Laporan Praktikum Genetika

ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)

Widya Setyaningtyas*, Haniyya, I. Sobari, K.S. Juarna, N. Restiana, Nuruliawati, A. Nurfitriana, R. Arita
Universitas Indonesia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Departemen Biologi Mei 2012

Abstrak Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) merupakan metode uji imunologi berdasarkan reaksi spesisfik antara antigen dan amtibodi. ELISA digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen dan antibodi pada suatu sampel. Prinsip kerja ELISA adalah reaksi spesifik antara antigen dan antibodi dengan menggunakan enzim sebagai penanda reaksi. Antigen merupakan makromolekul yang dapat menginduksi pembentukan antibodi. Antibodi adalah protein yang diproduksi oleh sistem imun akibat keberadaan antigen. Pemanfataan ELISA adalah untuk mengidentifikasi keberadaan antigen dan antibodi, menghitung konsentrasi antigen dan antibodi, serta sebagai alat diagnostik suatu penyakit. Hasil praktikum adalah didapatkan nilai kuantitatif dan kualitatif dari suatu sampel protein.

Kata kunci: ELISA; antigen; antibodi

1. Pendahuluan

keberadaan protein (Albala & Smith 2003: 132). ELISA juga digunakan untuk menentukan keberadaan antigen

Tujuan dilakukannya praktikum ELISA adalah untuk memahami prinsip kerja ELISA, mengetahui konsentrasi antigen atau antibodi dalam sampel. Selain itu juga untuk menentukan suatu sampel negatif atau positif mengidap suatu penyakit tertentu berdasarkan teknik ELISA. Latar belakang dilakukannya praktikum dengan menggunakan metode enzyme-linked

dan jumlah antigen dalam suatu sampel (Ausubel dkk. 2003: 1647). Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) adalah metode untuk mendeteksi serta menghitung konsentrasi antibodi atau antigen sampel secara spesifik (Ravichandra 2010: 337). Protein pada sampel yang

telah dipisahkan berdasarkan berat molekulnya dengan teknik SDS-PAGE, sulit untuk dipastikan jumlah relatif

immunosorbent assay (ELISA) adalah untuk mendeteksi

*) Kelompok 2A

protein tersebut. Teknik ELISA digunakan untuk menghitung serta memastikan konsentrasi dari protein dari suatu sampel (Miller 2006: 43). Teknik ELISA didasarkan pada reaksi spesifik antara antigen dengan antibodi yang memiliki

126). Sandwich ELISA atau ELISA lapis ganda dicirikan oleh antibodi penangkap antigen yang

diikatkan pada fase padat. Teknik tersebut terdiri dari dua macam, yaitu direct sandwich ELISA dan indirect sandwich ELISA. Antibodi penangkap pertama kali diletakkan ke dalam wells kemudian antigen dari darah atau urin ditambahkan ke dalam wells sehingga berikatan dengan antibodi penangkap. Jika ke dalam wells langsung ditambahkan antibodi detektor yang telah dilabel enzim maka disebut dengan direct sandwich ELISA, sedangkan apabila ditambahkan antibodi

sensitivitas dan spesifitas tinggi dengan menggunakan enzim sebagai indikator. Prinsip dasar ELISA adalah analisis interaksi antara antigen dan antibodi dengan menggunakan enzim sebagai penanda reaksi (Yusrini 2005: 16--17). Prinsip kerja ELISA adalah adanya ikatan antara antigen dan antibodi kompleks dengan

penambahan substrat tertentu dan enzim peroksida yang akan memberikan perubahan warna pada hasil yang positif (Azwar 1985: 2). ELISA memiliki 3 macam tipe yang terdiri atas direct ELISA, indirect ELISA, dan sandwich ELISA. Sandwich ELISA dapat dibedakan menjadi 2 jenis yaitu direct sandwich ELISA dan indirect sandwich ELISA (Ausubel dkk. 2003: 1654). Direct ELISA merupakan metode ELISA yang paling sederhana. Direct ELISA digunakan untuk mengukur konsentrasi antigen pada sampel. Direct ELISA mendeteksi antigen dengan cara mengikat antigen dengan antibodi yang telah dilabel dengan enzim. Reaksi pengikatan tersebut terjadi secara spesifik (Ausubel dkk. 2003: 1658). Direct ELISA memerlukan antibodi yang khas untuk antigen yang dideteksi. Kelemahan utama dari direct ELISA adalah tidak fleksibel. Enzim yang digunakan untuk amplifikasi reaksi diikatkan secara kovalen pada antibodi yang langsung berikatan dengan antigen (Akin 2006: 125). Indirect ELISA banyak digunakan untuk mengukur konsentrasi antibodi. Enzim diikatkan pada antibodi

detektor yang tanpa dilabel enzim terlebih dahulu disebut dengan indirect sandwich ELISA (Berg 2002: 1). Antigen merupakan substansi makromolekul yang muncul dalam tubuh atau akibat introduksi dari luar sehingga dapat menginisiasi reaksi imun. Respon dari reaksi imun terhadap munculnya antigen adalah memproduksi antibodi dalam jumlah yang efektif untuk menghilangkan antigen dari tubuh (Ahluwalia 2009: 331). Antibodi adalah suatu protein dapat larut yang dihasilkan sistem imun sebagai respon terhadap Antigen

keberadaan antigen (Sloane 1995: 256).

merupakan zat yang ada di dalam tubuh dan berasal dari luar tubuh (sel asing) yang dapat memulai reaksi kekebalan. Antigen ada pada permukaan sel darah merah dan sel darah putih yang penting dalam sistem imun tubuh (Ahluwalia 2009: 331). Antibodi berfungsi mengikat antigen pada organisme penginvasi, dan mencetuskan proses di mana organisme tersebut kemudian menjadi tidak aktif atau dihancurkan.

Antibodi memberi tanda pada organisme asing tersebut sehingga dapat dihancurkan oleh sel fagositik (Marks dkk. 1996: 89).

sekunder yang berikatan dengan antibodi primer. Antigen dan antibodi sekunder biasanya dibuat konstan dan yang berubah adalah antibodi primer (Akin 2006:

Aplikasi dari ELISA salah satunya adalah clinical laboratory. Uji clinical laboratory umumnya digunakan untuk mendeteksi protein dari patogen, atau marker yang mengindikasi adanya infeksi atau penyakit. Aplikasi umum dari ELISA dalam uji infeksi adalah identifikasi antibodi patogen spesifik dalam serum (Walker & Rapley 2005: 419). Aplikasi dari

ditambahkan ke dalam wells agar reaksi enzimatik berhenti sehingga berubah warna menjadi kuning. Ketujuh, optical density (OD) diukur dengan ELISA reader, sehingga didapatkan konsentrasi antigen atau antibodi.

ELISA lainnya yaitu untuk mendeteksi infeksi virus HIV (Nicholl 2008: 228).

3. Hasil dan Pembahasan

Pemberian 2. Metodologi

blocking

buffer

berfungsi

untuk

menjaga pH dan menghindari ikatan antibodi dengan antigen yang tidak spesifik (Walker 2002: 1086). Washing buffer adalah larutan buffer yang berfungsi Alat yang digunakan dalam praktikum ELISA antara lain 96 well plate, multichannel pipet, tips, ELISA reader, dan ELISA washer. Bahan yang digunakan pada praktikum ELISA adalah washing buffer, blocking buffer, antigen, 0.2 sampai 10 penangkap (antibodi monoklonal atau antibodi antibodi untuk menghilangkan antigen dan antibodi yang tidak berikatan. Larutan yang dapat menjadi washing buffer antara lain tris-buffered saline (TBS) atau phosphate buffer saline (PBS). Antibodi monoklonal atau

poliklonal dapat digunakan sebagai antibodi penangkap pada tipe sandwich ELISA. Antibodi monoklonal mempunyai monospesifitas yang memungkinkan hasil deteksi yang baik dan perbedaaan kuantitas yang kecil pada konsentrasi antigen. Antibodi poliklonal digunakan untuk menarik sebanyak mungkin antigen (Noonan

poliklonal), 50

antibodi detektor yang telah dilabel substrat

dengan enzim phosphatase dan 75

chromogenic. Substrat chromogenic dapat berupa 4methylumbelliferyl phosphate (MUP) atau p-nitrophenyl phosphate (NPP). Cara kerja pada praktikum ELISA adalah pertama wells ELISA (96 polystryrene well plate) dilapisi dengan antibodi penangkap, dan diinkubasi selama satu malam. Kedua, blocking buffer dimasukkan ke dalam wells kemudian antigen juga dimasukkan ke dalam wells tersebut. Ketiga, antibodi detektor yang telah tertaut enzim HRP (Horse Radish Peroxides) dimasukkan ke dalam wells. Keempat, yaitu proses pencucian (washing). Kelima, chromogenic substrate TMB (3,3,5,5 substrat tetramethylbenzidine) teroksidasi dimasukkan, hidrogen

2012: 1). Inkubasi dilakukan agar antibodi dan antigen dapat saling berikatan dengan sempurna. Penambahan asam H2SO4 bertujuan untuk menghentikan reaksi enzimatis (Ausubel dkk. 2003: 1661). Pemberian chromogenic substrate TMB akan menyebabkan

substrat terwarnai sehingga mengekspresikan besarnya nilai OD (Walker 2002: 1087). Pengamatan hasil ELISA dilakukan secara

kuantitatif maupun kualitatif. Hasil ELISA secara kuantitatif dapat diamati dari nilai optical density (OD) yang diukur dengan menggunakan ELISA reader (Miller 2006: 7). Hasil kuantitatif adalah data ELISA

sehingga

menjadi

peroksida yang berwarna biru. Keenam, asam H2SO4

dapat diinterpretasikan dalam perbandingan dengan kurva standar (purifikasi antigen) agar dapat secara tepat digunakan untuk menghitung konsentrasi antigen dalam berbagai sampel (Sylvest 2010: 1). Hasil ELISA secara kualitatif dapat diamati dengan adanya perubahan warna menjadi kuning pada reaksi pengujian jika sampel yang diuji mengandung virus. Semakin tinggi intensitas

Prinsip kerja ELISA didasarkan pada reaksi antara antigen dan antibodi secara spesifik, dengan menggunakan enzim sebagai penanda reaksi.

Konsentrasi antigen dalam suatu sampel dapat diketahui dengan menggunakan kurva standar dan perhitungan persamaan linear. Untuk menentukan sampel negatif atau positif menderita teknik suatu penyakit tertentu cara

warna yang terbentuk, maka semakin tinggi pula konsentrasi virus pada sampel tersebut (Miller 2006: 8). Semi-kuantitatif adalah data ELISA dapat digunakan untuk membandingkan tingkat relatif dari antigen di dalam sampel uji karena intensitas sinyal akan bervariasi secara langsung terhadap konsentrasi antigen. Data ELISA biasanya digambarkan dengan nilai optical density (OD) dan konsentrasi log untuk menghasilkan kurva sigmodial. Hal ini dapat dilakukan dengan menggambar grafik langsung atau dengan software curve fitting yang biasanya ada pada ELISA reader (Sylvest 2010: 2). Persamaan linear dari kurva standar pada lampiran soal adalah y = 0,0019x + 0,0457. Nilai sampel rasio didapatkan dari perhitungan nilai OD sampel dibagi dengan nilai OD cut off (nilai minimum sampel dikatakan positif) yaitu sebesar 0.2. Kriteria sampel negatif apabila nilai sampel rasio positif apabila nilai sampel rasio 0.5. Kriteria sampel 0.5. Sampel rasio

berdasarkan

ELISA

yaitu

dengan

membandingkan nilai sampel rasio dengan kiteria masing-masing sampel positif dan negatif. Sampel dengan rasio yang bernilai kurang dari 0,5 bernilai negatif, sedangkan sampel yang bernilai positif memiliki nilai minimal 0,5.

Daftar Pustaka

Ahluwalia, K. B. 2009. Genetics. 2nd ed. New Age International Ltd., New Delhi: xvi + 444 hlm. Akin, H. M. 2006. Virologi tumbuhan. Kanisius, Yogyakarta: 191 hlm. Albala, J. S. & I. H. Smith. 2003. Protein Arrays, Biochips, and Proteomics: The next phase of genomic discovery. Marcel dekker, Inc., USA: xiv + 407 hlm. Ausubel, F.M., R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith & K. Struhl. 2003. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc., USA: xii + 4384 hlm. Azwar, I. G. M. 1985. Kemungkinan Penggunaan Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) Dalam Diagnosa Serologis Brucellosis: 10 hlm. http://repository.ipb.ac.id/bitstream/handle/12345 6789/39637/B85igm_abstract.pdf?sequence=2. 19 Mei 2012, pk. 17.04.

dengan OD value 0,050 adalah 0,25, sehingga sampel dinyatakan negatif menderita penyakit demam berdarah. Sampel dengan OD value 0,0487 bernilai 0,2435, sampel dinyatakan negatif menderita penyakit demam berdarah. Sampel terakhir memiliki OD value 1,563 yang bernilai 7,815 dinyatakan positif menderita demam berdarah. 4. Kesimpulan

Berg, J. M. 2002. Indirect ELISA and Sandwich ELISA: 1 hlm. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22420/ 20 Mei 2012 15.40. Marks, D. B., A. D. Marks & C. M. Smith. 1996. Basic medical biochemistry: a clinical approach. Terj. dari Biokimia kedokteran dasar: sebuah

learner oleh James Veldman. EGC, Jakarta: x + 389 hlm. Sylvest, L. 2010. An Introduction to ELISA: 1 hlm. http://www.abdserotec.com/resources/elisatechnical-resources-and-troubleshooting/anintroduction-to-elisa.html 19Mei 2012 20.43. Walker, J. M. & R. Rapley. 2005. Medical biomethods handbook. Humana Press Inc., New Jersey: 644 hlm. Walker, J. M. 2002. The protein protocols handbook. 2nd ed. Humana Press Inc., New Jersey: 1146 hlm. Yusrini, H. 2005. Teknik analisis kandungan aflatoksin B1 secara elisa pada pakan 20 hlm.

pendekatan klinis oleh B.U. Pendit. EGC, Jakarta: ix + 770 hlm. Miller, D. C. 2006. Mechanism(s) of enhanced vascular cell response to polymeric biomaterials with nano-structured surface features. ProQuest Information and Learning Company, Ann Arbor: 84 hlm. Nicholl, D.S.T. 2008. An Introduction to Genetic Engineering, 3 ed. Cambridge University Press, London: xii + 302 hlm. Noonan, M. 2012. Overview of ELISA: 1 hlm. http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=F88 ADEC9-1B43-4585-922E-836FE09D8403 20 Mei 2012 19.21. Ravichandra, N. G. 2010. Methods and techniques in plant nematology. PHI Learning Private
rd

http://pustaka.litbang.deptan.go.id/publikasi/bt1 01055.pdf, 19Mei 2012. Pk. 08.15.

Sylvest, L. 2010. An Introduction to ELISA: 1 hlm. http://www.abdserotec.com/resources/elisatechnical-resources-and-troubleshooting/anintroduction-to-elisa.html 20 Mei 2012 pk 20.43.

Limited, New Delhi: 616 hlm. Sloane, E. 1995. Anatomi dan fisiologi untuk pemula. Terj. dari Anatomy and physiology: an easy

LAMPIRAN

1. Tugas Latihan saat Praktikum ELISA

Tabel data: Konsentrasi NS1 (pg/ml) 0 7.8 15.6 31.2 62.5 125 250 500 OD value 0.075 0.127 0.173 0.274 0.489 0.846 1.594 2.831

1. Kurva standar dan persamaan linearnya

Kurva Standar
3.5 3 OD Value 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 200 400 Konsentrasi NS1 600

y = 0.005x + 0.112 R = 0.997

Series1 Linear (Series1)

2. Konsentrasi antigen NS1 pada sampel yang diketahui memiliki OD value 0,785 Dik. y = 0,785 y = 0,0056x + 0,1124 0,785 = 0,0056x + 0,1124 0,785 - 0,1124 = 0,0056x

0,6726 = 0,0056x

= 120, 107 pg/ml

3. Sample ratio ODvalue sampel = 0,785 ODvalue cut off = 0,2 Kriteria sampel negatif : sample ratio < 0,5 Kriteria sampel positif : sample ratio Jawab: Sample ratio = 0,5

= 3,925 > 0,5

Sampel dinyatakan positif.

2. Tugas Latihan untuk Laporan Tabel data: Konsentrasi NS1 (pg/ml) 0 7.8 15.6 31.2 62.5 125 250 500 OD value 0.067 0.094 0.092 0.100 0.124 0.235 0.546 1.013

1. Kurva standar dan persamaan linearnya

Kurva Standar
1.2 1 OD Value 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 200 400 600 Konsentrasi Anti-NS1 (pg/ml) Series1 Linear (Series1) y = 0.0019x + 0.0457 R = 0.991

2. Konsentrasi antigen NS1 pada sampel yang diketahui memiliki ODvalue: a. 0,050 y = 0,0019x + 0,0457 0,050 = 0,0019x + 0,0457 0,050 - 0,0457 = 0,0019x 0,0043 = 0,0019x

= 2,26 pg/ml

b. 0,487 y = 0,0019x + 0,0457 0,487 = 0,0019x + 0,0457 0,487 - 0,0457 = 0,0019x 0,4413 = 0,0019x

= 232,26 pg/ml

c. 1,563 y = 0,0019x + 0,0457 1,563 = 0,0019x + 0,0457 1,563 - 0,0457 = 0,0019x 1,5173 = 0,0019x

= 798, 57 pg/ml

3. Sample ratio ODvalue cut off = 0,2 Kriteria sampel negatif : sample ratio < 0,5 Kriteria sampel positif : sample ratio 0,5

a. ODvalue sampel = 0,050 Sample ratio =

= 0,25 < 0,5

Sampel yang dihasilkan bernilai negatif menderita demam berdarah.

b. ODvalue sampel = 0,0487 Sample ratio =

= 0,2435 < 0,5

Sampel yang dihasilkan bernilai negatif menderita demam berdarah.

c. ODvalue sampel = 1,563 Sample ratio =

= 7,815 > 0,5

Sampel yang dihasilkan bernilai positif menderita demam berdarah.

10