ANALISIS FLAVONOID

Flavonoid dalam tumbuhan hijau umumnya terdapat dalam bentuk O-glikosida ( jarang yang Cglikosida ), dimana 1 gugus hidroksi flavonoid (atau lebih) terikat pada 1 gula (atau lebih) dengan ikatan hemiasetal. O-glikosida lebih mudah dihidrolisis dengan asam C-glikosida ikatan lebih kuat Glikosida glikon dan aglikon Gula umum : Glukosa Gula lain : galaktosa, ramnosa, xilosa, arabinosa Gula jarang : alosa, manosa, fruktosa, apiosa, as. glukuronat, galakturonat flavonoid dalam tumbuhan terikat dengan gula, tidak bebas, atau terikat dengan yang lain, yang kelarutannya akan berbeda Struktur umum 15 atom C dalam konfigurasi C 6 C 3 C 6

PENGGOLONGAN 1. Antosianin: pigmen bunga merah, biru pada daun dan bunga 2. Proantosianidin: tak berwarna, biasa terdapat dalam galih (bakal) dan daum 3. Flavonol: ko-pigmen tak berwarna, pada tumbuhan berkayu 4. Flavon: ko-pigmen tak berwarna, pada tumbuhan berkayu 5. Glikoflavon: ko-pigmen tak berwarna, sudah berikatan dengan glikosida 6. Biflavonil: ko-pigmen tak berwarna, terbatas pada gymnospermae 7. Khalkon & Auron: pigmen bunga kuning, cincin C nya terbuka 8. Flavanon: tak berwarna, biasanya terdapat pada daun & buah. Ikatan rangkap di cincin C hilang 1 9. Isoflavon: cincin B nempel di C no 3. Tak berwarna, biasa pada akar tumbuhan Leguminosae SIFAT KELARUTAN Karena punya sejumlah gugus OH bebas atau suatu gula, maka umumnya flavonoid bersifat polar, sehingga larut dalam air & pelarut polar lain: etanol, metanol, aseton, butanol, dimetilsulfoksida (DMSO), dimetil formamida (DMF), dll. Pemisahan KKt, proses lambat. DMSO & DMF untuk instrumen Aglikon yang kurang polar seperti isoflavon, flavanon, flavon, flavonol yang termetoksilasi, larut dalam pelarut nonpolar: eter, kloroform, benzen, heksan, toluen). Dalam bentuk aglikon, pemisahan lebih mudah (dengan KLT)

SIFAT FISIKA KIMIA

Aglikon flavonoid adalah polifenol, karena itu punya sifat kimia senyawa fenol, yaitu bersifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa (INGAT! Dalam larutan basa flavonoid akan lebih cepat / mudah terurai & teroksidasi) Sifat ini digunakan sebagai cara deteksi flavonoid pada pelat KLT. Senyawa fenol + basa (amoniak) perubahan warna. Warna bercak visibel, warna bercak dengan UV, dan warna bercak UV + amoniak, dapat dijadikan salahsatu petunjuk untuk identifikasi flavonoid. Contoh: - flavonoid glikosida kuning (+ amoniak) coklat tua (UV) kuning coklat

antosianidin 3 glikosida merah / jingga (+ amoniak) merah / jingga (UV) biru

Flavonoid mengandung senyawa dengan sistem aromatik terkonjugasi, sehingga menunjukkan pita serapan yang kuat pada daerah spektrum UV-vis dapat dijadikan sebagai petunjuk identifikasi. UV panjang gelombang 200 400 Vis panjang gelombang 300

pita II (nm)

pita I (nm)

jenis

250-280 250-280 250-280 245-275 275-295 230-270 (I rendah) 230-270 (I rendah) 270-280

310-350 330-360 350-385 310-330 300-330 bahu 340-390 380-430 465-560

flavon flavonol (3-OH tersubtitusi) flavonol (3-OH bebas) isoflavon flavanon & dihidroflavonol khalkon auron Antosianidin & antosianin

TAHAP ANALISIS 1. EKSTRAKSI Maserasi 2 tahap dengan menggunakan: Pelarut 1 metanol : air (9 : 1) selama 6 12 jam ======= untuk penetrasi, membuka menbran karena flavonoid ada di vakuola sel Pelarut 2 metanol : air (1:1) selama 6 12 jam Kedua ekstrak disatukan kemudian diuapkan. Bahan + pelarut 1 ampas + pelarut 2 ekstrak 2. FRAKSINASI Dengan n-heksan : air atau CHCl3 : air, lapisan n-heksan atau CHCl3 untuk menghilangkan senyawa yang kepolarannya rendah seperti lemak, terpena, klorofil, xantofil, dll., dengan cara Ekstraksi Cair-Cair (ECC) menggunkan 2 pelarut yang beda kepolarannya jauh.

3.

DALAM LAPISAN AIR mengandung sebagian besar senyawa flavanoid

KROMATOGRAFI KERTAS (KKt) 2 ARAH bisa mempunyai informasi tambahan dari jenis flavanoid Merupakan cara paling umum & berguna untuk analisis pendahuluan ekstrak & menguji adanya flavanoid. Penyangga: kertas Whatman 3 mm Pengembang: 1. BAA = 4:1:5 (lapisan atas) 2. As. asetat 15 % Pendeteksi: sinar UV 366 nm bercak terang (bukan 254 yang menghasilkan bercak gelap/pemadaman) Informasi / petunjuk dari KKt 2 arah dapat digunakan untuk menunutn struktur flavanoid dilihat dari: o Warna bercak sebelum disinari UV & setelah disinari UV o Letak bercak pada KKt 2 arah pada kondisi baku spt diatas Pengembang lain: TBA = t-buOH : HOAc : air = 3:1:1 KAA = kloroform : HOAc : air = 30:15:2 Forestal : HOAc : air : HCl = 30:10:3 BEA = benzen : HOAc : air = 125:72:3 Air HCl 1% Pereaksi semprot

kuning berfluoresensi (UV 366 nm) reagenz A) flavonol = bercak jingga (UV atau vis) bercak kuning hijau

AlCl3 5 % 5 OH flavanoid terhihat sebagai bercak Bercak yang semula tak terlihat jadi terlihat Kompleks difenil-as borat-etanol amin (Natur Stoff 3 4 dihidroksi flavon & 3 4 dihidroksi 4 hidroksi flavon & 4 hidroksi flavonol =

As sulfanilat terdiazotasi Senyawa yang mempunyai gugus fenol = bercak kuning, jingga, merah

Vanilin HCl Katekin & protoantosianidin = bercak merah atau merah lembayung segera setelah penyemprotan Flavanon & dihidroflavonol = bercak merah atau merah lembayung terbentuk lebih lambat setelah penyemprotan

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT) Tujuan: - mencari pelarut untuk krom. Kolom (KK) - analisis fraksi yang diperoleh dari KK - identifikasi flavonoid secara ko-kromatografi - isolasi flavonoid skala kecil Untuk KK perlu ditambah pelarut nonpolarnya untuk mengurangi kecepatan, Rf = 0.3 Ko-kromatografi dibandingkan dengan baku autentik yang di KLT sama2 dalam 1 plat 1 sistem. KROMATOGRAFI KERTAS PREPARATIF (1 ARAH / 2 ARAH) Pemisahan 1 komponen dalam skala besar, kertasnya lebih besar Bercak ditutulkan berupa pita lebar 1 3 cm Cara ini memungkinkan kita memisahkan ekstrak 10 15 kali jumlah yang dapat dipisahkan secara KKt biasa Setelah pengembangan, pita yang terjadi dipotong-potong & diekstraksi dengan pelarut KROMATOGRAFI KOLOM

Fasa diam / penjerap: selulosa, silika, poliamida, sephadex Fasa gerak / eluen: pelarut / campuran pelarut yang berurutan

dimulai dari yang kurang polar & sedikitsedikit meningkat ke yang paling polar (elusi gradien / elusi landaian)

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) Pada dasarnya sama dengan KK, perbedaan terletak pada ukuran pertikel kolom yang lebih kecil & lenih teratur Karena ukuran partikel lebih halus, maka diperlukan tekanan sampai 5000 lb/inchi atau 2000 kg/cm

Memungkinkan untuk menganalisis komponen flavonoid dalam suatu campuran secara kuantitatif pada asas resolusi & kepekaan yang tinggi ( < 50 ng) Kolom: fasa balik (hidrokarbon terikat pada kemasan silika) = Bondapak C-18 Eluen: air-metanol, air-metanol-HOAc, air-asetonitril