mutaciones). Cada nucletido del ADN est compuesto de tres subunidades: cido fosfrico De frmula H3PO4. Cada nucletido puede contener uno (monofosfato: AMP), dos (difosfato: ADP) tres (trifosfato: ATP) grupos de acido fosfrico Desoxirribosa Es un monosacrido de 5 tomos de carbono (pentosa) derivado de la ribosa, que forma parte de la estructura de nucletidos del ADN Su frmula es C5 H10 O4 y contiene toda la informacin gentica que ser transferida as de generacin en generacin. Bases nitrogenadas Hay cuatro tipos de bases nitrogenadas en los nucletidos del ADN: timina (T), citosina (C), guanina (G) y adenina (A).

 Timina La timina es una de las cinco bases nitrogenadas que forman parte de los cidos nucleicos y en el cdigo gentico se representa con la letra T. La timina es una base orgnica nitrogenada de frmula C5 H6 N2 O2 y es un compuesto cclico derivado de la pirimidina (es una base pirimidnica) Adenina Es un compuesto orgnico nitrogenado de frmula C5 H5 N5. Es un derivado de la purina (es una base prica) en la que un hidrgeno ha sido sustituido por un grupo amino (N H2) La adenina, junto con la timina, fue descubierta en 1885 por el bioqumico alemn Albrecht Kossel. Guanina La guanina es una de las cinco bases nitrogenadas que forman parte de los cidos nucleicos y en el cdigo gentico se representa con la letra G. En el ADN la guanina siempre se empareja con la citosina mediante tres enlaces de hidrgeno. Citosina La citosina siempre se empareja con la guanina mediante tres enlace de hidrgeno. Es un derivado pirimidnico, con un anillo aromtico y un grupo amino en posicin 4 y un grupo cetnico en posicin 2. CROMOSOMA PROCARIOTICO El cromosoma procariota es una sola molcula circular de ADN contenida en una regin definida del citoplasma, denominada nucleoide que ocupa aproximadamente un tercio del volumen de la clula, sin estar separado del mismo por una membrana. Este cromosoma es el elemento obligatorio del genoma, aunque es frecuente encontrar unidades de replicacin autnomas llamadas plsmidos, que si se pierden, la bacteria sigue siendo viable. Tambin podemos referirnos como cromosoma bacteriano. Muchas bacterias, poseen adems ADN extra cromosmico, tambin circular cerrado,

denominado ADN plasmdico, por estar contenido en estructuras llamadas plsmidos, que portan informacin gnica para una variedad de funciones no esenciales para la clula en condiciones normales de crecimiento. En trminos bioqumicos, la composicin y estructura de los cidos nuclecos bacterianos, es la misma que para cualquier clula. El cromosoma bacteriano, es suficientemente largo como para formar varios lazos circulares, que como tales pueden a su vez superenrollarse, formando de esta manera una serie de dominios topolgicos independientes. Las bacterias poseen enzimas capaces de alterar la estructura del ADN modificando su superenrollamiento. Estas enzimas que se denominan genricamente "topoisomerasas", actan introduciendo o eliminando vueltas superhelicoidales, cumpliendo un importante rol en los procesos de replicacin y transcripcin del ADN

MUTACION En el ADN Una mutacin es un cambio heredable en la secuencia de bases de los cidos nucleicos que constituyen el genoma de un organismo, que ocurren en condiciones naturales con una muy baja frecuencia y se deben fundamentalmente a errores en los procesos de replicacin del ADN. Mutaciones puntuales Son aquellas que implican un cambio en una nica base, y pueden provocar que se cambie un aminocido por otro en el producto proteico (mutacin por cambio de sentido). Otras veces no se traducen en ningn cambio (mutacin silenciosa), ya que como sabemos existe ms de un codn para cada aminocido. Tambin puede suceder que el codn se convierta en una seal de terminacin (mutacin sin sentido) y en ese caso se traduce una protena incompleta no funcional. Mutaciones gnicas o moleculares Son las mutaciones que alteran la secuencia de nucletidos del ADN. Entre las mutaciones puntuales podemos distinguir:

Mutacin por sustitucin de bases: Se producen al cambiar en una posicin un par de bases por otro (son las bases nitrogenadas las que distinguen los nucletidos de una cadena). Distinguimos dos tipos que se producen por diferentes mecanismos bioqumicos: o Mutaciones transicionales, cuando un par de bases es sustituido por su alternativa del mismo tipo. Las dos bases pricas son adenina (A) y guanina (G), y las dos pirimdicas son citosina (C) y timina (T). La sustitucin de un par AT, por ejemplo, por un par GC, sera una transicin. o Mutaciones transversionales, cuando un par de bases es sustituida por otra del otro tipo. Por ejemplo, la sustitucin del par AT por TA o por CG. o Mutaciones de corrimiento estructural, cuando se aaden o se quitan pares de nucletidos alterndose la longitud de la cadena. Si se aaden o quitan pares en un nmero que no sea mltiplo de tres (es decir si no se trata de un nmero exacto de codones), las consecuencias son especialmente graves, porque a partir de ese punto, y no slo en l, toda la informacin queda alterada. Hay dos casos: o Mutacin por prdida o delecin de nucletidos: En la secuencia de nucletidos se pierde uno y la cadena se acorta en una unidad. o Mutacin por insercin de nuevos nucletidos: Dentro de la secuencia del ADN se introducen nucletidos adicionales, interpuestos entre los que ya haba, alargndose correspondientemente la cadena.

Mutaciones cromosmicas La sustitucin de un nucletido por otro no es el nico tipo posible de mutacin. Algunas veces se puede ganar o perder por completo un nucletido. Adems, es posible que se produzcan modificaciones ms obvias o graves, o que se altere la propia forma y el nmero de los cromosomas. Una parte del cromosoma se puede separar, invertir y despus unirse de nuevo al cromosoma en el mismo lugar. A esto se le llama inversin. Si el fragmento separado se une a un cromosoma distinto, o a un fragmento diferente del cromosoma original, el fenmeno se denomina translocacin. Algunas veces se pierde un fragmento de un cromosoma que forma parte de una pareja de cromosomas homlogos, y este fragmento es adquirido por el otro. Entonces,

se dice que uno presenta una delecin o deficiencia (dependiendo si el fragmento que se pierde es intersticial o terminal, respectivamente) y el otro una duplicacin. Por lo general, las deficiencias son letales en la condicin homocigtica, y con frecuencia las duplicaciones tambin lo son. Las inversiones y las translocaciones suelen ser ms viables, aunque pueden asociarse con mutaciones en los genes cerca de los puntos donde los cromosomas se han roto. Es probable que la mayora de estos reordenamientos cromosmicos sean la consecuencia de errores en el proceso de sobre cruzamiento. Mutaciones espontneas o inducidas Espontaneas: Son aquellas que surgen normalmente como consecuencia de errores durante el proceso de replicacin del ADN. Tales errores ocurren con una probabilidad de 10 ^ -7 en clulas haploides y 10 ^ -14 en diploides. Inducidas: Surgen como consecuencia de la exposicin a mutgenos qumicos o biolgicos o a radiaciones. Agentes mutagnicos fsicos L.U.V. Radiaciones Agentes mutagnicos qumicos 1. Anlogos de bases nitrogenadas: 5 bromo uracilo Timina 2 amino purina Adenina 2. Agentes que reaccionan con el ADN: Agentes alquilantes: mostaza nitrogenada, oxido de etileno o nitroso de guanidina Acido Nitroso: Amino Hidroxilo Hidroxilamina: GC AT

Agentes mutagnicos biolgicos Plasmidos Bacterifagos Elementos transponibles Plsmidos Pequeas molculas de ADN circular Autorreplicativas No contienen genes esenciales Confieren habilidades tiles en circunstancias muy especificas (ej. Resistencia a antibiticos)

Los plsmidos pueden clasificarse segn distintos criterios, por ejemplo por su tamao en pb, su nmero de copias en la bacteria o por el tipo de genes que porta (plsmidos de virulencia, plsmidos de resistencia a antibiticos, etc.) Tambin pueden clasificarse en grupos de incompatibilidad. Se dice que dos plsmidos pertenecen al mismo grupo de incompatibilidad si son incapaces de coexistir en la misma clula bacteriana. Muchos plsmidos, en general los de mayor tamao (que pueden portar hasta 50 o 100 genes), suelen ser capaces de transferirse de una bacteria a otra mediante un proceso llamado conjugacin. Por ltimo, algunos plsmidos no se transfieren en absoluto. La adquisicin de ADN plasmdico por una cepa bacteriana, puede realizarse por medios distintos a la conjugacin, como transformacin, transduccin mediada por fagos o incorporacin en el cromosoma, segn veremos mas adelante. Bacterifagos Son pequeas molculas de ADN o RNA, cpside protenica en la forma libre, sin cpside dentro de las bacterias y se multiplica dentro de estas mismas. Fagos virulentos: Solo se propagan por ciclo ltico Fagos temperados: Pueden propagarse por ciclo ltico o ciclo lisognico Elementos transponibles Son segmentos de ADN, de cientos o miles de pb, nunca dependientes saltan dentro de la clula y con mucha frecuencia eligen el sitio al azar. Tienen

extremos repetidos invertidos. Contienen genes extra, que pueden codificar para muy distintas propiedades fenotpicas, encontrndose entre las mas importantes desde el punto de vista clnico, la resistencia a antimicrobianos como ser el caso de la resistencia de alto nivel a la gentamicina encontrada en algunas cepas de Enterococcus sp. Son responsables tambin de mutaciones en el ADN. Los elementos transponibles estn ampliamente distribuidos en la naturaleza, tanto en virus, clulas procariotas y eucariotas. Existen 2 variedades de elementos transponibles:

RECOMBINACIN GENTICA Es el proceso mediante el cual elementos genticos contenidos en genomas de diferentes individuos se combinan, lo que permite que el individuo lleve a cabo alguna nueva funcin y que pueda dar como resultado una adaptacin a los cambios en el medio ambiente. Este es un evento evolutivo importante y las clulas tienen mecanismos especficos que aseguran que dicha recombinacin se efecte. A diferencia de los eucariotas donde la

recombinacin gentica ocurre en asociacin a la reproduccin sexual, en los procariotas comprende una serie de mecanismos independientes del evento de reproduccin clula, mas adelantes se reanudara el tema, en la recombinacin en bacterifagos. Los mecanismos de recombinacin son llamados: Transformacin Transduccin Conjugacin. TRANSFORMACION La transformacin es el proceso por el cual ciertas bacterias llamadas competentes son capaces de incorporar ADN exgeno o extrao, proveniente de otras bacterias, que se encuentra libre en el medio. La virulencia del Streptococcus pneumoniae guarda relacin con la presencia de cpsula polisacardica a su alrededor. Las colonias con bordes rugosos (R) de S. pneumoniae, carecen de cpsula y no son letales al infectar ratones. La capacidad de captar el ADN exgeno, conservarlo en forma estable e interaccionar con l se denomina competencia. La competencia depende de la presencia de un sistema de captacin de ADN especfico asociado a membrana. Si bien la mayora de las bacterias no presentan capacidad natural para captar ADN, es posible inducir en el laboratorio la competencia, generando por distintos medios distorsiones en la membrana celular, por ejemplo mediante pulsos elctricos (electroporacin) o mediante cambios osmticos y trmicos. Estos procedimientos son muy utilizados para introducir experimentalmente ADN extrao, por ejemplo un plsmido, en una bacteria y as transformarla para que adquiera un fenotipo de inters. Las bacterias tambin pueden ser transformadas con ADN viral, en cuyo caso el proceso se llama transfeccin.

TRANSDUCCION La transduccin es la transferencia de ADN de una bacteria a otra por intermedio de un bacterifago. No todos los ciclos virales son iguales, pudiendo destacar dos ciclos principales, el lisognico y el ltico. I. Respuesta ltica: el virus se va replicando, formando una serie de nuevos fagos a la vez, que usan a la bacteria como elemento parasitado, hasta que son capaces de parasitar ya por ellos mismos. Respuesta lisognica: en la que el genoma del fago se integra en el de la bacteria, de forma que puede permanecer en este estado estacionario bastante tiempo hasta que se produzca el ciclo ltico.

II.

Este proceso es similar a la integracin o desintegracin del factor F, aunque la diferencia es que en la transduccin, la integracin del profago siempre es en el mismo punto del cromosoma bacteriano, mientras que el factor F poda integrarse en ms de un punto determinado. Existen dos formas de transduccin la especializada y la generalizada. Transduccin generalizada Cuando se va a replicar un fago, se produce la lisis de la bacteria para que los fagos puedan abandonar la bacteria. Esto provoca que pueda existir el intercambio de material gentico entre bacterias sin que haya contacto celular. La formacin de bacterias recombinantes a partir de las originales, puede darse gracias a la accin de un agente filtrable que deba transportar los marcadores entre bacterias. Este agente es un fago, y podemos destacar el fago P22. La degradacin del cromosoma bacteriano durante el ciclo ltico, posibilita el que algunos trozos de este cromosoma (siempre que sean de la longitud correcta), sean empaquetados por error dentro de cpsidas vricas, lo que provocar que cuando este fago vuelva a infectar una bacteria, introduzca el fragmento errneo de cromosoma. As es como se produce la transduccin. Este tipo de fagos se denomina fagos transductantes y los cuales, aunque son minoritarios (1/100000), cuando infectan nuevas bacterias, pueden producir la integracin de los marcadores genticos que llevan en el cromosoma bacteriano receptor y generar bacterias transductantes. Como en la conjugacin, estas bacterias

recombinantes se producen por doble entrecruzamiento entre el segmento de DNA dador y la regin homloga del cromosoma receptor.

Transduccin especializada Se da gracias a la accin de algunos fagos que se insertan en regiones concretas del cromosoma bacteriano, de forma que solamente pueden transducir genes que se encuentran alrededor de estos. Un ejemplo es el fago _, que se integra por recombinacin en una regin denominada att del fago y otra homloga perteneciente al cromosoma bacteriano y situada entre los genes gal y bio. En un momento determinado, una cepa bacteriana gal+ y bio+ puede verse lisogenizada por el fago lambda, e integrase en su cromosoma como un profago. Cuando se inicia el ciclo ltico, el fago se libera del cromosoma por entrecruzamiento entre las regiones att_/att. Esta escisin suele ser precisa, de forma que suele reconstruirse el fago, pero puede ocurrir que el punto de entrecruzamiento no se de entre las regiones comentadas, sino entre otras, originndose un DNA circular anormal. Puede entonces perderse una parte del

cromosoma del fago, pero en cambio se gane un trozo del cromosoma bacteriano con gal+. As obtendremos una progenie de fagos transductantes, que reciben el nombre de _dgal+, los cuales han perdido una parte de los genes esenciales para el establecimiento del ciclo ltico. Estos fagos necesitarn la ayuda de fagos no defectuosos ayudantes, gracias a los cuales suplirn las funciones requeridas para replicarse activamente.

CONJUGACION La conjugacin bacteriana es un proceso de transferencia de informacin gentica desde una clula donadora a otra receptora, promovido por determinados tipos de plsmidos, que portan un conjunto de genes cuyos productos participan en el proceso, y que requiere contactos directos entre

ambas, con intervencin de estructuras superficiales especializadas y de funciones especficas (pili sexuales en los Gram negativos, y contacto ntimo en los Gram positivos). La capacidad de conjugacin depende de la presencia en la bacteria de plsmidos conjugativos que contienen los genes necesarios para tal proceso. Algunos de estos plsmidos se comportan como episomas, es decir, que pueden integrarse en el cromosoma; en este caso, si se produce la conjugacin, se puede transferir el propio plsmido ms un segmento adyacente del cromosoma, que a su vez podr recombinarse con secuencias homlogas del cromosoma del receptor, dando lugar a un cromosoma hbrido. Proceso podemos usar los datos de la conjugacin interrumpida para realizar un mapa con frecuencias de recombinacin, usando la conjugacin, primero tenemos que asegurarnos de que los marcadores han pasado al cromosoma receptor, teniendo en cuenta que gracias al gradiente de transferencia natural, pasan con mayor frecuencia y facilidad, aquellos marcadores que se encuentran ms cerca del punto de entrada. Esto es debido a que el apareamiento entre las bacterias suele interrumpirse espontneamente, de forma que la transferencia de los marcadores suele ocurrir en el orden en que estos estn presentes en el DNA a partir del punto de inicio de la transferencia del mismo factor F. Nosotros seleccionamos para un determinado marcador, teniendo que controlar qu marcadores pasan, pudiendo estimar que se produce un punto de entrecruzamiento hacia el ltimo marcador. Podemos deducir el orden de los genes que entran gracias a las frecuencias relativas de recombinantes en cruzamientos recprocos entre los genotipos parentales. Podemos encontrar procesos relacionados con la conjugacin, tales como la sexduccin, en el que se usan elementos F para crear diploides parciales. El F es un caso de factor F modificado, encontrndose en algunas cepas Hfr. Podemos obtener estirpes F con fragmentos muy grandes del cromosoma bacteriano. Los factores F son ms fciles de recombinar porque poseen ms puntos para recombinar.

TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE A principios de 1970 el DNA era la molcula mas difcil de analizar, era enormemente larga y qumicamente montona. Actualmente el DNA es ms fcil de estudiar, es posible separar regiones determinadas y obtenerlas en cantidades prcticamente ilimitadas. Se puede determinar su secuencia de nucletidos a una velocidad de varios cientos de nucletidos al da. Las tcnicas utilizadas en el ADN recombinante Utilizacin de nucleasas de restriccin: Ruptura especifica de ADN, facilita enormemente los aislamientos y la manipulacin de los genes individuales.

Secuenciacin: La secuenciacin rpida de todos los nucletidos de fragmento purificado de ADN, hace posible determinar los lmites precisos de un gen y la secuencia de aminocidos que codifica Hibridacin de los cidos nucledos: Hace posible localizar secuencias determinadas de ADN o de RNA, con una gran exactitud y sensibilidad, utilizando la capacidad que tiene estas molculas de unirse a secuencias complementarias de otros cidos nucledos. Clonacin de ADN: Se puede conseguir que un fragmento de ADN se integre en un elemento gnico autoreplicante (plsmidos, virus) que habita en una bacteria de tal manera que de una molcula de ADN puede ser reproducida generando muchos miles de millones de copias idnticas. Ingeniera gnica: Se pueden alterar secuencias de ADN produciendo versiones modificadas de los genes, los cuales pueden reinsertar en clulas u organismos. Endonucleasas de restriccin Las endonucleasas de restriccin son unos enzimas bacterianos que cortan internamente las molculas de DNA de una forma especfica que viene determinada por la secuencia de los pares de bases. Una de las primeras endonucleasas de restriccin que se caracteriz fue de la bacteria Escherichia coli y se design EcoRI Enzimas utilizadas en la tecnologa de ADN recombinante Endonucleasa de restriccin de tipo II ADN ligasa ADN polimerasa I Transcriptasa inversa Polinucleotido quinasa Transferasa terminal Exonucleasa III Exonucleasa de bacterifago delta

Fosfatasa alcalina BIBLIOGRAFIA Microbiologa medica, Zinsser. Ed. Panamericana Microbiologa medica, Murray, Kobayashi, Pfuller, Rosenthal. Ed. Harcourt http://www.uniovi.es/esr/pp/mgb1.pdf http://webdelprofesor.ula.ve/odontologia/lurdanet/Genetica%20Bacteria na.pdf http://nostoc.usal.es/sefin/MI/tema11MI.html http://www.unap.cl/csmar/BioTecnologia/Clase5.pdf http://www.fagro.edu.uy/~microbiologia/docs/Gen%E9tica.pdf http://fbio.uh.cu/genmol2/temas/cromosomas.htm http://apuntes.rincondelvago.com/conjugacion-bacteriana.html http://html.rincondelvago.com/acidos-nucleicos.html http://es.wikipedia.org/wiki/ADN http://es.wikipedia.org/wiki/Conjugacin_bacteriana http://es.wikipedia.org/wiki/Mutaci%C3%B3n http://www.monografias.com/trabajos10/muta/muta.shtml http://www.personales.ulpgc.es/ecastro.dbbf/Descargas/Transparencias/ DNA%20recombinante.pdf http://mvz.unipaz.edu.co/textos/biblioteca/microbiologia/microbiologia _y_parasitologia_medicas_-_tomo_i/microcap08.pdf www.fcv.unl.edu.ar/archivos/grado/catedras/.../GENETICA06.ppt