1.8.

Arhitectura componenilor moleculari ai materiei vii

Dac se analizeaz natura moleculelor din care sunt compuse celulele oricrui organism, se gsete o mare proporie de micromolecule (n primul rnd ap) i de ioni anorganici. Referitor ns la componenii organici, care sunt cei specifici materiei vii, acetia se prezint majoritar, sub form de molecule uriae macromolecule cu masa cuprins ntre 103 i 109 u. Fr a intra n detalierea structurii chimice a acestor componeni (ceea ce face obiectul altor discipline) studierea organizrii materiei vii impune ca etap esenial cunoaterea arhitecturii componenilor ei macromoleculari. O macromolecul (sau un polimer) este un ansamblu de atomi legai covalent, constituit dintr-un numr mare de molecule mici asemntoare ntre ele (monomeri) care reprezint unitile de baz din a cror legare chimic rezult macromolecula. Dac este un singur tip de unitate monomeric (de ex. A), polimerul rezultat este un homopolimer (A-A-A--A), iar dac monomeri sunt de mai multe tipuri (A, C, G), rezult un heteropolimer (A-G-A-A-C-G--G-A). Este evident faptul c, pentru a se lega ntr-un lan polimeric, unitile monomerice trebuie s posede cel puin dou grupri funcionale care s permit formarea de legturi. Lanurile polimerice pot avea conformaii cu diferite grade de ordonare (deci cu entropii diferite), variind ntre structur rigid, aa cum este faza cristalin i ghem haotic, n care monomerii au libertate de rotaie reciproc. Conformaia depinde att de natura monomerilor, ct i de parametrii ambiani: temperatur, natura solventului, tria ionic, pH-ul etc. Marea majoritatea a biopolimerilor sunt heteropolimeri constituii din monomeri diferii, dar evident, aparinnd aceleai clase de substane. Principalele tipuri de uniti monomerice sunt aminoacizii, nucleotidele i monozaharidele, crora le corespund, respectiv, polimerii: polipeptide (coninute n proteine), polinucleotide (ADN i ARN) i plizaharide. La acestea se mai adaug i unii polimeri hidrocarburici, cum ar fi cauciucul natural. Formarea biopolimerilor din unitile monomerice de baz reprezint o scdere a gradelor de libertate de micare, deci a entropiei, pe msura creterii cantitii de informaie structural. Acest proces de ordonare nu se limiteaz la formarea lanului polimeric cu o anumit structur chimic, structura primar, ci continu cu stabilirea unei succesiuni de structurri ierarhizate. Formarea de zone ordonate ntr-un lan de biopolimer, datorit att forelor London van der Waals, ct i interaciunii hidrofobe i mai ales stabilirii de puni de hidrogen i disulfhidrice (-S-S-), reprezint structura secundar. Dei legturile de hidrogen sunt slabe ele joac un rol important, pentru c numrul lor este de acelai ordin cu al unitilor monomerice. Depinznd n special de posibilitatea formrii de legturi de hidrogen i disulfhidrice ntre diferitele grupri de pe lanul polimeric, structura secundar este, deci, determinat de atomii componeni ai lanului, adic depinde direct de structura primar. 1.8.1. Structura proteinelor i a acizilor nucleici Aceast problem a fost clarificat de Pauling i Corey. Dup cum se cunoate, proteinele reprezint catene lungi de molecule formate prin polimerizarea aminoacizilor. n lungul legturilor peptidice apare o mezomerie, n care o parte a legturii duble se repartizeaz orbitalului atomului de oxigen, iar o parte gruprii NH. Apare un plan determinat de atomii care au creat mezomeria. Analiznd structura spaial a acestor molecule gigant, putem desprinde urmtoarele aspecte generale: - legturile la atomul de carbon numrul 1, se afl toate ntr-un plan, unghiul de legtur fiind n jurul valorii de 120; - legtura dintre atomul 1 de carbon i atomul de azot nvecinat se afl, conform legilor mezomeriei, ntr-o posibilitate de rotire liber; - legtura dintre atomul de azot i atomul de carbon 2, nu este nici ea restrns de posibilitile de rotire, deci legtura dintre atomii de carbon 2 i 3 poate fi repartizat n orice direcie;

- n lungul lanului polipeptidic se gsesc multe grupri NH i CO ntre care se pot forma legturi prin puni de hidrogen. Din acest motiv, molecula va cpta, structura care s prezinte maximum de puni de hidrogen posibile, ceea ce nseamn c a aprut conformaia cu energie intern minim. Catenele polipeptidice din proteine pot avea, n principal, dou tipuri de structuri secundare: a) unele n care legturile de hidrogen se formeaz ntre catene diferite; b) alte structuri n care legturile de hidrogen sunt intracatenare. Datorit posibilitii de rotire liber de la atomul 2 de carbon, planul legturii peptidice (primele dou condiii) se poate frnge la acest nivel. Astfel apare structura numit foaie pliat (foaie beta pliat), avnd legturi de hidrogen intercatenare. Aceasta este una din formele de baz a structurii secundare. O alt structur ce apare datorit numrului mare de puni de hidrogen, este alfa-helix-ul, aceasta fiind o alt form de baz a structurii secundare a proteinelor. n acest caz molecula se torsioneaz n jurul unui ax stabilizat prin numeroase puni de hidrogen intracatenare. Distana la care aceeai grupare molecular (structural) se repet n cadrul unui lan macromolecular cu structur secundar se numete perioad de identitate. Alfa-helix-ul este ntlnit ca structur de baz n multe molecule proteice, care sunt formate prin polimerizarea unor aminoacizi foarte diferii. n cazul acizilor nucleici (ADN), moleculele au tot o structur spiralat ca variant a structurii secundare, numit helix-Watson-Crick (helix-ADN). Acest helix este compus din dou catene lungi, torsionate mpreun. n acest caz structura este stabilizat prin puni de hidrogen, care realizeaz legturi ntre bazele componente ale dublei spirale. Aceast structur spiralat spre dreapta are 34 i conine 10 nucleotide pentru fiecare pas al spiralei. Un alt tip de structur proteic este structura teriar. Structura teriar a unei proteine reprezint forma geometric final pe care aceasta o poate lua. Aceast structur este determinat de o varietate de legturi ntre poriuni din lanul de aminoacizi. Ca rezultat al acestor interaciuni dintre diferite poriuni ale lanurilor de aminoacizi, se formeaz pliuri i bucle n lanul proteic, astfel nct fragmente diferite ale aceluiai lan pot ajunge legate mpreun. Structur teriar au toate proteinele (i cele constituite dintr-un singur lan polipeptidic i cele cu multiple lanuri polipeptidice) n timp ce structur cuaternar au doar proteinele multimerice (cu cel puine dou lanuri polipeptidice). Exist patru tipuri de interaciuni (care se manifest ntre diveri radicali ai aminoacizilor din componena lanului peptidic) care sunt implicate n stabilitatea structurii teriare: puni de hidrogen, puni disulfidice, puni saline i interaciunea hidrofob. Punile de hidrogen, se formeaz ntr-o varietate de circumstane. Ele contribuie att la stabilitatea structurii secundare ct i la stabilitatea celei teriare. Cele mai uzuale cazuri implic puni de hidrogen ntre gruprile alcoolice, ntre grupri acide, ntre o grupare alcoolic i una acid sau ntre o grupare alcoolic i o amin sau o amid. Punile disulfidice, se formeaz ntre atomii de sulf aparinnd la dou molecule de cistein prin oxidarea gruprilor sulfhidril (-SH) de la aminoacidul cistein, singurul aminoacid care are n componen aa ceva. Aceste legturi pot s apar ntr-un singur lan polipeptidic sau ntre dou lanuri complet diferite.

O HO NH2 SH HS

O OH NH2 HO

punte disulfidic

O OH NH2

S NH2

Rolul punilor disulfidice const n creterea stabilitii mecanice a structurii proteice. Acestea determin i o serie de proprieti chimice prin stabilirea conformaiei active, iar la unele proteine joac un rol catalitic. Punile saline sau puni ionice (interaciuni puternice de natur Columbian), rezult din neutralizarea unui acid cu o amin. Interaciunea propriu-zis este de natur ionic i are loc ntre gruparea pozitiv amoniu i gruparea negativ acid.

R H3N CH C
+

O O
+

R R H3N CH C O O
-

H3 N CH C

O
+

O O
-

O H3 N CH C
punte salin

Interaciunile hidrofobe, reprezint un alt factor important care contribui la stabilitatea structurii teriare a proteinelor. Att timp ct n componena unei proteine intr att lanuri polare ct i non-polare, ntr-o soluie apoas moleculele se comport ca picturile de ulei, cu gruprile polare la exterior n contact cu soluia i gruprile non-polare la interior. De asemenea i moleculele solventului din imediata vecintate a proteinei se ordoneaz n funcie de gruprile polare. Astfel, fa de gruprile non-polare, moleculele solventului contribuie n mod negativ la energia entropic, determinnd ca structura mpachetat (teriar) s fie favorizat n detrimentul strii denaturate. Multe proteine n forma lor activ (funcional) exist sub forma unor agregate cu mai mult de un lan polipeptidic mpachetat, acest aranjare determin structura cuaternar. Aceasta este rezultatul interaciunii a mai mult de o molecul proteic, denumit n acest context subunitate proteic i care este parte integrant din ansamblul complexului proteic. O subunitate proteic reprezint o singur molecul proteic care se asambleaz cu alte molecule proteice pentru a forma o protein multimeric sau oligomeric. Proteinele n general i enzimele n special au structur multimeric. Exemple de proteine cu structur cuaternar: ADN-polimeraza47, hemoglobina48, nucleosomul49, canalele inionice50, microtubulii i proteinele care intr n structura citoscheletului etc.

Structur cuaternar (1bpd), ADN-polimeraza de la obolan. n culori sunt identificate structurile secundare: -helix cu rou, -pliat cu albastru.
47

Structur cuaternar (1aoi), complexul nucleosom-ADN. n centru sunt reprezentate componentele nucleosomale (H2a, H2b, H3, H4, reprezentate n culori diferite) nconjurate de un

ADN-polimeraza este o enzim care catalizeaz polimerizarea dezoxiribonucleotidelor ntr-o caten de ADN. Aceasta are un rol deosebit n replicarea macromoleculei de ADN cnd citete o caten intact de ADN considerat matri n scopul de a sintetiza o nou caten. ADN-polimeraza poate s adauge noi nucleotide libere doar la captul 3 terminal a noii catene n formare. Acesta fapt determin direcia de elongare care este ntotdeauna 5-3. Nu este clarificat nc motivul pentru care ADN-polimeraza este capabil s nceap sinteza unei noi catene (de novo). Structura acestei enzime este nalt conservat, ceea ce implic diferene mici de la o specie la alta. 48 Hemoglobina este o protein tetrameric ce are n componen dou lanuri, fiecare cu cte dou polipeptide diferite (lanul- i lanul-). Fiecare subunitate include o grupare hem care conine un atom de Fe capabil s lege oxigenul. 49 Nucleosomul constituie unitatea fundamental care st la baza cromatinei eucariotelor. 50 Canalele ionice sunt proteine formatoare de pori care sunt implicate n determinarea i controlul variaiei tensiunii de-a lungul membranei plasmatice la toate celulele, prin controlul concentraiei ionilor de o parte i de alta a membranei celulare, facilitnd trecerea lor mpotriva gradientului electrochimic.

Surs: RCSB Protein Data Bank

fragment de ADN cu lungimea de 146bp. Surs: RCSB Protein Data Bank

Structur cuaternar (1a3n), deoxi-hemoglobina uman. n culori diferite sunt evideniate cele patru subuniti proteice globulare: dou subuniti i dou . Surs: RCSB Protein Data Bank.

Structur cuaternar (1k4c), complexul kcsa-fab al canalului de K voltaj-dependent n situaia unei concentraii + foarte mari de K . Culorile evideniaz subunitile proteice. Surs: RCSB Protein Data Bank.

La unele ansambluri proteice o anumit subunitate funcioneaz ca subunitate reglatoare, iar alta funcioneaz ca subunitate catalitic. O enzim care deine ambele tipuri de subuniti este numit holoenzim. La majoritatea proteinelor multimerice, numrul de subuniti variaz ntre 2 i 12, cele mai multe avnd 2 sau 4. Excepie fac complexele enzimatice i virusurile care pot avea cu mult mai multe. n proteinele cu puini monomeri sau cu un numr mic de subuniti, toate interaciunile care sunt posibile n cadrul unei subuniti trebuie s fie ndeplinite n totalitate. Astfel, pot s apar agregate moleculare foarte mari. Proteinele multimerice posed un punct al simetriei de grup, constnd n una sau mai multe axe care se intersecteaz. O simetrie tetraedric este pus n eviden acolo unde monomerii sunt n vrfurile unui tetraedru. Proteinele hexamerice pot forma prisme triunghiulare (trigonale), iar cele octamerice, cuburi sau prisme ptratice.

Protein tetrameric (simetrie tetraedric)

Protein hexameric (simetrie hexagonal plan)

Protein hexameric (simetrie prism triunghiular)

Protein hexameric (simetrie octaedric)

Protein octameric (simetrie octaedric)

Protein octameric (simetrie prism ptratic)

Pentru a atinge o anumit funcie specific, exist multe argumente care demonstreaz, de ce un ansamblu de subuniti mpachetate n diferite conformaii tridimensionale este mult mai avantajos din punct de vedere al evoluiei materiei vii, fa de o molecul gigantic asamblat prin legturi covalente. Unul din motive este acela c pentru codificarea unei astfel de proteine (cu structur cuaternar) este nevoie de o cantitate mult mai mic de ADN, deoarece monomerii dein ei nii informaia de auto-asamblare n configuraii multimerice. De asemenea subunitile cu funcii particulare pot fi combinate cu alte subuniti n scopul realizrii de proteine cu complexitate foarte mare i cu funcii noi, diferite de cele ale subunitilor din care au luat natere. 1.8.2. Structura i rolul membranelor vii Membrana este un constituent celular cruia mult vreme i s-a acordat un rol mai mult sau mai puin pasiv n viaa celulei, n special cel de izolare fa de mediu i de aprare. n schimburile cu mediul, dictate de caracterul de sistem deschis al celulei, membrana era privit ca un fel de barier mecanic, asemntoare unei site. Astzi este cunoscut faptul c membrana plasmatic, ca i alte membrane vii, au o structur complex i ndeplinesc numeroase funcii, majoritatea legate de procese metabolice fundamentale. Prezena membranelor este strns legat de necesitatea existenei unor compartimente, n vederea dirijrii i controlului fluxului de substane i energie. Membranele vii au proprieti de semipermeabilitate i de selectivitate. Transportul selectiv de substane din celul i ctre celul este n general un proces activ, adic are loc cu consum de energie metabolic, fiind mijlocit de anumite structuri ale membranei (transportori specifici). n acelai timp, membranele constituie sediul unor enzime sau complexe funcionale cu rol important n inter-conversia i stocarea diferitelor tipuri de energii, n desfurarea i controlul unor reacii biochimice, n recunoaterea unor molecule cu rol de stimuli etc.

Structura membranei celulare

Cercetrile au dovedit c membranele sunt formate, n esen, din lipide (mai ales fosfolipide) i proteine. Moleculele fosfolipidice sunt dispuse ntr-un strat dublu, astfel nct prile lor hidrofobe vin n contact, iar cele polare rmn descoperite spre exteriorul i, respectiv, interiorul celulei. Poziia proteinelor n cadrul membranelor este nc un subiect de discuie, dar cele mai multe observaii experimentale sunt n concordan cu aa-numitul model al mozaicului fluid (fluidmosaic-membrane). Acest model se bazeaz pe cercetri moderne de microscopie electronic, mai ales prin folosirea tehnicii de fracturare prin ngheare51 (freeze-fracture-technique). Combinate cu alte cercetri, asemenea observaii confirm ideea stratului dublu i indic faptul c printre moleculele fosfolipidice sau la suprafaa lor se afl molecule proteice (din loc n loc). Unele dintre ele traverseaz complet membrana, iar altele numai parial. Printre acestea se afl complexe lipoproteice cu rol enzimatic sau de transport, molecule glicoproteice cu rol antigenic etc. n ceea ce privete atribuirea nsuirii termenului de fluid, aceasta rezult, de asemenea, din observaii experimentale, care atest faptul c exist o micare lateral continu n planul membranei, la care particip nu numai fosfolipidele ci i proteinele. n schimb, micarea n plan perpendicular, adic schimbul de fosfolipide ntre stratul intern i cel extern al membranei, este

51

Aceast tehnic const n examinarea unei replici fine (obinut cu ajutorul unor electrozi platin-carbon) a suprafeei descoperite n urma fracturrii pieselor ngheate. Constatarea care s-a fcut este c fracturarea are loc, de preferin, ntre cele dou straturi lipidice, astfel c este dezvluit tocmai structura intern a membranei.

extrem de rar. Toate aceste observaii indic faptul c membrana este un fluid structurat, care i pstreaz forma i integritatea general, dar ai crui componeni individuali sunt n micare. Multe din cunotinele despre structura i funcionarea membranelor au rezultat din studiul unor membrane artificiale, adic a unor membrane model. Din multitudinea de variante, dou modele sunt deosebit de importante, ele fiind modele artificiale, cu ajutorul crora au putut fi reproduse i studiate anumite funcii, exact ca n cazul membranelor naturale. n amndou cazurile este vorba despre membrane lipidice (n particular, fosfolipidice), cu strat dublu (bilayer lipid membranes). Primul model este vezicular, cunoscut i sub numele de liposom52, iar cellalt este plan, cunoscut sub numele de membran lipidic neagr. Avantajul liposomilor const n faptul c pot fi formai ntr-o anumit soluie, iar apoi, prin metode de filtrare pe coloane speciale, se poate schimba complet mediul lor de suspensie. n felul acesta se realizeaz o diferen de concentraie sau/i de compoziie ntre interior i exterior, iar apoi se urmresc schimburile ce au loc spontan sau prin mijlocirea unor transportori specifici, mai cu seam aa numiii ionofori53 (transportori de ioni). Cea de a doua categorie de membrane model (membranele lipidice negre) se deosebesc de liposomi prin faptul c sunt plane i au ncorporat n structura lor un solvent organic (de ex. aceton), n care au fost dizolvate iniial lipidele. Membrana se formeaz n mod spontan n urma ntinderii soluiei de lipide peste un orificiu de aproximativ 1mm2, practicat n peretele unei desprituri sau al unui vas mic de teflon sau polietilen. Aceste membrane par negre deoarece, la dimensiunile lor de Seciuni prin structuri care pot fi formate de aproximativ 50 nu reflect razele luminoase. Avantajul l moleculele de fosfolipide n soluii apoase. constituie dimensiunile relativ mari ale celor dou compartimente pe care le desparte membrana, care sunt direct accesibile unor msurtori macroscopice cu ajutorul electrozilor de pH sau a celor specifici pentru diveri ioni, precum i msurtorilor electrice de conductibilitate i capacitate specific. n cazul ambelor modele, dar mai ales n cazul liposomilor, au fost puse la punct tehnici pentru ncorporarea unor proteine (de ex. complexe enzimatice sau de transport), astfel nct au putut fi realizate i studiate anumite funcii, exact ca n cazul membranelor naturale, dar cu avantajul simplitii i al posibilitilor multiple de manipulare i control pe care le ofer membranele model.

52

Exist diferite modele de a obine liposomi, dintre care cea mai rapid i sigur este cea a ultrasonrii. Materialul fosfolipidic, extras chiar din membrane naturale, este suspendat ntr-o soluie apoas i supus aciunii ultrasunetelor. La nceput, prin dispersarea lipidelor, se obine o soluie lptoas, n care predomin vezicule cu mai multe straturi duble, ntre care a fost nchis o cantitate oarecare de solvent. Pe msura dispersrii tot mai accentuate, soluia se clarific complet. n acest moment, s-a atins stadiul de liposom propriu-zis (vezicul cu un singur strat dublu). Compoziia, structura i comportarea cestei vezicule este foarte apropiat de cea a membranei plasmatice. 53 Ionoforii sunt transportatori mai mult sau mai puin specifici pentru anumii ioni. Ei pot fi folosii pentru transportul unor ioni prin membrane naturale sau artificiale i, din studiul caracteristicilor de transport, se pot face anumite deducii referitoare la mecanismul transportului i structura membranei. Cei mai cunoscui ionofori fac parte din grupul antibioticelor, fiind molecule polipeptidice.