PRACTICA #9 TINCIONES PERMANENTES DE PARASITOS I.

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OBJETIVO DE LA PRACTICA Que el alumno se familiarice con diferentes tcnicas de tincin de parsitos para poder distinguirlos al microscopio y utilizarlas en diagnstico. INTRODUCCION En la mayora de los casos los protozoarios intestinales se pueden observar bien con tinciones temporales, como es el caso de los exmenes directos con lugol, solucin salina o Sudn, como se vi en prcticas anteriores. En algunas ocasiones es necesario teir los parsitos en forma definitiva, para obtener preparaciones permanentes; otras veces estas tinciones son necesarias porque se necesita distinguir algunas de sus estructuras celulares, usando tinciones especiales permanentes. Algunos parsitos requieren tinciones especiales, para poder observarse. El inmunodiagnstico puede realizarse recurriendo a la tincin con anticuerpos marcados con colorantes fuorescentes, permitiendo una identificacin ms fcil. Las preparaciones fecales permanentes son hechas por diferentes razones: - Proporcionan informacin sobre el material estudiado. ( ej: tincin de Romanowsky) - Utiles en la identificacin exacta de flagelados (eJ: tincin de Romanowsky, tincin de Fierro-hematoxilina) - Cuando el parsito no puede ser detectado en preparaciones en fresco o por tcnicas de concentracin, la tincin permanente de material fecal fresco puede revelar la presencia de parsitos intestinales (ej: tincin de Romanowsky, tincin Trichromo, Tincin de ziehl Neelsen modificada) - Son tiles en la demostracin de patrones nucleares de quistes, facilitando la identificacin (Tincin de fierro-hematoxilina, tincin Tricromo) MATERIALES Y METODOS 1. Tincin de Romanowsky a) Tincin modificada rpida de Field: Es una modificacion de la tincin de Field, que permite una tincion rpida de frotes delgados y fijados de varias muestras clnicas. Es muy til para tinciones de frotes fecales, exudados fecales y aspirados duodenales. Una tincin permanente de Romanowsky (ej: Giemsa o tincion rpida de Field) debe ser usada para diarrea sanguinolenta y para heces semi-formadas con sangre y/o muco. Proporciona informacin sobre el exudado presente, presencia de

trofozotos de flagelados como Giardia lamblia. Permite determianr la presencia de protozoarios que son difciles de detectar o no son detectados en preparaciones en fresco, como Blastocystis hominis. Metodo. a. Haga un frote delgado de heces o de exudado fecales. Deje secar al aire libre. b. Fije con metanol por 1 minuto. c. Cubra el frote con 1 ml de colorante de Field (colorante B) (diluido 1:4 con agua destilada) d. Aada inmediatamente un volumen igual de colorante concentrado de Field (colorante A), mezcle bien y deje colorear por 1 minuto. e. Enjuague con agua de la llave y escurra para secar. f. Los flagelos, cilios y ncleos se tien de rojo, mientras que el citoplasma de azul. b). Tincin de Giemsa El colorante de Giemsa puede ser usado para frotes de heces no-formadas, exudados fecales y aspirados duodenales. Mtodo a. Haga un frote delgado de exudado fecal. Deje secar al aire libre. b. Fije en metanol por 1 minuto. Escurra y deje secar. a. Cubra el frote con colorante Giemsa diluido 1:10 con agua destilada. Cada vez debe prepararse el colorante. b. Deje colorear por 20-25 minutos. c. Lave con agua de la llave y no deje precipitar el colorante en el frote. Deje secar al aire libre. d. Examine el frote a 100 X. e) Los Flagelos, cilios y ncleos se tien de rojo y el citoplasma azul.
Colorante de Giemsa: 1 g de polvo de Giemsa + 66 mL de glicerina calentado a 50 grados durante 2 horas, aadir 66 mL de actohol metlico absoluto, dejar a temperatura ambiente 7-14 das (maduracin). Filtrar antes de su empleo.

2. Tincin de Tricromo El mtodo de tricromo para teir protozoarios es recomendado especialmente para identificar caractersticas de quistes y trofozoitos de amibas Solucion A: fijador de Schaudinn . Solucion B: Yodo-alcohol. Para preparar la solucin concentrada, aada cristales de yodo al 70% en etanol para hacer una solucin oscura. Para preparar la solucin de trabajo, diluya la solucin concentrada, adicionando etanol 70% (la solucin debe quedar del color del t poco cargado). No es importante la concentracin exacta.

Solucin C: Etanol Acido. Acido acetico glacial 0.5 ml Etanol 90% 100 mL Metodo a. Haga un frote delgado de material fecal en un portaobjetos. b. Mientras el frote aun esta hmedo sumerja el portaobjetos en un vaso de Coplin conteniendo fijador de Schaudin (solucion A.) durante 5 minutos a 50 C o a temperatura ambiente 1 hora. Tincin. c. Yodo-alcohol (solucin B) 10 minutos. d. Etanol de 70% por 3-5 minutos. e. Etanol de 80% por 3-5 minutos. f. Colorante Trichromo Parapak por 10 minutes. g. Alcohol Acido (solucion C) 2 sumergidas rapidas h. etanol de 95% sumergir dos veces, 5 minutos cada vez. i. etanol 100% por 3 minutos. l. Xileno 5 minutos. m. Monte con un cubreobjetos con DPX no permita que el xileno se seque en el portaobjetos. Se tien de rojo los nucleos, las barras cromaticas, la cromatina, los eritrocitos y las bacterias, el citoplasma se tine de azul-verde. El fondo y las levaduras se tinen ded verde. 4. Fierro-Hematoxilina Esta tincin es til para demostrar la cromatina nuclear y las inclusiones citoplsmicas de quistes de protozoarios. Reactivo 1: Fijador de Schaudinn Reactivo 2 : Yodo 2g, mas etanol 95% 100mL Disolver el yodo en el etanol y se almacena en una botella ambar, y se conserva varios meses. Reactivo 3: solucion concentrada de alumina de fierro: Mordente alumina Sulfato ferrico de Amonio 4g Agua destilada 100mL Para usar anada 1 parte de la solucin concentrada a 10 partes de etanol 50%. Esta solucion solo permanence estable varias semanas. Reactivo 4: hematoxilina de Heidenhain Haematoxilina 1g Etanol de 70% 100g Este reactivo mejora despus de un perodo de maduracin exponiendo el

colorante a la luz directa del sol por 4 6 semanas o aadiendo 10 mL de peroxido de hidrogeno. Reactivo 5 Solucion acuosa de cido pcrico o mordente almina de fierro para decolorar. Metodo Coloque frotes fecales recin preparados en un vaso de coplin con fijador de Schaudinn. a. Fijador de Schaudinn 20 minutos b. etanol 10 minutos c. Yodo al 95% en etanol 10 minutos d. etanol 10 minutos e. mordente Alumina de fierro 50% en etanol 1224 horas f. etanol 10 minutos g. Lave en agua de la llave 15 minutos h. Tina en etanol-hematoxilina 12-24 hours i. Lave con agua de la llave 15 minutos j. Diferenciar en mordente alumina de fierrro o en solucion de acido picrico (es un decolorante mas rapido ). Este proceso se controla bajo el microscopio, hasta que la cromatina se vea clara y bien definida. k. Lavar con agua de la llave 5 minutos l. Lavar en etanol de 70% con 3 cambios de etanol 1 hora m. etanol 5 minutos n. Alcohol absoluto 5 minutos o. Xileno 5 minutos p. Montar en permount La cromatina nuclear y el cariosoma son negros. El resto se observa con variaciones de gris/negro. RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES. Describa sus observaciones y resultados. Dibuje los organismos observados en su cuaderno de prcticas Bibliografa Taghi-Kilani,R. and L. Sekla. 1987. Purification of Cryptosporidium oocysts and sporozoites by Cesium Chloride and Percoll discontinuos density gradient. J. Tropical Med. Hyg., 36: 505. DPDx - CDC. Laboratory Identification of Parasites of Public Health concern. Diagnostic procedures for stool specimens. 2006. http://www.btinternet.com/~ukneqas.parasitologyscheme/index.html