Resumen: E-057

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E Comunicaciones Cientficas y Tecnolgicas 2006

Actividad Antimicrobiana de un grupo de Terpenoides.

Maguna, Fabiana P. - Romero, Ana M. - Garro, Oscar A. - Okulik, Nora B. Facultad de Agroindustrias, UNNE. Cdte. Fernndez N 355, CP 3700, Senz Pea, Argentina. fmaguna@fai.unne.edu.ar Antecedentes El uso de las plantas con fines teraputicos en la medicina tradicional es un importante legado que han dejado generaciones anteriores y una parte de la cultura de los pueblos. Existen innumerables sustancias qumicas vegetales que pueden considerarse frmacos y son empleados en uno o ms pases, de las cuales el 74 % fue descubierto a partir de su empleo en medicina tradicional. 1 Esto nos brinda la oportunidad de encontrar nuevos agentes activos desde el punto de vista farmacolgico, a partir de una fuente de materia prima ms econmica y natural: las Plantas medicinales. 1 Actualmente es enorme la difusin y popularidad de las terapias vegetales en el mundo. Se aconsejan ya no como alternativas en los servicios de salud, sino como primera intencin para diversas afecciones, antes de pasar a otros medicamentos ms agresivos. 2 En este contexto podemos referirnos a numerosos estudios sobre los aceites esenciales, en los cuales se destaca su gran utilidad en diversas reas tales como la fabricacin de los perfumes, productos cosmticos, saborizantes, en la industria farmacutica, etc. Varios estudios reportan sobre las diferentes actividades biolgicas que presentan los aceites esenciales, tales como insecticidas, 3 antioxidante, 4,5 y efecto antibacteriano.6 Si profundizamos un poco podemos mencionar trabajos sobre el aceite esencial de Menta (Mentha piperita), Organo (Origanum sp.), Salvia (Salvia fructicosa) 7, 8, 9 donde los autores enumeran propiedades tales como carminativo, antinflamatorio, antiespasmdico, antiemtico, analgsico, emenagogo, estimulante, anticatarral, etc. Pero cabe destacar que estos trabajos fueron llevados a cabo utilizando los aceites esenciales y diversos extractos de ellos, es decir, que la actividad biolgica no se puede atribuir a un compuesto en particular. Esta actividad biolgica de la que hablamos puede variar desde la inhibicin completa o parcial del crecimiento microbiano hasta la accin bactericida o fungicida. Sin embargo segn estudios realizados 10, 11, 12 se ha encontrado que la actividad antimicrobiana presentada por los aceites esenciales es debida, en gran medida a la presencia de un tipo de compuestos denominados terpenoides. Por otro lado varios estudios han demostrado que los terpenoides son los principales contribuyentes de la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales, siguiendo en orden de actividad los terpenoides que contienen grupos alcoholes, luego los que poseen aldehdos y por ultimo los que tienen grupos cetnicos. Por ejemplo, podemos mencionar que el aceite esencial de Lemon grass posee cantidades considerables de -citral, -citral, citronelol, citronelal, linalool y geraniol los cuales han mostrado poseer actividad antimicrobiana ante Escherichia coli, Bacillis subtilis y Staphylococcus aureus. Otro ejemplo lo presenta el aceite esencial del Melaleuca alternifolia (Tea tree) el cual est compuesto, entre otras cosas, por -terpineol, linalool y terpinen-4-ol y demuestran tener efectiva actividad antimicrobiana. 13 Sin embargo el mecanismo de accin especfico de estos compuestos an hoy no ha sido claramente caracterizado. Aunque actualmente se propone como posible sitio de accin la membrana celular donde los terpenoides surtiran efecto desencadenando una serie de procesos que podran arribar a la muerte bacteriana. 13, 14 Es de mencionar tambin que en la actualidad la resistencia de los microorganismos a los frmacos existentes tiende a incrementarse, razn por la cual se mantiene el mpetu en la bsqueda de nuevos agentes antimicrobianos para combatir las infecciones y superar los problemas de resistencia bacteriana y los efectos secundarios de algunos agentes disponibles actualmente. 8, 15 En tal sentido, lograr que la poblacin disponga de fitofrmacos rigurosamente estudiados, es un propsito de muchos investigadores, por ello, en este trabajo se decidi probar la actividad antimicrobiana in vitro de un grupo de terpenoides frente a microorganismos gram-positivos y gram-negativos que son causantes de diversas patologas en el hombre. Esto podra llevarnos al desarrollo, a partir de plantas aromticas, de diferentes formas farmacuticas con actividad farmacolgica definida y colaborar con la gran demanda social de nuevos agentes antibacterianos. Las bacterias utilizadas fueron Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli. Para llevar a cabo esta tarea se us el mtodo de difusin radial en agar utilizando discos embebidos con el potencial antibacteriano dado que ste es un mtodo usado en forma rutinaria para bacterias de rpido crecimiento. Materiales y Mtodos El grupo de 17 terpenoides usados para los ensayos se presentan en la Tabla 1. Los microorganismos usados para la evaluacin biolgica fueron aislamientos clnicos provistos por la Facultad de Bioqumica, Qumica y Farmacia de Tucumn. Estos aislamientos fueron conservados en viales con medio agarizado en heladera de 3-5C aproximadamente y fueron mensualmente subcultivados en caldo de triptosa soya.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E Comunicaciones Cientficas y Tecnolgicas 2006 En el trabajo se us una batera de 3 microorganismos: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli. Para la activacin de las bacterias almacenadas se prepararon suspensiones a partir de cada uno de ellas y se incubaron a 37C hasta alcanzar la fase logartmica de crecimiento (aproximadamente 2 hs para Escherichia coli, 4 hs para Staphylococcus aureus y 8 hs para Pseudomonas aeruginosa). Para evaluar la sensibilidad de estos microorganismos a los terpenoides se emple el mtodo de difusin radial en medio agarizado (BHI agarizado) segn recomendaciones del National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) utilizando para ello discos embebidos con 2l del compuesto. Esta tcnica estandarizada por la NCCLS est basada en el conocido mtodo de Kirby-Bauer. Este mtodo de difusin se basa en que el compuesto a estudiar difundir por el medio agarizado produciendo un gradiente de concentracin, entonces si el compuesto es efectivo contra el microorganismo probado se formar una zona de inhibicin alrededor del disco embebido en el compuesto. El tamao de la zona de inhibicin proporciona indicios de la relativa actividad de la sustancia, en nuestro caso del terpenoide. Para la preparacin del inculo se tom una ansada de la bacteria en estudio (previamente activada) y se suspendi en una porcin de caldo Triptosa Soya, hasta lograr una turbidez comparable al patrn de turbidez 0,5 Mc Farland, esta comparacin se llev a cabo visualmente utilizando un fondo blanco con lneas negras contrastantes y fuente de luz adecuada. De este inculo se tom una alcuota de 100l lo que corresponde a 1x108 unidades formadoras de colonias/ ml (ufc/ml) y se colocaron en las placas estriles con BHI agarizado. Estas placas se prepararon con 15 ml cada una del medio agarizado. Para la distribucin uniforme del inculo en las placas se utiliz la tcnica de escobillado, para lo cual se aplic sobre la superficie de la placa el inculo y luego con un asa de Digralski se efectu un barrido en por lo menos tres direcciones, girando la placa a 90 grados. A continuacin se aplicaron en cada placa, con la ayuda de una pinza estril y ejerciendo una ligera presin sobre la superficie del medio, 3 discos de papel de 5,5 mm de dimetro embebidos con 2l de terpenoide cada uno. Despus de 10 minutos pero antes de 15 minutos de aplicados los discos, se comenz la incubacin a 35-37C, durante 12 horas, al cabo de las cuales se leyeron los resultados. Para la interpretacin de los resultados se consideraron 3 categoras: inhibicin del crecimiento, a todo halo translcido detectado alrededor del disco, es decir que la bacteria es sensible al compuesto. no inhibicin del crecimiento, es decir que no se forma halo y la bacteria no es sensible. Se presenta en la tabla como (NI) inhibicin del crecimiento en forma irregular, es decir que se observa una inhibicin pero el halo no adopta la forma esperada. Se presenta en la tabla como (II) Las soluciones de terpenoides utilizadas para embeber los discos poseen un grado de pureza del 99%. Discusin de Resultados En los resultados obtenidos del ensayo de sensibilidad bacteriana se observa que 14 de los terpenoides estudiados poseen actividad antimicrobiana contra alguna de las bacterias ensayadas y solo 3 de ellos ( -terpineno, para-cimeno y mirceno) manifiestan no tener actividad alguna sobre las bacterias estudiadas. Estos resultados pueden traducirse en que el 82% de los compuestos probados constituyen una potencial fuente de agentes antimicrobianos, destacndose que los terpenoides presentan mayor actividad sobre la bacteria Escherichia coli. Otra observacin que se puede hacer de las placas es que algunos terpenoides producen zonas de inhibicin, pero que estas zonas no tenan una forma circular ni bordes definidos, pero si provocaban un rea de inhibicin relativamente grande; por lo tanto consideramos a estos casos como compuestos que producan inhibicin irregular y sern vueltos a analizar. Las medidas de la zona de inhibicin se presentan en la Tabla 1. En ella se observa que las bacterias gram-negativas son las que presentan mayor sensibilidad a los compuestos y adems las que muestran zonas de inhibicin ms grandes, en cambio la gram-positiva manifest clara sensibilidad solo a 5 compuestos con un tamao de zona de inhibicin intermedio. Esto se puede fundamentar por el hecho de que uno de los principales mecanismos de accin propuestos para los terpenoides consiste en la disrupcin de la membrana celular bacteriana mediante 3 posibles vas: aumentando la permeabilidad de la membrana a iones pequeos, afectando la estabilidad estructural de la membrana y desestabilizando el empaquetamiento de la bicapa lipdica, cualquiera de estos 3 efectos produce la muerte en la clula bacteriana. Entonces podramos considerar que el hecho de que las bacterias gram-negativas presenten mayor sensibilidad, entre otras cosas, puede deberse a su pared celular menos compleja dado que tiene una capa simple (red de murena delgada), mientras que en las gram-postiva es una estructura de multicapa (red de murena muy desarrollada y llega a tener hasta 40 capas). Un ejemplo lo presenta el aceite esencial de Melaleuca alternifolia (Tea tree) que se ha encontrado que causa la filtracin de iones K+ en la membrana de la Escherichia coli con lo cual estimula su autolisis. 16 Tambin cabe mencionar que pueden existir discrepancias entre los resultados presentado en este trabajo y otras investigaciones, por ejemplo con respecto a la actividad del mirceno; que es reportada por Shane Griffin 13 como positiva y en este trabajo no produjo zona de inhibicin con ninguna de las bacterias.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E Comunicaciones Cientficas y Tecnolgicas 2006 Estas discrepancias pueden encontrar su razn en la variedad de mtodos usados para evaluar la actividad antimicrobiana. Por otro lado tambin se conoce que el medio de cultivo es un factor importante en el ensayo de actividad, dado que sus constituyentes pueden reaccionar con los aceites esenciales, activndolos o inactivndolos.

Tabla 1: Terpenoides ensayados y Zonas de Inhibicin (mm) Bacterias Gram NEGATIVA Terpenoide Escherichia coli Cineole -terpineol Eugenol Isopulegol Carvacrol -terpineno -pineno Carvona -pineno Citronelal Citronelol Dipenteno Citral Linalool p-cimeno acetate de citronelilo Mirceno II 16 15 12 27 NI NI II NI 11 8 NI 9 14 NI 6 NI Pseudomonas aeruginosa NI 28 NI 12 NI NI NI 12 NI 11 10 14 NI 16 NI 7 NI Bacteria Gram POSITIVA Staphylococcus aureus 13 12 11 9 20 NI II NI II II II NI II II NI II NI

El dimetro de la zona de inhibicin est expresado en mm. II: inhibicin irregular NI: no produjo inhibicin Asimismo existen varios factores que influyen sobre los resultados tales como: el volumen y tipo de medio de cultivo, la concentracin y edad del inculo, las condiciones de incubacin, etc. Adems es muy importante destacar que existen propiedades fsicas de los terpenoides que afectan negativamente la realizacin de los ensayos tal como lo es la baja solubilidad de stos en los medios de cultivo, lo cual nos lleva a considerar si el gradiente de concentracin que se produce alrededor del disco es uniforme, entre otras cosas. Conclusiones Las bacterias Gram-negativas, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa, fueron ms sensibles a los terpenoides en comparacin con la gram-positiva, Staphylococcus aureus. Esto puede tener su causa en la diferencia que presentan estas bacterias en cuanto a su pared celular, lo cual determinar la penetracin o no del terpenoide a la clula bacteriana para que produzca su accin. De esta manera se sigue sumando evidencia sosteniendo que los terpenoides, como componentes mayoritarios de los aceites esenciales, son una buena fuente natural y disponible que posibilitar desarrollar diferentes formas farmacuticas con actividad farmacolgica definida. Por otro lado, estos resultados nos pueden servir para comenzar a entender las razones del extenso uso de los aceites esenciales ya sean en la medicina tradicional o en la aromaterapia. Al mismo tiempo podemos acercarnos cada vez ms a la utilizacin de las plantas aromticas, que contienen aceites esenciales, y esto a su vez a los terpenoides, como terapia complementaria de las convencionales. Por otro lado es importante mencionar que la continuidad inmediata de este trabajo nos lleva a la determinacin experimental de la concentracin mnima inhibitoria (CMI) y concentracin mnima bactericida (CMB) de los compuestos. En este aspecto es importante mencionar el inconveniente que se presenta con la escasa solubilidad acuosa

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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E Comunicaciones Cientficas y Tecnolgicas 2006 de los terpenoides, dado que se convierte es un gran desafo a la hora de realizar la determinacin de concentracin mnima inhibitoria (CMI) y concentracin mnima bactericida (CMB), pero actualmente nos encontramos trabajando en los ajustes de una tcnica que nos permite lograr una emulsin entre el medio de cultivo y el terpenoide mediante el uso de un emulgente.

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