Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica

Editores Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C.

UNIVERSIDAD

EDITORIAL

DE TALCA
MCMXCI
UNIVERSIDAD DE

TALCA

EDITORIAL UNIVERSIDAD DE TALCA COLECCIN E-BOOK Serie de libros electrnicos

Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica

Editores Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. EDITORIAL UNIVERSIDAD DE TALCA Vicerrectora Acadmica COLECCIN E-BOOK Serie de libros electrnicos

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EDITORIAL
DE TALCA
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MCMXCI

TALCA

Registro de propiedad intelectual N 128.873 ISBN: 978-956-7059-86-7 EDITORIAL UNIVERSIDAD DE TALCA Talca- Chile, julio de 2009 Edicin soporte papel ao 2002
Diseo Editorial: Marcela Albornoz Dachelet Correccin de textos: Mara Cecilia Tapia Castro

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Registro de propiedad intelectual N 128.873 ISBN: 956-7059-51-9

EDITORIAL UNIVERSIDAD DE TALCA Talca - CHILE, 2002

Ilustraciones BQ. Marcos Prez Cid Diseo grfico Marcela Albornoz Dachelet Revisin de textos Mara Cecilia Tapia Castro

La ilustracin de la portada muestra la interaccin entre una Clula Presentadora de Antgeno y un Linfocito T. Se representan algunas de las molculas que participan: Receptor de clulas T (TCR), molcula del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC), Pptido Antignico y Molculas de Adhesin Celular.

Diagramacin e impresin Gutenberg-Talca Impreso en Chile

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica

Editores

Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C.

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EDITORIAL

DE TALCA
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UNIVERSIDAD DE TALCA

FUNDAMENTOS DE INMUNOLOGA BSICA Y CLNICA

Editores Prof. Dr. Ivn Palomo Gonzlez Unidad de Inmunologa y Hematologa Departamento de Bioqumica Clnica e Inmunohematologa Facultad de Ciencias de la Salud Universidad de Talca Prof. Dr. Arturo Ferreira Vigouroux Programa Disciplinario de Inmunologa Instituto de Ciencias Biomdicas Facultad de Medicina Universidad de Chile Prof. Dra. Cecilia Seplveda Carvajal Unidad de Inmunologa Departamento de Medicina Facultad de Medicina Universidad de Chile Prof. Dr. Mario Rosemblatt Silber Fundacin Ciencias para la Vida Departamento de Biologa Facultad de Ciencias Universidad de Chile Prof. Dr. Ulises Vergara Castillo Escuela de Postgrado, Facultad de Medicina y Departamento de Medicina Preventiva, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad de Chile.

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AUTORES DE CAPTULOS
Dra. Ana Mara Agar Muoz Unidad de Inmunologa Clnica Alemana Prof. Dra. Edilia Andrews Garca Departamento de Microbiologa Facultad de Ciencias Biolgicas Universidad de Concepcin Prof. Dra. Adriana Ardiles Sandoval Policlnico de Medicina Integral Servicio de Medicina Hospital San Juan de Dios Dra. Luz P. Blanco Palma Laboratorio de Inmunobioqumica Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacuticas Universidad de Chile Prof. Dra. Eva Burger Departamento de Inmunologa Instituto de Ciencias Biomdicas Universidad de San Pablo, Brasil Prof. Dr. Antonio Cabral Departamento de Reumatologa Instituto Nacional de Nutricin Salvador Subiran, Mxico Prof. Dr. Flavio Carrin Arriagada Unidad de Inmunologa Facultad de Medicina Universidad de Los Andes Dr. Darwins Castillo Alvarez Seccin Inmunodiagnstico Unidad de Inmunologa Instituto de Salud Pblica Prof. Dr. Edgardo Carrasco Caldern Departamento de Medicina Oriente Facultad de Medicina Universidad de Chile Instituto Nacional del Trax Prof. Dra. Mnica Cornejo De Luigi Unidad de Inmunologa Facultad de Medicina Universidad de Valparaso

BQ. Alejandra Arenas Celf Seccin Histocompatibilidad Unidad de Inmunologa Instituto de Salud Pblica Dr. Miguel Barra Maldonado Instituto de Inmunologa Facultad de Medicina Universidad Austral de Chile Prof. Dra. Mara Ins Becker Contreras Unidad de Inmunologa Facultad de Ciencias Biolgicas P. Universidad Catlica de Chile

Prof. Dr. Rosario Billetta Daquila Programa disciplinario de Inmunologa Instituto de Ciencias Biomdicas Facultad de Medicina Universidad de Chile Prof. Dra. Mara Rosa Bono Merino Departamento de Biologa Facultad de Ciencias Universidad de Chile

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Prof. Dr. Alfredo De Ioannes Ilis Unidad de Inmunologa Facultad de Ciencias Biolgicas P. Universidad Catlica de Chile Prof. Dra. Patricia Daz Amor Departamento de Medicina Experimental Facultad de Medicina Universidad de Chile Dra. Susana Elgueta Miranda Seccin Histocompatibilidad Unidad de Inmunologa Instituto de Salud Pblica Prof. Dr. Patricio Esquivel Snchez Instituto de Inmunologa Facultad de Medicina Universidad Austral de Chile Prof. Dr. Heriberto Fernndez Jaramillo Instituto de Microbiologa Clnica Facultad de Medicina Universidad Austral de Chile Prof. Dr. Jorge A. Fernndez Vargas Unidad de Virologa Facultad de Medicina Universidad de Chile Prof. Dr. Arturo Ferreira Vigouroux Programa disciplinario de Inmunologa Instituto de Ciencias Biomdicas Facultad de Medicina Universidad de Chile Prof. Dr. Hugo Folch Vilches Instituto de Inmunologa Facultad de Medicina Universidad Austral de Chile

Prof. Dr. Ricardo Forastiero Valcarcel Unidad de Hematologa Universidad Favarolo Buenos Aires, Argentina Prof. Dr. Enrique Gonzlez Villanueva Laboratorio de Biologa Molecular Instituto de Biologa y Biotecnologa Universidad de Talca Prof. Dr. Jorge Gonzlez Corts Unidad de Parasitologa Departamento de Tecnologa Mdica Facultad de Ciencias de la Salud Universidad de Antofagasta Dra. Mara Antonieta Guzmn Melndez Unidad de Inmunologa Servicio de Medicina Hospital Clnico Universidad de Chile Prof. Dr. Gustavo Hoecker Salas Unidad de Inmunogentica Instituto de Ciencias Biomdicas Facultad de Medicina Universidad de Chile Prof. Dra. Mnica Imarai Bahamonde Departamento de Biologa Facultad de Qumica y Biologa Universidad de Santiago de Chile Prof. Dr. Sergio Jacobelli Gabrielli Departamento de Reumatologa e Inmunologa Clnica Facultad de Medicina P. Universidad Catlica de Chile Prof. Dra. Cecilia Koenig Samohod Departamento Biologa Celular y Molecular Facultad de Ciencias Biolgicas P. Universidad Catlica de Chile

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Dra. Mara Anglica Marinovich Unidad de Reumatologa Departamento de Medicina Interna Universidad de Chile Hospital Clnico San Borja-Arriarn Prof. Dr. Benjamn Martnez Rondanelli Departamento de Patologa Oral Facultad de Odontologa Universidad Mayor Dr. Rodrigo Mora Sanhueza Programa Doctorado en Ciencias Biomdicas Facultad de Medicina Universidad de Chile Prof. Dra. Cristina Navarrete Departamento de Histocompatibilidad e Inmunogentica The London Blood Transfusion Center Londres, Inglaterra Dr. Rodrigo Naves Pichuante Instituto Milenio de Biologa Fundamental y Aplicada Dra. Ximena Norambuena Rodrguez Unidad de Inmunologa Servicio de Pediatra Hospital Exequiel Gonzlez Corts Prof. Dr. Jos M. Ojeda Fernndez Unidad de Virologa Facultad de Medicina Universidad de Chile Prof. Dr. Mauricio Oqueteaux Tacchini Departamento de Hematologa y Oncologa Facultad de Medicina P. Universidad Catlica de Chile

Prof. Dr. Ivn Palomo Gonzlez Unidad de Inmunologa y Hematologa Departamento de Bioqumica Clnica e Inmunohematologa Facultad de Ciencias de la Salud Universidad de Talca Prof. Dr. Jaime Pereira Garcs Departamento de Hematologa y Oncologa Facultad de Medicina P. Universidad Catlica de Chile Prof. Dra. Silvia Pierangeli Departamento de Microbiologa e Inmunologa Morehouse School of Medicine Atlanta, Georgia, USA. Prof. Dr. Javier Puente Piccardo Laboratorio de Inmunobioqumica Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacuticas Universidad de Chile Prof. Dr. Arnoldo Quezada Lagos Departamento de Pediatra Facultad de Medicina Universidad de Chile Dr. Santiago Rivero Daz Departamento de Reumatologa e Inmunologa Clnica Facultad de Medicina P. Universidad Catlica de Chile Prof. Dr. Cristin Rodrguez Guiraldes Unidad de Inmunologa Facultad de Medicina Universidad de Los Andes

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Prof. Dr. Mario Rosemblatt Silber Fundacin Ciencias para la Vida Departamento de Biologa Facultad de Ciencias Universidad de Chile Prof. Dr. Flavio Salazar-Onfray Programa disciplinario de Inmunologa Instituto de Ciencias Biomdicas Facultad de Medicina Universidad de Chile Prof. Dra. Cecilia Seplveda Carvajal Unidad de Inmunologa Departamento de Medicina Facultad de Medicina Universidad de Chile Prof. Dra. Mireya Silva Batista Laboratorio Clnico Inmunolab Tc. Qum.Valeska Simon Zegers Departamento de Biologa Facultad de Ciencias Universidad de Chile Prof. Dr. Julio Sharfstein Instituto de Biofsica Carlos Chagos Filho. UFRJ Laboratory of Molecular Immunology CCS Ro de Janeiro, Brasil BQ. Carolina Valenzuela Barros Seccin Inmunodiagnstico Unidad de Inmunologa Instituto de Salud Pblica Prof. Dr. Claudio Vsquez Guzmn Departamento de Ciencias Biolgicas Facultad de Qumica y Biologa Universidad de Santiago de Chile

Prof. MgCs. Marcela Vsquez Rojas Unidad de Inmunologa y Hematologa Departamento de Bioqumica Clnica e Inmunohematologa Facultad de Ciencias de la Salud Universidad de Talca Dra. Pilar Vega Covarrubias Seccin Inmunidad Celular Laboratorio CIDI Prof. Dr. Ulises Vergara Castillo Laboratorio de Inmunologa Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias Universidad de Chile Prof. Dra. Juana Villegas Moraga Departamento de Medicina Interna Facultad de Medicina Universidad de la Frontera Prof. Dr. Luis Zaror Cornejo Instituto de Microbiologa Clnica Facultad de Medicina Universidad Austral de Chile Prof. Dra. Marta Zelazko de Cheistwer Servicio de Inmunologa Hospital Nacional de Pediatra Juan P. Garrahan Buenos Aires, Argentina Dr. Claudio Ziga Marti Laboratorio de Inmunologa Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias Universidad de Chile

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PATROCINIO
International Union of Immunology Societies (IUIS) Asociacin Latinoamericana de Inmunologa (ALAI) Sociedad Chilena de Inmunologa (SOCHIN) Sociedad Chilena de Alergia e Inmunologa Network for Research and Training in Parasitic Diseases at the Southern Cone of Latin America, SIDA, Suecia Universidad de Talca Universidad de Chile Facultad de Medicina Facultad de Ciencias Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacuticas Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias P. Universidad Catlica de Chile Facultad de Ciencias Biolgicas Universidad Austral de Chile Facultad de Medicina Universidad de Valparaso Facultad de Medicina Universidad de Santiago de Chile Facultad de Qumica y Biologa Universidad de la Frontera Facultad de Medicina Universidad de Antofagasta Facultad de Ciencias Mdicas Universidad de Los Andes Facultad de Medicina Universidad Mayor Facultad de Odontologa Universidad Favaloro (Argentina) Instituto de Salud Pblica de Chile

AUSPICIO
International Union of Immunology Societies (IUIS) Biomrieux S.A. Equilab Laboratorio Clnico Talca Ltda.

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A nuestras queridas familias y a nuestros estimados alumnos

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CONTENIDOS

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PREFACIO PRLOGO

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SECCIN I: GENERALIDADES SOBRE INMUNIDAD

Captulo 1 INTRODUCCIN A LA INMUNOLOGA: LAS BASES BIOLGICAS DE LA INDIVIDUALIDAD Prof. Dr. Gustavo Hoecker S. Captulo 2 HISTORIA DE LA INMUNOLOGA Prof. Dr. Ivn Palomo G. y Prof. Dr. Arturo Ferreira V. 1. Introduccin 2. Dos siglos de inmunologa 2.1. Inmunidad 2.2. Serologa 2.3. Inmunoqumica 2.4. Inmunobiologa 3. Premios Nobel Captulo 3 CLULAS Y RGANOS DEL SISTEMA INMUNE Prof. Dr. Ivn Palomo G., Prof. Dr. Jaime Pereira G. y Prof. Dra. Cecilia Koenig S. 1. Introduccin 2. Clulas del sistema inmune 2.1. Hematopoyesis 2.2. Linfocitos 2.3. Sistema fagoctico mononuclear 2.3.1. Monocitos 2.3.2. Macrfagos 2.3.3. Clulas dendrticas 2.4. Granulocitos 2.4.1. Neutrfilos 2.4.2. Eosinfilos 2.4.3. Basfilos 3. rganos linfoides 3.1 rganos linfoides primarios 3.1.1. Mdula sea 3.1.2. Timo 3.2. rganos linfoides secundarios 3.2.1. Ganglios linfticos 3.2.2. Bazo 3.2.3. Tejido linfoide asociado a mucosa 3.2.4 Amgdalas

37 39

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4.

Trnsito linfocitario

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Captulo 4 INMUNIDAD INNATA Prof. Dr. Ivn Palomo G., Prof. Dra. Adriana Ardiles S. y Prof. Dr. Ulises Vergara C. 1. Introduccin 2. Componentes de la inmunidad innata o natural 3. Fase de reconocimiento en la respuesta inmune innata 4. Fase efectora en la respuesta inmune innata 5. Proyeccin clnica 6. Filogenia de la respuesta inmune innata

89 90 93 94 98 99

SECCIN II: ESPECIFICIDAD DE LA RESPUESTA INMUNE

Captulo 5 ANTGENOS Prof. Dra. Mara Ins Becker C. y Prof. Dr. Alfredo De Ioannes I. 1. Introduccin 2. Conceptos generales 2.1. Antgeno 2.2. Inmunogenicidad y antigenicidad 2.3. Determinante antignico 2.4. Haptenos 3. Caractersticas del antgeno que lo hacen inmunognico 3.1 Tamao 3.2. Presencia de grupos qumicos activos 3.3. Conformacin espacial de los eptopos 3.4. Movilidad atmica 4. Naturaleza qumica de los antgenos 4.1. Protenas 4.2. Carbohidratos 4.3. Lpidos 4.4. cidos nucleicos 5. Clasificacin de los antgenos segn las clulas inmunes involucradas en su reconocimiento 5.1. Antgenos timo-dependientes 5.2. Antgenos timo-independientes 6. Clasificacin general de los antgenos segn su funcin 6.1. Antgenos de trasplante 6.2. Antgenos tumorales 6.3. Autoantgenos 6.4. Antgenos de diferenciacin 6.5. Superantgenos 6.6. Alergenos

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103 105 105 105 106 106 108 108 109 109 110 110 110 110 111 112 113 113 113 113 113 113 113 113 114 114 114

Captulo 6 117 RECEPTOR DE LINFOCITOS B E INMUNOGLOBULINAS Prof. Dr. Ivn Palomo G., Prof. Dra. Mara Ins Becker C., Prof. Dra. Silvia Pierangeli y Prof. Dr. Ulises Vergara C. 1. Introduccin 119 2. Receptor de linfocitos B (BCR): Estructura y funcin 120 2.1. Inmunoglobulina de membrana 121 2.2. Complejo accesorio Ig/Ig 124

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3. 3.1. 3.2. 4. 5. 5.1. 5.2. 5.3. 5.3.1. 5.3.2. 5.3.3. 5.4. 6. 6.1. 6.2. 7. 7.1. 7.1.1. 7.1.2. 7.2. 7.2.1. 7.2.2. 7.2.3. 7.2.4. 7.2.5. 7.2.6. 7.2.7. 7.3. 7.4. 7.5. 8. 9.

Linfocitos B y seales accesorias de coestimulacin Antgenos T-dependientes y antgenos T-independientes Co-Receptor CD21 (CR2) Subpoblaciones linfocitarias B1 y B2 Estructura y funcin de inmunoglobulinas Estructura general Dominios de inmunoglobulinas y regiones hipervariables Variaciones isotpicas, alotpicas e idiotpicas Variaciones isotpicas Variaciones alotpicas Variaciones idiotpicas Clases y subclases de inmunoglobulinas Respuesta inmune humoral Avidez Afinidad Bases genticas de la diversidad de inmunoglobulinas Genes de inmunoglobulinas Genes de cadenas pesadas Genes de cadenas livianas Reordenamiento gnico Reordenamiento de cadenas pesadas Reordenamiento de cadenas livianas Reordenamiento impreciso del DNA Diversificacin de la regin N Exclusin allica Exclusin isotpica Cambio de clase de cadenas pesadas Hipermutacin somtica Control de la transcripcin de los genes de inmunoglobulinas Estimacin numrica de la diversidad de anticuerpos Edicin del receptor linfocitario Biosntesis y ensamblaje de las inmunoglobulinas

125 125 125 126 126 127 128 129 130 130 130 130 135 136 136 136 137 138 138 139 140 140 141 141 142 142 142 143 144 144 145 146 149

Captulo 7 RECEPTOR DE LINFOCITOS T Y SEALES ACCESORIAS DE COESTIMULACIN Prof. Dr. Ulises Vergara C. y Prof. Dr. Ivn Palomo G. 1. Introduccin 2. Estructura del receptor T 2.1. TCR 2.2. TCR 3. Estructura y funcin del complejo CD3 4. Receptor T y reconocimiento antignico 4.1 Linfocitos TCD4 , linfocitos TCD8 y restriccin MHC 4.2. Clulas TNK 5. Gentica molecular del receptor T 5.1. Genes de cadenas TCR, TCR, TCR y TCR 5.1.1. Genes de cadenas TCR 5.1.2. Genes de cadenas TCR 5.1.3. Genes de cadenas TCR 5.1.4. Genes de cadenas TCR 5.2. Reordenamiento gnico 6. Linfocitos T y seales accesorias de coestimulacin 7. Homeostasis y desarrollo post-tmico de linfocitos T

151 152 152 153 154 154 156 157 159 159 159 159 160 161 161 163 165

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Captulo 8 167 COMPLEJO PRINCIPAL DE HISTOCOMPATIBILIDAD Prof. Dr. Ulises Vergara C., Prof. Dr. Ivn Palomo G., Dr. Claudio Ziga M. y Prof. Dra. Cristina Navarrete 1. Introduccin 169 2. Genes y molculas del Complejo Principal de Histocompatibilidad 170 2.1. Genes del MHC 171 2.1.1. Genes de clase I 171 2.1.2. Genes de clase II 172 2.1.3. Genes de clase III 173 2.1.4. Otros genes del MHC 173 2.2. Estructura y funcin de las molculas MHC 174 2.2.1. Estructura y funcin de las Molculas MHC de clase I 174 2.2.2. Estructura y funcin de las Molculas MHC de clase II 174 3. El concepto de restriccin MHC 175 4. Otras molculas de presentacin 176 4.1. Molculas CD1 176 5. Herencia de los genes HLA 176 6. Complejo Principal de Histocompatibilidad y enfermedad 176 7. Nomenclatura y tipificacin HLA 178 Captulo 9 PROCESAMIENTO, PRESENTACIN Y RECONOCIMIENTO ANTIGNICO Prof. Dr. Ulises Vergara C., Dr. Claudio Ziga M., Prof. Dr. Ivn Palomo G., y Prof. Dra. Cristina Navarrete 1. Introduccin 2. Linfocitos T y reconocimiento antignico 2.1. Subpoblaciones linfocitarias T y reconocimiento peptdico 2.2. Linfocitos T 2.3. Clulas NK 2.4. Clulas presentadoras de antgenos 3. Trfico celular y procesamiento antignico 4. Antgenos endgenos y exgenos 5. Fragmentos peptdicos y molculas MHC 6. Procesamiento y presentacin de antgenos endgenos 7. Procesamiento y presentacin de antgenos exgenos 8. Presentacin alternativa de pptidos Captulo 10 ACTIVACIN DE LOS LINFOCITOS Prof. Dr. Javier Puente P. 1. Introduccin 2. Activacin de los linfocitos T 2.1. Relacin estructura-funcin del complejo TCR 2.2. Secuencias de activacin en el TCR-CD3 y cadenas 2.3. Protenas tirosina quinasas en la activacin de los LT 2.4. Protenas adaptadoras en la activacin de los linfocitos 2.5. Modelo general de activacin de los LT 2.6. Las dos seales necesarias para la activacin de los LT 3. Activacin de los linfocitos B 3.1. Secuencias de activacin en el BCR y sub-unidades asociadas 3.2. Modelo general de activacin de los LB 4. Activacin de las clulas NK 179

181 181 182 182 182 183 184 184 184 185 187 189 191

194 195 195 196 196 198 198 201 202 202 202 205

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4.1.

Modelo de activacin de las clulas NK

205 209

Captulo 11 CITOQUINAS Dr. Rodrigo Naves P. y Prof. Dra. Mara Rosa Bono M. 1. Introduccin 2. Propiedades generales de las citoquinas 3. Receptores de las citoquinas y mecanismos de transduccin de seales 3.1. Receptores de citoquinas 3.2. Transduccin de seales 4. Principales actividades biolgicas de las citoquinas 4.1. Inmunidad innata 4.1.1. Inmunidad antiviral 4.1.2. Citoquinas e inflamacin 4.2. Citoquinas y respuesta inmune 4.2.1. Citoquinas y diferenciacin de clulas linfoides 4.2.2. Clulas Th1 y Th2 4.2.3. Activacin de linfocitos B 4.2.4. Respuesta inmune especfica mediada por clulas 4.3. Citoquinas y hematopoyesis 4.3.1. Factores estimuladores de colonias 4.3.2. Otras citoquinas estimuladoras de la hematopoyesis 4.3.3. Citoquinas supresoras 5. Quimioquinas 5.1. Quimioquinas en la diferenciacin linfocitaria 5.2. Quimioquinas en la recirculacin de los linfocitos a travs de los rganos linfoides secundarios 5.3. Quimioquinas en el homing de los linfocitos a sitios efectores perifricos 5.4. Quimioquinas y enfermedades 5.5. Quimioquinas y terapia Captulo 12 RECEPTORES DE ADHESIN, HOMING Y ACTIVACIN DE LINFOCITOS Dr. Jorge Rodrigo Mora S. y Prof. Dr. Mario Rosemblatt S. 1. Introduccin 2. Modelo general de adhesin leucocitaria 3. Receptores de adhesin y sus ligandos 3.1. Receptores de adhesin de la familia de las integrinas 3.2. Receptores de adhesin de la superfamilia de las inmunoglobulinas (SFIg) 3.3. Molculas de adhesin de la familia de las selectinas 4. Interacciones linfocito-endotelio 4.1. Trfico linfocitario a travs del endotelio inflamado 4.2. Trfico linfocitario a travs del endotelio columnar (HEV) 4.3. Trfico linfocitario hacia la piel 5. Regulacin del posicionamiento (homing) de linfocitos 6. Receptores de adhesin en la diferenciacin y activacin linfocitaria 6.1. Receptores de adhesin y diferenciacin temprana en la mdula sea 6.2. Receptores de adhesin y diferenciacin en el microambiente de los OLS Captulo 13 ONTOGENIA Y DIFERENCIACIN DE CLULAS B Y T Dr. Rodrigo Naves P. y Prof. Dr. Mario Rosemblatt S. 1. Introduccin

211 211 219 219 223 223 223 224 224 225 225 226 228 228 229 230 231 232 232 232 234 235 235 237 239

241 242 244 245 246 248 248 250 252 253 253 257 257 258 261

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2. 3. 3.1. 3.2. 4. 4.1. 4.2. 4.3.

Regulacin gnica de la diferenciacin linfocitaria Diferenciacin y maduracin de linfocitos B Etapa antgeno-independiente Etapa antgeno-dependiente Diferenciacin y maduracin de linfocitos T Migracin de los precursores de linfocitos T Diferenciacin Seleccin tmica

264 266 266 267 269 269 269 271 275

Captulo 14 REGULACIN DE LA RESPUESTA INMUNE Prof. Dr. Ulises Vergara C., Dr. Claudio Ziga M. y Prof. Dr. Ivn Palomo G. 1. Introduccin 2. Regulacin de la respuesta inespecfica 2.1. Regulacin del sistema del complemento 2.2. Regulacin de la accin de clulas NK 3. Regulacin de la respuesta inmune especfica 3.1. Mecanismos inmunolgicos y no inmunolgicos de regulacin 3.2. Delecin y anergia clonal. Tolerancia inmunolgica 3.3. Activacin de linfocitos T supresores 3.4. Regulacin mediante linfocitos Th1 y Th2 3.5. Regulacin idiotpica o red idiotipo-anti-idiotipo 3.6. Regulacin o feedback por anticuerpos y complejos inmunes 3.7. Regulacin por Prostaglandinas 3.7.1. Prostaglandina E2 (PGE2) 3.7.2. Prostaglandina 15-d PGJ2 Captulo 15 NEUROINMUNOLOGA Prof. Dr. Hugo Folch V., Dr. Miguel Barra M. y Prof. Dr. Patricio Esquivel S. 1. Introduccin 2. Interacciones entre el sistema nervioso central, sistema endocrino y sistema inmune 2.1. Inervacin de los rganos linfoides 2.2. Existencia de un eje Sistema nervioso central-hipfisis-sistema inmune 2.3. El SNC tiene conocimiento de la entrada de antgeno al organismo y responde a l 2.4. El sistema inmune produce hormonas 2.5. El sistema inmune tiene receptores para hormonas y neuropptidos 2.6. Otras seales derivadas del sistema inmune tienen efecto en el sistema neuroendocrino 3. Resultante de la interaccin del sistema nervioso, sistema endocrino y el sistema inmune: evidencias en el organismo vivo que demuestran su efecto en la respuesta inmune 3.1. Efecto del stress en la respuesta inmune 3.2. Depresin e inmunidad 3.3. Efecto de los factores sociales en la respuesta inmune 3.4. Las drogas psicoactivas alteran el funcionamiento del sistema linfoide 3.5. Las hormonas sexuales modulan la respuesta autoinmune 4. Algunos casos en que el sistema inmune origina cambios o trastornos en el sistema nervioso 4.1. Efecto de los anticuerpos a nivel del sistema nervioso 4.2. Efecto de complejos antgeno-anticuerpo en el sistema nervioso central 4.3. Rol patognico de linfocitos T, macrfagos y citoquinas en el tejido nervioso

277 277 277 277 278 279 280 281 282 283 284 286 286 286 289

291 292 293 293 294 294 295 295 297 297 297 297 298 298 298 298 298 298

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Captulo 16 INMUNIDAD DE MUCOSAS Prof. Dr. Ulises Vergara C. y Prof. Dr. Ivn Palomo G. 1. Introduccin 2. Sistema inmune de mucosas 2.1. Organizacin estructural 2.2. Transporte y presentacin de antgenos 3. Funciones efectoras de la inmunidad de mucosas 3.1. Respuesta inmune de anticuerpos 3.2. Respuesta inmune celular 4. Inmunizacin a travs de mucosas 4.1. Uso de adyuvantes 5. Tolerancia inducida a travs de mucosas Captulo 17 INMUNOLOGA DE LA REPRODUCCIN Prof. Dra. Mnica Imarai B. y Prof. Dra. Juana Villegas M. 1. Introduccin 2. El sistema inmune asociado a la mucosa reproductiva 2.1. El sistema inmune asociado a la mucosa reproductiva de la hembra 2.2. El sistema inmune asociado a la mucosa reproductiva del macho 3. Induccin de la respuesta inmune en la mucosa reproductiva 3.1. Induccin de la respuesta inmune en la mucosa reproductiva de la hembra 3.2. Respuesta inmune a las infecciones en la mucosa reproductiva de la mujer 4. El sistema inmune local en el embarazo 4.1. La Interfase materno fetal 4.2. Expresin de MHC en las clulas trofoblsticas 4.3. Las clulas NK de la decidua 4.4. Los linfocitos T de la decidua 4.5. Citoquinas en la preez 5. Factores inmunolgicos que afectan la fertilidad 5.1. Aborto espontneo recurrente de causa inexplicada 5.2. Anticuerpos antiespermticos

299

301 302 302 304 305 305 306 307 308 309 311

313 314 314 316 316 316 317 318 318 318 319 319 320 320 320 321

SECCIN III: MECANISMOS EFECTORES DE LA RESPUESTA INMUNE 325

Captulo 18 SISTEMA DEL COMPLEMENTO Prof. Dr. Arturo Ferreira V. y Prof. Dr. Julio Scharfstein 1. Introduccin 2. Generalidades sobre la activacin y regulacin del Sistema del Complemento 2.1. Generacin de enlaces covalentes por parte de C3b y C4b, al reaccionar con estructuras de las superficies atacadas por el sistema 2.2. Las C3 y C5 convertasas de las rutas clsica y alterna son funcionalmente homlogas 3. Ruta clsica: algunos detalles moleculares 3.1. Unin C1 3.2. Activacin de C4 y C2 3.3. Convertasa de C3 3.4. Convertasa de C5 3.5. Mecanismos que confinan la activacin del complemento a las membranas blanco (target) o culpables 3.6. Rutas de las lectinas 327

329 331 335 336 337 337 338 339 340 340 340

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4. 4.1. 4.2. 5. 5.1. 5.2. 5.3. 5.4. 6. 7.

Ruta alterna: algunos detalles moleculares Activacin de la ruta alterna Papel de la properdina Fase terminal: generacin del complejo destructor de membranas Generacin de C5-8 Polimerizacin de C9 Efecto funcional de la insercin del MHC en las membranas Perspectivas futuras del estudio de la fase final de la activacin del complemento Algunos aspectos genticos del Complemento Complemento y enfermedad

341 342 344 344 344 345 346 347 347 347 349

Captulo 19 INMUNIDAD MEDIADA POR CLULAS Dra. Luz Blanco P. y Prof. Dr. Javier Puente P. 1. Introduccin 2. Citolisis mediada por linfocitos T 2.1. Mecanismo membranoltico 2.2. Mecanismo dependiente de la interaccin FasL-Fas 3. Citolisis mediada por clula NK 3.1. Citotoxicidad mediada por clulas NK 3.2. Receptor FcRIIIA (CD16) 4. Mtodos de estudio del proceso citoltico 5. Hipersensibilidad retardada (HR) Captulo 20 RESPUESTA INMUNE MEDIADA POR IgE Prof. Dr. Arnoldo Quezada L. y Dr. Edgardo Carrasco C. 1. Introduccin 2. Caractersticas de la IgE 3. Mastocitos y Basfilos 4. Receptores para IgE y liberacin de mediadores 5. Regulacin de la sntesis de IgE 6. Rol biolgico de la respuesta mediada por IgE 7. Aplicaciones biomdicas

351 352 355 356 358 358 360 361 362 365

367 367 367 368 371 372 373

SECCIN IV: INMUNOLOGA CLNICA

Captulo 21 HIPERSENSIBILIDAD Prof. Dr. Arnoldo Quezada L. y Dra. Ximena Norambuena R. 1. Introduccin 2. Clasificacin de las reacciones de hipersensibilidad 3. Hipersensibilidad inmediata mediada por IgE (tipo I) 4. Hipersensibilidad citotxica (tipo II) 5. Hipersensibilidad mediada por complejos inmunes (tipo III) 6. Hipersensibilidad retardada mediada por clulas (tipo IV) Captulo 22 ANAFILAXIS Prof. Dra. Patricia Daz A. 1. Introduccin 2. Fisiopatologa

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389 389

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2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 3. 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6. 3.7. 4. 4.1. 4.2. 4.3. 5. 6. 7. 8.

Mastocitos Degranulacin de mastocitos y basfilos Participacin de cascadas de la inflamacin en la reaccin anafilctica y anafilactodea Alteraciones Funcionales Causas de anafilaxis Frmacos Ltex Picaduras de himenpteros Alimentos Anafilaxis inducida por inmunoterapia Anafilaxis inducida por ejercicio Anafilaxis idioptica Causas de reacciones anafilactodeas Aditivos Medios de contraste cido acetil saliclico (AAS) y anti-inflamatorios no esteroidales (AINE) Reacciones anafilcticas y anafilactodeas en pabellones quirrgicos Signos y sntomas Laboratorio Tratamiento

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Captulo 23 AUTOINMUNIDAD Dra. Ana Mara Agar M. y Dra. Mara Anglica Marinovic M. 1. Introduccin 2. Formas clnicas y caractersticas comunes 3. HLA y enfermedades autoinmunes 4. Patogenia de las enfermedades autoinmunes 5. Autotolerancia 5.1. Falla de la tolerancia central del linfocito T 5.2. Falla de la tolerancia perifrica del linfocito T 5.3. Falla de la tolerancia del linfocito B 6. Citoquinas y enfermedades autoinmunes 7. Nuevos tratamientos Captulo 24 ENFERMEDADES REUMTICAS Prof. Dr. Sergio Jacobelli G. y Prof. Dr. Santiago Rivero D. 1. Introduccin 2. Artritis Reumatodea 2.1. Patogenia 2.1.1. Gentica 2.1.2. Infecciones 2.1.3. Autoinmunidad 2.2. Clnica y tratamiento 3. Lupus eritematoso sistmico 3.1. Patogenia 3.1.1. Factores genticos 3.1.2. Factores ambientales 3.1.3. Disregulacin del sistema inmune 3.1.4. Inflamacin y dao celular/tisular 3.2. Clnica y tratamiento

401 401 403 404 404 405 405 405 406 407 409

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Captulo 25 SNDROME ANTIFOSFOLPIDO Prof. Dr. Ivn Palomo G., Prof. Dr. Antonio Cabral, Prof. Dra. Silvia Pierangeli y Prof. Dr. Ricardo Forastiero V. 1. Introduccin 2. Antgenos y anticuerpos 2.1. Antgenos 2.2. Anticuerpos 3. Mecanismos de trombosis 3.1. Biosntesis de eicosanoides e isoeicosanoides 3.2. Sistema antitrombtico de la protena C 3.3. Va del factor tisular 3.4. Sistema fibrinoltico 3.5. Anexinas y activacin celular 3.6. Inmunidad celular y perfil de citoquinas 3.7. Asociacin con factores genticos de riesgo trombtico 4. Manifestaciones clnicas 4.1. Manifestaciones vaso-oclusivas 4.2. Manifestaciones hemocitopnicas 4.3. Otras manifestaciones 5. Laboratorio 5.1. Anticardiolipina por ELISA 5.2. Anticoagulante Lpico 5.3. Pruebas de laboratorio ms especficas para el diagnstico de SAF 5.4. Qu pruebas de laboratorio se deben usar en el diagnstico de SAF? 6. Tratamiento Captulo 26 CITOPENIAS INMUNES Prof. Dr. Ivn Palomo G., Prof. Dr. Jaime Pereira G. y Prof. MgCs. Marcela Vsquez R. 1. Introduccin 2. Anemias hemolticas inmunes 2.1. Sistemas antignicos de los glbulos rojos 2.2. Anemias hemolticas inmunes 2.2.1. Anemias hemolticas aloinmunes 2.2.2. Anemias hemolticas autoinmunes 3. Trombocitopenias inmunes 3.1. Sistemas antignicos de las plaquetas 3.2. Trombocitopenias inmunes 3.2.1. Trombocitopenias aloinmunes 3.2.2. Trombocitopenias autoinmunes 4. Neutropenias inmunes 4.1. Sistemas antignicos de los neutrfilos 4.2. Neutropenias inmunes 4.2.1. Neutropenias aloinmunes 4.2.2. Neutropenias autoinmunes Captulo 27 GAMMAPATAS MONOCLONALES Prof. Dra. Mireya Silva B. y Prof. Dr. Mauricio Oqueteaux T. 1. Introduccin 2. Estudio inmunolgico de las gammapatas monoclonales 2.1. Pesquisa de una protena monoclonal

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425 425 425 426 427 427 428 428 428 428 429 429 429 429 430 430 430 431 432 432 432 433 437

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2.2. 2.3. 2.4. 2.5. 2.6. 2.7. 2.8. 3. 3.1. 3.2. 4. 4.1. 4.2. 5. 5.1. 5.2. 5.3. 5.4. 5.5. 5.6. 5.7. 5.8. 5.9. 6. 7. 7.1. 7.2. 7.3. 7.4. 8.

Identificacin de una protena monoclonal Cuantificacin de inmunoglobulinas Viscosidad srica Beta-2 microglobulina Protena C reactiva Interleuquina-6 Estudios inmunolgicos en orina Gammapata monoclonal de significado incierto Aspectos generales Evolucin de las MGUS en el tiempo Mieloma mltiple Manifestaciones clnicas Pronstico Variedades infrecuentes de mieloma mltiple y otras gammapatas Mieloma "indolente" Leucemia de clulas plasmticas Mieloma osteoesclertico Plasmocitoma extramedular Plasmocitoma seo solitario Macroglobulinemia de Waldenstrm (MW) Enfermedad de cadenas livianas Amiloidosis primaria Enfermedad por cadenas pesadas Diagnstico diferencial entre MGUS y MM Patogenia Papel de la IL-6 y va de la ciclina D1 Genes supresores de tumores Apoptosis de CPs Papel del estroma en las discrasias de CPs Tratamiento

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Captulo 28 ENFERMEDADES ORALES DE ORIGEN INMUNOLGICO Prof. Dr. Benjamn Martnez R. 1. Introduccin 2. Reacciones de hipersensibilidad orales 3. Manifestaciones orales de inmunodeficiencias 3.1. Candidiasis oral en infeccin por VIH 3.2. Leucoplasia pilosa 3.3. Sarcoma de Kaposi 4. Enfermedades autoinmunes orales 4.1. Sndrome de Sjgren 4.2. lcera oral recurrente (aftas) Captulo 29 OTRAS ENFERMEDADES INMUNOMEDIADAS Prof. Dra.Cecilia Seplveda C. 1. Introduccin 2. Algunas enfermedades inmunomediadas 2.1. Lupus eritematoso sistmico 2.2. Artritis reumatoidea 2.3. Enfermedades mediadas por anticuerpos 2.4. Otras enfermedades

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Captulo 30 INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS Prof. Dra. Mnica Cornejo De L. y Prof. Dra. Marta Zelazko de Ch. 1. Introduccin 2. Inmunodeficiencias primarias 2.1. Aspectos genticos de las IDP 2.2. Estudios de laboratorio inmunolgico para el diagnstico de IDP 2.3. Caractersticas de las IDP 2.3.1. Defectos predominantemente de anticuerpos 2.3.2. Defectos combinados de clulas T y B 2.3.3. Inmunodeficiencias asociadas a otros defectos 2.3.4. Defectos congnitos de inmunidad natural 3. Tratamiento de las inmunodeficiencias congnitas

495

497 499 499 500 501 501 503 507 508 509

Captulo 31 INMUNODEFICIENCIAS SECUNDARIAS Dra. Mara Antonieta Guzmn M. y Prof. Dra. Cecilia Seplveda C. 1. Introduccin 2. Infeccin por VIH y SIDA 2.1. Magnitud del problema 2.2. Caractersticas del virus 2.3. Progresin de la infeccin por VIH-1 2.4. Ingreso al organismo 2.5. Respuesta inmune anti-VIH 2.6. Diagnstico de laboratorio 2.7. Tratamiento 3. Sistema inmune fetal y neonatal 3.1. Inmunidad celular 3.2. Inmunidad humoral 3.3. Inmunidad innata 4. Envejecimiento y sistema inmune 4.1. Inmunidad celular 4.2. Inmunidad humoral 5. Inmunidad y nutricin 5.1. Inmunidad celular 5.2. Dficit de nutrientes especficos 6. Inmunodeficiencia inducida por ciruga y trauma 7. Inmunodeficiencia secundaria a enfermedades infecciosas 7.1. Inmunodeficiencia secundaria a infecciones virales 7.2. Inmunodeficiencia secundaria a infecciones bacterianas y fngicas 7.3. Inmunodeficiencia secundaria a infecciones parasitarias 8. Inmunodeficiencia secundaria a enfermedades infiltrativas y tumores 8.1. Evasin de la respuesta inmune por tumores 8.2. Defectos inmunolgicos en tumores 9. Inmunodeficiencia secundaria a terapia inmunosupresora 9.1. Mecanismos de accin 9.2. Impacto de la inmunodeficiencia asociada a inmunosupresora Captulo 32 INMUNIDAD FRENTE A BACTERIAS Prof. Dra. Eva Burger, Prof. Dra. Edilia Andrews G. y Prof. Dr. Heriberto Fernndez J. 1. Introduccin

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2. 2.1. 2.2. 2.2.1. 2.2.2. 2.3. 2.3.1. 2.3.2. 2.3.3. 2.3.4. 3. 3.1. 3.2. 3.2.1. 3.2.2. 3.3. 3.3.1. 3.3.2. 3.3.3. 3.3.4. 3.3.5. 3.3.6. 4. 5. 5.1. 5.2. 5.2.1. 5.2.2. 5.2.3. 5.2.4.

Inmunidad frente a bacterias extracelulares Caractersticas generales de las bacterias extracelulares Mecanismos de inmunidad natural Mecanismos comunes a bacterias extra e intracelulares Inmunidad natural a bacterias extracelulares Inmunidad adquirida a bacterias extracelulares Neutralizacin de toxinas o enzimas bacterianas por anticuerpos Efectos directos del sistema del complemento Efecto conjunto de anticuerpo, complemento y lisozima Opsonizacin y facilitacin de la fagocitosis Inmunidad frente a bacterias intracelulares Caractersticas generales de las bacterias intracelulares Inmunidad natural a bacterias intracelulares Clulas NK Leucocitos polimorfonucleares neutrfilos Inmunidad adquirida a bacterias intracelulares Macrfagos activados Linfocitos T Efecto conjunto de linfocitos T CD4+ y CD8+ Linfocitos T- Citoquinas Granulomas Anlisis comparativo del desarrollo de inmunidad en infecciones por bacterias extracelulares e intracelulares Estrategias de intervencin inmune en relacin a bacterias intracelulares Tipos de vacunas para bacterias intracelulares en uso Desarrollo de nuevas vacunas Identificacin de antgenos protectores Cepas vaccinales atenuadas y recombinantes Vacunas de subunidades y empleo de adyuvantes Vacunas DNA

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Captulo 33 INMUNIDAD FRENTE A HONGOS Prof. Dra. Eva Burger, Prof. Dr. Luiz Zaror C., y Prof. Dr. Heriberto Fernndez J. 1. Introduccin 1.1. Consideraciones histricas 1.2. Caractersticas generales de algunos hongos oportunistas 1.3. Caractersticas generales de algunos hongos patognicos 1.4. Caractersticas generales de los dermatofitos 1.5. Conceptos sobre inmunidad a hongos patognicos 2. Inmunidad natural 2.1. Factores hormonales 2.2. Concentracin de hierro 2.3. Sistema del complemento 2.4. Clulas natural killer (NK) 2.5. Leucocitos polimorfonucleares neutrfilos (PMN) 2.6. Macrfagos 3. Inmunidad humoral a hongos 3.1. Papel de la inmunidad humoral 3.2. Mecanismos protectores de la inmunidad humoral 4. Inmunidad celular a hongos 4.1. Macrfagos

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4.2. 4.3. 4.4. 5. 5.1. 5.2.

Linfocitos T Citoquinas Granulomas Mecanismos de inmunidad protectora Mecanismo principal Otros mecanismos

522 553 553 554 554 555 557

Captulo 34 RESPUESTA INMUNE FRENTE A VIRUS Prof. Dr. Jos M. Ojeda F. y Prof. Dr. Jorge A. Fernndez V. 1. Introduccin 2. Infeccin viral 2.1. Interaccin virus-husped 3. Respuesta inmune en infecciones virales 3.1. Inmunidad antiviral natural 3.1.1. Produccin de IFN tipo I y otras citoquinas 3.1.2. Clulas NK 3.1.3. Activacin del complemento y fagocitosis 3.2. Inmunidad antiviral especfica 3.2.1. Inmunidad humoral 3.2.2. Inmunidad celular 3.3. Evasin de la respuesta inmune por virus 3.3.1. Persistencia intracelular 3.3.2. Variacin antignica 3.3.3. Interaccin con componentes del sistema inmune 3.3.4. Interferencia con la presentacin antignica 3.3.5. Simulacin molecular 3.3.6. Inmunosupresin Captulo 35 INMUNIDAD FRENTE A PARSITOS Prof. Dr.Ulises Vergara C. y Prof. Dr. Jorge Gonzlez C. 1. Introduccin 2. Respuesta inmune frente a protozoos 2.1. Desarrollo de inmunidad protectora 2.2. Activacin de macrfagos infectados 2.3. Activacin de linfocitos T CD8+ 2.4. Rol de los anticuerpos en el control de protozoos 3. Respuesta inmune frente a nemtodos intestinales 3.1. Aspectos generales de la respuesta inmune 3.1.1. Enterocitos 3.1.2. Inmunoglobulinas 3.1.3. Linfocitos 3.1.4. Clulas mieloides 3.2. Respuesta Th2 y proteccin inmunolgica 3.2.1. Mecanismos efectores y resistencia a la infeccin 3.3. Respuesta Th1 y susceptibilidad a la infeccin 4. Respuesta inmune frente a tremtodos intestinales 4.1. Inmunidad protectora frente a Schistosoma 4.1.1. Eosinfilos 4.1.2. Macrfagos 4.2. Inmunidad en la rata 4.3. Inmunidad en el ratn 4.4. Interferencia con la inmunidad

559 560 560 560 561 561 561 561 562 562 562 564 564 564 565 565 566 566 567

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Captulo 36 VACUNAS Prof. Dr. Ulises Vergara C. y Prof. Dr. Rosario Billetta 1. Introduccin 2. Vacunas naturales o tradicionales 3. Vacunas recombinantes 4. Vacunas anti-idiotpicas 5. Vacunas sintticas 6. Vacunas de DNA 7. Vacunas Genmicas 8. Adyuvantes, inmunomoduladores e inmunogenicidad Captulo 37 MECANISMOS DE INMUNIDAD ANTITUMORAL Prof. Dr. Flavio Salazar O. y Prof. Dr. Javier Puente P. 1. Introduccin 2. Defensa inmunolgica contra el cncer 2.1. La hiptesis de vigilancia inmunolgica antitumoral 2.2. Componentes de la respuesta inmune antitumoral 2.2.1. Respuesta inmunolgica humoral 2.2.2. Respuesta inmunolgica celular 3. Antgenos asociados a tumores 3.1. Clasificacin de AAT reconocidos por LT 4. Estrategias tumorales de evasin inmunolgica 4.1. Disminucin de la expansin de las molculas MHC 4.2. Factores inmunosupresores producidos por los tumores 5. Terapia inmunolgica contra el cncer 5.1. Anticuerpos monoclonales 5.2. Terapia biolgica contra el cncer 5.2.1. Utilizacin de citoquinas 5.2.2. Terapia celular adoptiva 5.3. Inmunizacin activa contra tumores Captulo 38 MECANISMOS INMUNOLGICOS DEL RECHAZO DE ALOINJERTOS Prof. Dra. Cecilia Seplveda C. 1. Introduccin 2. Rechazo de aloinjertos 2.1. Presentacin directa de aloantgenos 2.2. Presentacin indirecta de aloantgenos 2.3. Clulas que participan en el rechazo 3. Mecanismos efectores del rechazo 3.1 Rechazo hiperagudo 3.2. Rechazo agudo 3.3. Rechazo crnico 4. Prevencin y tratamiento del rechazo 4.1 Inmunosupresin 4.2. Seleccin de donantes 4.3. Induccin de tolerancia

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587 590 593 596 596 598 600 600 605

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Captulo 39 INMUNOMODULADORES Prof. Dra. Cecilia Seplveda C. y Dra. Mara Antonieta Guzmn M. 1. Introduccin 2. Principales Inmunomoduladores 2.1. Antiproliferativos 2.2. Antagonistas de las Inmunofilinas 2.3. Glucocorticoides 2.4. Agentes biolgicos 2.5. Citoquinas 2.6. Trasplante de mdula sea 2.7. Clulas autlogas modificadas 2.8. Isoprinosine 3. Efectos Adversos de los Inmunomoduladores

627

629 629 629 630 631 631 632 633 633 633 633

SECCIN V: MTODOS INMUNOLGICOS Y DE BIOLOGA MOLECULAR

Captulo 40 MTODOS INMUNOQUMICOS Dr. Darwins Castillo A. y BQ. Carolina Valenzuela B. 1. Introduccin 2. Inmunoanlisis 2.1. Inmunoanlisis con reactivos no marcados 2.1.1. Reaccin de precipitacin 2.1.1.1. Reaccin de precipitacin en medio lquido a) Precipitacin en tubo b) Floculacin c) Turbidimetra d) Nefelometra e) Precipitacin de complejos inmunes solubles 2.1.1.2. Reaccin de precipitacin en gel a) Inmunodifusin doble b) Inmunodifusin radial c) Inmunoelectroforesis d) Inmunofijacin e) Contrainmunoelectroforesis f) Rocket inmunoelectroforesis g) Inmunoelectroforesis cruzada o bidimensional de Laurell 2.1.2. Reaccin de aglutinacin a) Aglutinacin directa b) Aglutinacin indirecta c) Aglutinacin pasiva 2.1.3. Reaccin con participacin del complemento a) Fijacin del complemento b) Actividad hemoltica del complemento 2.2. Inmunoanlisis con reactivos marcados 2.2.1. Inmunoanlisis fluorescente a) Microscopa inmunofluorescente b) Inmunoanlisis de fluorescencia polarizada c) Inmunoanlisis de fluorescencia unida a enzima d) Citometra de flujo

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2.2.2. a) b) c) 2.2.3. a) b) c) 2.2.4. 2.2.5.

Enzimainmunoanlisis (EIA) EIA homogneo EIA heterogneo Electroinmunotransferencia o Western blot o Immunoblotting Radioinmunoanlisis (RIA) RIA en fase soluble RIA en fase slida Deteccin inmunorradiomtrica para antgeno Quimiluminiscencia Bioluminiscencia

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Captulo 41 655 MTODOS DE ESTUDIO DE LA INMUNIDAD CELULAR Prof. Dr. Jorge Gonzlez C. y Dra. Pilar Vega C. 1. Introduccin 657 2. Preparacin y aislamiento de diferentes poblaciones celulares 658 2.1. Mtodos de purificacin tradicionales 658 2.2. Separacin inmunomagntica 659 3. Estudio de la respuesta inmune celular especfica 660 3.1. Estudio de las subpoblaciones de linfocitos 660 3.2. Estudio de las funciones de inmunidad celular especfica 662 3.3. Estudio de la sntesis de citoquinas y sus receptores 670 3.4. DNA microarrays 675 3.5. Pruebas para evaluar reacciones de hipersensibilidad retardada (RHR) 676 3.6. Estudios de la especificidad de clulas T 676 3.7. Deteccin de clulas T supresoras 677 4. Estudio de la inmunidad celular inespecfica 678 4.1. Ensayos funcionales de neutrfilos 678 4.2. Ensayos funcionales de eosinfilos 679 4.3. Funciones de monocitos y macrfagos 679 5. Evaluacin de laboratorios del paciente infectado con el virus de la inmunodeficiencia humana. Un modelo del estudio de las deficiencias en la respuesta celular 682 5.1. Estudio fenotpico de linfocitos 682 5.2. Estudio de la respuesta proliferativa 683 5.3. Estudio de la respuesta citotxica 683 5.4. Evaluacin de los niveles de citoquinas y subpoblaciones de linfocitos T 684 Captulo 42 LABORATORIO DE HISTOCOMPATIBILIDAD Y TRASPLANTE DE RGANOS Dra. Susana Elgueta M., BQ. Alejandra Arenas C. y Prof. Dra. Cristina Navarrete 1. Introduccin 2. Nomenclatura HLA 2.1. Herencia 3. Tipificacin HLA 3.1. Tcnica serolgica 3.2. Tcnica celular 3.3. Tcnica molecular 4. Anticuerpos HLA 4.1. Anticuerpos reactivos con panel 4.2. Crossmatch 5. Requerimientos de histocompatibilidad para trasplante 6. Otras aplicaciones de la tipificacin HLA 685

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Captulo 43 CITOMETRA DE FLUJO: PRINCIPIOS BSICOS Y APLICACIONES Tc. Qum. Valeska Simon Z. y Prof. Dra. Mara Rosa Bono 1. Introduccin 2. Principios generales 2.1. Sistemas de fluidos 2.2. Sistema ptico 2.3. Sistema electrnico 2.4. Reactivos para citometra de flujo 3. Aplicaciones de la citometra de flujo 3.1. Determinacin de poblaciones celulares 3.2. Fenotipificacin de neoplasias hematolgicas 3.2.1. Fenotipificacin de leucemias 3.2.2. Fenotipificacin de linfomas 3.3. Enfermedad de Hodgkin 3.4. Trasplante de mdula sea 3.5. Anlisis de DNA y ciclo celular 3.6. Anlisis de enfermedad residual mnima Captulo 44 ANTICUERPOS MONOCLONALES Prof. Dra. Mara Ins Becker C. y Prof. Dr. Alfredo E. De Ioannes I. 1. Introduccin 2. Fundamentos del desarrollo de hibridomas 2.1. Mielomas 2.2. Fusin celular 2.3. Medio de seleccin 3. Etapas de la produccin de hibridomas murinos 3.1. Inmunizacin 3.2. Fusin 3.3. Seleccin y crecimiento 3.4. Subclonacin y congelacin 3.5. Cultivo masivo 4. Anticuerpos monoclonales versus anticuerpos policlonales 4.1. Especificidad 4.2. Avidez y afinidad 5. Aplicaciones de los anticuerpos monoclonales 5.1. Investigacin bsica 5.2. Medicina 5.3. Biotecnologa 6. Otros tipos de hibridomas 6.1. Heterohibridomas 6.2. Hibridomas humanos Captulo 45 MTODOS FUNDAMENTALES DE BIOLOGA MOLECULAR Prof. Dr. Claudio Vsquez G. y Prof. Dr. Enrique Gonzlez V. 1. Introduccin 2. Bases de la Biologa Molecular 2.1. El DNA es el material gentico 2.2. Componentes del DNA 2.3. Estructura del DNA 3. Las nuevas tecnologas

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3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6. 3.7. 4. 4.1. 4.2. 4.3. 5. 5.1. 5.2. 5.3. 5.4.

Endonucleasas de restriccin Clonamiento del DNA Transferencia de Southern Transformacin de clulas Secuenciacin del DNA Reaccin de la polimerasa en cadena Animales transgnicos y knock out de genes La expresin gnica en organismos eucariticos Estructura de los genes eucariticos El proceso de expresin gnica y sus etapas La expresin diferencial de genes y su regulacin Mtodos de anlisis de la expresin gnica Hibridacin Northern Reaccin de la polimerasa en cadena acoplada a la reaccin de la transcriptasa reversa (RT-PCR) Anlisis del perfil transcripcional mediante el mtodo de differential display de mRNAs. Hibridacin sustractiva

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Captulo 46 GRUPOS DE DIFERENCIACIN ANTIGNICA Prof. Dr. Ivn Palomo G., Prof. Dr. Flavio Carrin A. y Prof. Dr. Cristin Rodrguez G. 1. Introduccin 2. Estructura de los antgenos de membrana 2.1. Protenas de transmembrana tipo I 2.2. Protenas de transmembrana tipo II 2.3. Protenas de transmembrana tipo III 3. Molculas CD asociadas a lneas celulares 3.1. Molculas CD expresadas principalmente en "stem cell" 3.2. Molculas CD expresadas principalmente en clulas B 3.3. Molculas CD expresadas principalmente en clulas T 3.4. Molculas CD expresadas principalmente en clulas NK 3.5. Molculas CD expresadas principalmente en granulocitos 3.6. Molculas CD expresadas principalmente en monocitos-macrfagos 3.7. Molculas CD expresadas principalmente en plaquetas 4. Familias de molculas CD 5. Algunas aplicaciones de la nomenclatura CD en Inmunologa

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GLOSARIO

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NDICE ALFABTICO GENERAL DE MATERIAS

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PREFACIO

Nuestras primeras palabras queremos que sean para dedicar un homenaje pstumo a Csar Milstein, quien junto a George Khler, en la dcada del setenta, desarrollaron la metodologa para obtener anticuerpos monoclonales. Tal importancia cientfica represent su aporte, que recibieron el Premio Nobel en 1984 (ver captulo 2). El Dr. Milstein, naci el 8 de octubre de 1927 (Baha Blanca, Argentina) y falleci a comienzos del presente ao. Despus de obtener el Doctorado en Qumica en la Universidad de Buenos Aires (1957), obtuvo el grado de PhD en la Universidad de Cambridge, Inglaterra, institucin en la que trabajaba cuando recibi el mximo premio cientfico. Su conferencia (Nobel Lecture, 8 de diciembre, 1984) se titul From the structure of antibodies to the diversification of the immune response. Dada la importancia de esta herramienta en el estudio molecular de diversas macromolculas y que su aplicacin se realiza tanto en ciencias bsicas como en clnica, dedicamos un captulo del libro a la descripcin de los anticuerpos monoclonales (captulo 44). Por otra parte, en las personas de Walter Gilbert, Francis Collins y J. Craig Venter, queremos expresar nuestro reconocimiento a todos los cientficos que participaron en uno de los ms importantes avances de la biologa moderna, nos referimos a la decodificacin del genoma humano. Mientras trabajbamos en la edicin de este libro: Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica, la noticia recorri el mundo, a mediados de 2000, primero, y luego a comienzos de 2001. Alrededor de 50 aos despus que James Watson y Francis Crick publicaran en Nature (Abril de 1953) la estructura del DNA, dos grupos de investigadores (del Proyecto Genoma Humano y de una compaa privada), publicaron, en febrero de 2001, en Nature y Science, respectivamente, la informacin sobre el genoma humano. Describieron que los humanos tenemos alrededor de 30.000 genes, nmero significativamente menor de los, aproximadamente, 80.000 que se esperaba. Deseamos que el nuevo conocimiento que se generar en los prximos aos, a partir de este significativo avance cientfico, sea utilizado en la bsqueda de terapias para las casi cinco mil enfermedades genticas conocidas y en el tratamiento del cncer. Adicionalmente, queremos expresar en estas lneas nuestro reconocimiento a los inmunlogos, ex-acadmicos de la Universidad de Chile, Dra. Olga Pizarro y Dr. Tulio

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Pizzi, por sus contribuciones a la inmunologa, en el conocimiento de la inmunogentica H2, y por su labor en la formacin de especialistas en Inmunologa Clnica y los aportes en el mbito de la Enfermedad de Chagas, respectivamente. El libro Fundamentos de Inmunologa (Julio de 1998, 33 captulos) represent un aporte significativo a la enseanza de la Inmunologa moderna en Chile. El respaldo del Comit Editorial de la Editorial de la Universidad de Talca, de los inmunlogos, profesores de Inmunologa y de los alumnos de pre y postgrado nos compromete a entregar un texto de calidad internacional y que pueda ser utilizado en Chile como tambin en otros pases de lengua espaola. Este texto cuenta con 46 captulos, estructurados en cinco secciones: En la seccin I, Generalidades sobre inmunidad, entre otros aspectos se incluye el captulo Introduccin a la Inmunologa: las bases biolgicas de la individualidad celular, escrito por el Dr. Gustavo Hoecker, destacado Inmunlogo y Premio Nacional de Ciencias; adems en la seccin hay un captulo dedicado a las clulas y rganos del sistema inmune. La seccin II, Especificidad de la respuesta inmune, trata sobre molculas del sistema inmune, como por ejemplo las inmunoglobulinas, los receptores de clulas T, Complejo Principal de Histocompatibilidad y las citoquinas. La seccin III, Mecanismos efectores de la respuesta inmune, principalmente est dedicada al sistema del complemento y a la citotoxicidad mediada por clulas. La seccin IV, Inmunologa clnica, se refiere a las enfermedades que presentan un mecanismo patognico de tipo inmune. Finalmente la seccin V, Mtodos inmunolgicos y de biologa molecular, presenta los principios de los mtodos inmunoqumicos y de inmunidad celular, y de biologa molecular. Salvo excepciones, los captulos estn escritos por dos o ms autores, lo que garantiza una mayor calidad al contenido. Participan 64 inmunlogos; adems de destacados inmunlogos chilenos participaron siete inmunlogos de universidades extranjeros (Estados Unidos, Inglaterra, Mxico, Brasil y Argentina), lo cual es una fortaleza que destacamos. Por tratarse de un texto docente, con el propsito de facilitar la lectura, en los captulos se han numerado los subttulos, y en cada uno de ellos se ha incluido, al comienzo, un ndice de captulo y Resumen; y al final las Lecturas Sugeridas. Para cerrar el libro se incluye un Glosario que comprende los trminos inmunolgicos ms usados y un ndice alfabtico general de materias. En los ltimos aos se han realizado importantes avances en el conocimiento del Sistema Inmune y en las aplicaciones de la nueva informacin. Ello justifica que, actualmente, los Planes de Estudios de las carreras de la salud y biolgicas en general, incluyan Inmunologa como asignatura independiente. Siendo este un libro docente, est dirigido a alumnos de carreras que, en sus Planes de Estudios, tienen esta asignatura: Medicina, Odontologa, Medicina Veterinaria, Bioqumica, Qumica y Farma-

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cia, Tecnologa Mdica, Biotecnologa y Licenciatura en Biologa, entre otras. Creemos que el libro tambin ser de gran utilidad para alumnos de postgrado y profesionales que se interesen en esta disciplina. Si bien el texto est escrito en castellano, se usarn algunos trminos y siglas en ingls por lo difundido de su uso, como por ejemplo LT helper, TCR, entre otros. Agradecemos a las personas que colaboraron en la edicin del libro; a la correctora de textos, Profesora Mara Cecilia Tapia Castro, por el inters puesto en esta obra como tambin por su excelente trabajo profesional; a la diseadora grfica Marcela Albornoz D. y al BQ Marcos Prez C., quien realiz las figuras del libro; a la secretaria Hayde Alvarez A., nuestro reconocimiento por su destacada colaboracin en el trabajo de preedicin. Agradecemos a las instituciones que han respaldado nuestro trabajo con su patrocinio: la International Union of Immunology Societies (IUIS) en la persona de la Prof. Dr. Genevieve Milon, Chairperson IUIS Education Committee; la Asociacin Latinoamericana de Inmunologa (ALAI); la Sociedad Chilena de Inmunologa (SOCHIN); y la Sociedad Chilena de Alergia e Inmunologa. Tambin agradecemos a la Universidad Favaloro (Argentina), Universidad de Chile (Facultades de Medicina, de Ciencias, de Ciencias Qumicas y Farmacuticas, de Ciencias Veterinarias y Pecuarias), Pontificia Universidad Catlica de Chile (Facultad de Ciencias Biolgicas), Universidad Austral de Chile (Facultad de Medicina), Universidad de Valparaso (Facultad de Medicina), Universidad de Santiago de Chile (Facultad de Qumica y Biologa), Universidad de la Frontera (Facultad de Medicina), Universidad de Antofagasta (Facultad de Ciencias de la Salud), Universidad de Talca (Facultad de Ciencias de la Salud), Universidad Mayor (Facultad de Odontologa), Universidad de Los Andes (Facultad de Medicina) e Instituto de Salud Pblica de Chile. Damos las gracias a la Universidad de Talca, en la persona de su Rector, Prof. Dr. lvaro Rojas Marn, y a la Editorial de esta institucin en la persona del Vicerrector de Extensin y Comunicaciones, Prof. Dr. Pedro Zamorano Prez, por el apoyo otorgado durante el desarrollo de esta obra. Finalmente, expresamos nuestro deseo que este libro sea de utilidad e inters para alumnos y profesionales que quieran conocer algo ms sobre las clulas, molculas y mecanismos del sistema inmune, tanto en situaciones de normalidad como en enfermedad. Dr. Ivn Palomo Gonzlez Dr. Arturo Ferreira Vigoroux Dra. Cecilia Seplveda Carvajal Dr. Mario Rosemblatt Silber Dr. Ulises Vergara Castillo Editores

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PRLOGO

Al calor de las nuevas tecnologas de biologa celular y molecular, y de la reciente aparicin de la genmica, la protemica y la bioinformtica, la Inmunologa moderna se desarrolla de forma vertiginosa. Se produce un volumen colosal de nuevos conocimientos, algunos de los cuales echan por tierra nuestros dogmas ms repetidos, y los nuevos descubrimientos y conceptos sobre cmo opera el sistema inmune se convierten rpidamente en productos aplicables en la prevencin y en el tratamiento de las enfermedades, gracias a la Biotecnologa. Es este el contexto donde se mueve la enseanza de la Inmunologa de estos tiempos, que debe combinar el estmulo al instinto de experimentacin y el alto rigor acadmico, con la idea de que es importante convertir los conocimientos en objetos de impacto real para nuestras sociedades. Con un extenso contenido formado por cinco secciones y cuarenta y seis captulos, Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica, descolla por su cuidadosa elaboracin, resultado del trabajo de un grupo importante de inmunlogos. Las generalidades de la Inmunologa, los aspectos ms especficos de la respuesta inmune, la Inmunologa Clnica y algunos de los mtodos ms empleados para la aplicacin de estos conocimientos, o para su descubrimiento, forman parte de un texto que est llamado a jugar un rol importante en la docencia de esta ciencia. Slo me queda felicitar a los autores de este excelente texto y conminar a sus lectores a enfrentar con esfuerzo y dedicacin los nuevos retos que impone el desarrollo de la Inmunologa en Latinoamrica para experimentadores y clnicos, ms ahora cuando tenemos el honor y el compromiso de organizar el Congreso Mundial de Inmunologa del 2007, cuya sede fue recientemente concedida a Ro de Janeiro. Jorge Victor Gavilondo Cowley, D.Sc. Presidente de la Asociacin Latinoamericana de Inmunologa (ALAI) 2000-2002

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

SECCIN

GENERALIDADES SOBRE INMUNIDAD

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Captulo 1
INTRODUCCIN A LA INMUNOLOGA: LAS BASES BIOLGICAS DE LA INDIVIDUALIDAD CELULAR
Gustavo Hoecker S.*

* Premio Nacional de Ciencias, 1989.

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El avance sorprendente de la ciencia y la tecnologa ha adquirido tal velocidad que, por una parte, su ltimo fruto, la biologa molecular ha conducido a identificar las molculas responsables de la herencia como sus productos de traduccin, las protenas, y se estn visualizando los caminos complejos por los cuales discurren todas las funciones vitales. Los seres vivientes desde las bacterias hasta los elefantes, incluido el hombre, se caracterizan por una individualidad podra decirse total o sea que no existen dos seres exactamente iguales. De esto se infiere que otra caracterstica mayor de las especies vivientes es la heterogeneidad. Esta resulta de la recombinacin, tanto de los factores hereditarios, los genes, como de los factores ambientales que comparten los miembros de una misma especie. En el segundo captulo de este libro, que detalla el desarrollo histrico de nuestra disciplina, vern que el avance del conocimiento ha sido el resultado de la prctica de la crianza de plantas y de la observacin de las propiedades y enfermedades en todos los seres vivos, algunos de los cuales moran y otros se recuperaban y sobrevivan. Se dedujo que la produccin y la resistencia a las enfermedades, dependan de la individualidad de cada miembro del grupo biolgico, lo que llev a la seleccin artificial de las especies domsticas. Independientemente de sta, la seleccin natural, al azar, trabaja sobre todos los seres vivientes. La inmunologa en su estado presente, podra decirse que empez en 1900 y ha crecido paralelamente con el redescubrimiento y progreso de la gentica. Los hechos fundamentales fueron el descubrimiento en el suero de las inmunoglobulinas, que reaccionaban especficamente con ciertas clulas, bacterias, hongos o parsitos y sus productos de secrecin. El centro de este progreso fue el desarrollo de la teora qumica de los receptores y de sus agentes especficos que debemos a Ehrlich en lo qumico, y a Carl Landsteiner, primero, por su descubrimiento de los grupos sanguneos humanos (1900) y segundo, por su demostracin de la inmunogenicidad de substancias qumicas artificiales que, ligadas a protenas naturales, reaccionaban especficamente

a las inmunoglobulinas de los animales inyectados. Deseo sealar en un parntesis, que Landsteiner era, y fue hasta su muerte, un anatomopatlogo que hizo autopsias todos los das desde las 6 a las 8 de la maana. De ah, suba a su modesto laboratorio para leer, hacer experimentos, pensar y describir sus resultados. Ambos, Ehrlich y Landsteiner, fueron Premios Nobel y son el origen de la inmunologa humoral clsica y sus extensos descubrimientos acerca del origen y causas de casi todas las enfermedades infecciosas, y de las aplicaciones a la transfusin sangunea. Landsteiner mismo fue el descubridor de la mayor parte de los antgenos mayores de los glbulos rojos humanos (ABO y Rh). El continuo y rpido progreso de la inmunologa demostr que unas clulas insignificantes, pero muy abundantes en el organismo (aproximadamente un dcimo del peso total), los linfocitos, eran responsables de la produccin de las inmunoglobulinas: los linfocitos B. Esta era una clara indicacin de una extensa heterogeneidad celular, inaparente a la inspeccin microscpica. Exista, tambin, una inmunidad celular. La simple observacin permiti ver que al comienzo de las infecciones y en los primeros cinco das, los organismos se defendan de los agentes infecciosos y parasitarios. Exista una inmunidad natural. Los elementos celulares centrales en esta inmunidad eran los macrfagos y a nivel humoral, una serie de diferentes substancias que eran activadas o existan naturalmente en el suero (alexinas, substancia A, complemento, etc.). Debemos a Metchnikoff, un bilogo general, el descubrimiento de esta fraccin celular fundamental de la inmunidad tanto natural como inducida. Establecida en los primeros 50 aos del siglo pasado las bases de la inmunidad humoral y su estructuracin gentica, se expandi una cantidad enorme de investigaciones acerca de la heterogeneidad de los linfocitos. Primero se descubri que la respuesta humoral era el resultado de la multiplicacin clonal de un escaso nmero de linfocitos (Jerne, 1952) portadores de receptores especficos para una porcin menor, aproximadamente 10 a 12 aminocidos, de la

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macromolcula inmunognica, el eptopo. La unin de ambos transmita una seal que llegaba al ncleo. ste, a su vez, traduca la seal y sus productos estimulaban a unos pocos clones de linfocitos a multiplicarse y a diferenciarse. La respuesta total puede ser la secrecin de inmunoglobulinas especficas, la conversin del linfocito neutro en un linfocito citotxico para los agentes infectantes o uno de colaboracin y estimulacin del complejo inmunitario. El desarrollo de la inmunologa, como dependiente de los genes y stos, a su vez, agentes inmutables, salvo excepcionales y poco frecuentes mutaciones, explicaban la individualidad como resultado de las recombinaciones de los genes en el curso de las generaciones, pero no exista una explicacin para la inmensa cantidad de inmunoglobulinas especficas. No haba una interpretacin para esta extensa heterogeneidad adaptativa del individuo que se manifestaba slo en los linfocitos, y que tena una base gentica desde que se trasmita a todos los miembros de un mismo clon y a sus productos. El nico problema comparable era el sistema nervioso. La clave sigui al descubrimiento por Barbara McClintock y Jacob y Monod (1958) de los genes saltarines, o sea, de los fenmenos de recombinacin gentica en clulas somticas. Susumi Tonegawa en 1976 descubri que los genes caractersticos de las inmunoglobulinas, v por variable, j por unin (joint en ingls), y c por constante (ver captulo 6) eran totalmente uniformes en el embrin, inmunolgicamente inmaduro y en cambio, en el adulto, inmunolgicamente maduro, eran extremadamente heterogneos. De esto concluy que la heterogeneidad era el resultado de la recombinacin somtica de los genes para las regiones v, j y c. A esta heterogeneidad contribuye tambin una alta tasa de mutaciones espontneas en este sistema. Podramos decir que la inmunologa clsica termina con el descubrimiento de las bases de la especificidad de los trasplantes de tejidos. Era un hecho conocido en los mamferos que slo los autotrasplantes se establecen: los alotrasplantes - entre individuos de la misma especie - son siempre rechazados. Con mayor razn, los trasplantes entre diferentes especies - los heterotrasplantes, no prenden: o sea, que los organismos reconocen lo propio y lo distinguen de lo ajeno. Debemos a George Snell el descubrimiento de las bases de este fenmeno: los genes de histocompatibilidad y, en especial, una familia de ellos, los genes mayores (MHC), HLA y H.2 en el hombre y el ratn, respectivamente. Las diferencias entre dador y receptor entre stos provoca el rechazo del injerto en no ms de 10 a 12 das, los otros genes H, determinan rechazos

ms dbiles - 20 o ms das. Peter Gorer en Inglaterra e investigadores chilenos establecieron que los genes mayores de histocompatibilidad determinaban, un complejo de antgenos que se heredaban estrechamente ligados (ver captulo 8) y se expresaban en prcticamente todas las clulas del organismo (Gorer et al, 1955; Hoecker et al, 1954 ) y que haba, por lo menos, dos clases diferentes, 1 y 2, de este sistema que se expresaban diferencialmente en los linfocitos de clase 1, en los linfocitos citotxicos y los linfocitos B, y de clase 2 en los linfocitos originados en el timo, linfocitos T. Estas eran las clulas responsables de la inmunidad adquirida. El sistema inmunolgico, como todas las funciones vitales, es de una eficacia, economa y adaptabilidad increble frente a las variantes inmunognicas ambientales. Las investigaciones siguientes cuyos detalles pueden verse en los diversos captulos de este libro, analizan las interrelaciones celulares y humorales de la respuesta inmune, en especial, los aspectos moleculares de estos procesos. El estado actual de la investigacin inmunolgica se centra en especial en los caminos moleculares que siguen, por una parte los factores inmunognicos y por otra la respuesta inmune especfica y algunos factores estructurales y metablicos que regulan la respuesta inmune. Scott & Rawson (Sc.Am., June, 2000 54- 64) sealan que las clulas de nuestro cuerpo tienen una sorprendente red de comunicaciones internas y que comprender estos circuitos ayuda a los cientficos a desarrollar nuevas terapias para muchos y serios desrdenes. La biologa molecular, en especial la gentica, establecieron que la estimulacin especfica de los genes nucleares se traducira en protenas especficas en el citoplasma. stas eran con frecuencia, enzimas hidrolticas y el citoplasma pareca un saco de enzimas y otras molculas. Un sistema as no permitira trasmitir las protenas inducidas. Y es caracterstico de los seres vivientes que los sistemas de comunicacin intracelular, a diferencia de las comunicaciones extracelulares, se transmiten sin ningn error. Cuando se producen errores -mutaciones- las funciones metablicas y orgnicas funcionan mal, o los seres mutantes, mueren. De lo cual se deduce que en el interior de las clulas existen caminos exactos entre las molculas mensajeras vgr. un antgeno, y los receptores especficos para ellas. A esta unin se sigue un complejo grupo de seales moleculares que llega hasta el ncleo. En ste, un gen especfico se activa y su accin se traduce en la produccin y secrecin de la protena que l determina. Para que esto ocurra, los mensajeros cruzan cada una de las estructuras celulares protegidas

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de la destruccin enzimtica por su unin con molculas de algunos sistemas que no son hidrolizables. Entre stos y muy importantes, son los antgenos mayores de histocompatibilidad (MHC). Se sabe que las molculas MHC de clase 1 pueden asociarse a receptores de superficie para diversas hormonas -beta-adrenrgicas, insulina, interleuquina -2, endorfinas y otras. Ligado a este problema est el hecho que los linfocitos citotxicos slo se activan si son portadores en la superficie de antgenos de clase 1. Los antgenos solubles a su vez, pueden penetrar al citoplasma unidos a antgenos MHC de clase 2 de aqu vuelven a la superficie celular donde las inmunoglobulinas circulantes y el complemento los eliminan a travs de los macrfagos. Este no es solamente un caso especial para el sistema inmunolgico sino que un proceso continuo para todas las funciones celulares y puede decirse que todos los sistemas estn interconectados incluido el sistema nervioso. Como ltimo comentario, creo poder predecir que en este siglo y en base a informacin inmunogentica y tcnicas moleculares ya en uso, cambiar substancialmente la farmacologa: se fabricar vacunas de DNA o RNA, se inocular genes para la produccin de anticuerpos y clulas especficas, adecuadas para la mayor parte de las enfermedades infecciosas, bacterianas, parasitarias, virales y autoinmunes. Como resultado, el hombre vivir unos cuantos aos ms y aparecern otras enfermedades o disfunciones todava no conocidas o estudiadas. Tendrn buena tarea los jvenes inmunlogos clnicos. LECTURAS SUGERIDAS Hoecker, G., Counce Sh., Smith, P., The antigens determined by the H-2 locus. A rhesus-like system in the mouse, Proceedings of the National Academy of Sciences, 1954; 40: 1040 - 1051. Monod, J., Le hasard et la necessit. Essai sur la philosophie naturelle de la biologie moderne, Editions du Seuil, Paris, 1975. Scott J. D., Pawson R., Cell communication: the inside story, Scientific American, 2000, pp. 54 61.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 2
HISTORIA DE LA INMUNOLOGA
Ivn Palomo G. y Arturo Ferreira V.

1. Introduccin 2. Dos siglos de inmunologa 2.1. Inmunidad 2.2. Serologa 2.3. Inmunoqumica 2.4. Inmunobiologa 3. Premios Nobel

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RESUMEN La Inmunologa tiene una historia de aproximadamente 200 aos, los que se pueden separar en dos perodos: 1796-1958 y 1959 a la fecha. Este ltimo perodo se ha caracterizado por importantes avances en el conocimiento del sistema inmune a nivel molecular. Veintitrs cientficos han obtenido quince Premios Nobel por sus aportes en el campo de la Inmunologa: Boehring, Koch, Erlich, Metchnikoff, Richet, Bordet, Lansteiner, Theiler, Bovet, Burnet, Medawar, Edelman, Porter, Yalow, Benacerraf, Dousset, Snell, Jerne, Koller, Milstein, Tonegawa, Doherty y Zinkernagel. En este captulo se menciona los avances ms importantes en inmunidad, serologa, inmunoqumica e inmunobiologa, realizados durante los dos siglos de historia de esta ciencia.

1. INTRODUCCIN El origen de la inmunologa se ha relacionado con el descubrimiento de la vacuna contra la viruela, hace aproximadamente 200 aos (1796), aporte realizado por Edward Jenner, un mdico rural ingls. Jenner, observ que las personas que contraan la vacuna (erupcin viral leve que afectaba al ganado y que se transmita a las ordeadoras), quedaban protegidas contra la viruela. Esta observacin le llev a transferir pus de una lesin de vacuna de una ordeadora, al brazo de un nio, al cual seis semanas ms tarde volvi a inocular, pero esta vez con pus tomado de una pstula de viruela y el nio no enferm. En dos siglos de historia de la inmunologa se han realizado importantes avances cientficos en reas como la serologa, inmunidad celular, inmunologa molecular e inmunogentica. Por otra parte, se han postulado y demostrado mecanismos inmunolgicos que explican la patogenia de enfermedades como las alergias, las inmunodeficiencias, las gammapatas monoclonales y las enfermedades autoinmunes. Adems, se han desarrollado reas como son la inmunofarmacologa, la inmunologa del cncer y la inmunologa de trasplante. Los doscientos aos de historia de la inmunologa pueden ser divididos en dos perodos: 1796-1958 y 1959 a la fecha. Perodo 1796-1958. Al menos treinta y cinco destacados investigadores hicieron contribuciones seminales en este perodo. En 1980, casi un siglo despus que Jenner inmunizara contra la viruela, Louis Pasteur realiz importantes investigaciones en relacin a la atenuacin de vacunas. Otros investigadores de este perodo fueron

Metchnikoff que investig la fagocitosis, Koch que hizo aportes fundamentales sobre hipersensibilidad y Landsteiner que demostr la existencia de varios sistemas antignicos en los glbulos rojos humanos. Perodo 1959 a la fecha. Este perodo, se inicia con los hallazgos sobre estructura de los anticuerpos realizados en 1959 por Porter y Edelman (Premio Nobel en 1972; ver punto 3). Estas cuatro dcadas, llamado perodo de la Inmunologa Molecular, se ha caracterizado por la velocidad en la generacin de nuevo conocimiento y tecnologa. Durante estos aos se han identificado las molculas que son propias del sistema inmune, y de los genes que las codifican. Entre los descubrimientos ms relevantes de este perodo se pueden citar, la obtencin de anticuerpos monoclonales, el conocimiento de la gentica de las inmunoglobulinas, la descripcin de los genes del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC). Adems, en este perodo se realiz el aislamiento de las molculas y genes de los receptores de clulas T, de citoquinas y de molculas de adhesin celular. Adicionalmente se han conocido importantes aspectos moleculares de la activacin linfocitaria. Por otra parte, estos conocimientos de inmunologa bsica han permitido importantes avances en el conocimiento de la patogenia y tratamiento de diferentes enfermedades inmunes. En este captulo slo se har una relacin de los principales investigadores en inmunologa indicando una breve descripcin de sus contribuciones.

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2. DOS SIGLOS DE INMUNOLOGA A continuacin se describen, brevemente, los aportes realizados por alrededor de setenta cientficos durante los doscientos aos de historia de la inmunologa. Han sido separados en cuatro reas (inmunidad, serologa, inmunoqumica e inmunobiologa) y ordenados cronolgicamente en cada una de ellas. En este punto los Premios Nobel slo sern nombrados ya que su aporte se describe en el punto 3. Algunos de ellos son citados en ms de un rea. 2.1. Inmunidad JENNER, Edward. En 1796 realiz la inmunizacin contra la viruela. PASTEUR, Louis. En 1880 describi lo que represent la primera vacuna atenuada. Observ que los cultivos viejos del bacilo del clera, al ser inoculados en aves no provocaban la enfermedad. Por otra parte, describi que la incubacin de Bacillus anthracis a 42C, haca perder la virulencia del bacilo. Posteriormente, en 1885, desarroll una vacuna contra la rabia, atenuando el virus causante de la enfermedad. METCHNIKOFF, Elie. Obtuvo el Premio Nobel en 1908 (ver punto 3). NUTTALL, George. En 1888 demostr que la sangre desfibrinada era bactericida por s misma y sugiri que en dicho fenmeno participara una sustancia termolbil presente en el suero. VON BEHRING, Emil. Obtuvo el Premio Nobel en 1901 (ver punto 3). EHRLICH Paul. Obtuvo el Premio Nobel en 1908 (ver punto 3). WRIGTH, Almroth y DOUGLASS, Stewart. En 1903 demostraron que ciertas sustancias presentes en el suero, que denominaron opsoninas, favorecan la fagocitosis de bacterias. RAMON, Gastn. En 1923 observ que al tratar las toxinas con formaldehido, stas perdan sus efectos nocivos y conservaban la actividad antignica. Los toxoides resultantes comenzaron a usarse como vacunas. THEILER, Max. Obtuvo el Premio Nobel en 1951 (ver punto 3). ISAACS, Alick y LINDENMANN, Jean. En 1957 describieron el interfern. 2.2. Serologa GRBER, Max y DURHAM, Herbert. En 1896 demostraron la reaccin de aglutinacin del Vibrio cholerae y del bacilo de la tifoidea por antisueros especficos. WIDAL, Georges. En 1986 desarroll la prueba de serodiagnstico para fiebre tifoidea.

KRAUSS, Rudolf. En 1987 observ que los filtrados de cultivos bacterianos o los extractos de bacterias lisadas, precipitaban con antisueros bacterianos. BORDET, Jules. Obtuvo el Premio Nobel en 1919 (ver punto 3). VON WASSERMANN, August. En 1906 desarroll la prueba de fijacin del complemento para el diagnstico de la sfilis. COONS, Albert. En 1942 desarroll una tcnica de marcacin de los anticuerpos basada en la unin covalente del isotiocianato de fluorescena. COOMBS, Robin. En 1945 desarroll la prueba de antiglobulinas. OUCHTERLONY, rjan; OUDIN, Jacques y ELECK, Stephen. Entre 1946 y 1948 desarrollaron pruebas de inmunodifusin. GRABAR, Pierre y WILLIAMS, Curtis. En 1953 modificando la prueba de inmunodifusin en gel, desarrollaron la tcnica de inmunoelectroforesis. YALOW, Rosalyn. Obtuvo el Premio Nobel en 1977 (ver punto 3). 2.3. Inmunoqumica EHRLICH, Paul. Obtuvo el Premio Nobel en 1908 (ver punto 3). OBERMAYER, Friedrich y PICK, Ernst. En 1906 observaron que la nitrificacin o yodacin de las protenas, modifican su especificidad serolgica. ARRHENIUS, Svante. En 1907 acu el trmino inmunoqumica. La primera contribucin importante, en esta rama de la inmunologa, fue el estudio de los haptenos. LANDSTEINER, Karl. Obtuvo el Premio Nobel en 1930 (ver punto 3). MARRACK, John. En 1934 propuso un nuevo modelo de reaccin antgeno-anticuerpo, basado en la polivalencia, es decir la presencia de varios sitios de combinacin, de cada uno de ellos. HEIDELBERGER, Michael y KENDALL, F.E. En 1935, disearon una tcnica de precipitacin cuantitativa que permiti expresar la cantidad de anticuerpos en mg de protena por ml, en lugar de usar el mtodo de titulacin. KABAT, Elvin y TISELIUS, Arne. En 1938 demostraron que los anticuerpos estn en la fraccin gamma-globulina del suero. PORTER, Rodney y EDELMAN, Gerald. Obtuvieron el Premio Nobel en 1972 (ver punto 3). 2.4. Inmunobiologa KOCH, Robert. Obtuvo el Premio Nobel en 1905 (ver punto 3). RICHET, Charles. Obtuvo el Premio Nobel en 1913 (ver punto 3).

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LANDSTEINER, Karl. Obtuvo el Premio Nobel en 1930 (ver punto 3). VON PIRQUET, Clemens y SCHICK, Bela. En 1905 estudiaron la Enfermedad del suero. Pirquet realiz varios aportes sobre la alergia que siguen siendo vlidos. EHRLICH, Paul. Obtuvo el premio Nobel en 1908. PRAUSNITZ, Carl y KSTNER, Heinz. En 1921 publicaron sus observaciones sobre la reagina, una sustancia de tipo anticuerpo presente en el suero y asociada con procesos alrgicos. Hoy se acepta que la reagina corresponde a la IgE. HAUROWITZ, Flix. En 1930 formul la teora del molde o plantilla para la formacin de anticuerpos. BOVET, Daniel. Obtuvo el Premio Nobel en 1957 (ver punto 3). BURNET, Macfarlane y MEDAWAR, Peter. Obtuvieron el Premio Nobel en 1960 (ver punto 3). WITEBSKY, Ernest. En 1956 estableci los criterios para demostrar la existencia de una enfermedad autoinmune. SNELL, George; DAUSSET, Jean y BENACERRAF, Baruj. Obtuvieron el Premio Nobel en 1980 (ver punto 3). MILSTEIN, Csar; KHLER, George y JERNE, Nils. Obtuvieron el Premio Nobel en 1984 (ver punto 3). TONEGAWA, Susumu. Obtuvo el Premio Nobel en 1987 (ver punto 3). DOHERTY, Peter y ZINKERNAGEL, Rolf. Obtuvieron el Premio Nobel en 1996 (ver punto 3). JANEWAY, Charles; MEDZHITOV, Rusian y PRESTON-HURLBURT, Paula. En 1997 (Nature, 388:394-397) comunicaron la existencia en humanos de la protena Toll, homloga a la descrita en Drosophila y que induce respuesta inmune natural y adquirida. Se trata de una protena de transmembrana que presenta un dominio extracelular rico en leucina y otro citoplasmtico homlogo al que presenta el receptor de interleuquina 1 (IL-1R). Ambas protenas transducen seales a travs de NF-kB. Este hallazgo ha significado el primer ejemplo de una conexin a nivel molecular entre el sistema inmune innato y adaptativo. 3. PREMIOS NOBEL Entre 1901 y 1996 veintitrs cientficos han obtenido el Premio Nobel por sus aportes a la inmunologa y temas afines (tabla 2-1). A continuacin se indican algunos antecedentes sobre los Premios Nobel otorgados a cientficos que han hecho aportes significativos en Inmunologa:

1901, Von Behring Emil Von Behring (1854-1917) recibi el primer Premio Nobel en Medicina. Estudi en el Instituto Koch en Berln. Entre 1890 y 1892, junto a sus colaboradores, demostr que la inmunidad contra la difteria y el ttano se basaba en antitoxinas y demostr que la administracin pasiva de sueros antitoxina diftrica y antitoxina tetnica, respectivamente, podan curar estas enfermedades. Cre as una estrategia teraputica que sera usada ms tarde en otras patologas. 1905, Koch Robert Koch (1843-1910), mdico que inicialmente investig sobre el Bacillus anthracis en un pequeo pueblo de Alemania y luego trabaj en el Instituto Koch en Berln. Hizo contribuciones en metodologa de cultivo y aislamiento bacteriano, y public los famosos postulados de Koch para probar la etiologa. Hizo aportes en varias enfermedades pero fueron sus aportes en relacin a tuberculosis: descripcin del Micobacterium tuberculosis y la reaccin de tuberculina (fenmeno de hipersensibilidad retardada), los que le hicieron merecedor del Premio Nobel. 1908, Metchnikoff y Ehrlich Elie Metchnikoff (1845-1916) naci en Rusia y estudi zoologa. En 1884, trabajando en un laboratorio de biologa marina en Italia, realiz las observaciones iniciales sobre clulas fagocticas de estrella de mar, que le permitieron desarrollar la teora de inmunidad celular (fagocitosis; ver captulos 3 y 4). Despus sigui investigando sobre fagocitosis en el Instituto Pasteur en Pars. Paul Ehrlich (1854-1916), naci en Alemania y estudi Medicina. Realiz aportes en las reas de inmunidad, serologa e inmunobiologa. Ehrlich desarroll varias tinciones citoqumicas en tejidos; desarroll las tinciones ms usadas en hematologa para teir las clulas sanguneas. En 1891, siendo asistente de Koch, comenz a realizar estudios inmunolgicos. En 1897 hace su primera contribucin a la inmunologa describiendo un mtodo para estandarizar la preparacin de toxina y anti-toxina diftrica. Ehrlich hizo contribuciones tericas sobre la formacin de anticuerpos; postul la hiptesis de las cadenas laterales. Tambin plante algunos mecanismos en la patogenia de hemlisis inmune. Ms adelante hizo importantes aportes en el tratamiento de tripanosomiasis y sfilis.

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Tabla 2-1. Premios Nobel por investigaciones en Inmunologa Ao 1901 1905 1908 1913 1919 1930 1951 1957 1960 1972 1977 1980 1984 Investigador Emil von Behring Robert Koch Paul Ehrlich Elie Metchnikoff Charles Richet Jules Bordet Karl Landsteiner Max Theiler Daniel Bovet Macfarlane Burnet y Peter Medawar Gerald Edelman y Rodney Porter Rosalyn Yalow Baruj Benacerraf, Jean Dausset y George Snell Niels Jerne Georges Koller y Csar Milstein Susumu Tonegawa Peter Doherty y Rolf Zinkernagel Aporte Teraputica con antisueros Tuberculosis Teoras sobre inmunidad Fagocitosis Mecanismo de la Anafilaxia Accin bactericida del Complemento Grupos sanguneos humanos Vacuna contra la Fiebre amarilla Antihistamnicos Tolerancia inmunolgica Estructura qumica de las inmunoglobulinas Radioinmunoanlisis Inmunogentica e Histocompatibilidad Teora selectiva Red idiotipo/anti-idiotipo Tecnologa del hibridoma Gentica de las inmunoglobulinas Restriccin gentica de la respuesta inmune

1987 1996

1913, Richet Charles Richet (1850-1935). Naci en Pars, Francia y estudi Medicina. Interesado en la fisiologa estudi el efecto del veneno de invertebrados marinos sobre mamferos. Junto a Paul Portier describi la Anafilaxia (ver captulos 21 y 22). As mostr que los mecanismos protectores de la inmunidad tambin podran causar enfermedad. 1919, Bordet Jules Bordet (1870-1960) fue un mdico nacido en Blgica. Siendo joven fue a estudiar con Metchnikoff en el Instituto Pasteur en Pars. Hace importantes contribuciones al entendimiento del mecanismo bactericida mediado por complemento (ver captulo 18). En 1899 describe el fenmeno de hemlisis especfica. Luego, junto a Octave Gengou, describe el fenmeno de fijacin de complemento y sus posibilidades diagnsticas. 1930, Landsteiner Karl Landsteiner (1868-1943), mdico de Viena. En 1901, estudiando anticuerpos antieritrocitarios identific el sistema antignico ABO en los glbulos rojos (ver captulos 4 y 26). Posteriormente, en 1926, con Philip Levine describe el sistema MNP y en 1940 con Alexander Wiener describe el sistema Rh. En otro orden, Landsteiner fue el primero en demostrar que la

poliomielitis se poda producir en primates no humanos y uno de los primeros en hacer la misma observacin en sfilis. Por otra parte, contribuy a entender las bases qumicas de las interacciones antgeno-anticuerpo. 1951, Theiler Max Theiler (1899-1972), naci en Sudfrica, estudi Medicina en Inglaterra y luego viaj a Estados Unidos. Demostr que la Fiebre amarilla era causada por un virus filtrable; luego obtuvo virus atenuados y logr inmunizar contra esta infeccin. Sus estudios permitieron obtener la actual vacuna contra la Fiebre amarilla. 1957, Bovet . Daniel Bovet (1907- ), fisilogo y farmaclogo. Trabaj con Emile Roux en el Instituto Pasteur (Pars) en la respuesta del sistema nervioso autnomo a varios productos qumicos. Se interes en sustancias que pudieran oponerse a la accin de la histamina y desde all surgieron drogas antihistamnicas para el tratamiento de alergias (Asma y Fiebre del heno) (ver captulos 21 y 22). 1960, Burnet y Medawar Macfarlane Burnet (1899-1985), mdico australiano. Alrededor de 1950 Burnet junto con proponer una teora sobre la formacin de

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anticuerpos (teora de la seleccin clonal), postul que la respuesta inmune se desarrolla tardamente durante la vida embrionaria e involucra un sistema de reconocimiento de lo propio y lo extrao. En otras palabras plante que el autorreconocimiento (tolerancia a los antgenos propios) sucede en la vida neonatal por contacto de las clulas formadoras de anticuerpos con nuevos antgenos; cuando el feto sintetiza estas clulas por primera vez. Peter Medawar (1915-1987), inicialmente se interes en la reparacin de tejidos y problemas asociados a los trasplantes. Algunos aos despus comprob la teora postulada por Burnet en experimentos realizados en ratones. 1972, Porter y Edelman Rodney Porter (1917-1985) de la Universidad de Oxford y Gerald Edelman (1929- ) de la Universidad Rockefeller. Recibieron el Premio Nobel por sus trabajos en la estructura qumica de los anticuerpos (inmunoglobulinas). Ambos trabajaron con la misma inmunoglobulina, hoy conocida como IgG, pero cada investigador la trat con diferentes mtodos analticos. Porter emple diferentes enzimas; en 1958, a partir de la molcula IgG purificada, utilizando papana obtuvo dos fragmentos Fab (fragmento que une antgeno) iguales y un fragmento Fc (fragmento cristalizable) (ver captulo 6). Edelman, a partir de IgG de Mieloma Mltiple (ver captulo 27) y utilizando urea (reductor), obtuvo la separacin en cadenas pesadas (H) y livianas (L) (ver captulo 6). Tambin demostr que diferentes anticuerpos de cerdos guinea tenan distinta movilidad electrofortica. Luego Porter y colaboradores demostraron que cada molcula de inmunoglobulina estaba formada por dos cadenas H y dos cadenas L. Posteriormente Porter, Edelman y otros investigadores realizaron la primera secuenciacin aminoacdica parcial de las cadenas de los anticuerpos. En 1969 Edelman y colaboradores realizaron la secuenciacin aminoacdica completa de la molcula de inmunoglobulina, lo que ayud a definir sus diferentes dominios funcionales. 1977, Yalow A comienzos de la dcada del 50, Rosalyn Yalow (1921- ) junto a su colaborador Solomon Berson, estudiaron las causas de la resistencia a la insulina en la diabetes. Demostraron la formacin de anticuerpos anti-insulina; el complejo antgenoanticuerpo lo pudieron medir desarrollando un mtodo inmunorradiomtrico de competencia en que marcaban con un istopo el antgeno. Este mtodo ha servido de base a las tcnicas de radioinmunoanlisis actualmente usadas para la

deteccin de diferentes antgenos en el orden de los nanogramos o picogramos ( ver captulo 40). 1980, Benacerraf, Dausset y Snell Se les otorg el Premio Nobel a Benacerraf, Dausset y Snell por sus trabajos en molculas genticamente determinadas en la superficie celular y que regulan las reacciones inmunolgicas. George Snell (1903-1996) a mediados de la dcada del cuarenta desarroll cepas congnicas de ratones, las que slo se diferencian en un locus gnico. Junto con Peter Gorer, comprobaron que los genes controlan la sntesis del antgeno II, denominado posteriormente H-2; hoy conocido como Complejo Principal de Histocompatibilidad, clase II (MHC-II) (ver captulo 8). Adems demostraron que de estos antgenos depende el xito o el fracaso de los injertos entre ratones congnicos. En los experimentos que condujeron a estos fundamentales hallazgos particip Gustavo Hoecker S, profesor e inmunlogo chileno, y Premio Nacional de Ciencias 1989. Jean Dausset (1916- ), francs, descubri que los pacientes que reciben mltiples transfusiones sanguneas producen isoanticuerpos contra los leucocitos del dador. Dichos anticuerpos reaccionan con los antgenos de superficie de los leucocitos del dador (HLA, human leukocyte antigen) (ver captulo 8) o con el mismo antgeno en los leucocitos de otras personas. Poco despus se relacion la produccin de una respuesta inmune a los HLA con los rechazos de injertos (ver captulo 38). Baruj Benacerraf (1920- ) y colaboradores demostraron que otros genes presentes en el locus del Complejo Principal de Histocompatibilidad, en la regin I, tambin participan en el control de la respuesta inmune. 1984, Milstein, Khler y Jerne Csar Milstein (1927- ) y George Khler (1946-1995) en la dcada del setenta desarrollaron la metodologa para obtener anticuerpos monoclonales (ver captulo 44). Henry Kunkel y colaboradores (1955) mostraron que los mielomas, tumores de clulas plasmticas (ver captulo 27) producan anticuerpos monoclonales; en 1962 Michael Potter mostr que dicho tumor poda ser inducido en ratones y otros mostraron que podan crecer indefinidamente en cultivo. En 1974 Khler inici un postdoctorado en el laboratorio de Milstein en Cambridge; ambos emprendieron la tarea de inmortalizar clulas formadoras de anticuerpo por fusin con clulas de mieloma, con el propsito de estudiar las bases genticas de la diversidad de los anticuerpos. Para ello usaron una lnea celular mutante de mieloma deficiente en la enzima hipoxantina

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fosforibosiltransferasa; clulas que mueren en un medio que contiene hipoxantina, aminoptirina y timidina (medio HAT), pero las clulas hbridas (hibridomas) sobreviven, pudiendo ser seleccionadas. stas sintetizan anticuerpos con una nica especificidad (anticuerpos monoclonales) en forma indefinida. Los anticuerpos monoclonales han sido una poderosa herramienta en el estudio molecular de diversas macromolculas y su aplicacin se realiza tanto en ciencias bsicas como en clnica. Nils Jerne (1912-1994) realiz varias contribuciones a la inmunologa. Principalmente hizo aportes tericos. En 1955 fue el primer cientfico moderno que plante la teora selectiva para la formacin de los anticuerpos, en la cual el antgeno selecciona el anticuerpo a partir de un repertorio preformado. En 1971 postula una hiptesis sobre el desarrollo de especificidades del repertorio de clulas T; dice que el principal estmulo para que los linfocitos se dividan en el timo son los antgenos MHC. En 1974 desarrolla la teora ms importante; predijo que cada molcula de anticuerpo tiene una regin inmunognica especfica llamada marcador idiotpico, que estimulara la formacin de un segundo anticuerpo que reaccionara con ese marcador y as sucesivamente (red idiotipo-anti-idiotipo), pudiendo representar uno de los principales mecanismos reguladores de la respuesta inmune (ver captulo 14). 1987, Tonegawa Susumu Tonegawa (1939- ) recibi el Premio Nobel por sus trabajos en biologa molecular de los genes de inmunoglobulinas, mostrando cmo se genera la diversidad de las inmunoglobulinas. En 1965 Dreyer y Bennett propusieron que podra ser necesario menos DNA para codificar las diferentes especificidades de las inmunoglobulinas si mltiples genes para regiones variables (V) se combinaban con un nico gen para regin constante (C) (ver captulo 6). En 1976 Tonegawa y Hozumi confirmaron la hiptesis de Dreyer y Bannett; demostraron que en el DNA embrionario los segmentos gnicos V y C estaban separados. Luego Tonegawa, Gilbert y Maxam mostraron, en diferentes clulas, que estos dos genes estaban an separados por DNA no codificante (intron). Ms adelante, Tonegawa y Philip Leder, encontraron que la secuencia amininoacdica de la regin V de la cadena L tena ms aminocidos que los codificados por los segmentos gnicos V. Tonegawa y colaboradores pronto encontraron el segmento restante que llamaron J (joining, unin). Posteriormente Tonegawa y Leroy Hood describieron que en el caso de la regin variable de las cadenas H, inter-

vena otro segmento gnico adicional a V y J que denominaron D (diversity, diversidad) (ver captulo 6). Los trabajos de Tonegawa han tenido repercusin en el conocimiento de la variabilidad gentica de los receptores de linfocitos T (TCR). 1996, Doherty y Zinkernagel A Peter Doherty (1940- ) y Rolf Zinkernagel (1944- ) se les otorg el Premio Nobel por la demostracin de la restriccin MHC en el reconocimiento de antgenos virales sobre clulas infectadas, por parte de los linfocitos T citotxicos. En la dcada del setenta Doherty y Zinkernagel realizaron experimentos en un sistema in vitro que permita medir la capacidad de clulas efectoras de destruir clulas blanco infectadas por virus; utilizaron el virus de la coriomeningitis linfoctica (LCMV) que infecta ratones. Cuando los dos tipos celulares (linfocito T citotxico y clula blanco) pertenecan a la misma cepa de ratn, la muerte fue eficiente. En cambio cuando ambas clulas pertenecan a ratones con diferente haplotipo MHC, la destruccin de las clulas blanco generalmente no ocurre. Ellos concluyeron que la clula efectora deba reconocer dos seales sobre la clula infectada, una derivada del virus y otra de las molculas MHC presentes en la clula blanco (ver captulo 9) LECTURAS SUGERIDAS Barret, J., Inmunologa mdica, Captulo 1, Quinta edicin, Ed. Interamericana, Mxico, 1990. Hoecker, G., Los Complejos Mayores de Histocompatibilidad, Universum, ao 9:61-72, 1994. Silverstein, A., A history of Immunology, Appendix B and appendix C, Ed. Academic Press Inc., California, 1988. Silverstein, A., The history of Inmunology en Fundamental Immunology, Chapter 2, Ed. Paul W., Leppincott-Raven, Publisher, 1999. Stites, D. and Terr, A., Basic and Clinical Inmunology, Chapter 1, Seventh edition, Ed. Appleton & Lange, USA, 1991.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 3
CLULAS Y RGANOS DEL SISTEMA INMUNE
Ivn Palomo G., Jaime Pereira G. y Cecilia Koenig S.

1. Introduccin 2. Clulas del sistema inmune 2.1. Hematopoyesis 2.2. Linfocitos 2.3. Sistema fagoctico mononuclear 2.3.1. Monocitos 2.3.2. Macrfagos 2.3.3. Clulas dendrticas 2.4. Granulocitos 2.4.1. Neutrfilos 2.4.2. Eosinfilos 2.4.3. Basfilos 3. rganos linfoides 3.1 rganos linfoides primarios 3.1.1. Mdula sea 3.1.2. Timo 3.2. rganos linfoides secundarios 3.2.1. Ganglios linfticos 3.2.2. Bazo 3.2.3. Tejido linfoide asociado a mucosa 4. Trnsito linfocitario

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RESUMEN Las clulas del sistema inmune que incluyen linfocitos, granulocitos y monocitosmacrfagos, se forman en la mdula sea a partir de clulas pluripotentes, a travs de un proceso finamente regulado y en el que participan varias citoquinas. Los linfocitos son las clulas que participan en la inmunidad adquirida o especfica. Las clulas T participan en la inmunidad celular y las clulas B en la inmunidad humoral. Una tercera subpoblacin de linfocitos, las clulas NK, participan en la inmunidad celular de tipo innata. Las clulas del Sistema Fagoctico Mononuclear (monocitos, macrfagos y clulas dendrticas) tienen como funcin fagocitar, actividad ms desarrollada en los macrfagos, que son clulas tisulares derivadas de los monocitos circulantes. Los granulocitos (neutrfilos, eosinfilos y basfilos) presentan particularidades morfolgicas y funcionales. La principal funcin de los neutrfilos es su capacidad fagoctica. En el captulo se explican los procesos de activacin, quimiotaxis, fagocitosis y bacteriolisis. Los rganos linfoides se pueden clasificar en primarios (timo y mdula sea) y secundarios (bazo, ganglios linfticos y tejido linfoide asociado a mucosas). En el timo maduran los LT y en la mdula sea los LB. En los rganos linfoides secundarios, los linfocitos toman contacto con los antgenos y es en ellos donde se genera la respuesta inmune especfica (clulas efectoras y de memoria). En estos rganos existen zonas ricas en clulas B, y otras en que, principalmente, existen clulas T. La capacidad de los linfocitos de recircular entre los rganos linfoides secundarios, vasos linfticos, conducto torcico y vasos sanguneos le permiten tomar contacto con antgenos en diferentes lugares del organismo.

1. INTRODUCCIN El sistema inmune humano, y de los vertebrados en general, consiste en varios rganos y diferentes tipos de clulas, que le permiten al organismo distinguir lo propio y eliminar lo extrao. En este captulo se revisan los aspectos fundamentales de las clulas del Sistema Inmune, que participan en la inmunidad especfica e inespecfica (ver captulo 4), y los rganos que componen este sistema, tanto los que participan en la produccin y maduracin celular, como los que sirven para encuentro de las clulas del sistema inmune con los antgenos. 2. CLULAS DEL SISTEMA INMUNE Las clulas del sistema inmune incluyen linfocitos y diferentes clulas fagocticas, organizadas en los tejidos linfoides. Las clulas del sistema inmune derivan de clulas pluripotentes de

la mdula sea, rgano en que ocurre la hematopoyesis, proceso por el cual se forman, diferencian y maduran las clulas sanguneas. 2.1. Hematopoyesis En el feto la hematopoyesis ocurre en el hgado y en el bazo. A partir del nacimiento se suspende este proceso en esos rganos y se incrementa en la mdula sea, sitio donde haba comenzado en los ltimos meses de gestacin. En la mdula sea tres aspectos son importantes a considerar: (a) la estructura anatmica (ver punto 3.2.1): disposicin tridimensional de vasos sanguneos y diferentes tipos celulares; (b) el estroma: incluye varios tipos celulares, (fibroblastos, adipocitos, macrfagos, linfocitos y clulas endoteliales de los sinusoides) y macromolculas de la matriz extracelular (colgeno, fibronectina, laminina, hemonectina, tenascina, trombospondina y proteoglicanos). En la mdula sea las clulas hemato-

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poyticas se distribuyen en tres compartimientos morfo-funcionales: (a) compartimiento de clulas madres, (b) compartimiento mittico o de divisin y (c) compartimiento de maduracin almacenamiento (figura 3-1).

eritroblstica se reconocen las etapas, proeritroblasto, eritroblasto basfilo, eritroblasto poliromatfilo, eritroblasto ortocromtico, reticulocito y glbulo rojo. En la lnea linfoide, a partir de la CFU-L, despus de un proceso de di-

Figura 3-1. Compartimientos celulares en la mdula sea. Se distinguen 3 compartimientos morfo-funcionales: de clulas madres (stem cells), mittico y de maduracin almacenaje. En la figura, los dos ltimos compartimientos ejemplifican la serie granultica, representndose el tamao relativo de los diferentes compartimientos.

Las clulas del compartimiento stem cell (de clulas madres) corresponden a menos del 1% de las clulas de la mdula. No son identificables morfolgicamente, por lo que deben ser estudiadas en cultivos in vitro. La stem cell o clula madre pluripotente, tambin denominada CFUML (Unidad formadora de colonias mieloides y linfoides) tiene la capacidad de dividirse y autoperpetuarse. Da origen a dos lneas celulares principales, mieloide y linfoide (figura 3-2). En la lnea mieloide, a partir de la CFU-GEMM (granuloctica, eritroide, monoctica y megacarioctica) se producen dos diferentes CFU encomendadas, CFU-GM (granulocito, monocito) y CFU-MegE (megacariocito, eritroide); posteriormente se generan las CFU-G, CFU-M, CFU-E, CFU-Meg. En el compartimiento mittico, a partir de las CFU de las lneas celulares especficas antes mencionadas, se generan las primeras clulas reconocibles morfolgicamente de cada lnea celular: mieloblasto en el caso de los granulocitos, que posteriormente madurar a promielocito y luego a mielocito etapa en la cual se diferencian las tres lneas especficas de los granulocitos (neutrfilos, eosinfilos y basfilos); las etapas posteriores de maduracin de los granulocitos corresponden a juveniles, baciliformes y segmentados. Por su parte, la serie monoctica madura en las etapas de monoblasto y monocito. De la CFU-Meg, la lnea megacarioctica se reconoce las etapas de megacarioblasto, megacariocito y plaquetas; por su parte en la serie

ferenciacin y maduracin se originan los linfocitos T y linfocitos B. En el proceso de diferenciacin y maduracin de las diferentes lneas celulares, participan varios factores de maduracin y citoquinas secretadas por clulas del estroma (ver captulo 11). Existen factores que actan sobre progenitores de multilinaje: Kit ligand, GMCSF (CSF: Factor estimulador de colonias), G-CSF, interleuquina (IL)-3, IL-4, IL-6, IL-11, IL-12, Flt3 ligand, Factor inhibidor de leucemia (LIF), Oncostatin (OSM). Algunos de estos factores participan tambin en la maduracin de algunas lneas celulares en particular. Entre los factores de maduracin de los granulocitos y monocitos, se reconocen a GM-CSF; G-CSF favorece la maduracin a neutrfilos, M-CSF a monocitos, IL-5 a eosinfilos y Kit ligand a basfilos. Por su parte, el regulador fisiolgico de la maduracin eritroide es la eritropoyetina (EPO) y de los megacariocitos la trombopoyetina (TPO) tambin denominada mpl-ligand. Kit ligand tambin parece tener participacin en la maduracin eritroide. En la lnea linfoide B, que a diferencia de los linfocitos T, maduran en la mdula sea, el factor de maduracin es la IL-7. Las clulas de las diferentes lneas hematopoyticas presentan receptores para los factores de maduracin antes nombrados. En la tabla 3-1 se resumen los principales factores maduracin hematopoyticos y sus receptores.

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Figura 3-2. Esquema de la Hematopoyesis. La clula madre pluripotencial autoperpetuable, da origen a una clula pluripotencial, tambin denominada CFU-ML (Unidad formadora de colonias mieloides y linfoides), de la que se originan: a) el progenitor mieloide (CFU-GEMM), a partir del cual por procesos de maduracin y diferenciacin se originan los granulocitos (neutrfilos, eosinfilos y basfilos), monocitos, eritrocitos y plaquetas; y b) el progenitor linfoide (CFU-L), que despus de un proceso de maduracin y diferenciacin, da origen a los linfocitos T y linfocitos B. Se muestra los puntos de accin de las citoquinas (IL-1, IL3, IL-6 e IL-7) y factores estimuladores de colonias (CSF) especficos, que participan como factores reguladores de la granulopoyesis y linfopoyesis. EPO, eritropoyetina; TPO, trombopoyetina.

Tabla 3-1. Factores de maduracin hematopoyticos y sus receptores Factor Eritropoyetina (EPO) Kit ligand (KL) Interleuquina-1, etc. (IL-1, etc.) Factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) Factor estimulador de colonias de granulocitosmacrfago (GM-CSF) Factor estimulador de colonias de monocito-macrfago (M-CSF, CSF-1) Interfern (IFN) , , Trombopoyetina (TPO, mpl, ligand) Factor inhibidor de leucemia (LIF) Oncostatin M (OSM) Factor de crecimiento transformante (TGF-) Factor de crecimiento tipo insulina (IGF-1) Flt-3 ligand (FL) Flk-1 ligand Receptor EPOR Kit IL-1 receptor G-CSF receptor G-CSF receptor CSF-1R IFN-, , receptor mpl LIF receptor OSM receptor EGF receptor IGF-1R Flt-3, STK Flk-1

2.2. Linfocitos Los linfocitos, junto con las clulas presentadoras de antgeno (CPA) son la base celular de la respuesta inmune especfica. Actualmente los linfocitos son uno de los tipos de clulas mejor estudiadas. Dado que una parte importante del libro trata sobre la inmunidad especfica y, por lo

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tanto, sobre la ontogenia y funcin de las diferentes subpoblaciones de linfocito, en este captulo el tema ser tratado slo en sus aspectos generales. Caractersticas generales Los linfocitos constituyen aproximadamente el 20-25% de los leucocitos circulantes en el adulto (tabla 3-2). Desde el punto de vista morfolgico, en frotis sanguneo teido con May Grnwald-Giemsa se distinguen dos tipos: los linfocitos pequeos (7-9 m) que presentan una relacin ncleo/citoplasma alta y representan la mayora, y los linfocitos grandes (11-20 m), que presentan citoplasma ms abundante (figura 3-3). El ncleo generalmente es redondo u oval y compuesto predominantemente de heterocromatina. Los nuclolos pueden no observarse con tincin de May Grnwald-Giemsa. En los linfocitos grandes puede observarse grnulos citoplasmticos (linfocitos granulares grandes).

Los denominados "linfocitos activados" corresponden a linfocitos asociados a una respuesta inmune. Estos linfocitos estimulados antignicamente se caracterizan por presentar citoplasma abundante, hiperbasfilo (azul intenso) y de bordes irregulares. A la microcospa electrnica de barrido, los linfocitos en reposo presentan una superficie lisa; que se hace irregular (velluda) al estar activados. Los linfocitos, al igual que otros leucocitos, se pueden movilizar. Inicialmente se forma un pseudpodo que rodea la clula y al contraerse empuja el ncleo hacia delante quedando una cola citoplasmtica llamada urpodo (ura: cola, podi: pie), presentando la clula un aspecto de espejo de mano o pera. La velocidad es de aproximadamente 20 m/minuto, la que aumenta cuando la clula es estimulada. El urpodo, adems de permitir el movimiento facilita las interacciones con otras clulas (linfocitos, macrfagos), etc. Los linfocitos adems de presentar diferen-

Tabla 3-2. Leucocitos normales en sangre perifrica del humano adulto normal Tipo de clula Leucocitos (totales) Neutrfilos Eosinfilos Basfilos Monocitos Linfocitos % Nmero absoluto (/L) 4 - 10 x103 2 - 7 x103 0 - 0,4 x103 0,1 - 1 x103 0,2 - 0,8 x103 1,5 - 3,5 x103 cias morfolgicas son un grupo heterogneo estructural y funcionalmente. Se dividen en tres grupos funcionales diferentes: los linfocitos T (LT) que participan en la inmunidad adquirida de tipo celular, los linfocitos B (LB) que participan en la inmunidad adquirida de tipo humoral y las clulas NK ("Natural Killer") que no expresan marcadores de clulas T ni clulas B y que participan en la inmunidad natural o innata. Las clulas T y B, originadas a partir de la CFU-L en la mdula sea (figura 3-2), experimentan un proceso de maduracin y diferenciacin en el timo y mdula sea (tejido bolsa equivalente en el humano). La mayor parte de los linfocitos que se encuentran en la sangre, linfa, ganglio linftico y timo son linfocitos T, en cambio un mayor porcentaje de los linfocitos presentes en la mdula sea son linfocitos B; en el bazo y amgdalas el porcentaje de ambas subpoblaciones es similar.

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Figura 3-3. Esquema de estructura subcelular de un linfocito pequeo. En el frotis de sangre teido con May Grnwald - Giemsa los linfocitos pequeos presentan un dimetro similar a los glbulos rojos (7-9 mm). A la microscopa electrnica se observa nuclolo y un pequeo aparato de Golgi. Adems, en su escaso citoplasma presenta algunos ribosomas y un pequeo retculo endoplsmico y escasos grnulos.

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Las clulas plasmticas generalmente presentan forma ovalada. Corresponden a las clulas efectoras de la lnea linfoide B (productoras de inmunoglobulinas). El ncleo, con una distribucin radial de la heterocromatina, est ubicado excntricamente y el citoplasma presenta una gran cantidad de retculo endoplsmico rugoso que le otorga la intensa basofilia que le caracteriza al ser teidas estas clulas con May Grnwald - Giemsa. A nivel perinuclear presenta un desarrollado aparato de Golgi (figura 3-4).

subpoblaciones de clulas T "helper": LTh1 y LTh2. Los LTh1 secretan IL-2, IFN-, IL-3 y estimulan la inmunidad mediada por clulas; los LTh2 secretan IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 y favorecen la respuesta inmune humoral. Por su parte, los linfocitos B se reconocen por la expresin en su membrana de inmunoglobulinas IgM y en algunos casos IgD. Adems son CD19+, CD20+, CD22+ y tambin expresan molculas MHC clase II. Las clulas NK presentan los siguientes marcadores: FcRIII (CD16), CD56 y CD57.

Diferenciacin de linfocitos Los linfocitos se generan a partir de la CFUL de la mdula sea (ver punto 2.1) que presenta desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) en el ncleo y expresa CD34, C-Kit y HLA-DR (tipo de molcula MHC clase II en humanos) en la membrana celular. La lnea linfoide B madura en la propia mdula sea y la lnea linfoide T en el timo. En ambos casos la maduracin implica una etapa independiente de antgeno, que ocurre en la mdula sea (lnea B) y en el timo (lnea T), y una etapa dependiente de antgeno que en ambas lneas celulares ocurre en los rganos linfoides secundarios (ver punto 3.2). La maduracin de las clulas B se puede separar en dos estadios previos al LB maduro: Pro-B en que las clulas son TdT+, CD10+, CD19+, CD24+, CD34+, CD38+ y HLADr+ y Pre-B se caracterizan por ser TdT+, CD10+, CD19+, CD20+, CD24+, CD38+ y cadenas citoplasmticas + (de IgM; ver captulo 6). Las clulas B maduras presentan el siguiente Inmunofenotipo: CD19, CD20, CD21, CD22, CD24, CD38, IgM, IgD (no siempre) y FcR. Las etapas finales de diferenciacin de los LB tienen lugar en periferia, en algn rgano linfoide secundario (ver punto 3.2) y son antgeno dependientes. En el punto siguiente se explica muy brevemente el proceso de activacin linfocitaria que ocurre como consecuencia de la interaccin, en este caso, entre IgM o IgD de membrana de un LB y el antgeno respectivo. Los LB vrgenes expresan en su membrana IgM y IgD y son CD10-, CD23-, CD38- y CD77-; de tomar contacto con el antgeno expresa CD23. Luego, como clula precursora del centro germinal en los folculos linfoides (ver punto 3.2) el fenotipo que le caracteriza es IgM+, e IgD+, CD10+, CD23-, CD38+ y CD77- (figura 3-5). Posteriormente en la zona oscura del centro germinal, las clulas

Figura 3-4. Esquema de la estructura subcelular de una clula plasmtica. Las clulas plasmticas presentan un dimetro de 10-25 mm. Se ubican principalmente en los rganos linfoides secundarios y muy raramente en sangre perifrica.

En el estudio hematolgico de rutina de los linfocitos sanguneos slo se utiliza la tincin de May-Grnwald-Giemsa, metodologa que no permite conocer la lnea celular de los linfocitos. En caso de requerirse dicha informacin, como es el caso de diagnstico diferencial de leucemias, se puede recurrir a tinciones citoqumicas que identifican la presencia o ausencia de ciertas enzimas y otras molculas en el citoplasma de los linfocitos. Ms recientemente se utiliza citometra de flujo para identificar las subpoblaciones de linfocitos (ver captulo 43). Al respecto, el uso de anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromos permite identificar marcadores de superficie designados con el sistema CD ("cluster designation") a modo de ejemplo se muestran algunos en la (tabla 3-3) (ver captulo 45). De esta forma se reconoce como marcadores de las clulas T al complejo CD3 y a las dos subpoblaciones ms importantes de esta lnea celular se les identifica por ser CD4+ (LT "helper") o CD8+ (LT citotxicos). Basndose en el patrn de secrecin de citoquinas, se reconocen dos

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Tabla 3-3. Molculas CD asociadas a linfocitos CD Sinnimo Expresin clula LT, clulas NK LT LT "helper" LT y timocitos LT citotxicos LT inmaduros Granulocitos, monocitos, NK Granulocitos, macrfagos, clulas NK Clulas B Pre-B y LB LB LB maduros LB activados LT, LB, macrfagos Activados LT citotxicos Amplia Granulocitos, monocitos, eritrocitos LB LB Amplia Amplia NK, algunos LT NK, algunos LT Funcin(es)

CD2 CD3 CD4 CD7 CD8 CD10 CD11b CD16 CD19 CD20 CD21 CD22 CD23 CD25 CD28 CD29 CD35 CD40 CD54 CD55 CD56 CD57

LFA-2

CAM Transduccin de seales Adhesin, transduccin de seales Adhesin, transduccin de seales CAM. Con CD18 forma Mac-1 Receptor de iC3b Receptor de baja afinidad para IgG Regulacin de activacin Regulacin de activacin? Receptor de C3d y virus de Epstein Barr Ligando de CD23 CAM Receptor de IgE de afinidad intermedia Con cadena 70 KDa forma receptor alta afinidad IL-2 CAM con CDw49a,b,c,d,e,f Receptor de C3b Une CD40-L. Activacin de LB. CAM Regulador del complemento

CALLA CR3 () FcRIII

FcRIIa Receptor de IL-2 baja afininidad VLA () CR1

ICAM-1 DAF

CD, "cluster designation"; CAM, molcula de adhesin celular; LB, linfocitos B; LT, linfocitos T; LFA, antgeno asociado a funcin de linfocito; ICAM, molcula de adhesin intercelular; VLA, antgeno muy tardo; DAF, "Decay Accelerating factor"; NK, clulas "Natural Killer".

(centroblastos) son IgM+, IgD- CD10+, CD23-, CD38+ y CD77-; luego en la zona clara del mismo centro las clulas (centrocitos) presentan el siguiente fenotipo; IgG+ o IgM+ o IgE+, CD10+, CD23-, CD38+ y CD77-. Durante la etapa de precursor del centro germinal y centroblasto ocurre el fenmeno de mutacin somtica y entre la etapa de centroblasto y de centrocito se produce el fenmeno de cambio de clase (ver captulo 6). La ltima etapa es en la que se generan clulas plasmticas (IgG+ o IgA+ o IgE+, CD10-, CD23-, CD38+ y CD77-) y clulas de memoria (IgG+ o IgA+ o IgE+, CD10-, CD23-, CD38- y CD77-). Por otra parte, se distinguen dos

subpoblaciones de clulas B, LB1 y LB2: Entre otros aspectos la subpoblacin B1 presenta receptores BcR polirreactivos de baja afinidad y se encuentra mayoritariamente en el peritoneo y en el bazo. La subpoblacin B2, constituye la mayor parte del repertorio linfocitario B y se encuentra fundamentalmente en los rganos linfoides secundarios y en la sangre (ver captulo 6). La mayora de los linfocitos B1 se caracteriza por la expresin del marcador CD5 (glicoprotena monomrica de 67 kDa, propia de linfocitos T) y aunque su funcin es todava un misterio, se ha sugerido que la activacin de estas clulas conduce a la produccin de anticuerpos que

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Figura 3-5. Maduracin de los linfocitos B en el centro germinal de los folculos linfticos. Los LB vrgenes toman contacto con el antgeno en la zona oscura del centro germinal (del folculo linfoide). En esta zona ocurre la expansin clonal y mutacin somtica. Luego en la zona clara del centro germinal se produce el cambio de clase, y se generan clulas B de memoria (recirculan) y clulas plasmticas (algunas migran a la mdula sea). CDF, clula dendrtica folicular.

proporcionan proteccin contra infecciones bacterianas durante la vida fetal, mucho antes que el repertorio linfocitario de .la respuesta inmune adquirida sea completamente funcional. Adems, en el repertorio adulto, los linfocitos B1 dan origen a clulas plasmticas que secretan IgM y a una fraccin importante de clulas plasmticas productoras de IgA en el intestino. De hecho, la transferencia pasiva de linfocitos peritoneales B1 en ratones Scid (que sufren de una severa inmunodeficiencia combinada), reconstituye la produccin de IgA contra muchas bacterias intestinales. Por otro lado la transferencia pasiva de clulas de hgado fetal o del omentum intestinal, a ratones irradiados, rpidamente reconstituye la subpoblacin B1, mientras la transferencia de de precursores de mdula sea adulta reconstituye la subpoblacin B2 pero no la B1. En el repertorio linfocitario adulto, los linfocitos B 1 son bastante frecuentes en la poblacin B que sufre neoplasias y en aqullos que reconocen una gran variedad de autoantgenos y reaccionan cruzadamente con antgenos bactarianos como polisacridos y lipopolisacridos. El repertorio de receptores BcR es bastante ms limitado en los linfocitos B1 que en los linfocitos B2, sus reordenamientos gnicos VH son ms restringidos, y, como no expresan la enzima TdT (Terminal deoxinucleotidil Transferasa), carecen de regiones N en las uniones VDJ.

Por su parte, la maduracin de las clulas T se puede separar tambin en dos estadios previos al LT maduro: Pro-T que son TdT+, HLA-DR+, CD1+, CD2+, CD5+, CD7+, C-kit+ y CD3 citoplasmtico +, y Pre-T que son TdT+, CD1+, CD4+, CD5+, CD7+, CD8+, CD3 citoplasmtico + (ver captulo 7). Las clulas T maduras presentan el siguiente inmunofenotipo: CD2+, CD3+, CD4+ CD8+, CD7+, TCR+ (ver captulo 7). Por otra parte, en base al diferente patrn de secresin de citoquinas, se distinguen dos subpoblaciones de clulas T helper (CD4+), LTh1 y LTh2 (ver captulos 11 y 14). Mayores antecedentes sobre la diferenciacin de los linfocitos B y T, sern descritos en el captulo 13. Reconocimiento antignico Los LB y LT presentan receptores para antgenos especficos, como son la IgM de membrana que forma parte del BCR (Receptor de clulas B) y el TCR (Receptor de clulas T), respectivamente (ver captulos 6 y 7). Adems de presentar un receptor diferente, las clulas B y clulas T reconocen el antgeno en diferente forma; en el caso de los LB las IgM de membrana reconocen el antgeno directamente, sin intervencin de otra clula, en cambio en el caso de los LT los TCR reconocen pptidos extraos que son presentados por otra clula, unidos a mo-

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lculas MHC, clase I si se trata de LTc y clase II si es LTh. Estos pptidos se originan durante el procesamiento del antgeno en clulas blanco (cuando son presentados en molculas MHC clase I), y en las denominadas clulas presentadoras de antgeno (cuando son presentados en molculas MHC clase II). En el captulo 9 se explica en detalle el procesamiento de los antgenos a travs de dos vas diferentes (endgena y exgena) segn los pptidos sean presentados a LTc o LTh. Adems se explica el concepto de restriccin MHC. Las clulas NK, que no expresan inmunoglobulinas ni TCR, poseen dos tipos de receptores: de activacin (KAR: "Killer Activating Receptor") y de inhibicin (KIR: "Killer Inhibition Receptor"). Los KAR reconocen patrones moleculares hidrocarbonados caractersticos de microorganismos y los KIR reconocen molculas MHC propias en otras clulas; si stas son propias transducen seales de inhibicin de los mecanismos de citoxicidad (ver captulo 19). Activacin de los linfocitos La unin del antgeno con el receptor especfico de una clula T o B activa al linfocito mediante un delicado proceso bioqumico que implica transduccin de seales al interior de la clula, generacin de segundos mensajeros (IP3, DAG, Ca2+) y fosforilacin de protenas (ver captulo 10). Protenas fosforiladas, se unen a secuencias reguladoras de genes que participan en la activacin de los linfocitos. Como consecuencia de la activacin, el linfocito sufre un proceso denominado transformacin blstica que implica una serie de cambios estructurales y bioqumicos que terminan en la formacin de una clula grande, de citoplasma basfilo (por aumento de retculo endoplsmico), ncleo laxo, semejante a un linfoblasto. La activacin linfocitaria produce una amplificacin clonal (etapa de proliferacin de clulas con la misma especificidad antignica), posteriormente ocurre una produccin de clulas efectoras, responsables de la sntesis de anticuerpos (clulas plasmticas) y de la inmunidad mediada por clulas (LT CD4+ y LT CD8+) y clulas de memoria (estas dos ltimas como parte de la etapa de maduracin) (figura 3-6).

Figura 3-6. Esquema de la seleccin clonal de las clulas B y clulas T. Luego que un antgeno interacciona con la clula T y/o B que posee el receptor que le es especfico, el linfocito es activado, sufriendo una transformacin blstica. La activacin linfocitaria lleva a una proliferacin clonal y diferenciacin celular con produccin de clulas efectoras y de memoria, tanto en la lnea celular B como T.

2.3. Sistema fagoctico mononuclear Dada su relacin ontognica, y sus caractersticas estructurales y funcionales, a los monocitos y macrfagos se les agrupa en el denominado Sistema fagoctico mononuclear (SFM), antes llamado sistema retculo endotelial. Se describir en este punto a las clulas dendrticas (DC, Dendritic Cells) por su origen comn, aunque no son principalmente fagocticas. Estas clulas presentan un amplio espectro de funciones: (a) remocin de clulas muertas, senescentes, extraas, y alteradas; (b) regulacin de la funcin de otras clulas; (c) procesamiento y presentacin de antgenos; (d) participacin en reacciones inflamatorias; (e) destruccin de microorganismos y (f) destruccin de clulas neoplsicas. 2.3.1. Monocitos Los monocitos presentan un dimetro de 1215 m (figura 3-7) y representan un 4-10% de los

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leucocitos sanguneos (tabla 3-2). En su citoplasma tienen grnulos azurfilos o primarios que contienen hidrolasas cidas, que junto con los mecanismos oxidativos, participan en la destruccin de las partculas fagocitadas; al respecto es vlido lo descrito antes para los neutrfilos.

(testculo, ovario, tero, oviductos), hueso (osteoclastos) e intestino. Tambin se encuentran en la leche materna. Receptores de fagocitos mononucleares Los macrfagos y monocitos presentan una gama importante de receptores: para regin Fc inmunoglobulinas, complemento, lipoprotenas, citoquinas y factores quimiotcticos, entre otras molculas (tabla 3-4). Las Molculas de Adhesin Celular (CAM) participan en las uniones clula-clula y clulamatriz. En los monocitos y macrfagos, entre otras molculas de adhesin se han descrito las molculas LFA1 (CD11a/CD18), Mac-1 (CD11b/ CD18) y p150,95 o CR1(CD11c/CD18) de la familia integrinas y las molculas CD2 e ICAM-1 (CD54) de la superfamilia de las inmunoglobulinas (SFIg) (ver captulo 12). 2.3.2. Macrfagos Los macrfagos pueden ser residentes (fijos en tejidos) o libres. Entre los primeros destacan: a) Macrfagos intestinales. Los macrfagos se encuentran principalmente en la lmina propia del tracto gastrointestinal. Las reas corticales ricas en linfocitos asociados a intestino (GAL) y las placas de Peyer contienen muy pocos macrfagos. Respecto a su funcin podran participar en la presentacin antignica, en la fagocitosis de bacterias y clulas muertas. b) Macrfagos del hgado. Las clulas de Kupffer se ubican en las paredes vasculares de los sinusoides hepticos. Pueden fagocitar un espectro amplio de clulas y partculas, entre ellos, liposomas, bacterias, parsitos, virus, glbulos rojos y plaquetas opsonizadas con IgG y/o complemento. c) Macrfagos cerebrales. Estos macrfagos son llamados clulas microgliales. La funcin de estos macrfagos no es bien conocida, posiblemente participan en la induccin de la respuesta inmune y probablemente modulen la funcin neuronal. d) Macrfagos peritoneales. stos se encuentran entre los macrfagos de serosas; tienen capacidad para destruir clulas neoplsicas y bacterias. En casos de peritonitis o ascitis

Figura 3-7. Esquema de la estructura subcelular de monocitos y macrfagos. Los monocitos son precursores sanguneos de los macrfagos tisulares. Ambos tipos de clulas presentan un ncleo excntrico arrionado. En la indentacin presentan el aparato de Golgi. Ambos poseen escasa cantidad de retculo endoplsmico rugoso y las mitocondrias estn distribuidas en el citoplasma. Los macrfagos son de mayor tamao que los monocitos y presentan diferente forma y funciones segn el tejido en que estn ubicados. En los macrfagos es posible observar microfilamentos, liposomas, gotas de grasa y vesculas endocticas conteniendo molculas solubles y partculas de distintos tamaos que han sido internalizadas.

Despus de salir de la mdula sea los monocitos circulan aproximadamente 8 horas; al igual que los neutrfilos, en la sangre se reconocen dos compartimentos, circulante y marginal; luego pasan a los tejidos donde se transforman en macrfagos. En relacin a los monocitos los macrfagos son de mayor tamao y presentan mayor capacidad fagoctica y microbicida. Pueden permanecer vivos entre algunos meses y aos. Se encuentran en varios rganos, destacando su presencia en el hgado (clulas de Kupffer), riones, pulmones (macrfagos alveolares e intersticiales), serosas (peritoneal y plural) bazo, ganglios linfticos, cerebro, aparato reproductivo

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Tabla 3-4. Receptores de macrfagos y monocitos Receptores de Inmunoglobulinas FcRI (CD64) FcRII (CD32): A, B y C FcRIII (CD16): A y B FcRI FcRI FcRII (CD23): A y B FcR Receptores del Complemento CR1 (CD35) CR3 (CD11b/CD18) Receptores de Citoquinas TNF-R IL-1R M-CSFR IFNR Receptores de factores quimiotcticos De pptidos formilados De quimioquinas De C5a Receptor de lipopolisacrido (CD14) Receptores de lipoprotenas LDL-R Receptor scavenger (de LDL modificada) Receptores de hormonas De Glucocorticoides De Insulina De Estrgenos Otras hormonas Receptor de transferrina Receptor de lactoferrina Receptor de fibronectina

maligna aumenta el nmero de macrfagos. Macrfagos de rganos reproductivos. Los testculos contienen un gran nmero de macrfagos. Pueden participar en la fagocitosis de espermios moribundos no eyaculados y en la destruccin de microorganismos. En los ovarios los macrfagos pueden participar en la fagocitosis de clulas degenerativas del cuerpo lteo. f) Macrfagos del hueso. Los osteoclastos se encargan de la resorcin sea. g) Macrfagos del tejido conjuntivo: Histiocitos. h) Macrfagos renales. Cluas mesangilales de los glomrulos renales e) Los macrfagos libres estn situados en r-

ganos linfoides secundarios; all atrapan material extrao: macrfagos de los sinusoides esplnicos y de los senos medulares en los ganglios linfticos. Los macrfagos tienen una vida vida media mucho ms larga que los neutrfilos en los tejidos (meses e incluso aos). Una subpoblacin de los monocitos y macrfagos, expresa en su superficie molculas de clase II del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC), que participan en la presentacin del antgeno a los linfocitos T "helper" (LTh) (ver captulos 8 y 9). Por otra parte, sintetizan y secretan citoquinas como Interfern (IFN) y , IL-1 y Factor de necrosis tumoral (TNF).

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2.3.3. Clulas dendrticas Junto a los monocitos y macrfagos las DC son clulas presentadoras de antgeno, pero este ltimo tipo celular es el que presenta una mayor capacidad, siendo muy eficiente en el inicio y modulacin de la respuesta inmune. Morfolgicamente se caracterizan porque del cuerpo celular salen prolongaciones alargadas. Durante su maduracin sufren una serie de cambios inmunolgico-funcionales que les permiten una mayor adaptacin a las circunstancias, as consiguen una mayor especializacin en sus funciones de activacin de linfocitos T. Se ha demostrado la existencia de distintas lneas de DC, con diferentes estadios madurativos y vas de migracin, lo que implica una distribucin anatmica diferente. A partir de la clula pluripotencial CD34+ y en presencia de GM-CSF y TNF se diferencia en: (a) CD1+, CD14-, de las que se originan las clulas de Langerhans (DC de la piel) y (b) CD1-, CD14+ que dan origen a las DC mieloides. Las clulas de Langerhans se trasladan hacia tejidos no vascularizados como la epidermis en la piel, y las DC mieloides lo hacen hacia zonas vascularizadas, localizndose en los intersticios (DC intersticiales). Una vez que las clulas de Langerhans han incorporado el antgeno en la piel, migran por la linfa hacia los ganglios linfticos donde lo presentan a las LT; las DC intersticiales, por su parte, migran hacia el bazo a travs de la sangre. Segn su distribucin las DC se clasifican en: (a) DC del tejido linfoide (DC interdigitantes); existen en la mdula sea y timo y se denominan de la zona marginal, cuando estn presentes en bazo, (b) DC de los tejidos slidos no linfoides (clulas de Langerhans, cuando se localizan en la epidermis y clulas intersticiales a las localizadas en el corazn y riones) y (c) DC de fluidos a las que se encuentran en trnsito, tanto en los vasos linfticos aferentes como en la sangre. La maduracin de la DC es fundamental en la iniciacin de la respuesta imune. Los estudios de maduracin in vitro de DC se realizan a partir de monocitos obtenidos de sangre perifrica e incubados en presencia de GM-CSF e IL-4; se obtiene as una poblacin de DC inmaduras, clulas que expresan en su superficie molculas MHC clase II en baja densidad,

receptor de manosa, quimioquina CCR5 (ver captulo 11) y FcR, y no expresan la molcula de adhesin ICAM-1 y molcula coestimuladora B7. En el paso a DC maduras participan LPS (Lipopolisacrido) de la pared bacteriana, citoquinas como IL-1 y TNF. Las DC maduras expresan en su superficie altos niveles de molculas MHC clase II, de molculas coestimulatorias (CD40, CD86/B7-2 y B7-1), de molculas de adhesin (ICAM-1 y LFA-3) y de receptores para quimioquinas como CCR7 (ver captulo 11). In vivo, factores, tanto de tipo infecciosos como inflamatorios, influyen en estimular la maduracin y el movimiento de las DC hacia los tejidos linfoides secundarios. 2.4. Granulocitos Como se indic antes, en la serie granuloctica, a partir del estadio madurativo de mielocito se reconocen tres lneas celulares diferentes: neutrfilos, eosinfilos y basfilos. En la tabla 3-2 se muestra el porcentaje que cada lnea celular ocupa entre los leucocitos en los adultos y el nmero absoluto que representa. 2.4.1. Neutrfilos. En los adultos, los neutrfilos maduros representan aproximadamente el 65% de los 4-10 x 103 glbulos blancos o leucocitos por microlitro de la sangre. Los neutrfilos tienen un dimetro de 1015 m y un ncleo segmentado con 2-5 lbulos (figura 3-8). En su citoplasma se han descrito cuatro tipos de grnulos, los primarios o azurfilos (lisosomas), secundarios (especficos), terciarios y vesculas secretoras (tabla 35). Los grnulos primarios, son escasos en los estadios maduros, y contienen enzimas y protenas microbicidas (entre otras, peroxidasa, lisozima, protenas catinicas) protenas (elastasa, catepsina G y otras protenas) e hidrolasas cidas (entre otras, N-acetilglucuronidasa y catepsinas B y D). Los grnulos secundarios, son los ms numerosos en los neutrfilos maduros; contienen lisosima, colagenasa, fosfatasas alcalina, lactoferrina y otras enzimas y protenas. Los grnulos terciarios contienen principalmente gelatinasa. Las vesculas secretoras, al parecer formadas por endocitosis, contienen algunas protenas plasmticas.

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Tabla 3-5. Contenido de los grnulos de los neutrfilos humanos Grnulos Primarios Grnulos Secundarios Membrana Grnulos Terciarios Vesculas Secretoras CD11b (Mac-1) Citocromo b558 Receptor de FMLP Receptor de uPA Fosfatasa alcalina CD10, CD13, CD45 CD16 DAF (CD55) CR1 (CD35)

CD63 CD66c CD68

CD11b (Mac-1) CD11b (Mac-1) Citocromo b558 Citocromo b558 Receptor de FMLP Receptor de FMLP Receptor de laminina Receptor de laminina Receptor de uPA CD15 CD66a CD666 Receptor de fibronectina Subunidad de Protena G Antgeno NB1 RAP1, RAP2 Receptor de Trombospondina Receptor de TNF Receptor de Vitronectina

Matriz Agentes microbicidas Lisozima Lisozima Mieloperoxidasa Colagenasa Defensinas Protenas catinicas Protena bactericida permeabilizante (BPI) Proteasas Elastasa Catepsina G Proteinasa 3 Hidrolasas cidas N-Acetilglucuronidasa Catepsinas B y D -Glucuronidasa -Glicerofosfatasa -Galactosidasa -Glucosaminidasa -Fucosidasa -Manosidasa N-Acetil--glucosaminidasa Otros Sialidasa Azurocidin cido mucopolisacrido Protena ligante de heparina Factor inactivador de C5a Sialisidasa Pro-uPA Pro-uPA/uPA Apolactoferrina Gelatinasa Protenas plasmticas: 2-Microglobulina Acetiltransferasa Tetranectina, Histaminasa Albmina, Heparinasa Otras Protena ligante de Vitamina B12 Inhibidor de protena Kinasa C Otros Lisozima

FMLP, pptido formil-metil-leu-phe; uPA, Activador del plasmingeno tipo uroquinasa.

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factor, (DAF, CD55), Antgeno lencocitario comn (CD45) (Protena tirosina fosfatasa). Una vez que los neutrfilos salen de la mdula sea, permanecen en circulacin aproximadamente 7 horas, para luego pasar al azar a los tejidos, donde subsisten vivos 2-3 das. La produccin y destruccin diaria de neutrfilos es de 0,9x109/Kg de peso. Para que los neutrfilos puedan cumplir su funcin de fagocitar y destruir las partculas ingeridas deben movilizarse al foco infeccioso.
Figura 3-8. Esquema de la estructura subcelular de un neutrfilo. Clula de 10-15 m. Debido al pH neutro de su citoplasma y contenido granular, stos no se tien con la clsica tincin hematolgica de May Grnwald-Giemsa. Una caracterstica de los neutrfilos maduros es su ncleo segmentado. El citoplasma contiene un pequeo aparato de Golgi y retculo endoplsmico rugoso, y escasas mitocondrias y ribosomas. Los neutrfilos presentan dos tipos de grnulos, primarios y secundarios; estos ltimos ms numerosos en neutrfilos maduros. Adems contienen numerosos y pequeos grnulos de glicgeno.

Quimiotaxis El movimiento de los neutrfilos al sitio de infeccin es dirigido por un gradiente qumico (quimiotaxis). Entre otros factores quimiotcticos (tabla 3-6), para los que estos leucocitos poseen receptores, destacan algunas protenas del complemento (C5a, C3a), pptidos formilados (Ej. Nformil-met-leu-phe, FMLP) y lpidos derivados de las bacterias, factor plaquetario 4 (PF4), metabolitos de la va de la lipoxigenasa del metabolismo del cido araquidnico, especialmente el leucotrieno B4 (LTB4), y las llamadas quimioquinas, entre ellas la IL-8. Varios de estos factores han sido clonados y secuenciados. A modo de ejemplo el receptor de C5a es una protena de transmembrana de 30 kDa y presenta tres loops extracelulares e intracelulares, siete dominios transmembrana, el extremo carboxilo citoplasmtico y el extremo amino extracelular.

Algunas molculas expresadas en la membrana de los neutrfilos son: (a) molculas de adhesin (ver captulo 12), entre ellas LFA-1 (CD11a), Mac-1 (CD11b), p150, 95 (CD11c), 2- integrina (CD18), ICAM-3 (CD50), L-selectina (CD62b), (b) receptores: FcRI (CD64), FcRII (CD32), FcRIII (CD16), Receptor para C5a (CD68), receptor para G-CSF (CD114), (c) ectoenzimas: aminopeptidasa N (CD13, inactiva IL-8), endopeptidasa (CD10, inactiva FMLP) y (d) otros: Decay accelerating

Tabla 3-6. Factores quimiotcticos para neutrfilos Factor quimiotctico Clsicos Pptidos formilados Fragmento C5a Leucotrieno B4 (LTB4) Factor activador de plaquetas (PAF) Quimioquinas C-X-C Interleuquina 8 (IL-8) -tromboglobulina gro- ENA-78 Quimioquinas C-C MIP-1 Monocitos Linfocitos T, monocitos, clulas endoteliales, otras clulas. Grnulos de plaquetas Clulas endoteliales, monocitos, otras clulas. Clulas epiteliales Fuente Bacterias Activacin del Complemento Metabolismo del cido araquidnico Metabolismo de fosfatidilcolina

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Los factores quimiotcticos actan a bajas dosis (0,1-1mM). El efecto biolgico de los factores quimiotcticos es lograr una migracin dirigida de los neutrfilos. La respuesta leucocitaria a los factores quimiotcticos es regulada positiva o negativamente por varios estmulos fisiolgicos y farmacolgicos. Varias citoquinas, como por ejemplo, TNF e IFN favorecen la quimiotaxis. En el caso del IFN participa aumentando la hidrlisis de fosfatidilcolina por la fosfolipasa D. La desensibilizacin celular al estmulo del factor quimiotctico puede ocurrir por aumento de cAMP o degradacin del factor quimiotctico. Receptores que participan en la fagocitosis Una etapa inicial de la fagocitosis es el reconocimiento, por parte de la clula fagoctica, de la partcula a ser fagocitada. Para ello las clulas fagocticas poseen 2 grupos de receptores, capaces de reconocer: (a) ligandos propios de los organismos o clulas a fagocitar y (b) molculas que se han unido a ellas y que favorecen la fagocitosis (opsoninas). Entre los receptores que unen molculas no opsnicas y que se presentan fundamentalmente los macrfagos, se encuentran: (i) los receptores scavenger que unen varios ligandos, entre otros, protenas modificadas, polianiones (incluye cidos nucleicos), fosfolpidos cidos (incluye lipopolisacrido de bacterias Gram negativas y cido lipoteicoico de bacterias Gram positivas y (ii) el receptor de manosa, que une carbohidratos.

Entre los receptores de opsoninas, se distinguen: (i) los receptores de fragmento Fc de IgG (FcR) e IgA (FcR) unidos a un dmero de cadenas , los receptores del complemento y otros receptores (de colectinas y de protenas plasmticas). Los receptores de Fc son miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas (ver captulo 6), con 3 (FcRIA) o 2 (otros receptores Fc) dominios tipo inmunoglobulina extracelulares, un dominio transmembrana y una corta cola citoplasmtica; FcRIIIB, unido a glicofosfatidilinositol (GPI), es una excepcin. En la tabla 3-7 se muestra en diferentes FcR y el FcR indicado las clulas que los presentan: Los receptores del complemento incluyen CR1, una protena de transmembrana que une C3b, y dos integrinas CD11b/CD18 y CD11c/CD18, llamadas tambin CR3 y CR4, respectivamente. Estos dos ltimos receptores unen iC3b, molcula derivada de C3b y se une covalentemente a la superficie celular. Otros receptores unen un grupo de molculas llamadas colectinas, entre ellas la protena que une manosa (MBL), molcula que participa en la activacin del sistema del complemento y la protena C reactiva (PCR) que se puede unir por ejemplo al carbohidrato C del Streptococcus pneumoniae. Adems de receptores para las colectinas tambin existe receptores para algunas protenas plasmticas que se pueden unir a los microorganismos, por ejemplo receptores para fibringeno y fibronectina.

Tabla 3-7. Receptores de la regin Fc de IgG e IgA Receptor FcRI* FcRIIA FcRIIB FcRIIIA FcR CD CD64 CD32 CD32 CD16 CD89 Clulas Monocitos, macrfagos, Neutrfilos maduros tratados con IFN Neutrfilos maduros, monocitos Macrfagos, plaquetas Monocitos, macrfagos Linfocitos B, mastocitos Macrfagos, clulas NK Mastocitos Granulocitos, monocitos Macrfagos

* Tres locus gnicos; I, alta afinidad; II, afinidad intermedia; III, baja afinidad

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Transduccin de seales en la fagocitosis Se describir el mecanismo de transduccin de seales asociados a la fagocitosis mediada por FcR. Los receptores FcRI, FcIIA y FcIIIA comparten la capacidad para activar la cascada de tirosina kinasa. Los dominios ITAM (inmunetyrosine activation motifs) de la cadena de los receptores FcR pueden ser fosforilados por tirosina kinasa de la familia SyK. Esta etapa es fundamental para la ingestin y polimerizacin de actina. Paralelamente, la unin ligando-receptor activa la fosfolipasa C la cual desdobla el fosfatidil inositol-4,5-difosfato (PIP2) en inositol-1,4,5trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG) (figura 3-9). El IP3 permite que se libere Ca2+ de los depsitos citoplasmticos, el que tiene dos acciones: (a) desencadena el ordenamiento de los filamentos de actina y de la protena contrctil miosina, responsables del movimiento de los neutrfilos y (b) activa la fosfolipasa A2 que convierte los fosfolpidos de membrana en cido araquidnico a partir del cual se obtienen otros metabolitos. El

DAG activa la protena kinasa C que fosforila protenas que participan en los procesos de degranulacin y secrecin. La fosfolipasa D escinde fosfatidilcolina a cido fosfatdico y colina; su activacin se asocia a la unin de ligandos a receptores del complemento. Adhesin de neutrfilos al endotelio Para que los neutrfilos lleguen a los tejidos infectados, junto recibir la seal quimiotctica, stos deben unirse al endotelio, luego rodar sobre ste (rolling), sufrir un proceso de activacin adicional y luego participar de un proceso de migracin transendotelial. En este proceso tienen importante participacin algunas molculas de adhesin celular (captulo 12), expresadas en forma constitutiva e inducida en la membrana de los neutrfilos y clulas endoteliales. Aproximadamente la mitad de los neutrfilos circulantes forman parte del pool marginal, que mantienen interaccin intermitente con el endotelio. Las molculas de adhesin de la fami-

Figura 3-9. Activacin de los neutrfilos a travs de FcR. La unin de bacterias opsonizadas con IgG a FcR favorece la fosforilacin de las cadenas del FcR por protena kinasa. Adems se activa la fosfolipasa C que desdobla el fosfatidil inositol 4,5-difosfato (PIP2) en inositol-1,4,5-trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG). La figura muestra esquemticamente la participacin de los segundos mensajeros (IP3, Ca2+ y DAG).

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lia selectinas (L-selectinas, CD62L en leucocitos y E-selectinas, CD62E en clulas endoteliales) y sus ligandos, carbohidratos sialilados, son responsables del rolling de los neutrfilos sobre el endotelio. La interaccin de los factores quimiotcticos con sus respectivos receptores inicia el proceso de transduccin de seales en los neutrfilos, lo que inicialmente se asocia con expresin de molculas de adhesin de la familia integrinas, especialmente LFA-1 (CD11a-CD18) que se une a su ligando de la superfamilia de las inmunoglobulinas ICAM-1 (CD54) en las clulas endoteliales. Este ltimo tipo de interaccin resulta en un marcado incremento de la adhesin de los neutrfilos al endotelio y trmino del rolling. Luego los neutrfilos migran entre las clulas endoteliales al tejido. Fagocitosis La endocitosis, proceso por el cual el material es introducido en la clula, puede tomar la forma de una pinocitosis (bebiendo por clulas) y fagocitosis (comiendo por clulas). La fagocitosis es visible al microscopio ptico; la pinocitosis se refiere a la ingestin de macromolculas. Ambos procesos involucran invaginacin de la membrana celular y la formacin de vesculas o vacuolas (fagosomas). La mayora de las clulas pueden realizar pinocitosis, pero la fagocitosis es un proceso caracterstico de los neutrfilos, monocitos y macrfagos, y, en mucho menor grado, de los eosinfilos y basfilos. La fagocitosis de los microorganismos se ve favorecida si stos estn recubiertos (opsonizados)

con IgG (subclases 1 3) y/o fracciones del complemento (C3b y/o C4b). Los neutrfilos al igual que los monocitos y macrfagos, poseen receptores para la regin Fc de IgG (FcR) y para C3b y C4b (tabla 3-8). La unin de estas opsoninas con el receptor respectivo, activa la clula fagoctica, sta emite prolongaciones que engloban al microorganismo. El fagosoma formado por la membrana plasmtica, posteriormente se fusiona con la membrana de los grnulos citoplasmticos que descargan su contenido enzimtico en el interior del fagosoma (figura 3-10). El DAG, a travs de la protena kinasa C que fosforila protenas, gatilla la degranulacin.

Figura 3-10. Esquema de fagocitosis. Se muestra el proceso de fagocitosis de bacterias opsonizadas. La unin de grnulos primarios y especficos con el fagosoma forman la vacuola digestiva. La degradacin bacteriana conduce a la formacin de un cuerpo residual y a la expulsin (exocitosis) de componentes no degradables.

Tabla 3-8. Receptores para inmunoglobulinas y fracciones del complemento en los granulocitos y monocitos/macrfagos. FcRI Neutrfilos Eosinfilos Basfilos Monocitos/ macrfagos + FcRII + + FcRI FcRII +? FcRIII + + + C5aR + + + CR1 + + + CR3 + + +

FcR, Receptor para IgE (I, alta afinidad; II, afinidad intermedia); Fc, Receptor para IgG (I, alta afinidad; II, afinidad intermedia; III, baja afinidad); C5aR, receptor de C5a; CR1, receptor de C3b; CR3, receptor de iC3b.

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Antes se indic el contenido de cada uno de los tres tipos de grnulos de los neutrfilos (tabla 3-5). As por ejemplo los grnulos azurfilos contienen componentes antibacterianos; tambin contienen elementos como elastasa que puede favorecer el movimiento de los neutrfilos al hidrolizar algunos componentes de la matriz extracelular. Los grnulos secundarios son liberados ms fcilmente de los neutrfilos, conteniendo entre otras molculas, algunas que activan el sistema del complemento. Tambin contienen colagenasa, que al igual que la elastasa puede favorecer el movimiento de las clulas fagocticas. Por otra parte, la apolactoferrina al unir hierro puede tener un efecto antimicrobiano, entre otras razones por privar de este elemento a las bacterias. Por su parte, la gelatinasa contenida en los grnulos terciarios puede participar, junto a otros componentes, en la modificacin de la matriz extracelular durante el desplazamiento de los neutrfilos. En otro orden, protenas de membrana de los grnulos terciarios y de las vesculas secretoras, pueden aumentar su expresin en la superficie celular, despus de la activacin. Mecanismos microbicidas Una vez fagocitados los microorganismos, stos son destruidos por mecanismos dependientes e independientes del oxgeno, tambin denominados mecanismos oxidativos y no oxidativos, respectivamente (tabla 3-9). Tabla 3-9. Mecanismos antimicrobianos de los neutrfilos Dependientes del oxgeno Mediados por mieloperoxidasa cido hipocloroso (HOCl) Independientes de mieloperoxidasa Perxido de hidrgeno (H2O2) In superxido (O2-) Otros? Independientes del Oxgeno pH cido Lisozima Lactoferrina Defensinas Protena bactericida permeabilizante (BPI) Protenas catinicas de los grnulos

a) Mecanismos antimicrobianos dependientes del oxgeno. Durante la fagocitosis, proceso dependiente de energa, se produce un aumento del consumo de oxgeno, de la oxidacin de la glucosa y de la produccin de metabolitos del oxgeno, fenmeno tambin denominado estallido respiratorio (figura 3-11). La generacin de estos ltimos se debe a la activacin de la NADPH oxidasa que al oxidar el NADPH reduce el oxgeno molecular a in superxido (O-2), el que se convierte en perxido de hidrgeno (H2O2). Los metabolitos del oxgeno pueden actuar a travs de un mecanismo dependiente o independiente de mieloperoxidasa (MPO), enzima presente en alta concentracin en los grnulos primarios, los que son degranulados al interior del fagosoma (figura 3-11). La MPO, en presencia de un in haluro como Cl- (o Br-), transforma el H2O2, generada por mecanismos dependientes de oxgeno pero independiente de MPO, en cido hipocloroso (HOCl), un potente oxidante y antimicrobiano, (antibacteriano, antifngico, antiviral y antimicoplasma). Los radicales superxido e hidroxilo, por s solos tienen accin microbicida. La oxidasa dependiente de NADPH, es un complejo multienzimtico que incluye dos protenas de membrana (de dos tipos de grnulos: vesculas secretoras y grnulos secundarios) y tres citoslicas, cuando la clula est en reposo (figura 3-12). El componente de membrana es un heterodmero formado por una protena de 91 kDa (gp91phox) y una protena de 22 kDa (p22phox). Estas protenas, junto con flavin adenin dinucletido (FAD) forman un flavocitocromo denominado citocromo b558. Adicionalmente en la membrana participa una protena de unin de nucletidos de guanina denominada rap1. La subunidad de 91 kDa presenta el sitio de unin para el NADPH. Ambas subunidades presentan grupos HEME. El componente citoplasmtico est formado por tres protenas independientes: p40phox, p74phox y p67 phox. Adems participa otra protena de unin de nucletidos de guanina, rac2; en reposo una GDP y cuando la clula es activada une GTP. Precozmente durante la activacin, las vesculas secretoras y posteriormente los grnulos secundarios, se fusionan con la membrana plasmtica, la cual durante la fagocitosis se invagina y por tanto la membrana de los fagosomas presentar las protenas de membrana de la NADPH oxidasa. Como consecuencia de la activacin de los neutrfilos, proceso en

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Figura 3-11. Mecanismos microbicidas oxidativos. Una oxidasa cataliza la reduccin de oxgeno a in superxido (O-2) a expensas del NADPH. El NADPH es regenerado a travs de la va de las hexosas. El O-2 es transformado en perxido de hidrgeno (H2O2) y O2 por la superxido dismutasa (SOD). Reacciones posteriores que comprometen al H2O2 y al O-2, llevan a la formacin de dos tipos de compuestos microbicidas: radicales libres altamente oxidantes (OH) o halgenos oxidados (por ejemplo: cido hipocloroso, HOCl).

Figura 3-12. NADPH oxidasa. La oxidasa dependiente NADPH est formada por protenas de membrana (22 y 91 kDa), unidas a flavin adenin dinucletido (FAD) y a protenas citoslicas (40, 47 y 67 kDa y Rac 2). Estas ltimas se translocan a la membrana cuando el neutrfilo es activado.

que p47phox es fosforilada, las protenas citoslicas son translocadas a la membrana plasmtica, formndose y activndose el complejo NADPH oxidasa. La enfermedad granulomatosa crnica es una inmunodeficiencia primaria, caracterizada por una mayor susceptibilidad a infecciones bacterianas y fngicas. Es causada por mutaciones que producen una prdida o inactivacin de una de las subunidades principales de la

NADPH oxidasa (p47phox, p67phox, p22phox o p91phox). b) Mecanismos antimicrobianos independientes del oxgeno. Estos mecanismos funcionan en ausencia de metabolitos del oxgeno, situacin que se presenta en un ambiente anaerbico; sin embargo ambos tipos de mecanismos, oxidativos y no oxidativos, a menudo participan en forma sinrgica. En los meca-

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nismos microbicidas independientes del oxgeno participan protenas y enzimas presentes en los grnulos citoplasmticos de los fagocitos (tabla 3-3). Entre otros componentes de estos mecanismos destacan: (a) la lisozima, enzima catinica que destruye el pptidoglican de la pared celular, principalmente de las bacterias Gram positivas; (b) la protena bactericida permeabilizante (BPI), protena catinica que permeabiliza la membrana bacteriana; (c) la catepsina G, una serino proteasa con actividad sobre bacterias Gram negativas y (d) las defensinas, pptidos de 29-34 aminocidos, ricos en arginina y cistena, y que presentan actividad microbicida sobre bacterias Gram positivas, Gram negativas, hongos y algunos virus. En la figura 3-13 se muestra un resumen de los mecanismos microbicidas durante la fagocitosis.

Una vez muertas las bacterias en el interior de los fagolisosomas, son degradadas por hidrolasas cidas, que por la generacin de cido lctico durante la gliclisis, encuentran su pH ptimo para actuar. 2.4.2. Eosinfilos. Los eosinfilos son clulas de aproximadamente 10 m de dimetro y cuyo ncleo es generalmente bilobulado (figura 3-14) y su citoplasma anaranjado con tincin de hematoxilina-eosina. Representan el 1-4% de los leucocitos sanguneos (tabla 3-2); alrededor del 99% de los eosinfilos se encuentra en los tejidos donde llegan luego de un breve paso de aproximadamente 30 minutos por la sangre, despus de salir de la mdula sea.

Figura 3-14. Esquema de la estructura subcelular de los eosinfilos. Los eosinfilos son leucocitos de aproximadamente 10 m de dimetro. Presentan un ncleo bilobulado con un nuclolo medianamente grande. En el citoplasma se observan ribosomas, mitocondria y pequea cantidad de retculo endoplsmico rugoso. El aparato de Golgi es pequeo. Un hecho caracterstico de los eosinfilos son sus grnulos esfricos u ovales.

Grnulos
Figura 3-13. Fagocitosis y mecanismos microbicidas. (A) Bacteria opsonisada con IgG y C3b se une a una clula fagoctica a travs de los respectivos ligandos (FcR y CR1). (B) Luego de emitir pseudpodos la bacteria es fagocitada, los grnulos azurfilos y secundarios se acercan al fagosoma en formacin, y se estructura la NADPH oxidasa. (C) En el fagosoma se inicia el estallido respiratorio en el que a partir de oxgeno molecular y con participacin de la superxido disminutasa (SOD) se genera perxido de hidrgeno (H2O2) y por accin de la mieloperoxidasa (MPO) de los grnulos azurfilos se genera cido hipocloroso (HOCl). Adicionalmente participan otros componentes bactericidas (lisozima y otras protenas) de los grnulos especficos. La enzima glucosa 6 fosfato deshidrogenasa (G 6 PD) pertenece a la va de derivacin de la hexosa monofosfato.

Los eosinfilos presentan dos tipos de grnulos en su citoplasma: grnulos especficos de eosinfilos y grnulos pequeos. Los grnulos especficos, aproximadamente 20 por clula, en su centro presentan la protena bsica mayor (MBP) y algunas citoquinas; en la matriz contienen protena catinica eosinfila (ECP), peroxidasa eosinfila (EPO), neurotoxina derivada de eosinfilos (EDN) y algunas citoquinas. Los grnulos pequeos que almacenan arilsulfatasa, se encuentran en los eosinfilos maduros.

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Otras molculas sintetizadas en los eosinfilos Cuando los eosinfilos son estimulados secretan algunos mediadores derivados de membrana: Leucotrieno C4 (LTC4), leucotrieno B4, 15HETE y PAF. Los eosinfilos pueden sintetizar varias citoquinas proinflamatorias; se ha descrito mRNA para ellas: Interleuquinas (IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-10, IL-16) factores de crecimiento (TGF, TGF, TNF, GM-CSF), Interferones (IFN) y quimioquinas (IL-8, MIP-1 y RANTES). Receptores de membrana Uno de los receptores ms importantes desde el punto de vista fisiopatolgico son los receptores de Fc de IgE de baja afinidad (FcRIII) (tabla 3-8). Acumulacin de eosinfilos en tejidos La quimiotaxis, adhesin a clulas endoteliales y matriz extracelular parece ser controlada por la respuesta inmune de clulas T y subsecuente liberacin de citoquinas. Las citoquinas liberadas en procesos alrgicos son las que participan en respuestas inmunes tipo Th2 (IL-4, IL5), en cambio en la reaccin de hipersensibilidad de tipo retardada (DTH) se encuentran citoquinas asociadas a respuesta tipo Th1 (Ej. IL-2, IFN). La liberacin de IL-5 por LTh2 sensibilizados luego de su estimulacin con antgeno especfico, se puede asociar al desarrollo de eosinofilia durante enfermedad alrgica. Las citoquinas adems de participar en la diferenciacin de los eosinfilos a partir de los precursores, contribuyen a su acumulacin en el tejido inflamado. En esta ltima funcin participan principalmente IL-3, IL-5, GM-CSF, PF4, LTB4, IL-8 y RANTES. En la adhesin a endolelio y migracin transendotelial participan, al igual que para los neutrfilos, las molculas de adhesin celular: selectinas, integrinas y de la superfamilia de las inmunoglobulinas (ver punto 2.2.1). Algunas citoquinas (IL-3, IL-5 y GM-CSF) prolongan la sobrevida de los eosinfilos en los tejidos. Estas citoquinas tambin aumentan la capacidad citotxica de ellos.

Eosinfilos y patologas Hay varias situaciones patolgicas en que aumenta la cifra absoluta de eosinfilos en la sangre (eosinoflia). Destacan: (a) las infecciosas parasitarias, particularmente por helmintos, en las cuales se ha observado que los eosinfilos pueden tener una accin efectora (captulo 35) y (b) las enfermedades alrgicas (captulos 21 y 22). Enfermedades mieloproliferativas, otras neoplasias y algunos frmacos (Ej. Penicilina, Tetraciclina, Nitrofurantoina) pueden asociarse con eosinfilos. 2.4.3 Basfilos. Los basfilos representan menos del 1% de los leucocitos sanguneos (tabla 3-2). Al igual que los otros granulocitos maduros presentan un dimetro aproximado de 10 m. En los frotis sanguneos teidos con May-Grnwald Giemsa, los grnulos citoplasmticos cidos que se caracterizan por presentar un intenso color azul violeta, casi cubren completamente el ncleo bilobulado. La figura 3-15 muestra un esquema de su estructura subcelular.

Figura 3-15. Esquema de la estructura subcelular de un basfilo. El ncleo es bilobulado y la cromatina presenta una distribucin similar a los neutrfilos y eosinfilos. Presenta un pequeo aparato del Golgi y retculo endoplasmtico; escaso nmero de ribosomas libres y mitocondrias.

Los basfilos son muy similares a los mastocitos o clulas cebadas, en cuanto a la composicin de sus grnulos y a su funcin. La diferenciacin a basfilos y mastocitos desde clulas inmaduras (CD34+, c-kit-, FcRI-) ocurre a travs de varias etapas en que estos y otros marcadores de membrana se van modificando. Las clulas cebadas maduras presentan el siguiente fenotipo FcRI+ y c-kit+ y los basfilos son FcRI+, c-kit-, CD23+. Adems al igual que los eosinfilos son CD25+ y CD125+.

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En la tabla 3-10 se indican las principales protenas de membrana de los basfilos y mastocitos. Ambos tipos de clulas presentan receptores de alta afinidad para IgE (FcRI), slo los basfilos presentan integrinas y solamente los mastocitos presentan c-kit.

Tabla 3-10. Protenas de membrana de basfilos y clulas cebadas Marcador FcRI FcRII Integrina CD11a/18 Integrina CD11b/18 Integrina CD11c/18 IL-2R (CD25) C-Kit (CD117) IL-3R (CD123) IL-3/5/GMR Bsofilo + + Mastocitos + + + + + + + +

Concavalina A), algunas citoquinas (ej. IL-1, MIP1). El pptido formil-met-leu-phe slo estimula la secrecin de los basfilos. Ambos tipos celulares participan en las etapas iniciales del proceso inflamatorio, pero en las etapas ms avanzadas de reparacin slo lo hacen los mastocitos. As, inicialmente ambos secretan mediadores inflamatorios: (Histamina, IL-4, quimioquinas; basfilos: IL-13; mastocitos: TNF, etc.), molculas que durante el proceso van disminuyendo. Por su parte, las clulas cebadas durante el desarrollo del proceso siguen liberando otros mediadores, ahora antiinflamatorios (IL10, TGF-, etc.) y ms adelante, molculas que favorecen la reparacin tisular (proteinasas, factores de crecimiento y otras citoquinas). Varios frmacos antialrgicos y antiinflamatorios inhiben la secrecin de mediadores desde los basfilos y mastocitos; sus acciones son mltiples y variadas. Entre ellas se incluyen: Agonistas de B 2 , antagonistas de H 1 , corticoides y ciclosporina A, entre otros. 3. RGANOS LINFOIDES

En las primeras etapas de maduracin participa el factor de stem cell o c-kit ligand. En la maduracin de clulas cebadas participan citoquinas como IL-3, IL-6. En cultivos celulares se han descrito las CFU de basfilo y eosinfilos (CFU- baso/eo). En la diferenciacin de basfilos la principal citoquina que participa es IL-3; tambin participan GM-CSF, IL-4 e IL-5. Esta ltima promueve adems la diferenciacin de eosinfilos. El TGF, en presencia de IL-3 suprime la diferenciacin de eosinfilos y favorece la diferenciacin de basfilos. Varias molculas mediadoras de inflamacin son liberadas desde ambos tipos celulares por mecanismos mediados por unin de IgE u otros mecanismos. Ambas clulas contienen histamina, PAF, condroitinsulfato, LTB4, LTC4, IL-4 e IL-13. Slo en los mastocitos, xido ntrico (NO), prostaglandinas D2 (PGD2), PGF2, tromboxano A2, triptasa, carboxipeptidasa A, IL-5, IL-6, IL-8, IL10, TNF, TGF-, IFN. Slo en los basfilos, MIP-1. Varios factores pueden activar la secrecin de mediadores de inflamacin por parte de basfilos y clulas cebadoras. Entre ellos, la unin de una molcula de IgE (o IgG) y su respectivo antgeno (alergeno) a los FcRI (o FcRII), anafilotoxinas (C3a y C5a), lectinas (ej.

Desde un punto de vista inmunolgico, los rganos y tejidos linfoides, se pueden clasificar en primarios y secundarios (figura 3-16). Ms recientemente se han descrito los tejidos linfoides terciarios; parte de ellos son descritos aqu como tejido asociado a mucosas (punto 3.2.3) y se incluye adems en este concepto el tejido linfoide asociado a piel (ver captulo 16). 3.1. rganos linfoides primarios En los rganos linfoides primarios, timo y mdula sea en el hombre, las clulas linfoides experimentan un proceso de proliferacin y diferenciacin a clulas T y clulas B, respectivamente. Este proceso no requiere presencia de antgenos extraos (antgeno independiente). All los linfocitos adquieren el repertorio de receptores antignicos especficos (LT: TCR y LB: IgM e IgD) y aprenden a distinguir entre lo propio y lo extrao. 3.1.1. Mdula sea En la mdula sea, a partir de la segunda mitad del embarazo y en el resto de la vida, ocurre la diferenciacin y maduracin de los glbulos rojos, glbulos blancos y plaquetas

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Figura 3-16. rganos linfoides. Se muestran los rganos linfoides primarios, (Mdula sea y Timo) secundarios (Bazo, Ganglios linfticos: cervicales, axilares mesentricos e inguinales), tejido asociado a mucosa (GALT: intestinal; BALT: bronquial) y amgdalas (palatinas, farngea y linguales). Adems se indica el lugar de drenaje de los linfocitos desde el conducto torcico a la sangre (vena subclavia izquierda).

(Hematopoyesis, ver punto 2.1). Entre los leucocitos, tiene especial inters en este caso la maduracin de los linfocitos B. En el hombre y otros mamferos, la mdula sea es el tejido equivalente a la bolsa de Fabricio, rgano en el que se diferencian los linfocitos B en las aves; el origen de "B" se refiere a bolsa. La bolsa de Fabricio es un rgano linfoepitelial, que corresponde a un trozo de intestino modificado, localizado cerca de la cloaca; los folculos estn en la corteza y mdula de la bolsa. La mdula sea se encuentra en la cavidad medular de los huesos largos (principalmente en las epfisis) y en los espacios existentes entre las trabculas de los huesos esponjosos. Histologa. La mdula sea est formada por dos importantes compartimientos: vascular y hematopoytico (figura 3-17).

Figura 3-17. Estructura general de la mdula sea. Se destaca el compartimiento vascular (arterias, venas y sinusoides) y del compartimiento hematopoytico.

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Los vasos sanguneos del compartimiento vascular forman un esqueleto estructural en la mdula sea. La sangre que ingresa a la mdula sea lo hace por las arterias nutricias que perforan la difisis a travs de los agujeros nutricios. Estas arterias entran en la cavidad medular y dan origen a la arteria longitudinal central, desde la cual se generan pequeos vasos que irrigan tanto la mdula como el hueso cortical. Las ramas dirigidas a la mdula descargan su sangre a capilares los cuales vacan en una extensa red de sinusoides. Los sinusoides (45 a 80 m de dimetro) estn compuestos por clulas endoteliales, una lmina basal y una capa externa de clulas reticulares; estas ltimas cubren aproximadamente el 50% de la superficie endotelial. Estos sinusoides drenan en una vena longitudinal central, que a su vez descarga su contenido en venas que salen del hueso por el conducto nutricio. El pasaje transendotelial de clulas maduras, desde el comportamiento hematopoytico a la sangre ocurre directamente a travs de poros de mi-

gracin transitorios (<4 m de dimetro) que se forman en las clulas endoteliales de los sinusoides. El Compartimiento hematopoytico est formado por los islotes de clulas hematopoyticas de las diferentes lneas celulares (serie granuloctica, serie monoctica, serie eritroblstica, serie megacarioctica y serie linfoide), en sus distintos estadios madurativos. En clulas se ubican entre los sinusoides, y entre stos y la cortical del hueso. Adems de las clulas hematopoyticas en la mdula sea tambin existen otras clulas que forman parte de denominado estroma medular. Entre ellas destacan: macrfagos, clulas reticulares y algunas clulas adiposas (figura 318). Estas clulas participan activamente en la regulacin de la hematopoyesis secretando citoquinas y factores de maduracin. Adicionalmente los macrfagos fagocitan ncleos expulsados por los eritroblastos ortocromticos al madurar a reticulocitos, clulas alteradas y clulas muertas.

Figura 3-18. Estructura histolgica de la mdula sea. La mdula sea est formada por vasos sanguneos, sinusoides, clulas del estroma y clulas hematopoyticas. Los distintos tipos de clulas se desarrollan en islotes hematopoyticos ubicados a diferente distancia de la pared de los sinusoides, segn el linaje celular.

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La hematopoyesis implica un complejo proceso de maduracin y diferenciacin celular. A partir de una clula pluripotencial se originan los diferentes tipos de leucocitos (neutrfilos, linfocitos, monocitos, eosinfilos y basfilos), glbulos rojos y plaquetas. En dicho proceso participan varias citoquinas (ver punto 2.1). Por otra parte, las molculas de adhesin celular (ver captulo 12) presentes en las clulas hematopoyticas y del estroma, y la matriz extracelular tienen fundamental participacin en el proceso de maduracin y focalizacin en la mdula sea. En el caso particular de los linfocitos, las clulas B maduran en la propia mdula sea. En la figura 3-19 se muestra esquemticamente este proceso.

llegan, en estado inmaduro, desde la mdula sea. En el humano, el timo comienza a originarse hacia el final de la sexta semana de gestacin. Para el nacimiento el timo est totalmente desarrollado. El timo es un rgano de naturaleza linfoepitelial que se ubica en el mediastino anterosuperior, sobre los grandes vasos del corazn (figura 3-16). Su tamao y grado de desarrollo varan con la edad del individuo, alcanzando su mximo desarrollo (40 a 50 gramos), cerca de la pubertad, despus de la cual empieza a involucionar, proceso que contina hasta avanzada edad. Histologa. Es el nico rgano linfoide lobulado; est formado por dos lbulos, derecho e izquierdo

Figura 3-19. Maduracin de clulas B en la mdula sea. Esquemticamente se muestra la secuencia de maduracin de las clulas B a partir de una clula madre (stem cell); durante este proceso depende de clulas de estroma (clulas reticulares, entre otras). Otro aspecto importante es que muchas clulas no reordenan correctamente los segmentos gnicos VDJ o VJ (ver captulo 6) y sufren apoptosis por lo que son fagocitadas por los macrfagos medulares. Las clulas B vrgenes (este proceso no ha requerido de contacto con antgeno) pasan a la sangre a travs de los sinusoides y luego a los rganos linfoides secundarios donde pueden tomar contacto con el antgeno para el cual presentan especificidad. Se indican los principales marcadores en diferentes etapas de maduracin. , cadena pesada mu (IgM); k, cadena liviana de Ig; TdT, desoxinucleotidil transferasa terminal.

Respecto a las clulas T, si bien stas maduran en el timo, desde la mdula sea emigran clulas encomendadas a madurar como linfocitos T. Usando citometra de flujo (ver captulo 43), en mdula sea, se ha detectado una subpoblacin que coexpresa CD34 (marcador de Stem Cells), CD2, CD7 y CD3 citoplasmtico (marcadores de lnea T). Sin embargo, tambin se propone la existencia de un progenitor comn para ambos linajes celulares, B y T. Otros hallazgos indican que CD44 podra participar en el "homing" de las clulas linfoides que llegan al timo a madurar como clulas T. 3.1.2. Timo La principal funcin del timo es participar en la maduracin y diferenciacin de los linfocitos T a partir de la proliferacin y diferenciacin de linfocitos troncales inmunolgicamente no competentes que

unidos por tejido conectivo. Ambos lbulos estn rodeados por una cpsula de tejido conectivo; sta emite numerosos tabiques al interior de los lbulos subdividindolos en miles de lobulillos de 0,5-2 mm. Cada lbulo posee una zona perifrica y ms rica en clulas, denominada corteza y la mdula. Los tabiques llegan hasta el lmite corticomedular (figura 3-20). El estroma laxo, compuesto por clulas reticulares epiteliales entreteje la corteza y la mdula. En el retculo se encuentran linfocitos, macrfagos y clulas dendrticas interdigitantes. Las Clulas reticulares epiteliales tienen un aspecto variable. Presentan prolongaciones en forma de estrella, que interaccionan entre s. En la periferia de la corteza y alrededor de los vasos sanguneos, estas clulas conforman una capa continua de clulas planas.

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Figura 3-20. Estructura histolgica del timo. En cada lbulo del timo se pueden describir 2 regiones: corteza y mdula. En ambas zonas, corteza y mdula tmica, existen clulas linfoides, reticulares epiteliales y macrfagos. En la corteza ocurren los procesos de seleccin positiva y negativa de las clulas linfoides T (ver texto) en el que participan las clulas reticulares epiteliales corticales. Las clulas linfoides a medida que maduran migran a la mdula tmica desde donde emigran a la sangre. A medida que maduran las clulas linfoides expresan diferentes marcadores de superficie.

En la mdula existen ms clulas reticulares epiteliales que en la corteza, conformando en la primera los corpsculos de Hassall. Las clulas reticulares epiteliales expresan en su superficie molculas MHC de clase I y de clase II, las que al interaccionar con las clulas linfoides son fundamentales en el proceso de maduracin de estos ltimos. Esto es especialmente significativo en la corteza capsular. Los Macrfagos se encuentran en cantidad moderada en la corteza, pero son ms abundantes en la mdula. Tambin expresan molculas MHC de clase I y II. Las Clulas dendrticas interdigitantes se encuentran en abundante cantidad en el lmite crticomedular y en la mdula, se ubican entre el retculo que conforman las clulas retculo epiteliales. Al igual que estas ltimas presentan largas prolongaciones citoplasmticas a travs de las cuales toman contacto con los linfocitos. Al igual que las clulas reticulares epiteliales expresan en su membrana molculas MHC clase I y II, y participan en la maduracin de los linfocitos. Las Clulas linfoides se localizan entre las ma-

llas que dejan las clulas retculo epiteliales. Las clulas linfoides son mucho ms abundantes en la corteza que en la mdula. En la corteza subcapsular externa son clulas grandes ( 15 m); corresponden a linfoblastos (clulas linfoides inmaduras). En el resto de la corteza y mdula son ms pequeos. Despus de la pubertad, cuando el timo comienza a involucionar, pierde peso y aumenta progresivamente la proporcin de adipocitos (clulas grasas); sin embargo durante toda la vida persisten restos de parnquima. En el adulto una vez que se ha formado un pool de clulas T perifricas, aparentemente no es necesario la produccin de grandes cantidades de linfocitos T. Respecto a los Vasos sanguneos, el timo es irrigado por sangre que fluye a travs de arterias que ingresan por la cpsula, formando arteriolas en los tabiques. Aqu se forman las vnulas interlobulares las cuales se vacan en la vena tmica eferente. Los capilares presentan un endotelio rodeado de una gruesa lmina basal. La corteza slo es irrigada por capilares, stos participan de la llamada barrera hematotmica, que protegera a las clulas linfoides en maduracin en la corteza tmica, contra sustancias antignicas circulantes.

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Fisiologa. En el timo ocurre la maduracin de los linfocitos T, clulas que participan de la inmunidad celular e indirectamente en la inmunidad humoral. Clulas linfoides inmaduras llegan, desde la mdula sea (durante la gestacin: del saco vitelino, bazo e hgado) a la regin subcapsular de la corteza tmica donde se diferencian a clulas T inmaduras (timocitos). En el proceso de maduracin, desde clulas doble negativas (CD4-, CD8) y CD3- y TCR- a clulas T CD4+ (LTh) o CD8+ (LTc) y CD3+ y TCR+, las clulas linfoides se movilizan desde la corteza a la mdula tmica. Durante este recorrido interaccionan con clulas reticulares epiteliales y clulas dendrticas interdigitantes, las cuales expresan en su membrana molculas de MHC clase I y II. En el proceso de maduracin ocurren los procesos de seleccin, positiva y negativa (ver captulo 13). En la primera, los linfocitos que a travs de su TCR reconocen las molculas MHC propias son seleccionados positivamente (pueden continuar el proceso de maduracin); los otros sufren apoptosis. Las clulas que pasan la primera etapa son sometidas a la llamada seleccin negativa, durante la cual son eliminadas (apoptosis) las que, a travs de su TCR, reconocen con alta afinidad antgenos propios en las molculas MHC de clase I o II de las clulas reticulares epiteliales o clulas dendrticas interdigitantes. Durante el proceso de maduracin tmica sobrevive alrededor del 5% de las clulas linfoides que proliferaron en la corteza tmica. Las clulas T maduras, (LTc y LTh), abandonan la mdula tmica a travs de las venas que drenan al timo. La falta de desarrollo congnita de timo se denomina Sndrome de DiGeorge. Estas personas no pueden producir linfocitos T, desarrollando una inmunodeficiencia grave (ver captulo 30). 3.2. rganos linfoides secundarios Los diferentes tejidos linfoides secundarios presentan especificidades asociadas a sus funciones, sin embargo tienen algunas caractersticas estructurales comunes: (a) presentan mecanismos para transportar los antgenos al microambiente linfoide; (b) tienen adaptaciones vasculares especializadas para atraer linfocitos, desde la sangre, especialmente vrgenes; y (c) presentan regiones donde principalmente existen LT o LB, llamadas zona T y zona B, respectivamente. Los rganos linfoides secundarios incluyen los ganglios linfticos, el bazo y el tejido linfoide

asociado a mucosas (MALT). Los rganos secundarios, son los tejidos donde los linfocitos vrgenes (B y T) interactan con los antgenos y con otras clulas del sistema inmune; es aqu donde se inicia la respuesta inmune. En estos tejidos existe un microambiente linfoide altamente organizado, donde las clulas B y T toman contacto con el antgeno y como consecuencia de ello se activan y proliferan (expansin clonal), desarrollndose dos subpoblaciones, clulas efectoras y clulas de memoria. 3.2.1. Ganglios linfticos Los ganglios linfticos son pequeos rganos linfoides ovales y encapsulados, de 1-3 cm de dimetro. A diferencia de otros rganos linfoides, estn interpuestos en el trayecto de los vasos linfticos, actuando como filtros a travs de los cuales pasa la linfa en su camino hacia la sangre; entre otros elementos filtran bacterias, otros microorganismos y otras sustancias extraas. Los ganglios linfticos se encuentran en nmero variable en ciertas zonas del cuerpo, pero son ms abundantes en las regiones axilar, cervical, inguinal, en las cavidades corporales (Ej. Mesenterio) y a lo largo de los vasos mayores (figura 3-16). Histologa. Los elementos de sostn del ganglio linftico son: (i) cpsula: rodea al ganglio y est compuesta de tejido conectivo, (ii) trabculas: son prolongaciones de la cpsula hacia el interior del parnquima ganglionar, especficamente de la corteza y (iii) tejido reticular: red tridimensional formada por clulas y fibras reticulares, suspendidas de la cpsula y trabculas, que forma la estructura del rgano. En uno de los bordes donde la cpsula es ms gruesa se distingue el hilio. El parnquima del ganglio se divide en dos regiones: corteza y mdula (figura 3-21). La corteza, es la zona ms externa y separada en compartimientos por las trabculas. Se distinguen las cortezas externa y profunda (o paracorteza). La corteza externa alberga los denominados folculos (o ndulos) linfoides primarios que son agregados esfricos de LB (vrgenes y de memoria). Estos ndulos pueden presentar un centro germinativo, denominndose as folculos linfoides secundarios. Estos ltimos se forman cuando se desarrolla una respuesta inmune; en el centro germinal se encuentran LB llamados centroblastos. Aqu se generaran los LB de me-

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Figura 3-21. Estructura histolgica de un ganglio linftico. El ganglio posee elementos de sostn (cpsula, trabculas y tejido reticular). Su parnquima se divide en corteza y mdula; en la corteza existe tejido linfoide organizado como folculos y en la mdula existen cordones de tejido linfoide separados por senos medulares. Vasos linfticos aferentes y eferentes entran y salen de los ganglios, respectivamente.

moria y clulas plasmticas (clulas efectoras de las clulas B). La regin perifrica de los folculos secundarios se denomina zona del manto o calota, formada por linfocitos que estn emigrando del centro germinal. La corteza externa es una zona dependiente de mdula sea o zona B. En la corteza profunda (paracorteza) no existen folculos y est poblada principalmente de clulas T. (zona dependiente de timo, zona T) Las clulas presentadoras de antgeno emigran hacia esta zona para presentar los antgenos en molculas MHC clase II a los LTh. Si stas se activan, ocurrir una expansin clonal y aumentar la anchura de la paracorteza. Las clulas T recin formadas emigran hacia los senos medulares, dejan el ganglio y van a la zona de actividad antignica. Las vnulas de endotelio columnar (HEV) estn localizadas en esta regin; a travs de este tipo de epitelio los linfocitos de la circulacin general ingresan al parnquima ganglionar. En la interaccin de los linfocitos con

el endotelio y migracin transendotelial participan molculas de adhesin, en forma similar a lo descrito para los neutrfilos (ver punto 2.4.1.). Los LB que ingresan migran a la corteza y la mayora de los LT, permanecen en la corteza profunda. La mdula corresponde a la parte ms interna del ganglio. Consiste en los llamados cordones medulares constituidos por linfocitos, clulas plasmticas y macrfagos. Estos cordones estn ubicados alrededor de los senos medulares, los que convergen a la regin del hilio donde desembocan en los vasos linfticos eferentes. Los linfocitos de los cordones estn en proceso de emigrar desde la corteza para entrar en los senos medulares y as va linfticos eferentes alcanzar el conducto torcico, y luego la circulacin general (ver punto 4). Los vasos que llegan al ganglio se llaman vasos linfticos aferentes y se introducen en l por varios puntos de la superficie convexa y vacian la linfa en el seno subcapsular. Este seno se conti-

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na con los senos corticales o paratrabeculares (paralelos a las trabculas) los que descargan la linfa en los senos medulares que a su vez drenan la linfa en los vasos linfticos eferentes. stos abandonan el ganglio por el hilio; ambos vasos linfticos, aferentes y eferentes poseen vlvulas. Tambin entran y salen a travs del hilio (zona cncava del ganglio), los vasos sanguneos (arteria y vena) y nervios. Otros tejidos linfoides como las amgdalas, el bazo y el timo tienen slo vasos linfticos eferentes. Fisiologa. Entre las funciones de los ganglios linfticos, est el filtrar la linfa que ingresa va vasos linfticos aferentes, as los macrfagos pueden fagocitar alrededor del 90% de los antgenos que ingresan a los ganglios. Esto causa un proceso inflamatorio con aumento de volumen del ganglio. Adems de la fagocitosis del antgeno en los ganglios linfticos los linfocitos B y/o T toman contacto con los antgenos. Una respuesta inmune primaria (primer contacto con el antgeno especfico) la respuesta se inicia con activacin de LTh vrgenes, ubicados en la corteza profunda; aproximadamente 48 horas despus de la activacin se transforman en linfoblastos los que sufren mitosis generndose a los 5 das un clon de LTh efectores y de memoria. Si el agente infeccioso es intracelular (Ej. Virus) se activan los LTc que reconocen los antgenos expresados en molculas MHC de clase I (ver captulos 8 y 9). Al mismo tiempo que se activa la respuesta inmune celular los escasos LB existentes en la cor-

teza profunda y otros reclutados desde la corteza externa pueden endocitar el antgeno, procesarlo y presentarlo a los LTh. Por su parte, los LT CD4+ facilitan la respuesta inmune humoral, particularmente en el caso de los llamados antgenos timo dependientes (ver captulo 5). As en la paracorteza se generan pequeos focos de diferenciacin y maduracin de LB a clulas plasmticas las que secretarn anticuerpos (IgM, IgG) que llegan a la sangre va linfa eferente. Posteriormente algunos LTh y LB migran a los folculos primarios de la corteza externa amplificando la respuesta inmune. All se generan linfoblastos, llamados en este caso centroblastos. Por un proceso de maduracin y seleccin por afinidad van siendo seleccionados los que presentan mayor afinidad por el antgeno. Tambin ocurre aqu el fenmeno denominado cambio de clase (ver captulo 6). 3.2.2 Bazo El bazo es el rgano linfoide de mayor tamao del cuerpo (aproximadamente 150 g en adultos); est situado en el peritoneo, en la regin superior izquierda del abdomen. El bazo est rodeado por una cpsula de tejido conectivo desde la cual parten trabculas hacia el parnquima del rgano (figura 3-22). Por el hilio entran la arteria esplnica y nervios, y salen por la vena esplnica y vasos linfticos. La estructura del rgano est dada por una red tridimensional de fibras y clulas reticulares, conectadas a la cpsula y trabculas (similar a los ganglios linfticos).

Figura 3-22 Estructura histolgica del bazo. Una cpsula de tejido conectivo rodea al bazo; de sta se originan trabculas hacia el parnquima. La pulpa blanca est compuesta principalmente por linfocitos. La pulpa roja la componen sinusoides venosos, clulas y fibras reticulares, eritrocitos, macrfagos, linfocitos y granulocitos.

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La arteria esplnica se ramifica en las arterias trabeculares, las que al presentar un dimetro de 0,2 mm dejan las trabculas y son rodeados por linfocitos denominndose a stos vaina linftica periarterial y al vaso, arteria central. Luego sta pierde la vaina linftica y se subdivide en varias arterias penicilares, que entran la llamada pulpa roja (ver ms adelante). El extremo de las arterias penicilares corresponden a capilares arteriales terminales que descargan la sangre en los senos esplnicos. stos drenan en las venas pequeas de la pulpa, las que van aumentando de calibre, llegando a formar la vena esplnica, que drena en la vena cava. El parnquima esplnico o pulpa esplnica, se divide en pulpa blanca y pulpa roja. La pulpa blanca est compuesta por tejido linfoide, principalmente linfocitos, estrechamente asociados a la arteria central, a cuyo alrededor forman la vaina linftica periarterial. En sta existen principalmente clulas T (aproximadamente 70% de CD4+ y 30% de CD8+). Las clulas B estn organizadas en folculos, generalmente incorporados en la vaina linftica periarterial. Los folculos primarios contienen clulas B no estimuladas y los folculos secundarios son sitios de activacin y proliferacin de clulas B, y contienen centro germinal. La pulpa blanca est rodeada por una delgada zona marginal que la separa de la pulpa roja, que contiene clulas B, clulas helper, macrfagos y clulas dendrticas interdigitantes (clulas presentadoras de antgeno). En la zona marginal tambin se encuentran los senos marginales; aqu es donde las clulas y antgenos transportados por la sangre tienen acceso al parnquima del bazo. As puede ocurrir: (i) contacto entre los antgenos y las clulas presentadoras de antgeno; (ii) los macrfagos pueden fagocitar microorganismos y clulas senescentes; (iii) clulas T y B de la sangre pueden ingresar a la pulpa blanca; y (iv) los LTh, reconocen antgenos presentados en molculas MHC clase II por las clulas dentrticas interdigitantes; esto dar lugar a activacin y proliferacin clonal en la pulpa blanca (folculo secundario). A modo de resumen, los linfocitos se forman en la pulpa blanca, las clulas B de memoria y clulas plasmticas en los folculos linfticos y las subpoblaciones de clulas T en las vainas linfticas periarteriales. Los LB y LT recin formados entran en los senos marginales y emigran hacia el sitio inflamatorio, o forman parte de la reserva

recirculante de linfocitos. La mayora de las clulas plasmticas emigran a la mdula sea para sintetizar y secretar anticuerpos en los senos medulares; slo algunas se quedan en la zona marginal para hacer lo propio en los senos marginales. La pulpa roja est compuesta de sinusoides venosos separados por cordones parenquimatosos, que consisten en mallas de clulas reticulares y fibras reticulares, en la que existen abundantes eritrocitos, macrfagos, linfocitos, clulas plasmticas y granulocitos. Estos macrfagos son responsables de retirar de la circulacin los glbulos rojos y plaquetas, senescentes y alterados. Desde el punto de vista inmune, el bazo presenta una funcin similar a los ganglios linfticos, la diferencia fundamental radica en que el bazo es el ms importante sitio de respuesta inmune a antgenos circulantes y los ganglios linfticos participan en la respuesta inmune a antgenos presentes en la linfa. El concepto de respuesta inmune se refiere a la respuesta inmune innata y especfica, tanto celular (fagocitosis, activacin de clulas T) como humoral (activacin de clulas B con la consiguiente sntesis de anticuerpos). 3.2.3 Tejido linfoide asociado a mucosa En muchas regiones del cuerpo, el tejido linfoide no est encapsulado como en los ganglios linfticos y el bazo. Se trata de tejido linfoide difuso sin organizacin especial, que no se separa con precisin del tejido conectivo vecino, pero que presenta folculos linfoides aislados. A estos tejidos se le denomina tejido linfoide asociado a mucosa (MALT), las localizaciones ms caractersticas son las asociadas a la mucosa intestinal (GALT, gut) y respiratoria (BALT, broncus) (figura 3-16); tambin existe en la mucosa urogenital (ver captulo 16). Adems de linfocitos, clulas que se encuentran en mayor porcentaje, tambin se hallan linfoblastos, clulas plasmticas y macrfagos. Los folculos de los MALT son similares a los existentes en el bazo y los ganglios linfticos; las regiones centrales son ricas en clulas B, igual que los centros germinales. GALT. Todo el tracto gastrointestinal contiene MALT. Sin embargo, el intestino delgado, principalmente el leon, adems de folculos linfoides aislados, contiene conglomerados linfoides denominados placas de Peyer. stas presentan un folculo formado por clulas B, rodeado por una regin ms laxa de clulas T y macrfagos que

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actan como CPA. Las placas de Peyer no cuentan con vasos linfticos aferentes, pero s presentan vasos linfticos eferentes que drenan en los ganglios linfticos mesentricos. Los linfocitos llegan a las placas a travs de pequeas arteriolas que son drenadas por HEV. Si bien el leon est revestido por epitelio cilndrico simple, las zonas adyacentes a los folculos linfoides de las placas estn cubiertas por clulas de tipo escamoso (pequeas y anchas) llamadas clulas M, a travs de las cuales los antgenos luminales penetran por pinocitocis y fagocitosis. (figura 3-23)

La IgA es la clase de anticuerpo que ms activa y eficientemente puede ser secretada a travs del epitelio. Ello le significa una importante participacin en la defensa contra patgenos a nivel de las vas respiratorias y del tracto intestinal. En el intestino la produccin de IgA se inicia por el ingreso de los antgenos a las placas de Peyer, donde clulas T de regiones interfoliculares y clulas B foliculares, son estimuladas. Algunos de los linfocitos B se diferencian a clulas productoras de IgA y migran a la lmina propia, ubicada bajo el epitelio de mucosa. Las citoquinas ms importantes en el cambio de clase a isotipo IgA son el factor de crecimiento transformante B (TGF-B) e IL-5 (ver captulo 6). Algunas clulas B activadas migran a los centros germinales de las placas de Peyer, donde ocurren proliferacin de los LT y mutaciones somticas de los genes de Ig, lo que conduce a una mayor afinidad de los anticuerpos. Los linfocitos productores de IgA pueden permanecer en la lmina propia o pueden migrar a otras mucosas u rganos linfoides. 3.2.4 Amgdalas Las amgdalas son agregados encapsulados, de manera incompleta, de folculos linfoides. Existen 3 tipos de amgdalas: (a) palatinas: bilaterales, localizadas en los lmites de la cavidad oral y la faringe; (b) farngea: nica, ubicada en el techo de la faringe nasal y (c) linguales: varias, se encuentran en superficie dorsal del tercio posterior de la lengua (figura 13-16). Por su estratgica localizacin, las amgdalas estn directamente expuestas a tomar contacto con antgenos inhalados e ingeridos. El parnquima de los diferentes tipos de amgdalas es similar, est conformado por folculos linfoides ricos en clulas B, los que pueden presentar centros germinales. Reaccionan a los antgenos formando linfocitos y estableciendo una reaccin inflamatoria. La superficie de las amgdalas est recubierta por epitelio, diferente en cada caso. 4. TRNSITO LINFOCITARIO Una parte de los linfocitos formados en la mdula sea pasa al timo, donde se diferencia a clulas T y otra parte se diferencia a clulas B en la propia mdula sea. Luego de adquirir en los rganos linfoides primarios, los receptores que los caracterizan como linfocitos T (helper y

Figura 3-23. Participacin de las clulas M en la incorporacin de antgenos hasta las placas de Peyer. Las clulas M, expuestas hacia el lumen intestinal, permiten el ingreso de antgenos por pinocitosis y fagocitosis. De esta forma los antgenos pueden tomar contacto con los linfocitos y macrfagos de las placas de Peyer.

BALT. El tejido linfoide asociado la mucosa de bronquios es, estructuralmente, similar a las placas de Peyer, presenta folculos ricos en clulas B, y sectores en que existen LT y CPA. El BALT se encuentra en los bronquios de todos los lbulos pulmonares; se ubica principalmente en las bifurcaciones de los bronquios y bronquiolos. Al igual que en el GALT en la zona adyacente a los folculos linfoides el epitelio cilndrico es reemplazado por clulas M descritas en el GALT. Tampoco presentan vasos linfticos aferentes, pero s eferentes y est ricamente vascularizado.

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citotxicos) y linfocitos B, las clulas linfoides vrgenes pasan a travs de la circulacin general a los tejidos linfoides secundarios. El paso desde la sangre por las HEV se ve favorecido por molculas de adhesin (ver captulo 12); molculas que presentan ciertas diferencias dependiendo del tipo de linfocito (virgen o de memoria) y del tejido de destino (ganglio linftico, placas de Peyer, GUT o piel). All toman contacto con los antgenos para los cuales presentan especificidad. En los rganos linfoides secundarios se ubican en zonas especficas, as los folculos linfoides son ricos en LB y la paracorteza (de los ganglios linfticos) es rica en LT. Aqu en los rganos linfoides secundarios se generan los linfocitos de memoria (T y B) y efectores (linfocitos T citotxico y clulas plasmticas Los linfocitos salen de los ganglios linfticos a travs de los vasos linfticos eferentes, para llegar nuevamente a la circulacin a travs del conducto torcico y conducto linftico derecho (figura 3-24). En condiciones normales, los linfocitos estn recirculando permanentemente, lo cual proporciona una vigilancia inmunolgica ms eficiente, al permitir la presencia de todo el repertorio de linfocitos antgeno-especficos, en diferentes partes del organismo.

LECTURAS SUGERIDAS Austyn, J. and Wood, K., Principles of cellular and molecular immunology, Chapter 1, Oxford University Press, New York, 1993. Babior, B., NADPH oxidase: An update, Blood, 93(5):1464-1476, 1999. Bokoch, G., Chemoattractant signaling and leucocyte activation, Blood 86(5):1649-1660, 1995. Degos, L; Linch, C.; Lwenberg, B., Textbook of Malignant Haematology, Chapters 3, 4, Martin Dunitz, 1999. Gartner, L. y Hiatt, J., Traducido por Sapia, S., Histologa, texto y atlas, Captulos 10 y 12, Interamericana, 1997. Geneser, F., Histologa: sobre bases moleculares, Captulos 10, 11 y 16, Editorial Panamericana, 2001.

Figura 3-24. Recirculacin de los linfocitos. Una vez que las clulas T y B salen de los rganos linfoides primarios como linfocitos maduros, pasan a travs de la circulacin general a los tejidos linfoides secundarios. Desde los ganglios linfticos, salen a travs de los vasos linfticos eferentes y vuelven a la circulacin general, fundamentalmente, por el conducto torcico.

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Hampton, M.; Kettle, A.; Winterbown, C., Inside the neutrophil phagosome: oxidants, mieloperoxidase, and bacterial killing, Blood, 92(9): 3007 - 3017, 1998. Lee, R.; Foerter, J.; Lukeng, J.; Pareskevas, F.; Greer, J.; Rodgers, G., Editors, Wintrobe's clinical hematology, Chapters 8, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, Lippincott Willians E. Wilkins, Philadelphia, 1998. Palomo, I. y Pereira, J., Fundamentos inmunolgicos en Fisiopatologa de las citopenias inmunes, Editorial Universidad de Talca, Talca, 1995. Paul, W., Editor, Fundamental Inmunology (Four Edition), Chapters 14, 30, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1999. Pereira, J., Produccin, cintica y funcin de los granulocitos en Fisiologa de la sangre (Mezzano, D. y Pereira, J., Editores), captulo 7, Editorial Universitaria, P. Universidad Catlica de Chile, Santiago, Chile, 1993. Stiene-Martin, A.; Lotspeich-Steininger, Ch.; Koepke, J., Clinical Hematology: Principles, procedures and correlations, Second edition, Chapter 23, 1998.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 4
INMUNIDAD INNATA
Ivn Palomo G., Adriana Ardiles S. y Ulises Vergara C.

1. Introduccin 2. Componentes de la inmunidad innata o natural 3. Fase de reconocimiento en la respuesta inmune innata 4. Fase efectora en la respuesta inmune innata 5. Proyeccin clnica 6. Filogenia de la respuesta inmune innata

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RESUMEN La inmunidad innata es la primera lnea de defensa contra la infeccin. Posee mecanismos de reconocimiento de diversidad limitada codificadas en la lnea germinal. No posee memoria. Est constituido por diversos tipos celulares y molculas solubles que juegan un rol en el reconocimiento de microorganismos y tambin en la fase efectora de la respuesta innata. Filogenticamente es el mecanismo de defensa ms antiguo y se ha conservado a lo largo de la evolucin. Acta rpidamente para eliminar al antgeno a travs de mecanismos microbicidas y respuesta inflamatoria. Por ser sus mecanismos efectores tan potentes y con capacidad de producir dao tisular del husped estn finamente regulados por diversos mecanismos de control. La respuesta innata tiene la capacidad de alertar y dirigir la respuesta inmune adquirida orientndola hacia una respuesta celular o humoral especfica.

1. INTRODUCCIN El sistema inmune es parte de los mecanismos biolgicos destinados a mantener la integridad estructural y funcional de los individuos y, est genticamente programado para la neutralizacin y eliminacin tanto de agentes infecciosos, clulas y molculas extraas, como detritus y productos moleculares de clulas propias envejecidas, transformadas o tumorales. Los componentes celulares y moleculares del sistema inmune se han separado tradicionalmente en componentes naturales o innatos y componentes adquiridos o especficos que han desarrollado estrategias, mecanismos y receptores distintos para el reconocimiento inmunolgico. As, mientras la inmunidad especfica se basa en el tamao y la diversidad del repertorio linfocitario T (1018) y B (1014) y requiere la activacin y expansin clonal de linfocitos T y B nicos y especficos para el desarrollo de una respuesta inmune eficiente; el sistema innato utiliza unos pocos cientos de receptores de expresin constitutiva y no clonal en las clulas de la inmunidad natural y, cuya especificidad est dirigida a molculas o patrones moleculares altamente conservados en grandes grupos de agentes infecciosos (PAMPs= Pathogen Associated Molecular Patterns). La inmunidad innata es filogenticamente ms antigua que la adquirida, se ha conservado a lo largo de la escala evolutiva y constituye la primera lnea de defensa contra la infeccin. Est constitui-

da por un conjunto de diversos tipos celulares y factores solubles encargados de la resistencia del husped ante agentes infecciosos con los cuales nunca ste ha tenido contacto. A diferencia de la inmunidad especfica, la inmunidad innata es de accin inmediata, no requiere exposicin previa al antgeno y no se modifica con exposiciones repetidas al agente infeccioso. Su rapidez de activacin y, por lo tanto, rapidez de la respuesta efectora a la infeccin, colocan a la inmunidad innata en una situacin privilegiada para eliminar a los agentes infecciosos. Sin embargo, no debemos olvidar que en el curso de la evolucin estos microorganismos han desarrollado diversas estrategias para evadir, distraer, suprimir o manipular en su propio beneficio, los diversos mecanismos efectores de la respuesta inmune. Por otra parte, los huspedes han desarrollado mecanismos defensivos cada vez ms selectivos y especficos. Esto ha significado mejorar, diversificar y amplificar mediante mecanismos de recombinacin gnica, el repertorio de receptores linfocitarios aumentando as la probabilidad que un linfocito individual y nico reconozca antgenos del microorganismo. Estos cambios evolutivos han permitido el surgimiento de la inmunidad adquirida, optimizando la defensa inmunolgica de los hospederos y por lo tanto su sobrevida en un ambiente siempre cambiante y de gran complejidad. Existe una interaccin bidireccional entre estos dos sistemas: el sistema inmune innato funciona como una alerta para el sistema inmune especfico y puede determinar el tipo de respuesta

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adquirida, ya sea humoral o celular. Por otra parte, el sistema inmune especfico utiliza los mecanismos efectores de la inmunidad innata para eliminar a los microorganismos haciendo ms eficiente el proceso de fagocitosis y amplificando la respuesta inflamatoria mediante la activacin del complemento por la va clsica (figura 4-1). Del balance entre la efectividad de los mecanismos inespecficos para eliminar la infeccin y de la carga del agente infectante va a depender la evolucin de la infeccin. Si sta persiste por ms tiempo, el influjo de monocitos y macrfagos al sitio de infeccin va a llevar al procesamiento y presentacin de antgenos del agente infeccioso al sistema inmune especfico, con su consecuente activacin (figura 4-2). Despus de un tiempo relativamente corto de 3 a 5 das, los anticuerpos producidos por la progenie de los clones de linfocitos B activados van a producir una opsonizacin adicional del agente infeccioso. La fijacin de anticuerpos en la superficie bacteriana por s sola puede no tener un efecto nocivo para la sobrevida bacteriana, sin embargo, a travs de la activacin de la va clsica de complemento y de la fagocitosis se acelera la eliminacin de dicho agente. A su vez, los linfocitos T (LT) secretan citoquinas que activan a los monocitos y macrfagos, permitindoles eliminar organismos ingeridos que resisten la destruccin por parte de clulas no activadas. As, los mecanismos inespecficos que iniciaron la reaccin inmune vienen ahora a completar su efecto, bajo la direccin y activacin de la inmunidad especfica (figuras 4-1 y 4-2). 2. COMPONENTES DE LA INMUNIDAD INNATA Los componentes del sistema inmune innato son un grupo heterogneo de clulas y factores solubles (tabla 4-1). Estos componentes se ubican en posibles puntos de entrada de los agentes infecciosos desde el medio ambiente; en la circulacin, donde pueden hacer una labor de vigilancia y, en los tejidos donde finalmente se llevar a cabo la respuesta efectora si es que el agente infeccioso ha logrado sobrepasar estas primeras barreras. Estos mecanismos son de tipo fsico; estn preformados o mantenidos bajo control por el husped. Deben ser activados rpidamente en respuesta a la infeccin, pero debido a su alta potencia e inespecificidad, pueden producir dao tisular, por lo tanto, su activacin debe ser regulada. Con respecto a los componentes celulares

(tabla 4-1), se puede citar la integridad de la piel y de las mucosas del tracto respiratorio, digestivo y urogenital. Al estar las clulas epiteliales firmemente adheridas, constituyen una barrera muy importante en la resistencia del husped a la infeccin. Cada sistema posee caractersticas particulares de acuerdo con su anatoma y fisiologa. As por ejemplo, en el aparato respiratorio, el flujo de aire o de fluidos a lo largo del epitelio, unido al movimiento ciliar ejerce una funcin de barrido de microorganismos que se hayan adherido al mucus impidiendo de esta manera la adhesin a las clulas epiteliales. En la inmunidad innata participan linfocitos con caractersticas especiales que los hacen ms afines con sta que con la inmunidad adquirida. Estos linfocitos tienen un receptor para antgeno de diversidad limitada. Son los linfocitos T intraepiteliales y los linfocitos B-1. Los primeros producen citoquinas, activan fagocitos y causan la muerte de las clulas infectadas; y los segundos, producen anticuerpos naturales clase IgM. Constituyen un mecanismo preformado para enfrentar microorganismos que sobrepasan las barreras epiteliales. Los mastocitos son otro tipo celular que participa en la inmunidad innata. Se ubican en las proximidades de pequeos vasos sanguneos y posee mediadores de la inflamacin preformados como histamina, serotonina, factor quimiotctico para eosinfilos, factor quimiotctico para neutrfilos, heparina, quimasa, peroxidasa, etc. Tambin tienen la capacidad de secretar mediadores lipdicos de neoformacin tales como las prostaglandinas, tromboxano y leucotrienos y mediadores proteicos de neoformacin como las citoquinas. El lipopolisacrido puede inducir directamente la liberacin de productos de los mastocitos e indirectamente, a travs de la activacin del sistema del complemento. Los mastocitos, por estas caractersticas, pueden iniciar y orquestar la respuesta inflamatoria en los sitios de infeccin. Otros tipos de clulas que intervienen en la inmunidad innata son los polimorfonucleares (PMN) neutrfilos, eosinfilos, los monocitos y las clulas natural killer (NK). Todas estas clulas tienen la propiedad de circular y migrar. Ello les permite ejercer una vigilancia eficiente y una rpida llegada a los lugares de infeccin. Estas clulas se originan en la stem cell de la mdula sea, la que se diferencia a un precursor mieloide (que genera los granulocitos, monocitos y

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Figura 4-1. El sistema inmune. El sistema inmune est compuesto de dos ramas principales: inmunidad innata y adquirida. La confrontacin del sistema inmune innato con patgenos lleva a su rpida activacin y capacita al sistema inmune especfico para responder apropiadamente. Existen interconexiones entre los mediadores solubles y celulares de ambos sistemas, que interactan aumentando la eficacia de la respuesta. Modificado de Ploegh, HL., Science 1998; 280:248.

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Figura 4-2. Interacciones entre inmunidad innata y adquirida. Los anticuerpos producidos por los linfocitos B, al unirse a los microorganismos actan como agentes opsonizantes. Las citoquinas liberadas por las clulas T activan las clulas fagocticas para destruir el material que stos han endocitado. A su vez, los macrfagos y monocitos pueden presentar el antgeno a las clulas T y causar su activacin.

macrfagos) y a un precursor linfoide del cual derivan las clulas NK (ver captulo 3). Los polimorfonucleares son el tipo celular ms numeroso a nivel circulante. Son de corta vida y se producen en gran nmero en la respuesta inflamatoria. Estas clulas deben migrar al sitio de infeccin abandonando el torrente sanguneo en respuesta a seales moleculares. Los PMN poseen grnulos primarios y secundarios. Los grnulos primarios contienen mieloperoxidasa, que potencia la actividad microbicida del perxido de hidrgeno; lisozima, que hidroliza uniones glicosdicas entre cido acetilmurmico y

acetlglucosamina en la pared celular bacteriana; hidrolasas neutras y cidas, que degradan macromolculas microbianas, y protenas catinicas que destruyen bacterias gram negativas. Los grnulos secundarios contienen lisozima, lactoferrina, que tiene la capacidad de que el fierro requerido para el crecimiento microbiano lo que produce bacteriostasis y colagenasa que digiere macromolculas bacterianas. Los monocitos son los precursores circulantes de los macrfagos tisulares. Se encuentran en gran nmero en tejido conectivo, pulmn (macrfagos alveolares e intersticiales), hgado (clulas de Kpfer), bazo (macrfagos esplnicos), cerebro (clulas de la microgla). Las clulas NK o linfocitos granulares grandes presentan actividad citotxica directa y citotoxidad dependiente de anticuerpos y participan en defensa contra clulas infectadas por virus precozmente durante la infeccin (ver captulo 19). No expresan receptores de linfocitos T. Poseen receptores de activacin KAR (Killer Activating Receptor) que reconocen patrones moleculares o PAMPs hidrocarbonados propios de los agentes infecciosos y activan la citotoxicidad directa. Receptores Fc reconocen anticuerpos especficos unidos a la membrana de los agentes infecciosos y activan la citotoxicidad dependiente de anticuerpos. Las clulas NK poseen adems receptores de inhibicin KIR Killer Inhibition Receptor que reconocen molculas codificadas por el Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) y transducen seales de inhibicin de la citotoxicidad contra clulas propias que expresan estas molculas MHC. Adems de ser una barrera fsica, la piel y

Tabla 4-1. Componentes de la inmunidad innata Celulares Clulas epiteliales de la piel y mucosas Linfocitos T intraepiteliales Linfocitos B-1 Mastocito Polimorfonucleares neutrfilos Monocitos Macrfagos Clulas Natural Killer Solubles Defensinas, lisozima y otras Sistema del complemento Colectinas Pentraxinas Factores de coagulacin Citoquinas: TNF, IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IFN Quimioquinas: IL-8, MC, MIP

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mucosas poseen sustancias como cidos grasos (piel), enzimas como lisozima (presente en saliva, sudor, lgrimas) y pptidos antibacterianos como defensinas con accin microbicida o inhibidora del crecimiento bacteriano. A nivel digestivo, participan la lisozima de la saliva, el pH cido del estmago, las criptidinas (pptidos antibacterianos generados en las criptas del intestino delgado), y la flora normal que compite por nutrientes con microorganismos patgenos y tambin elabora sustancias antibacterianas tales como las colicinas, que previenen la colonizacin por otro tipo de bacterias dentro del intestino. Adems de los Componentes solubles mencionados en relacin con las barreras epiteliales y mucosas, en la inmunidad innata hay otros componentes de este tipo, que participan en la fase de reconocimiento y en la fase efectora (tabla 4-1). A continuacin se describen brevemente: El complemento es un sistema de protenas plasmticas que interactan entre s de una manera regulada. Es un mecanismo efector de la inmunidad humoral inespecfica y tiene un rol amplificador de la respuesta inflamatoria. Los precursores de este sistema deben ser activados secuencialmente por reacciones bioqumicas a travs de dos vas principales: clsica y alterna, que comparten una secuencia terminal comn. La va clsica se activa por inmunocomplejos de IgG o IgM y la va alterna se activa por lipopolisacridos de pared bacteriana, polisacridos y agregados de inmunoglobulinas. La va de las lectinas de la activacin del complemento es gatillada por la unin de polisacridos microbianos a lectinas circulante (ver captulo 18). Las colectinas son una familia de protenas caracterizadas por la presencia de un dominio colgenosmil y un dominio lectina. Juegan un rol en la inmunidad innata al actuar como receptores de patrones de reconocimiento y pueden activar al complemento va unin de C1q. Las pentraxinas son una familia de protenas del plasma que contienen cinco unidades globulares. La protena C reactiva es el miembro ms importante de esta familia: (a) es un reactante de fase aguda que se sintetiza a nivel heptico, (b) su ligando es polisacrido bacteriano, (c) reconoce tambin constituyentes fosfolipdicos de clulas daadas, (d) funciona como opsonina y (e) puede activar el complemento por va clsica, por su unin a C1q. El sistema de la coagulacin adems de participar en la hemostasia y contribuir a evitar localmente la diseminacin de la infeccin, est estrechamente unido a la injuria tisular y al proceso in-

flamatorio secundario a la infeccin. Interviene en la fase de reparacin tisular y en consecuencia en la recuperacin de la integridad de los tejidos. El sistema de la coagulacin, junto a las otras cascadas plasmticas enzimticamente gatilladas, como el sistema de las quininas, el sistema de la fibrinolisis y el sistema del complemento, son mediadores de la inflamacin. Estos sistemas se interrelacionan por lo que la activacin de uno de ellos puede producir la activacin de los otros. La puesta en marcha de la accin de los mediadores plasmticos de la inflamacin junto con la activacin de los mediadores celulares, contribuye a la eliminacin del agente infeccioso a travs de la respuesta inflamatoria local. Las citoquinas son una familia de protenas que participan tanto en la inmunidad innata como en la inmunidad adquirida (ver captulo 11). Ellas son producidas por diversos tipos celulares. Comunican clulas del sistema inmune entre s. Ejercen acciones locales y a distancia sobre diferentes tipos celulares. Las citoquinas que participan en la inmunidad innata son generadas por macrfagos activados en sitios de infeccin. Hay citoquinas de alarma o proinflamatorias como interleuquina 1 (IL-1), factor de necrosis tumoral (TNF) e interleuquina 6 (IL-6), las cuales inducen en la etapa precoz de la infeccin una repuesta inflamatoria local dirigida a contenerla y, eventualmente, inducen una respuesta sistmica o de fase aguda. Otras citoquinas tienen funcin quimiotctica para leucocitos como interleuquina 8 (IL-8). La interleuquina 12 (IL-12) activa clulas NK y estimula a los macrfagos, la interleuquina 10 (IL-10) inhibe a los macrfagos y los interferones (IFN) y tienen actividad antiviral.

3. FASE DE RECONOCIMIENTO EN LA RESPUESTA INMUNE INNATA La diferencia esencial entre los sistemas inmunolgicos innato y adquirido es el modo a travs del cual reconocen a los microorganismos. El sistema inmune innato emplea protenas codificadas en la lnea germinal. Reconoce estructuras compartidas por diferentes tipos de microorganismos (patrones moleculares). Estas protenas pueden ser receptores de superficie celular o sustancias solubles de diversidad limitada. Las principales molculas solubles de reconocimiento de la inmunidad innata, en general, reconocen estructuras carbohidrato (tabla 4-2). Las prin-

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cipales son Protena C reactiva, Protena amiloide srico, mannose binding protein (MBP), lipopolysaccharide binding protein (LBP), CD14 soluble y C3. Es importante destacar que algunos de estos receptores solubles tienen la capacidad de activar complemento y de esa manera pueden favorecer la fagocitosis, amplificar la respuesta inflamatoria y lisar a microorganismos. Otros son profagocticos. Claramente se puede ver que la funcin de reconocimiento est unida a funciones efectoras.

Subsecuentemente la activacin del macrfago es el resultado de seales gatilladas por la subunidad Tolllike-4. La activacin de los macrfagos se evidencia a travs de la estimulacin de sntesis de protenas que van a favorecer la funcin microbicida (oxidasas, xido ntrico sintetasa), la trombosis (factor tisular), la remodelacin tisular (proteasas, factores de crecimiento, factores angiognicos), inflamacin local y respuesta de fase aguda (IL-1, IL-6 y TNF), activacin de otros tipos celulares (IL-12) y

Tabla 4-2. Inmunidad innata: molculas solubles de reconocimiento Sntesis heptica Ubicacin Ligando: srica Polisacridos Ligando: Protena matriz extracelular Activacin complemento Profagoctica

PCR PAS MBP LBP sCD14 C3

+ + + + +

+ + + + + +

+ + + + + +

+ + + + +

+ + + + +

PCR, Protena C reactiva; PAS, Protena amiloide A; MBP, Mannose binding protein; LBP, Lipopolysaccharide binding protein; sCD14, CD14 soluble.

Los principales receptores celulares de reconocimiento de la inmunidad innata (tabla 4-3) se ubican en la membrana celular de polimorfonucleares neutrfilos, monocitos y macrfagos, dotndolos as de la capacidad de vigilancia de microorganismos que puedan haber ingresado al husped habiendo sobrepasado la barrera inicial del sistema de defensa inespecfico. Reconocen glicoprotenas y lipopolisacridos bacterianos comunes a muchos patgenos y que no estn presentes en clulas de mamferos. Son los receptores de patrones de reconocimiento. Adems, los receptores solubles y celulares de reconocimiento pueden actuar en conjunto para llevar a cabo su funcin. De este modo el sistema sensor de lipopolisacrido (LPS) del macrfago est constituido por tres componentes: una protena plasmtica de unin a LPS que es LBP, un receptor de superficie celular para LPS que es CD14 y un receptor transductor de seales llamado receptor Toll-like4. LPS circulante es inicialmente unido a LBP y luego es entregado a CD14 sobre la superficie del macrfago donde la LBP es liberada.

estimulacin de la respuesta especfica a travs de presentacin antignica y de la expresin de molculas coestimuladoras. Entre otros receptores celulares de reconocimiento que presentan los polimorfonucleares neutrfilos se encuentran el receptor para el pptido bacteriano que contiene residuos N-formil metionil y el receptor para fragmento de complemento como CR3, que puede directamente reconocer bacterias para fagocitosis.

4. FASE EFECTORA EN LA RESPUESTA INMUNE INNATA La unin ligando-receptor induce respuestas celulares que estimulan la inflamacin y la accin microbicida. Entre los sistemas mediadores de la inflamacin juega un rol preponderante el sistema de las cascadas plasmticas enzimticamente gatilladas: sistema de la coagulacin, sistema de las quininas, sistemas de la fibrinolisis y sistema del complemento (figura 4-3). Estos siste-

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Tabla 4-3. Inmunidad innata: receptores celulares de reconocimiento Ubicacin Receptor de manosa Receptores scavenger Receptor CD14/Toll-like Receptor CR3 Receptor pptido Nformilmetionil Macrfago tisular Macrfago tisular Monocitos y macrfagos Monocitos, macrfagos y PMN neutrfilos PMN neutrfilos, macrfagos Ligando Glicoprotenas microbianas Pared celular de bacterias y hongos LPS iC3b, LPS Protenas bacterianas Funcin Fagocitosis Fagocitosis Activacin de macrfagos Fagocitosis, adhesin Activacin neutrfilos y macrfagos

LPS, Lipopolysaccharide (lipopolisacrido) ; PMN, polimorfonucleares.

mas estn interrelacionados y juegan un papel amplificador de la respuesta inflamatoria. El factor Hageman o factor XII es fundamental; su activacin (por superficies cargadas negativamente, como colgeno, membranas basales, expuestos durante la injuria tisular) inicia la cascada de la coagulacin, del sistema de las quininas y de la fibrinolisis. La plasmina activa al sistema del complemento; factores derivados de ste participan en la inflamacin aguda, como C3a y C5a, que actan sobre el mastocito produciendo su degranulacin y liberando histamina, lo que produce aumento de la permeabilidad vascular y vasodilatacin. C5a favorece la adhesin, quimiotaxis y activacin de leucocitos. C3b es una

opsonina y favorece la fagocitosis por neutrfilos y macrfagos. La activacin del sistema de las quininas libera bradiquinina, que aumenta la permeabilidad vascular y tambin provoca dolor. Adems, el quiningeno, de alto peso molecular, es un cofactor en la activacin del factor Hageman. La calicreina por s misma, al ser un activador de este factor, permite la amplificacin autocataltica del estmulo inicial. Los neutrfilos y macrfagos activados matan microorganismos por medio de enzimas lisosomales, intermediarios reactivos del oxgeno y xido ntrico, o sea tambin en relacin con estos receptores de superficie celular se puede ver la unin entre funcin de reconocimiento y funciones efectoras.

Figura 4-3. Sistemas mediadores del plasma en la inflamacin. Protenas de los sistemas de la coagulacin, de la fibrinolisis, de las cininas y del complemento interaccionan, participando como mediadores qumicos de la inflamacin. CAPM, ciningeno de alto peso molecular; AP, activador del plasmingeno; PDF, productos de degradacin de la fibrina.

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Con respecto a mediadores de la inflamacin de origen celular los productos derivados del metabolismo del cido araquidnico son fundamentales (figura 4-4). Luego de su liberacin desde fosfolpidos de membranas a travs de la activacin de fosfolipasa A2, el cido araquidnico es metabolizado a travs de dos vas, la va de la cicloxigenasa y la va de la lipoxigenasa. En la va de la cicloxigenasa se obtienen secuencialmente, entre otros metabolitos, los endoperxidos prostaglandinas G2 y H2, tromboxano A2 (agregante plaquetario y vasoconstrictor), prostaciclina o prostaglandina I2 (antiagregante plaquetario y vasodilatador) y las prostaglandinas E2, F2 y D2 (vasodilatadores). El tromboxano A2 se sintetiza, fundamentalmente, en las plaquetas y la prostaciclina en las clulas endoteliales. En la va de la lipoxigenasa se genera el cido hidroperoxieicosatetraenoico (HETE), un potente agente quimiotctico para los neutrfilos. El HETE puede originar el leucotrieno A4, a partir del cual se generan los leucotrienos B4 (factor quimiotctico) y leucotrienos C4, D4 y E4, que aumentan la permeabilidad vascular. El trmino leucotrieno se debe a que presentan una cadena conjugada trinica y que se aislaron originalmente en los leucocitos.

bios vasculares de aumento de flujo y de permeabilidad, producidos por los mediadores qumicos de la inflamacin y el reclutamiento de leucocitos hacia los sitios de infeccin con la formacin subsecuente del infiltrado inflamatorio. Este reclutamiento es estimulado por citoquinas y mediado por molculas de adhesin. Estas molculas son glicoprotenas unidas a la membrana celular que permiten a la clula interactuar con otra (ver captulo 12). La migracin de los leucocitos se realiza a travs del endotelio de la vnula postcapilar. Productos bacterianos como lipopolisacridos e IL-1 y TNF secretados por macrfagos estimulan a las clulas endoteliales para expresar secuencialmente selectinas e integrinas que median la adhesin preferencial de diferentes tipos de leucocitos. Las selectinas intervienen en la unin inicial, laxa del leucocito con la clula endotelial y las integrinas median la unin estable entre aquellas clulas. Esta unin es previa a la migracin del leucocito a travs de los espacios intercelulares endoteliales. Los quimioatractantes activan la adhesividad de las integrinas y dirigen la migracin de los leucocitos de acuerdo al gradiente de concentracin de factores quimiotcticos hasta llegar al foco de infeccin (figura 4-5).

Figura 4-4. Metabolitos del cido araquidnico. Una vez desesterificado por la fosfolipasa A2, el cido araquidnico es metabolizado a travs de las vas de la cicloxigenasa y de la lipoxigenasa. PGG2 y PGH2, endoperxidos; PGI2, prostaciclina; PGE2, PGF2a y PGD2, prostaglandinas; HPETE, cido hidroxieicotetranoico; LTA4-LTE4, leucotrienos.

Figura 4-5. Migracin de leucocitos en inflamacin. Varias familias de molculas de adhesin controlan la migracin de leucocitos durante la inflamacin; las selectinas facilitan el rodamiento (rolling), las quimioquinas dan las seales que convierten la interaccin de baja afinidad mediada por selectinas en una interaccin de alta afinidad mediadas por integrinas previa a la extravasacin de leucocitos.

La respuesta inflamatoria local se evidencia semiolgicamente por los cinco signos clsicos: aumento de volumen, eritema, aumento de temperatura local, dolor e impotencia funcional. Dichos signos son la expresin clnica de los cam-

Los neutrfilos inician el englobamiento a travs de la proyeccin de pseudpodos alrededor del microorganismo, y luego fusionan los polos distales de aquellos, para formar el fagosoma.

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Los grnulos citoplasmticos de los leucocitos polimorfonucleares se fusionan a la base del fagosoma y descargan su contenido dentro de l. Estos grnulos, como se dijo anteriormente, contienen enzimas y otras sustancias bactericidas o bacteriostticas. Cuando los fagocitos son activados por estmulos particulados o solubles, la va glicoltica y el shunt hexosamonofosfato, son estimulados para producir nicotinamida adenina dinucletido fosfato reducido (NADPH). NADPH es un sustrato para la enzima NADPH oxidasa, que es activada. Esta activacin reduce el oxgeno molecular a anin superxido, que es convertido a H2O2, el cual por medio de la accin de la mieloperoxidasa, tambin presente en fagocitos, forma OCl-, potente citotxico (ver captulo 3). Otra va incluye la produccin de xido ntrico. Los neutrfilos activados expresan una enzima inducible llamada xido ntrico sintetasa que genera xido ntrico a partir del aminocido arginina y oxgeno molecular; en presencia de otras especies reactivas de oxgeno dentro de la vacuola fagoctica el xido ntrico se convierte en otros productos altamente txicos para microorganismos. Hay un aumento del consumo de oxgeno por el neutrfilo llamado estallido respiratorio que se produce inmediatamente despus de la fagocitosis. Estas vas oxidativas proporcionan algunos de los efectos antimicrobianos preponderantes de los neutrfilos. La generacin de radicales libres es regulada cuidadosamente para evitar dao tisular por el sistema del glutatin, catalasa, superxidodismutasa, etc. La respuesta de fase aguda se caracteriza por un conjunto de cambios que afectan al sistema nervioso, endocrinolgico y hematolgico. Tambin se presentan alteraciones del metabolismo y de la nutricin. Pero, sin duda, lo ms llamativo es la respuesta febril y la sntesis de protenas de fase aguda. Estos cambios reemplazan a los mecanismos homeostticos normales por nuevos equilibrios y prioridades los que presumiblemente contribuyen a mejorar la respuesta adquirida. La mayor parte de estos cambios se presentan dentro de las etapas iniciales de la infeccin y son mediados por IL-1, TNF e IL-6. La sntesis de estas citoquinas es inducida por lipopolisacridos bacterianos que estimulan al macrfago. La respuesta de fase aguda se caracteriza por la presencia de fiebre, somnolencia, anorexia; aumento de ACTH, cortisol y catecolaminas y disminucin de Insulin like growth factor 1 (IGF-1); aumento de la cantidad de neutrfilos inmaduros circulan-

tes, anemia de enfermedades crnicas y trombocitosis; balance nitrogenado negativo, prdida de masa muscular, disminucin de la gluconeognesis, aumento de la lipolisis del tejido adiposo y caquexia; disminucin del zinc y del fierro sanguneos; y aumento de la sntesis heptica de protenas de fase aguda. En general, las protenas de fase aguda tienen funciones destinadas a favorecer la eliminacin de agentes infecciosos, limitar el dao tisular, favorecer la reparacin y por lo tanto restablecer la homeostasis (tabla 4-4). Hay protenas de fase aguda cuyos niveles sricos aumentan significativamente y se conoce su evolucin durante el curso de la infeccin. La variacin de estos parmetros tiene utilidad clnica para el seguimiento de las infecciones. Las protenas de fase aguda cuyos niveles tienen mayor modificacin son: Protena C reactiva y protena amiloide srico. Tambin aumenta MBL (Mannose Binding Lectin). La Protena C reactiva inicia su aumento srico entre seis u ocho horas de iniciado el proceso, alcanzando el mximo nivel a los dos o tres das. La Protena C reactiva y MBL actan como opsoninas y activan complemento, por lo tanto el husped puede disponer rpidamente de dos protenas con propiedades funcionales que facilitan la fagocitosis y amplifican la respuesta inflamatoria. La concentracin srica de otras protenas disminuye durante la respuesta de fase aguda; estas protenas no son requeridas para la defensa del husped. La respuesta de fase aguda disminuye al eliminarse la infeccin, por la inhibicin de citoquinas mediada por glucocorticoides y por citoquinas reguladoras, como IL-10, que inhibe a los macrfagos activados. IL-10 est involucrada en el control homeosttico de la inmunidad innata. En relacin con la evolucin temporal de la respuesta inmune innata y adquirida, los mecanismos innatos actan inmediatamente ya que se produce el reconocimiento por efectores preformados inespecficos (0-4 horas). Los mecanismos de inmunidad innata son seguidos horas despus por respuestas inducidas precoces (4-96 horas) que pueden ser activados por la infeccin pero no dan inmunidad protectora. Estas etapas precoces ayudan a mantener la infeccin bajo control mientras los linfocitos especficos para el antgeno y que pertenecen al sistema inmune especfico son activados (ms de 96 horas). Las citoquinas y molculas coestimuladoras producidas durante estas etapas precoces tienen un importante rol en dar

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Tabla 4-4. Protenas de fase aguda Reactantes positivos Complemento: C3, C4, C9, Factor B, MBL, Inhibidor de C1, C4b-bp. Coagulacin y fibrinolisis: Fibringeno, Plasmingeno, Activador tisular de plasmingeno, Uroquinasa, Protena S, Vitronectina, Inhibidor I del activador de plasmingeno. Antiproteasas: Inhibidor 1 proteasa, 1 Antiquimotripsina, Inhibidor de la tripsina pancretica. Protenas de transporte: Cruloplasmina, Haptoglobina, Hemopexina. Otras: Protena C reactiva, Amiloide A srico, 1-Glicoprotena cida, Fibronectina, Ferritina, Angiotensingeno, LPS-bp. Reactantes negativos Albmina Transferrina Transtiretina IGF-1 Factor XII Feto protena

MBL: Mannose binding lectin; C4b-bp: C4b binding protein; LPS-bp: Lipopolysaccharide binding protein; IGF-1: Insulin like growth factor 1.

forma a la respuesta inmune especfica y puede determinar que una respuesta sea mediada por LT o LB. En la inmunidad innata, microorganismos que son reconocidos e ingeridos por macrfagos, activan macrfagos o clulas presentadoras de antgenos (CPA) para secretar citoquinas y expresar molculas coestimuladoras como B7-1 y B72 que en conjunto con el antgeno estimulan al LT especfico. Microorganismos extracelulares que son reconocidos a nivel srico pueden activar complemento; la protena C3d liberada durante esta activacin como producto de clivaje de C3 se une a CR2 de LB especfico para ese antgeno y que ha recibido, al reconocer al microorganismo, su primera seal de activacin. CR2 es un receptor para C3d que est presente en LB maduros. La unin de C3d a CR2 da la segunda seal de activacin para LB y de este modo se inicia la respuesta inmune humoral especfica.

5. PROYECCIN CLNICA La importancia de la inmunidad innata queda de manifiesto al pensar en las patologas que

se asocian con mayor frecuencia a pacientes que presentan deficiencias de este sistema. Estos pacientes presentan infecciones muy graves y recurrentes especialmente bacterianas o por hongos a pesar de tener un sistema inmune adquirido intacto. Es as como pacientes con alteraciones de barrera cutnea como los grandes quemados presentan infecciones muy graves y pacientes con deficiencias cuantitativas o cualitativas de polimorfonucleares neutrfilos presentan infecciones recurrentes principalmente bacterianas (ver captulo 30). Las deficiencias cualitativas pueden ser primarias (deficiencias de grnulos azurfilos y especficos, deficiencias de adhesin leucocitaria, deficiencias de generacin de metabolitos intermediarios del oxgeno, etc.) o pueden ser adquiridos (deficiencias de quimiotaxis y fagocitosis que se observan en Diabetes Mellitus e Insuficiencia Renal crnica). Las deficiencias cuantitativas tambin pueden ser primarias o adquiridas. Neutropenias menores a 500 clulas/L, conllevan un serio riesgo de infeccin por hongos o bacterias cuyo pronstico va a depender de la rapidez de la cada de los neutrfilos, de la reserva medular, de la duracin

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y de la causa de la neutropenia. Entre las neutropenias adquiridas, las ms importantes son las autoinmunes y las secundarias a drogas citotxicas. Pacientes con deficiencias del sistema de complemento se presentan con diferentes cuadros clnicos segn las fracciones del complemento que estn deficitarias (ver captulos 18 y 30). Aquellos con deficiencias de C1, C2 y C4 presentan asociacin a patologas autoinmunes como Lupus Eritematoso Sistmico y discoide con mayor frecuencia que la poblacin general. Aquellos con dficit de C3, Factor H, Factor I, Properdina presentan susceptibilidad a infecciones pigenas. Por ltimo los pacientes con dficit de los componentes finales del sistema del complemento (Complejo de ataque a la membrana) y con dficit de los componentes de la va alterna son ms susceptibles a infecciones fulminantes por Neisserias. Existen dficit inmunes fisiolgicos que contribuyen a una mayor susceptibilidad a infecciones en pacientes peditricos. En el perodo de recin nacido la inmadurez del sistema inmune inespecfico contribuye a este hecho. Se puede evidenciar tambin la importancia de la inmunidad innata al revisar la maduracin de los componentes de sta durante la etapa postnatal y en los primeros aos de vida y su relacin con la inmunidad adquirida. La respuesta inmune especfica a la mayora de los antgenos depende de complejas interacciones entre macrfagos, LT y LB. Pero la expresin completa de mecanismos de defensa del husped requiere la maduracin de otras lneas celulares y componentes sricos relacionados con la fase efectora de la inmunidad. Esto incluye complemento, fagocitos, mastocitos, basfilos, etc., que son componentes de la inmunidad innata. En el recin nacido los niveles de complemento son bajos en comparacin con los del adulto, y los fagocitos presentan una inmadurez fisiolgica. Hay una produccin defectuosa y una migracin disminuida de polimorfonucleares al foco infeccioso. Hay una capacidad disminuida de la stem cell para responder a las demandas de la infeccin. Adems, la produccin de factor estimulador de colonias de granulocitos y monocitos (GM-CSF) por monocitos est disminuida. Tambin se ha invocado dficit funcionales intrnsecos de los PMN del recin nacido. Estos pueden presentar defectos en adherencia, agregacin, migracin, fagocitosis y funciones microbicidas. Esto se ha asociado con dficit de maduracin que se expresa en alteracin de la

transduccin de seales, disminucin en la expresin de receptores en la superficie celular, alteracin de la estructura del citoesqueleto y disminucin en la produccin de intermediarios reactivos del oxgeno. En los recin nacidos tambin se ha descrito deficiencia de regulacin de expresin de molculas de adhesin (selectinas e integrinas) en PMN lo que podra explicar la falla relativa de estas clulas para formar el infiltrado inflamatorio. Los monocitos en el recin nacido son semejantes a los de los adultos en cantidad, capacidad fagoctica, capacidad microbicida, perfil enzimtico y propiedades migratorias al azar. Son funcionalmente deficientes en relacin con la activacin de LT y en presentacin antignica de aloantgenos y antgenos virales. Los monocitos del recin nacido presentan menor capacidad de produccin de IL-6 y TNF. Este hecho conlleva menor reactividad inflamatoria y menor respuesta febril en esta etapa de la vida. La adhesin de los monocitos est disminuida lo que incide en el reclutamiento de estas clulas al foco de infeccin. La actividad de las clulas NK en los recin nacidos est disminuida con respecto al adulto. Responden menos a seales de activacin exgenas. Durante el perodo de lactante hay una maduracin de los fagocitos y un aumento progresivo de las concentraciones de complemento.

6. FILOGENIA DE LA RESPUESTA INMUNE INNATA Los mecanismos de la inmunidad innata estn presentes en todos los organismos en diferente forma. La defensa del husped en invertebrados es mediada por clulas y molculas que se parecen a los mecanismos efectores de la inmunidad innata de los organismos superiores. Los invertebrados, por ejemplo, equinodermos, anlidos y artrpodos, poseen barreras defensivas fsico qumicas, procesos de coagulacin y cicatrizacin de heridas. La fagocitosis est presente en todos los invertebrados. Los equinodermos y artrpodos adems poseen factores humorales defensivos naturales o inducibles y un sistema ltico anlogo al complemento. En algunos invertebrados como esponjas, celenterados, anlidos, artrpodos, tunicados y equinodermos hay reacciones de reconocimiento de injertos alognicos, limitadas y de corta duracin. Los

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mecanismos especficos y especializados propios de la inmunidad adquirida se encuentran slo en vertebrados. No obstante lo anterior, existen semejanzas entre reconocimiento de patgenos, vas de seales y mecanismos efectores de inmunidad innata en animales inferiores y mamferos lo que apunta a un ancestro comn de estas defensas. Recientemente, la inmunidad innata ha logrado despertar mayor inters en investigacin ya que la permanencia de sus mecanismos en especies ms evolucionadas que cuentan con el sistema de inmunidad adquirida, avala su eficacia en la primera lnea de defensa, y conjuntamente con eliminar la infeccin, es capaz de estimular y orientar la respuesta inmune especfica.

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Captulo 5
ANTGENOS
Mara Ins Becker C. y Alfredo De Ioannes I.

1. Introduccin 2. Conceptos generales 2.1. Antgeno 2.2. Inmunogenicidad y antigenicidad 2.3. Determinante antignico 2.4. Haptenos 3. Caractersticas del antgeno que lo hacen inmunognico 3.1. Tamao 3.2. Presencia de grupos qumicos activos 3.3. Conformacin espacial de los eptopos 3.4. Movilidad atmica 4. Naturaleza qumica de los antgenos 4.1. Protenas

4.2. Carbohidratos 4.3. Lpidos 4.4. cidos nucleicos 5. Clasificacin de los antgenos segn las clulas inmunes involucradas en la respuesta 5.1. Antgenos timo-dependientes 5.2. Antgenos timo-independientes 6. Clasificacin general de los antgenos segn su funcin 6.1. Antgenos de trasplante 6.2. Antgenos tumorales 6.3. Autoantgenos 6.4. Antgenos de diferenciacin 6.5. Superantgenos 6.6. Alergenos

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RESUMEN Los antgenos son compuestos de diversa naturaleza qumica provenientes del medio o generados por el propio organismo- que son capaces de inducir una respuesta inmunolgica en los vertebrados, propiedad denominada inmunogenicidad. La interaccin del antgeno con los productos de la respuesta inmune y especialmente, con los anticuerpos propiedad denominada antigenicidad- ha permitido conocer la estructura y funcin de numerosos antgenos, demostrndose que los productos de la respuesta inmune interactan con regiones especficas del antgeno, denominadas eptopos, los cuales pueden corresponder a una secuencia aminoacdica determinada (eptopos lineales) o a un arreglo espacial de la cadena polipeptdica (eptopos conformacionales). Aunque la capacidad inmunognica de un antgeno depende de su naturaleza qumica intrnseca (tamao, forma, movilidad atmica, presencia de grupos qumicos activos y residuos aromticos) tambin est relacionada con la capacidad de respuesta del organismo y, en este sentido, son determinantes sus caractersticas genticas y su historial inmunolgico.

1. INTRODUCCIN Los conceptos de antgeno e inmungeno son tan antiguos como la inmunologa. Inicialmente se asoci el concepto de vitalidad y patogenicidad a la capacidad de inducir una respuesta inmune protectora: los inmunlogos del siglo pasado se resistan a pensar que algo inerte e inocuo esencialmente intil- pudiera despertar una respuesta inmune. Esa lnea de pensamiento asociaba a la microbiologa como una disciplina secundaria, limitando el desarrollo de vacunas para la profilaxis de enfermedades graves que afectaban a la humanidad. Con el tiempo, la patogenicidad como requisito de la inmunogenicidad, cedi el paso al uso de cepas bacterianas atenuadas, o, simplemente se utilizaron microorganismos con reaccin cruzada para inducir una proteccin efectiva, siendo el caso ms notable el desarrollo de la vacuna para la viruela por Jener. La demostracin por parte de Ehrlich y Von Behring que microorganismos muertos por fijacin con formaldehdo o por calentamiento eran inmunognicos, fue un nuevo paso para acercarse a la esencia del reconocimiento inmunolgico. A principios de este siglo, se pudo inducir inmunidad protectiva con fracciones de microorganismos, los toxoides, que son exotoxinas bacterianas inactivadas, demostrndose que los

conceptos de vitalidad y patogenicidad eran perfectamente disociables de la inmunogenicidad, lo que determin que la inmunologa se independizara de la microbiologa. Fue en esta poca cuando Landsteiner, padre de la inmunoqumica, acu el concepto de determinante antignico o eptopo y defini serolgicamente los grupos sanguneos humanos. 2. CONCEPTOS GENERALES 2.1. Antgeno La definicin de antgeno deriva de la esencia misma del sistema inmune: su capacidad para reconocer en forma especfica, en una molcula, caractersticas que no son constituyentes normales del organismo, mediante la activacin de linfocitos B o T. Los antgenos pueden ser compuestos de diversa naturaleza qumica provenientes del medio, que se encuentran presentes en microorganismos, plantas, alimentos, frmacos y cosmticos, etc. Los antgenos tambin pueden ser compuestos que se generan en el organismo como resultado del metabolismo en el caso de la detoxificacin de drogas, como resultado de una transformacin neoplsica (antgenos tumorales) o como manifestacin de enfermedades autoinmunes

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(autoantgenos). 2.2. Inmunogenicidad y antigenicidad Dos propiedades de un antgeno son inmunogenicidad y antigenicidad. Cuando un antgeno induce una respuesta del sistema inmune se dice que es inmunognico, propiedad que est ntimamente relacionada con la capacidad de estimular linfocitos T en el caso de las protenas y con la actividad mitognica de los polisacridos en las clulas B. Aunque la capacidad inmunognica de una molcula depende de varios factores intrnsecos relacionados con su estructura qumica, esta propiedad es la sumatoria de una serie de influencias que reflejan tanto el historial inmunolgico del animal como los atributos genticos de que ste dispone para reconocerlo como tal. Es decir: el repertorio de clulas B, la actividad de clulas T helper y clulas T supresoras, la red idiotipo-anti-idiotipo y el Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) (ver captulo 8). Recientemente, se ha postulado que las molculas, para ser inmunognicas adems de ser capaces de ser reconocidas por los receptores especficos, deberan generar seales de peligro para el sistema inmune por medio de receptores de la respuesta innata, como son los de la familia Toll, descritos inicialmente en Drosophilia melanogaster, que reconocen estructuras ms generales presentes en compuestos bacterianos como son el LPS por el receptor TLR4, pptido glicanos, lipoprotenas bacterianas y lipoarabino-mananos de micobacterias por el receptor TLR2. El DNA bacteriano con motif CpG es reconocido por TLR9. La estimulacin de estos receptores finalmente converge en la activacin del factor NFkB, que induce la expresin de genes defensivos y pro-inflamatorios en clulas claves de la respuesta innata. Por esta razn, la incorporacin de bacterias o productos de ellas en los adyuvantes para aumentar la inmunogenicidad de protenas, tiene como fundamento la estimulacin de clulas accesorias del sistema inmune. El trmino antigenicidad se refiere a la capacidad de interaccin de un antgeno con los productos de una respuesta inmune, ya sea con anticuerpos o con clulas T. Aunque muchos de los conceptos definidos aqu han surgido del estudio de la reaccin antgeno-anti-

cuerpo, tambin pueden ser aplicados a la relacin del antgeno con receptores especficos de las clulas T. Sin embargo, a los fragmentos peptdicos presentados clsicamente por los MHC a los Receptores de clulas T (TCR), se han agregado lpidos y glicolpidos presentes en micobacterias que son presentados por CD1. En resumen, gran parte del conocimiento disponible sobre la estructura y funcin de numerosos antgenos se debe a que ha sido posible desarrollar anticuerpos especficos contra ellos; esto ha permitido estudiar las regiones del antgeno con las cuales dichos anticuerpos interactan y tambin ha hecho posible comprender las condiciones y mecanismos fisicoqumicos que gobiernan esta interaccin. 2.3. Determinante antignico El lugar de reconocimiento especfico de los anticuerpos en el antgeno se denomina determinante antignico o eptopo. En general, los eptopos presentes en protenas y macromolculas corresponden a zonas flexibles que poseen grupos qumicos ricos en posibilidades de interaccin con el sitio activo de los anticuerpos. Como se ver ms adelante, la presencia de grupos aromticos y de regiones con alta movilidad atmica es determinante en la interaccin antgeno-anticuerpo. Los antgenos proteicos pueden contener uno o ms determinantes antignicos diferentes -a menos que la protena tenga subunidades o segmentos repetidos- y, en teora, cada uno de ellos puede interactuar con un anticuerpo. La observacin que los anticuerpos producidos contra una protena nativa a menudo no reaccionan con la protena desnaturalizada, llev a definir dos clases de determinantes antignicos: los de tipo lineal o secuencial y los de tipo conformacional o discontinuo, como lo ilustra la figura 5-1, utilizando la protena lisozima como modelo. Los determinantes lineales, derivan de la estructura primaria de la protena; corresponden a eptopos formados por aminocidos adyacentes en la secuencia polipeptdica, y se calcula que el tamao necesario de un eptopo para unir un anticuerpo especfico es de unos seis aminocidos de longitud. Estos eptopos se localizan en la superficie o en una regin extendida de la molcula. Si los determinantes lineales se encuentran al inte-

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Figura 5-1. Estructura antignica de la lisozima de huevo de pollo. La lisozima es una pequea protena globular cuya estructura primaria consiste en una cadena polipeptdica de 129 aminocidos unida por cuatro puentes disulfuro. Estudios cristalogrficos apoyados con antisueros convencionales de cabra y conejo y anticuerpos monoclonales murinos, han permitido definir en su estructura antignica 8 pptidos principales denominados de la siguiente forma: N-C; LII, pIb; una regin continua entre los aminocidos 34 y 54 dentro de pIb; pptido 8; regin del loop (asa) entre los residuos 60 a 83; loop II y loop III. Para determinar la importancia de diferentes aminocidos en la unin de los anticuerpos, se han realizado estudios con anticuerpos dirigidos contra la regin del loop (la ms inmunognica, junto con el pptido N-C) utilizando lisozima obtenida de huevos de diferentes aves, pptidos derivados de la protena nativa y pptidos sintticos en que algunos aminocidos han sido modificados. Los resultados demuestran claramente que no todos los aminocidos de esta regin contribuyen a la antigenicidad de este pptido, siendo la arginina que se encuentran en la posicin 68, el requerimiento principal para la unin de los anticuerpos. Se ha demostrado que la antigenicidad de esta molcula depende de su estructura conformacional intacta, puesto que existe muy poca reaccin cruzada entre lisozima nativa y desnaturada.

rior de la protena, es necesario desnaturalizarla para hacer accesibles los anticuerpos. Los determinantes conformacionales corresponden a eptopos derivados del arreglo espacial o plegamiento de la cadena peptdica; es decir, dependen de la estructura secundaria y terciaria de la protena, siendo en ciertos casos estabilizados por puentes disulfuro. Con ayuda de los anticuerpos monoclonales (ver captulo 44) -una de cuyas propiedades ms poderosas es que se unen a un slo eptopo del antgeno- se ha logrado conocer la estructura antignica completa de algunas protenas globulares, que han sido utilizadas como antgenos modelo. Entre ellas se encuentran la mioglobina,

la lisozima, el citocromo c y la albmina del suero. Los estudios con estas protenas han permitido definir los siguientes conceptos sobre la estructura antignica de las protenas: (a) prcticamente toda la superficie de una protena puede ser inmunognica y antignica a la vez y puede incluir mltiples determinantes antignicos a menudo sobrepuestos. (b) muchos sitios antignicos presentan un arreglo tridimensional de residuos de aminocidos que requieren la conformacin nativa de la protena, para su integridad antignica. c) en un antgeno dado, los determinantes potencialmente inmunognicos varan de una especie a otra y dependen tanto de las diferencias estructurales entre el antgeno y las protenas propias del

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husped como de los mecanismos que regulan las interacciones entre las diferentes subpoblaciones celulares que desarrollan la respuesta inmune. De tal modo, se puede decir que en algunas protenas los eptopos estn suficientemente separados como para unir anticuerpos especficos sin interferirse; pero, algunas molculas tienen eptopos sobrepuestos y, a menudo, la unin del primer anticuerpo puede interferir estricamente con la unin de otro anticuerpo. Adems hay casos de eptopos que se exponen a raz de un cambio conformacional producido por la unin de un anticuerpo a otro eptopo de la molcula. Finalmente, se pueden producir neoeptopos como resultado, por ejemplo, del tratamiento de una protena con proteasas. Cabe destacar que el conjunto de anticuerpos que predominan despus de una inmunizacin con una protena nativa, no es igual al repertorio potencial total del animal. Ciertas secuencias y a veces residuos individuales sobre la superficie de la protena, pueden identificarse como inmunodominantes: son aquellos a los cuales se dirige la mayor parte de la respuesta inmune. Esto puede deberse a propiedades estructurales especiales intrnsecas de esa regin y a factores genticos propios del animal. El elemento estructural del determinante antignico que se proyecta distalmente desde la masa central del antgeno y, que aporta mayor cantidad de energa libre para la interaccin con el anticuerpo, se denomina grupo inmunodominante y determina la especificidad del anticuerpo. Este concepto surgi de los estudios para determinar las fuerzas responsables de la estabilidad de la unin antgeno-anticuerpo. Dado que ellas afectan la especificidad de la unin, se puede afirmar lo siguiente: Los anticuerpos reaccionan ms efectivamente con antgenos que estimulan su formacin que con otros. Dentro de este contexto, se les designa como antgenos homlogos. Sin embargo, ocasionalmente, como resultado de una reaccin cruzada, algunos anticuerpos reaccionan con mayor afinidad con un antgeno heterlogo (antgeno diferente al que gener el anticuerpo) que con uno homlogo; es el caso de los anticuerpos denominados heteroclticos. 2.4. Haptenos No todas las molculas son inmunognicas; por ejemplo, numerosas substancias pequeas de

masa molecular inferior a 5 kDa (alergenos, drogas, mono u oligosacridos y oligopptidos) slo pueden actuar como inmungenos al ser acopladas qumicamente a macromolculas de inmunogenicidad probada, que funcionan como transportadoras; son los denominados haptenos. La base del concepto de la ntima relacin de la respuesta inmune a un antgeno con su estructura qumica, fue planteada por Landsteiner a principios del siglo XX. Este investigador acopl varios haptenos a diferentes protenas transportadoras y demostr que los anticuerpos producidos contra estas protenas conjugadas artificialmente, exhiban reacciones especficas con los grupos introducidos (figura 5-2). Debido a que tambin se formaban anticuerpos contra la protena transportadora, para evidenciar la antigenicidad del hapteno, fue preciso emplear antgenos de prueba, en los que el mismo hapteno estaba acoplado a una protena no relacionada. Cuando se desarrollan anticuerpos policlonales o monoclonales contra un hapteno, se observa que, en gran parte de ellos, el reconocimiento del hapteno depende total o parcialmente de nuevas estructuras, generadas por el tipo de enlace qumico aportado por el agente acoplante. Este hecho tiene gran trascendencia: si los anticuerpos estn destinados a reconocer el hapteno en solucin como en el caso de un RIA o un ELISA de competencia (ver captulo 40), la nica forma para que esto ocurra ser modificando el hapteno con el mismo compuesto utilizado para acoplarlo a la protena transportadora. En conclusin, los haptenos no inducen la produccin de anticuerpos pero s son capaces de reaccionar especficamente con ellos, ofreciendo al inmunlogo un modelo excepcional para investigar los mecanismos de la reaccin antgeno-anticuerpo, ya que la estructura de por lo menos uno de los reactivos, el hapteno, es conocida.

3. CARACTERSTICAS DEL ANTGENO QUE LO HACEN INMUNOGNICO Como se ha mencionado, existen varios factores que influyen en la inmunogenicidad de una protena. Algunos son de carcter intrnseco y tienen que ver con su propia naturaleza qumica, lo que determina su hidrofilicidad y su flexibilidad. En cambio, otros factores son extrnsecos y estn relacionados con la capacidad de respuesta del ani-

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Figura 5-2. Efecto sobre la reaccin antgeno-anticuerpo de la posicin y naturaleza de grupos haptnicos substituidos en una protena transportadora. Landsteiner desarroll antisueros de conejo especficos contra globulina de suero de caballo substituida con haptenos como sulfonato de m-aminobenceno (A) y p-azotoluidina (B). Luego estudi, mediante reacciones de precipitacin, el efecto que producan sobre la especificidad de la reaccin antgeno-anticuerpo, modificaciones de la posicin y naturaleza de los grupos haptnicos substituidos en globulina de pollo. La intensidad de la reaccin observada (cantidad de precipitado) se seala en una escala arbitraria que va desde 0 a dos cruces (++). La reaccin con el hapteno homlogo se destaca en negrita.

mal y con la dosis de antgeno: concentraciones muy pequeas no producen estimulacin de la respuesta inmune y concentraciones muy elevadas pueden inhibirla. En la ltima dcada, con el desarrollo de la tecnologa de pptidos sintticos, se ha identificado las propiedades de una molcula que inciden directamente en su inmunogenicidad. As, construyendo pptidos de un mismo aminocido, pptidos que combinan las diferentes propiedades de los aminocidos, pptidos lineales y ramificados, elaborados exclusivamente con la forma D o L de los aminocidos o con mezclas de ambos, ha quedado en evidencia que, para la produccin de anticuerpos es determinante la ramificacin y arreglo espacial del pptido, la naturaleza levogira (L) de los aminocidos y la presencia de aminocidos con ncleos aromticos.

3.1. Tamao Se sabe que las protenas de masa molecular superior a 10 kDa son inmunognicas. Sin embargo, algunas protenas de menor masa, inoculadas con un coadyuvante apropiado, inducen la produccin de anticuerpos; tambin ocurre lo inverso es decir existen protenas de elevada masa molecular que no son buenos inmungenos; es el caso de las histonas, las protaminas y la gelatina. Su falta de inmunogenicidad se explica en parte porque carecen de grupos qumicos activos. 3.2. Presencia de grupos qumicos activos Ha quedado en evidencia que la inmunogenicidad de las protenas depende de la presencia de ciertos grupos qumicos activos, especialmente los de carcter polar.

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La presencia en la superficie de las protenas de aminocidos con residuos aromticos o con grupos cargados positivos (Lisina) o negativos (Glutmico y Asprtico) contribuye a aumentar su antigenicidad. Otro aminocido frecuentemente involucrado es Tirosina y un buen ejemplo de la importancia de este aminocido es la protena Nicrosina presente en invertebrados. El estudio cristalogrfico de Nicrosina no revela en condiciones normales la presencia de una tirosina expuesta en la superficie; pero la sntesis de la protena recombinante, en la que se introduce un cambio en el residuo de tirosina no expuesto, conduce a la prdida de un eptopo. Un anlisis de cristales de Nicrosina que incluyen el Fab de un anticuerpo monoclonal contra ella, muestra claramente que, a consecuencia de la interaccin antgeno-anticuerpo, se produce un cambio conformacional en la protena: la Tirosina emerge a la superficie y participa activamente en la interaccin. Este ejemplo, pone de manifiesto la notable dinmica de la reaccin antgeno-anticuerpo y la importancia de la movilidad atmica en la definicin de un eptopo. 3.3. Conformacin espacial de los eptopos La palabra eptopo presupone que las regiones antignicas corresponden a prominencias sobre la superficie de la molcula, lo cual es vlido en muchos casos; pero tambin se ha descrito que pueden ser hondonadas de la superficie y que el sitio de unin del anticuerpo se introduce en la cavidad epitpica. 3.4. Movilidad atmica Dado que el repertorio de receptores del sistema inmune humoral es finito y se genera durante el desarrollo embrionario de los vertebrados, antes de la exposicin con los antgenos, la posibilidad de que una estructura antignica se una a algn receptor depende de su capacidad de interactuar con cierta afinidad con un receptor preexistente. Por lo tanto, la flexibilidad de las estructuras antignicas contribuye a su antigenicidad ya que les permite adaptarse a receptores preexistentes. Este fenmeno tambin se observa en las regiones hipervariables de los anticuerpos, que tambin presentan alta movilidad molecular.

4. NATURALEZA QUMICA DE LOS ANTGENOS En general las protenas son las molculas ms inmunognicas y, en orden decreciente, les siguen los carbohidratos, los lpidos y los cidos nucleicos. 4.1. Protenas Las protenas son antgenos timo dependientes, es decir, en su reconocimiento participan linfocitos T y B. Debido a su gran complejidad estructural, puesto que adems de estructura primaria, secundaria y terciaria, poseen mltiples eptopos, lo que las hace a la vez antignicas e inmunognicas. La agregacin y la presencia de formas polimricas aumentan la inmunogenicidad de las protenas. Para conocer la estructura antignica de algunas protenas, se ha usado la cristalografa y, sin duda, la herramienta ms utilizada actualmente son los anticuerpos monoclonales, que han permitido realizar mapeos epitpicos precisos de numerosas protenas modelo -como Lisosima, Mioglobina y Albmina- y tambin de protenas utilizadas en la formulacin de vacunas para humanos, por ejemplo, el antgeno de superficie del virus de la Hepatitis B y las protenas de la cubierta del virus del SIDA. El anlisis antignico de protenas virales tiene gran relevancia, puesto que mediante sntesis peptdica, se cree que podran construirse vacunas compuestas de aquellos pptidos que producen anticuerpos capaces de neutralizar la infectividad viral. Esta idea ha sido abordada experimentalemente con varios modelos, entre ellos se ha utilizado dos antgenos de superficie del virus de la influenza, denominados Hemaglutinina (HA) y Neuraminidasa (NA). Tambin este concepto se ha aplicado en el anlisis de antgenos de patgenos como Plasmodium falciparum (agente causal de la malaria) y de Tripanosoma cruzi (agente causal de la Enfermedad de Chagas) que poseen mecanismos que les permiten evadir la respuesta inmune del hospedero; sin embargo, a la fecha no se tienen resultados plenamente satisfactorios. Otro ejemplo de antgeno proteico es el sistema antignico Rh de los glbulos rojos. El sistema Rh es uno de los sistemas sanguneos ms polimrficos, ya que a la fecha se han descrito 47 antgenos diferentes, siendo comunes slo cinco,

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que se denominan: D, C, c, E y e (ver captulo 26). El antgeno ms importante de este sistema es el antgeno proteico D, ya que su tipificacin determina que la sangre del paciente sea clasificada como Rh positiva (presencia del antgeno D) o negativa (ausencia del antgeno D). La protena D est compuesta por 417 aminocidos, tiene una masa molecular en torno a 30 kDa y no es glicosilada. Presenta 12 dominios transmembrana ricos en aminocidos hidrofbicos. La diferencia entre los antgenos D, difiere de C/c y E/e se basa en cambio de aminocidos. El paso de eritrocitos fetales a la circulacin materna puede inducir anticuerpos anti Rh (D+) en la madre cuando sta carece de estos antgenos (ver captulo 26). 4.2. Carbohidratos Los determinantes antignicos de numerosas substancias de inters biolgico, corresponden a carbohidratos que se encuentran en glicolpidos y glicoprotenas. Buenos ejemplos son el lipopolisacrido (LPS) de las bacterias Gram-negativas y el sistema de antgenos de grupo sanguneo en humanos, como el sistema ABO. LPS La diversidad antignica entre las especies de bacterias Gram negativas, reside en las diferencias estructurales de los componentes del LPS, antiguamente denominado endotoxina, porque estaba unido a la clula y tena carcter termoestable. El LPS es el principal blanco de la respuesta inmune humoral contra este tipo de patgenos. La estructura qumica del LPS puede dividirse en tres regiones: el polisacrido O-especfico, que tambin acta como sitio receptor para algunos bacterifagos y confiere la especificidad serolgica; el polisacrido central, que contiene cido 2-ceto-3-desoxioctnico (KDO) y heptosa, que son compuestos exclusivos de bacterias; y, finamente, el lpido A (regin III) donde reside la toxicidad. Sistema ABO En humanos, se conocen actualmente 19 sistemas de grupos sanguneos, que suman ms de 200 antgenos. Sin embargo, dos de ellos el sistema ABO y el sistema Rh, son los de mayor importancia clnica desde el punto de vista transfusional,

en trasplantes y en otros procesos patolgicos (ver captulo 26). El sistema ABO fue descrito a principio de este siglo por Landsteiner, quien descubri que el suero de dadores humanos normales aglutinaba a los eritrocitos de otros dadores. Al analizar el patrn de reacciones, defini los principales antgenos de este sistema como A, B y O, que corresponden a determinantes antignicos de naturaleza oligosacrida. Los antgenos del sistema ABO se heredan en forma autosmica, siendo los genes A y B codominantes entre s y dominantes sobre O. El sistema ABO se caracteriza por su ubicuidad, puesto que los antgenos estn presentes en alta densidad sobre la superficie de los eritrocitos y clulas epiteliales y tambin se reconocen en numerosas secreciones como la saliva, leche, y mucosa gstrica, entre otras. Los antgenos del sistema ABO se caracterizan tambin porque en un individuo existe la presencia natural de anticuerpos IgM contra el producto de el o los alelos que l no posee. La formacin de estos anticuerpos se explica en parte, por la ubicuidad de este tipo de oligosacridos, ya que tambin se encuentran antgenos muy similares en la pared de numerosas bacterias, algunas de las cuales se localizan en la flora normal del intestino. Por otra parte, tambin se postula que se formaran como consecuencia del paso de eritrocitos maternos a la circulacin fetal en el momento del parto. El conocimiento de la estructura qumica de los antgenos ABO se facilit enormemente por el hecho que los determinantes antignicos corresponden a oligosacridos, que pueden ser preparados mediante sntesis qumica. Por lo tanto, fue posible utilizarlos en estudios de inhibicin de la aglutinacin de eritrocitos por haptenos. Posteriormente, se realiz un avance enorme con el advenimiento de los anticuerpos monoclonales, puesto que permitieron realizar una fina diseccin de los diferentes tipos de cadenas oligosacridas presentes en cada grupo. Desde el punto de vista bioqumico, los antgenos del sistema ABO estn constituidos por cadenas de oligosacridas, formadas por azcares unidos por enlaces a (1-2 1-4) b (1-3), producto de la accin de glicosiltransferasas -del tipo fucosil, N-acetil y galactosil transferasas- que actan sobre un substrato tetrasacrido denominado paraglobsido. Este posee una galactosa como residuo terminal, unida por enlace b (1-3) o b (14), segn se trate de un tetrasacrido tipo I (en

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antgenos secretados) o tipo 2 (sobre eritrocitos), respectivamente. Posteriormente, sobre la galactosa terminal acta una fucolsiltransferasa denominada H, que le adiciona una fucosa por enlace a (1-2). De esta forma, se completa una cadena denominada antgeno H, que est presente en la membrana plasmtica de todos los eritrocitos, anclada va una protena integral de membrana denominada Banda 3 (figura 5-3). La especificidad antignica en los individuos del grupo A, est dada por la adicin de Nacetilgalactosamina a la substancia H y, en los individuos del grupo B, por la adicin de galactosa, azcares que constituyen el grupo inmunodominante de los determinantes antignicos A y B, respectivamente. Los individuos del grupo O slo poseen el antgeno H.

Es importante destacar que dentro de cada grupo existen variaciones: son los subgrupos de A y B, que reflejan diferencias cuantitativas, segn el nmero de eptopos presentes en la superficie del eritrocito y cualitativas, segn el largo y ramificacin de las cadenas oligosacridas. 4.3. Lpidos Los lpidos son, en general, poco inmunognicos, fundamentalmente por su poca solubilidad en agua; sin embargo, al unirse a protenas, algunos pueden generar eptopos. En el caso de lpidos compuestos, como los lipopolisacridos de las bacterias Gram negativas, la fraccin lipdica participa activamente en la mitogenicidad de estas substancias.

Figura 5-3. Estructura de los antgenos ABO de grupo sanguneo humano. Los antgenos ABO tienen estructura de tipo carbohidrato y estn presentes en numerosos tejidos, siendo sintetizados bajo el control de varios genes que codifican para glicosiltransferasas. Se pueden expresar de diferentes formas: como oligosacridos en la orina, como glicoprotenas en las secreciones y fluidos corporales y como glicolpidos en las membranas de numerosas clulas. El compuesto bsico inicial desde el cual crecen las cadenas oligosacridas que conforman los antgenos ABO, es un compuesto de tipo cermido (formado por una molcula de glucosa y galactosa) que est anclado a un glicolpido. Sobre el paraglobsido acta una transferasa que agrega una fucosa (Fuc) en el azcar terminal, formndose de esta forma el producto denominado substancia H, que posteriormente es convertida en substancia A o B por la apropiada adicin de una molcula de N-acetilgalactosamina (Galnac) o galactosa (Gal) respectivamente. (Glu), glucosa.

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4.4. cidos nucleicos Los cidos nucleicos son poco inmunognicos ya que para inducir anticuerpos requieren ser conjugados a protenas inmunognicas. Sin embargo, en varias patologas de tipo autoinmune -en que componentes normales del organismo pasan a ser autoantgenos- es frecuente observar la presencia de anticuerpos anti-DNA, actividad que ayuda al diagnstico de las enfermedades. De hecho, existen anticuerpos que reconocen diferentes formas de DNA como el denominado tipo Z, entre otros.

independientes. Entre las propiedades que presentan estos antgenos podemos mencionar las siguientes: (a) Son molculas de gran tamao con eptopos repetidos, lo que les permite interactuar con mltiples receptores de la superficie, dando como resultado una reaccin de alta avidez que induce el coronamiento (capping) de los mismos, (b) Son mitognicos, es decir, inducen proliferacin de los linfocitos B y (c) Pueden activar la va alternativa del complemento.

6. CLASIFICACIN GENERAL DE LOS ANTGENOS SEGN SU FUNCIN 6.1. Antgenos de trasplante El trasplante de tejido incompatible y la maternidad multpara van acompaados de la induccin de altos ttulos de anticuerpos que reconocen a los antgenos de histocompatibilidad, especialmente de Clase I. Esto se debe al alto polimorfismo gentico de la cadena pesada de estas molculas en la especie humana y en los animales superiores. Estos antisueros naturales, han sido una herramienta fundamental para entender las reglas que gobiernan la histocompatibilidad y prolongar la sobrevida de los trasplantes. Los antgenos o molculas MHC de clase II son menos potentes en la induccin de anticuerpos y en la actualidad se usan tcnicas de biologa molecular para su tipificacin. 6.2. Antgenos tumorales Se han descrito numerosos anticuerpos monoclonales que son reactivos con antgenos que se expresan exclusivamente o, en mayor cantidad en clulas tumorales, por lo tanto son utilizados en diagnstico clnico de humanos como marcadores de la presencia de clulas neoplsicas. Entre estos antgenos, se encuentran marcadores de melanoma, carcinoma colo-rectal, neuroblastoma, antgeno prosttico y antgenos de leucemias linfticas, entre otros. 6.3. Autoantgenos

5. CLASIFICACIN DE LOS ANTGENOS SEGN LAS CLULAS INMUNES INVOLUCRADAS EN SU RECONOCIMIENTO 5.1. Antgenos timo-dependientes Abundante evidencia experimental muestra que la produccin de anticuerpos por las clulas B contra numerosos antgenos y especialmente para los de naturaleza proteica requiere de la ayuda de clulas T, de ah que se los denomine antgenos timo-dependientes. En la dcada de los 60, dos grupos de investigadores, Miller y Mitchell en Australia y Claman en Denver, demostraron que animales deficientes en clulas T, por timectoma neonatal eran incapaces de producir anticuerpos contra antgenos proteicos; sin embargo, cuando se reconstituan con clulas tmicas, esta capacidad se restauraba. Estudios posteriores revelaron que la capacidad de ayuda de las clulas T corresponde a una subpoblacin de linfocitos T denominada T helper ( LT CD4+). Los antgenos timo-dependientes provocan respuestas primarias caracterizadas por la sntesis de anticuerpos de la clase IgM, pero en exposiciones posteriores al antgeno maduran hacia IgG (suero) o IgA (secreciones) y clulas de memoria, a diferencia de las respuestas a los antgenos timoindependientes, que slo estimulan la produccin de anticuerpos de la clase IgM y muy pocas clulas de memoria. 5.2. Antgenos timo-independientes Algunos antgenos, como los polisacridos y lipopolisacridos de bacterias, son capaces de activar linfocitos B sin la ayuda de linfocitos T helper; son los denominados antgenos timo-

Existen procesos patolgicos en que el sistema inmunolgico reconoce como antgenos componentes propios; son las denominadas enfermedades autoinmunes. Si bien pueden afectar cualquier rgano de un individuo, las ms frecuentes

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incluyen: la substancia blanca del cerebro y la espina dorsal (Esclerosis mltiple); los revestimientos de las articulaciones (Artritis reumatoide); las clulas secretoras de la insulina (Diabetes mellitus juvenil). Otras enfermedades autoinmunitarias destruyen las conexiones entre nervios y msculos (miastenia gravis), producen ampollas en la piel (Pnfigo vulgar) o destruyen los riones y otros rganos (Lupus eritematoso sistmico) (ver captulo 23). 6.4. Antgenos de diferenciacin El trmino antgeno de diferenciacin surge del uso de los anticuerpos como herramienta para identificar molculas que se localizan en determinados tipos celulares o tejidos. Sin embargo, este trmino es ambiguo, porque se refiere tanto a los antgenos especficos de estado como los antgenos especficos de tejido. Un antgeno que se reconoce exclusivamente durante una etapa del desarrollo embrionario de un organismo, pero que posteriormente no es reconocido en clulas terminalmente diferenciadas corresponde a un antgeno especfico de estado; mientras que un antgeno reconocido en cierto tipo celular diferenciado, que sirve como marcador para distinguirlo de otro, es propiamente un antgeno especfico de tejido. En esta ltima categora se pueden incluir aquellos antgenos que reconocen en tipos celulares embrionarios, son los denominados marcadores de linaje celular. 6.5. Superantgenos Se definen como superantgenos (Sags) numerosas protenas de microorganismos bacterianos (estafilococos, estreptococos, micobacterias, y micoplasmas, entre otras) y virales (del tipo rabdovirus y retrovirus), que se unen a molculas MHC clase II y que estimulan las clulas T predominantemente va unin directa al dominio Vb del receptor de la clula T, fuera de la regin de unin al antgeno (ver captulo 7). Se les denomina Sags debido a que el nmero de clulas T involucradas en la respuesta inmune es mucho mayor que el de las clulas especficas a antgenos proteicos convencionales. Los superantgenos de microorganismos estn presentes en diferentes formas. En el caso de las bacterias, generalmente son protenas secretadas como por ejemplo las enterotoxinas estafiloccicas; mientras que en el virus de la ra-

bia, el Sag se encuentra incluido en la partcula infecciosa como una protena que encapsula el material nuclear. En el caso de algunos retrovirus, como el que produce tumores mamarios en algunas cepas endogmicas de ratn, se produce expresin de Sags despus de la infeccin e integracin del DNA proviral en el genoma del hospedero. 6.6. Alergenos Los alergenos son antgenos capaces de provocar reacciones de hipersensibilidad de tipo inmediato (minutos despus de su exposicin) o retardado (das despus del desafo antignico) (ver captulos 21 y 22). Desde el punto de vista bioqumico, los alergenos incluyen polisacridos, protenas y haptenos de origen sinttico y naturales. En este ltimo caso se incluye la sustancia exudada por el Litre, compuesto que pertenece a la familia de los urushioles, que incluyen especies como el Poyson ivy, Poyson oack y Laca Japnica, entre otros, que provocan severas alergias en humanos susceptibles. El Litre es un rbol de la familia Anacardiaceae que causa una severa dermatitis de contacto en campistas, guardabosques, scouts, etc, que transitan por la zona central de Chile. Como resultado del metabolismo secundario de la planta, se produce un compuesto identificado como 3 pentadecyl-10-en catecol, que es el responsable de la alergia. Esta pequea molcula es un clsico hapteno, es decir, slo causa la alergia cuando se une a protenas de la piel del husped. A pesar de su potencia, no se ha descrito al alergeno del litre como un inductor de anticuerpos. La reaccin alrgica es de tipo retardado, es decir los sntomas se comienzan a observar despus de 24 horas de exposicin al hapteno en un individuo ya sensibilizado y participan en ella clulas T CD8+. Las lesiones que provoca este alergeno son exudativas y presentan infiltracin de macrfagos y monocitos. Aunque este tipo de compuestos se conoce desde principios de este siglo, los mecanismos celulares y moleculares que conducen a esta alergia son poco conocidos. Se sabe que la cadena aliftica es fundamental para la inmunogenicidad, porque solubiliza el alergeno en las membranas celulares; por otra parte, el anillo cateclico permite la reaccin electroflica con grupos amino de las protenas de la piel, modificndolas (vase figura 5-4).

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LECTURAS SUGERIDAS Aderem, A., Ulevitch, R.J., Toll-like receptors in the induction of the innate immune response, Nature, 17, 782-787, 2000. Barlow, D.J., Edwards, M.S., Thornton J.M., Continuous and discontinuous protein antigenic determinants, Nature, 322: 747 748, 1986.
Figura 5-4. Estructura del compuesto activo del litre; 3pentadecil (10-enil) catecol.

De esta forma, los pptidos modificados por el Litre emergen a la superficie de las clulas epidrmicas unidas a molculas MHC de clase I y clase II, los cuales inician y desencadenan la reaccin alrgica. Debido a que los ratones de cepas utilizadas en experimentacin tambin son sensibles al litre, han sido un modelo muy valioso en el estudio de los componentes celulares involucrados en la alergia provocada por este compuesto. La eliminacin selectiva de subpoblaciones de linfocitos T con anticuerpo monoclonales especficos para cada una de ellas (anti-CD4+ anti-CD8+), ha mostrado que los linfocitos T CD4+ regulan esta respuesta en ratones y que los linfocitos T CD8+ son los efectores. Nuestro grupo de investigacin tambin ha encontrado evidencia de que la cadena aliftica se metaboliza intracelularmente, lo que sugiere que el producto final del litre que modifica las protenas propias no sera el mismo que produce la planta. Recientemente, se ha demostrado que los urushioles inhiben la respiracin mitocondrial a nivel del Complejo III. Este fenmeno es especfico, porque requiere la presencia de la estructura cateclica y de la cadena aliftica, ya que pentadecil fenol y 3 metil catecol no ejercen una inhibicin significativa en la respiracin. El alergeno del poison ivy, que posee tres veces ms insaturaciones en la cadena aliftica, es el inhibidor ms potente de la respiracin y el ms alergnico en humanos. Estudios recientes en que se analiza la unin de Litreol marcado con 3H en la cadena aliftica a protenas mitocondriales, muestran la aparicin de protenas marcadas especficamente de una masa molecular relativa en torno a 30 kDa, que se encuentran distribuidas en la membrana mitocondrial interna.

Benjamin C., Berzofsky JA., East IJ., Gurd, FRN., Hannum, C., Leach SJ., Margoliash E., Michael JG., Miller A., Prager EM., Reichlin M., Sercarz EE., Smith-Gill SJ., Todd PE., Wilson AC. The antigenic structure of proteins: A reapraisal, Ann. Rev. Immunol, 2: 67 101, 1984. Berzofsky, J. A., Berkower, I.J., Immunogenicity and antigen structure en Fundamental Immunology, Editor: W. Paul, 4 Edicin, Raven Press, New York, pp. 651 700, 1999. Davies, D.R., Padlan, E.A., Antibody-antigen complexes, Ann. Rev. Biochem, 59: 439 473, 1990. Janeway, C.A., Travers, P., Walpot, M., Capra, J.D., Immuno Biology. The immune system in health and disease. CB Current Biology Publications Elsevier Science Ltd/Garland Publishing, 1999. Landsteiner, K., Van der Scheer J., Serologcal studies on azoproteins. Antigens containing azo components with aliphatic side chains, J. Exp. Med., 59: 751 768, 1934. Laver, W.G., Gillian, M.A., Immune recognition of protein antigens en Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1985. Lpez C.B., Kalergis A.M., Becker M. I., Garbarino J.A., De Ioannes A.E., Contact Dermatitis to the Urushiol Related Compound 3pentadecyl (10 enyl) catechol is Mediated by CD8+ Cells and Regulated by CD4+ Cells in Mice, J., Allergy and Immunology 117: 194-201, 1998.

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Moody, D.B., Ulrichs,T., Muhlecker, W., Young, D.C., Gurcha, S.S., Grant, E., Rosat J.P., Brenner, M.B., Costello, C.E., Besra, G.S., Porcelli, S.A., CD1c-mediated T-cell recognition of isoprenoid glycolipids in Mycobacterium tuberculosis infection, Nature, 404,884 888, 2000. Palomo G., I., Pereira G., J., Fisiopatologa de las citopenias inmunes. Editorial Universidad de Talca,1995, Talca - Chile. Tainer, J.A., Getzoff, E.D., Paterson, Y., Olson, A.J., Lerner, R.A., The atomic mobility component of protein antigeniciicity, Ann. Rev. Immunol, 3: 501- 535, 1985.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 6
RECEPTOR DE LINFOCITOS B E INMUNOGLOBULINAS
Ivn Palomo G., Mara Ins Becker C., Silvia Pierangeli y Ulises Vergara C.

1. Introduccin 2. Receptor de linfocitos B (BCR): Estructura y funcin 2.1. Inmunoglobulina de membrana 2.2. Complejo Ig/Ig 3. Linfocitos B y seales accesorias de coestimulacin 3.1. Antgenos T-dependientes y antgenos T-independientes 3.2. Co-Receptor CD21 4. Subpoblaciones linfocitarias B1 y B2 5. Estructura y funcin de inmunoglobulinas 5.1. Estructura general 5.2.Dominios de inmunoglobulinas y regiones hipervariables 5.3.Variaciones isotpicas, alotpicas e idiotpicas 5.3.1. Variaciones isotpicas 5.3.2. Variaciones alotpicas 5.3.3. Variaciones idiotpicas 5.4. Clases y subclases de inmunoglobulinas 6. Respuesta inmune humoral 6.1. Avidez 6.2. Afinidad

7. Bases genticas de la diversidad de inmunoglobulinas 7.1. Genes de inmunoglobulinas 7.1.1. Genes de cadenas pesadas 7.1.2. Genes de cadenas livianas 7.2. Reordenamiento gnico 7.2.1. Reordenamiento de cadenas pesadas 7.2.2. Reordenamiento de cadenas livianas 7.2.3. Reordenamiento impreciso del DNA 7.2.4. Diversificacin de la regin N 7.2.5. Exclusin allica 7.2.6. Exclusin isotpica 7.2.7. Cambio de clase de cadenas pesadas 7.3. Hipermutacin somtica 7.4. Control de la transcripcin de los genes de inmunoglobulinas 7.5. Estimacin numrica de la diversidad de anticuerpos 8. Edicin del receptor linfocitario 9. Biosntesis y ensamblaje de las inmunoglobulinas

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RESUMEN La inmunidad especfica humoral se asocia a linfocitos B y anticuerpos. Los aspectos ms importantes que revisa este captulo son: la estructura y funcin del Receptor de clulas B (BCR) y de inmunoglobulinas, y las bases genticas de la diversidad de estas ltimas. El BCR es un complejo glicoproteico hetero-oligomrico transmembrana, que incluye dos subunidades: una inmunoglobulina de membrana (IgM o IgD) responsable del reconocimiento especfico del antgeno y el complejo accesorio Ig-/Ig-, conservado en todos los linfocitos B y responsable de la transduccin de seales de activacin. Dependiendo de la naturaleza qumica del antgeno, la activacin de los linfocitos B, requerir seales accesorias de coestimulacin, proporcionadas por el correceptor CD21 (CR2) y por linfocitos T helper. Las inmunoglobulinas (Igs) son una familia de glicoprotenas estructuralmente relacionadas, presentes en la membrana de linfocitos B y en el suero y fluidos titulares La unidad estructural bsica de las inmunoglobulinas est dada por un monmero glicoproteico formado por cuatro cadenas polipeptdicas - dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas livianas (L) idnticas: IgG (2, 2 2), IgM (2, 2 2), Ig (2, 2 2), IgD (2, 2 2) e IgD (2, 2 2). Entre las regiones funcionales ms importantes de la estructura de las Igs destacan la regin de unin con el antgeno (Fab), ubicada en el extremo amino y el fragmento Fc que participa en funciones efectoras tales como: activacin del sistema del complemento, activacin de clulas fagocticas, citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC), inmunidad de mucosas, inmunidad neonatal, hipersensibilidad inmediata y regulacin de la respuesta inmune. Cada cadena, H y L, presenta slo un dominio variable. Las cadenas H presentan 3 4 dominios constantes y las cadenas L solamente un dominio constante. La variabilidad idiotpica de las Igs se genera somticamente en la mdula sea (en humano), durante un proceso de diferenciacin que es independiente del antgeno y que permite que cada linfocito B est provisto de un BCR nico. El repertorio de estos receptores y por tanto de Igs secretadas, es generado al azar durante un proceso regulado de reordenanamiento o recombinacin de segmentos gnicos V(D)J. En humanos, los genes para codificar las cadenas H, y , se encuentran en el cromosoma 14, 2 y 22, respectivamente. La variabilidad puede aumentar por otros mecanismos que sern descritos en el captulo.

1. INTRODUCCIN El desarrollo de una respuesta inmune humoral requiere la seleccin, activacin y expansin clonal de linfocitos B individuales provistos de un receptor antgeno-especfico (BCR: "B cell receptor") anclado en su membrana plasmtica. Esta habilidad de un individuo para responder virtualmente a cualquier antgeno, depende de la capacidad del sistema inmune para generar un repertorio muy grande de linfocitos, cada uno de los cuales expresa un receptor especfico para un eptopo antignico particular. Por otra parte, la naturaleza clonal del reconocimiento antignico, constituye un elemento esencial de la respuesta inmune, puesto que an cuando el sistema inmu-

ne puede reconocer una gran variedad de antgenos distintos, slo aquellos clones linfocitarios con la especificidad apropiada para un eptopo del antgeno particular, sern expandidos por divisin celular. El receptor de un linfocito B (BCR) es un complejo glicoproteico transmembrana que incluye una inmunoglobulina (Ig) de membrana propia de cada linfocito y responsable del reconocimiento especfico del antgeno. Cuando un individuo es expuesto a un antgeno extrao, slo aquellos linfocitos cuyo BCR es capaz de reconocer un eptopo antignico, sern activados y expandidos para diferenciarse en linfocitos B de memoria o en clulas plasmticas productoras de anticuerpos. Las clulas plasmticas producen

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generalmente slo un tipo de anticuerpo y ste siempre corresponde a la forma secretada o soluble de la Ig de membrana del linfocito B del cual deriva la clula plasmtica. La forma de membrana de una Ig es un componente estructural y funcional del receptor BCR; su forma soluble o secretada constituye en cambio un anticuerpo, que conserva la especificidad por el antgeno y es adems responsable de la funcin efectora de la respuesta inmune humoral: neutralizacin del antgeno, reclutamiento y activacin de fagocitos, activacin del sistema del complemento, reclutamiento y activacin de clulas NK, macrfagos y otras clulas capaces de realizar citotoxicidad dependiente de anticuerpos. La expresin de un receptor BCR responsable de la iniciacin de una respuesta inmune contra diversos agentes infecciosos y otros antgenos, es uno de los eventos cruciales en el desarrollo de los linfocitos B. Durante este proceso, receptores antgeno-especficos nicos, son expresados por linfocitos individuales despus del reordenamiento regulado de segmentos gnicos para cadenas livianas y pesadas de una inmunoglobulina. La naturaleza azarosa del reordenamiento gnico, acoplado a la mayor complejidad que se consigue con el apareamiento de cadenas pesadas y livianas crea una increble diversidad en el repertorio linfocitario B. Aunque tal diversidad permite el reconocimiento de un gran nmero de protenas extraas, la independencia antignica del reordenamiento gnico inevitablemente conduce a la generacin de linfocitos B autorreactivos. Para evitar la autoinmunidad inducida por la eventual activacin de estas clulas autorreactivas, el sistema inmune debe poner en marcha mecanismos que le permitan inducir tolerancia a antgenos propios. Entre estos mecanismos se encuentran la eliminacin por apoptosis de las clulas autorreactivas (delecin clonal), la inhibicin de su actividad (anergia clonal), o la edicin de su receptor mediante un reordenamiento secundario de segmentos gnicos para cadenas livianas, lo que conduce a modificar la especificidad del BCR autorreactivo. Linfocitos B apropiadamente activados proliferan y luego diferencian en clulas plasmticas o en clulas B de memoria. Durante este proceso de diferenciacin los linfocitos B expresan estrategias nicas que llevan a diversificar aun ms el repertorio de receptores BCR: (i) hipermutacin somtica que conduce a un aumento de la afinidad del receptor por su eptopo antignico, (ii)

recombinacin o reordenamiento gnico, que conduce al switching isotpico o cambio de clase de la inmunoglobulina del BCR en linfocitos B de memoria, y (iii) reordenamientos gnicos secundarios, que conducen a la edicin del receptor. En el presente captulo se describe la estructura y funcin del receptor linfocitario B (BCR), las caractersticas estructurales y funcionales de las distintas clases de inmunoglobulina y los mecanismos genticos que explican su diversidad y heterogeneidad: recombinacin V(D)J, hipermutacin, reordenamiento de clase y edicin del receptor.

2. RECEPTOR DE LINFOCITOS B (BCR): ESTRUCTURA Y FUNCIN El receptor de los linfocitos B (BCR) es generado somticamente durante la diferenciacin linfocitaria, lo cual permite que cada clula B est provista de un receptor nico que no est codificado en el DNA germinal y no est predestinado a reconocer un antgeno extrao particular. El repertorio linfocitario es generado al azar y, los linfocitos B cuyo receptor es capaz de reconocer un eptopo antignico particular sern seleccionados para su proliferacin y expansin clonal. La interaccin BCR-antgeno inicia la transduccin de seales bioqumicas que conducen a la activacin, proliferacin y diferenciacin linfocitaria; adems gatillan la internalizacin endoctica del complejo y el procesamiento y presentacin de fragmentos antignicos a linfocitos T-antgeno especficos, en aquellos casos en que el desarrollo de respuesta inmune requiere de colaboracin de linfocitos T "helper" (LTh). El BCR es un complejo glicoproteico heterooligomrico transmembrana, que incluye dos subunidades, estructural y funcionalmente distintas y no covalentemente unidas entre s (figura 61). La primera subunidad corresponde a una inmunoglobulina (Ig) de membrana, que acta como receptor clonotpico propio de cada linfocito y responsable del reconocimiento especfico del antgeno. La segunda subunidad, denominada complejo accesorio Ig-/Ig-, es invariante o (conservado) en todos los linfocitos B y, responsable del transporte y expresin del receptor clonotpico en la membrana y de la transduccin de seales de activacin, luego de la interaccin BCR-antgeno.

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Figura 6-1. Estructura del receptor linfocitario BCR y del correceptor CD21. El receptor de un linfocito B (BCR) est constituido por una Ig de membrana, responsable del reconocimiento especfico del antgeno y por un complejo accesorio Ig-/Ig, responsable del transporte y expresin del receptor BCR en la membrana y de la transduccin de seales de activacin, luego de la interaccin BCR-antgeno. La proliferacin y diferenciacin de los linfocitos B, requiere adems de seales accesorias de coestimulacin proporcionadas por el correceptor CD21. Mientras el receptor BCR reconoce al antgeno, el correceptor reconoce C3d, que se ha unido al antgeno luego de la proteolisis enzimtica parcial de C3 por activacin del sistema del complemento durante el reconocimiento innato del antgeno. CD21 reconoce C3d y CD19 transduce luego las seales accesorias de coestimulacin.

2.1. Inmunoglobulina de membrana Todas las inmunoglobulinas, tanto de membrana como de secrecin, tienen una estructura bsica general constituida por 4 cadenas polipeptdicas: 2 cadenas pesadas (H, "heavy") idnticas entre s y 2 cadenas livianas (L, "light"), tambin idnticas entre s. Las cadenas pesadas y livianas se asocian de modo tal que forman una estructura simtrica compuesta por dos heterodmeros H/L idnticos y unidos covalentemente entre s por uno o ms puentes disulfuro (figura 6-2). De esta manera, en la estructura tetramrica bsica de una Ig, la interaccin entre las regiones variables aminoterminales de las cadenas H y L, forman dos sitios idnticos de combinacin para el antgeno. La estructura de las Ig se describe en el punto 5 de este captulo.

As como la capacidad para unir antgeno reside, fundamentalmente, en la especificidad y afinidad de los sitios de combinacin aminoterminales de una Ig, su eventual capacidad para activar mecanismos efectores de respuesta inmune, reside en la regin constante carboxiterminal de las cadenas pesadas. En la Ig de membrana, la regin constante carboxiterminal de sus cadenas pesadas incluye una regin hidrofbica transmembrana de 25 aminocidos, que no est presente en la Ig de secrecin y es responsable del anclaje obligado de la Ig a la membrana plasmtica de linfocitos B. La regin carboxiterminal de las cadenas pesadas incluye adems un dominio citoplasmtico, cuya longitud vara entre los distintos isotipos de Ig de membrana (3 residuos aminoacdicos en IgM y 28 residuos en IgG). El anclaje a la membrana

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Figura 6-2. Los anticuerpos estn constituidos por cuatro cadenas polipeptdicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas livianas (L) unidas por enlaces disulfuro (S-S) e interacciones no covalentes. Los dominios variables de 110 aminocidos de cadenas pesadas y livianas forman el sitio de unin para el antgeno. Los dominios constantes (CH1 a CH3) determinan las funciones efectoras de un anticuerpo. Las cadenas pesadas de IgM e IgE, contienen un dominio constante adicional (CH4), que no existe en los otros isotipos inmunoglobulnicos.

impide que los dominios carboxiterminales de las cadenas pesadas estn disponibles para reclutar y activar mecanismos efectores de respuesta inmune. Por lo tanto, una Ig de membrana es una molcula bivalente y monofuncional: tiene capacidad para unir especficamente el antgeno (mediante 2 sitios de combinacin idnticos), pero carece de funcin efectora. Los anticuerpos o Ig de secrecin, que estn presentes en el plasma y otros fluidos de un individuo, son en cambio molculas bifuncionales: conservan la capacidad de unir el mismo antgeno, pero adems los extremos libres carboxiterminales de sus cadenas pesadas tienen la capacidad de reclutar y activar mecanismos efectores destinados a la eliminacin del antgeno (fagocitosis, sistema del complemento y citotoxicidad dependiente de anticuerpos). Variaciones estructurales en la regin constante carboxiterminal de la cadena pesada, deter-

minan la existencia de 5 clases de cadena pesada, denominadas , , , y . De esta manera, la asociacin de una misma regin variable a distintas regiones constantes pesadas, conduce a la produccin de distintas clases o isotipos de Ig (IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente) que difieren en su capacidad para reclutar y activar distintos mecanismos efectores de respuesta inmune humoral. En su etapa final de maduracin y previo al encuentro con el antgeno, los linfocitos B vrgenes expresan simultneamente en su membrana receptores BCR que contienen IgM y receptores BCR que contienen IgD, ambos con idntica especificidad y afinidad por el eptopo antignico pero con distinta regin constante en sus cadenas pesadas. Luego del primer encuentro con el antgeno, los linfocitos B vrgenes proliferan aumentando el nmero de linfocitos eptopo-especficos para el antgeno, los cuales se diferencian

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luego en clulas plasmticas (con la habilidad de sintetizar y secretar altos niveles de lo que ser el repertorio primario de anticuerpos IgM), y en distintos linfocitos B de memoria que difieren en la clase de Ig de membrana que expresan como parte de su receptor BCR (figura 6-3).

Los linfocitos B de memoria, an cuando conservan las cadenas livianas y las regiones variables de las cadenas pesadas de su receptor clonotpico (y por lo tanto, mantienen la especificidad por el mismo antgeno), han sufrido durante su diferenciacin antgeno-dependiente: (i) un pro-

Figura 6-3. Diferenciacin de clulas plasmticas y de linfocitos B de memoria. Luego de la expansin clonal de linfocitos B vrgenes (gatillada por su encuentro con el antgeno), los linfocitos se diferenciarn en clulas plasmticas responsables de la sntesis del repertorio primario de anticuerpos IgM, o en linfocitos B de memoria en los que se produce "switching" isotpico hacia IgG, IgA o IgE, y mutacin somtica que conduce a un aumento de afinidad por el mismo antgeno. Un encuentro posterior de cada linfocito B de memoria con el antgeno, gatillar la generacin de clulas plasmticas que sintetizarn los respectivos anticuerpos de clase IgG, IgA o IgE.

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ceso de hipermutacin somtica, que conduce a una mayor afinidad por el antgeno, y (ii) un proceso de recombinacin gnica, que conduce a un cambio de la regin constante pesada expresada en los linfocitos B vrgenes originales, por una regin constante distinta (, ) en los linfocitos B de memoria. Durante la diferenciacin antgeno-independiente de linfocitos B (que ocurre en los rganos linfoides primarios), opera un mecanismo de filtro o de seleccin del receptor, que ha evolucionado para seleccionar slo aquellos linfocitos cuyo BCR ser ms til en el desarrollo de una respuestas inmune en la periferia (ver captulo 13). Durante la diferenciacin antgeno-dependiente (que ocurre en los centros germinales de los rganos linfoides perifricos), opera un mecanismo de seleccin que ha evolucionado para seleccionar aquellos linfocitos B de memoria que presentan mayor afinidad por el antgeno y que simultneamente han realizado el switching isotpico o cambio de clase de la cadena pesada, para expresar IgG, IgA o IgE como parte de su receptor BCR (figura 6-3). En un siguiente encuentro con el antgeno, los linfocitos B de memoria se diferenciarn en clulas plasmticas que secretarn la misma clase de inmunoglobulina expresada como parte del receptor BCR del linfocito B de memoria del cual derivan. 2.2. Complejo accesorio Ig-/Ig- En los linfocitos B, las inmunoglobulinas recientemente sintetizadas son transportadas a la superficie celular slo cuando estn no covalentemente asociadas con las protenas accesorias Ig- (CD79a) e Ig- (CD79b), que se encuentran como heterodmeros covalentemente unidos mediante puentes disulfuro. Los complejos BCR parcialmente ensamblados, en los que falta cualquiera de sus componentes polipeptdicos (cadenas H, L, Ig- o Ig-) son retenidos en el retculo con la participacin de diversas chaperoninas (protenas que ayudan a que los procesos intracelulares ocurran adecuadamente). Adems de su participacin en el ensamblaje y transporte del BCR, las cadenas Ig- e Ig- desempean un rol fundamental en la transduccin de seales de activacin en los primeros estados de diferenciacin de los linfocitos B en los rganos linfoides primarios (hgado fetal, mdula sea o bolsa de Fabricio), y en la diferenciacin de linfocitos B perifricos en los rganos linfoides

secundarios, luego del reconocimiento e interaccin especfica BCR-antgeno. Ig- e Ig- son protenas de 30 a 45 kDa (variaciones en el peso molecular obedece al grado de glicosilacin de cada molcula), cuyo dominio transmembrana contiene grupos polares que pueden interactuar con grupos similares de la regin transmembrana de la Ig del BCR. Las molculas Ig- e Ig- presentan adems, dominios extracelulares y dominios citoplasmticos similares a los de las protenas del complejo CD3 del receptor TCR de linfocitos T, y que funcionan de manera tambin similar en la transduccin de seales de activacin luego del encuentro con un antgeno que contiene eptopos reconocibles por el receptor linfocitario. La valencia, grado de agregacin, concentracin local y persistencia del antgeno parecen tener una importante influencia en la generacin de las seales intracelulares que conducirn a la tolerancia por antgenos propios o la iniciacin de una respuesta humoral contra antgenos extraos. La unin del antgeno a la inmunoglobulina del receptor BCR, conduce a la fosforilacin de los dominios citoplasmticos de Ig- (61 aminocidos) y de Ig- (48 aminocidos) que contienen secuencias de 26 aminocidos ricas en tirosina (ITAM: "Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motifs") y al reclutamiento y activacin de diversas tirosina quinasas. La evidencia experimental en ratones, sugiere que los individuos deficientes en la expresin de Ig- muestran un desarrollo linfocitario B completamente bloqueado, en un estado equivalente al de CD44-/low CD25+ del desarrollo linfocitario T. Los reordenamientos V H hacia D HJ H estn marcadamente reducidos, mientras los reordenamientos DH a JH ocurren normalmente (V, D, J se explica en punto 7 de este captulo). De esta manera Ig- parece involucrado en la iniciacin del reordenamiento VH hacia DHJH, antes de funcionar como parte de la subunidad de transduccin de seales en el receptor pre-BCR. Un ratn mutante que carece de la mayor parte del dominio citoplasmtico de Ig-, exhibe slo un trastorno moderado en el desarrollo B temprano, aun cuando est casi completamente bloqueada la aparicin de linfocitos B perifricos. Todo lo anterior indica que se requiere un heterodmero Ig- /Ig- intacto para el desarrollo y mantencin de linfocitos B maduros en la periferia. Por ltimo, el modelo ms ampliamente aceptado sobre la organizacin del receptor de

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linfocitos B, sugiere que el BCR es un complejo proteico en el que la Ig de membrana est unida a dos heterodmero Ig- /Ig-, uno a cada lado de la molcula (figura 6-1). Sin embargo, estudios recientes sugieren que en el complejo Ig-Ig- /Ig, la molcula de Ig est asociada a un nico heterodmero Ig- /Ig- y que, en la superficie celular, distintos BCR se asocian luego en oligmeros, en microdominios, regiones o rafts lipdicos ricos en colesterol y esfingolpidos. 3. Linfocitos B y seales accesorias de coestimulacin La activacin de linfocitos B requiere la unin del antgeno a la Ig de membrana del receptor BCR. Sin embargo, la valencia, grado de agregacin, concentracin local y persistencia del antgeno, parecen tener una importante influencia en la generacin de seales intracelulares que conducirn a la tolerancia por antgenos propios o la iniciacin de una respuesta contra antgenos extraos. Por otro lado, dependiendo de la naturaleza qumica del antgeno, la entrada en el ciclo celular y la proliferacin y diferenciacin de los linfocitos B, requerir seales accesorias de coestimulacin, proporcionadas por el correceptor CD21 (CR2) y por LTh antgeno-especficos, que expresan molculas coestimuladoras de membrana (CD40L, CD28) y liberan diversas citoquinas (IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IFN-, TGF-). Estas seales accesorias de coestimulacin son indispensables para la induccin del "switching" isotpico y la hipermutacin que conducen a la sntesis de anticuerpos con diversas funciones efectoras y mayor afinidad por el antgeno. 3.1. Antgenos T-dependientes y Antgenos Tindependientes La activacin de linfocitos B puede ser T-dependiente o T-independiente, dependiendo de si requiere o no de seales accesorias de coestimulacin proporcionada por LTh. Esta segunda seal de coestimulacin puede ser proporcionada a travs de CD40 que interacta con su ligando CD40L (CD154) expresado en la membrana de linfocitos T activados y por B7.1 (CD80) y B7.2 (CD86) que se expresan en linfocitos B activados e interactan con su ligando CD28, constitutivamente expresado en linfocitos T. Individuos que sufren el sndrome de hiper-IgM li-

gado al cromosoma X, representan un claro ejemplo de la importancia de las seales accesorias de coestimulacin en la funcin de los linfocitos B (ver captulo 30). En los pacientes con este sndrome (muy susceptibles a las infecciones pigenas), los niveles sricos de anticuerpos IgG, IgA e IgE son muy bajos y en circulacin slo expresan IgM, debido a que son incapaces de realizar "switching" isotpico, maduracin de afinidad y generacin de linfocitos B de memoria. Paradjicamente el sndrome de hiper-IgM ligado al cromosoma-X es ms un defecto de los linfocitos T que de linfocitos B, ya que es consecuencia de una deficiente expresin de CD40L en LTh. En la respuesta a antgenos T-dependientes, la interaccin BCR-antgeno y la transduccin de seales a travs del complejo Ig- /Ig- conduce rpidamente a: (i) entrada de los linfocitos en el ciclo celular, (ii) rescate de la apoptosis, (iii) aumento en la expresin de molculas MHC de clase II y de las molculas coestimuladoras CD80 y CD86, y (iv) aumento de la expresin de receptores para citoquinas liberadas por linfocitos T. Sin embargo, en ausencia de las seales accesorias de coestimulacin, el reconocimiento antignico y la transduccin de seales a travs de complejo Ig-/Ig- inevitablemente terminan en anergia o en apoptosis de los linfocitos B antgeno-especficos. Los antgenos T-independientes (entre los que se encuentran polisacridos y protenas polimricas de origen bacteriano), no inducen la formacin de centros germinales y son, por lo tanto, incapaces de inducir la generacin de linfocitos B de memoria. Estos antgenos inducen generalmente anticuerpos IgM de baja afinidad, debido a que son incapaces de inducir la hipermutacin que conduce a la produccin de anticuerpos de alta afinidad y porque el "switching" isotpico est severamente limitado en ausencia de las citoquinas producidas por LTh. 3.2. Correceptor CD21 (CR2) As como los linfocitos T expresan las molculas CD4 o CD8 que actan como correceptores linfocitarios de activacin celular, los linfocitos B expresan en su membrana el correceptor CD21 que funciona en coordinacin con el receptor BCR, para gatillar la proliferacin y diferenciacin de linfocitos B antgeno-especficos (figura 6-1). Mientras el receptor BCR reconoce al antgeno, el correceptor CD21 reconoce C3d que est

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covalentemente unido al antgeno y ha sido generado por digestin parcial de C3 durante la activacin del sistema del complemento inducida por el reconocimiento innato del antgeno. De esta manera, el receptor CD21 permite integrar el reconocimiento innato de antgenos bacterianos por el sistema del complemento, con la respuesta inmune humoral a travs de la activacin y diferenciacin de linfocitos B. La molcula CD21 se expresa tambin en clulas dendrticas foliculares y es responsable de la retencin prolongada del antgeno en el tiempo y la mantencin de los linfocitos B de memoria. El correceptor CD21 (tambin conocido como CR2 o receptor para complemento tipo 2) se expresa en la membrana de los linfocitos B como un complejo proteico que incluye 3 protenas distintas: CD21, CD19. y CD81 (tambin denominado TAPA-1). En el complejo CD21/CD19/ CD81, el correceptor CD21 acta como subunidad que une C3d y asocia el reconocimiento del antgeno por el sistema del complemento, a la activacin de linfocito B a travs de la transduccin de seales bioqumicas gatilladas por CD19. 4. Subpoblaciones linfocitarias B1 y B2 En el repertorio linfocitario B (estimado en 1014 linfocitos B distintos), se distinguen al menos dos subpoblaciones celulares denominadas B1 y B2, que presentan caractersticas estructurales y funcionales distintas, tienen distinta distribucin anatmica y se generan a distintas edades durante la ontogenia de los LB. La subpoblacin linfocitaria B1 se desarrolla durante la vida fetal/ neonatal, presenta receptores BCR polirreactivos de baja afinidad, se asocia a la produccin de anticuerpos naturales T-independientes y se encuentra mayoritariamente en el peritoneo, la cavidad peritoneal y en el bazo. La subpoblacin linfocitaria B2 se genera a partir de clulas progenitoras de la mdula sea adulta, constituye la mayor parte del repertorio linfocitario B, su activacin es T-dependiente y se encuentra fundamentalmente en los rganos linfoides secundarios y en el torrente sanguneo. La mayora de los linfocitos B1 se caracteriza por la expresin del marcador CD5 (glicoprotena monomrica de 67 kDa, propia de linfocitos T) y aunque su funcin es todava un misterio, se ha sugerido que la activacin de estas clulas conduce a la produccin de anticuerpos que proporcionan proteccin contra infecciones

bacterianas durante la vida fetal, mucho antes que el repertorio linfocitario de la respuesta inmune adquirida sea completamente funcional. Adems, en el repertorio adulto, los linfocitos B1 dan origen a clulas plasmticas que secretan IgM y a una fraccin importante de clulas plasmticas productoras de IgA en el intestino. De hecho, la transferencia pasiva de linfocitos peritoneales B1 en ratones Scid (presentan una severa inmunodeficiencia combinada), reconstituye la produccin de IgA contra muchas bacterias intestinales. Por otro lado la transferencia pasiva de clulas de hgado fetal o del omentum intestinal, a ratones irradiados, rpidamente reconstituye la subpoblacin B1, mientras la transferencia de precursores de mdula sea adulta reconstituye la subpoblacin B2 pero no la B1. En el repertorio linfocitario adulto, los linfocitos B1 son bastante frecuentes en la poblacin B que sufre neoplasias y en aquellos que reconocen una gran variedad de autoantgenos y reaccionan cruzadamente con antgenos bacterianos como polisacridos y lipopolisacridos. El repertorio de receptores BCR es bastante ms limitado en los linfocitos B1 que en los linfocitos B2, sus reordenamientos gnicos VH son ms restringidos, y, como no expresan la enzima TdT (Deoxinucleotidil Transferasa Terminal), carecen de regiones N en las uniones VDJ.

5. ESTRUCTURA Y FUNCIN DE INMUNOGLOBULINAS Las inmunoglobulinas son una familia de glicoprotenas estructuralmente relacionadas, presentes en la membrana de linfocitos B y en el suero y fluidos titulares de todos los vertebrados, con excepcin de los ciclostomos. Sus genes se expresan exclusivamente en los linfocitos B y, en respuesta a la exposicin a un antgeno, se secretan como anticuerpos que actan como mediadores de la inmunidad humoral especfica. Aunque todos los anticuerpos tienen una estructura monomrica bsica similar, se agrupan en clases estructural y funcionalmente distintas. En la ltima dcada, los esfuerzos de numerosos inmunlogos se han centrado tanto en el anlisis de la estructura de los anticuerpos, como en la comprensin de los mecanismos genticos que dan cuenta de su sntesis y del potencial prcticamente ilimitado del repertorio linfocitario.

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5.1. Estructura general La unidad estructural bsica de las inmunoglobulinas est dada por un monmero glicoproteico formado por cuatro cadenas polipeptdicas -dos cadenas livianas (L) idnticas y dos cadenas pesadas (H) tambin idnticascovalentemente unidas por puentes disulfuro y estabilizadas por uniones no covalentes, como puentes de hidrgeno, fuerzas de Van der Waals e interacciones electrostticas. Al asociarse una cadena pesada con una liviana, sus extremos aminoterminales forman un paratopo o sitio de unin para el antgeno; existen por lo tanto, dos sitios de combinacin por monmero de Ig (figura 6-2). Esto significa que una Ig es una molcula bivalente, que puede interactuar simultneamente con dos eptopos idnticos. Sin embargo, algunos anticuerpos se secretan como multmeros inmunoglobulnicos, en los cuales monmeros Ig se asocian covalentemente entre s mediante una cadena peptdica adicional, denominada cadena J. En estos casos, anticuerpos multimricos como IgM e IgA, presentan una valencia mayor (proporcional al nmero de sitios de unin para el antgeno) y pueden estar presentes en las secreciones, gracias a su capacidad de unirse a un receptor poli-Ig existente en la cara basolateral de clulas epiteliales del tracto respiratorio, gastrointestinal y genitourinario. Las cadenas pesadas tienen un peso molecular que flucta entre 55 y 77 kDa. Estn constituidas por aproximadamente 450 550 aminocidos y contienen 3 a 15% de carbohidratos, que resultan esenciales para mantener la estructura del monmero inmunoglobulnico y favorecer la activacin del sistema del complemento y la unin a receptores Fc. Cada cadena pesada est formada por segmentos o dominios de 110 aminocidos, que incluyen un dominio variable (VH) aminoterminal que forma parte del paratopo y tres o cuatro dominios constantes (C H ) carboxiterminales, que determinan la funcin efectora de un anticuerpo. Diferencias estructurales en la regin carboxiterminal, permiten reconocer, en un mismo individuo, cinco clases o isotipos de cadenas pesadas, que se designan con letras griegas: gamma () presente en la IgG, mu () en la IgM, alfa () en la IgA, delta () en la IgD y psilon () en la IgE. La cadena pesada contiene adems una regin bisagra, rica en prolina y de gran flexibili-

dad, ubicada entre los dominios CH1 y CH2. La longitud de la regin bisagra vara de 10 a 60 aminocidos en los distintos isotipos de Ig y su flexibilidad es determinante en la orientacin espacial de los paratopos y en la eficiencia de la unin antgeno-anticuerpo. Las cadenas livianas de la Ig, tienen un peso molecular en torno a 25 kDa; no contienen carbohidratos y estn constituidas por aproximadamente 220 aminocidos, separados en un dominio variable (VL) aminoterminal y un dominio constante (CL) carboxiterminal. Variaciones estructurales en el dominio constante carboxiterminal, permiten distinguir dos tipos de cadena liviana: kappa (k) y lambda (). En una Ig, las cadenas livianas son siempre idnticas entre s; por lo tanto, un monmero inmunoglobulnico slo puede tener cadenas de tipo kappa o de tipo lambda, pero nunca de ambas. Utilizando enzimas proteolticas como papana y pepsina, se ha logrado degradar monmeros de Ig y establecer que el reconocimiento del antgeno y la funcin efectora de la respuesta inmune, residen en fragmentos definidos y distintos de la molcula. La papana ataca selectivamente cada cadena pesada justo en el sitio aminoterminal del enlace disulfuro intracadena pesada, liberando tres grandes fragmentos: un fragmento Fc y dos fragmentos idnticos de aproximadamente 45 kDa, denominados Fab (fragmento de unin con el antgeno) que contienen la cadena liviana completa (VL y CL) y los dominios VH y CH1 de la cadena pesada (figura 6-4). Los fragmentos monovalentes Fab, pueden unirse especficamente al antgeno pero no lo precipitan, puesto que presentan un nico sitio de combinacin con el antgeno. El tercer fragmento, denominado Fc (fragmento cristalizable) de aproximadamente 50 kDa, contiene el segmento carboxiterminal de la cadena pesada, es responsable de la funcin efectora de un anticuerpo y, presenta una gran facilidad para cristalizar en soluciones amortiguadoras neutras. El fragmento Fc de un anticuerpo, participa en funciones efectoras tales como: activacin del sistema del complemento, activacin de clulas fagocticas, citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC), inmunidad de mucosas, inmunidad neonatal, hipersensibilidad inmediata y regulacin de la respuesta inmune. Distintos tipos celulares (monocitos, clulas NK, macrfagos, clulas cebadas y granulocitos, entre otras) pre-

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sentan en su membrana plasmtica receptores Fc (FcR) isotipo-especficos para el fragmento Fc de distintas clases de anticuerpos (FcR, FcR, FcR). Estos receptores Fc, presentan un dominio citoplasmtico implicado en la transduccin de seales de activacin tales que, la naturaleza de la respuesta efectora depender del isotipo de Ig unida al FcR y del tipo de clula que expresa el receptor. El tratamiento de un anticuerpo con pepsina, genera un fragmento bivalente F(ab)2, que contiene dos fragmentos Fab covalentemente unidos entre s y pequeos fragmentos peptdicos derivados de la degradacin de la regin carboxiterminal Fc, de las cadenas pesadas (figura 6-4).

5.2. Dominios de inmunoglobulinas y regiones hipervariables La secuenciacin completa de una molcula de inmunoglobulina, permiti definir los sitios de unin al antgeno y localizar las regiones responsables de las actividades biolgicas secundarias o efectoras de los anticuerpos. Se descubri as que las cadenas pesadas y livianas de los Igs estn estructuradas en regiones o dominios homlogos y globulares, de aproximadamente 110 aminocidos, que forman un asa o loop caracterstico, unido por puentes disulfuro intracatenarios (figuras 6-1 y 6-2). La homologa aminoacdica entre los distintos dominios de la molcula, sugiere que las inmunoglobulinas se habran originado a partir de un gen ancestral comn, que codificaba para un polipptido de 110 aminocidos y de funcin desconocida. En el curso de la evolucin este gen habra sufrido sucesivas duplicaciones y mutacio-

Figura 6-4. Fragmentos obtenidos por accin de papana y pepsina, sobre la molcula de inmunoglobulina. La papana separa la Ig en dos fragmentos monovalentes Fab que conservan la capacidad de unir especficamente el antgeno y, un fragmento Fc, responsable de la funcin efectora de un anticuerpo. La pepsina en cambio, escinde la molcula en un fragmento bivalente F(ab)2, con dos sitios de combinacin para el antgeno y, en mltiples pptidos de bajo peso molecular derivados de la degradacin del fragmento Fc.

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nes, que generaron las distintas clases y subclases de inmunoglobulinas. La comparacin de la secuencia aminoacdica de cadenas pesadas y livianas de diferentes Igs, revela la existencia de una gran variabilidad en el extremo aminoterminal, que constituye precisamente el dominio variable (VH y VL) de cada cadena. En el extremo carboxiloterminal de las cadenas pesadas y livianas en cambio, los distintos dominios presentan una muy escasa variacin constituyendo los dominios constantes (CH o CL) de cada cadena. En las cadenas pesadas , y existen tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3), mientras en las cadenas pesadas y , existen cuatro dominios constantes (CH1, CH2, CH3 y CH4). En las cadenas livianas existe slo un dominio constante CL (figuras 6-1 y 6-2). Cada dominio de la molcula de inmunoglobulina tiene la forma de un cilindro compuesto por dos hojas: una contiene tres hebras de cadenas polipeptdicas y la otra cuatro. En cada hoja, las hebras adyacentes son antiparalelas y forman una estructura secundaria tipo beta u hoja plegada. Ambas hojas estn alineadas en forma casi paralela y tienen enlaces disulfuro intracadenas entre dos cistenas altamente conservadas, cada una perteneciente a una de las hlices de cada lmina (figura 65). Las protenas que presentan una estructura similar, se clasifican en el grupo denominado superfamilia de las inmunoglobulinas. De los 110 aminocidos de la regin variable de las cadenas H y L, slo participan en el sitio de unin con el antgeno alrededor de 30 residuos de cada cadena, situados en las regiones de mayor variabilidad aminoacdica, denominadas re-

giones hipervariables o regiones determinantes de complementariedad (CDR: "ComplementaryDeterminig-Region"). Los CDRs que son tres segmentos cortos de 10 aminocidos (denominados CDR1, CDR2 y CDR3), no contiguos en la secuencia primaria de cadenas pesadas y livianas. En ambos tipos de cadenas H y L las regiones hipervariables se localizan en las posiciones 2535, 50-60 y 90-100 de la cadena polipeptdica. Adyacente a los CDR existen segmentos de aminocidos de menor variabilidad, conocidos como regiones marco, regiones de entramado o regiones flanqueantes FR1, FR2, FR3 y FR4 (FR: "Framework-Regions"), situadas en las posiciones 1-30, 35-50, 60-90 y 98-110, respectivamente. Estas regiones FR proporcionan un marco estructural para la yuxtaposicin de los CDR y conformacin del paratopo y, eventualmente, pueden estar involucradas en el contacto con el antgeno, especialmente cuando se trata de haptenos, donde uno o ms CDRs puede estar fuera de la regin de contacto con el antgeno. Las regiones variables de las cadenas pesadas y livianas pueden dividirse en subgrupos, segn la secuencia aminoacdica de las regiones de entramado. El nmero de subgrupos depende de cada especie. En humanos, existen cuatro subgrupos para cadenas kappa, seis para cadenas lambda y tres para cadenas pesadas. 5.3. Variaciones isotpicas, alotpicas e idiotpicas El sistema inmune es capaz de generar un repertorio linfocitario B estimado entre 1014 y 1016

Figura 6-5. Dominio constante y variable de una cadena liviana. Los dominios tienen una estructura beta mantenida por puentes disulfuro. En el extremo de la regin variable, las regiones hipervariables forman parte del sitio de unin al antgeno. Este sitio se completa con las regiones hipervariables presentes en la cadena pesada.

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clulas distintas y capaces de originar un repertorio de anticuerpos de igual diversidad. Las funciones biolgicas de este repertorio de anticuerpos estarn fundamentalmente determinadas por variaciones en la especificidad y afinidad de sus paratopos y por diferencias estructurales en la regin carboxiterminal (Fc), de sus cadenas pesadas. El estudio de las variaciones estructurales y/ o funcionales de cadenas pesadas y livianas, ha permitido identificar en los anticuerpos 3 tipos distintos de variaciones, denominadas: (i) variaciones isotpicas expresadas en los dominios constantes de cadenas pesadas o livianas de todos los individuos de una especie, (ii) variaciones alotpicas expresadas en los dominios constantes de cadenas pesadas o livianas de algunos, pero no todos los individuos de una misma especie, y (iii) variaciones idiotpicas, expresadas en las regiones variables o en los paratopos de distintos anticuerpos. 5.3.1. Variaciones isotpicas Definen variaciones estructurales en la regin constante de cadenas livianas o pesadas de una inmunoglobulina. As, diferencias aminoacdicas en el dominio constante, de cadenas livianas que expresan la misma regin variable VL , determinan la existencia de dos tipos o isotipos de cadenas livianas, denominados kappa () y lambda (). Diferencias estructurales en la regin constante de cadenas pesadas que expresan la misma regin variable VH, determinan la existencia de 5 clases o isotipos de cadenas pesadas (denominadas , , , y ) que conducen a la existencia de 5 clases o isotipos de inmunoglobulinas que difieren en su funcin efectora y se denominan IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente 5.3.2. Variaciones alotpicas Definen variaciones estructurales en las regiones constantes de las cadenas pesadas o livianas de una clase de Ig, entre diferentes individuos de una misma especie. Estas variaciones se heredan en forma estrictamente mendeliana y no ligada al sexo. Los isotipos se expresan en todos los individuos de una especie, mientras los alotipos se expresan slo en algunos individuos de la especie.

As, en humanos se han descrito cinco grupos distintos de marcadores alotpicos denominados Gm, Am, Mm (que se expresan en los dominios constantes de las cadenas pesadas , y , respectivamente), Km que se expresa en el dominio constante de las cadenas livianas kappa y Hv que se expresa en el dominio variable de las cadenas pesadas y debe por lo tanto ser considerado como marcador idiotpico. Variaciones en la regin constante de las cadenas pesadas de IgG han permitido distinguir al menos 24 variantes distintas (3 de las cuales han sido asociadas con IgG1, 1 asociada con IgG2, 13 asociadas con IgG3 y 7 variantes que no han sido asociadas a una subclase particular). 5.3.3. Variaciones idiotpicas La utilizacin de inmunoglobulinas como antgeno, ha permitido definir determinantes antignicos especficos, denominados idiotopos, asociados a las regiones o dominios variables de cada Ig. El conjunto de idiotopos de una inmunoglobulina, particularmente aqullos asociados al sitio de combinancin o paratopo, definen el llamado idiotipo de esa Ig o anticuerpo particular. Los idiotipos son generalmente propios o especficos de anticuerpos derivados de un clon linfocitario B particular (idiotipos privados) o pueden ser compartidos por varios clones linfocitarios (idiotipos pblicos). 5.4. Clases y subclases de inmunoglobulinas En mamferos superiores, especficamente en humanos, se reconocen clases y subclases de inmunoglobulinas que difieren en tamao, carga, composicin aminoacdica y contenido de carbohidratos de sus cadenas pesadas. Electroforticamente, presentan un espectro de migracin, que va desde la fraccin gamma a la alfa del suero normal. Las fracciones en que migran ms frecuentemente son: IgG en la fraccin gamma, IgA en gamma-beta, e IgM e IgD en beta. La tabla 6-1, presenta las caractersticas fisicoqumicas de las Igs humanas y la tabla 6-2 muestra sus caractersticas biolgicas.

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Tabla 6-1. Caractersticas fisicoqumicas de las inmunoglobulinas humanas Caracterstica Cadenas H Subclases de cadenas H Cadenas L Peso molecular (kDa) Nmero de monmeros Carbohidratos (%) S Valencia Cadena J IgG 1, 2, 3, 4 150 1 2-3 7 2 No Clase de Inmunoglobulina IgM IgA IgD 1, 2 970 5 12 19 10 S 1, 2 160 - 400 1-2 7 - 11 7 - 18 2-4 S, polimrica _ 184 1 9 - 13 7 2 No IgE _ 188 1 12 8 2 No

H, pesada; L, liviana; S, coeficiente de sedimentacin. Inmunoglobulina G. La IgG representa el 70-75% del repertorio total de inmunoglobulinas, siendo en su mayor parte de la subclase IgG1. Es una glicoprotena monomrica que posee dos cadenas pesadas g y dos cadenas livianas ( o ) (figura 6-2). Su peso molecular es de aproximadamente 150 kDa y est glicosilada en un 2 a 3%. Existen cuatro subclases (IgG1 a IgG4) originadas por pequeas diferencias en la regin constante de la cadena pesada, particularmente a nivel de la regin bisagra. Son los anticuerpos predominantes en la sangre, linfa y fluidos peritoneal y cerebroespinal. En cuanto a su comportamiento trmico, las IgG reaccionan mejor a 37C. Los anticuerpos de clase IgG predominan en la respuesta inmune secundaria y tienen una vida media de aproximadamente 21 das. Entre sus propiedades biolgicas destaca que todas las subclases (con excepcin de IgG 2 ), pueden unirse al sincitiotrofoblasto placentario a travs de los dominios CH1 y CH2; son por lo tanto, capaces de atravesar la placenta y responsables de la proteccin del recin nacido en los primeros meses de vida. La IgG es tambin importante en la induccin de fagocitosis (opsonizacin) dado que sus dominios CH1 y CH2 pueden unirse a receptores (FcR) presentes en la superficie celular de monocitos, macrfagos y neutrfilos. Todas las subclases de IgG (excepto IgG4 que lo hace muy dbilmente), unen el primer componente (C1q), del sistema complemento y pueden por lo tanto, activar complemento a travs del dominio CH2.

Tabla 6-2. Caractersticas biolgicas de las inmunoglobulinas humanas Caracterstica IgG Porcentaje del total de Ig en la sangre Concentracin en el suero (mg/ml) Fija complemento Atraviesa la placenta Unin a macrfagos y neutrfilos Unin a clulas cebadas y basfilos Unin a plaquetas 70 -75 800 - 1600 S S S No S Clase de Inmunoglobulina IgM IgA IgD 10 50 - 200 S No No No No 15 - 20 140 - 400 S No No No No 1 0,3 - 40 No No No No No

IgE 1 0,01 - 0,1 No No No S No

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Inmunoglobulina M. La IgM tiene un peso molecular de aproximadamente 970 kDa y representa el 10% del repertorio total de anticuerpos. Es una inmunoglobulina o anticuerpo polimrico con 10 12 sitios de unin para el antgeno (dados por 5 6 monmeros inmunoglobulnicos) y est glicosilada en un 12%. La estructura bsica del monmero IgM est dada por dos cadenas pesadas m y dos cadenas livianas o . Las cadenas m poseen cuatro dominios constantes (figura 6-6). Las subunidades se unen a travs de enlaces disulfuro entre los dominios C3. La polimerizacin de la molcula se ve favorecida por la existencia de la cadena J (joining o de unin), de aproximadamente 15-20 kDa, que se une a nivel de los penltimos residuos de cistena de cadenas , entre la primera y la ltima unidades monomrica del polmero. El 80% de la IgM se encuentra en el espacio intravascular. La IgM es la inmunoglobulina predominan-

te en la respuesta inmune primaria y tiene una vida media de 5 das. Es la Ig ms eficiente en la fijacin de complemento, en las reacciones de lisis celular y en la potenciacin de las reacciones de fagocitosis. Es una inmunoglobulina que reacciona bien a temperaturas inferiores a 37C. Inmunoglobulina A. La IgA representa de 10 a 5% del total de inmunoglobulinas corporales. Puede ser monomrica (160 kDa) o dimrica (385 kDa); la forma dimrica existente en las secreciones, se denomina IgA secretora (IgAs); Los anticuerpos IgA polimricos presentan, al igual que las IgM polimricas, la cadena J y el llamado componente secretor (glicoprotena de 70 kDa), que constituye un remanente del receptor poli-Ig (poli-IgR) sintetizada por las clulas epiteliales (figura 6-7). La cadena J se une al dominio CH3 y el componente secretor al dominio CH2 del dmero IgA.

Figura 6-6. Estructura de la Inmunoglobulina M. Las cinco unidades estructurales bsicas se unen por puentes disulfuro. Las cadenas m poseen cuatro dominios constantes. Una cadena J inicia el ensamblaje del pentmero.

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Figura 6-7. Inmunoglobulina A monomrica, dimrica y de secrecin. Las IgA monomrica y dimrica corresponden a formas sricas; la dimrica tiene una cadena J. La IgA secretora, adems de la cadena J, presenta un componente secretor.

La IgA es la principal inmunoglobulina presente en leche, saliva, lgrimas, y secreciones respiratorias y digestivas. Las clulas epiteliales sintetizan el poli-IgR en el retculo endoplsmico, y luego de pasar por el complejo Golgi ser expuesto, como receptor para las IgA e IgM polimricas, en la superficie basolateral de la clula epitelial. La unin no covalente, del extremo carboxiterminal del anticuerpo al receptor es dependiente de la cadena J. El complejo IgA-poliIgR (o IgM-poli-IgR) ingresa por endocitosis a la clula epitelial y es luego transportado a la superficie apical o luminal del epitelio (transcitosis) donde el receptor ser parcialmente digerido, dejando un fragmento o componente secretor covalentemente unido al anticuerpo secretado. El componente secretor protege a IgA e IgM, de la accin de las enzimas proteolticas presentes en las secreciones (figura 6-8). Entre las propiedades de la IgA destacan las siguientes: neutraliza los virus, activa el sistema del complemento por la ruta alterna y por la ruta

de las lectinas, impide la adherencia de bacterias a la superficie de la mucosa intestinal y su porcin Fc se une al receptor fagoctico Fc-R (CD89). Existen dos subclases de IgA (IgA1 e IgA2) que presentan pequeas diferencias en las regiones constantes de las cadenas alfa. No se han observado diferencias en la actividad biolgica. Inmunoglobulina D. La IgD tiene un peso molecular de aproximadamente 185 kDa, est glicosilada en un 9 a 14% y tiene una vida media de 2 a 3 das. Existe controversia sobre su funcin; sin embargo, se piensa que por encontrarse presente en cantidades importantes sobre la membrana de los linfocitos B circulantes, podra estar involucrada en la activacin de dichas clulas como receptor de antgeno. Representa menos del 1% del total de las inmunoglobulinas y la mayor parte se encuentra en el espacio intravascular (figura 6-9).

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Figura 6-8. Proceso de secrecin de la IgA. La IgA plasmtica dimrica se une al receptor poli-Ig expuesto en la superficie basolateral de la clula epitelial e ingresa a la clula como complejo poli-Ig-IgA, por endocitosis. Posteriormente, hacia el lado luminal de la clula, el receptor poli-Ig, es parcialmente digerido, dejando un fragmento o componente secretor, covalentemente unido a la IgA dimrica secretada.

Figura 6-9. Estructura de las inmunoglobulinas E y D. La IgD y la IgE son inmunoglobulinas monomricas de aproximadamente 185 y 190 kDa, respectivamente. Las cadenas e poseen cuatro dominios constantes.

Inmunoglobulina E. La IgE es una glicoprotena de aproximadamente 190 kDa, que se encuentra glicosilada en un 12% y tiene una vida media de 2 a 3 das. Las cadenas e presentan cuatro dominios constantes (figura 6-9). La IgE representa menos del 1% del total de las

inmunoglobulinas y el 50% de ella se encuentra en el espacio intravascular. La regin Fc de la IgE se une con facilidad a receptores especficos de alta afinidad (receptores FcRI), constitutivamente expresados en la membrana de clulas cebadas, basfilos y eosinfilos, de

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esta manera estas clulas adquieren receptores antgeno-especficos. La unin de antgenos (alergenos) a las IgE unidas a mastocitos y basfilos, gatilla no slo la degranulacin celular y la liberacin (exocitosis) de mediadores de inflamacin (histamina, serotonina, triptasa), sino tambin la sntesis de citoquinas (IL-4, IL-5, IL-6, TNF) y de mediadores derivados del cido araquidnico (leucotrieno C4, prostaglandina D2). La liberacin de estos mediadores de hipersensibilidad inmediata en reacciones alrgicas como asma, fiebre del heno y urticaria, induce rpidamente edema de la mucosa bronquial, secrecin de mucus, contraccin de la musculatura lisa y, subsecuentemente, infiltrado leucocitario en el sitio de inflamacin. Un FcR de baja afinidad y rol biolgico hasta ahora desconocido (FcRII) se expresa constitutivamente en linfocitos B (receptor FcRIIA) o en respuesta a IL-4, en monocitos y eosinfilos (receptor FcRIIB o CD23).

6. RESPUESTA INMUNE HUMORAL Los anticuerpos producidos por las clulas plasmticas -que representan el estado final de diferenciacin de los linfocitos B- son mediadores de la respuesta inmune humoral y por lo tanto, responsables de la neutralizacin y eliminacin de diversos antgenos, gatillando una variedad de reacciones inmunolgicas. Una de las caractersticas esenciales de esta respuesta es su carcter especfico y heterogneo; es decir, se sintetizan anticuerpos de distinta clase, avidez y afinidad, capaces de interactuar con eptopos antignicos segn un claro patrn temporal. En un individuo que por primera vez toma contacto con un antgeno, se distinguen cuatro fases en la respuesta primaria de produccin de anticuerpos (figura 6-10): (i) Fase de latencia, en la que no se detectan anticuerpos, (ii) Fase logartmica, en la cual el ttulo del anticuerpo se eleva en forma exponencial, (iii) Fase de meseta, en cual el ttulo de anticuerpos se estabiliza, y (iv) Fase de descenso, en cual la concentracin de anticuerpos disminuye por eliminacin o catabolismo.

Figura 6-10. Respuesta inmune humoral. La figura superior presenta las etapas de una respuesta inmune humoral, expresadas como ttulo de anticuerpos: Fase de latencia, logartmica, de meseta y de decadencia. La figura inferior muestra diferencias entre las respuestas inmune humoral primaria y secundaria, particularmente respecto a la clase de inmunoglobulinas y al ttulo de los anticuerpos. Se destaca que en la respuesta primaria, se pesquisa primero IgM en bajo ttulo y en la respuesta secundaria predomina la sntesis de IgG, en un ttulo significativamente superior (ver cambio de clase).

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Aunque estas fases de la curva de produccin de anticuerpos se presentan siempre en la respuesta primaria, en los posteriores contactos con el antgeno (respuesta secundaria, terciaria, etc.), pueden distinguirse los siguientes aspectos (figura 6-10): (i) Evolucin cronolgica, fase de latencia ms corta y fases de meseta y de descenso ms largas, (ii) Ttulo de anticuerpos, en la fase de meseta mucho mayor concentracin de anticuerpos, (iii) Clase de anticuerpos, en la respuesta primaria para los antgenos timo-dependientes, se sintetizan y secretan fundamentalmente anticuerpos de isotipo IgM, de gran avidez, en cambio en la respuesta secundaria se encuentran casi exclusivamente anticuerpos de isotipo IgG, y (iv) Afinidad de los anticuerpos, generalmente mucho mayor en la respuesta secundaria o posterior. Este fenmeno se denomina maduracin de la afinidad y es consecuencia de la hipermutacin somtica en los genes recombinados del anticuerpo y de una expansin selectiva de los clones de alta afinidad. 6.1. Avidez El trmino avidez se refiere a la fuerza con que un anticuerpo se une a un antgeno multivalente y, por lo tanto, tiene relacin con la afinidad y con la valencia del antgeno y del anticuerpo. Si tanto el antgeno como el anticuerpo tienen carcter multivalente, la fuerza de unin entre ellos es mayor que la suma de las afinidades. Debido a que la avidez de un anticuerpo es una funcin de los mtodos utilizados para medirla (precipitacin con sulfato de amonio o con suero anti-Ig o, seroneutralizacin de fagos o bacterias, entre otros), slo puede expresarse en unidades arbitrarias. 6.2. Afinidad El trmino afinidad de un anticuerpo, es una expresin termodinmica de la fuerza de la interaccin entre un eptopo del antgeno y el sitio de combinacin de un anticuerpo; por lo tanto, es una medida de la compatibilidad estereoqumica entre ambas molculas y puede aplicarse a interacciones que involucran determinantes simples (como los haptenos). La afinidad resulta de la suma de las fuerzas de repulsin y atraccin (puentes de hidrgeno, interacciones de Van der Waals, interacciones electrostticas e interacciones hidrofbicas) entre

el antgeno y el anticuerpo. Operacionalmente, esto significa que mientras mayor es la afinidad de la interaccin, es ms difcil separar los componentes del complejo antgeno-anticuerpo. Dado que las interacciones antes mencionadas no son covalentes, la unin antgeno-anticuerpo se puede representar por la constante de asociacin o afinidad Ka, (que se expresa en M-1). Se obtiene asumiendo que esta reaccin obedece rigurosamente a la ley de accin de masas, como sigue:

Ka Ag + Ac Kd * Concentracin Molar AgAc Ka =

[ AgAc ]* [ Ag ] x [ Ac ]

La Ka se puede medir por varias tcnicas, tales como: dilisis en equilibrio, radioinmunoensayo y precipitacin con sulfato de amonio de complejos antgeno-anticuerpo.

7. BASES GENTICAS DE LA DIVERSIDAD DE LAS INMUNOGLOBULINAS En los vertebrados superiores el tamao y diversidad del repertorio linfocitario, aumenta la probabilidad que un linfocito individual encuentre un antgeno que se una a su receptor de superficie y gatille la proliferacin y diferenciacin celular a travs de un proceso de seleccin clonal de linfocitos. El receptor de un linfocito B (BCR) es generado somticamente en el rgano linfoide primario, durante un proceso de diferenciacin antgeno independiente que permite que cada linfocito B est provisto de un receptor nico, cuyas cadenas pesadas y livianas no estn codificadas en el DNA germinal y no est predestinado a reconocer un antgeno extrao particular. El repertorio de receptores linfocitarios B es generado al azar durante un proceso regulado de reordenamiento o recombinacin de segmentos gnicos V(D)J (como ocurre en humanos), por conversin gnica (como ocurre en pollos y conejos) o por mutacin somtica (como ocurre en ovejas). Adems durante la recombinacin V(D)J, puede introducirse una

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mayor diversidad por: (i) corte impreciso de los segmentos gnicos que se recombinan, (ii) agregado de nucletidos al azar, en los sitios de corte y unin de los distintos segmentos gnicos y, (iii) combinacin al azar de distintas cadenas pesadas y livianas. A estos mecanismos de generacin de diversidad en el rgano linfoide primario, se agregarn luego, en los rganos linfoides secundarios, mecanismos antgeno-dependientes como: (i) la hipermutacin de las regiones hipervariables (CDRs) de cadenas pesadas y livianas, (ii) el switching isotpico o cambio de clase de las cadenas pesadas y (iii) la edicin del receptor a travs de reordenamientos secundarios V en las cadenas livianas.

7.1. Genes de inmunoglobulinas En el DNA germinal de los vertebrados superiores no existen genes que codifiquen la sntesis de cadenas pesadas y livianas de una inmunoglobulina; al contrario estos genes deben ser creados o ensamblados a partir de copias mltiples de pequeos segmentos gnicos, en un proceso de recombinacin sitio-especfico, catalizado por un complejo enzimtico denominado recombinasa (figuras 6-11 y 6-12). Los segmentos gnicos que codifican las distintas regiones o dominios de cadenas pesadas y livianas de una inmunoglobulina, se encuentran agrupados en tres grupos o familias gnicas distintas: (i) una nica familia gnica H, que incluye

Figura 6-11. Generacin del gen activo de la cadena pesada. El gen activo para una cadena H surge de cuatro genes (V, D, J y C) de la lnea germinal. Mediante recombinacin somtica se unen a una de las secuencias V, D y J, formando la regin variable. Los genes para regin constante (nueve en el ser humano) estn situados ro abajo (hacia 3'). Uno de los genes constantes se une a los segmentos ya recombinados que codifican la regin variable. El montaje final de las secuencias se realiza durante el procesamiento del RNA.

Figura 6-12. Recombinacin de segmentos gnicos y generacin de RNA mensajero para cadenas livianas. En la clula precursora de un linfocito B, los distintos segmentos gnicos se encuentran en configuracin germinal y deben recombinarse para generar un gen que codifique la cadena liviana de una inmunoglobulina.

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genes CH (constantes), genes VH (variables), genes JH (unin) y genes DH (diversidad) de las cadenas pesadas; (ii) dos familias gnicas livianas distintas (kappa y lambda) que incluyen genes CL (constantes), genes VL (variables) y genes JL (unin). En humanos, los segmentos gnicos que codifican las cadenas pesadas se encuentran en el cromosoma 14 y los de cadenas livianas y en los cromosomas 2 y 22, respectivamente. En el ratn, en cambio, los genes para cadenas pesadas se ubican en el cromosoma 12, y los genes para cadenas livianas y , se ubican en los cromosomas 6 y 16, respectivamente. 7.1.1. Genes de cadenas pesadas La regin variable de una cadena pesada (VH, de aproximadamente 110 aminocidos), se genera a partir de tres segmentos gnicos distintos: un segmento gnico variable VH, de 285 pares de bases, que codifica los primeros 95 aminocidos y dos segmentos gnicos distintos (de diversidad DH y de unin JH) que codifican los ltimos 13 aminocidos del dominio variable. Cada segmento gnico VH contiene adems en su extremo 5, una pequea secuencia nucleotdica de 60 a 90 pares de bases, que codifican una secuencia aminoacdica lder o seal aminoterminal hidrofbica de 20 a 30 aminocidos, que permite la sntesis de la cadena liviana en ribosomas asociados al retculo endoplsmico celular. Iniciada la sntesis de la cadena liviana, la secuencia lder o seal es luego, rpidamente removida del extremo amino de la protena (figura 6-11). El sitio de ensamblaje de los segmentos V(D)J codifica la tercera regin hipervariable (CDR3), de la cadena pesada, mientras las dos primeras regiones hipervariables (CDR1 y CDR2), estn codificadas dentro del segmento gnico VH. La regin constante de la cadena pesada est codificada por un segmento gnico o minigen constante CH que contiene 3 4 exones (CH1, CH2, CH3, CH4: que codifican la regin constante de las cadenas pesadas de los anticuerpos) y exones ms pequeos que codifican la regin transmembrana y el dominio citoplasmtico de la cadenas pesadas de Ig del receptor linfocitario BCR (figura 61). Los minigenes de cadenas pesadas de diferentes isotipos (C, C, C, C y C), estn ordenadas en series (en tndem), en un orden que es caracterstico de cada especie. En humanos, el repertorio genmico de ca-

denas pesadas ocupa 1250 kilobases (kb), en el brazo largo del cromosoma 14, y consiste de 123 a 129 segmentos gnicos variables VH, 27 segmentos gnicos DH, 9 segmentos gnicos JH y 11 minigenes constantes CH. Los segmentos gnicos variables ocupan una posicin muy cercana al telmero cromosmico y entre ellos se distinguen 41 seudogenes y slo 82 a 86 segmentos funcionales que se clasifican en 7 familias o subgrupos cuyos miembros presentan ms de 70% de homologa. Los minigenes constantes ocupan una posicin ms centromrica en el cromosoma 14 humano. Se han descrito adems, fuera del cromosoma 14 humano, 35 segmentos gnicos hurfanos y no funcionales que no contribuyen a la sntesis de cadenas pesadas: 9 segmentos VH y 10 segmentos DH en el cromosoma 15; 16 segmentos VH en el cromosoma 16 y un segmento VH en el cromosoma 9. Los seudogenes o segmentos gnicos no funcionales, aunque no contribuyan directamente a la diversidad de las cadenas, pueden constituir un importante reservorio de diversidad, puesto que pueden utilizarse en la recombinacin desigual (conversin gnica) con segmentos gnicos funcionales y generar as nuevos segmentos gnicos funcionales. 7.1.2. Genes de cadenas livianas La regin o dominio variable de una cadena liviana (V L de aproximadamente 110 aminocidos), se genera a partir de dos segmentos gnicos distintos: un segmento gnico variable VL, de 285 pares de bases, que codifica los primeros 95 aminocidos y, un segmento gnico de unin JL, de 39 pares de bases que codifica los ltimos 13 aminocidos del dominio variable liviano (aminocidos 96 al 108 en direccin aminocarboxilo). Cada segmento gnico VL contiene adems en el extremo 5, una pequea secuencia nucleotdica de 60 a 90 pares de bases, que codifica una secuencia aminoacdica lder o seal hidrofbica, ubicada en el extremo amino de la cadena liviana (figura 6-12). El dominio constante de la cadena liviana est codificado por un segmento o minigen constante (CL) que contiene un nico exn de aproximadamente 330 pares de bases, puesto que las cadenas livianas no contienen dominios transmembrana y citoplasmtico (figura 6-1).

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a) Genes de cadena kappa En humanos el repertorio genmico para cadenas livianas kappa (), ocupa 1820 kb en el brazo corto del cromosoma 2 y consiste de 76 segmentos variables V (agrupados en 7 familias distintas, y cuyos miembros muestran ms de 70% de homologa), 5 segmentos gnicos de unin J y un nico gen constante C. Los segmentos variables V, estn separados en dos grupos o clusters: uno distal conteniendo 36 genes en 400 kb (ms centromrico y en posicin 5, ms lejos del gen constante C) y, otro ms proximal conteniendo 40 segmentos gnicos en 600 kb (en posicin ms telomrica y en posicin 3, ms cercano al gen constante C). Se ha descrito adems un haplotipo raro que contiene slo el cluster proximal con 40 segmentos gnicos V distribuidos en 7 familias, de los cuales 18-20 son segmentos funcionales. En este haplotipo se han identificado y secuenciado, adems, 28 segmentos gnicos V adicionales y hurfanos, distribuidos en distintos cromosomas: 3 ubicados en el brazo corto del cromosoma 2, (pero fuera del locus mayor IgL), 13 segmentos en el brazo largo del cromosoma 2, 6 segmentos en el cromosoma 22, 1 en el cromosoma 1, 1 en el cromosoma 15 y 4 fuera del cromosoma 2. b) Genes de cadenas lambda En humanos el repertorio genmico de cadenas livianas lambda (), ocupa 1050 kb en el brazo largo del cromosoma 22 y contiene: 70-71 segmentos variables V, que ocupan 900 kb (dependiendo del haplotipo), 7 a 11 segmentos constantes (C) en posicin ms telomrica y, adems, cada segmento gnico constante est precedido por un nico segmento gnico J. Los segmentos gnicos V ocupan una posicin ms centromrica y entre ellos se distinguen 14 seudogenes y 56-57 segmentos V funcionales, agrupados en 11 familias distintas. Se han descrito adems dos segmentos gnicos hurfanos ubicados en el cromosoma 8 humano y dos segmentos V y dos segmentos constantes C, en el cromosoma 22, por fuera del locus mayor de cadenas livianas lambda. 7.2. Reordenamiento gnico El reordenamiento gnico se realiza de manera definida y ordenada, recombinando primero los segmentos gnicos que codifican las cadenas pe-

sadas y luego los segmentos gnicos que codifican las cadenas livianas. La recombinacin es iniciada por un complejo enzimtico o recombinasa, que reconoce y corta de manera especfica, una secuencia seal de recombinacin (RSS: "Recombination Signal Sequence") que flanquea o es adyacente a cada uno de los segmentos gnicos V(D)J que deben reordenarse. Cada secuencia RSS consta de un heptmero conservado (5CACAGTG) y un nonmero tambin conservado (5 ACAAAAACC), separados entre s por un espaciador no conservado de 12 23 pares de bases (figura 6-13). Los espaciadores definen dos tipos distintos de secuencias de recombinacin (denominadas 12-RSS y 23-RSS) y, el reordenamiento se realiza de manera tal que una recombinacin eficiente slo ocurre cuando un segmento gnico que contiene el espaciador 12RSS, se reordena con un segmento gnico distinto que contiene el espaciador 23-RSS. Esta restriccin del reordenamiento gnico, se conoce como la regla 12/23 y determina qu segmentos podrn recombinarse entre s, dependiendo de la posicin de las secuencias 12-RSS o 23RSS, en el extremo 5 o 3 de cada segmento gnico (figura 6-14). La secuencia RSS se encuentra en el extremo 3 de cada segmento variable V, en el extremo 5 de cada segmento de unin J y en ambos extremos, 5 y 3, de los segmentos gnicos de diversidad D. El proceso de recombinacin o reordenamiento gnico es altamente complejo e implica la participacin de una maquinaria enzimtica (recombinasa) que incluye componentes de expresin exclusivamente linfocitaria y componentes que forman parte de la maquinaria de reparacin del DNA celular. El reordenamiento V(D)J es iniciado por los productos de expresin linfoide-especfica de los genes RAG-1 y RAG-2 (RAG: "Recombination Activating Gene") que reconocen y cortan las secuencias RSS, adyacentes a cada segmento gnico que ser recombinado. Las secuencias RSS son primero reconocidas por la maquinaria de recombinacin y luego aproximadas en estrecha yuxtaposicin o sinapsis para cortar de manera precisa el DNA, en el lmite entre el heptmero de cada secuencia RSS y el segmento gnico codificante. Protenas de alta movilidad de los grupos 1 y 2 (HMG1/2) parecen desempear un rol auxiliar en estos eventos tempranos de la recombinacin gnica. El corte o dao en el DNA

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agregar nucletidos en los extremos libres de los segmentos gnicos codificantes, incrementando notablemente la diversidad generada durante este proceso de reordenamiento o recombinacin gnica. 7.2.1. Reordenamiento de cadenas pesadas El reordenamiento de segmentos gnicos en el locus para cadenas pesadas, se realiza en un orden preciso e implica la eliminacin o delecin, de todos los segmentos que separan a aqullos que deben recombinarse. Primero se reordena un segmento gnico de diversidad D, con un segmento de unin J, eliminando toda la secuencia nucleotdica que los separa, pero manteniendo todos los segmentos gnicos que estn en posicin y direccin 5 del segmento D y en posicin y direccin 3 del segmento J que se recombina. Luego, uno de los segmentos gnicos variables V, se recombina con el complejo DJ ya reordenado, eliminando los segmentos que los separan y conservando aqullos que estn en posicin y direccin 5 de V y en direccin 3 del complejo DJ. El DNA ya reordenado, es ahora utilizado como molde para la sntesis de una RNA o transcrito primario que incluir, tantos los segmentos gnicos V(D)J recombinados, como los genes constantes C y C, ubicados en direccin 3 de los segmentos J. El transcrito primario es luego procesado de manera tal que: (i) se eliminan por "splicing" los segmentos J que separan V(D)J de CC y los segmentos gnicos V, situados en direccin 5 del complejo V(D)J reordenado. Se eliminar adems C o bien C, para generar por splicing alternativo, dos RNA mensajeros distintos: uno que contiene V(D)JC y codificar una cadena pesada de tipo mu y otro que contendr V(D)J-C y codificar la sntesis de una cadena pesada delta; (ii) se agrega un capuchn de 7-metil guanosina en el extremo 5 del RNA, y (iii) se agrega una cola de poli-A (de 150 a 200 adeninas), en el extremo 3 de V(D)J-C y en el extremo 3de V(D)J-C, para generar mRNA funcionales, que sern transportados desde el ncleo al citoplasma celular proB, para la sntesis de las respectivas cadenas pesadas H y/o H. 7.2.2. Reordenamiento de cadenas livianas El reordenamiento de segmentos gnicos

Figura 6-13. Recombinacin de segmentos gnicos V(D)J. La recombinacin de segmentos gnicos es iniciada por un complejo enzimtico (recombinasa) que reconoce y corta de manera especfica una secuencia seal de recombinacion (RSS) que flanquea los segmentos gnicos que deben reordenarse. Cada secuencia RSS consta de un heptmero conservado (5 CACAGTG) y un nonmero tambien conservado (5 ACAAAAACC), separados entre s por un espaciador no conservado de 12 23 pares de bases. El reordenamiento se realiza de manera tal que una recombinancin eficiente slo ocurre cuando un segmento que contiene el espaciador 12-RSS, se reordena con un segmento gnico distinto que contiene el espaciador 23-RSS (regla 12/23).

es ahora detectado por la maquinaria celular de reparacin del DNA, que incluye una protena quinasa DNA dependiente (DNA-PK ), reclutada en sitio del dao a travs de su interaccin con el heterodmero regulador Ku70/Ku80, que reconoce los extremos cortados del DNA. La quinasa DNA-PK es una protena de 450 kDa, codificada por el gen XRCC7 y perteneciente a la familia de las fosfatidil inositol (PI) quinasas. Forma tambin parte de la maquinaria de reparacin el producto del gen XRCC4 que se une a la DNA-PK y acta como una ligasa IV para unir los extremos cortados del DNA codificante, en los eventos finales de reparacin del DNA. Previo a la reparacin final del DNA, una exonuclesa puede remover nucletidos al azar y la enzima TdT puede

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de cadenas livianas kappa o lambda se realiza de manera similar al reordenamiento de cadenas pesadas. Primero se reordenan al azar segmentos gnicos V y J, con deleccin del DNA que separa los segmentos que se recombinan y mantencin de los segmentos gnicos que estn en direccin 5 del segmento V y en direccin 3 del segmento J que se recombina. El complejo VJ reordenado, se recombina ahora con un gen constante C, eliminando todo el DNA que los separa. Si los segmentos J y C estn asociados en un mismo grupo o cluster, el reordenamiento de un J determinado implicar la recombinacin, del gen C asociado a ese segmento gnico J. Reordenado el DNA, se sintetiza ahora un transcrito primario que ser procesado para generar el RNA mensajero que codifica la sntesis de una cadena liviana kappa o lambda. 7.2.3. Reordenamiento impreciso del DNA El reordenamiento de segmentos gnicos y el corte de las secuencias RSS adyacentes a cada

segmento, presenta cierto grado de imprecisin que contribuye a aumentar la diversidad del repertorio linfocitario. Esto significa que en linfocitos que utilizan los mismos segmentos gnicos para generar las cadenas y livianas de su receptor BCR, el corte impreciso del DNA conducir a variaciones aminoacdicas codificadas por diferencias en el nmero de nucletidos en la regin de unin de los segmentos gnicos recombinados (figura 6-14). El reordenamiento impreciso tambin puede llevar a reordenamientos no funcionales que estn fuera del marco de lectura, de modo que el DNA no pueda transcribirse 7.2.4. Diversificacin de la regin N Linfocitos que utilizan los mismos segmentos gnicos V(D)J para generar las cadenas pesadas y livianas de su receptor, pueden presentar un BCR con claras diferencias aminoacdicas como consecuencia de la remocin o agregado de nucletidos en la regin de unin de esos segmentos V(D)J. El agregado aleatorio de nucletidos

Figura 6-14. Reordenamiento impreciso del DNA. El punto de corte nucleotdico durante la recombinacin entre segmentos V y J, puede variar en un margen de varios nucletidos, dando lugar a diferentes secuencias nucleotdicas en el gen activo de la cadena kappa. El aminocido 96 podra estar codificado por los codones TGG (triptfano), CGG (arginina) y CCG (prolina).

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que no estn codificados en el DNA germinal es catalizado por la enzima TdTy conduce a la generacin de la llamada regin N (N: "New nucleotides") que, en algunos casos, puede incluir hasta 20 nuevos nucletidos, en la regin de unin de los segmentos gnicos reordenados. Durante la reparacin del DNA en la regin de unin de los segmentos gnicos, pueden tambin transferirse nucletidos desde la hebra no codificante, a la hebra codificante del DNA, generando las denominadas secuencias nucleotdicas P. El agregado de nucletidos en la regin de unin de los segmentos gnicos V(D)J que se recombinan, puede llevar a reordenamientos no funcionales que estn fuera del marco de lectura, generando codones sin sentido o de trmino, en dos de cada tres reordenamientos. 7.2.5. Exclusin allica

7.2.6. Exclusin isotpica El reordenamiento de los genes que codifican inmunoglobulinas es desde luego complejo, pero es tambin altamente ordenado: primero se reordenan los segmentos gnicos que codifican cadenas pesadas y luego, la familia de segmentos kappa se reordena antes que aqullos que codifican la cadena liviana lambda. El reordenamiento productivo (paterno o materno) de una cadena liviana kappa implica por lo tanto exclusin allica materna o paterna del locus kappa y simultneamente exclusin de los cromosomas que contienen los segmentos gnicos que codifican la expresin del isotipo liviano lambda (exclusin isotpica). La generacin de genes funcionales que codifiquen la expresin de cadenas pesadas y livianas de una inmunoglobulina depende del fenmeno ensayo-error durante el reordenamiento de segmentos gnicos y depende de diversos elementos reguladores positivos ("enhancers") y negativos ("supressors"), ubicados entre los segmentos gnicos que deben reordenarse. 7.2.7. Cambio de clase de cadenas pesadas Una estrategia adicional para la diversificacin del repertorio de anticuerpos de un individuo es, durante la generacin de linfocitos B de memoria, el cambio de clase de la regin constante de la cadena pesada. Los linfocitos B vrgenes clonalmente expandidos luego del encuentro con su antgeno especfico sufrirn una diferenciacin que incluye un proceso de recombinacin gnica que conduce a un cambio de la regin constante m expresada en el linfocito virgen original, por una regin constante distinta (, ) en la cadena pesada del receptor clonotpico del linfocito B de memoria. De esta manera la asociacin de una misma regin variable (que mantiene la especificidad por el antgeno), a distintas regiones constantes pesadas conduce a un cambio en la funcin efectora de los anticuerpos, que difieren as en su capacidad para reclutar y activar distintos mecanismos efectores de la respuesta inmune humoral (figura 6-15). La recombinacin gnica de cambio de clase es gatillada por seales accesorias de coestimulacin linfocitaria (dependientes fundamentalmente de CD40/CD40L y citoquinas) e implica el reconocimiento de secuencias nucleotdicas Ss

El receptor linfocitario BCR, est constituido por dos cadenas pesadas idnticas y dos cadenas livianas tambin idnticas, implicando que cada linfocito B slo puede expresar el locus paterno o materno, para la sntesis de una cadena pesada o para la sntesis de una cadena liviana kappa o lambda. La sntesis de una cadena pesada , como resultado del reordenamiento exitoso de segmentos gnicos V(D)J en el alelo de uno de los cromosomas homlogos (materno o paterno), inhibe o excluye irreversiblemente el reordenamiento gnico en el alelo del otro cromosoma (exclusin allica). El reordenamiento gnico en un cromosoma puede no traducirse en la sntesis de la respectiva cadena polipeptdica debido a que: (i) durante el reordenamiento de segmentos gnicos V(D)J se produce delecin o generacin de codones de trmino de lectura, (ii) el reordenamiento es exitoso pero no se generan mRNA funcionales, debido a un procesamiento inadecuado del transcrito primario, y (iii) el reordenamiento gnico es incompleto, puesto que se recombinan algunos segmentos (DH-JH o VH-DH) pero no todos aqullos necesarios para generar un adecuado transcrito primario. Si la recombinacin V(D)J en un cromosoma materno o paterno genera un reordenamiento no productivo, el segundo cromosoma (paterno o materno, respectivamente) ser reordenado; incluso cabe la posibilidad de corregir combinaciones aberrantes en un cromosoma recurriendo a un segundo reordenamiento (reordenamiento secundario) sobre el mismo cromosoma.

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Figura 6-15. Cambio de clase de cadenas pesadas. Cuando un linfocito sintetiza cadenas mu o delta, el gen de las cadenas pesadas presenta la ordenacin ilustrada en la parte superior de la figura. Las secuencias S intervienen en un proceso de recombinacin que une la secuencia VDJ a una de los otros genes para la regin constante. Decidida la clase, el DNA se transcribe y el RNA se procesa, formndose un mRNA especfico para la regin gamma-3, psilon o alfa, segn el ejemplo de la figura.

(Switching sequences) de 1 a 10 kb localizadas en el extremo 5 de cada segmento o gen constante pesado (excepto en el extremo 5 del gen ). En general las secuencias de switching tienen la forma (GAGCT)n GGGGT, donde el primer elemento est repetido en tndem de 1 a 7 veces y luego la secuencia completa est repetida hasta 150 veces en una regin de DNA que ocupa de 1 a 10 kb y est ubicada entre 1 a 4 kb hacia arriba del extremo 5 del gen constante. El reordenamiento implica adems la participacin de una recombinasa de "switching" que no es sitio-especfica porque la regin Ss puede variar enormemente en longitud y los cortes en el DNA no necesariamente ocurren dentro de la regin de cambio de clase. Aunque los componentes de la recombinasa de switching no han sido claramente definidos, se ha logrado establecer que no incluye los productos de los genes RAG-1 y RAG-2 y que contiene componentes de la maquinaria de reparacin del DNA celular y un complejo proteico denominado SWAP (Switching Activation Protein) en el que se han identificado cuatro protenas: nucleoplasmina, poli-ADP-ribosa polimerasa, nucleolina y la protena SWAP-70. El cambio de clase de cadenas pesadas es regulado de manera tal que diferentes citoquinas, producidas fundamentalmente por linfocitos T CD4+, promueven el cambio hacia un isotipo particular de inmunoglobulina.. En humanos por ejemplo, la interleuquina-4 (IL-4) promueve el "switching" IgE, mientras que "Transforming

Growth Factor " beta (TGF-) e IL-5 promueven el cambio hacia IgA. En ratones, el interfern gamma (IFN-) induce un cambio selectivo hacia IgG2a, que activa el sistema del complemento y promueve la fagocitosis de agentes infecciosos opsonizados por estos anticuerpos. Por otra parte, dependiendo del sitio de entrada y la distribucin del antgeno en el organismo, puede inducirse una respuesta inmune caracterizada por la sntesis de distintas clase de anticuerpos. As un antgeno que ingresa a la circulacin sangunea o linftica inducir la sntesis de distintos isotipos, mientras aquellos que ingresan por va oral o respiratoria activan preferentemente inmunidad de mucosas caracterizada por la secrecin de IgA. En algunos individuos existe adems una clara predisposicin gentica (atopia) a desarrollar alergias como resultado de la sntesis y secrecin de IL-4 e IL-5 que estimulan la produccin de IgE y la diferenciacin especfica de eosinfilos, respectivamente. En el hombre, el ordenamiento de genes para las regiones constantes de las cadenas pesadas en direccin 5' a 3' en el cromosoma 14 es el siguiente: mu, delta, gamma (1-4), psilon y alfa (1-2). En el ratn, el cromosoma 12 presenta el orden: mu, delta, gamma-3, gamma-1, gamma-2b, gamma-2a, psilon y alfa (figura 6-16) 7.3. Hipermutacin somtica El proceso de recombinacin V(D)J genera un repertorio primario de inmunoglobulinas el que,

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luego del encuentro con el antgeno en los rganos linfoides secundarios, ser enormemente diversificado en los centros germinales, a travs de un proceso de mutacin puntual en sus regiones hipervariables o CDRs. El microambiente particular de los centros germinales, no slo favorece la expansin clonal de los linfocitos antgenoespecficos sino que tambin favorece el "switching" isotpico y la modificacin paratpica de cadenas pesadas y livianas. Aquellos linfocitos en los cuales el proceso de hipermutacin genera un receptor de mayor afinidad por el antgeno, sern selectivamente seleccionados para continuar su maduracin en linfocitos B de memoria. El nivel de mutacin en las regiones hipervariables de una inmunoglobulina, se ha estimado en 10-3 pares de bases por generacin, lo cual es seis rdenes de magnitud ms alto que una mutacin espontnea. Aunque la mayora de estas mutaciones son cambios puntuales, se ha logrado establecer que las deleciones representan entre 47% de las mutaciones, mientras las duplicaciones representan casi el 1% de las modificaciones en las regiones hipervariables. Las mutaciones parecen estar de alguna manera asociadas al proceso de transcripcin y confinadas a un dominio de hipermutacin ("HYM domain") que se extiende 2000 pares de bases (2 kb) hacia abajo, en direccin 5- 3 desde el promotor asociado a cada segmento V que se ha recombinado. Por otro lado, la hipermutacin no parece ser un proceso al azar puesto que las transiciones son ms frecuentes que las transversiones y los nucletidos que contienen Adenina son ms frecuentemente utilizados que aqullos que contienen Timina. La figura 6-3 muestra esquemticamente la diferenciacin celular del linfocito B en presencia del antgeno: activacin, proliferacin celular y cambio de clase. 7.4. Control de la transcripcin de los genes de inmunoglobulinas La regulacin de la transcripcin de los genes de Igs, es uno de los modelos mejor estudiados para entender la transcripcin de genes que se expresan de manera tejido-especfica y dependientes del estado de desarrollo. El mapeo de los genes de Igs, revela que cada uno contiene mltiples elementos regulatorios, promotores y estimuladores ("enhancers"), que son especialmente activos en linfocitos B.

Los promotores se ubican inmediatamente hacia el extremo 5' del segmento V que se va a transcribir. Su funcin consiste en garantizar transcripciones exactas y especficas, determinando dnde inicia la transcripcin la ARN-polimerasa II. La organizacin bsica de todos los promotores de inmunoglobulinas presenta dos secuencias ricas en adenina (A) y timina (T). Una de ellas est restringida slo a tejido linfoide y tiene un elemento temtico (motif) de 8 nucletidos, ATTTGCAT o la secuencia inversa. La otra secuencia, no es restringida ya que tambin se encuentra en otros linajes celulares, es la denominada TATA box. Mutaciones de estas secuencias reducen drsticamente la transcripcin de los genes de Igs. Los "enhancers" son secuencias de DNA cuya funcin principal es aumentar la tasa de transcripcin de los genes recombinados. A diferencia de los promotores, pueden actuar cuando estn ubicados a distancia, ya sea ro arriba (hacia el extremo 5') o ro abajo (hacia el extremo 3'). Se han identificado en ratones y seres humanos, para locus de cadenas pesadas y livianas, demostrndose que algunos han sido muy conservados durante la evolucin; es el caso de los denominados ENHI H, y ENH3H y ENHi k. Por ejemplo en el ratn, se cree que una consecuencia de la recombinacin VDJ es acercar al promotor ubicado hacia 5' de un gen V al "enhancer" localizado hacia 3 de los segmentos JH, permitiendo un inicio ms eficiente de la transcripcin. Se han identificado factores nucleares que son activados por estmulos externos, y que se unen a "enhancer" de cadenas pesadas y livianas. Es el caso del factor llamado NF-B; reconoce un motif de 10 pares de bases llamado B que es crucial en la actividad de ENHi , puesto que mutaciones de B la eliminan. Las interacciones de estos factores proteicos entre s, y con secuencias de DNA reguladoras, son crticos en la estimulacin de la transcripcin de genes especficos de inmunoglobulina en linfocitos B. 7.5. Estimacin numrica de la diversidad de anticuerpos Diversos mecanismos genticos contribuyen a la diversidad de los anticuerpos: (i) mltiples genes V en la lnea germinal, (ii) recombinacin de los genes VJ en las cadenas livianas y VDJ en las cadenas pesadas, (iii) imprecisin en la recombinacin, (iv) diversidad de regin N, (v)

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mutacin somtica, y (vi) combinacin de las cadenas H y L. El aporte estimado de los mecanismos ms clsicos a la generacin de la diversidad de los anticuerpos en el ratn, se resume en la tabla 6-3. La formacin de un gen activo en la regin variable de la cadena pesada puede generar un nmero muy grande de posibilidades genticas. En el hombre hay 80 genes V en la lnea germinal y 6 genes J activos. Si se estima que los genes D se componen de 50 miembros, la recombinacin somtica VDJ puede generar, aproximadamente, unas 24.000 combinaciones genticas diferentes (80x6x50). Si este nmero se multiplica por un factor de 100 debido a la flexibilidad recombinatoria, se obtiene un total de 2.400.000 cadenas diferentes. En las cadenas livianas de tipo kappa, la unin de uno de los cientos de genes para regin variables (ms de 150) a uno de los cinco genes J, puede producir hasta 750 genes V activos diferentes (150x5). Por el mecanismo de flexibilidad combinatoria, el nmero potencial de recombinaciones VJ puede aumentar unas 10 veces la diversidad, llegando a ser de 7.500 cadenas L diferentes (150x5x10). Si se considera la potencialidad para generar diversidad que poseen las cadenas H y L, resulta un total posible de 18.000 millones de anticuerpos (2.400.000 posibles cadenas H x 7.500 posibles cadenas L), generados a partir de slo aproximadamente 300 segmentos gnicos

distintos, localizados en la lnea germinal. Los linfocitos B perifricos no expresan simultneamente todo el repertorio. Las clulas B maduras localizadas principalmente en los folculos linfoides primarios y secundarios, presentan una vida media de slo algunas semanas, si no unen antgeno, mueren. Diariamente, la mdula sea libera a circulacin ms de 5 x 107 linfocitos B, de tal forma que se va renovando el pool de especificidades.

8. Edicin del receptor linfocitario La naturaleza aleatoria del reordenamiento gnico, acoplada a la mayor complejidad proporcionada por la combinacin de distintas cadenas pesadas y livianas, crea una enorme diversidad en el repertorio de anticuerpos que, aunque permite el reconocimiento de agentes infecciosos puede eventualmente contener receptores autorreactivos. Para evitar una eventual respuesta autoinmune el sistema inmune debe poner en marcha mecanismos que le permitan inducir tolerancia a antgenos propios: (i) la eliminacin por apoptosis de las clulas autorreactivas (delecin clonal), (ii) la inhibicin de su actividad (anergia clonal), y (iii) la edicin o modificacin antgeno-dependiente del receptor linfocitario BCR, mediante un reordenamiento secundario de segmentos gnicos, particularmente aqullos que codifican cadenas livianas. Aparentemente el fenmeno de edicin del re-

Tabla 6-3. Estimacin de la diversidad de anticuerpos en ratn, considerando algunos de los mecanismos genticos involucrados Mecanismo Genes de la lnea germinal Segmentos V Segmentos J Segmentos D Recombinacin somtica VxJxD Asociacin de cadenas H L H x kappa H x lambda Potencial total de diversidad del repertorio 1 - 4 x 107 5 - 10 x 104 109 - 1011 10.000 - 40.000 1000 6 250 - 1000 4 12 250 4 _ 2 3 _ Cadenas H Cadenas L Cadenas L

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ceptor linfocitario B, no slo puede ocurrir a nivel central en el rgano linfoide primario, sino tambin en los rganos linfoides secundarios e implica la reexpresin de las protenas RAG-1 y RAG-2. 9. Biosntesis y ensamblaje de las inmunoglobulinas Al igual que la mayora de las protenas de secrecin y de membrana, las cadenas pesadas y livianas de las inmunoglobulinas son sintetizadas en ribosomas unidos a la membrana del retculo endoplsmico rugoso (RER), donde los pptidos lderes son escindidos cotranslacionalmente. La asociacin covalente va puentes disulfuro de cadenas H y L tambin se produce en el RER, donde adems se agregan a los residuos de asparragina oligosacridos ricos en manosa. Luego las Igs nacientes se dirigen a las cisternas del aparato de Golgi, donde los carbohidratos ricos en manosa se convierten en sus formas maduras (tipo O-unido y tipo N-unido ) incorporando cadenas laterales de azcares. Finalmente, las molculas de inmunoglobulinas son transportadas a la membrana plasmtica ancladas en vesculas y son secretadas por un fenmeno de pinocitosis inversa (figura 6-16). Otros pptidos que se unen a la estructura bsica de las inmunoglobulinas son regulados coordinadamente, como en el caso de las cadenas J (IgA e IgM).

LECTURAS SUGERIDAS Abbas, A.K.; Lichtman, A.H.; Pober, J.S., Cellular and Molecular Immunology, Fourth Edition, W.B. Sanders Company, USA, Captulos 3, 9 y 14, 2000. Bishop, G.A., Hostager, B.S., B lymphocyte activation by contact-mediated interactions with T lymphocytes. Curr. Opin. Immunol. 13: 278-285, 2001. Davies, D.R., Matzger, H., Structural basis of antibody function, Ann. Rev. Immunol., 1: 87 117, 1983. Durandy, A., Honjo, T., Human genetic-defects in class-swith recombinatio (hyper-IgM sndromes), Curr. Opin. Immunol. 13: 543-548, 2001. Fagarasan, S., Honjo, T., T-independent Immune Response: New Aspects of B Cell Biology, Science 290: 89-92, 2000. Fearon, D.T., Carroll, M.C., Regulation of B Lymphocytes Response to Foreign and Self-antigens by the CD19/CD21 Complex, Annu. Rev. Immunol. 18: 393-422, 2001. Fugmann, S.D.; Lee, A.I.; Shickett, P.E.; Villey, I.J.; Schatz, D.G., The RAG Proteins and V(D)J Recombination: Complexes, Ends and Transposition, Annu. Rev. Immunol. 18: 495-527, 2000. Grawunder, U., Harfst, E., How to make ends meet in V(D)J recombination, Curr. Opin. Immunol., 13: 186-194, 2001. Hayakawa, K., Ard, R.R., Development and function of B-1 cells, Curr. Opin. Immunol. 12: 346-353, 2000. Jacobs, H., Bross, L., Towards an understanding of somatic hypermutation, Curr. Opin. Immunol. 13: 208-218, 2001.

Figura 6-16. Biosntesis y ensamblaje de las inmunoglobulinas. Las cadenas H y L de las inmunoglobulinas son sintetizadas y ensambladas va puentes disulfuro en el RER, donde adems se agregan oligosacridos ricos en manosa, que posteriormente maduran en el aparato de Golgi incorporando otros azcares. Las inmunoglobulinas son transportadas a la membrana plasmtica ancladas a la membrana de vesculas y secretadas por pinocitosis inversa.

Kurosaki, T., Functional dissection of BCR signalling pathways, Curr. Opin. Immunol. 12. 276281, 2000.

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Lefranc, M.P., Locus Map and Genomic Repertoire of Human Ig Genes, Immunologist 8: 8087, 2000. Martn, F., Kearney, J.F., B1 cells: similarities and differences with other B cell subsets, Curr. Opin. Immunol. 13: 195-201, 2001. Matsuuchi, L., Gold., M.R., New views of BCR structure and organization, Curr. Opin. Immunol. 13: 270-277, 2001. Moshous, P. et al., Artemis, a Novel DNA Double-Strand-Break Repair/V(D)J Recombination Protein, Is Mutated in Human Severe Combined Immune Deficiency, Cell 105: 177-186, 2001. Mostov, K.E., Transepithelial transport of immunoglobulins, Ann. Rev. Immunol. 12: 63-84, 1994. Paul, W., Fundamental Immunology, Fourth Edition, Raven Press, USA, Captulos 3, 4, 5, 6 y 7, 1999. Roos, A., et al., Human IgA activates the Complement System Via the Mannan-Binding Lectin Pathway, J. Immunol. 167: 2861-2868, 2001. Schamel, W.W.A., Reth, M., Monomeric and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor, Immun. 13: 5-14, 2000. Van Parijs, L., Abbas, A.K., Homeostasis and Self-Tolerance in the Immune System: Turning Lymphocytes Off, Science 280: 243-248, 1998. Wagner S.D., Neuberger M.S., Somatic hypermutation of immunoglobulin genes, Ann. Rev. Immunol. 14: 441 - 457, 1996.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 7
RECEPTOR DE LINFOCITOS T Y SEALES ACCESORIAS DE COESTIMULACIN
Ulises Vergara C. e Ivn Palomo G.

1. Introduccin 2. Estructura del receptor T 2.1. TCR 2.2. TCR 3. Estructura y funcin del complejo CD3 4. Receptor T y reconocimiento antignico. 4.1. Linfocitos TCD4, linfocitos TCD8 y restriccin MHC 4.2. Clulas TNK (Linfocitos TNK1.1 o NKT).

5. Gentica molecular del receptor T 5.1. Genes de cadenas TCR, TCR, TCR y TCR 5.1.1. Genes de cadenas TCR 5.1.2. Genes de cadenas TCR 5.1.3. Genes de cadenas TCR 5.1.4. Genes de cadenas TCR 5.2. Reordenamiento gnico 6. Linfocitos T y seales accesorias de coestimulacin 7. Homeostasis linfocitaria y desarrollo post-tmico de linfocitos T

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RESUMEN As como los linfocitos B reconocen el antgeno a travs de receptores BCR, los linfocitos T lo hacen a travs de receptores TCR. stos son heterodmeros o que reconocen pptidos antignicos unidos a molculas MHC (de clase I o II) o antgenos glicolipdicos unidos a molculas CD1. Los receptores T se expresan asociados al complejo CD3, que entre otras funciones, participa en la transduccin de seales de activacin de la clula, una vez que el TCR ha reconocido el antgeno. El captulo se refiere adems al fenmeno de restriccin MHC. Por otra parte, se describe la subpoblacin de linfocitos T, denominada clulas TNK, las cuales pueden ser CD4+, CD8+, o CD4- y CD8-, y presentan marcadores de clulas NK. En humanos los segmentos gnicos que codifican para las cadenas TCR y TCR se encuentran en el cromosoma 14 y los de las cadenas TCR y TCR en el cromosoma 7. El captulo revisa en detalle los mecanismos de variabilidad gentica del TCR, los que son similares a los descritos para BCR. La diversidad del repertorio linfocitario T se ha estimado ms elevada (1018) que la del repertorio linfocitario B (1014). Los segmentos gnicos que codifican para las cadenas TCR se reordenan primero que los segmentos gnicos para cadenas TCR; en las clulas B se reordenan primero los segmentos gnicos de cadenas pesadas y luego aquellos de las cadenas livianas. Al igual que en el reordenamiento gnico de las inmunoglobulinas, en el reordenamiento de segmentos gnicos de cadenas del TCR tambin existen los fenmenos de exclusin allica y exclusin isotpica (T versus T). Las clulas T, adems del TCR y de las molculas CD4 o CD8, expresan otros receptores de membrana que resultan importantes en la transduccin de seales accesorias de coestimulacin,, en la estabilidad de la interaccin linfocito T-clula presentadora de antgeno, o en el reclutamiento, recirculacin y homing linfocitario. Entre estos receptores se encuentran: CD28, CD40L, CD2, LFA-1 y CD45.

1. INTRODUCCIN El desarrollo de una respuesta inmune humoral mediada por anticuerpos, se asocia primariamente a los linfocitos B y requiere el reconocimiento antignico por el receptor (BCR) de linfocitos B especficos. El desarrollo de una respuesta inmune celular en cambio, se asocia a linfocitos T y requiere el reconocimiento antignico por el receptor (TCR ,"T cell receptor") de linfocitos T especficos. Los mecanismos efectores humoral y celular de respuesta inmune resultan entonces de la seleccin, activacin y expansin clonal de dos poblaciones linfocitarias distintas, que utilizan mecanismos y receptores distintos de reconocimiento antignico. As, mientras el repertorio linfocitario B puede reconocer directamente antgenos solubles o de membrana de muy diversa naturaleza qumica (protenas, carbohidratos,

lpidos, cidos nucleicos, haptenos), el repertorio de receptores linfocitarios T reconoce fundamentalmente protenas antignicas en forma de fragmentos peptdicos unidos a molculas de presentacin MHC ("Major Histocompatibility Complex") o antgenos glicolipdicos unidos a molculas de presentacin CD1, expresadas en la membrana de clulas presentadoras de antgeno (ver captulo 9). En el repertorio linfocitario B (estimado en 1014 linfocitos B distintos) se distinguen al menos dos subpoblaciones celulares, denominadas B1 y B2, que presentan caractersticas estructurales y funcionales distintas y se generan a diferentes edades durante la ontogenia linfocitaria. La subpoblacin B1 se desarrolla durante la vida fetal/neonatal, presenta receptores polirreactivos de baja afinidad, se asocia a la produccin de anticuerpos naturales T-independientes y se encuentra mayoritariamente en las cavidades

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peritoneal y pleural. La subpoblacin linfocitaria B2 que se genera a partir de clulas progenitoras de la mdula sea adulta, constituye la mayor parte del repertorio linfocitario B, su activacin es linfocito T-dependiente y se encuentra, fundamentalmente, en los rganos linfoides secundarios y en el torrente sanguneo. En el repertorio linfocitario T (estimado en 1018 linfocitos T distintos) se distinguen tambin dos subpoblaciones celulares, denominadas linfocitos T y linfocitos T, que presentan TCR con caractersticas estructural y funcionalmente distintas. Entre los linfocitos T se distinguen adems 3 subpoblaciones celulares distintas denominadas linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+ y linfocitos TNK. Los linfocitos TNK (denominados tambin clulas NKT: "natural killer T cells"), corresponden a una subpoblacin linfocitaria T, que presenta marcadores o receptores propios de clulas NK (natural killer).

2. ESTRUCTURA DEL RECEPTOR T En el receptor de un linfocito B se distinguen dos subunidades, estructural y funcionalmente distintas: el receptor clonotpico representado por una inmunoglobulina de membrana (responsable del reconocimiento antignico) y el complejo accesorio Ig/Ig, responsable del transporte y expresin del BCR en la membrana y de la transduccin de seales de activacin cuando el receptor clonotpico une especficamente un antgeno. De manera similar, en el receptor de un linfocito T se describen tambin dos subunidades estructural y funcionalmente distintas: el receptor clonotpico T o T (responsable del reconocimiento especfico del antgeno) y el complejo accesorio CD3, responsable del transporte y expresin del TCR en la membrana y de la transduccin de seales de activacin cuando el receptor clonotpico T une especficamente su antgeno. El receptor clonotpico TCR es un heterodmero o formado por dos cadenas glicoproteicas de 40 a 60 kDa, covalentemente unidas entre s por puentes disulfuro. Como ocurre en los linfocitos B, este receptor tiene una distribucin clonal, indicando que clones linfocitarios con distinta especificidad antignica expresarn distintos TCR. De la misma manera, la regin variable de los componentes clonotpicos del receptor TCR presenta, como en las inmunoglobulinas, tres regiones CDR que en el caso de los linfocitos T,

reconocern un complejo formado por un fragmento peptdico alojado en el bolsillo de presentacin de una molcula MHC, o un antgeno glicolipdico unido a una molcula CD1. La mayora de los linfocitos T no reconocen el antgeno en la forma de un complejo MHC-pptido, aunque molculas MHC-Ib no clsicas (como CD1, H-2M3 y Q de ratn) pueden presentar ciertos antgenos a esta subpoblacin de LT. Adems algunos linfocitos T pueden reconocer directamente al antgeno, de la misma manera como hacen los linfocitos B. Linfocitos T y T recombinan su DNA y expresan su receptor clonotpico, en momentos distintos durante la ontogenia linfocitaria tmica. As, linfocitos T emergen tempranamente desde el timo y expresan un receptor denominado TCR1 que se genera antes que el receptor TCR2, cuya expresin est limitada a los linfocitos T, que maduran ms tardamente en el rgano linfoide primario. Aunque el timo es el principal sitio anatmico de desarrollo linfocitario T, se ha descrito en el intestino la existencia de una lnea celular T distinta, generada extratmicamente a partir de precursores celulares presentes en la lmina propia intestinal. 2.1. TCR El 90 a 95% de los clones presentes en el repertorio linfocitario expresan copias mltiples de un receptor T, constituido por las glicoprotenas y covalentemente unidas entre s por enlaces disulfuro (figura 7-1) y no covalentemente unidas al complejo accesorio CD3 (figura 7-2) (ver punto 3). La cadena es una glicoprotena acdica de 40-50 kDa y la cadena es una glicoprotena bsica o neutra de 40-45 kDa. Ambas cadenas tienen similitud estructural con las cadenas pesadas y livianas de las inmunoglobulinas, presentando una regin o dominio variable aminoterminal de 102119 aminocidos (V y V) y un dominio constante carboxiterminal de 138 a 170 aminocidos (C y C, respectivamente). Tal como ocurre con los linfocitos B, la diversidad y especificidad del TCR estn dadas fundamentalmente por las regiones hipervariables o determinantes de complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 de los dominios V y V, que se asocian y configuran de manera tal que se forma un nico paratopo T, que presenta por el antgeno una afinidad entre 10-5 y 10-7 M, en los distintos clones linfocitarios T. En la regin constante carboxiterminal de las cadenas T y T (o T y T), se distinguen 4 domi-

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Figura 7-1. Estructura esquemtica del receptor linfocitario T. El receptor TCR est formado por dos cadenas polipeptdicas covalentemente unidas entre s por puentes disulfuro. Los receptores TCR2 presentan cadenas y, los TCR1 cadenas y . En cada una de las cadenas y (o /), existe un dominio variable aminoterminal y un dominio constante carboxiterminal, de manera similar a lo que ocurre en las cadenas pesadas y livianas del receptor linfocitario B (BCR).

nios estructural y funcionalmente distintos: a) un dominio constante extracelular hacia el extremo aminoterminal y que forma un loop semejante a los dominios constantes de inmunoglobulinas; b)

una regin bisagra inmediatamente por fuera de la membrana plasmtica linfocitaria y que contiene el enlace disulfuro que une el heterodmero del receptor clonotpico T; c) un dominio hidrofbico transmembrana de 20 a 25 aminocidos y que incluye residuos polares conservados como arginina y lisina, que permiten la unin no covalente con residuos de cido glutmico y cido asprtico negativamente cargados del complejo accesorio CD3; d) un dominio citoplasmtico carboxiterminal, de 5 a 12 aminocidos. 2.2. TCR Entre los linfocitos T pueden distinguirse diferentes subpoblaciones celulares que se desarrollan en momentos distintos de la ontogenia linfocitaria; expresan distintos dominios variables y tienen distinta distribucin tisular perifrica. En ratones por ejemplo, los linfocitos T que se encuentran en la piel, se desarrollan neonatalmente y expresan regiones variables distintas de los linfocitos T que se encuentran en vagina, tero y lengua, que se diferencian ms tardamente en el timo.

Figura 7.2. Complejo CD3. El complejo CD3 est constituido por cinco protenas transmembrana denominadas , , , y (o ). El complejo CD3 est funcionalmente asociado con la expresin del TCR en la membrana y con la transduccin de seales de activacin, luego del reconocimiento antignico.

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Los linfocitos T constituyen entre 5 a 10% del repertorio linfocitario T en sangre perifrica, bazo y ganglios linfticos de humanos, ratones y aves; pero pueden representar hasta el 50% de los linfocitos intraepiteliales en piel y mucosas intestinal y gnitourinaria murina. En ovejas, los linfocitos T pueden representar hasta el 30% de los linfocitos T perifricos. Las cadenas (45-55 kDa) y (40-50 kDa) de receptor clonotpico T, son glicoprotenas de membrana con estructura similar a las cadenas y del receptor T. Ambas presentan un dominio variable aminoterminal y un dominio constante carboxiterminal que incluye una regin bisagra, un dominio transmembrana, y una corta cola citoplasmtica. Las distintas regiones y presentan caractersticas similares a las descritas para las cadenas polipptdicas del receptor T (figura 7-1).

tintos, dos de los cuales corresponden a los heterodmeros y . En aproximadamente el 90% de los linfocitos T, el tercer dmero corresponde al homodmero y slo el 10 % de los linfocitos T perifricos expresan el heterodmero . Los dominios transmembrana de cada una de las protenas del complejo CD3 contienen residuos aminoacdicos negativamente cargados, que se asocian no covalentemente con residuos transmembra positivamente cargados de los receptores clonotpicos T o T.

4. RECEPTOR T Y RECONOCIMIENTO ANTIGNICO Los linfocitos T MHC-restringidos, expresan receptores clonotpicos que slo reconocen fragmentos peptdicos presentados por molculas MHC de clase I o de clase II, en la superficie de las clulas presentadoras profesionales y otras clulas (figura 7-4). Los linfocitos T CD1-restringidos, expresan en cambio receptores clonotpicos que slo reconocen antgenos glicolipdicos, asociados a molculas de presentacin CD1, expresadas en la membrana de clulas presentadoras profesionales (clulas dendrticas, macrfagos y linfocitos B). Linfocitos T cittoxicos T reconocen antgenos MHC clase I-restringidos y son primariamente responsables de la eliminacin de clulas infectadas con virus o bacterias intracelulares. Para la mayora de las clulas, los antgenos MHC clase I-restringidos, derivan de protenas sintetizadas en el citoplasma de la misma clula, exis-

3. ESTRUCTURA Y FUNCIN DEL COMPLEJO CD3 Los receptores clonotpicos T y T se expresan asociados de manera no covalente, al complejo accesorio CD3, que representa la subunidad responsable del transporte y expresin del TCR en la membrana y de la transduccin de seales de activacin, luego del reconocimiento antignico por el receptor clonotpico T. El complejo CD3 est constituido por cinco protenas denominadas , , , y de 25, 20, 20, 16 y 22 kDa, respectivamente (figuras 7-3 y 7-4). Las protenas del complejo CD3 se asocian entre s de manera tal que se forman tres dmeros dis-

Figura 7-3. Relacin estructural TCR-CD3. La asociacin entre TCR y del CD3 es no covalente. Se produce una interaccin electrosttica entre aminocidos transmembrana con carga positiva del TCR, con aminocidos negativamente cargados del complejo CD3. Existen enlaces disulfuro entre las cadenas (o ) del receptor T, y entre los homo o heterodmeros formados por las cadenas y .

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Figura 7-4. TCR y reconocimiento antignico MHC-clase II-restringido. El receptor linfocitario T, reconoce el complejo molecular MHC-fragmento peptdico. La molcula CD4 acta como co-receptor reconociendo una regin conservada, en cadena de la molcula MHC de clase II.

tiendo un acceso limitado de antgenos exgenos a esta va endgena de procesamiento y presentacin antignica. Sin embargo, existe una subpoblacin de clulas presentadoras (particularmente clulas dendrticas) que pueden capturar antgenos exgenos tejido especficos en la periferia y presentarlos, asociados a molculas MHC de clase I, a linfocitos T citotxicos en los ganglios linfticos, mediante un mecanismo de presentacin cruzada (cross-priming). Adems, en infecciones con Mycobacterium tuberculosis, se activan tambin linfocitos citotxicos T CD1restringidos que reconocen glicolpidos bacterianos y linfocitos citotxicos T que reconocen ligandos fosforilados. Las clulas dendrticas son clulas de origen medular que estn normalmente presentes en un estado inmaduro en epitelios y tejidos perifricos. Estas clulas dendrticas son capaces de una efectiva fagocitosis de clulas apoptticas y de endocitosis y macropinocitosis de antgenos solubles, pero no expresan molculas MHC y ligandos coestimuladores, en los niveles requeridos para la activacin de linfocitos T. Esta forma de incorporacin antignica por clulas inmaduras, resulta en un mayor y mejor cross-priming de antgenos exgenos en el contexto de molculas MHC de clase I por clulas dendrticas maduras, lo que re-

Figura 7-5. Migracin de clulas dendrticas y linfocitos T. Clulas dendrticas inmaduras capturan antgenos en los tejidos perifricos y migran a los tejidos linfoides convirtindose en clulas maduras que expresan altos niveles de molculas MHC y ligandos coestimuladores para los linfocitos T. Los linfocitos se movilizan desde el torrente sanguneo a los rganos linfoides secundarios y luego de su activacin y expansin clonal se diferencian en linfocitos T efectores y linfocitos T de memoria central ( TMC) y linfocitos de memoria efectores (TEM).

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sulta fundamental, tanto para el desarrollo de una respuesta inmune dependiente de linfocitos T citotxicos, como para la induccin de tolerancia a lo propio. En respuesta a un estmulo inflamatorio (generalmente proporcionado por citoquinas proinflamatorias o productos bacterianos), las clulas dendrticas inmaduras capturan material antignico en la periferia (microorganismos, clulas apoptticas y detritus celulares) e inician su diferenciacin en clulas maduras que pierden sus receptores para quimioquinas inflamatorias y aumentan la expresin de receptores para quimioquinas de tejidos linfoides. Las clulas dendrticas en maduracin se movilizan hacia los rganos linfoides secundarios donde culminan su diferenciacin expresando altos niveles de molculas MHC y ligandos coestimuladores que las convierten en clulas maduras extraordinariamente eficientes en la presentacin de antgenos a linfocitos T vrgenes (figura 7-5). Mediante la secrecin de distintos patrones de citoquinas, las clulas dendrticas maduras inducen y regulan la respuesta inmune promoviendo la activacin y diferenciacin de linfocitos T, la expansin clonal de linfocitos B, la produccin de anticuerpos y la estimulacin de la actividad citotxica de clulas NK y la produccin de IFN-. Los linfocitos T vrgenes se movilizan desde el torrente circulatorio a las regiones T de los rganos linfoides secundarios, en busca de antgenos presentados por clulas dendrticas. Como consecuencia de su estimulacin, los linfocitos T proliferan por expansin clonal y se diferencian en clulas efectoras que expresan receptores que les permiten luego migrar a las reas de linfocitos B del rgano linfoide secundario o hacia los sitios de inflamacin en los tejidos perifricos. An cuando la mayora de los linfocitos T efectores son de corta vida media, unos pocos sobreviven durante varios aos como linfocitos T de memoria que pueden separarse en dos subpoblaciones de acuerdo a sus habilidades migratorias: (i) las llamadas clulas efectoras de memoria (TEM), migran a los tejidos perifricos y (ii) las denominadas clulas T de memoria central (TCM), permanecen en circulacin. Esta ltima subpoblacin expresa receptores de homing similares a los de linfocitos T vrgenes que les permite migrar preferentemente a los rganos linfoides secundarios donde, luego de una reestimulacin con el antgeno, inducirn el desarrollo de una respuesta inmune secundaria y la

generacin de nuevos linfocitos T de memoria. Se ha sugerido que la expresin de CCR7, un receptor para las quimioquinas MIP ("Macrophage Inflammatory Protein") y SLC ("Secondary Lymphoid Chemokine") controla el "homing" a rganos linfoides secundarios y permite separar los linfocitos de memoria T efectores (CCR7-) que tienen funcin efectora inmediata y representan la primera lnea de defensa inmune especfica, de los linfocitos de memoria centrales CCR7+ que carecen de funcin efectora inmediata pero patrullan los rganos perifricos y constituyen la lnea defensiva de reserva. Los linfocitos T efectores CCR7- producen citoquinas efectoras como IFN-, IL-4, IL-5 o expresan perforina (linfocitos T citotxicos). 4.1. Linfocitos T CD4, Linfocitos T CD8 y restriccin MHC Linfocitos T parecen reconocer slo fragmentos peptdicos presentados en asociacin con molculas MHC o fragmentos glicolipdicos presentados en asociacin con molculas CD1, en la superficie de clulas presentadoras profesionales. Este fenmeno se explica como resultado del proceso de educacin tmica que permite que durante la diferenciacin en este rgano linfoide primario, precursores linfocitarios T sean positivamente seleccionados en funcin de su capacidad para reconocer antgenos asociados a molculas de presentacin antignica en la membrana de clulas del epitelio tmico. La mayora de los linfocitos perifricos T, son linfocitos MHC restringidos que expresan el correceptor CD4 o el correceptor CD8, y han sido positivamente seleccionados en funcin de su capacidad para reconocer slo fragmentos peptdicos asociados a molculas MHC de clase I (linfocitos T CD8+) o fragmentos peptdicos asociados a molculas MHC de clase II (linfocitos T CD4+) (figura 7-6). El correceptor CD4 es una glicoprotena transmembrana de 55 kDa que se expresa en aproximadamente el 65% de los linfocitos perifricos T; reconoce una regin conservada (2) de la molcula MHC de clase II y transduce seales accesorias de coestimulacin linfocitaria T. El correceptor CD8 es un heterodmero o un heterodmero , de 78 kDa, que se expresa en aproximadamente el 35% de los linfocitos T de sangre y tejido linfoide perifrico, reconoce una regin conservada (3) de la molcula MHC de

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Figura 7-6. Estructura del receptor de la clula T, complejo CD3 e interaccin con el complejo MHC-pptido.

clase I y transduce seales accesorias de coestimulacin linfocitaria T, luego de su interaccin con la molcula MHC de clase I. Los linfocitos T CD4+ expresan funciones de colaboracin o helper por medio de citoquinas que activan macrfagos y/o linfocitos B, mientras los linfocitos T CD8+ actan primariamente como clulas citotxicas que destruyen las clulas infectadas. Los linfocitos T CD4+ MHC de clase II-restringidos desempean un rol muy importante en la inmunidad protectora contra bacterias y protozoos, mientras los linfocitos T CD8+ MHC de clase I-restringidos resultan fundamentales en la respuesta inmune contra infecciones virales. Sin embargo, la respuesta inmune contra bacterias intracelulares involucra la participacin no slo de linfocitos T CD4+ MHC-II restringidos, sino tambin de diversas subpoblaciones linfocitarias entre las que se encuentran clulas T CD8+ MHC-I restringidos, linfocitos T que reconocen fosfoligandos en ausencia de clulas presentadoras de antgeno y finalmente, linfocitos

T restringidos por molculas MHC de clase Ib y linfocitos T y T restringidos por molculas CD1 que reconocen ligandos bacterianos altamente conservados. Durante mucho tiempo se pens que los linfocitos T slo reconocan fragmentos peptdicos presentados por molculas MHC de clase I o de clase II. Sin embargo, el descubrimiento de las molculas CD1 que presentan ligandos glicolipdicos, ha permitido la identificacin de subpoblaciones linfocitarias T CD1-restringidas: TCD4+, TCD8+, TCD4-, CD8- (TDN o doble negativos) y de linfocitos T NK1.1 (clulas TNK o NKT), que constituyen poblaciones celulares heterogneas presentes en diferentes tejidos. Las molculas CD1 se expresan predominantemente en clulas presentadoras profesionales e incluyen 4 molculas distintas en humanos (CD1a, CD1b, CD1c y CD1d) y slo una en ratones (CD1d). Las molculas son similares a las molculas MHC de clase I, estn no covalentemente unidas a la 2-microglobulina, pero su bolsillo de presentacin antignica es ms estrecho y ms profundo que el de las molculas MHC y une su ligando glicolipdico mediante interacciones hidrofbicas. Las molculas CD1a, b y c (grupo I) se expresan en timocitos corticales y clulas dendrticas, mientras las molculas CD1d (grupo II) se encuentran principalmente en clulas epiteliales, timocitos corticales, hepatocitos y clulas presentadoras de antgeno profesionales (clulas dendrticas, macrfagos y linfocitos B). Glicolpidos como fosfatidil inositol mansido (PIM), lipoarabino manan (LAM), cido miclico y hexosil-1-fosfo-isoprenoide, son presentados a linfocitos T, por molculas CD1 del grupo I (tabla 7-1). Tanto en humanos como en ratn, se ha descrito que las molculas CD1d presentan -galactosil ceramida existente en esponjas marinas. 4.2. Clulas TNK Las clulas TNK (linfocitos T NK1.1 o NKT) corresponden a una subpoblacin heterognea de linfocitos T, que presentan marcadores propios de las clulas NK o natural killer e incluye clulas TNK CD4+, clulas TNK/CD8+ y clulas TNK DN (CD4- CD8-) que presentan distinta distribucin tisular (timo, hgado, bazo, ganglios linfticos y mdula sea). El marcador NK1.1 corresponde a NKRP1C o CD161.

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Tabla 7-1. Antgenos lipdicos presentados por molculas CD1 humanas Antgeno Glicolpidos bacterianos Lpidos no definidos Lipoarabinomanan (LAM) Glucosa monomicolato Fosfatidil inositol (PI) Hesoxil 1- fosfoisoprenoide Glicolpidos autlogos Lpidos no definidos Ganglisidos cerebrales Lpidos no definidos Lpidos no definidos Otras molculas A-Galactosil Ceramida Linfocitos T Molcula CD1

T T T T T T T T y T TNK

CD1a CD1b CD1b CD1b CD1c CD1a CD1b CD1c CD1d

TNK

CD1d

La diversidad de su receptor T es bastante restringida y limitada a la expresin de unas pocas cadenas TCR (V8-2, V7, V2 y V14J281 en el ratn y de sus equivalentes V11 y V24JQ en humanos), que resultan CD1d restringidas. La proporcin de clulas TNK vara en diferentes tejidos y representan subpoblaciones funcionalmente distintas en el hgado (30-50%), mdula sea (20-30%) y timo (10-20%), y son menos frecuentes en rganos como bazo (3%), ganglios linfticos (0,3%), sangre perifrica (4%) y pulmn (7%). Las clulas TNK CD4+ y TNK DN parecen ser de origen tmico, puesto que no se desarrollan en ratones atmicos o en ratones neonatalmente timectomizados. Las clulas TNK CD8+ en cambio, parecen tener un origen extratmico, puesto que se encuentran normalmente en la periferia en ratones timectomizados neonatalmente. Las clulas TNK constituyen una subpoblacin linfocitaria heterognea en la que es posible encontrar clulas CD1-restringidas y clulas MHC-restringidas (estas ltimas expresan TCR de mayor diversidad), que tienen la capacidad de secretar diferentes citoquinas (IL-4, IFN, TNF), dependiendo del microambiente tisular. La produccin de altos niveles de IL-4 e IFN-, sugieren un rol regulador en el desarrollo de las respuestas Th1 y Th2 dependientes. El desarrollo de una respuesta Th2 sera estimulada a travs de

la secrecin de IL-4. El desarrollo de una respuesta Th1 sera inhibida mediante la secrecin de IL-4, IL-10 y TGF-. Las clulas TNK tambin producen altos niveles de quimioquinas, tales como MIP- y MIP-, lo que concuerda con su capacidad para reclutar monocitos, clulas dendrticas mieloides y linfocitos T convencionales, e iniciar una respuesta inmune adquirida. Finalmente la actividad efectora citotxica de las clulas TNK, es mediada por perforina y granzimas. Se desconoce la influencia de molculas coestimuladoras y otros receptores asociados a las clulas T NK y aunque es claro que el receptor TCR de clulas TNK responde a molculas CD1d, el ligando natural de CD1d es todava desconocido. La mayora de las clulas TNK reconoce molculas CD1d asociadas a un ligando hidrofbico, probablemente glicolipdico y de naturaleza desconocida. Sin embargo, se ha sugerido que podra ser glicofosfatidil inositol (GPI) y/o fosfatidil inosito mansido (PIM). La molcula -galactosil ceramida derivada de esponjas marinas se une a molculas CD1d, estimula linfocitos TNK CD4+ y TNK DN y parece imitar al ligando natural de CD1d en humanos y ratones. Las clulas TNK tienen tambin la habilidad de responder no slo a ligandos especficos derivados de agentes patgenos sino tambin a ligandos lipdicos autlogos derivados de clulas tumorales y parecen desempear un rol impor-

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tante en la regulacin de la respuesta inmune a clulas tumorales y agentes patgenos y en la mantencin de la tolerancia a lo propio.

cadena TCR) y, un segmento gnico C (codifica la regin constante TCR). Familia TCR: incluye segmentos gnicos V, D, J y C. Familia TCR: incluye segmentos gnicos V, J y C. Familia gnica TCR: incluye segmentos V, D, J y C.

5. GENTICA MOLECULAR DEL RECEPTOR T El TCR es generado a partir de la recombinacin somtica de segmentos gnicos, durante un proceso de diferenciacin que permite que cada linfocito T o T est provisto de copias mltiples de un receptor clonotpico nico que no est codificado en el DNA germinal de la clula precursora. La organizacin genmica de los TCR es similar a la organizacin de las inmunoglobulinas y contiene tanto segmentos gnicos V(D)J que codifican la regin variable, como segmentos gnicos C, que codifican la regin constante de cada cadena del receptor clonotpico. De esta manera el repertorio de linfocitos T (estimado en 10 18 linfocitos T distintos), es generado tambin al azar por reordenamiento gnico V(D)J y, la variabilidad TCR, generada por la recombinacin de distintos segmentos gnicos, ser tambin enormemente diversificada por: (i) corte impreciso de los segmentos gnicos que se recombinan, (ii) agregado de nucletidos al azar en los sitios de corte y unin de los distintos segmentos gnicos, (iii) combinacin al azar de cadenas TCR y TCR (o TCR y TCR), y (iv) edicin del receptor T o T. 5.1. Genes de cadenas TCR, TCR, TCR y TCR En el DNA germinal de un vertebrado, no existen genes que codifiquen la sntesis de los componentes polipeptdicos del receptor clonotpico TCR. Al contrario, estos genes deben ser generados o ensamblados, por una recombinasa sitio-especfica que reordena segmentos gnicos V(D)J, distintos de aqullos utilizados para ensamblar los genes que codifican las cadenas pesadas y livianas del receptor de linfocitos B (ver captulo 6). Los segmentos gnicos que codifican las distintas regiones o dominios de las cadenas TCR, TCR, TCR o TCR, se encuentran agrupados en cuatro grupos o familias gnicas distintas: Familia TCR: incluye segmentos gnicos V y J (codifican la regin variable de la

En humanos, los segmentos gnicos que codifican las cadenas TCR y TCR, se encuentran en el cromosoma 14 (en regin alejada del locus para cadenas pesadas de Inmunoglobulinas (Ig), mientras los segmentos gnicos de cadenas TCR y TCR, se encuentran en el cromosoma 7. En ratones, los segmentos gnicos que codifican las cadenas TCR y TCR, se encuentran en el cromosoma 14, mientras los segmentos gnicos que codifica las cadenas TCR y TCR, se encuentran en los cromosomas murinos 6 y 13, respectivamente. 5.1.1. Genes de cadenas TCR El repertorio genmico de cadenas TCR ocupa 1000 kilobases en el brazo largo del cromosoma 14 humano e incluye 54 segmentos gnicos variables V en posicin centromrica, 61 segmentos gnicos de unin J y, un nico segmento constante C, en posicin ms telomrica. Como ocurre en el repertorio genmico de las inmunoglobulinas, cada segmento TCR variable, est precedido de una secuencia lder o seal (L), en posicin 5(figura 7-7). Los segmentos gnicos VJ, situados en posicin 5, se encuentran separados de C, por una regin genmica que contiene los segmentos gnicos de la cadena TCR. El potencial de este repertorio genmico consiste de 41 a 47 segmentos funcionales V (que pertenecen a 35-37 subgrupos o subfamilias) y 50 segmentos funcionales J. Entre los segmentos variables se encuentran adems 5 segmentos designados TCRV/V que pueden reordenarse con J o con D y pueden, por lo tanto, utilizarse en la generacin de genes TCR o TCR. 5.1.2. Genes de cadenas TCR En humanos, el repertorio genmico de cadenas TCR ocupa 620 kb en el brazo largo del

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Figura 7-7. Distribucin de los segmentos gnicos TCR y TCR. En el cromosoma 14 humano y 14 murino, se encuentran el locus que contiene los segmento gnicos V y C asociado a segmentos J y D. Los segmentos V y J, localizados en posicin 5, estn separados de C por el locus TCR.

cromosoma 7 y consiste de 62-65 segmentos gnicos variables V y de segmentos D, J y C que se encuentran separados en dos grupos (clusters) distintos. El primer grupo, situado en posicin 5, contiene un segmento D1, seis segmentos J1 (J11 a J16) y un segmento C1. El segundo grupo, situado en posicin 3 con respecto al primero, incluye un segmento D2, ocho segmentos J2 y un nico segmento C2. Los segmentos V se encuentran en posicin ms telomrica, pero existe un segmento gnico V30, en orientacin invertida con respecto a la transcripcin, localizado en posicin 3, ms centromrico que el segundo "cluster" D2J2C2. El repertorio genmico potencial consiste de 39-46 segmentos V funcionales, que pertenecen a 23 subgrupos o subfamilias. Cada segmento J codifica 3-5 aminocidos, mientras los segmentos, segmentos D, codifican de 15 a 17 residuos aminoacdicos. Cada segmento varia-

ble precedido de un exn lder (L) o seal (figura 7-8). Se han descrito adems, 6 segmentos V hurfanos, localizados en el brazo corto del cromosoma 9 humano. 5.1.3. Genes de cadenas TCR El locus TCR humano ocupa 165 kb en el brazo corto del cromosoma 7 y consiste de 12-15 segmentos gnicos variables V, en posicin ms centromrica y dos "clusters" de segmentos CJ. El primer grupo contiene tres segmentos J1 y un nico segmento C1. El segundo grupo, situado en posicin ms telomrica, contiene dos segmentos J2 y un segmento a C2. El repertorio potencial incluye 4-6 segmentos V que se agrupan en dos subfamilias y los dos "clusters" DJC (figura 7-9).

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Figura 7-8. Distribucin de segmentos gnicos TCR. En los cromosomas 7 humano y 6 murino, se encuentran distribuidos los segmentos V y los dos conjuntos C con sus respectivos segmentos gnicos J y D.

5.1.4. Genes de cadenas TCR En humanos el locus TCR ocupa una regin de 60 kb localizada dentro del locus TCR y contiene un cluster formado por un segmento gnico V (V3), tres segmentos D, cuatro segmentos JD y un nico gen C (figura 7-7). El locus TCR contiene adems un segmento gnico V (V3), localizado hacia abajo en posicin 3 del gen C y, un segmento gnico variable V1, localizado 360 kb hacia arriba en direccin 5, entre los segmentos V. Todos los segmentos gnicos TCR/D son funcionales y a ellos

se agregan, finalmente, los 5 segmentos TCRV/ V (mencionados en 5.1.1.), que pueden comportarse como funcionales o como seudogenes. 5.2. Reordenamiento gnico Al igual como ocurre en las clulas B inmaduras, respecto a las inmunoglobulinas, en las clulas T precursoras los segmentos gnicos V(D)J y C que codifican las cadenas TCR, se encuentran en una configuracin germinal no funcional y deben reordenarse por recombinacin sitio-especfica, para generar la enorme diversidad

Figura 7.9. Familia de segmentos gnicos TCR murino y humano.

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del repertorio linfocitario T, durante un proceso regulado de maduracin y educacin tmica. La recombinacin de segmentos gnicos V(D)J, es fundamental en el desarrollo del sistema inmune de los vertebrados e implica la participacin de una recombinasa que reconoce y corta secuencias especficas de recombinacin (12-RSS y 23-RSS) (figura 7-10) y de una compleja maquinaria de reparacin del DNA que incluye una protena quinasa DNA-dependiente (DNA-PK), las protenas Ku/Ku80 y Artemisa, la DNA ligasa IV (ver captulo 6), y diversas otras protenas como Xrcc, histona H2AX y el complejo Mre11/ rad50/Nbs1. Deben adems existir diversos factores de remodelacin de la cromatina, que limitan el acceso a las secuencias de recombinacin RSS de modo tal que las regiones genmicas que contienen los segmentos V(D)J y C, de Ig o TCR, slo estn disponibles en ciertos tipos celulares y en ciertos estados de desarrollo, segn el microambiente tisular. El orden en el reordenamiento, es similar a como ocurre con las inmunoglobulinas y tambin implica el cumplimiento de la regla 12/23 y la eliminacin o deleccin de todos los segmentos que separan a aqullos que deben recombinarse (ver captulo 6). As, en las cadenas TCR y TCR, primero se reordena un segmento gnico de diversidad D, con un segmento de unin J, eliminando toda la secuencia nucleotdica que los separa. Luego uno de los segmentos variables V, se recombina con el complejo DJ ya reordenado,

eliminando los segmentos gnicos que los separa. Sin embargo, dada la existencia de "clusters" DJC, la seleccin de un determinado segmento D obliga a la recombinacin con los segmentos J y C, incluidos en el mismo "cluster". El DNA ya reordenado, ser luego utilizado como molde para la sntesis de un transcrito primario, el que una vez procesado dar origen al correspondiente mRNA que codifica la cadena TCR (figura 7-11). La maquinaria de recombinacin de segmentos gnicos es siempre la misma, tanto en linfocitos B como linfocitos T. Sin embargo, slo las Ig se reordenan en linfocitos B, y slo cadenas TCR se reordenan en los linfocitos T. Adems en cada una de estas lneas celulares existe un orden preciso de reordenamiento de modo tal que las cadenas pesadas se reordenan siempre antes que las cadenas livianas del BCR y las cadenas TCR se reordenan siempre antes que las cadenas TCR en los linfocitos T. La diversidad potencial de los TCR se estima mayor que en las inmunoglobulinas y ello obedece, fundamentalmente a una mayor diversificacin de las regiones N (generada por agregado de nucletidos al azar) y P (generada por transferencia de nucletidos desde la hebra no codificante del DNA. Adems, a diferencia de lo que ocurre con las inmunoglobulinas, los genes de TCR ya reordenados no sufren hipermutaciones en sus CDRs, que conduzcan a cambios en la funcin o afinidad del receptor, durante la respuesta inmune.

Figura 7-10. Secuencia seal de recombinacin (RSS) y segmentos gnicos V(D)J. (A) Heptmero, espaciador y nonmero de las secuencias RSS. (B) Los diversos reordenamientos de los segmentos gnicos V(D)J que generan los genes que codifican las cadenas TCR, TCR, TCR y TCR. Las secuencias 12-RSS se muestran con tringulos abiertos y las secuencias 23-RSS con tringulos cerrados.

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Figura 7-11. Reordenamiento gnico y transcripcin de la cadena TCR. El proceso se inicia con el reordenamiento de un segmento gnico D y un segmento J. Luego, el complejo D-J ya reordenado, se recombina con un segmento V. Posteriormente, el transcrito primario ser procesado para generar el mRNA que codifica la cadena TCR.

Finalmente, slo uno de los dos loci de cada una de las cadenas TCR, TCR, TCR o TCRD que existen en el DNA germinal, ser funcionalmente reordenado y expresado en un linfocito T maduro. De esta manera, al igual que en los genes de inmunoglobulinas, el fenmeno de exclusin allica impide que se reordenen ambos alelos de un mismo gen. As por ejemplo, slo cuando del reordenamiento de segmentos gnicos en uno de los cromosomas homlogos, se obtiene un gen TCR no funcional (que no puede ser transcrito o el transcrito no puede ser traducido) se inicia el reordenamiento de segmentos en el otro cromosoma homlogo. Si de ambos alelos se obtienen genes no funcionales, se induce apoptosis de la clula T en diferenciacin. El fenmeno de exclusin isotpica que ocurre entre las cadenas livianas y de las

inmunoglobulinas, es tambin vlido para los genes TCR, puesto que un reordenamiento TCR excluye todo reordenamiento TCR y viceversa.

6. LINFOCITOS T Y SEALES ACCESORIAS DE COESTIMULACIN Los linfocitos T, aparte del receptor TCR y de los correceptores CD4 y/o CD8, expresan otros receptores de membrana que, aunque no reconocen antgenos, resultan fundamentales en la transduccin de seales accesorias de activacin celular (molculas accesorias), en la estabilizacin de la interaccin linfocitoT-clula presentadora de antgeno (CPA), o en el reclutamiento, recirculacin y homing linfocitario (molculas de adhesin) (figura 7-12).

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Figura 7-12. Activacin de linfocitos T y seales accesorias de coestimulacin. Adems del receptor TCR, del complejo CD3 y de los correceptores CD4 o CD8, los linfocitos T expresan otros receptores de membrana (CD2, CD28, LFA-1, CD40L, etc.), que resultan fundamentales en la transduccin de seales accesorias de coestimulacin, en la estabilizacin de la interaccin linfocito T-clula presentadora o en el reclutamiento, recirculacin y homing linfocitario.

En ausencia de seales accesorias de coestimulacin, el reconocimiento antignico y la transduccin de seales a travs del complejo TCR-CD3, no conduce a activacin celular. Al contrario, seales aisladas transducidas por TCRCD3, conducen a anergia celular y/o apoptosis. Las seales adicionales requeridas para la activacin de linfocitos T, son fundamentalmente proporcionadas por molculas coestimuladoras expresadas en la membrana de clulas vecinas o de clulas presentadoras de antgeno y por mediadores solubles como citoquinas. Entre las molculas accesorias expresadas en la superficie de linfocitos T y que unen molculas coestimuladoras, se encuentran: CD8 y CD4, que se unen a molculas MHC de clase I y II, respectivamente, CD28 que une sus ligandos B7.1 (CD80) y B7.2 (CD86), expresados en clulas presentadoras de antgeno (CPA) activadas.

CD40L (CD154), que se expresa en linfocitos T activados y une su ligando CD40 (constitutivo en la CPA). CD2 (LFA-2), que une su ligando LFA-3 (CD58 en humanos) CD48 en ratn. LFA-1 ("Leukocyte Function Associated Antigen-1") que une su ligando ICAM ("Intercellular Adhesin Molecule-1" o CD54). CD45, una tirosn fosfatasa que une su ligando CD22. La isoforma CD45RA se expresa en linfocitos T en reposo y CD45RO en linfocitos T activados.

Adems, molculas como ICOS ("Inducible costimulator", similar a CD28 pero no une CD80 o CD86), citoquinas (IL-1, IL-2 , IL-4, IL-6, IL12, TNF) y diversas molculas de adhesin (integrinas 1 y 2, selectinas), tambin proporcionan seales secundarias o terciarias que facilitan o promueven la activacin y/o diferenciacin

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de distintas subpoblaciones de linfocitos T. Sin embargo, no todas las seales proporcionadas por citoquinas o molculas de superficie, proporcionan estmulos coactivadores. As por ejemplo, IL-10 y TGF- ("transforming growth factor-"), a menudo inhiben diversas poblaciones linfocitarias T, B y NK. De manera similar, la unin a CTLA-4 (CD152, una molcula homloga a CD28 y que se expresa en la superficie de linfocitos T activados), a sus ligandos CD80 o CD86, tambin proporciona seales de inhibicin linfocitaria. El efecto de las seales accesorias de coestimulacon va a depender de diversos factores; entre stos se encuentran: el nmero de complejos MHC-pptido que inician las seales de transduccin, la afinidad, avidez y duracin de esa interaccin y el nivel de molculas coestimuladoras que amplifican las seales iniciales de activacin. Clulas dendrticas y linfocitos B, expresan constitutivamente molculas MHC, CD40, ICAM-1, LFA-3 y son bastante eficientes en la captura y procesamiento de antgeno. Sin embargo, slo una vez activadas (y como consecuencia de la expresin de altos niveles de las molculas coestimuladoras CD80 y CD86 y de molculas de presentacin MHC), se convertirn en potentes clulas estimuladoras de linfocitos T. La maduracin de la clula presentadora de antgeno, aumenta notablemente los niveles de CD80 y CD86, que se coexpresan en microdominios de membrana junto a molculas MHC, lo que favorece la efectividad de las seales transducidas por TCR/ CD3 y CD28. La unin de CD28 a CD80 o CD86 gatilla la activacin de linfocitos T, la expresin de CD40L que potencia la activacin y la sntesis de IL-2 y sus receptores (IL-2R), todo lo cual conduce a la proliferacin y diferenciacin linfocitaria (figura 7-12). En una fase posterior, las molculas CD80 y CD86 las puede modular la diferenciacin Th1/Th2 e inhibir la respuesta celular T, ya sea directamente mediante la unin a su ligando CLA-4 (expresado en la fase final de activacin de los linfocitos) o indirectamente promoviendo la generacin de clulas T reguladoras.

7. HOMEOSTASIS Y DESARROLLO POSTTMICO DE LINFOCITOS T Una de las caractersticas del sistema inmune es que el nmero total y la distribucin de los

distintos clones linfocitarios estn bajo control homeosttico. Por lo tanto, nuevos linfocitos que son continuamente generados en los rganos linfoides primarios y secundarios (linfocitos vrgenes y linfocitos activados/linfocitos memoria, respectivamente) deben competir con los linfocitos residentes en los distintos rganos y tejidos y mantener la diversidad del repertorio linfocitario. Luego del encuentro con el antgeno, los linfocitos T vrgenes se convertirn en clulas T efectoras o en clulas T de memoria, que se distinguirn de los linfocitos vrgenes en funcin del patrn de molculas de adhesin y de receptores para citoquinas que expresan en su membrana. Como la homeostasis de linfocitos vrgenes y de memoria se regula independientemente, nuevos linfocitos T de memoria reemplazarn slo a otros linfocitos T de memoria; de esta manera el nmero de linfocitos vrgenes y de memoria permanecer relativamente constante y equivalente en la periferia. En los ltimos aos se ha establecido que an en ausencia de antgeno, la sobrevida post-tmica de los clones linfocitarios T, es un proceso activo y requiere la interaccin continua de linfocitos vrgenes perifricos con molculas MHC para las cuales los linfocitos fueron positivamente seleccionados en el timo. En ratones por ejemplo, linfocitos T CD8 MHC de clase I (H-2Db)-restringidos sobrevivirn sin proliferar si se transfieren pasivamente a ratones de haplotipo H-2Db, pero no sobrevivirn si se transfieren a ratones de haplotipo H-2Dk que expresan molculas MHC de clase I distintas. Si la transferencia es hacia ratones que expresan bajos niveles de molculas H2Db de clase I, sobrevivir slo una pequea fraccin de los linfocitos T CD8 adoptivamente transferidos y esta fraccin ser proporcional al nivel de expresin de estas molculas MHC de clase I en el individuo receptor. Aunque el antgeno no parece ser un prerrequisito para la sobrevida de los linfocitos de memoria, el tamao de un clon linfocitario antgeno-especfico puede disminuir en ausencia del antgeno, simplemente por mecanismos homeostticos. Se ha sugerido, por lo tanto, que la vida media de los linfocitos memoria est determinada por la frecuencia con que los linfocitos se encuentran con el antgeno y del espacio disponible para su sobrevida en el repertorio linfocitario T. As, la memoria inmunolgica contra un antgeno que se encuentra una nica vez, ser relativamente corta, mientras que el encuentro fre-

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cuente con un antgeno ser suficiente para mantener o aumentar el tamao clonal de los linfocitos T antgeno-especficos, generando una memoria inmunolgica casi indefinida, debido a la generacin continua de nuevas clulas de memoria. El compartimiento linfocitario T puede ser mantenido o reemplazado por nuevas clulas que emergen desde el rgano linfoide primario o bien por repoblamiento a partir de la expansin perifrica de clones linfocitario T maduros, sobre todo cuando la actividad tmica disminuye como consecuencia de la edad.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 8
COMPLEJO PRINCIPAL DE HISTOCOMPATIBILIDAD
Ulises Vergara C., Ivn Palomo G., Claudio Ziga M. y Cristina Navarrete

1. Introduccin 2. Genes y molculas del Complejo Principal de Histocompatibilidad 2.1. Genes del MHC 2.1.1. Genes de clase I 2.1.2. Genes de clase II 2.1.3. Genes de clase III 2.1.4. Otros genes del MHC 2.2. Estructura y funcin de las molculas MHC 2.2.1. E s t r u c t u r a y f u n c i n d e las molculas MHC clase I 2.2.2. E s t r u c t u r a y f u n c i n d e las molculas MHC clase II 3. El concepto de restriccin MHC 4. Otras molculas de presentacin 4.1. Molculas CD1 5. Herencia de los genes HLA 6. Complejo Principal de Histocompatibilidad y enfermedad 7. Nomenclatura y tipificacin HLA

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RESUMEN El Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) es un complejo gnico altamente polimrfico que controla la expresin de molculas que desempean un rol fundamental en las interacciones celulares que inducen y regulan la respuesta inmune a travs del procesamiento y presentacin de antgenos a los linfocitos T. Los genes de clase I del MHC (en el hombre llamado HLA) controlan la expresin de los antgenos de histocompatibilidad clsicos HLA-A,-B,-C y no clsicos HLA-E, -F, G y MIC, y su funcin principal es la de presentar pptidos antignicos a los linfocitos T citotxicos CD8+, linfocitos T y a clulas NK. Los genes de clase II (HLA-DR,-DQ y -DP en el hombre) corresponden a los antiguos genes de respuesta inmune (genes Ir) y codifican la expresin de molculas que presentan pptidos a linfocitos T CD4+ (linfocitos T "helper"). Los genes de clase III codifican la expresin de los factores de complemento C4, Bf y C2. El complejo incluye adems genes que codifican la expresin de molculas importantes en el procesamiento antignico como por ejemplo tapasina, LMP2, LMP7, TAP1, TAP2, DM y DO y molculas involucradas en la respuesta inflamatoria (TNF, TNF, Linfotoxinas, hsp70).

1. INTRODUCCIN La defensa inmunolgica contra diversos agentes infecciosos depende de la habilidad del sistema inmune para reconocer antgenos del agente patgeno y poner en marcha un conjunto de mecanismos que incluyen la activacin del complemento y la activacin, tanto de clulas fagocticas como de distintas clulas inmunocompetentes. El desarrollo de una respuesta inmune efectiva implica entonces una compleja serie de eventos que conducen a activacin celular y la generacin de clulas efectoras que secretan anticuerpos y clulas citotxicas (ver captulo 10), que destruirn al agente infeccioso, o a la clula infectada en el caso de patgenos intracelulares. En general, tanto la respuesta contra antgenos extraos (inmunidad) como la tolerancia a antgenos propios, estn sujetas a un coordinado y complejo mecanismo de regulacin que incluye inmunoglobulinas (ver captulo 6), receptores de clulas T (TCR) (ver captulo 7) receptores de clulas NK (ver captulo 10), citoquinas (ver captulo 11) y molculas codificadas por el denominado Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC, "Major Histocompatibility Complex"). Una falla en estos mecanismos de regulacin de la inmunidad o la tolerancia puede

conducir al desarrollo de inmunodeficiencia (ver captulos 30 y 31) o autoinmunidad (ver captulo 23), respectivamente. El MHC est constituido por un conjunto de genes que controlan la expresin de molculas que desempean un rol fundamental en el procesamiento y presentacin de antgenos a los linfocitos T y en la regulacin de las interacciones celulares que caracterizan la respuesta inmune. Este complejo gnico parece estar presente en todos los vertebrados y en algunos invertebrados, lo que revela un origen temprano en la evolucin de las distintas especies. El MHC es un sistema polignico que contiene muchos genes estructural y funcionalmente relacionados y altamente polimrficos, puesto que en la poblacin existen mltiples alelos para cada gen. Los distintos genes del complejo estn adems estrechamente ligados y tienden a heredarse como una unidad, como un complejo supergnico o haplotipo, entendindose como tal a una combinacin particular de genes en un complejo gnico o en un cromosoma. En la poblacin de individuos de la especie existir tericamente entonces, tantos haplotipos MHC como diferentes combinaciones de alelos de los distintos genes del complejo. El Complejo Principal de Histocompatibili-

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dad fue originalmente descrito por Peter Gorer en el ratn (1936), como un locus de grupos sanguneos que controlaba la expresin de diversos antgenos en los glbulos rojos. Gorer defini, inicialmente, cuatro antgenos eritrocitarios, denominados antgenos I, II, III y IV, y ms tarde demostr que el denominado antgeno II se expresaba tambin en diversos tejidos y jugaba un rol decisivo en la susceptibilidad o resistencia al trasplante de tumores y en la aceptacin o rechazo del trasplante de tejidos entre distintas cepas consanguneas o endogmicas de ratn. Trasplantes entre cepas genticamente idnticas (cepas isognicas o singnicas) son aceptados, mientras los trasplantes entre cepas genticamente distintas (cepas alognicas) que presentan alelos distintos de uno o ms genes son rpida y fuertemente rechazados. Slo en las cepas que rechazaban el trasplante, era posible detectar anticuerpos que reaccionaban con el antgeno-II, proporcionando evidencia acerca de la naturaleza inmunolgica de la resistencia al trasplante de tumores y del rechazo al trasplante de tejidos. Ms tarde, en 1948, George Snell design a los genes y antgenos, responsables de la compatibilidad tisular, como genes y antgenos de histocompatibilidad, respectivamente. As el locus y antgeno-II de grupo sanguneo, se designaron como locus y antgeno de histocompatibilidad-2 (o locus y antgeno H-2, respectivamente). Muy pronto se demostr que el locus H-2 era en realidad un conjunto de genes, estrechamente ligados que controlaban la expresin de diversos antgenos de histocompatibilidad. Como estos antgenos inducan el ms rpido y el ms fuerte rechazo al trasplante de tejidos, el conjunto gnico fue definitivamente designado como Complejo Principal de Histocompatibilidad-2 o Complejo H-2 del ratn. El MHC humano, HLA (Human Leukocyte Antigen), fue descrito en la dcada del 50 por Dausset y van Rood, a partir de anticuerpos leucoaglutinantes encontrados en el suero de pacientes politransfundidos y de madres multparas, que reaccionaban con los leucocitos presentes en los productos sanguneos transfundidos lo que dio el nombre al sistema. Los antgenos de histocompatibilidad fueron durante muchos aos reconocidos como el mayor obstculo al trasplante de tejidos entre distintos individuos de la misma especie. Sin embargo, pareca claro que esta no era la funcin o el

significado biolgico de las molculas codificadas por el Complejo Principal de Histocompatibilidad, puesto que el trasplante de tejidos es un fenmeno artificial, que no ocurre espontneamente en la naturaleza. As, en las dcadas del 60 y del 70, se demostr que la capacidad para desarrollar una respuesta inmune contra diversos antgenos naturales y sintticos, estaba bajo el control de genes MHC (genes de respuesta inmune o genes Ir). Finalmente, se demostr que la funcin biolgica real de estas molculas era la de actuar como presentadoras de antgenos (incluido aloantgenos) a los linfocitos T. Asimismo se demostr que estos antgenos altamente polimrficos al ser expresados en la membrana participaban en el fenmeno de rechazo al trasplante de tejidos mediante un mecanismo de reconocimiento directo e indirecto (figura 8-1). En el caso de reconocimiento directo estos antgenos son reconocidos directamente por las clulas T del receptor y reconocimiento indirecto, cuando la presentacin de pptidos antignicos derivados de estas molculas ocurre por las clulas presentadoras autlogas. Este ltimo mecanismo es el que est involucrado en el reconocimiento de cualquier otro antgeno ya sea derivado de protenas virales, bacteria u otra molcula polimrfica.

2. GENES Y MOLCULAS DEL COMPLEJO PRINCIPAL DE HISTOCOMPATIBILIDAD Anlisis inmunogenticos, funcionales y ms recientemente estudios de biologa molecular, han permitido identificar ms de 200 genes en el locus MHC. stos se han separado en tres familias o clases distintas: genes de clase I, de clase II y de clase III. En el complejo HLA estos genes ocupan una extensin de alrededor de 4 millones de pares de bases, en el brazo corto del cromosoma 6 humano. En el ratn el complejo H-2 ocupa una extensin de alrededor de 3 millones de pares de bases, en el cromosoma 17 murino. Los genes de clase I y de clase II codifican la expresin de protenas integrales de membrana que participan en la discriminacin entre lo propio y lo ajeno, al actuar como elementos de restriccin en la presentacin de antgenos a linfocitos T. Los genes de clase III, en cambio, codifican la expresin de protenas plasmticas que tienen una funcin completamente distinta, puesto que forman parte de la cascada de activacin del

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Figura 8-1. Mecanismos de presentacin directa e indirecta de molculas MHC del injerto por parte de clulas T del receptor.

sistema del complemento. En el complejo existen varios genes de clase I y de clase II, cada uno de los cuales presenta mltiples alelos (y por tanto elevado polimorfismo), que codifican la expresin de diferentes molculas de clase I o de clase II y por lo tanto con distintas capacidades para presentar fragmentos peptdicos a linfocitos T especficos. Esta forma de organizacin del MHC confiere a los distintos individuos una enorme capacidad para presentar y responder a una gran variedad de antgenos distintos, ya que los diferentes alelos de cada gen son codominantes, es decir los productos moleculares de cada alelo se expresan y funcionan de manera independiente en la superficie celular. 2.1. Genes del MHC 2.1.1. Genes de clase I Los genes de clase I controlan la expresin de los antgenos clsicos y no clsicos. Los antgenos clsicos de histocompatibilidad de clase

I (Ia: HLA-A, -B y C en el humano y H-2 K, D y L en el ratn) se expresan en la mayora de las clulas nucleadas del organismo y son los que han sido tradicionalmente reconocidos como el mayor obstculo al trasplante de tejidos entre individuos de la misma especie. La participacin de estas molculas en el rechazo de tejidos es slo un efecto secundario de su rol fisiolgico como elemento de restriccin en la presentacin antignica a linfocitos T CD8+. Estos linfocitos (T citotxicos o T supresores), son incapaces de reconocer el antgeno en su conformacin natural y slo lo reconocen en la superficie de una clula presentadora de antgeno, en asociacin con una molcula MHC de clase I. Estos genes presentan un alto grado de polimorfismo, es decir en la poblacin se describe un elevado nmero de variantes allicas para cada uno de estos locus. Por ejemplo en el ratn, en el locus K se han descrito ms de 100 alelos, considerando las cepas de laboratorio y poblaciones silvestres. En los humanos se han descrito, hasta ahora, 209 alelos HLA-A, 414

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alelos del gen B y 101 del gen C . Cada gen de clase I codifica la cadena pesada o cadena alfa del heterodmero glicoproteico y est formado por 7 exones: el exn 1 codifica para el pptido seal, los exones 2, 3 y 4 para los dominios 1 a 3 de la cadena (ver punto 2.2.1), el exon 5 para el dominio transmembrana y los exones 6 y 7 para la regin citoplasmtica. Los genes de clase I no clsicos (Ib) incluyen HLA-E, -F, -G y MIC en el humano y H2-Q, -T y -M en el ratn. stos son menos polimrficos, se expresan en forma ms restrigida a travs de las diversas clulas y tejidos y tienen una funcin diferente. La mayora de ellos participan en la interaccin con receptores de clulas NK. Adems estn los genes relacionados con la cadena pesada de clase I (MIC) A, B, C y D de los cuales slo A y B se expresan. Los genes MIC codifican para molculas reconocidas por linfocitos T en situaciones de stress.

2.1.2 Genes de clase II Los genes de clase II corresponden, a los antiguamente denominados como genes de respuesta inmune (genes Ir) del Complejo Principal de Histocompatibilidad y controlan la expresin de molculas de clase II, involucradas en la presentacin de fragmentos peptdicos a los linfocitos T CD4+. En el Complejo HLA humano los genes de clase II se ubican en las regiones HLA-DP, -DQ y -DR del complejo. En el ratn los genes de Clase II se ubican en las regiones I-A e I-E del sistema H-2 murino (figura 8-2). Los genes de clase II estn formados por 4 exones: el exon 1 codifica para el pptido seal, los exones 2 y 3 codifican para los dominios 1 y 2 y el exon 4 codifica para las regiones transmembrana y citoplasmtica. Cada regin contiene por lo menos dos genes:

Figura 8-2. Organizacin Gentica del Complejo Principal de Histocompatibilidad en humanos (Complejo HLA) y en el ratn (Complejo H-2). Tanto en humanos como en el ratn los genes de clase I incluyen a los genes clsicos altamente polimrficos (genes de clase Ia), como genes oligomrficos o monomrficos (genes de clase Ib). En humano los genes de clase II se ubican en las regiones DP, DQ y DR y en el ratn corresponden a los genes de las regiones IA e IE que codifican la cadena alfa (genes A) y genes que codifican la cadena beta (genes B) de la molcula de clase II. Los genes clase III codifican para algunos componentes del sistema del complemento y otras protenas.

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uno que codifica la cadena alfa (gen A) y otro que codifica la cadena beta (gen B) de la molcula de clase II, y el heterodmero se forma siempre a partir de cadenas y codificadas por genes de la misma regin. En la regin DR, por lo menos hay descritos 4 genes B funcionales (B1 y B3 B4 B5'), por lo tanto en esta regin se pueden originar 2 molculas DR diferentes dependiendo del haplotipo. Los genes de clase II tambin, presentan un alto grado de polimorfismo, al igual que los genes Ia. Sin embargo en el caso de estos genes solamente el DQA y DPA son polimrficos; el DRA es relativamente monomrfico y hasta el momento se han descrito slo dos variantes. Esto en contraste a los 273 alelos DRB1, 21 DQA, 45 DQB, 19 DPA y 93 DPB. Por lo tanto el nmero de molculas de clase II distintas que puede codificar una regin de clase II, depende del nmero de combinaciones - que puedan formarse a partir de los distintos genes funcionales A y B de la regin. En un individuo heterozigoto, con un haplotipo distinto en cada cromosoma homlogo, el nmero de combinaciones es an mayor, dado que no slo pueden codificarse molculas de clase II a partir de genes A y B que estn en posicin cis (genes en el mismo cromosoma), sino tambin a partir de genes A y B en posicin trans (genes en cromosomas homlogos distintos) (figura 8-3). Sin embargo la mayora de las molculas expresadas estn codificadas en cis ya que las molculas codificadas en trans no son estables. 2.1.3. Genes de clase III Los genes de clase III tambin codifican la expresin de protenas plasmticas que cumplen

una funcin completamente distinta a las molculas de clase I y de clase II, puesto que codifican la expresin de molculas como C2, C4 y factor B (Bf) que forman parte de la cascada de activacin del sistema del complemento (ver captulo 18) (figura 8.2). Tanto en el Complejo HLA como en el Complejo H-2, la regin de los genes de Clase III contiene: el gen que codifica la expresin del segundo factor del complemento (C2), dos genes (C4A y C4B) que codifican la expresin de dos formas del cuarto factor del complemento (C4), el gen que codifica el factor B (Bf) de la ruta alterna del sistema del complemento, los genes CYP-21A y CYP-21B que codifican la expresin de la 21 hidroxilasa (21-OH), enzima involucrada en la sntesis de esteroides. Entre los genes de clase III estn tambin los que codifican para el Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-), Linfotoxina A, B y C y aquellos que codifican la expresin de protenas de shock trmico de 70 kDa (hsp 70) (figura 8-2). Estas molculas estn relacionadas con fenmenos inflamatorios y algunos autores han planteado la posibilidad de clasificar esta regin como genes clase IV. 2.1.4. Otros genes del MHC En la regin de los genes clase II se ubican una serie de genes que codifican para molculas involucradas en el procesamiento antignico por las molculas de clase I tales como, tapasina (tps), LMP2 y LMP7, TAP1 y TAP2 y aquellas involucradas en la seleccin y presentacin de pptidos antignicos a las molculas de clase II incluidos DMA y DMB y DOA y DOB. No todos los genes ligados en el Complejo Principal de Histocompatibilidad pueden clasificarse como genes de clase I, II III. En esta categora se encuentran: (a) los genes LMP-2 y LMP-7 que codifican subunidades de la maquinaria citoplasmtica de degradacin o procesamiento de protenas (Proteasoma), (b) los genes TAP-1 y TAP2 que codifican las subunidades de un transportador peptdico ATP dependiente (TAP, "Transporter Associated with Antigen Processing"), (c) el gen que codifica para la protena Tapasina, chaperona involucrada en la formacin del complejo molcula MHC-pptido, en el interior del retculo endoplsmico (d) los genes DMA y DMB que codifican la expresin de las subunidades del heterodmero o molcula DM, involucrada en la unin de fragmentos peptdicos a las molculas de

Figura 8-3. Asociacin de cadenas del mismo cromosoma (apareamiento cis) y de cromosomas opuestos (apareamiento trans). Un individuo heterocigoto para los genes DRA1 y DRB1 puede codificar para 2 cadenas y 2 cadenas diferentes por lo que puede formar cuatro cadenas DR diferentes.

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clase II. Todas estas molculas estn involucradas en el procesamiento antignico y sus genes mapean en la regin de los genes clase II. 2.2. Estructura y funcin de las molculas MHC 2.2.1. Estructura y funcin de las molculas clase I Las molculas MHC de clase Ia se expresan en todas las clulas nucleadas en niveles de 104 a 105 molculas por clula, particularmente en clulas linfoides. Una menor expresin de estas molculas MHC de clase I se observa en clulas germinales y glbulos rojos. Las molculas MHC de clase Ia y Ib son glicoprotenas integrales de la membrana plasmtica y se expresan como un heterodmero constituido por una cadena pesada o cadena de 45 kDa (codificada por los genes MHC de clase I) y una cadena liviana de 12 kDa, la Beta-2 microglobulina (2m) no codificada por el MHC, sino por un gen situado en el cromosoma 15 en humanos y en el cromosoma 2 en el ratn (figura 8-4). Las molculas clase Ia (B, C, A en el humano y K, D, L en el ratn) se caracterizan por expresarse en prcticamente todas las clulas nucleadas, tambin en los glbulos rojos y plaquetas; su funcin se asocia a la presentacin de pptidos antignicos principalmente de origen endgeno a los linfocitos T CD8+. La cadenas y de la molcula de clase I estn no covalentemente unidas y slo la cadena alfa se encuentra anclada a la membrana plasmtica celular.

La cadena contiene aproximadamente 330 aminocidos y su conformacin en la membrana es tal que presenta distintas regiones o dominios claramente definidos: 3 dominios extramembrana denominados 1, 2 y 3, de alrededor de 90 aminocidos cada uno; una regin hidrofbica transmembrana de alrededor de 25 aminocidos de anclaje en la membrana y, una cola o segmento citoplasmtico de 30 aminocidos (figura 8-4). Los dominios 1 y 2 conforman la ranura o bolsillo de unin para la presentacin de fragmentos peptdicos, de 8-9 aminocidos, a clulas T CD8+. El dominio 3 presenta una regin de unin no covalente a la 2m y un sitio o regin no polimrfica o monomrfica para interaccin con la molcula CD8, co-receptor linfocitario. Tanto el dominio 3, como la 2m presentan una secuencia aminoacdica y una conformacin similar a los dominios constantes de las molculas de inmunoglobulinas (ver captulo 6). Por lo tanto las molculas de clase I se clasifican dentro del gran grupo de protenas de la superfamilia de las inmunoglobulinas. La mayor parte del polimorfismo de las molculas de clase I est localizado en los dominios alfa 1 y alfa 2. Los productos de los genes clsicos de clase I (HLA-A, -B y -C) interactan con el receptor de las clulas T y con el receptor KIR (killer/immunoglobulin like receptor) presente en las clulas T y NK, respectivamente. Por otra parte, HLA-E interacta con los receptores tipo lectina presente en las clulas NK. Los productos de los genes MIC que no estn unidos a la 2m, no participan en la presentacin de antgenos a los linfocitos T , pero s son reconocidos por linfocitos T intraepiteliales. 2.2.2. Estrcuctura y funcin de las molculas clase II A diferencia de las molculas MHC de clase I, que se expresan en virtualmente todas las clulas nucleadas, las molculas MHC de clase II tienen una distribucin ms restringida expresndose en forma constitutiva en clulas como linfocitos B, monocitos, macrfagos, clulas de Langerhans, clulas dendrticas y, en general en clulas presentadoras de antgeno (CPA). Clulas endoteliales, epiteliales y estromales no expresan molculas MHC de clase II en forma constitutiva, pero pueden

Figura 8-4. Esquema de las molculas MHC de clase I. La molcula MHC de clase I es un heterodmero glicoproteico formado por una cadena pesada de 45 kDa codificada por el complejo MHC y una cadena liviana de 12 kDa, 2m, codificada en el cromosoma 15 humano y en el cromosoma 2 murino. El bolsillo o sitio de unin de fragmentos peptdicos se conforma de los dominios 1 y 2 de la cadena .

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hacerlo bajo el estmulo de citoquinas como interfern gamma (IFN), lo que puede tener importantes consecuencias en la respuesta inmune normal y/o en el desarrollo de autoinmunidad. Los linfocitos T son claramente negativos para molculas MHC de clase II, pero tambin pueden expresarlas como resultado de la activacin celular. Las molculas MHC de clase II tambin son glicoprotenas integrales de la membrana celular y estn constituidas por dos cadenas polipeptdicas, y , no covalentemente asociadas y codificadas por genes de clase II del complejo. Tanto en la cadena (32-34 kDa), como en la cadena (28 -32 kDa) del heterodmero de clase II, se distinguen claramente: dos dominios extracelulares de 90 aminocidos, 1 y 2 y 1 y 2, respectivamente; una regin o dominio hidrofbico transmembrana de alrededor de 25 aminocidos para anclaje en la membrana celular y, una pequea cola citoplasmtica de longitud variable en las distintas molculas MHC de clase II (figura 8-5). La ranura o bolsillo peptdico de presentacin antignica est conformado por los dominios 1 y 1 y, normalmente, presenta a los linfocitos T CD4+ fragmentos peptdicos de 13 a 15 aminocidos. El polimorfismo de esta molcula est localizado principalmente en los dominios alfa 1 y alfa 2 de las molculas y est concentrado en tres regiones hipervariables que son las que hacen contacto directo con el ppetido antignico y/o el receptor de clulas T.

Los dominios 3 y 3 de las molculas de clase II, lo mismo que el dominio 3 y la 2m de las molculas de clase I, tienen una secuencia aminoacdica y una conformacin similar a los dominios constantes de las molculas de inmunoglobulinas y se clasifican entonces dentro de la misma superfamilia de las inmunoglobulinas.

3. EL CONCEPTO DE RESTRICCIN MHC Un linfocito T, especfico para un fragmento peptdico presentado en el contexto de una molcula MHC particular, slo reconocer este complejo molcula MHCpptido y no reconocer el mismo pptido presentado en el contexto de una molcula MHC de la misma clase (I o II), pero distinta. El genotipo o la molcula MHC restringe entonces la especificidad del linfocito T, el que no reconoce a la molcula MHC o al fragmento peptdico, sino slo al complejo MHC-pptido especfico. El origen del fenmeno de restriccin MHC se encuentra en el proceso de diferenciacin o "educacin tmica", puesto que en el timo se produce la seleccin positiva de linfocitos T, en funcin de su capacidad para reconocer fragmentos peptcos en el contexto de molculas MHC propias. Sin embargo, un linfocito T citotxico especfico para un fragmento peptdico presentado en el contexto de una molcula MHC de clase I propia, puede reconocer o reaccionar cruzadamente con un fragmento peptdico extrao, presentado en el contexto de una molcula MHC de clase I extraa o contra un pptido propio presentado en el contexto de una molcula de clase I extraa o alognica. De esta manera puede entonces explicarse, al menos en parte, el rechazo al trasplante de tejidos, puesto que antgenos propios o extraos (alognicos) estn siendo presentados en el contexto de molculas MHC extraas en la superficie de clulas extraas o alognicas, presentes en el tejido del donante. Un fenmeno similar puede explicar la denominada reaccin del trasplante o injerto contra el husped (GvH, "graft-versus-host"), en la que linfocitos T citotxicos presentes en el tejido trasplantado (linfocitos alognicos) reaccionan contra tejidos o clulas del receptor.

Figura 8-5. Esquema de las molculas MHC de clase II. La molcula de clase II es un heterodmero glicoproteico constituido por una cadena de 32-34 kDa y una cadena de 28-34 kDa. Ambas cadenas estn codificadas por genes MHC de clase II y estn asociadas no covalentemente. El bolsillo o sitio de unin de fragmentos peptdicos se conforma de los dominios 1 y 1 y de las cadenas y respectivamente.

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4. OTRAS MOLCULAS DE PRESENTACIN 4.1. Molculas CD1 Las molculas CD1 son glicoprotenas transmembrana constituidas por una cadena alfa de 43-49 kDa asociada no covalentemente a una 2m. Lo anterior indica una semejanza estructural con las molculas MHC clase I, con las cuales comparten una limitada pero significativa homologa de secuencia (20%). Estas molculas son codificadas por genes fuera del MHC (cromosoma 1 humano y 3 murino) y tienen un bajo polimorfismo. Su transporte intracelular es TAP o Ii independiente, molculas importantes en el movimiento de las molculas clase I y II, respectivamente. Aunque existe evidencia de que estas molculas estn presentes en, al menos, todos los mamferos, la mejor caracterizacin se ha hecho en humano y ratn. Los miembros de la familia CD1 se dividen en dos grupos, sobre la base de sus secuencias aminoacdicas. El grupo I comprende slo molculas descritas en humano: CD1a, CD1b y CD1c; al parecer no habra protenas grupo I en el ratn. El grupo II incluye a CD1d en el humano, y CD1d.1 y CD1d.2 en el ratn. Las molculas CD1 son fundamentalmente expresadas en timocitos inmaduros y clulas presentadoras de antgeno, incluyendo clulas dendrticas, macrfagos activados por citoquinas y linfocitos B. Esto es un indicio de la participacin de estas molculas en la presentacin antignica, pero a diferencia de las molculas convencionales, ellas participan en la presentacin de lpidos y glicolpidos a linfocitos CD4+, CD8+ y dobles negativos (DN). Glicolpidos de micobacterias, como mansidos de fosfoinositol (PIM), lipoarabinomananos (LAM), cido miclico y hexosil-1-fosfoisoprenoide (hPIP) se presentan en el contexto de molculas CD1, grupo I. Las molculas CD1d (del grupo II) interactan con las recientemente descritas NKT cells. Las celulas NKT representan una subpoblacin linfocitaria que expresa receptores T (TCR) y NK (CD161). Estas clulas utilizan una cadena invariante del TCR alfa (Va14Ja281 en el ratn y Va24JaQ en el humano). A pesar que se sabe que estas clulas participan en la regulacion de la respuesta inmune, los mecanismos precisos no estn an bien definidos. Las molculas CD1 forman parte, al parecer,

de mecanismos complementarios para establecer una respuesta inmune adecuada en la infeccin con bacterias intracelulares y abre la posibilidad del uso de antgenos glicolipdicos en posibles vacunas, por ejemplo contra la tuberculosis. 5. HERENCIA DE LOS GENES HLA Los genes HLA se heredan en forma codominante, por tanto los alelos de ambos locus son expresados, as dos set de molculas HLA o haplotipos pueden ser pesquisados en las clulas, uno heredado del padre y otro de la madre. Existe un 25% de posibilidades que 2 hijos compartan ambos haplotipos (HLA idnticos), un 25% de posibilidades que no compartan ningn haplotipo y un 50% de posibilidades que compartan un haplotipo (figura 8-6).

Figura 8-6. Herencia de haplotipos HLA. En la figura, (a) y (b) representan los dos haplotipos maternos, y (c) y (d) representan lo haplotipos paternos. Al heredar uno de los haplotipos de cada padre, pueden obtenerse los haplotipos (ac), (ad), (bc) y (bd). Existe un 25% de posibilidades que dos hijos dean HLA idnticos (ejemplo (ac) y (ac), un 25% de posibilidades que sean totalmente HLA no idnticos (ejemplo (ac) y (bd) y 50% de posibilidades que ellos sean HLA semiidnticos.

6. COMPLEJO PRINCIPAL DE HISTOCOMPATIBILIDAD Y ENFERMEDAD Durante muchos aos se ha sabido que la resistencia o susceptibilidad a contraer diversas enfermedades est en muchos casos determinada por factores genticos y, en los ltimos aos se han identificado diversos marcadores genticos que son idnticos o estn estrechamente ligados a los genes que confieren resistencia o susceptibilidad a la enfermedad. El anlisis de tales marcadores permite no slo identificar a los individuos que estn en riesgo de contraer o desarrollar una cierta enfermedad, sino tambin estudiar o determinar la patognesis de la enfermedad.

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Ciertos genes o haplotipos del MHC parecen estar asociados con la susceptibilidad o resistencia a desarrollar algunas enfermedades. Sin embargo, los exactos mecanismos responsables de estas asociaciones son variados y en general nos estn claramente definidos. Se postula que esta asociacin puede ser debida a la semejanza entre pptidos propios y pptidos derivados de patgenos como por ejemplo Klebsiella, lo que llevara al desarrollo de una respuesta autoinmne. Este sera el mecanismo que explicara la asociacin entre HLA-B27 y ArtritisAnquilosante (AS). Otra posibilidad es que la asociacin se deba a la presentacin preferencial de ciertos pptidos derivados de patgenos u otros antgenos como es el caso de la enfermedad celiaca (EC) y el Prpura aloinmune neonatal (PAN). En el caso de la EC los alelos HLA-DQ2 y DQ5 presentan pptidos derivados del gluten a los linfocitos T y stos

estn directamente involucrados en la patologa de la EC. En el caso de PAN los pptidos son derivados del aloantgeno HPA1a que son presentados por el alelo HLA-DRB3*0101 y que lleva a la produccin de anticuerpos patgenos en contra de este aloantgeno, resultando en grave trombocitopenia en el recin nacido. Finalmente es posible que esta asociacin sea con un gen an no identificado que se encuentra en desequilibrio de unin con algunos de los genes de HLA como es el caso de Hemocromatosis Hereditaria (HH) y HLA-A3. Hoy se sabe que HH ocurre como resultado de mutaciones en el gen HFE localizado telomrico de HLA-A. La asociacin con HLA-A3 se debe al desequilibrio de unin con ese alelo en un haplotipo ancestral en el cual se origin la mutacin inicial. En este caso se habla de enfermedades ligadas al HLA. En la tabla 8-1 se muestran algunos ejemplos de asociaciones entre HLA y enfermedades.

Tabla 8-1. Enfermedades asociadas y ligadas al sistema HLA Enfermedades asociadas a HLA Corioretinopata de Birdshot Enfermedad de Behet's Espondilitis anquilosante Malaria Diabetes Mellitus insulino dependiente Artritis reumatoidea Narcolepsia Enfermedad celiaca Deficiencia selectiva de IgA Desarrollo de anticuerpos HPA-Ia PAN No respuesta de anticuerpos con vacunas para VHB Remocin de HCV circulante Enfermedades ligadas a HLA Hemocromatosis Deficiencia de 21 OH (HLA-A3) gen HFE C282Y y H63D (HLA-B27) gen 21 OH HLA-A29 HLA- B51 HLA-B27 HLA-B53 HLA-DQ8 Aminocidos 70-74 codificados por gen DRBI (QKRAA or QRRAA) HLA-DQBI*0602/DQAI*0102 HLA-DQBI*0201/DQAI*0501 HLA-DRBI*0301/-DQBI*02 HLA-DRB3*0101 HLA-B44-DR7-DQ2 (en Caucsicos) HLA-B8-DR-DQ2 (en Caucsicos) HLA-B564-DR4-DQ4 (en Japoneses) HLA-DRBI*11-DQB1*0301

PAN, Prpura aloinmune neonatal; VHB, Virus de Hepatitis B; (), Alelo asociado

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El riesgo relativo a desarrollar una enfermedad se calcula a partir de la frecuencia del alelo o haplotipo en la poblacin enferma y su frecuencia en la poblacin control sana. As, en una tabla de 2 x 2, el nmero de individuos enfermos y sanos que presentan o carecen de un determinado alelo o haplotipo HLA es:

Campbell, R., and Trowsdale, J., A map of the human Major Histocompatibility Complex, Inmunol. Today. 18: 43-45, 1997. Gruen, J., and Weissman, S., Evolving views of the Major Histocompatibility Complex, Blood 11: 4252-4246, 1997. Jackson, M.R. and Peterson, P.A., Assembly and intracellular transport of MHC class I molecules, Ann. Rev. Cell Biology 9: 207-233, 1993.

Alelo HLA + Enfermos A B Sanos C D A/D Riesgo relativo = B/C

As, por ejemplo, la Espondilitis anquilosante presenta un riesgo relativo de 87.4 y Enfermedad Celiaca 10.8.

Kirberg, J., Berns, A. and von Boehmer, H., Peripheral T cell survival requires continual ligation of the T cel receptor to Major Histocompatibility complex-encoded molecules, J. Exp. Med. 8: 1269-1275, 1997. Matsuda, J. and Kronenberg, M., Presentation of self and microbial lipids by CD1 molecules, Curr. Opin. Inmunol. 13: 19-25, 2001.

7. NOMENCLATURA Y TIPIFICACIN HLA Las molculas MHC clase I y II son muy polimrficas. En humanos (HLA) actualmente se les identifica con una nueva nomenclatura que incluye el locus (Ej. A, de clase I), seguido de un asterisco (*) y 3 4 dgitos en que los dos primeros corresponden a la especificidad serolgica y los dos segundos al nmero de la variante. Ejemplo: HLA-A*0203 . La tipificacin HLA, requerida entre otras situaciones, para trasplantes y determinacin de riesgo de enfermedad, se estudia a travs de pruebas serolgicas (microlinfocitotoxicidad), mtodos celulares y de biologa molecular (ver captulo 42). Schaible, U. and Kaufmann, H., CD1 and CD1restricted Tcells in infections with intracellular bacteria, Trends Microbiol. 9: 419-425, 2000. Sette, A. and Sidney, J., HLA supertypes and supermotifs: a funcional perspective on HLA polymorphism, Curr. Opin. Inmunol. 10: 478-482, 1998. Steven, G.E., Marsh., Julia G. Bodmer ., Ekkehard D. Albert et al., Nomenclature for factors of the HLA system, European journal of immunogenetics. 28:377-424. 2000.

LECTURAS SUGERIDAS Bahram, S., and Spies, T., The MIC gene family, Res. Immunol. 147:328-334, 1996. Barber, L.D., and Parham, P., Peptide binding to major histocompatibility complex molecules, Ann. Rev. Cell Biology 9:163-206, 1993. Braud, V., Alland, D., And Mc Michael A. Functions of non classical MHC and non-MHCencodedclas I molecules, Curr. Opin. Inmunol. 11: 100-108, 1999.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 9
PROCESAMIENTO, PRESENTACIN Y RECONOCIMIENTO ANTIGNICO
Ulises Vergara C., Claudio Ziga M., Ivn Palomo G. y Cristina Navarrete

1. Introduccin 2. Linfocitos T y reconocimiento de antgenos 2.1. Subpoblaciones linfocitarias T y reconocimiento peptdico 2.2. Linfocitos T 2.3. Clulas NK 2.4. Clulas presentadoras de antgenos 3. Trfico celular y procesamiento antignico 4. Antgenos endgenos y exgenos 5. Fragmentos peptdicos y molculas MHC 6. Procesamiento y presentacin de antgenos endgenos 7. Procesamiento y presentacin de antgenos exgenos 8. Presentacin alternativa de pptidos

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RESUMEN Los linfocitos T reconocen fundamentalmente antgenos proteicos, en forma de fragmentos peptdicos presentados en asociacin con una molcula del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) en la membrana de una clula presentadora de antgenos (CPA). As la presentacin antignica en el contexto de una molcula MHC y el reconocimiento del complejo molcula MHC-pptido por el receptor T, proporciona al sistema inmune de un mecanismo de control o deteccin de protenas anormales en clulas transformadas o tumorales y de protenas extraas en clulas infectadas por virus, bacterias o parsitos. Las evidencias experimentales sugieren que el procesamiento antignico y la unin de fragmentos peptdicos a molculas MHC parece depender tanto del origen del antgeno, como del trfico antignico a travs de distintos compartimientos celulares. As, los antgenos intracelulares o endgenos son procesados o degradados por la maquinaria multicataltica citoplasmtica (Proteasoma) y los fragmentos peptdicos all generados son luego translocados al retculo endoplsmico, con la participacin de un transportador ATP-dependiente (TAP). En el retculo, los pptidos endgenos sern unidos a una molcula MHC clase I y slo el complejo correctamente ensamblado ser transportado y expresado en la superficie celular, para su presentacin a linfocitos T CD8+. Los antgenos extracelulares sern en cambio, internalizados por la clula presentadora y procesados en un compartimiento acdico celular (endolisosoma o fagolisosoma). Los fragmentos peptdicos aqu generados son luego asociados a una molcula MHC clase II y slo el complejo correctamente ensamblado, se expresar en la membrana celular para la presentacin del fragmento peptdico a linfocitos T CD4+.

1. INTRODUCCIN El sistema inmune es parte de los mecanismos biolgicos destinados a mantener la integridad estructural y funcional de los individuos y est genticamente programado para defendernos de la agresin de agentes infecciosos, clulas y molculas extraas. El sistema inmune est constitudo por clulas con capacidad para reconocer y neutralizar o eliminar molculas extraas (linfocitos B, linfocitos T y clulas NK) y por clulas accesorias que cumplen una importante funcin en el procesamiento y presentacin de antgenos (monocitos, macrfagos, clulas dendrticas, clulas interdigitantes, etc.).

2. LINFOCITOS T Y RECONOCIMIENTO ANTIGNICO Los linfocitos B pueden reconocer eptopos estructurales, continuos o de secuencia y/o

eptopos conformacionales o discontinuos en antgenos de naturaleza qumica tan variada como protenas, hidratos de carbono, lpidos y cidos nucleicos. Los linfocitos T en cambio, reconocen fundamentalmente determinantes continuos o de secuencia en antgenos proteicos y, slo en forma de pequeos fragmentos peptdicos presentados en asociacin con una molcula del Sistema o Complejo Principal de Histocompatibilidad, en la superficie de una CPA. Dada la elevada homologa tanto estructural como funcional, entre el receptor antignico de los linfocitos B (BCR) y el receptor de los linfocitos T (TCR), no exista hasta ahora una explicacin satisfactoria que diera cuenta de esta capacidad limitada o restringida de los linfocitos T para reconocer fundamentalmente eptopos o determinantes antignicos de naturaleza proteica. Sin embargo, todo parece indicar que esta restriccin estaba determinada por las molculas MHC, que slo son capaces de unir o presentar fragmentos peptdicos. Pero con el reconocimiento de las molculas CD1, que son capaces de presentar antgenos lipdicos o glicolipdicos a los linfocitos

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T CD4+, CD8+ y DN, sta visin limitada ha cambiado y al parecer el receptor T es capaz de reconocer antgenos de diversa naturaleza qumica, aunque presentadas por molculas diferentes a las clsicas MHC. De todas maneras, adems de estos mecanismos complementarios, la presentacin antignica en el contexto de molculas del MHC y la deteccin o reconocimiento del complejo molcula MHC-pptido por el receptor de un linfocito T, proporciona al sistema inmune de un mecanismo de control o deteccin de la expresin de protenas anormales en clulas transformadas o tumorales y de protenas extraas en clulas infectadas por virus, bacterias o parsitos. 2.1. Subpoblaciones linfocitarias T y reconocimiento peptdico Los linfocitos T (TCR) tanto como citotxicos (LTc) y linfocitos T supresores (LTs) reconocen fragmentos peptdicos asociados o presentados por molculas MHC clase I, mientras los linfocitos T "helper" (LTh), reconocen fragmentos peptdicos asociados a molculas MHC clase II. Esta especificidad en el reconocimiento de pptidos asociados a una clase particular de molcula MHC est determinado por las molculas CD4 y CD8, que actan como co-receptor linfocitario para el reconocimiento de la molcula MHC. As, la molcula CD8 slo se une con la molcula de clase I, reconociendo una regin monomrfica situada en el dominio -3 de esta molcula MHC. La molcula CD4 en cambio, slo se une con la molcula MHC clase II, reconociendo una regin monomrfica situada en el dominio -2. El reconocimiento antignico asociado a molculas MHC clase I resulta en la destruccin citotxica de la clula presentadora o clula blanco, mientras el reconocimiento de antgenos en el contexto de molculas MHC clase II conduce a la activacin y proliferacin de distintas subpoblaciones de clulas T "helper", con sntesis y secrecin de una combinacin particular de citoquinas que promueven una amplificacin de la respuesta inmune humoral o celular, al activar linfocitos B y/o macrfagos, y diversas clulas inflamatorias. La respuesta inmune humoral y celular son reguladas por subpoblaciones distintas de clulas T "helper". As, los linfocitos T helper 1 (Th1) participan en la regulacin de la respuesta inmune celular (reacciones inflamatorias, de hipersensibilidad retardada y citotxicas) y se caracterizan por la sn-

tesis y secrecin de interleuquina 2 (IL-2), interleuquina 12 (IL-12), interferon gamma (IFN) y factor de necrosis tumoral (TNF). Los linfocitos T helper 2 (Th2) en cambio, regulan la respuesta inmune humoral mediada por anticuerpos y se caracterizan por la sntesis y secrecin de interleuquina 4 (IL-4), interleuquina 5 (IL-5), interleuquina 6 (IL-6) e interleuquina 10 (IL-10). El reconocimiento especfico y restringido por las molculas del MHC est mediado fundamentalmente por linfocitos T que poseen el receptor (TCR). 2.2 Linfocitos T Los linfocitos T se encuentran predominantemente en tejidos epiteliales, tienen una diversidad restringida y forman parte de las respuestas innatas a patgenos intracelulares y a tumores. Estos linfocitos no requien de las molculas clsicas presentadoras de antgenos ni tampoco utilizan las vas clsicas de reconocimiento antignico utilizado por los linfocitos T . Sin embargo, esta subpoblacin de linfocitos T si reconocen los antgenos no clsicos de clase I, MICA y MICB que se expresan principalmente en clulas tumorales de origen epitelial que han sido sometidas a stress. El reconocimiento especfico de estas molculas est mediado por el receptor NK (NKG2D) expresado en estos linfocitos. Los linfocitos T tambin reconocen antgenos no peptdicos (lpidos) tales como isopentenyl pirofosfatasa (IPP) derivados de M. tuberculosis. El reconocimiento de estos antgenos es mediado por la presencia de CD1 y en la mayora de los casos requiere de la capacitacin y transporte de antgeno a un compartimiento intracelular acdico en la CPA similar al procesamiento de pptidos restringido por las molculas de MHC clase II (ver punto 7). Sin embargo, el sistema de transporte TAP1/TAP2 o las molculas DM no son requeridas ya sea para la expresin de CD1 o para la funcin presentadora de estas molculas (captulo 8). 2.3 Clulas NK Las clulas NK estn directamente involucradas en la respuesta inmune en contra de virus, parsitos, bacterias intracelulares y tumores. Tambin contribuyen directamente a la eliminacin de clulas alognicas y, mediante la secrecin de citoquinas, participan en la regulacin de otras funciones

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inmunolgicas, como la produccin de anticuerpos y la hematopoyesis. Las clulas NK presentan en su membrana una gran variedad de receptores. Los receptores como CD2, CD69 y CD16 funcionan en forma independiente de la expresin de molculas de MHC, mientras que otros si dependen de la expresin de las molculas clsicas y no clsicas de MHC clase I. En este ltimo grupo se encuentran los receptores del tipo C lectin-like (NKC) por ejemplo CD94/NKG2D y los "Ig like receptors" (LRC), por ejemplo KIRs (ver captulo 10). Los receptores de la familia NKC estn localizados en el cromosoma 12 mientras que los LRC en el cromosoma 19. Tanto los NKC como los LRC incluyen receptores de inhibicin y activacin de las clulas NK, que tienen como ligandos molculas MHC de clase I clsicas y no clsicas (tabla 1). Estos receptores son altamente polimrficos y su variacin est dada no slo por mutaciones en los distintos genes, sino tambin por su expresin diferencial en distintos individuos, vale decir no todos los individuos expresan el mismo nmero de receptores. 2.4 Clulas presentadoras de antgeno La posibilidad que linfocitos T puedan

Tabla 9-1. Interaccin entre molculas MHC clase I y los receptores activadores e inhibidores de las clulas NK.

Ligandos HLA-E MIC HLA-C HLA-B HLA-G Ligandos HLA-E HLA-C HLA-B HLA

Receptores activadores CD94/NKG2C (DAP 12) NKG2D (DAP 10) KIR2DS (DAP 12) KIR3DS (DAP 12) KIR2DL4 Receptores inhibidores CD94/ NKG2A/ KIR2DL KIR3DL ILT2/4

reconocer pptidos antignicos, est en gran parte determinada por las caractersticas de las clulas presentadoras de antgeno: monocitos, macrfagos, clulas dendrticas, clulas interdigitantes, linfocitos B. etc. De stas, las clulas dendrticas (CD), son sin duda las ms importantes debido a su capacidad para activar linfocitos T "naive". Las CD forman parte de un grupo heterogneo de clulas que se encuentran en los rganos linfoides secundarios y en la periferia, en distintos estadios de diferenciacin y maduracin. En los tejidos perifricos, las CD inmaduras tienen un grado moderado de sntesis y expresin de molculas MHC de clase II y una gran capacidad fagoctica. Luego de su reclutamiento y activacin, ya sea por citoquinas u otros estmulos capaces de sealar la presencia de patgenos o de dao tisular, se produce un aumento pasajero en la sntesis de molculas MHC de clase II, seguido de una disminucin de la capacidad fagoctica, luego de la captura o incorporacin de antgenos. Estas CD inmaduras, migran luego a los rganos linfoides secundarios, donde completan su proceso de maduracin para el adecuado procesamiento y presentacin de antgenos a linfocitos T. Utilizando marcadores de membrana de la serie mieloide (CD11c y CD33) se ha podido identificar, en sangre perifrica, 2 subpoblaciones de clulas dendrticas de origen mieloide y una subpoblacin CD11-, de origen linfoide o plasmocitoide. Las CD de origen mieloide son ms propensas a secretar IL-12 (una citoquina inductora de respuesta Th1), mientras que las CD de origen linfoide secretan IL-10, que promueve una respuesta de tipo TH2. La subpoblacin mieloide tiene la capacidad de inducir respuestas proliferativas contra diversos antgenos y aloantgenos mientras que la subpoblacin linfoide tiene una funcin limitada como clula presentadora de antgeno, pero parece tambien involucrada en la induccin de tolerancia. La presentacin de fragmentos antignicos asociados a molculas MHC ha llevado a los inmunlogos a preguntarse dnde y cmo se realiza el procesamiento antignico en la clula presentadora y cmo y dnde se realiza la asociacin de los fragmentos peptdicos a las molculas MHC clase I o clase II. Existe alguna relacin entre el procesamiento y presentacin de antgenos y la sntesis, transporte y expresin de las molculas MHC en la membrana de la clula presentadora?.

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3. TRFICO CELULAR Y PROCESAMIENTO ANTIGNICO La evidencia experimental hasta ahora acumulada sugiere que el procesamiento antignico y la unin de pptidos a molculas MHC parece depender tanto del origen del antgeno como del trfico antignico a travs de distintos compartimientos celulares. As, los antgenos intracelulares y extracelulares constituyen desafos distintos para el sistema inmune puesto que los fragmentos peptdicos derivados de antgenos intracelulares o endgenos son normalmente unidos a molculas MHC clase I y presentados a linfocitos T CD8+, mientras los antgenos extracelulares o exgenos se unen a molculas MHC clase II y son normalmente presentados a linfocitos T CD4+. La asociacin de fragmentos peptdicos a molculas MHC clase I o clase II es entonces funcin de la ruta de introduccin del antgeno a la clula y de su susceptibilidad al procesamiento o degradacin en distintos compartimientos celulares. El aislamiento e identificacin de lneas celulares con defectos en el procesamiento y presentacin de antgenos, ha constitudo un avance significativo en el conocimiento de la biologa de la respuesta celular T y del ensamblaje y transporte de las molculas MHC. As, la lnea celular RMAS derivada de clulas mutagenizadas de linfoma H2b de ratn transformadas por virus de Rauscher y la lnea linfoblastoide humana LBL 721.174, expresan bajos niveles de molculas MHC en la superficie celular, an cuando sintetizan niveles normales de la cadena alfa de la molcula clase I y de beta-2 microglobulina (2m). La incubacin de estas lneas celulares con pptidos virales capaces de unirse especficamente a las molculas MHC clase I, conduce a la expresin del complejo MHCpptido en la superficie celular y a su destruccin citotxica si se les cocultiva con linfocitos T CD8+ citotxicos especficos para ese complejo MHCpptido. Estos fenmenos no ocurren si las lneas celulares se infectan con el virus original, sugiriendo un defecto en el procesamiento y presentacin de antgenos y una relacin con el ensamblaje de las molculas MHC.

la CPA o de la clula blanco de la respuesta inmune. Estas protenas son generalmente sintetizadas en ribosomas libres en el citoplasma o pueden corresponder a protenas derivadas de virus, bacterias o parsitos intracelulares; pero, para todas ellas, sus fragmentos peptdicos se generan mediante protelisis citoplasmtica. Los fragmentos antignicos deben ser luego translocados o transportados al retculo endoplsmico, donde se encuentran las molculas MHC clase I sintetizadas en ribosomas asociados al retculo. Los antgenos proteicos exgenos corresponden a protenas extracelulares internalizadas mediante la unin a un receptor especfico de la superficie celular o en fase fluda mediante vesculas membranosas en procesos de fagocitosis, pinocitosis o endocitosis. Las protenas as internalizadas sern procesadas en un compartimiento acdico celular (fagolisosoma o endolisosoma) y los fragmentos peptdicos all generados sern luego asociados a una molcula MHC clase II para su transporte y expresin en la superficie celular.

5. FRAGMENTOS PEPTDICOS Y MOLCULAS MHC La evidencia experimental indica que las molculas MHC clase I unen preferentemente, pptidos de 8 a 9 aminocidos generados en el citoplasma celular. Las molculas MHC clase II en cambio, unen preferentemente pptidos de 13 a 15 aminocidos, generados en un compartimiento acdico celular (compartimiento endoctico MIIC). Esta diferencia en la longitud de los fragmentos peptdicos que pueden asociarse a molculas clase I o clase II parece depender de la estructura y conformacin del bolsillo de unin de la molcula MHC: el bolsillo es cerrado en las molculas de clase I y abierto en las molculas clase II. De esta manera las molculas clase II puede unir pptidos de mayor longitud que las molculas clase I. Cuando se purifican molculas MHC por inmunoprecipitacin de extractos celulares con anticuerpos monoclonales especficos para molculas clase I o clase II, se encuentra que ellas coprecipitan con los fragmentos peptdicos alojados en su bolsillo de unin. La secuenciacin de los fragmentos peptdicos, eludos o aislados del complejo MHC-pptido por denaturacin cida, demuestra la existencia de 2 a 3 residuos

4. ANTGENOS ENDGENOS Y EXGENOS Antgenos proteicos endgenos son todas aquellas protenas residentes en el citoplasma de

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conservados de anclaje a la molcula MHC. En los pptidos de 8 a 9 aminocidos que se unen a las molculas MHC clase I, los residuos de anclaje se encuentran normalmente en los extremos amino y carboxilo del fragmento peptdico y slo pueden ser ocupados por un aminocido especfico o por residuos aminoacdicos que contienen cadenas laterales similares o estrechamente relacionadas. El extremo carboxiterminal es con frecuencia un aminocido con cadena lateral aliftica (como isoleucina, leucina o valina) o cargada positiva o negativamente. Pptidos distintos pueden entonces asociarse a la misma molcula MHC, siempre y cuando los residuos de anclaje tengan la naturaleza y la posicin que corresponde para una adecuada y estable asociacin a esa molcula. Sin embargo, cada complejo MHC-pptido ser reconocido por un linfocito T distinto y especfico para ese complejo.

a esta estructura se le denomina inmunoproteasoma. LMP-2 y LMP-7 ("low molecular mass protein") codifican en la regin de los genes de clase II del Complejo Principal de Histocompatibilidad.

6. PROCESAMIENTO DE ANTGENOS ENDGENOS Los antecedentes hasta ahora disponibles sugieren que los antgenos endgenos son degradados o procesados en el citoplasma celular, generando fragmentos peptdicos de 8 a 9 aminocidos por accin de un complejo multicataltico de 700 kDa, denominado Proteasoma, Macropana o MCP ("multicatalytic proteinase"), que es responsable de la degradacin de la mayora de las protenas en el citoplasma y el ncleo celular (figura 9-1). Esta estructura cilndrica est formada por 4 anillos heptamricos de subunidades alfa y beta ( alfa7beta7beta7alfa7 ), a este cuerpo central se le puede adicionar una subunidad reguladora denominada 19S, que corresponde a un complejo ATPasa, generando el proteasoma 26S, responsable del procesamiento de la mayoria de las protenas citoplasmticas, unidas a una proteina seal llamada ubiquitina. Este proteosoma genera pptidos con un rango entre 5 30 aminocidos, y alrededor de un 15% de ellos cae dentro del rango de 9-10 aminocidos, que poseen la longitud apropiada para unirse a las molculas MHC clase I. Bajo la influencia del interfern gamma, tres subunidades beta, denominadas X, Y y Z en el house-keeping proteasoma son reemplazadas por las subunidades homlogas LMP-7, LMP-2 y MECL-1, respectivamente y tambin se induce la unin de otra subunidad reguladora denominada 11S o PA28,

Figura 9-1. Procesamiento de antgenos endgenos. Antgenos endgenos son degradados por el Proteasoma citoplasmtico, generando fragmentos peptdicos de 8 a 9 aminocidos que sern translocados al retculo endoplsmico por el transportador TAP. En el retculo endoplasmtico la molcula MHC clase I ser ensamblada a partir de la cadena de clase I, la 2m y un fragmento peptdico especfico. En el ensamblaje participan chaperoninas como calnexina y protenas de shock trmico (hsp 60 y hsp 70).

Al parecer los cambios anteriores no tienen consecuencias drsticas en la generacin de pptidos, pero si se inducen algunas diferencias cualitativas, preferentemente en la regin carboxiterminal de los pptidos generados. Las protenas LMP tienen alguna homologa con sernproteasas, y an cuando no existe evidencia directa y convincente que muestre su actividad enzimtica, se supone que ellas se incorporan al proteasoma alterando sus propiedades catalticas de endopeptidasa, de manera tal de aumentar la generacin de algunos fragmentos peptdicos. Estudios realizados utilizando lneas celulares mutantes incapaces de generar fragmentos peptdicos, demuestran que la presentacin antignica puede restaurarse an en ausencia de las subunidades codificadas por los genes LMP del sistema principal de histocompatibilidad, indicando que no existe un requerimiento absoluto de estas protenas en la generacin de pptidos. Sin embargo, esto no descarta la posibilidad que las molculas LMP incrementen la eficacia del complejo enzimtico, generando ms frecuen-

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temente fragmentos peptdicos escindidos despus de aminocidos bsicos, cidos o hidrofbicos. Estudios realizados con inhibidores especficos del proteasoma han revelado que frente a su inactivacin se inducen o se hacen evidentes mecanismos proteolticos compensatorios de la prdida de actividad del proteasoma, que pueden corresponder a complejos proteicos semejantes o a sistemas de endo y exopeptidasas. El sitio preciso donde los pptidos generados en el citoplasma se unen a las molculas MHC es el retculo endoplsmico. El tratamiento de clulas con Brefeldina A (metabolito de hongos que bloquea el transporte de protenas desde el retculo endoplsmico al Golgi) o con la protena E19 derivada de citomegalovirus (que retiene molculas MHC clase I en el retculo), bloquean o interfieren la presentacin antignica. Los fragmentos peptdicos generados por el complejo multienzimtico deben ser translocados desde el citoplasma al retculo donde se unirn a las molculas MHC clase I, para su transporte a la superficie celular a travs de la va exoctica (figura 9-2). La evidencia experimental sugiere la participacin de transportadores dependientes de ATP y codificados por los genes TAP-1 y TAP-2 localizados en las proximidades de los genes de clase II del MHC. Las protenas TAP-1 y TAP-2 se asociaran formando un heterodmero transportador en la membrana del retculo endoplsmico. La transfeccin del gen TAP-2 en la lnea celular RMA-S y de los genes TAP-1 y TAP-2 en la lnea LBL 721.174 restablece la expresin de las molculas MHC clase I y la adecuada presentacin de antgenos. La molcula MHC clase I est constituda por una glicoprotena integral de membrana (cadena pesada de 45 kDa) que est asociada no covalentemente con una subunidad soluble de 12 kDa, la -2 microglobulina, (2m) que no est codificada por genes MHC y se encuentra normalmente libre en el plasma y fludos tisulares (ver captulo 8). La cadena pesada alfa contiene 3 dominios extracelulares, dos de los cuales (-1 y -2) forman la regin o bolsillo de unin para el fragmento peptdico. El tercer dominio (-3), contiene una regin para el reconocimiento o interaccin con el co-receptor CD8 del linfocito T citotxico, y una regin para la unin no covalente con 2m. Tanto la cadena como la 2m de la molcula MHC clase I se sintetizan en ribosomas

Figura 9-2. Trfico antignico y presentacin de pptidos endgenos. En el contexto de MHC de clase I. En el retculo endoplsmico la molcula MHC clase II correctamente ensamblada a partir de la cadena , 2m y un fragmento peptdico, es transportado al Golgi y desde aqu presentado a un LT CD8+, en el contexto de una molcula MHC clase I. LMP, Low molecular mass protein; TAP, Transporter associated with Antigen Processing.

asociados al retculo endoplsmico y pueden por lo tanto ensamblarse en el lumen del retculo. Sin embargo, la evidencia experimental sugiere que la unin de un fragmento peptdico es un prerequisito necesario para la conformacin y ensamblaje estable de la molcula clase I y, en la mayora de los casos, slo el complejo trimolecular estable (pptido-cadena -2m) abandona el retculo endoplsmico para completar su glicosilacin en el Golgi y luego viajar a la superficie celular por la va exoctica. Las molculas MHC clase I, libres o mal ensambladas seran retenidas por protenas residentes en el retculo endoplsmico (como la protena p88 o calnexina), previniendo su degradacin y mantenindolas en una conformacin compatible con el ensamblaje adecuado. La calnexina parece funcionar como molcula chaperona o chaperonina, para el plegamiento o conformacin estable de diversas protenas, incluyendo los TCR y las inmunoglobulinas. Si clulas de Drosophila melanogaster (que carecen de molculas MHC, 2m y TAP), se transfectan con los genes

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para molculas MHC clase I y de 2m, se encuentra que estas clulas son capaces de expresar en su superficie, el complejo MHC-2m o molculas MHC libres. Si adems de los genes MHC y 2m, las clulas se transfectan tambin con el gen para calnexina, las molculas MHC son retenidas en el retculo mediante asociacin con calnexina y por lo tanto, no se expresan en la superficie celular. Las chaperoninas cumplen un rol fundamental en la estabilidad de diversas protenas, impidiendo su agregacin y favoreciendo un adecuado plegamiento, ensamblaje y retencin en diversos compartimientos celulares. La interaccin de las molculas MHC con chaperoninas residentes en el retculo endoplsmico asegura que distintas molculas MHC unan fragmentos pptidicos en el compartimiento celular adecuado. Por otro lado, chaperoninas citoslicas de la familia de las protenas de shock trmico de 60 kDa (hsp 60) y de 70 kDa (hsp 70), el heterodmero transportador TAP, calnexina y tapasina aseguran el transporte y asociacin de los pptidos adecuados a las molculas MHC de clase I (figura 9-2). Tapasina es una protena transmembrana de 48 kDa, con una seal de retencin en el retculo endoplsmico. Esta chaperona se une a la molcula MHC clase I y sirve de nexo para asociarse al complejo TAP. Habitualmente 4 complejos MHC I-Tapasina se unen a un transportador TAP, de manera de concentrar el nmero de molculas MHC vacas en el lugar de entrada de los pptidos. Esta molcula, aparte de actuar como chaperona en el ensamblaje y retencin de las MHC I, probablemente tambin participa como editora de pptidos, con una funcin semejante a lo que realiza la protena DM en relacin a las molculas MHC clase II. Se supone adems la existencia de un transportador, distinto de TAP, pero dependiente tambin de ATP, encargado del reflujo retrgado de fragmentos peptdicos desde el retculo al citosol, para mantener un bajo nivel de pptidos en el retculo endoplsmico y favorecer la unin a las molculas MHC, de los fragmentos peptdicos que presentan mayor afinidad. La glicosilacin de fragmentos peptdicos en el retculo o su asociacin con una molcula MHC clase I, evitara el reflujo retrgado de pptidos al citosol. Ahora bien, an cuando el heterodmero TAP transporta preferentemente fragmentos peptdicos de 8 a 10 aminocidos, ello no impide que pptidos de hasta 30 aminocidos puedan ser eficientemente transportados desde el citosol al retculo

endoplsmico. Al parecer ms que el tamao del pptido lo que importa para un transporte adecuado desde el citosol, es la naturaleza del extremo carboxiterminal del fragmento peptdico. As en humanos, el heterodmero TAP es permisivo para el transporte de pptidos con cualquier extremo carboxi-terminal, excepto si este contiene prolina y probablemente glicina, existiendo molculas MHC que unen preferentemente pptidos con extremos polares y otras que unen preferentemente pptidos con extremos carboxi-terminal hidrofbicos. En ratones en cambio, TAP parece restringido a fragmentos peptdicos con extremo carboxi-terminal hidrofbico. En resumen, una molcula MHC clase I madura y correctamente ensamblada consiste de 3 subunidades: la cadena MHC, la 2m y el fragmento peptdico alojado en el bolsillo de unin formado por los dominios -1 y -2 de la molcula MHC. La unin del pptido adecuado induce pequeos cambios conformacionales en la molcula MHC, lo que permite la disociacin de las protenas chaperonas. Este complejo trimolecular es fundamental no slo para el correcto ensamblaje de la molcula MHC de clase I, sino tambin para su glicosilacin en el Golgi, transporte efectivo por la va exoctica y expresin en la superficie celular. As clulas que carecen de 2m o del transportador TAP, acumulan en el retculo cadenas MHC o complejos MHC-2m, respectivamente.

7. PROCESAMIENTO DE ANTGENOS EXGENOS Antgenos proteicos exgenos internalizados mediante interaccin ligando-receptor o en fase fluda mediante vesculas membranosas (en procesos de fagocitosis, pinocitosis o endocitosis), sern procesados en un compartimiento acdico celular (fagolisosoma endolisosoma) y los fragmentos peptdicos all generados, sern luego asociados a una molcula MHC clase II para su transporte y presentacin en la superficie celular (figura 9-3). Las molculas MHC clase II son heterodmeros glicoproteicos constituidos por una cadena alfa de 33 kDa y una cadena beta de 28 kDa, sintetizadas en ribosomas asociados al retculo endoplsmico y ensambladas en el lumen del mismo (ver captulo 8). Al igual que las molculas de clase I, el ensamblaje de las molculas MHC clase II requiere

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Figura 9-3. Procesamiento de antgenos exgenos y presentacin en el contexto de molcula MHC clase II. En el retculo endoplsmico las molculas MHC de clase II son ensambladas a partir de las cadenas a y b, y la cadena invariante Ii. La asociacin de la cadena Ii bloquea el bolsillo peptdico de la molcula de clase II, adems asegura su transporte a travs de la va endoctica al compartimiento acdico celular. Aqu se realiza el procesamiento de los antgenos exgenos y se realiza adems la digestin parcial de la cadena Ii, dejando el pptido CLIP alojado en el bolsillo antes citado. La molcula DM que es transportada por la va endoctica en forma independiente, participa en el desplazamiento de CLIP y en la unin de un fragmento peptdico exgeno al bolsillo MHC de clase II. El complejo MHC clase II pptico es luego transportado a la superficie celular para su presentacin a un LT CD4+.

la interaccin con diversas chaperoninas, entre las que se destaca la denominada cadena invariante gamma o cadena invariante Ii. La protena Calnexina y chaperoninas de las familias de protena de shock trmico hsp 70 y hsp 90 favorecen el ensamblaje de las cadena y de la molcula clase II, pero el rol ms importante en este proceso lo desempea la cadena invariante Ii. La cadena invariante Ii no slo favorece el ensamblaje del heterodmero -, sino que tambin impide que pptidos endgenos puedan unirse al bolsillo de las molculas clase II y desva o dirige el transporte del complejo trimolecular (alfa-beta-Ii) hacia la va endoctica celular donde estn siendo generados los pptidos exgenos. El ensamblaje de las molculas MHC clase I

ocurre completamente en el retculo endoplsmico, mientras el ensamblaje de las molculas clase II se realiza en 2 etapas: (a) la primera ocurre en el retculo endoplsmico e implica la participacin de calnexina para la asociacin de las cadenas MHC alfa y beta entre si y con la invariante Ii. (b) La segunda etapa del ensamblaje de la molcula de clase II ocurre en el compartimiento acdico celular e implica la participacin de un heterodmero proteico denominado molcula DM (molcula asociada a la regin D, de clase II en el HLA humano), que favorece tanto la digestin parcial y remocin de la cadena invariante Ii del bolsillo de la molcula de clase II, como la asociacin de un fragmento peptdico exgeno a esta molcula MHC. La protena Calnexina retendr en el retculo endoplsmico las cadena y de las molculas clase II, si no se logra un correcto ensamblaje del complejo trimolecular (--Ii). El bajo pH del compartimiento endoctico es fundamental para el procesamiento antignico y el ensamblaje final de las molculas clase II. As, drogas lisosomotrpicas (primaquina, cloroquina, monosina, cloruro de amonio) que elevan el pH del compartimiento endoctico, inhibirn la presentacin antignica en el contexto de molculas MHC clase II. La cadena invariante Ii es una glicoprotena de membrana, no polimrfica, codificada en el cromosoma 5 humano y en el cromosoma 18 murino. Presenta 4 formas de distinto peso molecular (31, 33, 41 y 43 kDa) generadas por una combinacin de procesamiento alternativo del transcrito primario y el uso de distintos sitios de iniciacin de la sntesis proteica. Todas estas formas de la cadena invariante Ii poseen un extremo o dominio carboxiterminal, de 20 aminocidos, que se une y bloquea el bolsillo peptdico de clase II impidiendo as la asociacin de pptidos endgenos. Adems, en la cola citoplasmtica aminoterminal presentan una secuencia seal de 30 aminocidos que dirige el transporte a la va endoctica, del complejo MHC clase II-Ii, correctamente ensamblado en el retculo endoplsmico. En ausencia de la cadena invariante Ii, las molculas MHC clase II pueden eventualmente unir pptidos endgenos en el retculo endoplsmico, pero su transporte y expresin en la superficie celular se har a travs de la va exoctica, como ocurre con la presentacin antignica en el contexto de molculas MHC clase I. La cadena invariante, una vez sintetizada en

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el retculo endoplsmico, forma homotrmeros que se ensamblarn con 3 heterodmeros - de clase II. De esta manera, el ensamblaje adecuado de la molcula de clase II en el retculo endoplsmico, implica en realidad la formacin de un nonmero proteico contitudo por 3 trmeros (--Ii). El nonmero es entonces dirigido al complejo de Golgi y desde aqu el extremo amino terminal de la cadena invariante Ii desviar o dirigir el transporte del complejo al compartimiento acdico o endoctico celular, denominado MIIC (MHC class II Compartment). El bajo pH y la accin de cisten proteasas (principalmente las catepsinas S y L del compartimiento endoctico), no slo favorecen la degradacin o procesamiento de los antgenos exgenos, sino tambin la digestin parcial del extremo carboxilo de la cadena invariante Ii. Se genera as un fragmento peptdico, que incluye los residuos aminoacdicos 81 al 104 de Ii, denominado CLIP ("Class II-associated invariant-chain peptide"), que permanecer unido al bolsillo del heterodmero de clase II. El heterodmero proteico DM, anteriormente mencionado, estara involucrado en la liberacin del pptido CLIP del bolsillo de las molculas MHC de clase II y en la edicin de los fragmentos peptdicos que se unirn a la mollula MHC. En ausencia del heterodmero DM, molculas de clase II conteniendo el pptido CLIP se expresarn en la superficie celular. La molcula DM humana (denominada molcula M en el ratn) est codificada por genes de la regin de clase II del Complejo Principal de Histocompatibilidad (genes HLA-DMA y HLADMB en humanos y, genes Ma, Mb1 y Mb2 en ratn). Su sntesis se realiza en ribosomas asociados al retculo endoplsmico, pero su ensamblaje y transporte final al compartimiento endoctico celular, se realizara en forma independiente del complejo molcula MHC clase II-cadena invariante Ii. Los pptidos derivados de protenas endgenas son altamente promiscuos y por lo tanto capaces de ser presentados por una gran variedad de molculas MHC de clase II. De este modo las molculas de clase II pueden unirse a un rango ms amplio de pptidos en el compartimiento endoctico, que las molculas MHC de clase I, en el retculo endoplsmico rugoso. Es en el compartimiento endoctico donde se encuentra la molcula DM, que acta editor peptdico, favoreciendo la presentacin de pptidos de mayor afinidad y estabilidad. Las molculas DM parecen funcionar: (a) removiendo el pptido CLIP (Class

II associated Ii peptide) del bolsillo peptdico de las molculas de clase II y (b) estabilizando los heterodmeros MHC de clase II vacos o sin pptido. Esta estabilizacin previene la agregacin y subsecuente degradacin que sufren estos heterodmeros MHC, en ausencia del fragmento peptdico. De este modo las molculas DM juegan un rol crucial en la presentacin de antgenos exgenos.

8. PRESENTACIN ALTERNATIVA DE PPTIDOS Pptidos endgenos pueden tambin presentarse en el contexto de molculas MHC clase II. Esto puede explicarse por: (a) pptidos endgenos compiten con la cadena invariante Ii por el bolsillo de unin del heterodmero de clase I, (b) pptidos endgenos, generados en el citoplasma, pueden translocarse al compartimiento acdico celular, para su asociacin con molculas de clase II, (c) protenas endgenas que han sido secretadas o que se expresan en la membrana celular, pueden ser internalizadas y luego procesadas en el compartimiento acdico celular y (d) autofagia de componentes celulares a partir del retculo endoplsmico y su transporte, por va endoctica, al compartimiento acdico celular. De manera alternativa, pptidos exgenos pueden presentarse asociados a molculas clase I. Este fenmeno ocurre cuando fragmentos pptidicos o protenas exgenas escapan del compartimiento endoctico DIC y luego de su degradacin por la maquinaria citoslica de procesamiento antignico, son translocados al retculo endoplsmico para su asociacin a molculas MHC clase I. Algunas bacterias intracelulares secretan lisinas de membrana que favoreceran el escape de antgenos o fragmentos peptdicos exgenos desde el compartimiento endoctico al citoplasma de la clula presentadora de antgeno.

LECTURAS SUGERIDAS Amigorena, S.; Webster P., Drake, J.; Newcomb, J.; Cresswell, P. and Mellman I., Invariant chain cleavage and peptide loading in MHC class II vesicles. J. Exp. Med. 181:1729-1741, 1995.

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Brocke, P., Garbi, N., Momburg, F. and Hammerling G. J. HLA-DM, HLA-DO and tapasin: functional similarities and differences, Curr. Opin. Immunol. 14: 22-29, 2002. Cresswell P., Assembly, transport and function of MHC class II molecules, Ann. Rev. Immunol. 12:259-293, 1994. Denzin, L. K. and Cresswell, P., HLA-DM induces CLIP dissociation from MHC class II alpha-beta dimers and facilitates peptide loading, Cell 82:155-165, 1995. Fing, S. P.; Arp, B. and Pious, D., HLA-DMA and DMB genes are both required for MHC class II/peptide complex formation in antigen-presenting cells, Nature 368:554-558, 1994. Germain, R.N., MHC-dependent antigen processing and peptide presentation: Providing ligands for T lymphocyte activation, Cell 76:287-299, 1994. Hitbold, E.M. and Roche, P.A., Trafficking of MHC-cxlass II molecules in the late secretory pathway, Curr. Opin. Immunol. 14: 30-35, 2002. Howard, J.C., Supoly and transport of peptides presented by class I molecules, Current Opinion Immunol 7:69-76, 1995. Lennon-Dumnil, A.M.; Bakke, A.H.; WolffBryanty, P.; Ploegh, H.L. and Lagaudrieri-Gesbert, C., A closer look at proteolysis and MHC-class II-restricted antigen presentation, Curr. Opin. Immunol. 14: 15-21, 2002. Malcherek, G.; Gnau, V.; Jung, J.; Rammensee, H. G. and Melms, A. Supermotifs enable natural invariant-chain derived peptides to interact with many major histocompatibility complex-class II molecules, J. Exp. Med. 181:527-536, 1995. Matsuda, J.L. and Kronenberg, M., Presentation of of self and microbial lipids by CD1 molecules, Curr. Opin. Immunol. 13: 19-25, 2001. Morris, P.; Shaman, J.; Attaya, M.; Amaya, M.; Goodman, S.; Bergman, C.; Monaco, J.J. and Mellins, E., An essential role for HLA-DM in antigen presentation by class II major histocompatibility molecules, Nature 368:551-554, 1994.

Rammensee, H.G., Chemistry of peptides associated with MHC class I and class II molecules, Curr. Opin. Immunol. 7:85-96, 1995. Reisse Sousa, C., Dendritic cell as sensors of infections, Immunity 14:495-498, 2001 Sadavisan, B.; Lehner, P.; Ortmann, B.; Spies, T. and Cresswell, P., Roles for calreticulin and a novel glycoprotein, tapasin, in the interaction of MHC class I molecules with TAP, Inmunity. 5:103-114, 1996. Settle, A.; Southwood, S.; Miller, J. and Appella, E., Binding of major histocompatibility complex class II to the invariant chain derived peptide, CLIP, is regulated by allelic polymorphism in class II, J. Exp. Med. 181:677-683, 1995. Watts, C., Antigen processing in the endocytic pathway, Curr. Opin. Immunol. 13: 26-31, 2001. Williams, D.B. and Watts, T.H., Molecular chaperones in antigen presentation, Curr. Opin. Immunol. 7:77-84, 1995. Yewdell, J. and Bennink, J., Cut and Trim: generating MHC class I-peptide ligands, Curr. Opin. Immunol. 13:13-18, 2001.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 10
ACTIVACIN DE LOS LINFOCITOS

Javier Puente P.

1. Introduccin 2. Activacin de los linfocitos T 2.1. Relacin estructura-funcin del complejo TCR 2.2. Secuencias de activacin en el TCR-CD3 y cadenas 2.3. Protenas tirosina quinasas en la activacin de los LT 2.4. Protenas adaptadoras en la activacin de los linfocitos 2.5. Modelo general de activacin de los LT 3. Activacin de los linfocitos B 3.1. Secuencias de activacin en el BCR y sub-unidades asociadas 3.2. Modelo general de activacin de los LB 4. Activacin de las clulas NK 4.1. Modelo de activacin de las clulas NK

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RESUMEN El reconocimiento de los antgenos por parte de los receptores especficos de los linfocitos B y T, BCR y TCR respectivamente, es el evento que inicia la etapa de activacin. El TCR (), une especficamente al antgeno peptdico procesado ligado a las molculas de MHC (clase I o II). El heterodmero de localizacin mayoritariamente extracelular, est asociado en forma no covalente a un complejo de protenas de membrana denominado CD3- cuyos componentes estn localizados mayoritariamente en el extremo citoplasmtico. Participan en la unin adems los co-receptores CD4 o CD8, que se unen a determinantes no polimrficos de los MHC clase II y clase I respectivamente. Una de las principales caractersticas estructurales de los componentes del complejo CD3- es la presencia de secuencias aminoacdicas que contienen residuos de tirosina (ITAM) que pueden ser fosforilados por PTK. Esta accin de las PTK ocurre slo bajo las condiciones de la interaccin TCR, y estructuras asociadas, con el antgeno. Las secuencias ITAM estn presentes en todas las sub-unidades del complejo CD3- y estando fosforiladas pueden interactuar con otras secuencias aminoacdicas del tipo SH2 presentes en diversas PTK citoplasmticas como Zap-70, lo que permite una masiva fosforilacin de protenas adaptadoras citoslicas y de membrana y de enzimas. Las enzimas fosforiladas se activan y en estas condiciones fosforilan a otros sustratos celulares propagando la seal, proceso que se encarga de asociar el fenmeno de membrana con el citosol y el ncleo celular generando los cambios caractersticos en la expresin gnica. Una de las protenas activadas por fosforilacin es la fosfolipasa C1 o C2 que permite la generacin de los segundos mensajeros IP3, Ca2+, DAG y la posterior activacin de determinadas PK-C; estos primeros eventos son fundamentales para la respuesta proliferativa y efectora del respectivo LT. Otra interaccin importante ocurre entre CD28 (LT) : B7.1, B7.2 (CPA); esta interaccin aporta una segunda seal prcticamente obligatoria para una ptima activacin de los LT. El BCR, estructuralmente una Ig de membrana de localizacin principalmente en el extremo extracelular, se encuentra asociado a sub-unidades (Ig, Ig) que poseen secuencias ITAM. La interaccin del antgeno con el BCR y estructuras asociadas, que tambin poseen este tipo de secuencias permite el traspaso de la seal hacia el interior celular. Para ello como en el caso del TCR, el LB posee PTK unidas a membrana y citoslicas como la p72syk que pueden interactuar con los dominios ITAM fosforilados a travs de las secuencias SH2 y otro tipo de quinasas como la PI-3 quinasa que puede interactuar con las secuencias del tipo SH2 y SH3. Participan tambin protenas adaptadoras citoslicas que permiten agrupar una gran diversidad de protenas y enzimas en la superficie celular. Una de las enzimas activadas por fosforilacin unida a una protena adaptadora, es la FL-C que cataliza la hidrlisis del PIP2, la generacin de los segundos mensajeros y la activacin de la PK-C y calcineurina en forma similar a los LT. Estos eventos iniciales permiten la activacin de otras seales que actan a nivel del ncleo celular promoviendo los cambios en la expresin gentica tpicos de este tipo de linfocitos. La activacin de las clulas NK, tanto la ADCC como la citotoxicidad natural, ocurre a travs de la interaccin de receptores como FcIIIR (CD16) con la fraccin Fc de inmunoglobulinas o de los receptores NCR con sus ligandos, resulta tambin en una propagacin de la seal a travs de dominios ITAM fosforilados. En las clulas NK se han descrito tambin PTK de la familia src y syk y protenas adaptadoras de membrana y citoslicas. La activacin de los receptores CD16 y NCR, ambos asociados a sub-unidades de tipo y DAP12 presentan fosforilacin de secuencias ITAM y la generacin de los mismos segundos mensajeros ya sealados. La descripcin de un gran conjunto de receptores de inhibicin, de la familia de las inmunoglobulinas (KIR) y lectinas (CD94-NKG2A) que reconocen segmentos conservados de los complejos MHC-I, representan uno de los aspectos fundamentales del control de su funcionalidad.

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INTRODUCCIN

Los linfocitos B y T, pertenecientes a la respuesta inmunolgica especfica, tienen la capacidad de reconocer y discriminar, entre una vasta diversidad de estructuras, a aquellas que son agentes extraos para el organismo vertebrado, especialmente de carcter infeccioso. Para llevar a cabo estas funciones poseen receptores altamente especficos en su superficie para el reconocimiento de los antgenos: el receptor de antgenos de los linfocitos B (BCR) y el receptor de antgenos de los linfocitos T (TCR). Cada precursor linfocitario reordena exclusivamente sus genes nicos para estos receptores y los linfocitos maduros permanecen en estado quiescente en la ausencia de antgeno. El contacto del antgeno especfico con estos linfocitos induce en stas clulas un estado denominado activacin, que implica su expansin en nmero, y en el caso de los LB la produccin de anticuerpos y de los LT la adquisicin de funciones efectoras tales como citotoxicidad y secrecin de mediadores de la respuesta inmune denominadas citoquinas. Adems del receptor especfico, intervienen otras molculas de superficie denominadas co-receptores, molculas de adhesin, receptores de molculas co-estimuladoras; participando no solamente en la estabilizacin de la interaccin antgeno-receptor, sino tambin en la generacin de las seales bioqumicas caractersticas del proceso de activacin o de inhibicin de los linfocitos. La especificidad de esta respuesta est influida tambin por la localizacin de los mediadores participantes en zonas lipdicas especficas de la membrana plasmtica. Aun cuando entonces, la respuesta a un antgeno es comnmente denominada activacin, este trmino refleja toda la complejidad del proceso, que abarca desde la generacin de las primeras seales bioqumicas, transduccin de seales y la produccin de segundos mensajeros, hasta cambios en la expresin gentica y la morfologa y funcionalidad de los linfocitos. En el presente captulo se analizarn aquellos aspectos estructurales de los receptores y dems molculas accesorias involucradas en el contacto con el antgeno respectivo y cmo esta situacin inicia la serie de eventos bioqumicos que se encargan de la inter-comunicacin entre un fenmeno de membrana con el citosol y ncleo celular. Para ello es indispensable aclarar

como tanto el BCR y TCR en conjunto con sus molculas asociadas, que no poseen actividad enzimtica transmiten una seal hacia el interior celular; cmo diversas enzimas protena quinasas, bajo las determinadas condiciones de la interaccin del antgeno con su receptor, son capaces de interaccionar con los extremos citoslicos de las sub-unidades de las molculas asociadas y activarse fosforilando una serie de sustratos de membrana e intracelulares, especialmente enzimas y protenas adaptadoras, que finalmente van a permitir la comunicacin con el ncleo celular. Los linfocitos B y T tienen receptores oligomricos antignicos que reconocen fundamentalmente distintas formas de los antgenos. Los LB para proteccin de patgenos extracelulares; sus receptores tpicamente reconocen formas nativas o desnaturadas de protenas y carbohidratos ya sea solubles, particuladas o unidas a clulas. En contraste los LT protegen contra patgenos intracelulares, el TCR reconoce pptidos antignicos proteolticamente procesados (8-15 residuos) unidos a molculas del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) de la clula presentadora de antgenos (CPA). Sin embargo, la transduccin de seales que resulta de la interaccin de cada receptor con su antgeno son muy similares. Las clulas NK, pertenecientes a la respuesta inmunolgica innata, pueden tambin reconocer ligandos. Por ejemplo el receptor CD16 (RFcIII) de las clulas NK une al fragmento Fc de inmunoglobulina G, y de esta forma las clulas se activan utilizando mecanismos bioqumicos similares a los de los LB y LT. Los tres grandes sistemas de integracin de los organismos pluricelulares complejos son los sistemas: endocrino, nervioso e inmunolgico, cada uno de ellos responde a una variedad de seales o mensajes caractersticos. Sin embargo, los mecanismos bioqumico-moleculares involucrados son universales; en este caso los receptores de membrana (BCR y TCR), al interaccionar con el antgeno y el receptor CD16 de las clulas NK al interactuar con su ligando, activan vas mediadas por protena quinasas, quinasas de lpidos, protenas adaptadoras de membrana y citoslicas permitiendo la hidrlisis del fosfolpido de membrana fosfatidil-inositol (PIP2) a travs de una isoenzima de la fosfolipasa C y la generacin de los segundos mensajeros, inositol-trisfosfato (IP3), diacilglicerol (DAG) y

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Ca2+. Estos son tambin segundos mensajeros de la accin de hormonas y de factores de crecimiento (sistema endocrino) y neurotrasmisores (sistema nervioso). 2. ACTIVACIN DE LOS LINFOCITOS T 2.1. Relacin estructura-funcin del complejo TCR. El inmuno-receptor TCR es un oligmero complejo compuesto de los productos de seis genes (figura 10-1) (ver captulo 7), todos ellos requeridos para una eficiente expresin en la membrana plasmtica. Las cadenas y forman la sub-unidad de unin al ligando, responsable del reconocimiento de un pptido antignico unido a molculas de los complejos mayores de histocompatibilidad clase I o clase II de la clula presentadora, propagndose una respuesta que implica una interaccin cooperativa entre el TCR, el complejo CD3 y las sub-unidades (que pueden existir como dmeros o heterodmeros). Tanto el receptor como diversas protenas que participan en la activacin de los LT, se encuentran ubicadas en zonas lipdicas especficas de la membrana plasmtica (ZLE), denominadas tambin GEM (micro-dominios enriquecidos en glico-lpidos), cuya composicin bioqumica es diferente a la del resto de la membrana. Estos dominios estn enriquecidos en colesterol y esfingolpidos y pueden ser experimentalmente visualizados en la clula y purificados para su estudio in vitro.

estimuladoras como CD28 (CTLA-4), ICOS, CD40L, 4-1BB, OX40; muchas de stas son inducidas post-contacto con la CPA y molculas de adhesin como CD2, CD5 y LFA-1 (figura 10-2). Este evento de unin entonces le permite, durante el desarrollo de las clulas T, entrar a seleccin positiva o bien a apoptosis, entrar al ciclo celular, producir citoquinas o adquirir una funcin efectora citoltica. Por lo tanto, todas las responsabilidades de las clulas T estn radicadas en su TCR y en las estructuras accesorias. La interaccin estable entre el TCR y el antgeno presentado ha sido denominada tambin sinapsis inmunolgica, que implica tanto la interaccin como la propagacin de una seal hacia el interior de la clula.

Figura 10-2. Representacin esquemtica de algunas de las interacciones moleculares que ocurren durante el reconocimiento antignico en la interfase de un LT y una CPA. En este caso es un LT CD4, en el que las molculas CD40L y CTLA-4 son inducidas por el contacto con la CPA, las restantes molculas de superficie del LT son constitutivas.

Figura 10-1. Estructura de los receptores de los linfocitos T, B y NK. TCR, BCR, FcIIIR (CD16), NKp46 (NCR) y de los receptores de inhibicin CD94/NKG2A y KIR2DL4 y de sus sub-unidades. El nmero de las sub-unidades y sus asociaciones puede variar de acuerdo a la funcin celular. Las lneas interconectoras representan puentes dislfuro. Los rectngulos negros representan secuencias ITAM (motivos o secuencias de activacin basados en tirosina del inmuno-receptor) y los rectngulos achurados, secuencias ITIM (motivos o secuencias de inhibicin basados en tirosina del inmuno-receptor).

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2.2. Secuencias de activacin en el TCR-CD3 y cadenas . Como se puede apreciar de la figura 10-1, las sub-unidades y , responsables de la unin al antgeno, tienen una estructura mayoritariamente extra-citoplasmtica, lo que avala muy bin la funcin de unin. Sin embargo, ya a nivel estructural es posible descartarles una funcin importante en cuanto a la transduccin de la seal, encontrndose por lo tanto ambas funciones en forma separada. La funcin de transduccin de seales la cumplen el complejo CD3 y las sub-unidades , que tienen una parte importante de su estructura en la zona citoplasmtica, especialmente las sub-unidades . La relevancia de CD3 y cadenas ha quedado de manifiesto al usar mutantes que carecen de algunas de estas sub-unidades con la consecuente alteracin en la activacin de los LT. Analizando ms detalladamente ahora la estructura primaria del complejo CD3-, se pudo determinar que poseen secuencias de consenso en todas las sub-unidades, encontrndose incluso repetidas en las subunidades . Estas secuencias de consenso que incluyen dos tirosinas son: YXX(L/I)X(7-8)YXX(L/ I), del cdigo de aminocidos de una letra, siendo X cualquier aminocido. Estas secuencias (tabla 10-1), se encuentran en muchas otras protenas con caractersticas similares a las descritas, no soportan mutaciones y constituyen en la actualidad un conocimiento clave para el entendimiento de la activacin de los linfocitos. La nomenclatura para definirlas se basa en que constituyen una secuencia o motivo de activacin de reconocimiento del antgeno, secuencia que posee residuos de tirosina y leucina (o isoleucina) en posiciones caractersticas. En la actualidad se conocen estas secuencias como ITAM (motivo de activacin basado en tirosinas del inmuno-receptor). Un primer hecho relevante de los ITAM, es que son fosforilados los residuos de tirosina a consecuencia de la unin del antgeno especfico al TCR, situacin que temporalmente ocurre en el orden de unos pocos segundos (5 a 30 s); mutantes en tirosina son inactivos. En segundo lugar ni el TCR ni ninguna de las sub-unidades hasta ahora analizadas posee una actividad fosforilante en tirosina, tpica de las enzimas protenas tirosina quinasas (PTK) por lo que deben actuar PTKs celulares especficas, siendo el proceso de la fosforilacin un evento determinante en la secuencia de activacin, pues adems de las sub-unidades descritas, se fosforilan, ro abajo, una serie de otras protenas celulares, especialmente en residuos de tirosina.

Tabla 10-1. Secuencias ITAM h1 hCD3 hCD3 hCD3 mIg mIg YNE LNLGRR E EYDVL YQP LKDR EDDQY S HL YE P 1 RKGQRDLY S GL YQP L RDRDDAQY S HL Y E G L N L D D C S MY E D I YEGLNYDQTATYED I

2.3. Protenas tirosina quinasas en la activacin de los LT. Hasta ahora se han descrito tres familias diferentes de protenas tirosina kinasas (Src, Syk y Tec) en la activacin de los LT. Las PTK no forman parte del receptor TCR ni de sus sub-unidades asociadas. Dos de las ms importantes PTKs asociadas a este receptor pertenecen a la familia de protenas src. La oncoprotena viral v- src fue la primera PTK descrita; identificndose posteriormente una amplia variedad de enzimas en todo tipo de organismos que comparten un alto grado de similitud estructural con esta oncoprotena, incluyendo dominios estructurales y regulatorios. Estructuralmente las PTK de la familia src consisten de uno o ms sitios de acilacin en el extremo amino-terminal, requeridos para su localizacin en la membrana plasmtica en la zona lipdica especfica; un dominio nico (que define a cada uno de sus miembros) una homologa src SH3, dominio que tiene una alta afinidad por secuencias aminoacdicas ricas en prolina; una homologa src SH2, dominio con una alta afinidad por secuencias aminoacdicas que contengan tirosinas fosforiladas; un dominio cataltico, responsable de la actividad enzimtica fosforilante y una secuencia regulatoria en el extremo carboxilo terminal (figura 10-3a). Las PTK de la familia src que en forma ms consistente aparecen interviniendo en el proceso de activacin de los LT son: la denominada fyn, de 59 kDa, (p59 fyn) posee dos isoenzimas una presente en el sistema inmune y otra en cerebro y la de 56 kDa (p56lck) que se expresa exclusivamente en el sistema inmune (figura 10-3a). Uno de los hechos ms importantes en la participacin de la p56lck fue la demostracin de su unin no covalente a los dominios citoplasmticos de los co-receptores de membrana CD4 o CD8. Esta directa interaccin obviamente sugiere un importante papel de esta enzima en la transduccin de seales mediada por el TCR y numerosas evi-

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Figura 10-3. Dominios estructurales de protenas que participan en transduccin de seales en los linfocitos. A) Dominios estructurales de dos familias de PTK que participan en la activacin de los linfocitos T y B. Desde el extremo amino hacia el C terminal: U, dominio nico; M, modificacin por cido mirstico; SH3 y SH2 homologas src 3 y 2, respectivamente; K, dominio quinsico; R, dominio regulado; Y, residuo de tirosina. Los sitios con residuos de tirosina fosforilables del N al C terminal pueden ser hasta tres: Y en sitio inter-dominios (SH2 y K) fosforilada, permite asociacin a otras protenas; Y fosforilada en sitio cataltico (K) estimula su actividad e Y fosforilada en el sitio regulador R, bloquea su actividad. B) Dominios estructurales de protenas adaptadoras de membrana y citoslicas: LAT, Grb2 y SLP-76; TM, dominio transmembrana; PY, dominio fosforilado en tirosina; PPPP, dominio rico en prolina.

dencias experimentales as lo confirman: clulas T en respuesta al antgeno especfico responden con un rpido y transiente aumento en la actividad de esta enzima; ratones mutantes en esta enzima, presentan un profundo defecto en el desarrollo de las clulas T, estudios in vitro con la lnea celular T Jurkat mutante en esta PTK demuestran que prcticamente no se produce el proceso de activacin en respuesta a los estmulos correspondientes. Otra caracterstica extraordinariamente interesante de la p56lck tambin reside en su estructura. Como se puede apreciar de la figura 10-3a, la enzima posee una homologa SH2 y un extremo regulador C-terminal en que un residuo de tirosina puede encontrarse fosforilado y de hecho esa situacin es la observada en el estado de reposo no estimulado. De esta forma se encuentra en la misma estructura proteica la posibilidad de interaccin entre una secuencia SH2 y una secuencia que posee una tirosina fosforilable; el hecho de encontrarse fosforilada trae como consecuen-

cia el plegamiento de la protena lo que le impide su accin cataltica. Para mantener esta situacin, existen por un lado una PTK, la Csk, que se encarga de mantener siempre fosforilado ese sitio regulador y una fosfoprotena fosfatasa especfica para residuos de tirosina fosforilados, la CD45. Esta enzima provoca la hidrlisis de ese residuo de fosfotirosina y la transforma en una PTK activa. La enzima CD45 se encuentra ampliamente distribuida en el sistema inmune. La PTK p59fyn tambin puede encontrarse asociada directamente al TCR-CD3-, especficamente se la ha encontrado asociada en forma no covalente a las sub-unidades y componentes del CD3. Presenta tambin un rpido y transiente aumento en su actividad en respuesta a la estimulacin del TCR y clulas mutantes en esta quinasa presentan una significativa reduccin en el proceso de activacin y proliferacin celular lo que sugiere un importante papel de esta enzima en la transduccin de seales en el linfocito. El descubrimiento de otras PTK fuertemente asociadas al TCR slo de clulas T estimuladas, abri la posibilidad de la existencia de una asociacin rpida y transiente de protenas de la membrana con protenas citoslicas. La PTK asociada a la sub-unidad , result ser una protena de 70 kDa, por lo que fue denominada ZAP-70 (protena asociada a la sub-unidad zeta de 70 kDa). Tambin se le ha encontrado asociada a sub-unidades CD3 y se encuentra expresada exclusivamente en clulas T y clulas NK. Nuevamente sus propiedades se explican muy bien por su estructura, es una enzima citoslica, que presenta dos homologas SH2 hacia el extremo amino-terminal de la protena y un dominio cataltico con actividad de tirosina quinasa (figura 10-3a). La enzima ZAP-70 es altamente homloga a la PTK syk de 72 kDa muy abundante en los linfocitos B y clulas mieloides, enzima que puede asociarse al BCR postulndose la funcin de nexo entre los procesos de membrana y citoslico/nucleares en ese tipo de linfocitos. Tanto Zap-70 como syk pertenecen a la familia de PTK syk. La Zap-70 es expresada a lo largo de todo el desarrollo de los linfocitos T, en cambio la syk aparece ligada ms al desarrollo temprano de los linfocitos, siendo su expresin mucho menor en los linfocitos T maduros. Ambas PTK tienen, a travs de sus dominios SH2, una alta afinidad por las secuencias ITAM fosforiladas. Ms recientemente se ha incorporado una nueva familia de PTK: Tec, cuyos principales representantes son Tec, Ikt y Txk; si bien se

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ha informado un cierto grado de redundancia en su funcionalidad utilizando ratones transgnicos, su principal funcin en la activacin es la fosforilacin de la FL-C y por lo tanto en el control de los niveles de Ca2+. 2.4. Protenas adaptadoras en la activacin de los linfocitos. El conocimiento de otro conjunto de protenas, denominadas protenas adaptadoras, en la activacin de los linfocitos ha permitido una comprensin mayor de este fenmeno. Las protenas adaptadoras se caracterizan por carecer de actividad cataltica, al menos hasta ahora conocida, y por tener la propiedad de dirigir interacciones especficas protena-protena y protena-lpido. Se ha demostrado la participacin coordinada de este tipo de protenas en conjunto con los dems eventos bioqumicos del proceso de activacin de los linfocitos. Algunos de las protenas adaptadoras ms relevantes para los LT aparecen en la figura 10-3b; se pueden apreciar algunos de los dominios estructurales que median las interacciones moleculares, adems de los dominios SH2 y SH3 ya sealados, aparecen otros como PY (sitio fosforilable en tirosina) y PPPP (sitio rico en prolina). Las protenas adaptadoras pueden ser ya sea de membrana o citoslicas, dos de las ms representativas de cada una de stas son las protenas LAT y SLP-76. La protena adaptadora de membrana LAT, descrita inicialmente en clulas Jurkat y luego en linfocitos T, clulas NK plaquetas y monocitos, pero no en los linfocitos B, representa el nexo de activacin de los linfocitos T entre los eventos mediados por el TCR y las PTK iniciales, permitiendo explicar como una gran variedad de protenas y enzimas se pueden asociar a la membrana plasmtica. LAT es una protena de membrana, posee un sitio transmembrana que le permite esta localizacin; posee adems dos residuos de cisteina cercanos al sitio transmembrana. Estos residuos pueden ser modificados por palmitoilacin lo que le permite a LAT, bajo esas condiciones, ubicarse especficamente en el rea de las ZLE. Como posee adems residuos de tirosina fosforilables (P-Y), una vez fosforilados estos sitios pueden interactuar con protenas que posean segmentos SH2 y reclutarlas a la membrana plasmtica. Esto ocurre con las enzimas fosfolipasa C (FL-C 1), fosfatidil-inositol-3quinasa (PI3-quinasa) y las protenas adaptadoras Grb2, Gads y SLP-76, entre otras. Tanto clulas mutantes en LAT, ya sea en tirosina, cistena, o deficientes en su expresin, sufren trastornos en

la activacin y maduracin. Especialmente relevantes son las mutaciones en las cisteinas que sufren palmitoilacin, en este caso LAT no puede ubicarse en la ZLE; an cuando no se altera su capacidad de unirse a la membrana, pierde su propiedad de ser fosforilada y de participar como un regulador en la transduccin de seales iniciada por el TCR. Ratones carentes del gen LAT, LAT-/, sufren una completa alteracin en la maduracin de los timocitos. La protena adaptadora SLP-76 (protena fosforilable de los leucocitos y que posee dominios SH2, es una protena citoslica 76 kDa), especfica de las clulas del sistema hematopoytico; se encuentra en los linfocitos T, clulas NK, monocitos y megacariocitos, pero no en los linfocitos B. De acuerdo a su estructura posee dominios ricos en prolina, P-Y y SH2, lo que le permite una amplia capacidad de interaccin con otras protenas. Una vez fosforilada se puede unir a las protenas adaptadoras vav, Gads y a la PTK Ikt de la familia Tec. Al igual que en el caso de LAT, ratones mutantes en SLP-76 por recombinacin homloga, provocan una completa ausencia de LT en la periferia, el resultado es mas severo que la carencia de otras protenas adaptadoras o de cualquiera de las PTK antes mencionadas, poniendo en evidencia la importancia de esta protena adaptadora en los linfocitos T. Como se ha podido apreciar, hasta este punto se han descrito protenas participantes en el proceso de activacin de los linfocitos que de una u otra manera estn ubicadas en la membrana plasmtica, ya sea como protenas integrales de sta o bien asociadas a las sub-unidades o coreceptores. Las preguntas que surgen entonces son cmo se comunican estas estructuras con el citosol y con el ncleo celular?, Si bien existen enzimas protena quinasas, cmo stas interaccionan con sus sustratos citoslicos?, Qu evento les indica a los sustratos proteicos citoslicos que se asocien en un momento determinado a la membrana y eventualmente se modifiquen por fosforilacin?. El siguiente modelo de activacin de los LT permitir responder algunas de estas interrogantes. 2.5 Modelo general de activacin de los LT. Manteniendo presente a la activacin de los linfocitos como un proceso altamente complejo, podemos con los elementos proteicos estructurales y enzimticos sealados visualizar un modelo simple de la activacin de los LT como el de la figura 10-4 (a, b). La figura 10-4a indica la situa-

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cin basal, previa a la interaccin con el antgeno. Indudablemente la especificidad de la respuesta est dada por el reconocimiento por parte del TCR del pptido antignico presentado por el MHC de la clula presentadora. Producida esta situacin (Figura 10-4b), quedan los co-receptores CD4 o CD8 dependiendo del tipo de LT, topogrficamente en posicin de interactuar con la misma molcula de MHC pero en una regin diferente a la de unin al TCR. Es decir CD4 o CD8 tambin pueden unirse al MHC, a un segmento no polimrfico, pero ese evento ocurre solamente en esta altamente restringida condicin. Bajo estas condiciones la p56lck, unida al co-receptor puede quedar ahora muy prxima a los diversos ITAM de las sub-unidades CD3-, producindose la fosforilacin masiva de estas secuencias. De este modo las molculas co-receptoras, CD4/CD8, hacen a los pptidos antignicos unidos a las molculas de MHC, activadores mucho ms eficientes de las clulas T comparados a los ligandos que se unen directamente al TCR. Esta funcin de fosforilacin tambin la pueden efectuar la PTK p59 fyn , postulndose en este caso una activacin de la enzima mediada por los cambios conformacionales siguientes a la interaccin del TCR con el antgeno. Una vez generados ITAM fosforilados, puede entrar ahora en accin una PTK como la ZAP-70, pues se satisfacen los requerimientos para una interaccin efectiva, es decir la presencia de homologas SH2 (ZAP-70) y de secuencias fosforiladas en tirosina (ITAM de las subunidades CD3). Estando ahora unida, puede a su vez ser fosforilada por las PTK de membrana ya mencionadas y de esta forma activarse y fosforilar otros sustratos celulares propagando la respuesta o bien por el hecho de estar fosforilada crear nuevos sitios de reclutamiento de protenas que posean secuencias SH2. Enzimas como la ZAP-70 pueden actuar de una manera pivotal, dependiendo del estado del linfocito; en reposo, ubicada en el citosol; en estado activado, ligada a la membrana permitiendo, en conjunto con otras enzimas activadas, el traspaso de la informacin hacia el interior celular. La localizacin de mltiples protenas en la zona lipdica especfica durante la activacin de los linfocitos aparece como un requerimiento crucial. La presencia masiva en esta zona, durante la activacin, de la protena adaptadora LAT, permite que sea fosforilada por Zap-70, lo que a su vez permite la asociacin con diversas protenas adaptadoras y con enzimas explicando de paso

Figura 10-4. Mecanismo bsico de activacin de los LT. a) Tipos celulares participantes: LT que posee el complejo TCRCD3-, co-receptores CD4 o CD8, CD45 y enzimas protena quinasas PTK intracelulares. La CPA, que posee la molcula de MHC (clase I o II) y el pptido antignico. b) Interaccin entre el pptido antignico presentado y el TCR que inicia la serie de eventos de asociacin, activacin y fosforilacin en que participan mltiples protenas celulares como PTK, PKC, fosfo-protena fosfatasas, protenas que poseen ITAM, protenas adaptadoras, que culmina con la generacin de segundos mensajeros y traspaso de la informacin al ncleo celular. El color azul de la membrana indica la zona lipdica especfica (ZLE). Los rectngulos negros de las sub-unidades del TCR corresponden a los segmentos ITAM, figura 10-4 a y b, los crculos plomos adyacentes a las secuencias ITAM y tambin encontrados en otras protenas, corresponden a la fosforilacin de esos segmentos (figura 10-4b); en el caso de las enzimas y protenas paritcipantes, los cuadrados verdes corresponden a dominios SH3, y los valos amarillos a dominios SH2.

la acumulacin de stas a nivel de la membrana plasmtica de los LT. Entre las protenas asociadas estn las isoenzimas de la fosfolipasa C (FLC) del tipo 1 o 2, la PI3-quinasa y la protena adaptadora Grb2 que inicia la va de activacin de ras. El desdoblamiento del PIP 2 (fosfatidilinositol[4,5]bisfosfato), formando los productos IP3 (inositol[1,4,5]trisfosfato) y DAG (diacil-gli-

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cerol) por parte de la FL-C es un hecho ampliamente descrito en la literatura, este tipo de enzimas puede ser activado ya sea por protenas de tipo G, la isoenzima FL-C; o por fosforilacin en residuos de tirosina, como es el caso de las isoenzimas FL-C. En el proceso de activacin de los LT se ha observado hasta ahora, la participacin solamente de isoenzimas del tipo C. Un anlisis muy somero de la estructura de estas ltimas, nos revela adems de la existencia de secuencias que pueden ser fosforiladas, la existencia de secuencias tipo SH2, que le permiten por lo tanto interactuar con secuencias fosforiladas (en este caso de LAT), y de esta manera formar parte de la va de activacin. La FL-C1 en estas condiciones es activada por fosforilacin a travs de la PTK Ikt. La FL-C1 cataliza la hidrlisis del fosfolpido de membrana PIP2 generando los segundos mensajeros IP3 y DAG. Estos segundos mensajeros, inducidos a partir del TCR, son los responsables del muy rpido y persistente aumento en el Ca2+ citoslico y de la activacin de la enzima pivotal protena quinasa C de la cual existen ms de una docena de isoenzimas, siendo las ms importantes en los LT justamente las dependientes de Ca2+ y DAG (isoenzimas y ). Las PK-C activadas pueden actuar fosforilando, en serina/treonina, una serie de sustratos proteicos propagando de este modo la seal. La enzima PI 3-quinasa, tambin se asocia a LAT fosforilado, y genera a partir del del PIP 2 el producto PIP 3 (fosfatidilinositol[3,4,5]trisfosfato) que es un activador de la PKC, reforzando el papel de estas isoenzimas. El aumento del Ca2+ intracelular y activacin de la PK-C son eventos claves en la respuesta tanto de los linfocitos T y B. La elevacin del Ca 2+ intracelular adems de activar directamente a enzimas, conduce a la interaccin de este metal bivalente con la protena moduladora dependiente de calcio, denominada calmodulina; el complejo calmodulina calcio produce por interaccin protena:protena la activacin de diversas enzimas, entre stas la calcineurina, una fosfoprotena-fosfatasa (serina/treonina) que desfosforila al factor de activacin de la transcripcin (NFAT) citoslico, que bajo estas condiciones ingresa al ncleo y participa en la expresin del gen para IL-2, citoquina vital en el proceso de activacin de los LT. Esta va es inhibida por el frmaco ciclosporina A (CsA), frmaco que se une a protenas citoslicas (ciclofilinas), siendo este complejo el inhibidor de la fosfatasa calcineurina, impidiendo de esta manera el traspaso de la infor-

macin e inhibiendo por lo tanto el proceso de activacin de los LT. Este es uno de los pocos ejemplos directos que muestran la conexin entre la membrana y el ncleo celular. La participacin de la protena ras, que se sabe inicia una va importante en la activacin de los LT, es insensible a la accin de CsA. La protena ras (21 kDa) es una de las tpicas protenas que unen nucletidos de guanina, GDP en el estado inactivo y GTP en el estado activo. La estimulacin del TCR induce una marcada y rpida activacin de ras que se manifiesta por su estado de unin a GTP. Esta activacin se inicia a travs de la interaccin de Grb2 con LAT fosforilado, Grb2 puede interactuar con otras protenas adaptadoras y con protenas intercambiadoras de guanina (Sos) que permiten la unin de GTP a ras. Ras-GTP activa a la Raf-quinasa con la cual se inicia la activacin secuencial de la cascada de las MAP-quinasas, va tambin fundamental en la activacin de los LT. La protena adaptadora SLP-76 es tambin fosforilada por Zap-70, puede interactuar con otras protenas como la PTK Ikt y con Gads. La Ikt en esa posicin activa a la FL-C por fosforilacin y Gads, actuando como puente, le permite interactuar con LAT. Como se puede apreciar entonces estas protenas, LAT y SLP-76, actan como andamios temporales que pueden reclutar una gran cantidad de protenas en la superficie celular permitindoles activarse a travs de la interaccin protena-protena o a travs de la fosforilacin y de esta forma engranar toda la maquinaria bioqumica requerida en la transduccin de seales. Como resultado del proceso anterior, se activan diferentes vas: catalizadas por diversas familias de PTK, isoenzimas de PK-C, MAPkinasas, calcineurina; lo que trae como consecuencia: a) cambios en el citoesqueleto, polimerizacin de actina y la reorientacin del MTOC hacia la zona de contacto inter-celular; b) la activacin de diversos factores transcripcionales que permiten la sntesis de citoquinas, protenas citotxicas, entre otras, necesarias para la funcionalidad de los LT CD4 y CD8. La transduccin de seales es un proceso rpido, su trmino en este caso se encuentra asociado a la activacin de mecanismos de desfosforilacin efectuadas por fosfatasas especficas (fosfotirosina fosfatasas). Nuevamente aqu se ha descrito un papel importante de CD45, esta enzima puede aparecer, en determinados perodos, in-

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cluida o excluida de las zonas lipdicas especficas; pudiendo actuar como agente desfosforilante que va finalizando el proceso de activacin. De acuerdo a lo anterior, CD45 participara inicialmente desfosforilando el sitio regulador de la p56lck y posteriormente sera excluida de las ZLE. Existen muchas familias de fosfatasas, una de stas denominada SHP (fosfatasa que contiene dominios SH2), de la cual hay una gran variedad: SHP1, 2, etc. Este tipo de enzimas tiene la importante propiedad de reconocer a las PTK activadas a medida que aumenta su grado de auto-fosforilacin, y por ende de activacin, pueden unirse a stas a travs de los dominios SH2, desfosforilando a la PTK y por lo tanto volvindola al nivel basal. Este tipo de mecanismos es uno de los principales frenos de la activacin de los linfocitos. 2.6. Las dos seales necesarias para la activacin de los LT. Como los LT CD4 controlan la activacin de los LB, macrfagos y, en algunos casos la activacin de los LT CD8, su propia activacin por parte del antgeno, puede representar uno de los eventos ms importantes en la iniciacin de la inmunidad adquirida. Desde hace ya varias dcadas atrs, se saba que la estimulacin antgeno especfica no era suficiente para llevar a cabo la expansin clonal de los LT. Posteriormente se demostr la presencia de una interaccin coestimuladora antgeno-independiente encargada de aportar la necesaria segunda seal. Esta segunda seal, por lo tanto, no es dependiente del TCR y se ha denominado seal co-estimuladora pues, siendo esencial, no induce por s misma respuesta alguna en los LT. La interaccin del TCR con el antgeno solamente, sin las seales coestimuladoras accesorias puede llevar a la muerte del linfocito o a anergia, un estado en el que la clula no puede ser activada, aun cuando reciba todas las seales requeridas. Por lo tanto entonces el encuentro con el antgeno puede conducir a dos respuestas bien diferentes: proliferacin y adquisicin de funciones efectoras o inactivacin y muerte celular. Entre las molculas responsables de ejercer esta co-estimulacin aportadas por la CPA, se encuentran entre muchas otras, la protena B7 (B7.1, B7.2 o CD80, CD86) (figura 10-2), siendo CD28 el receptor en los LT. La molcula de CD28 tiene una MM de 44 kDa, es un homodmero expresado en la mayora de los LT, virtualmente en todos los LT CD4 y aproximadamente en el 50% de los LT CD8. La estimulacin de los LT con

mAbs anti-TCR y simultneamente con mAbs anti-CD28, produce una estimulacin de la proliferacin celular debido, fundamentalmente, a la sntesis y secrecin de IL-2; producindose tambin la sntesis y secrecin de otras numerosas citoquinas. Otro aspecto relevante en la estimulacin de CD28 es su potenciacin en la generacin de las zonas lipdicas especficas, lo que resultara en una mayor concentracin de las protenas participantes en la activacin de los linfocitos. La importancia de B7 como coestimulador ha quedado adems de manifiesto en numerosos sistemas experimentales in vivo, un ejemplo demostrado por varios grupos lo constituye el trasplante de clulas tumorales no inmunognicas, que se transforma en inmunognicas al transfectarlas con el gen de B7. Si bien el mecanismo de accin mediado por CD28 no es del todo conocido, implica la fosforilacin de su dominio citoplasmtico en la secuencia YXXM, por quinasas de la familia src activadas por la interaccin del TCR con el antgeno. Esta secuencia bajo estas condiciones puede asociarse con diversas enzimas como la PI3-quinasa, ras y la activacin de la va de las MAP-quinasas. La glicoprotena CTLA-4 es altamente homloga a CD28, ambas se unen a los mismos ligandos, pero CTLA-4 presenta algunas diferencias: a) une a los ligandos CD80 y CD86 con mucho mayor afinidad que CD28, aproximadamente 10 veces mayor, b) transmite una seal de inhibicin al interior celular. La regulacin de la expresin de CTLA-4 es un asunto crucial para ejercer sus efectos supresores, los LT en reposo no lo expresan y slo comienza a aparecer una vez que stos se han activado. El extremo citoplasmtico de esta glicoprotena, contiene la secuencia YXXM que puede ser fosforilada por las quinasas de la familia src; una vez fosforilado puede interactuar especficamente con fosfoprotena fosfatasas como la SHP-2, la cual bajo estas condiciones se activa y cataliza la desfosforilacin de las quinasas (src, syk, tec) y fosfoprotenas (LAT, SLP-76) requeridas para la transduccin de seales de los LT. Al interactuar por lo tanto el TCR y CTLA-4, ocurrira el comienzo de la activacin celular de los LT, se fosforila CTLA-4, estimulando la reaccin de desfosforilacin (por su asociacin a fosfatasas) y la terminacin de la respuesta. Actualmente, existe un amplio estudio de la utilizacin farmacolgica de este efecto, utilizando prote-

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nas anlogas a CTLA-4, que compitan con B7 de la CPA, como frmacos inmunosupresores. El proceso de activacin de los LT, incluyendo al TCR, co-receptores molculas de adhesin y receptores de co-estimulacin; abarca un primer evento constituido por la fosforilacin de proteinas en residuos de tirosina y la generacin de los segundos mensajeros IP3, Ca2+ y DAG. Esto constituye el traspaso de una seal o la transduccin de seales desde el exterior al interior celular y que inicia a las vas bioqumicas ya sealadas, culminando con los tpicos cambios en la expresin gentica y cambios morfolgicos y funcionales. El bloqueo de cualquiera de estas vas ya sea por inhibidores especficos o mutaciones que las inactiven, provoca una significativa disminucin a anulacin de la respuesta. Por otra parte, agentes que imiten los efectos de los segundos mensajeros como son los steres de forbol (estimuladores de la PK-C) e ionforos de calcio (que favorecen el ingreso de Ca2+ al interior celular), reproducen muchos de los efectos ro abajo, iniciados por el antgeno en contacto con el TCR. Adems, existen evidencias aportadas por la patologa inmunolgica, en muchos casos de inmunodeficiencias combinadas severas (SCID) se ha observado que el factor deficitario corresponde a una de las protenas o enzimas de las vas bioqumicas sealadas; el caso ms conocido es la deficiencia de la enzima Zap-70. Finalmente, dada la importancia de las PTK en diversos procesos tanto normales como patolgicos, existe en la actualidad una rama importante de la farmacologa dedicada a la interrupcin de la transduccin de seales a travs de esta va, diseando inhibidores especficos de estas PTK que puedan ser utilizados como frmacos. En el caso del sistema inmune, las PTK que intervienen en el proceso de activacin se expresan en forma prcticamente exclusiva en los linfocitos, lo que permitira bloquear selectivamente su accin actuando como inmunosupresores.

3. ACTIVACIN DE LOS LINFOCITOS B 3.1. Secuencias de activacin en el BCR y subunidades asociadas. An cuando la informacin sobre el mecanismo de activacin de los linfocitos B est aun lejos de ser completa; el conocimiento creciente de la estructura del receptor de antgenos de las clulas B (BCR) y de sus sub-unidades asociadas ha ido dando paso a un mecanismo que ha

resultado ser muy similar al de los LT, y como veremos ms adelante, al de las clulas NK. El BCR al igual que el TCR, cumple muchas funciones, permite la expansin proliferativa y diferenciacin de las clulas preB en clulas B maduras y sirve tambin como receptor para internar antgenos y presentarlos a los LT CD4 ayudadores. Estructuralmente el BCR est compuesto de una molcula de Ig asociada no covalentemente con dos molculas accesorias Ig- (CD79a) e Ig- (CD79b), las que se encuentran como heterodmeros unidos por puentes dislfuro (figura 10-1 y 10-5a). Las inmunoglobulinas de membrana difieren de las secretadas en cuanto a que se encuentran integradas a la membrana plasmtica, con dominios extracelular, trans-membrana y citoplasmtico; este ltimo puede ser muy corto, tan slo de unos pocos aminocidos (en general de 3 a 35/40 residuos). Aunque es factible la expresin de todos los tipos de inmunoglobulinas como parte del BCR, son solamente mIgM y mIgD los que se encuentran con mayor frecuencia (aproximadamente 90%) sobre la superficie del linfocito. En el caso de la mIgM, las sub-unidades Ig e Ig, poseen 61 y 48 residuos de aminocidos citoplasmticos respectivamente. El anlisis de la estructura primaria de estas sub-unidades permiti apreciar que cada una de stas poseen una copia de los dominios ITAM, abriendo la posibilidad de la participacin de PTK ya sea de membrana o solubles en la transmisin de la seal bioqumica al interior celular. Mutaciones en ambas tirosinas de los ITAM resultan en la total inactivacin de los LB. Adems del receptor, participan en la interaccin co-receptores, CD19/ CD21, molculas de adhesin y molculas de superficie celular que pueden tambin participar en la transduccin de seales (CD40). Se encuentran tambin en la superficie de las clulas B, molculas que promueven la inhibicin, como CD22 y FcRIIB1. Los co-receptores como CD19/CD21 en los LB, son de particular inters en el contexto de la transduccin de seales mediada por el receptor antignico, puesto que contribuyen directamente a la formacin del complejo entre el receptor y el antgeno, aumentando por lo tanto la sensibilidad de la interaccin (figura 10-5a). 3.2. Modelo general de activacin de los LB. A continuacin se analizar cmo la unin de un ligando especfico (antgeno) al receptor BCR, desencadena una compleja serie de eventos bioqumicos que permitirn el desarrollo de la res-

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Figura 10-5. Mecanismo bsico de activacin de los LB. a) Estructura del BCR y sub-unidades asociadas (Ig-, Ig-), coreceptores CD19, CD21, CD22 y enzimas, principalmente PTK intracelulares. b) Interaccin del BCR y estructuras asociadas con el antgeno (unido a un producto proteoltico del complemento) que inicia los eventos de asociacin y de fosforilacin de las secuencias ITAM y tambin de otras protenas, la activacin de protena quinasas, generacin de segundos mensajeros y traspaso de la informacin al ncleo celular. El PIP3 producido por la PI3-quinasa, permite la unin de la PTK Btk a la membrana.

puesta funcional de los LB. Es ya un hecho establecido la participacin de diversas PTK de la familia src, como p55blk, p56lck, p53/56lyn, y p59fyn, que tienen la posibilidad de encontrarse unidas a la membrana plasmtica o con el BCR de LB no estimulados (figura 10-5a). Estudios de unin in vitro, sugieren que las src-quinasas pueden interactuar con los receptores en reposo principalmente con la cadena Ig, a travs de una asociacin con el extremo amino-terminal de la quinasa. Otra PTK de importancia en la transduccin de seales de los LB es la p72 syk; esta enzima citoplasmtica, altamente homloga a la Zap-70, tiene tambin aqu una funcin similar. Nuevamente entonces, ni el receptor ni las sub-unidades asociadas poseen actividad enzimtica alguna, encontrndose separados los mdulos de unin al ligando de los mdulos de transduccin de la seal.

El modelo de la activacin de los LB por lo tanto es anlogo al de activacin a travs del TCR; la interaccin con el antgeno favorece la activacin de PTK de la familia src, como p53/56lyn, la que a travs de cambios conformacionales permiten la aproximacin de la PTK a los dominios ITAM, fosforilndolos (figura 10-5b). Este hecho entonces puede permitir el reclutamiento masivo de la p72syk citoslica, y otras PTK, a travs ahora de la interaccin de los dominios SH2 con los ITAM fosforilados en tirosina. Durante este proceso todas las PTK son fosforiladas y en general en este estado se encuentran activadas y adems y muy importante van generando sitios de interaccin con otras enzimas que posean dominios SH2 permitiendo el traspaso de la seal. La descripcin del papel de protenas adaptadoras citoslicas ha sido sustancial en el mecanismo de activacin de los LB. Una de stas denominada BLNK/SLP-65 es una protena que posee secuencias SH2, secuencias ricas en prolina y secuencias fosforilables en tirosina, por lo cual puede interactuar simultneamente con diversas protenas participantes en la activacin. Una vez fosforilada BLNK/SLP-65 por la PTK syk, puede en estas condiciones asociarse con esta quinasa, y con otras protenas como Grb2, y FL-C1. Por lo anterior BLNK/SLP-65 se encuentra fuertemente asociada a la membrana inmediatamente de producida la interaccin con el antgeno, favoreciendo de esta forma la va de ras MAP-quinasas a travs de Grb2 y la activacin por fosforilacin de la FL-C1 y 2. Recordemos que estas isoenzimas catalizan la hidrlisis de PIP2 y la generacin de los segundos mensajeros IP3, DAG y Ca2+. El papel de los co-receptores es tambin relevante, pues se encargan de estabilizar una interaccin entre el receptor y el antgeno que puede ser muy dbil; en el caso de los LB es tambin un hecho claro que estos mecanismos permiten la amplificacin de la seal recibida por el BCR. El principal co-receptor es un complejo molecular formado por CD19 y CD21 (receptor 2 del complemento, CR2). El co-receptor CD21 une un producto proteoltico del complemento (C3d) y de esta forma participa en conjunto con el BCR en el reconocimiento del antgeno. Adems el CD19 se puede encontrar constitutivamente asociado al BCR y es tambin fosforilado en su dominio intracitoplasmtico por la p53/56lyn post-contacto del BCR con el antgeno. El co-receptor CD19 una vez fosforilado puede reclutar a enzimas como la

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PI3-kinasa, las PTK lyn y fyn y a la protena adaptadora vav. Cada una de estas molculas tiene una activa participacin en los eventos bioqumicos de la activacin de los LB. La PI3quinasa genera como producto, el PIP3, molcula que puede interactuar con los sitios PH (homologa tipo Plekstrin) que presentan protenas como la PTK, Btk (tirosina quinasa de Bruton) y las FLC. Las secuencias PH son dominios de aproximadamente 120 aminocidos que reconocen al PIP3 de la membrana; este reconocimiento especfico les permite a estas protenas asociarse a la membrana plasmtica donde deben ejercer sus funciones. La participacin de la PI3-quinasa aparece como muy importante en los LB, la enzima est compuesta de dos sub-unidades una de 110 kDa, sub-unidad cataltica, y una sub-unidad reguladora de 85 kDa que posee dominios SH2 y ricos en prolina. Esta enzima que aparece fuertemente unida a la membrana post- activacin, posee en su sub-unidad reguladora regiones ricas en prolina que son afines a los dominios SH3 de las src PTK y regiones SH2, es decir tiene dos maneras de interactuar con elementos del BCR y activarse (Figura 9-5b). La protena adaptadora vav, que es un factor intercambiador de nucletidos de guanina, puede activar una vez fosforilada a la familia de las GTPasas Rho, Rac-1, RhoA y Cdc42 que inician una de las vas de activacin de las MAP-quinasas JNK y p38. La estimulacin de las Rho GTPasas regula tambin la polimerizacin de la actina necesaria para la ptima movilizacin de Ca2+. Los co-receptores de las clulas T pueden llegar a la proximidad del TCR a travs de la interaccin con la misma molcula de MHC, un mecanismo fisiolgico similar puede visualizarse aqu, pues el entrecruzamiento en la superficie del BCR con CD19/CD21, puede lograrse por la unin a complejos inmunes que contengan tanto el antgeno y los fragmentos proteolticos del complemento que se unan a CD21. El desdoblamiento por lo tanto del PIP2, la consecuente elevacin del Ca 2+ intracelular y la activacin de las isoenzimas de la PK-C y de la calcineurina son parte de los mecanismos ms importantes en la induccin de cambios en la expresin gentica en los LB. Existen claros antecedentes sobre el agrupamiento de muchas de estas protenas y enzimas en zonas lipdicas especficas, por lo cual este proceso tambin operara en la activacin de los LB. Otras protenas de membrana de importancia en la transduccin de seales en los LB son CD22 y FcRIIB; ambos regulan negativamente

a los LB. El CD22 est constitutivamente asociado al BCR, por lo que su funcin est asociada a la unin del BCR con el antgeno. En cambio FcRIIB, slo ejerce su accin inhibitoria a travs de la interaccin con antgenos asociados a IgG. Lo interesante de estas protenas de membrana es que en sus dominios intra-citoplasmticos poseen dominios compuestos de secuencias conservadas de aminocidos denominadas ITIM (motivos o secuencias de inhibicin basados en tirosina del inmuno-receptor) que consisten de dos pares de YXXL separados por 26 aminocidos. Estos residuos de tirosina pueden ser fosforilados a travs de la PTK lyn, la misma encargada de la activacin de los LB; es decir, la misma seal de activacin puede conducir a la regulacin negativa y de esta forma modular la respuesta. Una vez fosforilados los ITIM pueden asociarse con fosfatasas: SHP-1, (fosfotirosina fosfatasas que posee dominios SH2) o con la fosfatasa de lpidos SHIP (inositol-polifosfato-5-fosfatasa que posee dominios SH2). El co-receptor CD22, al igual que los receptores de inhibicin de las clulas NK que se analizarn ms adelante, se asocia con SHP-1 que se encarga de desfosforilar a las enzimas y otras protenas fosforiladas en tirosina, inhibiendo la formacin de IP3 y el proceso de activacin en general. El receptor FcRIIB se asocia con SHIP, cuyo efecto es regular los niveles del PIP3 de la membrana, dando como producto (PI[3,4]P2) que no tiene efecto regulador, impidiendo la asociacin de las protenas con dominios PH a la membrana, inhibiendo por lo tanto la funcionalidad de los LB. El principal representante de este tipo de molculas es la PTK Btk. El papel de CD22 es complejo pues, independientemente, puede interactuar con ligandos derivados del cido silico presentes en algunas glicoprotenas, y en este caso particular puede actuar como activador de los LB. Son numerosas las evidencias que validan este modelo, especialmente evidencias genticas. Algunos tipos celulares B no poseen p72syk, observndose fosforilacin de las sub-unidades de membrana solamente y ausencia de respuesta biolgica funcional; la eliminacin del gen para esta enzima (knock-out del gen) provoca tambin la eliminacin de la respuesta funcional. La transfeccin de syk (modificacin gentica que permite la incorporacin de syk al genoma celular) a estas clulas restaura la respuesta. Inhibidores de PTK inhiben tambin totalmente la funcionalidad y el tratamiento de LB con frmacos que activen a la PK-C y eleven los nive-

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les intracelulares de Ca2+, reproduce en gran medida los efectos mediados por el antgeno especfico. La deficiencia gentica de CD19, CD19-/-, provoca una disminucin de la respuesta humoral y la deficiencia gentica de SHP-1, presenta una estimulacin de la respuesta. La deficiencia de lyn, provoca una compleja alteracin pues altera tanto los procesos de activacin como de inhibicin. La alteracin gentica de Btk provoca la patologa agamaglobulinemia ligada al cromosoma X humano y una inmunodeficiencia ligada al cromosoma X en el ratn. En general la alteracin de cualquiera de las vas sealadas va a perturbar la funcionalidad de los LB, poniendo en evidencia la importancia de su funcionamiento integral.

lula blanco, provocan la activacin o inhibicin de su funcin. En un captulo posterior se analizarn en detalle los mecanismos que explican la citotoxicidad, haciendo ahora slo referencia a que sta puede ser de dos tipos: 1) citotoxicidad natural, lisa a clulas especialmente tumorales y transformadas por virus y 2) citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC) a travs del receptor CD16 que reconoce a las clulas blanco recubiertas por anticuerpos del tipo IgG. 4.1. Modelo de activacin de las clulas NK. La activacin de las clulas NK ms conocida hasta ahora, es la que ocurre a travs de la interaccin de CD16 con clulas blanco recubiertas con IgG. Como se puede apreciar de la Figura 10-1, el receptor CD16 est asociado a sub-unidades; stas pueden ser de tipo , o bien componentes del complejo CD3. Se han descrito componentes del complejo CD3 asociados a este receptor, lo que viene a representar una cierta analoga con el receptor de las clulas T (TCR). Considerando adems que estas sub-unidades poseen dominios ITAM susceptibles de ser fosforiladas, el mecanismo de activacin implica tambin un alto grado de fosforilacin de protenas similar al de los LT. Se han descrito en las clulas NK enzimas tales como: PTK de la familia src, syk; FL-C de tipo 1, 2; la va de ras y MAP-quinasas y la presencia de protenas adaptadoras como LAT, SLP-76, ya descritas, por lo que se desprende un modelo de activacin celular muy similar a los ya sealados para los linfocitos B y T. Una vez que el receptor CD16 reconoce a las clulas blanco, a travs del fragmento Fc de IgG, se inicia la maquinaria bioqumica de activacin de las clulas NK. La cascada de fosforilacin implica la generacin posterior de los mismos segundos mensajeros IP3, DAG y Ca2+ (figura 10-6). La descripcin de receptores de inhibicin en las clulas NK ha sido uno de los ms importantes aportes de los ltimos aos a la comprensin del mecanismo de accin de la citotoxicidad de stas clulas. Estos receptores, que reconocen a las molculas de MHC-I, especficamente a algunas secuencias proticas conservadas de estos complejos, son bsicamente de dos tipos o familias diferentes: a) los denominados KIR (killer cell inmunoglobulin-like receptors), y los LIR humanos (leukocyte immunoglobulin-like receptors) que son receptores como su nombre lo dice de estructura extracitoplasmtica similar a las inmunoglobulinas; b) protenas del tipo de las

4. ACTIVACIN DE LAS CLULAS NK Las clulas NK (natural killer o agresoras naturales) son una tercera poblacin de linfocitos, diferentes a los linfocitos B y T, pertenecientes al sistema inmune innato. Son una sub-poblacin celular altamente heterognea que se ha caracterizado en base a su funcin, fenotipo y morfologa: a) funcin, pueden lisar en forma espontnea una amplia variedad de clulas (denominadas en general clulas blanco), tales como clulas tumorales, clulas transformadas por virus e infectadas por bacterias o parsitos; secretan adems un conjunto determinado de citoquinas, especialmente IFN. b) Fenotipo, expresan mayoritariamente el fenotipo TCR -, BCR -, CD3 -, CD16 +, CD56 +; CD16, uno de los marcadores ms representativos, es el receptor de baja afinidad que reconoce a la fraccin Fc de IgG, por lo que se denomina tambin FcIIIR (figura 10-1). c) Morfologa, corresponden a linfocitos granulares grandes. Una de las caractersticas ms conocidas de las clulas NK es la eficiencia de su accin citoltica ejercida sobre clulas blanco que carecen parcial o completamente de la expresin de molculas MHC-I, es decir no dependeran de la expresin de este complejo; sin embargo, como se podr apreciar mas adelante, este concepto est comenzando a cambiar. La heterogeneidad de las clulas NK se manifiesta en que las sub-poblaciones pueden expresar diferentes molculas de activacin y de inhibicin de su funcionalidad; es decir, molculas que al interaccionar por ejemplo in vitro, con anticuerpos monoclonales o a travs de sus ligandos naturales especficos presentes en la c-

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lectinas, como CD94-NKG2 humano y Ly-49 murino. Mientras los KIR y Ly49 pueden reconocer e interactuar con mltiples MHC-I del tipo clsico (A,B,C), los receptores CD94-NKG2 lo hacen con MHC-I no clsicos (HLA-E). Estos receptores poseen en sus dominios intracitoplasmticos secuencias de inhibicin del tipo ITIM, ya descritas para otros receptores. Al interactuar la clula NK con la clula blanco, si la clula NK posee receptores de inhibicin que reconocen a su ligando respectivo en la clula blanco, se fosforilan los resduos de tirosina de estas secuencias de inhibicin a travs de las PTK de la familia src; una vez fosforilados los ITIM pueden asociarse con fosfoprotena fosfatasas SHP-1, SHP-2 que se encargan de desfosforilar a las protenas quinasas activadas e inhibir el proceso general de fosforilacin caracterstico de la activacin celular, inhibiendo por lo tanto la funcionalidad de las clulas NK. Es decir, el proceso de activacin de las clulas NK, al igual que el de los linfocitos T y B, implica activacin de quinasas y fosforilacin de protenas. El proceso de inhibicin mediado por los receptores recin descritos, si bien requieren PTK para la fosforilacin de las secuencias ITIM, activan a fosfatasas que frenan el proceso de activacin. La figura 10-1 muestra dos ejemplos de receptores de inhibicin. Una complejidad adicional la representa la existencia de receptores del tipo de los de inhibicin recin descritos, pero que carecen del sitio ITIM, y se comportan por lo tanto como receptores de activacin de las clulas NK al interactuar con las molculas de MHC-I. Uno de ellos el CD94-NKG2C, tiene asociada la sub-unidad denominada DAP12 (tambien llamada KARAP), que contiene una secuencia de activacin ITAM. De este modo, las molculas MHC-I pueden ser reconocidas por tres diferentes grupos de inmunoreceptores: TCR, que reconoce al antgeno presentado por stas moleculas; CD8, co-receptor que reconoce a secuencias de aminocidos conservadas de las molculas MHC-I y los receptores recin descritos, que tambin reconocen secuencias de estas molculas que pueden inhibir o activar la respuesta funcional de las clulas NK. Estos ltimos receptores presentan adems una distribucin clonal en las clulas NK, que explica la heterogeneidad de stas clulas. Por lo que se ha analizado hasta ahora, se desprende un importante papel de los complejos MHC-I en la respuesta de las clulas NK. Recien-

temente se han descrito una de las ms importantes familias de receptores de activacin que vienen a responder muy satisfactoriamente al requerimiento principal de las clulas NK, es decir actuar sobre clulas deficientes o que carecen por completo de los complejos MHC-I. Estos receptores que estn implicados en la citotoxicidad natural se han denominado justamente receptores de la citotoxicidad natural (NCR) y son : NKp46 (Figura 9-1), NKp44 y NKp30; su estructura externa es de la familia de las inmunoglobulinas y en su extremo citoplasmtico se encuentran asociados a subunidades del tipo de CD3 y DAP12, ambas poseen secuencias ITAM. Los NCR NKp46 y NKp30 se encuentran presentes exclusivamente en las clulas NK humanas, son los nicos con esta caracterstica y por lo tanto son tambin los nicos marcadores representativos de este tipo de clulas. El receptor NKp44 se expresa en respuesta a IL-2 y est tambin presente en los LT. Si bien no se les conoce con precisin sus ligandos respectivos, se sabe que pueden actuar especialmente sobre clulas tumorales, transformadas por virus e incluso tambin sobre clulas autlogas normales, siendo su principal elemento regulador, la presencia o ausencia de los receptores de inhibicin. Por lo tanto, las clulas NK poseen un repertorio de receptores de activacin y un repertorio de receptores de inhibicin; ahora, se ha observado que al enfrentarse a una clula blanco que posea ligandos para ambos tipos de receptores, prima la inhibicin. Si se pierde esta propiedad inhibitoria, principalmente por la menor o nula expresin de los complejos MHC-I, por parte de la clula blanco y est adems presente el receptor de activacin adecuado, en las clulas NK, ocurrir la lisis de la clula blanco. Los receptores de inhibicin tambin han sido descritos en los LT, por lo que representan uno de los principales factores de control de la activacin de los linfocitos. La descripcin de receptores de inhibicin en las clulas NK ha sido uno de los ms importantes aportes de los ltimos aos. Estos receptores, que reconocen a las molculas MHC-I, especficamente algunas secuencias conservadas de estos complejos, son bsicamente de dos tipos o familias diferentes: a) los denominados KIR (killer cell inmunoglobulin-like receptors), y los LIR humanos (leukocyte immunoglobulin-like receptors) que son receptores como su nombre lo dice de estructura extracitoplasmtica similar a

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Figura 10-6. Mecanismo bsico de activacin de las clulas NK. Tipos celulares participantes en el mecanismo Citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC): clulas NK que poseen el receptor CD16 y sub-unidades y ; las enzimas protena quinasas PTK intracelulares, protenas adaptadoras y otras son las que aparecen descritas en las figuras 10-4 y 10-5. La clula blanco en este caso, es reconocida por un anticuerpo (IgG), que acta como puente entre esta clula y la clula NK.

las inmunoglobulinas. b) Heterodmeros como CD94-NKG2 humano y el homodmero Ly-49 murino, que son lectinas del tipo C. Mientras los KIR y Ly49 pueden interactuar con mltiples MHC-I clsicos (A,B,C), los heterodmeros CD94NKG2 lo hacen con MHC-I no clsicos (HLA-E). Estos receptores poseen en sus dominios intracitoplasmticos secuencias ITIM. Los residuos de tirosina de estas secuencias pueden ser fosforiladas al interactuar el receptor con su ligando, a travs de las PTK de la familia src, o bien por el inicio de una reaccin de activacin de los linfocitos a travs de un receptor de activacin, en ambos casos una vez fosforilados los ITIM pueden asociarse con fosfoprotena fosfatasas SHP-1, SHP2 que se encargan de desfosforilar a las protenas activadas e inhibir el proceso, inhibiendo por lo tanto la funcionalidad de las clulas NK. La figura 10-1 muestra dos ejemplos de receptores de inhibicin. Algunos receptores de inhibicin tienen truncado el sitio ITIM, y se comportan como re-

ceptores de activacin, uno de ellos el CD94NKG2C, tiene asociada la molcula DAP12 (tambin llamada KARAP), que contiene una secuencia ITAM. De este modo, las molculas MHC-I pueden ser reconocidas por tres diferentes grupos de inmunorreceptores: TCR, CD8 y los receptores recin descritos, que pueden inhibir o activar la respuesta. Estos ltimos receptores presentan adems una distribucin clonal en las clulas NK. Recientemente se han descrito una de las ms importantes familias de receptores de activacin que vienen a responder muy satisfactoriamente al requerimiento principal de las clulas NK, es decir actuar sobre clulas que son deficientes o que carecen por completo de los complejos MHC-I. Estos receptores que estn implicados en la citotoxicidad natural se han denominado justamente receptores de la citotoxicidad natural (NCR) y son : NKp46 (figura 10-1), NKp44 y NKp30; su estructura externa es de la familia de las inmunoglobulinas y en su extremo citoplasmtico

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se encuentran asociados a subunidades del tipo de CD3 y DAP12, ambas poseen secuencias ITAM. Los NCR NKp46 y NKp30 se encuentran presentes exclusivamente en las clulas NK humanas, son los nicos con esta caracterstica y por lo tanto son tambin los nicos marcadores representativos de este tipo de clulas. El receptor NKp44 se expresa en respuesta a IL-2 y est tambin presente en los LT. Los NCR al ser activados por anticuerpos monoclonales presentan un aumento en la concentracin intracelular de calcio, aumento de la citotoxicidad y de la secrecin de citoquinas. Si bien no se les conoce con precisin sus ligandos respectivos, se sabe que pueden actuar sobre clulas tumorales y tambin sobre clulas autlogas normales, siendo su principal elemento regulador, la presencia o ausencia de receptores de inhibicin. Por lo tanto, las clulas NK poseen un repertorio de receptores de activacin y un repertorio de receptores de inhibicin; al enfrentarse con una clula blanco que posea ligandos para ambos tipos de receptores, prima la inhibicin; si se pierde esta propiedad, principalmente por menor o nula expresin de los complejos MHC-I y est adems presente el receptor de activacin adecuado, ocurrir la lisis de la clula blanco. Los receptores de inhibicin tambin se han descrito en los LT, por lo que representan uno de los principales factores de control de la activacin de los linfocitos.

LECTURAS SUGERIDAS Dustin M, Chan, A., Signaling takes shape in the immune system. Cell, 103, 283-294, 2000. Janes, P., Ley, S., Magee, A. & Kabouridis, P.S., The role of lipid rafts in T cell antigen receptor (TCR) signaling. Semin. Immunol. 12, 23-34, 2000. Kane, L. P., Lin J. & Weiss, A., Signal transduction by the TCR for antigen. Curr. Opin. Immunol. 12, 242-249, 2000. Kelly, M., & Chan, A., Regulation of B cell function by linker proteins. Curr. Opin. Immunol. 12, 267-275, 2000. Lanier, L., NK cell receptors. Annu. Rev. Immunol. 16, 359-393, 1998.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 11
CITOQUINAS
Rodrigo Naves P. y Mara Rosa Bono M.

1. Introduccin 2. Propiedades generales de las citoquinas 3. Receptores de las citoquinas y mecanismos de transduccin de seales 3.1. Receptores de citoquinas 3.2. Transduccin de seales 4. Principales actividades biolgicas de las citoquinas 4.1. Inmunidad innata 4.1.1. Inmunidad antiviral 4.1.2. Citoquinas e inflamacin 4.2. Citoquinas y respuesta inmune 4.2.1. Citoquinas y diferenciacin de clulas linfoides 4.2.2. Clulas Th1 y Th2 4.2.3. Activacin de linfocitos B 4.2.4. Respuesta inmune especfica mediada por clulas

4.3. Citoquinas y hematopoyesis 4.3.1. Factores estimuladores de colonias 4.3.2. Otras citoquinas estimuladoras de la hematopoyesis 4.3.3. Citoquinas supresoras 5. Quimioquinas 5.1. Quimioquinas en la diferenciacin linfocitaria 5.2. Quimioquinas en la recirculacin de los linfocitos a travs de los rganos linfoides secundarios 5.3. Quimioquinas en el "homing" de los linfocitos a sitios efectores perifricos 5.4. Quimioquinas y enfermedades 5.5. Quimioquinas y terapia

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RESUMEN En este captulo se describen algunas de las funciones de las citoquinas relacionadas con la respuesta inmune, en conjunto con las caractersticas propias de cada citoquina. La larga lista de citoquinas y quimioquinas que se mencionan representa slo a aquellas ms estudiadas. Las posibilidades que existen hoy en da para identificar y aislar nuevos tipos celulares como son las clulas T de memoria u otras, combinadas con las tcnicas de biologa molecular y el anlisis de un gran nmero de genes homlogos, ha llevado a definir nuevas citoquinas que de otra manera sera imposible detectar. Por lo tanto es imposible pretender, hoy en da, tener una visin acabada de las citoquinas y sus funciones. La produccin de ratones knock out y transgnicos para las citoquinas, sus receptores y las molculas implicadas especficamente en la transduccin de seales de las citoquinas es prometedora para el entendimiento de las funciones de las citoquinas. Sin embargo las propiedades intrnsecas de las citoquinas, tales como el pleiotropismo y su redundancia, la compleja red de interacciones clula-citoquina que producen, hace difcil pensar que se lograr en un futuro cercano entender la regulacin a nivel de los organismos vivos. Las citoquinas han sido implicadas en numerosas patologas las cuales a menudo se encuentran relacionadas no slo con la respuesta inmune sino con otros sistemas tales como, el sistema nervioso central o el sistema endocrino. Muchas de las citoquinas enumeradas tienen potencial uso clnico. Sin embargo, a pesar de la enorme cantidad de trabajos que se han realizado con las citoquinas, de la explosin de conocimientos de los ltimos aos, y de las importantes funciones que ellas regulan, su uso en clnica humana actualmente ha sido autorizado slo para un nmero muy reducido de citoquinas.

1. INTRODUCCIN Las citoquinas son protenas solubles producidas en forma transitoria por efecto de un estmulo. stas representan el lenguaje universal de las clulas, y gracias a ellas las clulas reconocen lo que est ocurriendo a su alrededor y establecen en consecuencia una respuesta. Las citoquinas participan, entre otros, en la proliferacin y diferenciacin celular, la hematopoyesis, la actividad microbicida, la reaccin inflamatoria, la respuesta inmune especfica y no especfica, y en procesos relacionados con el desarrollo de los organismos vivos. Las citoquinas regulan la respuesta inmune induciendo o inhibiendo la produccin de otras citoquinas y sus respectivos receptores as como activando mecanismos de transduccin de seales en clulas blanco o sobre ellas mismas. El nmero de citoquinas descubiertas ha ido en continuo aumento en los ltimos aos, as como los conocimientos en cuanto a los mecanismos regulatorios de stas. Un conjunto particular de citoquinas corresponde a la familia de las

quimioquinas las que en total suman actualmente tantas como el resto de las citoquinas. Las quimioquinas sern tratadas en forma separada en este captulo debido a que poseen propiedades particulares y a la importancia que han ido adquiriendo. Hoy en da existe una gran cantidad de conocimientos acerca de los mecanismos de accin de las citoquinas, sin embargo, sus acciones in vivo no son bien comprendidas debido a la complejidad de las numerosas interacciones celulares en las que ellas participan. En la tabla 11-1 se muestra una cronografa del descubrimiento de las citoquinas.

2. PROPIEDADES GENERALES DE LAS CITOQUINAS La mayor parte de las citoquinas han sido caracterizadas en cuanto a peso molecular, secuencia de DNA y aminocidos, e incluso los genes que codifican para ellas han sido localizados a nivel de cromosomas tanto en humanos como en ratn. Los receptores de las citoquinas y sus

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Tabla 11-1. Descubrimiento de las citoquinas

1957 1960-1970 1966 1969 1974 1979 Principios de 1980 1981 Mediados de 1980 1985 1989 1990 1993

Descubrimiento de la primera citoquina, IFN-. Descripcin de sobrenadantes con diferentes actividades biolgicas. Se descubri la primera linfoquina, MIF, factor producido por los linfocitos que Inhibe la migracin de los macrfagos in vitro Definicin de linfoquinas y monoquinas. Terminologa inexacta. Se acu el trmino de citoquina. Definicin de interleuquinas, IL-1 e IL-2. Purificacin de citoquinas por mtodos bioqumicos Se utiliz por primera vez una citoquina en clnica humana, IFN-. Clonamiento mediante tcnicas de biologa molecular de las citoquinas. Se utiliz IL-2 en clnica humana. Clonamiento de MIF Se clonaron los receptores para varias citoquinas Mecanismos de transduccin de seal de las citoquinas. Caracterizacin de PTK y STAT asociadas a las respuestas de las distintas citoquinas.

mecanismos de accin molecular han sido tambin ampliamente estudiados en los ltimos aos. En la mayor parte de las investigaciones se utiliza la citoquina recombinante la que, en general, muestra las mismas funciones que las citoquinas producidas en forma natural. Las principales caractersticas de las citoquinas se muestran en la tabla 11-2. Cuando se descubrieron las citoquinas se pens que ellas estaban relacionadas nicamente con la comunicacin entre los leucocitos y de all que se les dio el nombre de interleuquinas para lo cual se utiliz la abreviatura IL seguida de un nmero (por ejemplo IL-1, IL-2, etc.). Pero luego se demostr que la funcin biolgica de estos factores solubles afectaba a clulas de otros orgenes. Fue entonces que se acu el trmino ms general de citoquinas. Sin embargo, no todas las citoquinas son denominadas segn esta terminologa y en muchos casos se utiliza ms bien una abreviatura relacionada con la funcin de la molcula (por ejemplo, TNF significa factor de necrosis tumoral en ingls, primera funcin asociada a esta citoquina). Adems existe una

categora especial de citoquinas, las quimioquinas, las cuales tienen propiedades quimiotcticas hacia diferentes tipos celulares, y poseen caractersticas especiales que las distinguen de las citoquinas. Por esta razn, y por la relevancia que ellas tienen actualmente, sern discutidas en una seccin separada. Las citoquinas son factores proteicos solubles, producidos transitoriamente frente a un estmulo. La produccin de citoquinas es controlada a nivel transcripcional y existe un segundo nivel de control dado por la inestabilidad de los mRNA. La accin de las citoquinas es local, pudiendo en algunos casos, ejercer su funcin sobre la misma clula productora de la citoquina (actividad autocrina) o sobre clulas vecinas (actividad paracrina). En algunos casos pueden tener actividad endocrina cuando son producidas en grandes cantidades y pasan a la circulacin. En general, las citoquinas se encuentran en estado de monmeros, pero en algunos casos la forma activa est conformada por dmeros o trmeros de la misma molcula. Esta caracterstica de las citoquinas es importante, ya que se piensa

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Tabla 11-2. Caractersticas de las citoquinas

Clula Blanco Efecto sobre cada clula blanco Bioensayo

Citoquina

Tamao

Fuente

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IL-1IL-1Timocito Endotelial Hipotlamo Hgado Msculo Coestimulador Activacin, inflamacin, coagulacin Fiebre Protenas fase aguda Catabolismo

17-18 kDa

Monocitos/macrfagos, clulas de Langerhans, dendrticas, linfocitos T, B, NK, LGL, endoteliales, msculo, fibroblastos, epitelio tmico, astrocitos, microglia, glioma, keratinocitos. Linfocitos T NK Linfocitos B Proliferacin, produccin de citoquinas Proliferacin, activacin Proliferacin, sntesis de anticuerpos Proliferacin y diferenciacin. Proliferacin Activacin

Activacin de timocitos o lneas celulares T. Induccin de PGE2 en fibroblastos.

IL-2

14-17 kDa

Linfocitos T

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Proliferacin de linfocitos T activados, de lneas celulares dependientes de IL-2 o de linfocitos B coestimulados con anti-IgM. Proliferacin de lneas celulares humanas TF-1, MO7e o AML193. Estimulacin de colonias eritroides, granuloides y mieloides en mdula sea.

IL-3 Progenitores hematopoyticos: Linfocitos B Monocitos

14-30 kDa

Linfocitos T

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IL-4

15-19 kDa

Linfocitos Th2 CD4+, algunas T CD8+, mastocitos, estroma de mdula sea.

Linfocitos B Linfocitos T

Cambio de clase de Ig a IgE, aumento MHC-II. Proliferacin y diferenciacin.

Proliferacin de clulas T activadas con PHA, en presencia de anti-IL-2 o anti-IL-2R.

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Inhibicin de activacin. Proliferacin de MO7. Aumento de CD23, IgM o MHC-II en clulas B obtenidas de amgdalas. Macrfagos Endoteliales Estimula la expresin de molculas de adhesin. Proliferacin Mastocitos Eosinfilos Linfocitos B Proliferacin, diferenciacin y activacin En ratn, coestimulador de proliferacin de linfocitos B activados. Aumenta la sntesis de IgA en linfocitos B maduros. Diferenciacin de eosinfilos. Proliferacin de TF-1.

IL-5

40-50 kDa

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Linfocitos Th2 CD4+, mastocitos y eosinfilos.

IL-6 Timocitos Coestimulador Linfocitos B maduros Proliferacin Hgado Protenas fase aguda Progenitores de Proliferacin y diferenciacin linfocitos B. Linfocitos T maduros Proliferacin y diferenciacin Leucocitos Quimiotaxis y activacin

22-29 kDa

Linfocitos T y B, macrfagos, estroma de mdula sea, fibroblastos, keratinocitos, astrocitos, endoteliales.

Proliferacin de lnea celular B9. Aumento de la secrecin de Ig en lneas B linfoblastoides.

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IL-7

20-28 kDa

Clulas del estroma de mdula sea, timo o bazo. Fibroblastos.

Proliferacin de precursores de linfocitos B.

IL-8

6-8 kDa

Monocitos, linfocitos, granulocitos, fibroblastos, endoteliales, epiteliales, keratinocitos, hepatocitos.

Quimiotaxis o activacin de neutrfilos

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IL-9

30-40 kDa

Linfocitos Th2 activados por IL-2, linfoma de Hodgkin's.

Linfocitos T Proliferacin Mastocitos Proliferacin Precursores eritroides Proliferacin Macrfagos

Proliferacin de lneas T linfoblastoides humanas estimuladas con PHA e IL-4. Inhibe la produccin de citoquinas. Inhibicin de la sntesis de IFNInhibe expresin de por clones Th1 activados con MHC-II. mitgenos o antgeno o por

IL-10

17-40 kDa

Th0 y Th2 murinas, linfocitos T CD4+ y CD8+ humanos, linfocitos B Ly-1+ murinos, monocitos,

Sin ttulo-2

macrfagos, keratinocitos. Linfocitos B Timocitos Mastocitos Proliferacin Proliferacin y activacin Proliferacin Proliferacin clulas mononucleares de sangre perisfrica activadas. Proliferacin de lnea celular mastoctica MC/9 murina

IL-11 Progenitores hematopoyticos multipotencial, progenitores de megacariocitos y macrfagos. Plasmocitomas. Pre-adipocitos Proliferacin Inhibicin de adipognesis. Linfocitos T

23 kDa

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Fibroblastos estimulados con IL-1, lneas celulares de estroma de mdula sea.

Proliferacin de plasmocitomas murinos dependientes de IL-6, tal como T1165.

IL-12

Estimulacin de la produccin de IFN- por clulas de bazo.

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Heterodimero Macrfagos, linfocitos B y formado por lneas celulares B 2 cadenas de linfoblastoides. 35 y 40 kDa. NK

Induce produccin de IFN- Coestimulador de la proliferacin. Induce produccin de IFN- Aumenta la actividad NK y ADCC. Estimula la proliferacin y diferenciacin.

LTh1 Linfocitos B Proliferacin de clulas B humanas co-estimuladas con anti-IgM o anti-CD40

IL-13

17 kDa

Linfocitos T activados

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Monocitos

Promueve la proliferacin en combinacin con anti-Ig o anti-CD40. Estimula la secrecin de IgM, IgE e IgG4. Aumenta la expresin de CD23. Prolonga la sobrevida. Aumenta la expresin de MHC-II y CD23.

IL-14

60 kDa

Linfocitos T y tumores de clulas B.

Linfocitos B activados Estimula la proliferacin. Inhibe la sntesis de Ig.

Proliferacin de linfocitos B activados con Staphyloccus aureus.

Sin ttulo-2

IL-15 Linfocitos T Proliferacin de linfocitos T activados.

14-15 kDa

Monocitos y clulas epiteliales. El mRNA es encontrado en una amplia variedad de tipos celulares. LAK Linfocitos T CD4+ Quimiotaxis. Aumento expresin de IL-2R y MHC-II. Quimiotaxis Quimiotaxis Proliferacin de CTL. Generacin de linfocitos T citotxicos especficos. Estimulacin de la proliferacin. Quimiotaxis de linfocitos T CD4+.

IL-16

16-17 kDa

Linfocitos T

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Monocitos Eosinfilos activados Estroma de mdula sea, clulas endoteliales y fibroblstos Induce produccin de IL-6, IL-8, GCSF y PGE2 Progenitores hematopoyticos Granulocitos Monocitos Endoteliales Eritrocitos Megacariocitos Linfocitos T Precursores de neutrfilos. Progenitores hematopoyticos Cl. Endoteliales Progenitores de macrfagos y macrofgos Proliferacin y sobrevida Diferenciacin y activacin Diferenciacin y activacin Proliferacin Proliferacin Proliferacin Proliferacin Proliferacin, diferenciacin y activacin. Estimular la proliferacin, en sinergia con IL-3 Proliferacin y migracin. Factor de sobrevida, proliferacin, diferenciacin y activacin.

IL-17

15 kDa

LT activador

GMCSF

22 kDa

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Linfocitos T, macrfagos, fibroblastos y clulas endoteliales

No existe un bioensayo especfico. La formacin de colonias en agar blando con lneas celulares provee una estimacin de la actividad.

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G-CSF

21 kDa

Macrfagos, fibroblastos, clulas endoteliales, estroma de mdula sea.

Formacin de colonias en agar blando a partir de mdula sea.

M-CSF

45-90 kDa

Mltiple incluyendo linfocitos, monocitos, fibroblastos, clulas epiteliales, clulas endoteliales, mioblastos y osteoblastos.

Formacin de colonias en agar blando a partir de mdula sea.

Sin ttulo-2

SCF (kit ligand) Proliferacin Desarrollo Desarrollo Desarrollo Acta en sinergia con factores estimuladores de colonias en ensayos realizados en agar blando a partir de clulas de la mdula sea. Mastocitos Progenitores hematopoyticos Gnadas Precursores mieloides y linfoides

28-36 kDa

Estroma de mdula sea, hgado, cerebro, rin, pulmn, placenta, fibroblastos, oocitos, testculos.

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IFN- Mltiples tipos celulares Resistencia a virus Inhibicin de la proliferacin Aumento de MHC-I

16-27 kDa

Linfocitos, monocitos y macrfagos

Inhibicin del efecto citoptico de EMCV, VSV o SFV en lneas celulares epiteliales o en la lnea celular L929 de ratn. Inhibicin de la proliferacin en DAUDI.

IFN- Mltiples tipos celulares

20-26 kDa

Fibroblastos y clulas epiteliales

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Resistencia a virus Inhibicin de la proliferacin Aumento de MHC-I

Inhibicin del efecto citoptico de EMCV, VSV o SFV en lneas celulares epiteliales o en la lnea celular L929 de ratn. Inhibicin de la proliferacin en DAUDI. Inhibicin del efecto citoptico de EMCV, VSV o SFV en lneas celulares epiteliales o en la lnea celular L929 de ratn. Inhibicin de la proliferacin en DAUDI.

IFN- Linfocitos T y B, macrfagos y NK. Endoteliales Fibroblastos Mltiples tipos celulares

20-25 kDa

Linfocitos T y NK

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Activacin, proliferacin y diferenciacin Proliferacin Proliferacin Resistencia a virus, inhibicin de la proliferacin, aumento de MHC-I y MHC-II. Mediador de respuestas inflamatorias e inmunes. Regula la proliferacin y diferenciacin. Citotxico para clulas tumorales.

TNF-

52 kDa

Monocitos y macrfagos activados, muchos otros tipos celulares incluyendo linfocitos T, B y fibroblastos

Mltiples tipos celulares

Citotoxicidad en la lnea celular de ratn.L929.

Sin ttulo-2

TNF- 25 kDa (Linfoto xina) Mltiples tipos celulares Mediador de respuestas inflamatorias e inmunes. Regula la proliferacin y diferenciacin. Citotxico para clulas tumorales. Estimula proliferacin Proliferacin de la lnea de carcinoma A431 Quimiotaxis para eosinfilos

Linfocitos T y B activados

Citotoxicidad en la lnea celular de ratn L929.

EGF Clulas epiteliales

6 kD

Clulas ectodrmicas, monocitos, rin, glndulas duodenales Linfocitos B, T, NK y Quimiotaxis eosinfilos Clulas troncales Inhibicin de la proliferacin Leucocitos Clulas mieloides Quimiotaxis Estimulacin de la proliferacin

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MIP-1

8 kDa

Linfocitos T y B, clulas de Langerhan, neutrfilos y macrfagos

MIP-1a 7.8 kDa

Linfocitos T, B y macrfagos

Antagoniza los efectos de MIP1a. Aumenta la formacin de colonias hematopoyticas junto con GM-CSF. Quimiotaxis para monocitos o basfilos.

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MCP-1 Monocitos Basfilos

8-18 kDa

Monocitos, linfocitos T fibroblastos, clulas endoteliales, msculo liso y keratinocitos. Mltiples tipos celulares

Quimiotaxis y activacin Activacin

TGF-

25 kDa

Plaquetas y la mayor parte de las clulas nucleadas

Inhibicin de la proliferacin

Inhibicin del crecimiento de la lnea celular MV-1-Lu.

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que la forma activa u oligomrica de las citoquinas induce la oligomerizacin del receptor, es decir, pone en contacto o aproxima las diferentes subunidades que conforman el receptor funcional. Este reordenamiento en la membrana celular produce la activacin de protenas que se encuentran en forma latente en el citoplasma, desencadenando una cascada de reacciones que lleva a los efectos que se les conoce a las citoquinas. Las citoquinas son pleiotrpicas y redundantes lo que quiere decir que una citoquina puede ejercer una actividad funcional sobre varios tipos celulares y que una determinada funcin puede ser realizada por diferentes citoquinas, respectivamente. Las citoquinas en general son producidas por una gran variedad de clulas, como es el caso de la IL-1 la cual es producida por todas las clulas nucleadas. Por otra parte, los linfocitos T y los macrfagos son las clulas que producen la mayor diversidad de citoquinas, aunque casi cualquier clula es capaz de producir citoquinas ante determinados estmulos. La produccin de una citoquina desencadena variadas reacciones. Induce la secrecin de al menos otra citoquina, puede suprimir la actividad de otras citoquinas o bien puede inducir una cascada de citoquinas. La cantidad de citoquina producida tiene relacin con la actividad biolgica de ella misma. A menudo, las citoquinas actan en sinergia o en forma antagnica. Por otra parte, una citoquina puede inducir la expresin de su propio receptor en la clula que la est secretando o en clulas vecinas, o bien puede inducir la expresin de un receptor para otra citoquina. Las propiedades de las citoquinas demuestran que existe una red de interacciones celulares muy compleja y dificil de estudiar en los organismos vivos. Por esta razn, y a pesar de tener una enorme cantidad de conocimientos acerca de una citoquina particular, su utilizacin teraputica es hoy en da muy limitada.

extracelular enviada por el ligando hacia el interior de la clula. La tabla 11-3 muestra las caractersticas de los receptores para las pricipales citoquinas, as como las tirosinas kinasas que se activan por efecto de la unin del ligando al receptor, y los estimuladores y activadores de la transcripcin asociados a esta reaccin. Los receptores para las citoquinas son protenas de transmembrana altamente especficos, siendo en su mayor parte, especficos para una especie (figura 11-1). Es sorprendente el hecho de que jams se haya podido demostrar que una citoquina determinada sea capaz de inhibir la unin de otra citoquina a su receptor. La especificidad de especie que se le atribuye a las citoquinas podra explicarse a nivel de unin a su receptor. La interaccin entre la citoquina y su receptor es de gran afinidad, con constantes de disociacin cercanas a 10-11 M/L. Las clulas pueden presentar en su superficie receptores para varias citoquinas siendo su nmero muy bajo, entre 100 a 1.000 receptores por clula. Sin embargo se necesita que slo una fraccin de los receptores sea ocupada para ejercer una mxima actividad biolgica. El receptor funcional de una citoquina est, generalmente, formado por la subunidad que une la citoquina y una o ms subunidades diferentes ms bien relacionadas con la transduccin de la seal. Los receptores de las citoquinas han sido clasificados en familias de acuerdo a homologas estructurales, a la presencia de ciertos dominios conservados, o a homologas funcionales. A estas superfamilias pertenecen tambin protenas que no son, necesariamente, receptores para citoquinas: Familia de receptores hematopoyticos. La familia ms numerosa es la de los receptores hematopoyticos o receptores de tipo I, que contienen en su secuencia primaria de aminocidos el motivo WSXWS en la regin extracelular adems de 2 dominios extracelulares con cisteinas conservadas. Esta familia incluye las cadenas y de IL-2R, IL-4R, las cadenas y de IL-3R, las cadenas y de IL-5R, IL-6R, gp130, IL-9R, IL-12R, G-CSFR (Granulocyte Colony Stimulating Factor Receptor), GM-CSFR (Granulocyte/Macrophage Colony Stimulating Factor Receptor), CNTFR, LIFR, EpoR (Erythropoietin Receptor), PRLR (Prolactin Receptor) y GHR (Growth Hormone Receptor). La sealizacin a travs de este tipo de receptores no est bien definida aunque se han descrito la fosforilacin

3. RECEPTORES DE LAS CITOQUINAS Y MECANISMOS DE TRANSDUCCIN DE SEALES 3.1. Receptores de citoquinas La comprensin del mecanismo de accin de las citoquinas ha avanzado gracias al conocimiento que se ha adquirido de los receptores de stas, los cuales son responsables de transmitir la seal

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Tabla 11-3. Receptores, tirosinas kinasa y protenas STATs activadas por las citoquinas

Citoquina Receptor

JAKs acopladas a los diferentes receptores

STATs implicadas en la transduccin de la seal

Il-1- IL-1-b IL-2

2 receptores Tipo I: 80 kDa (CDw121a) Tipo II: 60 kDa (CDw121b) Complejo formado de 3 cadenas. Cadena-: 55 kDa (CD25, Tac) Cadena-: 75 kDa (CD122) Cadena-: 64 kDa (conocida como c) Complejo formado de 2 cadenas. Cadena-: 60-70 kDa CD123) Cadena-: 110-140 kDa (KH97 en humanos, AIC2A o AIC2B en ratn) Complejo formado de al menos 2 cadenas. Cadena-: 140 kDa (CD124) Cadena-: 64 kDa (conocida como c) Complejo formado de 2 cadenas. Cadena-: 60 kDa (CD125) Cadena-: 110-140 kDa (KH97 en humanos, AIC2A o AIC2B en ratn) Complejo formado de 2 cadenas. Cadena-: 80 kDa (CD126) Cadena-: 130 kDa (gp130) Complejo formado de al menos 2 cadenas. Cadena-: 68 kDa (CD127) Cadena-: 64 kDa (conocida como c) Una sola cadena de 64 kDa Es probable que est asociada a la cadena-g de 64 kD de IL-2R conocida como c. Una sola cadena de 90-110 kDa. Una sola cadena de 90-151 kDa. Una sola cadena de 180 kDa. TYK2, JAK2 Probablemente esta cadena est asociada a una componente relacionada a gp130. Desconocido an, pero probablemente comparta alguna componente con IL-4R. Receptor formado por una sola cadena. Peso molecular desconocido. Complejo formado de 3 cadenas. Cadena-: desconocida, pero no es Tac. Cadena-: 75 kDa (CD122) Cadena-: 64 kDa (conocida como c) JAK1,JAK3 ? STAT4, STAT3 JAK1, JAK2, TYK2 STAT1, STATX JAK1, JAK3 STAT3, STATX

IL-3

JAK2

STAT5

IL-4

JAK1, JAK3

IL4-STAT

IL-5

JAK2

STAT5

IL-6

JAK1, JAK2, TYK2

STAT1 (IL-6), STAT3

IL-7

IL-9

IL-10 IL-11 IL-12

TYK2, JAK1

STAT1, STAT3

IL-13 IL-14 IL-15

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IL-16 GM-CSF

Desconocido an. Complejo formado de 2 cadenas. Cadena-: 80 kDa (CDw116) Cadena-: 110-140 kDa (KH97 en humanos, AIC2A o AIC2B en ratn) Una sola cadena de 150 kDa. El receptor humano tiene homologa con la cadena gp130 del IL-6R. Una sola cadena de 150-165 kDa (CD115). El receptor es idntico al proto-oncogen c-fms. Receptor tiene actividad tirosina kinasa. Formado de 1 cadena de 145-150 kDa (CD117). Conocido como c-kit. El receptor est estructuralmente relacionado al proto-oncogen c-fms Receptor tiene actividad tirosina kinasa. IFN-/R de 102 kDa que liga IFN- e IFN-. Complejo formado de 2 cadenas IFN-gR de 90 kDa (CDw119) Cadena accesoria llamada AF-1 o cadena- de IFN-R. Existen 2 receptores Tipo I de 55 kDa (CD120a) Tipo II de 75 kDa (CD120b) Ambos receptores ligan TNF- y TNF-. Mismo receptor que para TNF-. Tipo I de 55 kDa (CD120) Tipo II de 75 kDa (CD120) Ambos receptores ligan TNF- y TNF-. Una sola cadena de 170 kDa. Receptor tiene actividad tirosina kinasa. Existen 3 receptores Tipo I, 53-68 kDa Tipo II, 65 kDa Tipo III, 250-350 kDa Tipo I y II tienen actividad tirosina kinasa JAK1 STAT1, STAT3 JAK1, TYK2 JAK2, JAK1 STAT1, STAT1, STAT2 STAT1, STAT1, STAT3 JAK2 STAT5

G-CSF

JAK1

STAT3

M-CSF

STAT1, STATX

SCF (c-kit ligand)

IFN-/ IFN-

TNF-

TNF- LT

EGF TGF-

en tirosinas y activacin de varias protenas celulares en respuesta a las citoquinas. Estos receptores no tienen actividad tirosina kinasa intrnseca por lo tanto se deben asociar directa o indirectamente con otras protenas tirosina kinasas, las Janus kinasas (JAK), las cuales activan protenas citoplasmticas estimuladoras y

activadoras de la transcripcin llamadas STATs (STAT1, STAT2, etc). Una vez que se produce la fosforilacin de una o ms STATs, stas pueden formar dmeros u oligmeros para enseguida translocarse al ncleo de la clula y activar directa o indirectamente la transcripcin. Otros substratos incluyen PI-3K, Raf-1 y src kinasas.

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Figura 11-1. Receptores de citoquinas. Estos receptores son protenas de transmembrana altamente especficos. (A) Se representa esquemticamente algunos receptores de citoquinas, indicando en cada caso los diferentes tipos de dominios que presentan. (B) Estos receptores a menudo se asocian con una segunda protena que les confiere funcionalidad. En algunos casos esta segunda protena es compartida por varios receptores.

Familia de los receptores del tipo interfern. Una familia propia de los receptores de las citoquinas es la familia de los receptores del tipo interfern (IFN) o de tipo II, entre los cuales se cuentan IFN/R, IFN-R e IL-10R. La transduccin de la seal por estos receptores involucra la fosforilacin y activacin de la familia de las kinasas JAK al igual que los de la familia de tipo I. Estos mecanismos han sido descritos con bastante precisin para los interferones, no as para IL-10. Superfamilia de las inmunoglobulinas. Otra familia de receptores es aquella que contiene dominios extracelulares del tipo de las inmunoglobulinas, a la cual pertenecen adems varias protenas que tienen un rol fundamental en la respuesta inmune y que no son receptores para citoquinas. Esta familia es caracterizada por una unidad estructural de alrededor de 100 aminocidos con un puente dislfuro que le confiere un plegamiento caracterstico de los dominios de las inmunoglobulinas. Los receptores de las citoquinas pueden contener uno o ms de estos dominios. Entre los receptores para las citoquinas que pertenecen a esta familia se encuentran IL-1R, IL-6R, FGFR (Fibroblast Growth Factor Receptor), PDGFR (Platelet Derived Growth Factor Receptor), M-CSFR (Macrophage Colony Stimulating Factor Recep-

tor) y c-kit, tambin denominado SCFR (Stem Cell Growth Factor Receptor). Familia con actividad tirosina kinasa intrnseca. La familia de los receptores con actividad tirosina kinasa intrnseca la constituye EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), PDGFR, c-kit, M-CSFR y FGFR. El mecanismo de transduccin de seal para estos receptores involucra la oligomerizacin inducida por la unin de la citoquina. Esta oligomerizacin produce autofosforilacin del receptor, lo que a su vez lleva a la unin de otras protenas que contienen dominios SH-2 (dominios src homlogos que se unen a tirosina fosforilada) y que estn involucradas en la cascada de seales. Receptores tipo TNF. Una ltima familia de receptores la constituyen los receptores del tipo TNF (Tumor Necrosis Factor), entre los cuales se cuentan NGFR (Nerve Growth Factor Receptor), TNFR-I (p55), TNFR-II (p75). Otras protenas como Fas y CD40 (la protena Fas juega un rol en la induccin de la apoptosis y CD40 est involucrado en la activacin de los linfocitos B mediante contacto directo con el linfocito T) pertenecen a esta familia de receptores. Los miembros de esta familia se caracterizan por la presencia de tres o cuatro motivos (dominios) de alrededor de 40 aminocidos con predominancia

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de cistenas en la parte extracelular de la molcula. Los mecanismos de transduccin de seales de esta familia llevan a la activacin de la expresin gnica o a la apoptosis. Estos dos mecanismos son mediados por adaptadores moleculares. Tal como se ha mencionado, en numerosos casos los receptores de las citoquinas estn formados por dos o tres subunidades, una de las cuales tiene por funcin unir la citoquina y las otras subunidades estn encargadas de transmitir la seal hacia el interior de la clula. El receptor funcional y de alta afinidad lo constituye el complejo formado por las diferentes subunidades. En algunos casos la subunidad transductora de la seal puede ser compartida por los receptores de varias citoquinas como es el caso de la cadena del receptor de IL-2 que se une al receptor de IL-4, IL7, IL-9 e IL-15. Otro ejemplo es la cadena de GM-CSF que se une al receptor de IL-3 e IL-5, y la subunidad gp130 que es compartida por IL6R, CNTFR, LIFR (Leukaemia Inhibitory Factor Receptor) y OSMR (Oncostatin M Receptor). Si consideramos adems que la subunidad que comparten estos diferentes receptores es la protena transductora de la seal, esto permitira explicar por qu diferentes citoquinas son capaces de ejercer una misma funcin, es decir la "redundancia" de las citoquinas. 3.2. Transduccin de seales Por otra parte, ltimamente se han descubierto formas solubles de muchos de los receptores de las citoquinas. Existen varias hiptesis respecto a la funcin de estos receptores solubles. Primero, los receptores solubles seran producidos por ruptura enzimtica con lo cual impediran que la citoquina pudiese efectuar su accin sobre la clula blanco. Tambin los receptores solubles podran encontrarse en el espacio extracelular y como tal competiran por la citoquina disponible actuando entonces como factores de regulacin negativo. Sin embargo, los receptores solubles que se encontraran en el espacio extracelular podran tener como funcin estabilizar la citoquina en el lugar, en cuyo caso estaran ms bien teniendo un efecto positivo sobre la accin de sta. Una ltima hiptesis discutida en la literatura es que los receptores solubles se podran ligar a protenas de la superficie de una clula que normalmente no tiene receptor para la citoquina y de esta manera hacerla sensible a sta. La familia de receptores de las quimioquinas

ser discutida ms adelante separadamente ya que tiene caractersticas especiales que la distinguen de todas las citoquinas ya mencionadas. Los mecanismos de transduccin de seales de los receptores de tipo I y II han sido extensivamente estudiados y se ha demostrado que involucran las JAK kinasas y las protenas STATs. Se ha demostrado directamente que la unin de una citoquina a su receptor induce la transcripcin de genes especficos a travs de la activacin de las STATs. En la tabla 10-3 se muestran las kinasas y las STATs activadas por cada citoquina. Se observa que citoquinas que comparten la subunidad transductora de la seal, como es el caso de la IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15 para la cadena , esto lleva a que se activen en todos estos casos las mismas JAKs kinasas (JAK-1 y JAK-3), sin embargo existen diferencias en cuanto a las STATs que son activadas en cada caso. Al parecer son las STATs las que le dan la especificidad a las citoquinas. En este mismo sentido cabe notar que casi nicamente los ratones knock out para las subunidades comunes a varias citoquinas, las JAK kinasas o bien las STATs son indispensables haciendo la mutacin letal.

4. PRINCIPALES ACTIVIDADES BIOLGICAS DE LAS CITOQUINAS Las citoquinas participan principalmente en la respuesta inmune innata y la reaccin inflamatoria, en la respuesta inmune especfica o adquirida y en la hematopoyesis. Estas actividades se manifiestan en la proliferacin y diferenciacin celular, la induccin de la sntesis de protenas o de mRNA, su participacin en la activacin celular, su papel como factores quimiotcticos y tambin su participacin en fenmenos como la apoptosis. 4.1. Inmunidad innata Un organismo puede ser infectado por numerosos tipos de patgenos, para lo cual se requieren diferentes medios para su eliminacin, adems de diversos mecanismos efectores. Las clulas implicadas en la inmunidad innata o natural son capaces de desarrollar diferentes funciones y de discriminar en funcin del patgeno qu tipo de funcin efectora debe ser activada. Por el contrario, las clulas de la inmunidad especfica, los linfocitos, no presentan esta

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especializacin sino despus de la etapa de activacin. Los linfocitos vrgenes son, en este sentido, clulas pluripotentes, que pueden diferenciarse hacia distintos linajes dependiendo de las seales que provengan del medio ambiente. Estas seales son inducidas por el patgeno sobre las clulas efectoras de la inmunidad natural. Cada tipo de clula efectora una vez activada producir diferentes citoquinas dependiendo de la naturaleza del patgeno. Estas citoquinas producidas tempranamente en la infeccin, determinan finalmente el tipo de respuesta del sistema inmune especfico. Por lo tanto la inmunidad innata y especfica estn integradas en la respuesta inmune. Dentro de la respuesta inmune innata consideraremos el efecto de las citoquinas en forma separada en la respuesta a patgenos de origen viral, recordando que la respuesta establecida y la produccin de citoquinas tendrn consecuencias en la respuesta inmune especfica as como en la hematopoyesis. Este ltimo tpico, ser tratado separadamente aunque est directamente involucrado en la respuesta inmune en su totalidad. 4.1.1. Inmunidad antiviral Existen dos tipos de respuestas a la infeccin por un virus. En primer lugar se estimula la produccin de interferones de tipo I, es decir INF o IFN-, los cuales tienen como funcin inhibir la replicacin viral. Por otra parte, la infeccin viral provoca la activacin de las clulas NK las cuales son capaces de matar una amplia variedad de clulas infectadas por virus. Los IFNs de tipo I aumentan adems la actividad ltica de las clulas NK, las cuales pueden matar en forma ms eficaz las clulas infectadas. Existen al menos 20 genes para interferones de tipo los cuales estn localizados en una misma regin en el cromosoma 21 en humanos. Las preparaciones naturales de IFN- comprenden una mezcla de stos. Los macrfagos son las mejores clulas productoras de IFN- y por esto se lo llama interfern leucocitario. El IFN- consiste de un nico producto gnico, localizado en la misma region cromosmica del IFN-. Estos dos tipos de interferones presentan muy poca homologa estructural, sin embargo se unen al mismo receptor celular. Los interferones inducen diversos efectos sobre las clulas. Primero, inhiben la replicacin del RNA o DNA viral mediante la sntesis de varias

enzimas, entre las cuales la 2'-5'oligoadenil sintetasa es la mejor estudiada. Esta accin de los interferones es paracrina, es decir, su accin se lleva a cabo en las clulas vecinas que no han sido infectadas. Este efecto es conocido como la induccin del estado antiviral en el cual la proliferacin celular es inhibida. Los interferones de tipo I aumentan la expresin de las molculas de histocompatibilidad de clase I (MHC clase I) e inhiben la expresin de las molculas MHC clase II. Ya que los linfocitos citotxicos (LTc) reconocen los antgenos en funcin de las molculas MHC clase I, la accin de este tipo de interfern favorece el desarrollo de una respuesta inmune especfica celular de tipo Th1. 4.1.2. Citoquinas e inflamacin La inflamacin es una respuesta fisiolgica normal al dao, ya sea mecnico o infeccioso. En las primeras etapas se encuentra localizada, pero luego puede desarrollarse una respuesta sistmica. Las principales alteraciones observadas son: coagulacin, exudacin plasmtica, activacin del sistema del complemento, diapedesis y migracin leucocitaria, activacin de clulas mononucleares y polimorfonucleares y produccin de mediadores solubles, entre ellos citoquinas. Todos los procesos inflamatorios, ya sean de origen inmune u otro, llevan consigo la activacin de macrfagos residentes y la infiltracin de leucocitos desde la sangre. La activacin induce cambios en las clulas entre los cuales se incluyen la produccin de citoquinas. Determinadas citoquinas originan directa o indirectamente la cascada de eventos que genera otros mediadores esenciales en la respuesta inflamatoria. De las numerosas citoquinas presentes en el sitio de la inflamacin, dos de ellas, IL-1 y TNF (Tumor Necrosis Factor-), juegan un papel fundamental. Algunas de sus acciones sobre diversos tipos celulares son: la produccin de mediadores lipdicos, enzimas proteolticas y radicales libres, todos elementos involucrados en el dao observado. IL-1 y TNF- ejercen su actividad citotxica sobre tejidos como el endotelio vascular, el cartlago, los huesos, msculos y las clulas de los islotes de Langerhans. Otras citoquinas, tales como el IFN-, IL-3 o GM-CSF, que pueden ser producidas por otras clulas presentes o atraidas al sitio de la inflamacin, las cuales actan amplificando la respuesta inflamatoria y aumentando la produccin

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de IL-1 y TNF- por los macrfagos. Las citoquinas producidas en el sitio de la inflamacin participan directamente en el reclutamiento de leucocitos en el foco inflamatorio. Este efecto es mediado por la produccin de quimioquinas, tales como IL-8 y MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein). Adems, en clulas endoteliales, IL-1, TNF-+e IFN-, inducen la expresin de molculas de adhesin tales como ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule 1) y VCAM (Vascular Cell Adhesion Molecule) participando de esta manera directamente en la adherencia de clulas sanguneas. Por otra parte, IL-1, TNF- e IL-8 alteran la permeabilidad vascular y permiten una extravasacin de protenas plasmticas. La IL-6, muy abundante en los procesos inflamatorios, induce la produccin de las protenas de fase aguda en los hepatocitos y la respuesta febril junto a IL-1 y TNF-. Lo mismo ocurre con IL-11 y LIF. La reaccin inflamatoria es inhibida por varias citoquinas antinflamatorias, entre las cuales se encuentran TGF- (Transforming Growth Factor beta), IL-4 e IL-10 que inhiben la produccin de IL-1 y de TNF-. Los glucocorticoides tienen igualmente esta capacidad y son producidos por una cascada de eventos iniciada por IL-1, TNF- e IL-6 a travs del sistema o eje neuro-endocrino. La nocin de red de citoquinas se ilustra perfectamente con la participacin de estos mediadores en la reaccin inflamatoria. Las prostaglandinas inducidas por IL-1 y TNF- causan muchos de los efectos observados en la inflamacin. Diversos tipos celulares pueden producir prostaglandinas (siendo PGE-2 la ms importante) en respuesta a IL-1 y TNF-. Otro mediador lipdico que se produce en la inflamacin es el factor activador de plaquetas (PAF) que junto con las prostaglandinas aumentan la permeabilidad vascular inducida por IL-1. La produccin de radicales libres, principalmente xido ntrico (NO), es altamente eficiente en la eliminacin de microorganismos. Sin embargo, el estrs oxidativo provocado por los radicales libres, daa numerosas clulas. La produccin de NO es inducida fuertemente a travs de IL-1 y TNF- en clulas endoteliales, monocitos/macrfagos y fibroblastos. En resumen, IL-1 y TNF- tienen tanto efectos beneficiosos como dainos para el organismo. Entre estos ltimos tenemos las lesiones vasculares, la degradacin del cartlago,

ostelisis, protelisis y citotoxicidad sobre clulas de los islotes de Langerhans. Tambin ejercen un fuerte efecto en el sistema nervioso central, induciendo fiebre, somnolencia y la produccin de glucocorticoides. 4.2. Citoquinas y respuesta inmune Las citoquinas regulan una gran variedad de respuestas inmunes, estimulando o inhibiendo el crecimiento y la diferenciacin de las clulas que componen el sistema inmune. Las citoquinas seleccionan el tipo de respuesta inmune y tambin los mecanismos efectores. Las respuestas inmunes mediadas por clulas involucran la activacin de macrfagos, linfocitos T "helper" (CD4+) y linfocitos T citotxicos (CD8+). Los linfocitos T, B y los macrfagos responden a la estimulacin antignica produciendo una variedad de citoquinas las cuales pueden estimular o inhibir clulas efectoras de la respuesta inmune. Los linfocitos B se activan y producen inmunoglobulinas dependiendo de las seales que reciben de las clulas Th. Los linfocitos B pueden producir distintas clases de inmunoglobulinas con diferentes afinidades dependiendo de las citoquinas que ellos encuentren. La activacin de los linfocitos T y B lleva al desarrollo de la memoria inmunolgica T y B, lo que le da al sistema inmune la capacidad de responder de manera ms rpida y eficaz frente a un estmulo posterior. Se establece as una red de complejas interacciones que determina la respuesta global frente a un estmulo. 4.2.1. Citoquinas y diferenciacin de clulas linfoides En un estado temprano del desarrollo en el timo, algunas citoquinas entre las cuales se incluyen SCF (Stem Cell Factor), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7 y TNF-, pueden jugar un papel importante en la diferenciacin de los linfocitos T. Las clulas que conforman el estroma tmico interactan con los timocitos en los diferentes estados de desarrollo y regulan la produccin de citoquinas de todo el sistema. La combinacin de SCF, IL-3, IL-6 e IL-7 mantienen el crecimiento de las clulas troncales hematopoyticas provenientes de la mdula sea. Los precursores tmicos linfoides expresan el receptor para SCF (CD117), y la expresin de CD117 se correlaciona negativamente con la

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iniciacin del reordenamiento de la cadena del TCR. La respuesta proliferativa temprana de los timocitos a SCF se ve aumentada por la presencia de IL-7, citoquina que es producida por las clulas que conforman el estroma. IL-1 e IL-7, as como TNF-, estn involucradas en la maduracin de los precursores tempranos de los timocitos CD3CD4-CD8- hacia el estado de clulas pro-T que luego pueden dar origen a linfocitos T funcionalmente competentes. IL-2 induce el receptor de alta afinidad para IL-2 en forma autocrina en los timocitos y regula la fase proliferativa temprana permitiendo el pasaje de la fase G1 a la fase S del ciclo celular. IL-2 participa adems en la posterior diferenciacin de las clulas T. El estudio de los receptores para las citoquinas en los timocitos, demostr que los receptores para IL-1, IL-2 e IL-4 estn regulados en el desarrollo y que su expresin est coordinada con la produccin de IL-1 por las clulas estromales y la produccin de IL-2 e IL-4 por los timocitos. Finalmente, las citoquinas influencian tambin el reordenamiento del receptor de los linfocitos T (TCR). 4.2.2. Clulas Th1 y Th2 Polarizacin de las clulas T "helper" Los linfocitos T maduros producen citoquinas en respuesta a una estimulacin antignica. La produccin de citoquinas por los linfocitos T activados depende de las seales que recibe del microambiente constituido por las clulas presentadoras de antgeno (CPA) y clulas accesorias de la respuesta inmune. En ratn y humanos, estudios realizados con clones de clulas Th (CD4+) han demostrado la existencia de al menos 2 subpoblaciones de clulas Th: Th1 y Th2. Estas subpoblaciones difieren en el espectro de citoquinas que ellas secretan una vez que son activadas: Los linfocitos LTh1 secretan IL-2, IFN, TNF- y los Th2 secretan IL-4, IL-5, IL-10. Se ha demostrado adems que las clulas T CD8+ y algunas clulas T tienen patrones de secrecin de citoquinas similares a Th1 y Th2, aunque no secretan IL-2. La polarizacin de los linfocitos T se debe a una secrecin temprana de citoquinas por clulas que participan probablemente en la inmunidad natural, como son macrfagos, clulas NK y en algunos casos incluso clulas epiteliales. La

secrecin de citoquinas por estas clulas accesorias depende de la naturaleza del antgeno, de la va de introduccin del antgeno as como de la concentracin del antgeno. IL-12, IFN- e IL-4 juegan un papel crtico en la diferenciacin hacia una u otra subpoblacin de linfocito Th. Hasta hace poco se pensaba que los macrfagos, las clulas T NK1.1+ y los mastocitos eran los responsables de la produccin temprana de estas citoquinas. Sin embargo, eosinfilos, neutrfilos, clulas epiteliales, clulas dendrticas y keranocitos producen y pueden guardar grandes cantidades de stas y otras citoquinas en funcin del estmulo que ellas reciben. No se conocen an marcadores de superficie especficos de Th1 o Th2, aunque la molcula CD30 es un buen candidato para las clulas Th2. Las clulas Th1 y Th2 tienen diferentes requerimientos para la proliferacin y activacin. Las clulas Th1 usan IL-2 como factor de crecimiento autocrino y casi no responden a IL-4. Las clulas Th2 usan IL-4 como factor de crecimiento autocrino pero tambin proliferan en respuesta a IL-2. Las clulas Th2 pueden ser activadas en ausencia de CPA por anticuerpos dirigidos contra TCR/CD3, pero necesitan IL-1 como coestmulo para proliferar. La IL-1 regula positivamente la produccin de IL-4, as como la expresin del IL-2R. Se desconoce si aumenta la expresin del IL-4R. Aparentemente IL-4 aumenta la expresin del IL-1R. Se puede concluir de esto ltimo que IL-1 e IL-4 son interdependientes. Las clulas Th1 no requieren IL-1 como coestmulo para su proliferacin y no expresan el receptor para esta citoquina. Las clulas Th1 y Th2 regulan mutuamente su actividad a travs de la produccin de citoquinas inhibitorias de la proliferacin de una u otra subpoblacin. IFN- e IL-4 son antagnicas en el desarrollo de clulas Th2 o Th1, respectivamente. Es as como, IFN- inhibe la proliferacin de Th2, mientras que IL-10 inhibe la proliferacin de Th1 mediante la inhibicin de la produccin de IFN-. Esta regulacin puede ocurrir tambin a nivel de las clulas efectoras activadas por estas subpoblaciones. Por ejemplo, en la produccin de diferentes isotipos de inmunoglobulinas, IL-4 induce la produccin de IgE, mientras que IFN- induce la produccin de IgG2a. De manera general Th1 regula negativamente la produccin de anticuerpos inducida por las clulas Th2 en las clulas B.

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Precursores de las clulas Th1 y Th2 Las clulas Th1 y Th2 derivan de una poblacin Th0, capaz de secretar ambos patrones de citoquinas. Th0 puede representar un progenitor no comprometido con la capacidad de diferenciarse hacia una u otra poblacin dependiendo de las seales que reciba del microambiente. Es posible postular que existen clulas T precomprometidas capaces de secretar ambos patrones de citoquinas, antes de desarrollarse en una clula comprometida hacia un determinado linaje T. Si esto fuera cierto, la activacin policlonal de clulas T debera llevar a la produccin del conjunto completo de citoquinas, pero en realidad slo se encuentran grandes cantidades de IL-2. Esto implica que la clula T virgen, solamente es capaz de producir IL-2. En otros estudios en los cuales se activan las clulas T con formol miristato (PMA) y ionforo de Ca, se demostr la produccin de IL-2 e IL-4. La identidad de Th0 no est an establecida. Funcin de las clulas Th1 y Th2 in vivo La activacin de las clulas Th por interaccin con un ligando, lleva a la clula Th en reposo a diferenciarse hacia algn subgrupo funcional caracterizado por el espectro de citoquinas que secretan. Las clulas Th1 secretan IL-2 e IFN- y activan los macrfagos y reacciones de hipersensibilidad retardada. Las clulas Th2 producen IL-4, IL-5 e IL-10, las cuales son importantes para la produccin de IgE, y suprimen la inmunidad mediada por clulas. Se ha postulado una tercera subpoblacin de linfocitos Th, Th3, la cual secretara principalmente TGF. En este ltimo tiempo parece haberse encontrado finalmente las clulas T supresoras postuladas hace muchos aos, actualmente llamadas clulas T reguladoras. Esta subpoblacin tiene la caracterstica de coexpresar CD4 y CD25 en forma endgena, y de secretar principalmente IL-10, una citoquina reconocidamente inhibitoria. Se mencionan aqu por su importancia aunque la caracterizacin es an muy reciente. Las citoquinas que produce cada subpoblacin actan como factores de crecimiento autocrino. No se sabe an con certeza si estas poblaciones se desarrollan in vivo. Actualmente existen evidencias indirectas de estas subpoblaciones ya que estos estudios han sido

realizados en clulas activadas o en determinadas patologas. Algunas respuestas inmunes parecen ser dominadas por una u otra subpoblacin, resultados inferidos a partir del espectro de citoquinas que se produce en una patologa particular. Por ejemplo, la inmunizacin con un antgeno en adjuvante de Freund completo, lleva a respuestas de tipo DTH (hipersensibilidad de tipo retardada) e involucran IFN- y anticuerpos, pero no del tipo IgE. El mismo antgeno adsorbido en almina provoca la produccin de IgE y poca DTH. La infeccin de ratones con ciertos tipos de parsitos (Helmnticos) produce gran cantidad de IgE, eosinofilia y una reducida cantidad de IL-2 e IFN-. Por lo tanto se produce una respuesta selectiva de tipo Th2. La infeccin con bacterias activa una respuesta dominante de tipo Th1, con altos niveles de IgG2a. Diferentes cepas de ratones pueden activar selectivamente una u otra respuesta contra un mismo antgeno. Ratones Balb/c infectados con Leischmania mayor, producen una enfermedad fatal la cual est dominada por altos niveles de IL-4. Este efecto se puede revertir si se les inyecta anticuerpos anti-IL-4 o transfiriendo clulas Th1. Sin embargo, C57Bl/6 produce una respuesta de tipo Th1 y elimina la infeccin. En general, agentes infecciosos intracelulares expanden clulas Th1, mientras que antgenos exgenos expanden respuestas de tipo Th2. No se sabe cules son los factores que activan una respuesta de tipo Th1 o Th2, pero estos hechos involucran adems componentes genticos. Otro rol funcional asignado a las clulas Th1 y Th2 es su participacin en el cambio de clase de inmunoglobulinas secretada por los linfocitos B. Esto ltimo es importante, ya que el cambio de isotipo lleva a un cambio en la funcin efectora del anticuerpo producido, sin cambiar su especificidad por el antgeno. Las clulas Th1 regulan pricipalmente la produccin de IgG2a por los linfocitos B, mientras que las clulas Th2 regulan la produccin de IgE. Ambos tipos de clulas Th son capaces de regular la produccin de IgM y de IgG3. Los linfocitos Th1 son clulas pobremente ayudadoras para los linfocitos B. Esto en parte debido a la produccin de IFN- que inhibe la estimulacin producida por IL-4, en particular para la produccin de IgE. Estas clulas presentan tambin actividad citotxica contra los linfocitos B presentadores de antgeno, de all que aparezcan como clulas supresoras de un determinado isotipo de inmunoglobulina.

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Subpoblaciones de linfocitos Th humanos Los estudios realizados in vitro con clones de linfocitos T activados, no han permitido demostrar la existencia de patrones de secrecin bien definidos. Los linfocitos Th humanos se parecen ms a los linfocitos Th0 murinos. Clones de clulas T derivados de dadores reactivos a alergenos o inmunizados con toxina tetnica, han demostrado la presencia de clones especficos para alergenos selectivamente enriquecidos en clulas capaces de producir IL-4. La inmunizacin con toxina tetnica produce preferencialmente IL-2 e IFN-. Esto demuestra que la inmunizacin in vivo activa selectivamente subpoblaciones similares a las encontradas en el ratn. No ha sido posible actualmente diferenciar estas respuestas in vitro pero los estudios realizados in vivo permiten postular la existencia de estas subpoblaciones celulares en humanos. 4.2.3. Activacin de linfocitos B Los linfocitos B en reposo pueden ser activados de manera independiente o dependiente de los linfocitos T. En cualquiera de los casos, la presencia de determinadas citoquinas es indispensable. Las citoquinas tienen dos funciones principales en las respuestas mediadas por inmunoglobulinas: participan en las fases proliferativas y de diferenciacin de los linfocitos B y promueven selectivamente el cambio de clase de las inmunoglobulinas (switch isotpico). Numerosas citoquinas pueden estimular la proliferacin de los linfocitos B. De las citoquinas producidas por los linfocitos Th, IL-2, IL-4 e IL-5 participan en la proliferacin y adems pueden actuar en sinergia para llevar a cabo este efecto. La IL-6, que es producida por varios tipos celulares participa en la proliferacin de los linfocitos B ya diferenciados productores de anticuerpos (plasmocitos). IL-1, IL-10 y TNF estimulan su crecimiento in vitro. La redundancia de las citoquinas involucradas en la proliferacin de los linfocitos B explica en parte por qu al bloquear la produccin de una determinada citoquina, esto no tiene efecto en la produccin de anticuerpos. Las citoquinas participan directamente en la secrecin de anticuerpos en respuesta a un antgeno. En el ratn ha sido demostrado que IL4 e IL-5 participan en esta funcin. En humanos se ha podido demostrar que IL-2 e IL-6 aumentan la produccin de anticuerpos. Probablemente todas estas citoquinas participan en ambos sistemas en

la produccin de anticuerpos, slo que el resultado est reflejando diferentes condiciones experimentales. La funcin ms especfica de las citoquinas sobre los linfocitos B es su participacin en el cambio de isotipo de la inmunoglobulina secretada. Los ejemplos ms claros de esta funcin de las citoquinas son IL-4, la cual es absolutamente necesaria para la produccin de IgE e IFN- que est implicado en la produccin de IgG2a. TGF- en conjunto con IL-5 participan en el cambio de isotipo a IgA. La afinidad de las inmunoglobulinas secretadas por los linfocitos B depende tambin de las citoquinas presentes en el sitio donde se est llevando a cabo la reaccin. 4.2.4. Respuesta inmune especfica mediada por clulas Los linfocitos T CD4+ y CD8+ activados secretan un grupo de citoquinas que sirven para activar clulas efectoras de la respuesta inmune no especfica o natural. Estas citoquinas comprenden el interfern inmune o IFN-, TNF o linfotoxina, IL-10, IL-5 e IL-12. Todas estas citoquinas producen la activacin de numerosos tipos celulares entre los cuales los principales son macrfagos, clulas NK, linfocitos T y B, clulas endoteliales, neutrfilos y eosinfilos. El IFN- es producido por los linfocitos T CD4+ del tipo Th1, T CD8+ y clulas NK. La produccin de IFN- es producida como consecuencia inmediata de la activacin de la respuesta inmune especfica y es estimulada por IL-2 e IL-12. IFN- es el ms potente activador de los macrfagos para matar microorganismos fagocitados. Tambin activa macrfagos para matar clulas tumorales. El IFN- acta a nivel de la fase de reconocimiento en la respuesta inmune, mediante la estimulacin de la sntesis de molculas MHC de clase I y la induccin de la sntesis de molculas MHC de clase II en numerosos tipos celulares que normalmente no las expresan. Por lo tanto, el IFN es capaz de activar tanto clulas T CD4+ como T CD8+. Como ya se seal, el IFN- promueve la diferenciacin de los linfocitos T CD4+ hacia el fenotipo Th1 e inhibe la proliferacin de clulas Th2. La maduracin de los linfocitos T CD8+ hacia LTc requiere de la presencia de IFN-. Como se vio anteriormente, el IFN- acta sobre los linfocitos B estimulando el cambio de isotipo de

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las inmunoglobulinas hacia IgG2a e Ig3, al mismo tiempo que inhibe el cambio a IgG1 e IgE. El IFN estimula la actividad citotxica de las clulas NK y activa los neutrfilos, aunque de manera menos eficaz que TNF- o LT. El IFN- puede sinergizar la actividad de estas ltimas citoquinas. El IFN- estimula la sntesis de numerosas otras protenas, entre otras, molculas de adhesin en clulas endoteliales vasculares, lo que facilita la extravasacin de linfocitos T CD4+. Todas estas acciones del IFN- conllevan a respuestas del tipo Th1 y estimulan la reaccin inflamatoria. La linfotoxina (TNF-) es una citoquina que tiene un cierto grado de homologa con TNF-, pero a diferencia de TNF-, es sintetizada exclusivamente por linfocitos T. La linfotoxina se une al mismo receptor que TNF-, regulando en consecuencia los mismos tipos de reacciones. TNF- es un potente activador de los neutrfilos, y por lo tanto se encuentra implicada en la reaccin inflamatoria, y contribuye adems a la lisis mediada por LTc de las clulas blanco. La linfotoxina, al igual que el IFN-, activa las clulas endoteliales aumentando la adhesin de leucocitos y la produccin de citoquinas. La IL-10 es una citoquina que tiene ms bien efectos inhibitorios sobre la respuesta inmune. Esta es producida por las clulas Th2 y varios otros tipos celulares. Las actividades ms importantes de la IL10 son la inhibicin de las funciones accesorias del macrfago y la produccin de citoquinas por ste. Estos efectos llevan a una inhibicin de la reaccin inflamatoria mediada por linfocitos T y a la estimulacin de los linfocitos B. Un hecho sorprendente es que el virus Epstein-Barr posee en su genoma un gen homlogo a IL-10, lo cual podra significar que este virus adquiri este gen con el objeto de evadir la respuesta inmune. La IL-5 es una citoquina producida por linfocitos Th2 y mastocitos activados. Su principal accin es la de estimular la proliferacin y diferenciacin de eosinfilos de tal manera que ellos sean capaces de eliminar clulas infectadas con un determinado parsito. La IL-5 acta en sinergia con IL-2 e IL-4 para estimular el crecimiento y la diferenciacin de los linfocitos B. La IL-12 tiene gran importancia en la respuesta inmune por las numerosas actividades biolgicas en las cuales participa. El efecto global de la IL-12 est en la respuesta inmune mediada por clulas, debido a los efectos que tiene sobre las clulas NK y los linfocitos T. La IL-12 es el ms potente estimulador de las clulas NK,

induciendo adems la produccin de IFN- por estas clulas. Para llevar a cabo estos efectos, la IL-12 puede actuar adems en sinergia con IL-2 produciendo las denominadas clulas LAK (Lymphokine Activated Killer Cells). La diferenciacin de las clulas Th1 es dependiente de la presencia de IL-12, la cual inhibe la proliferacin de clulas de tipo Th2. Finalmente, la IL-12 estimula la diferenciacin de linfocitos T CD8+ a clulas T citotxicas. 4.3. Citoquinas y hematopoyesis Las clulas de la sangre que ayudan a mantener la funcionalidad del organismo, tienen una vida media limitada. Por lo tanto, estas clulas terminales deben ser reemplazadas. La produccin de las clulas sanguneas es un proceso dinmico finamente regulado a nivel celular e intracelular. La regulacin involucra por una parte las clulas de la sangre y clulas accesorias, y por otra parte, las clulas que responden a la accin de las citoquinas. Entre las clulas accesorias, las cuales producen diferentes citoquinas, estn linfocitos, monocitos, macrfagos, granulocitos, clulas NK, fibroblastos, clulas endoteliales, adipocitos, miocitos y clulas del estroma en general. Las clulas sobre las cuales van a actuar las citoquinas dependern de la presencia en su superficie del receptor adecuado para la citoquina producida por la clula accesoria. Actualmente se conocen ms de 40 citoquinas, que tienen efecto sobre la hematopoyesis. Estas citoquinas tienen efectos estimulantes o supresores. Muchas de las citoquinas tienen actividad pleiotrpica, ms que efectos especficos. A su vez, las citoquinas pueden ejercer un efecto directo o indirecto en la hematopoyesis. Entre las acciones directas tenemos los efectos sobre las clulas troncales (stem cells) y progenitoras de las clulas de la sangre. Las clulas troncales son clulas multipotenciales con capacidad de autorregenerarse. Dentro del compartimiento troncal existe una jerarqua. Las clulas ms inmaduras tienen ms capacidad de autorrenovarse y una mayor capacidad de proliferacin mientras que las clulas ms maduras tienen una capacidad limitada de autorrenovarse y son menos proliferativas, pero con mayor capacidad para diferenciarse. Las clulas progenitoras hematopoyticas pueden detectarse en ensayos de proliferacin en

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medio semislido, por su capacidad formadora de colonias. Las clulas troncales se diferencian en una variedad de clulas, entre las cuales tenemos las CFU-GEMM (unidades formadoras de colonias granuloides, eritroides, mieloides y mielomonocticas) y clulas con un linaje ms restringido tales como CFU-GM (colonias mixtas granuloctica monoctica), CFU-G (granuloctica), CFU-M (monoctica), BFU-E (eritroides tempranas), CFU-E (eritroides ms maduras) y BFU-MK (megacariocticas) (ver captulo 3). Este tipo de ensayo ha permitido definir solamente los progenitores mieloides. Los progenitores de las clulas linfoides han sido definidos mediante marcadores de superficie principalmente. Las clulas troncales y progenitoras son muy escasas en la sangre, con frecuencias menores que 1/10.000; por lo tanto ha sido dficil demostrar un efecto directo de las citoquinas sobre estas clulas. Esto ha implicado tener que enriquecer o purificar una determinada poblacin para un estudio posterior. Estas mismas tcnicas se han aplicado en los trasplantes de mdula sea donde las clulas troncales juegan un papel fundamental. Durante la ontogenia las clulas troncales se encuentran primero en el saco vitelino, luego en el hgado fetal, ms tarde en el bazo fetal y finalmente en la mdula sea. Al nacimiento, la sangre que se encuentra en el cordn umbilical y la placenta tiene una alta concentracin de clulas troncales. En el caso de los trasplantes de mdula sea, el nmero de clulas troncales que se trasplantan es muy importante, por lo tanto gracias a estos conocimientos se ha podido desarrollar la tecnologa adecuada para realizar trasplantes alognicos en casos de compatibilidad HLA, utilizando como fuente de clulas troncales la sangre de cordn umbilical. Debido al nmero de clulas troncales, este tipo de trasplante ha sido posible slo en nios. En adultos, la mayor fuente de clulas troncales es la mdula sea y sta es la fuente usada de rutina en los trasplantes autlogos y alognicos. La sangre tambin es una fuente de clulas progenitoras, pero antes de recolectar las clulas troncales es necesario movilizarlas hacia la periferia usando factores de crecimiento tales como GM-CSF, G-CSF, IL-3 o combinaciones de ellos. Sin embargo las citoquinas no slo cumplen una funcin en los trasplantes sino tambin en la estimulacin y supresin de la hematopoyesis en una situacin determinada. Finalmente, los factores de crecimiento

hematopoytico contribuyen a mantener un amplio rango de funciones fisiolgicas. Por ejemplo, en conjunto con un antgeno especfico presentado por la CPA, la IL-2 contribuye a la proliferacin de linfocitos T y B, la cual en conjunto con IL-1 promueve la produccin de clulas NK a partir de progenitores hematopoyticos. La IL-2 e IFN- promueven la maduracin de los linfocitos B y actan directamente en la estimulacin de la produccin de IFN- por los macrfagos y clulas NK, e igualmente aumentan la capacidad citotxica de los macrfagos. 4.3.1. Factores estimuladores de colonias Las citoquinas que estimulan la hematopoyesis son tambin responsables del desarrollo, mantencin y activacin funcional de las clulas efectoras de la respuesta inmune. Los linfocitos cumplen un papel fundamental en la respuesta inmune, pero son clulas tales como granulocitos, eosinfilos y otros que participan activamente en la primera lnea de respuesta frente a la agresin causada por un agente patgeno o una agresin mecnica. Las principales citoquinas que estimulan la hematopoyesis son los diferentes "factores estimuladores de colonia", denominados por CSF antecedido por la inicial del tipo de clulas progenitoras sobre la cual acta. Entre estos tenemos GM-CSF, G-CSF, M-CSF. Otras citoquinas como IL-3 , IL-7, IL-12 y "c-kit ligand" o (SCF) tienen una funcin esencial en la hematopoyesis. Las acciones de estas citoquinas son influenciadas por otras citoquinas, algunas de las cuales como TNF-, LT, IFN- y TGF-, inhiben el crecimiento de los progenitores hematopoyticos. Las citoquinas que tienen un efecto estimulador directo en la proliferacin de las clulas progenitoras mieloides son IL-3, GM-CSF, G-CSF, M-CSF e IL-5. La eritropoyetina (Epo) acta sobre los progenitores eritroides. La IL-3 y el GM-CSF son citoquinas que actan sobre los progenitores ms tempranos, mientras que el GCSF, M-CSF, Epo e IL-5 actan sobre progenitores de linaje ms restringido. Todas estas citoquinas, a excepcin de IL-5, han sido usadas en estudios clnicos en humanos y ellas han acelerado la recuperacin de la hematopoyesis en una variedad de patologas. Sus efectos son dosis dependientes y su toxicidad es mnima. Los factores estimuladores de colonias actan en forma aditiva a sinrgica cuando se usan en

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combinacin. Esto ha llevado a producir citoquinas recombinantes a partir de protenas de fusin entre diferentes citoquinas. Una de estas citoquinas, PIXY321, producida por la fusin de GM-CSF e IL-3 por tcnicas de biologa molecular, es 10 veces ms activa que la combinacin de las 2 citoquinas. Las razones de esta sinergia se desconocen . Algunos de estos factores de crecimiento interactan con componentes de la matrix extracelular para contribuir a la funcin de los progenitores o clulas efectoras. El GM-CSF es producido por linfocitos T, macrfagos, fibroblastos y clulas endoteliales. Esta citoquina es un factor de sobrevida y crecimiento para progenitores hematopoyticos, as como para precursores ms maduros tales como eritrocitos, linfocitos T, megacariocitos, e igualmente para clulas endoteliales. Esta citoquina es adems un factor de diferenciacin y activacin para granulocitos y monocitos. Por otra parte, GM-CSF junto con G-CSF, IL-5 y M-CSF inducen la proliferacin y diferenciacin de precursores de neutrfilos, eosinfilos y monocitos respectivamente. Es interesante notar que el receptor de GMCSF, que es un complejo formado por una cadena de baja afinidad unida a una cadena , comparte esta ltima cadena con los receptores para la IL-3 e IL-5. Esta propiedad de los receptores podra explicar, en parte, que estas citoquinas posean funciones similares. El G-CSF es producido por macrfagos, fibroblastos, clulas endoteliales y clulas que conforman el estroma de la mdula sea. Este es un factor de crecimiento, diferenciacin y activacin de neutrfilos y sus precursores. Sinergiza con IL-3 para estimular el crecimiento de progenitores hematopoyticos, y causa proliferacin y migracin de clulas endoteliales. El receptor de G-CSF est compuesto de una sola molcula con una estructura hbrida que contiene un dominio Ig, un dominio hematopoyetina y 3 dominios FNIII. Existen formas solubles del receptor. El M-CSF es un factor de crecimiento, diferenciacin y activacin para macrfagos y sus clulas progenitoras. Este es producido por mltiples fuentes, incluyendo linfocitos monocitos, fibroblastos, clulas endoteliales, mioblastos y osteoblastos. Esta citoquina puede ser producida como una molcula soluble o una molcula de membrana.

4.3.2. Otras citoquinas estimuladoras de la hematopoyesis Varias citoquinas que no tienen un efecto directo sobre las clulas troncales o progenitoras, pueden aumentar el efecto proliferativo de los factores estimuladores de colonias en combinacin con ellos. Entre estas citoquinas tenemos: SCF, IL-1, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-12, LIF, MIP-1 (Macrophage Inflammatory Protein1), MIP-1 (Macrophage Inflammatory Protein-1) y MIP-2 (Macrophage Inflammatory Protein-2). De todas estas citoquinas la que tiene el efecto ms notable es SCF. Esta citoquina est presente de manera soluble o ligada a la membrana celular debido al procesamiento alternativo del mRNA. SCF soluble aumenta el nmero y el tamao de CFU-GEMM, BFU-E, CFU-GM, CFU-G derivadas por estimulacin con Epo o Epo ms IL-3, GM-CSF o G-CSF. SCF acta en sinergia con los factores estimuladores de colonias e IL-7. En estudios en animales, SCF ha sido asociado con aumento de la hematopoyesis (aumento de clulas troncales y progenitoras) en la mdula sea y movilizacin de clulas troncales hacia la sangre. El receptor para SCF es el proto-oncogen, c-kit, de ah que SCF sea tambin conocido como "c-kit ligand", (ligando para c-kit) el cual est expresado en todos los progenitores hematopoyticos excepto en precursores del linaje B. C-kit es una glicoprotena de membrana que consta de 5 dominios tipo inmunoglobulina y un dominio tirosina kinasa intracelular. El receptor funcional es probablemente un homodmero al igual que el SCF funcional. La IL-7 es producida por clulas estromales de la mdula sea y del timo. sta acta como un factor de crecimiento para los progenitores de los linfocitos B y T, aunque tambin estimula el crecimiento de linfocitos T maduros. La IL-9 es una citoquina que aumenta la proliferacin de los linfocitos T y de precursores eritroides aunque su funcin principal es estimular a los mastocitos. Esta citoquina es producida principalmente por linfocitos Th2 activados. La IL-11 es secretada por lneas celulares obtenidas de clulas estromales de mdula sea y acta sobre clulas troncales multipotenciales y progenitores comprometidos hacia macrfagos y megacariocitos. En un estudio reciente hecho in vivo en ratones, se demostr la capacidad de IL-12 para movilizar progenitores hematopoyticos hacia la

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sangre perifrica, efecto que se produce en sinergia con otras citoquinas. La IL-12 es producida por macrfagos y linfocitos B. Esta citoquina aumenta la respuesta inmune mediada por clulas, mientras que suprime la respuesta humoral. Los numerosos efectos estimulatorios hacen pensar de que IL-12 podra ser beneficiosa en el tratamiento de neoplasias. 4.3.3. Citoquinas supresoras Las citoquinas involucradas como molculas supresoras de la hematopoyesis son: lactoferrina, la subunidad H de ferritina, las prostaglandinas E1 y E2, TNF-, TNF-, IFN-a, IFN-, IFN-, TGF-, inhibina y algunos miembros de la familia de las quimioquinas.

5. QUIMIOQUINAS Las quimioquinas corresponden a un grupo de pequeas protenas bsicas (8-14 kDa), secretadas y estructuralmente relacionadas que fueron inicialmente descritas como molculas inducidas por la inflamacin y capaces de atraer monocitos, neutrfilos y linfocitos T activados. Posteriores investigaciones han mostrado que las quimioquinas cumplen un importante papel en la coordinacin del trfico linfocitario a travs de todo el cuerpo durante la vigilancia inmune y en la direccin de complejos movimientos celulares durante el desarrollo y diferenciacin de los linfocitos. Las quimioquinas tambin tienen efectos sobre clulas del sistema nervioso y el endotelio donde ejercen efectos angiognicos. Dos propiedades generales caracterizan a estas molculas: no son especie-especficas y son promiscuas en el uso de sus receptores. No obstante, tambin existen quimioquinas muy especficas. Hasta ahora se han descrito ms de 50 quimioquinas y en algunos casos la misma molcula ha sido reportada con nombres diferentes contribuyendo a crear una cierta confusin en este campo. Por lo tanto, recientemente se ha planteado una nueva clasificacin sistemtica de las quimioquinas (tabla 11-3). Las quimioquinas se clasifican en cuatro familias de acuerdo al nmero y espaciamiento de los aminocidos cistenas localizados cerca de su extremo amino-terminal. La familia CC agrupa a las quimioquinas cuyas dos cistenas se encuentran adyacentes, la familia C presenta una sola cistena y las familias CXC y

CX 3 C corresponden a quimioquinas cuyas cistenas se encuentran separadas por uno o tres aminocidos, respectivamente. Las quimioquinas actan a travs de su interaccin con receptores que poseen siete dominios de transmembrana acoplados a la familia de protenas G heterotrimricas y la transduccin de la seal de quimiotaxis es mediada por la subunidad Gi sensible a la toxina de Pertussis. Los receptores de quimioquinas se denominan de la misma manera que los ligandos seguidos por la letra R y un nmero (CCR1-9, CXCR1-5, XCR1, etc). Segn la nueva nomenclatura propuesta, las quimioquinas se designan con una letra L seguida por un nmero correspondiente al nmero del gen que codifica para esa quimioquina (tabla 11-3). Probablemente la mayora, si no todas, las quimioquinas se han originado por duplicacin gnica a partir de un gen ancestral. De hecho, los genes de muchas quimioquinas se encuentran agrupados en ciertas regiones cromosmicas. Un gran nmero de genes de quimioquinas CC humanas que tienen efectos sobre monocitos se encuentran agrupados en la regin 17q11.2, mientras que los genes de quimioquinas CXC que actan principalmente sobre neutrfilos se localizan en la regin cromosmica 4q12-13. No obstante, recientemente se ha descrito que algunas quimioquinas CXC especficas para linfocitos T (CXCL9, CXCL10 y CXCL11) forman una nueva mini-agrupacin gnica separada de la principal agrupacin 4q12-13. Esta diversificacin reflejara un cierto grado de especializacin funcional desarrollado a travs de la evolucin. La duplicacin gnica de las quimioquinas explicara su conservacin entre las especies, la redundancia de sus funciones y la promiscuidad con que se unen a sus receptores. Es posible que esta multiplicidad de funciones haya surgido en respuesta a la necesidad de producir una gran cantidad de factores quimiotcticos que aseguraran el reclutamiento de diferentes tipos de leucocitos al sitio de la inflamacin. 5.1. Quimioquinas en la diferenciacin linfocitaria En los rganos linfoides primarios (mdula sea para linfocitos B y el timo para linfocitos T) ocurre la diferenciacin y maduracin de los linfocitos a partir de una clula progenitora multipotencial (ver captulos 3 y 13). Recientes estudios han mostrado que las clulas progenitoras

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Tabla 11-3. Clasificacin de las quimioquinas y sus receptores Nombre sistemtico Ligando humano Familia C XCL1 XCL2 Familia CX3C CX3CL1 Familia CC CCL1 CCL2 CCL3 CCL4 CCL5 CCL6 CCL7 CCL8 CCL9/10 CCL11 CCL12 CCL13 CCL14 CCL15 CCL16 CCL17 CCL18 CCL19 CCL20 CCL21 CCL22 CCL23 CCL24 CCL25 CCL26 CCL27 Familia CXC CXCL1 CXCL2 CXCL3 CXCL4 CXCL5 CXCL6 CXCL7 CXCL8 CXCL9 CXCL10 CXCL11 CXCL12 CXCL13 CXCL14 CXCL15 Linfotactina/SCM-1/ATAC SCM-1 Ligando murino Linfotactina desconocido Receptores XCR1 XCR1

Fractalquina

Neurotactina

CX3CR1

I-309 MCP-1/MCAF MIP-1/LD78 MIP-1 RANTES desconocido MCP-3 MCP-2 desconocido Eotaxina desconocido MCP-4 HCC-1 HCC-2/Lkn-1/MIP-1 HCC-4/LEC TARC DC-CK1/PARC AMAC-1 MIP-3/ELC/exodus-3 MIP-3/LARC/exodus-1 6Cquina/SLC/exodus-2 MDC/STCP-1 MPIF-1 MPIF-2/Eotaxina-2 TECK Eotaxina-3 CTACK/ILC

TCA-3, P500 JE MIP-1 MIP-1 RANTES C10, MRP-1 MARC MCP-2 MRP-2, CCF18, MIP-1 Eotaxina MCP-5 Desconocido Desconocido Desconocido LCC-1 TARC Desconocido MIP-3/ELC/exodus-3 MIP-3/LARC/exodus-1 6Cquina/SLC/exodus-2/TCA-4 ABCD-1 Desconocido Desconocido TECK Desconocido ALP/CTACK/ILC

CCR8 CCR2 CCR1, CCR5 CCR5 CCR1, CCR3, CCR5 desconocido CCR1, CCR2, CCR3 CCR3 desconocido CCR3 CCR2 CCR2, CCR3 CCR1 CCR1, CCR3 CCR1 CCR4 desconocido CCR7 CCR6 CCR7 CCR4 CCR1 CCR3 CCR9 CCR3 CCR10

GRO/MGSA- GRO/MGSA- GRO/MGSA- PF4 ENA-78 GCP-2 NAP-2 IL-8 Mig IP-10 I-TAC SDF-1/ BLC/BCA-1 BRAK/bolequina Desconocido

GRO/KC GRO/KC GRO/KC PF4 LIX Cka-3 Desconocido Desconocido Mig IP-10 Desconocido SDF-1 BLC/BCA-1 BRAK Lungquina

CXCR2, CXCR1 CXCR2 CXCR2 Desconocido CXCR2 CXCR1, CXCR2 CXCR2 CXCR1, CXCR2 CXCR3 CXCR3 CXCR3 CXCR4 CXCR5 Desconocido Desconocido

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hematopoyticas (CPH) humanas expresan el receptor CXCR4 y que en experimentos in vitro son capaces de migrar y de inducir la expresin de molculas de adhesin en respuesta a la quimioquina CXCL12. Esta quimioquina se ha detectado tempranamente en el hgado fetal murino durante la colonizacin de las CPH (da embrionario 10.5-12.5) y decae abruptamente cuando estas clulas migran desde el hgado hacia la mdula sea (da embrionario 14.5). A su vez, en la microvasculatura y en las clulas estromales de la mdula sea es posible detectar CXCL12. Experimentos genticos han mostrado que ratones que no expresan el gen de CXCL12 o el receptor CXCR4 (CXCR4-/-) mueren perinatalmente y presentan una mielopoyesis y linfopoyesis de clulas B reducida en el hgado fetal y prcticamente ausente en la mdula sea. Estos resultados sugieren que CXCL12 es el nico ligando de CXCR4 y son un ejemplo de especificidad funcional de las quimioquinas. Una vez que las clulas B han terminado su proceso de maduracin en la mdula sea, ellas abandonan este rgano y salen a la circulacin perifrica. Estudios in vitro han mostrado que a partir del estado de diferenciacin descrito como de clulas B inmaduras, stas comienzan a perder su capacidad de respuesta a CXCL12 lo que ha sido interpretado como una estrategia para escapar al efecto de retencin de esta quimioquina y poder as emigrar de la mdula sea. Por otra parte, la maduracin de los timocitos implica la migracin de estas clulas a travs de distintos subcompartimentos tmicos que comienza en la regin ms externa de la corteza y culmina en la mdula tmica. Diversos estudios han mostrado la expresin diferencial de ciertas quimioquinas y la respuesta tambin diferencial de los timocitos a lo largo de este proceso. Hasta ahora, en la regin cortical slo se han identificado las quimioquinas CXCL12 y CCL25. La deteccin de CXCL12 se correlaciona con la alta expresin de su receptor CXCR4 en timocitos doble positivos (CD4+/CD8+), si bien su accin puede estar sobrepuesta con otros factores ya que el desarrollo de clulas T ocurre normalmente en los ratones CXCR4-/-. CCL25 es detectada en clulas dendrticas y epiteliales tmicas en la corteza, en la mdula e incluso en el timo fetal lo que sugiere que podra participar en el reclutamiento de clulas progenitoras tmicas. Sin embargo, estudios in vitro han mostrado que la neutralizacin de CCL25 no influye sobre el poblamiento tmico. Por otro

lado, el receptor de esta quimioquina, CCR9, es expresado por timocitos doble negativos y doble positivos pero cuando estos linfocitos maduran y se transforman en linfocitos T simple positivos pierden la expresin de CCR9 y adquieren CCR7 adems de L-selectina. En contraste a la corteza tmica, varias quimioquinas han sido detectadas en la mdula incluyendo a CCL22, CCL17, CCL19, CCL21, CCL11 y CXCL16. La participacin de CCL22 y CCL17 es consistente con la expresin del receptor de estos ligandos, CCR4, en timocitos que han sobrevivido al proceso de seleccin positiva y que transitan hacia la mdula tmica. En este mismo estado de maduracin los linfocitos T expresan el receptor CCR7 y muestran una aumentada capacidad de responder a sus ligandos CCL19 y CCL21. El patrn de expresin de estas dos ltimas quimioquinas y de su receptor, sugiere que ellos estn implicados en la organizacin celular tmica atrayendo a los linfocitos T haca las vas de salida del timo. 5.2. Quimioquinas en la recirculacin de los linfocitos a travs de los rganos linfoides secundarios Una vez que los linfocitos B y T maduros son liberados a la circulacin, ellos viajan constantemente a travs de los rganos linfoides secundarios (OLS) en bsqueda de antgeno. Para que esto ocurra, los linfocitos deben interactuar con las clulas endoteliales columnares (HEV) de las vnulas post-capilares ubicadas dentro del OLS y luego transmigrar hacia su interior (ver captulo 12). La sospecha que las quimioquinas podran participar en este proceso provino de resultados que mostraron que la toxina de Pertussis, un inhibidor de protenas G, bloqueaba la adhesin de leucocitos al endotelio. Estudios posteriores demostraron que las quimioquinas median la activacin de las integrinas hacia un estado conformacional de mayor afinidad, evento crucial en la obtencin de una adhesin ms firme entre linfocito y endotelio. La quimioquina CCL21 es detectada con gran intensidad por HEVs de los ndulos linfticos y de las placas de Peyer y su importancia en el "homing" de linfocitos a OLS est basada en el estudio de ratones plt. Debido a una mutacin espontnea an desconocida, las HEVs de estos ratones no pueden expresar el gen de CCL21 y sus ndulos linfticos y placas de Peyer muestran un reducido nmeros de clulas

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T. Adems, la adhesin a HEVs y el "homing" de linfocitos T a los OLS puede ser restaurado despus de que estos ratones plt son inyectados subcutneamente con CCL21. Se ha determinado que el receptor de esta quimioquina corresponde a CCR7 el cual es expresado por linfocitos T vrgenes. Consecuentemente, los ratones CCR7/- presentan el mismo fenotipo que los ratones plt, es decir, deficiente nmero de linfocitos T en los ndulos linfticos. En el modelo murino existen tres quimioquinas capaces de unir a CCR7: dos isoformas de CCL21, las cuales slo difieren en un slo aminocido (serina por leucina en la posicin 65) y CCL19, pero solamente la isoforma CCL21/serina no es expresada en los ratones plt. Esto significa que a pesar de la presencia de los otros ligandos para CCR7 (CCL21/leucina y CCL19) nicamente CCL21/serina puede mediar la migracin de linfocitos T a los ndulos linfticos. Una posible explicacin para este resultado es que los otros dos ligandos no sean expresados en el lugar ms apropiado para llevar a cabo la extravasacin o que cada ligando transduzca diferentes seales a travs del mismo receptor. En este caso, CCL21/serina correspondera a otro ejemplo de especificidad de las quimioquinas. Otra interesante observacin rescatada de los ratones plt es que la recirculacin de linfocitos B a los rganos linfoides secundarios no se ve afectado, lo que significara que la adhesin de las clulas B a las HEVs no depende de CCL21. Esto es corroborado por el hecho de que en ratones normales las clulas B se adhieren a una regin de las HEVs en la cual no ha sido detectada CCL21 y a la cual no se adhieren los linfocitos T. Por lo tanto, la expresin topolgica diferencial de quimioquinas podra ser el inicio de la segregacin de linfocitos haca las zonas B y T de los OLS, proceso en el cual participan otras quimioquinas. Por otra parte, se ha mostrado que las clulas B de ratones impedidos de expresar el receptor CXCR5 son incapaces de migrar desde la zona rica en clulas T haca la zona folicular B en el bazo y en las placas de Peyer. En amgdalas inflamadas este receptor es expresado por una poblacin particular de linfocitos T de ayuda que asisten a las clulas B en la produccin de anticuerpos. El ligando para este receptor, CXCL13, ha sido detectado en el manto folicular y en las HEVs foliculares pero no en la zona T. Por lo tanto, en el folculo del OLS, la quimioquina CXCL13 podra facilitar la interaccin de clulas B-T necesaria para una eficiente respuesta inmune.

Los ratones deficientes en la expresin de CXCR5 como de CCR7 presentan una severa desorganizacin de los OLS, lo que significa que las quimioquinas son fundamentales en el desarrollo y mantencin de microambientes localizados dentro de los tejidos linfoides (zonas B y T). 5.3. Quimioquinas en el "homing" de los linfocitos a sitios efectores perifricos A diferencia de los linfocitos T vrgenes que migran azarosamente a travs de todo el cuerpo, los linfocitos T de memoria/efectores presentan una migracin preferencial y selectiva haca los sitios efectores perifricos, proceso conocido como "homing". Estudios recientes han demostrado que las quimioquinas podran jugar un papel importante en el "homing" de los linfocitos a tejidos tales como la piel (tejido cutneo) e intestino (tejido mucoso). Las clulas T de memoria cutneas se caracterizan por la expresin de un antgeno llamado CLA, mientras que los linfocitos de memoria que migran preferencialmente al tejido intestinal expresan la integrina 47 como marcador especfico. Se ha determinado que el receptor de quimioquina CCR4 es expresado en altos niveles en linfocitos T CLA+ pero est prcticamente ausente en linfocitos T 47. A su vez, el ligando de CCR4, la quimioquina CCL17, ha sido detectada en clulas endoteliales de vnulas de la piel inflamada, pero no en vnulas de la lmina propia de la mucosa intestinal. Otra quimioquina, llamada CCL27 tambin es capaz de promover la migracin de linfocitos T de memoria a la piel a travs de su interaccin con el receptor CCR10, el cual es expresado por las clulas de Langerhans, melanocitos, fibroblastos y clulas endoteliales de la microvasculatura dermal. Por otro lado, el receptor CCR9 es expresado especficamente por linfocitos T de memoria 4 7hi con homing preferencial hacia el tejido intestinal y no por los linfocitos T de memoria cutneos. Consecuentemente, tan slo los linfocitos T 47hi responden a la quimioquina CCL25, ligando de CCR9, aunque solamente se ha podido detectar la expresin del mRNA de CCL25 en el intestino. 5.4. Quimioquinas y enfermedades Las quimioquinas pueden ser divididas en dos categoras. La primera corresponde a las

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quimioquinas constitutivas u homeostticas responsables del trfico linfocitario basal y de la mantencin y estructuracin de los rganos linfoides. La segunda categora est integrada por las quimioquinas inducibles o inflamatorias que son expresadas en respuesta a un estmulo o estrs fisiolgico. Esta induccin puede significar un aumento en el nivel de expresin del mRNA de una quimioquina de hasta 300 veces en pocas horas de activacin. Sin embargo, una alta expresin de quimioquinas puede ser la causa de una descontrolada activacin celular y provocar un dao tisular o enfermedad. De hecho, existe una estrecha relacin entre la expresin de ciertas quimioquinas y enfermedades asociadas con la infiltracin de leucocitos. En seres humanos la relacin ms irrefutable se encuentra en el sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), mientras que para otras patologas la asociacin ha sido inferida de modelos animales. En el SIDA se ha demostrado que el VIH (Virus de la Inmunodeficiencia Humana) requiere de CD4 y los receptores de las quimioquinas CXCR4 y CCR5 para infectar una clula . Este hallazgo provino de la identificacin de una delecin de 32 nucletidos en el receptor de quimioquina CCR5 que protege contra el SIDA a individuos homozigotos y frena la progresin de la enfermedad en personas heterozigotas. Los receptores CCR5 y CXCR4 definen diferentes poblaciones de clulas T (de memoria y vrgenes, respectivamente) lo que probablemente est relacionado con los diferentes tropismos celulares del virus (macrfagos y clulas T) y con su utilizacin en diferentes estados de la enfermedad (CCR5 en estados tempranos y CXCR4 en estados tardos). Otra enfermedad relacionada con la expresin de ciertas quimioquinas es la esclerosis mltiple (EM). Esta es una enfermedad autoinmune, neuroinflamatoria crnica y recurrente, en la cual el reconocimiento de un autoantgeno presente en las fibras nerviosas recluta a linfocitos T y macrfagos hacia el sistema nervioso central. Esta enfermedad tiene perodos de remisin lo que implica la existencia de mecanismos inmunes de regulacin. El modelo animal para estudiar la EM es la Encefalomielitis Alrgica Experimental (EAE), la cual puede ser inducida en ratones mediante la inmunizacin con antgenos derivados de la mielina. Utilizando este modelo se ha encontrado una correlacin entre las lesiones inflamatorias provocadas por esta enfermedad y

la deteccin de las quimioquinas CCL5, CCL3, CCL4, CXCL10 y CCL2. La utilizacin de anticuerpos neutralizantes anti-CCL3 sugiere que el desarrollo de lesiones inflamatorias agudas est asociado a CCL3, mientras que CCL2 participara en la reincidencia de la enfermedad. A pesar de algunos resultados discrepantes obtenidos con ratones knock out para la expresin de estas quimioquinas y de sus receptores, pareciera ser que CCL2, su receptor CCR2 y, en menor extensin CCL3 y CCR1, participaran activamente en el desarrollo de esta enfermedad. En humanos se ha encontrado que el lquido cefalorraqudeo de pacientes con EM en estado de reincidencia o de ataque activo contiene grandes cantidades de CCL3, CXCL10, CXCL9 y CCL5. El anlisis de las clulas T presentes en el lquido cefalorraqudeo demostr que estas expresaban CXCR3 y CCR5. Asimismo, se han detectado CCL2, CCL7, CCL8, CXCL10 y CXCL9 dentro de las lesiones activas de cerebros autopsiados de pacientes con EM. Consistente con estos resultados se encontr que macrfagos, microglia y linfocitos T activados expresaban los receptores CCR2 y CCR5, mientras que los astrocitos reactivos presentaban CCR3 y CCR5. Una creciente serie de evidencias ha demostrado que la formacin de placas ateroesclerticas son el resultado de una respuesta inflamatoria al dao arterial producido por la hipercolesterolemia o la hipertensin. Utilizando modelos experimentales de esta enfermedad, se ha observado que ratones CCL2-/- presentan 6585% menos acumulacin de lpidos en las arterias que el ratn que expresa CCL2. Similares resultados fueron obtenidos al utilizar ratones con una deficiencia en la expresin del receptor de CCL2 (CCR2). En todos los casos, se observ una disminucin en el contenido de macrfagos de la pared arterial. Esto sugiere que bajo condiciones de hipercolesterolemia, CCL2 podra participar en la quimioatraccin de monocitos que expresen CCR2 hacia los sitios de formacin de la placa ateroesclertica. En concordancia con estos resultados, en un modelo de ratn con hipertensin inducida experimentalmente se observ que CCR2 es requerido para la infiltracin de macrfagos hacia la pared arterial. La extrapolacin de estos hallazgos a los seres humanos est fundamentalmente basada en la deteccin de las quimioquinas CCL2, CCL5, CCL3 y CCL11 en las placas ateroesclerticas de pacientes que sufren de esta enfermedad.

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En la artritis reumatoides se ha encontrado una variedad de quimioquinas que incluyen a CCL2, CCL3, CCL5, CXCL8 y CXCL10 en el fluido sinovial de las articulaciones comprometidas. Estas quimioquinas han sido detectadas en clulas sinoviales y en los leucocitos infiltrantes. A su vez, en las clulas infiltrantes se ha detectado la presencia de los receptores CCR2, CCR5, CXCR2 y CXCR3. Al igual que en el SIDA se ha asociado la presencia del alelo de CCR5 que posee una delecin de 32 nucletidos con una progresin menos severa de la artritis. En el desarrollo del cncer las quimioquinas podran cumplir varias funciones potenciadoras. En primer lugar, se ha observado que las propias clulas tumorales pueden secretar factores quimiotcticos de leucocitos, particularmente CCL2, los cuales pueden representar una importante fuente de factores angiognicos. De hecho, en cncer de mama se ha correlacionado el grado de infiltracin de los macrfagos con la vascularidad del tejido invadido. En segundo lugar, las mismas quimioquinas pueden actuar como factores de crecimiento para las clulas tumorales. As por ejemplo, CXCL1 estimula la proliferacin de lneas celulares pancreticas y de melanoma mientras que CXCL8 tiene el mismo efecto sobre clulas tumorales de pulmn. Por otro lado, la presencia de leucocitos asociados al tumor podra reflejar el intento fallido del sistema inmune por eliminar el cncer. Siguiendo esta idea se han desarrollado varios trabajos con CCL2, CCL5, CCL1, CCL20, CCL21, CXCL10 y XCL1 con la finalidad de utilizarlas en la generacin de una respuesta inmune antitumoral ms potente. Finalmente, las quimioquinas podran participar en la metstasis del tumor. Varios tipos celulares malignos expresan receptores de quimioquinas lo que les permitira, una vez alcanzada la circulacin, migrar en respuesta a sus ligandos presentes en clulas de otros rganos o tejidos. 5.5. Quimioquinas y terapia Debido a la importante funcin que las quimioquinas cumplen en diversos aspectos de la respuesta inmune y a su participacin en graves patologas, varios estudios se han orientado a la bsqueda de antagonistas de quimioquinas con potenciales aplicaciones teraputicas. La delecin de los primeros ocho aminocidos de CCL5 o de CCL2 origina protenas incapaces de producir quimiotaxis. Asimismo, la extensin de la regin

amino-terminal mediante la retencin de la metionina inicial de CCL5 recombinante (MetRANTES) o la adicin qumica del radical aminoxipentano a la serina amino-terminal de CCL5 (AOP-RANTES) genera dos potentes antagonistas de esta quimioquina. Tambin ha resultado interesante el empleo de un inhibidor viral de quimioquinas de la familia CC (vCCI) utilizado por los Poxvirus para evadir la respuesta inmune. Los efectos de estos antagonistas han sido probados in vitro o en modelos animales de experimentacin para algunas enfermedades relacionadas con la expresin de quimioquinas. Se ha mostrado que Met-RANTES reduce la extensin y severidad de la artritis reumatoidea. Adems, este antagonista es capaz de inhibir la liberacin de radicales libres de eosinfilos activados por quimioquinas, por lo que potencialmente podra ser usado en enfermedades asociadas a una infiltracin de este tipo de leucocitos, tal como el asma alrgica. Adicionalmente, en este tipo de patologas podra emplearse el inhibidor viral de quimioquinas vCCI, el cual provoca una notable mejora de la funcin pulmonar y una disminucin de la inflamacin de la va area y del parnquima pulmonar en modelos de ratn con asma inducida por alergeno. Por otra parte, AOP-RANTES ha resultado ser un potente inhibidor de la infeccin de clulas mononucleares de sangre perifrica por VIH-1 y de la replicacin de este virus en macrfagos. En el caso de los antagonistas de CCL2, basados en la delecin de aminocidos de su regin amino terminal, se ha determinado que stos son capaces de retrasar la aparicin de la artritis o de reducir sus sntomas en modelos de ratones MRL-lpr. La transfeccin in vivo del cDNA de uno de los antagonistas de CCL2 (7ND) ha sido usado como terapia gnica contra la ateroesclerosis suprimiendo el reclutamiento de monocitos hacia los vasos sanguneos coronarios. Finalmente, se ha observado que inhibidores de la biosntesis del colesterol utilizados ampliamente como drogas en la prevencin de enfermedades cardiovasculares tambin inhiben la produccin de CCL2. Esto significa que parte de los efectos benficos de estas drogas tambin provienen de su accin anti-inflamatoria y que los inhibidores de quimioquinas representan innovadoras herramientas farmacolgicas para la prevencin de enfermedades cardiovasculares.

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LECTURAS SUGERIDAS Aggarwal, B.B. and Puri, R.K., Eds., Human cytokines: their role in disease and therapy, Blackwell Science, 1995. Ansel, K.M., and Cyster, J.G., Chemokines in lymphopoiesis and lymphoid organ development, Curr. Opin. Immunol. 13: 172-179. 2001. Callard, R. and Gearing, A., Eds., The cytokine Factsbook, Academic Press Limited, 1994. Campbell, J., and Butcher, E., Chemokines in tissue-specific and microenvironment-specific lymphocyte homing, Curr. Opin. Immunol.,12: 336-341. 2000 Gerard, C., and Rollins, B., Chemokines and disease, Nature Immunology 2: 108-115. 2001. Karnitz L. and Abraham R., "Cytokine receptor signaling mechanism", Curr. Op. Immunol. 7:320326, 1995. Moser, B., and Loetscher, P., Lymphocyte traffic control by chemokines, Nature Immunology 2: 123-128. 2001. Nicola, N.A., Ed., Guidebook to cytokines and their receptors, Oxford University Press, 1994. Nicholson LB. and Kuchroo V., "Manipulation of the Th1/Th2 balance in autoimmune disease", Curr. Op. Immunol. 8:837-842, 1996. Theze, J., Ed., The cytokine network and immune functions, Oxford University Press, 1999. Zlotnik, A., and Yoshie, O., Chemokines: A new classification system and their role in immunity, Immunity 12: 121-127. 2000.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 12
RECEPTORES DE ADHESIN, HOMING Y ACTIVACIN DE LINFOCITOS
Jorge Rodrigo Mora S. y Mario Rosemblatt S.

1. Introduccin 2. Modelo general de adhesin leucocitaria 3. Receptores de adhesin y sus ligandos 3.1. Receptores de adhesin de la familia de las integrinas 3.2. Receptores de adhesin de la superfamilia de las inmunoglobulinas (SFIg) 3.3. Molculas de adhesin de la familia de las selectinas 4. Interacciones linfocito-endotelio 4.1. Trfico linfocitario a travs del endotelio inflamado

4.2. Trfico linfocitario a travs del endotelio columnar (HEV) 4.3. Trfico linfocitario hacia la piel 5. Regulacin del posicionamiento ("homing") de linfocitos 6. Receptores de adhesin en la diferenciacin y activacin linfocitaria 6.1. Receptores de adhesin y diferenciacin temprana en la mdula sea 6.2. Receptores de adhesin y diferenciacin en el microambiente de los OLS

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RESUMEN Para que ocurra una respuesta inmune especfica, los linfocitos deben dejar la circulacin atravesando el endotelio de los rganos linfoides secundarios e ingresar a los rganos linfoides secundarios: ganglios linfticos perifricos, placas de Peyer (mucosa intestinal), y bazo. Por otro lado, en el sistema inmune la regulacin de la maduracin y proliferacin de los linfocitos a clulas efectoras depende del sitio anatmico en el cual se localizan las clulas, y por tanto de las interacciones que se establecen entre stas y su microambiente. Este dilogo entre linfocitos y estroma est regulado por la presencia, en la membrana, de linfocitos y de clulas estromales de receptores y contrarreceptores especficos de adhesin y por la disponibilidad local de citoquinas y quimioquinas. En este captulo se describen las diferentes familias de receptores de adhesin y sus contrarreceptores y se presenta informacin sobre la participacin de estos receptores en los diferentes mecanismos y procesos involucrados en la respuesta inmune, tanto normal como patolgica. Se discute el papel de estos receptores as como de sus contrarreceptores en la iniciacin y la duracin de la respuesta inmune, as como tambin sobre su participacin en la actividad efectora, recirculacin y posicionamiento o homing especfico de los linfocitos en los diferentes tejidos. Se presenta la informacin reciente que sustenta la idea de que los linfocitos vrgenes y de memoria/efectores tienen vas de homing diferentes y especficas para determinados tejidos, lo cual contribuye a hacer ms eficiente y especfica una respuesta inmune. Se discute la evidencia reciente en el contexto de que el homing tejido-especfico de un linfocito sea una caracterstica que probablemente perdure en el tiempo, dando fundamento a la idea de considerarlo como parte de la memoria inmunolgica.

1. INTRODUCCIN Los linfocitos son clulas esencialmente migratorias. Estudios clsicos que datan desde los aos 60 indicaron que los linfocitos circulan entre la sangre y la linfa de forma constante. Nuestro sistema inmune se caracteriza por generar una gran variedad en la especificidad linfocitaria, que en un adulto se estima entre 25-100 millones de clones distintos. Sin embargo, el nmero de estos linfocitos capaces de reconocer un antgeno individual es muy limitado (algunos miles como mximo), lo cual genera un desafo importante, el cual ha sido ilustrado en la siguiente analoga: Imaginen balones de 150 m de dimetro circunnavegando la tierra (comparable al volumen de un linfocito en reposo [125 femtolitros] en un adulto [75 litros]), que deban detectar dentro de horas estructuras mucho ms pequeas que se originan sbitamente en cualquier parte de nuestro planeta y que son solamente reconocibles por contacto directo. Este problema logstico se soluciona en

parte por la existencia de tejidos especializados conocidos como rganos linfoides secundarios (OLS), los cuales estn encargados por un lado de concentrar los antgenos provenientes desde tejidos no linfoides (tambin llamados terciarios), y por otro de permitir la entrada preferencial de linfocitos vrgenes, incrementando con ello tremendamente la probabilidad de que un linfocito dado encuentre su antgeno especfico en lo que se conoce como respuesta inmune primaria, que es aquella donde un linfocito virgen es activado por primera vez. Por otro lado, las clulas dendrticas (DC), clulas presentadoras especializadas en presentar antgenos a linfocitos T nave (vrgenes), se encargan de captar antgenos en los tejidos perifricos (mediante macropinocitosis, fagocitosis, y endocitosis mediada por receptor), procesarlos y presentarlos en el contexto de MHCI (fenmeno conocido como "crosspriming") o MHC-II, y finalmente transportarlos a los OLS para presentrselos a linfocitos T (LT). Por otro

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lado los linfocitos B, que reconocen antgenos en su forma nativa (sin necesidad de ser procesados ni presentados), tambin son activados y se diferencian en los OLS. Despus de su activacin inicial en los OLS, los linfocitos ya transformados en clulas efectoras y/o de memoria deben dispersarse y viajar a aquellos sitios del organismo (generalmente tejidos terciarios como la piel o lmina propia de la mucosa intestinal) donde deben eliminar al antgeno invasor y actuar como vigas frente a futuras invasiones, en lo que se denomina respuesta inmune secundaria. La respuesta inmune (RI) secundaria presenta varias caractersticas distintivas: (i) Existe desde su inicio un nmero enormemente mayor de linfocitos especficos capaces de reconocer al antgeno, comparados con la RI primaria. (ii) La respuesta de cada linfocito es intrnsecamente ms rpida, ya que se requiere un contacto de mucho menor duracin con la clula presentadora de antgeno (en el caso de LT), y a su vez no se requiere de seales co-estimuladoras tan exigentes como en la activacin inicial. Esto a su vez posibilita que clulas no especializadas funcionen como clulas presentadoras de antgenos. (iii) No se requiere que esta respuesta ocurra en OLS, de hecho la RI secundaria habitualmente se produce en tejidos terciarios. (iv) Generalmente es una RI polarizada, ya sea de tipo T helper-1 o tipo T helper2, lo cual determina que sea predominantemente celular o humoral y a su vez que est dominada por linfocitos B que producen un determinado isotipo de inmunoglobulina y por ltimo. (v) Actualmente se ha determinado que en una RI secundaria los linfocitos presentan predileccin para migrar preferentemente a aquellos tejidos asociados al OLS donde se produjo la RI primaria, fenmeno que se conoce como homing tejido-especfico. Inclusive, se ha postulado que el homing tejido-especfico sera una caracterstica adicional de lo que se conoce como memoria inmunolgica, caracterstica que se ha transformado en la base de las terapias actuales de vacunacin. Tanto para que pueda ocurrir una RI primaria como secundaria, los linfocitos deben entrar a los tejidos donde se producirn estas respuestas (ya sea OLS o tejidos terciarios, respectivamente). El paso de los linfocitos desde la sangre al tejido ocurre en las vnulas postcapilares, el llamado endotelio columnar o High Endothelial Venules (HEV) (excepto en bazo, pulmones, e hgado), no en arteriolas ni capilares (con lo cual se minimiza el riesgo de interferir con el intercam-

bio de gases y perfusin del tejido). Una etapa crtica para que los linfocitos puedan atravesar las vnulas postcapilares es la adhesin de estos linfocitos al endotelio de estos vasos. Esta es una etapa finamente regulada, que sucede en una serie de pasos secuenciales y que depende de la interaccin entre mltiples receptores de adhesin presentes en la membrana de los linfocitos y sus respectivos ligandos desplegados por las clulas endoteliales. En este captulo se har referencia a las diferentes familias de receptores de adhesin y se describirn los mecanismos adhesivos que regulan la migracin de los linfocitos a los tejidos.

2. MODELO GENERAL DE ADHESIN LEUCOCITARIA El modelo actual de cmo los linfocitos se adhieren al endotelio de un vaso sanguneo es extrapolable a la adhesin de los leucocitos en general (incluyendo por ej. neutrfilos). El modelo de adhesin de mltiples pasos fue originalmente propuesto en 1991 y consta al menos de cuatro etapas, separadas temporal y mecansticamente: (a) frenado y rotacin ("tethering" y "rolling"), (b) activacin de integrinas, (c) adhesin firme ("sticking") y (d) transmigracin (diapdesis). Cada una de estas etapas secuenciales es esencial para que ocurra la transmigracin del leucocito y depende de molculas genricamente llamadas molculas de adhesin. Estas molculas se pueden agrupar estructuralmente en diferentes familias, las cuales se describirn en detalle ms adelante y se mencionarn en este momento en el contexto del modelo de adhesin de mltiples pasos. Aunque, en general, estas etapas son comunes para todos los leucocitos, el proceso se describir considerando los linfocitos T (a menos que se indique otra cosa), por ser en ellos donde los fenmenos de adhesin han sido estudiados ms en detalle. La primera etapa en la cascada de adhesin se conoce como "tethering" y consiste en el frenado ("agarre") al endotelio venular. Esta etapa se considera generalmente en conjunto con la etapa inmediatamente siguiente conocida como "rolling", donde los linfocitos ruedan adheridos laxamente sobre el endotelio vascular. Tanto el "tethering" como el "rolling" dependen fundamentalmente de molculas conocidas como selectinas: L-selectina en los linfocitos y E- o Pselectina en el endotelio vascular, aunque en de-

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terminadas circunstancias pueden tambin participar integrinas del tipo 4 presentes en el linfocito (47 o 41). En cuanto a la distribucin de selectinas, L-selectina se encuentra en todos los leucocitos, aunque en los linfocitos su expresin est restringida especialmente a linfocitos vrgenes. E- y P-selectinas se encuentran principalmente en endotelios inflamados, aunque en la piel se expresan dbilmente en forma constitutiva. Una caracterstica importante de las molculas que participan en el "tethering" y "rolling" de los linfocitos es el estar predominantemente localizadas en estructuras conocidas como microvellosidades linfocitarias. Esta distribucin es importante funcionalmente, como se ha demostrado en experimentos en los cuales se ha reemplazado la porcin de transmembrana e intracelular de L-selectina para localizarla predominantemente en zonas del linfocito diferentes de las microvellosidades, con lo cual se reduce importantemente su capacidad de mediar el "tethering" y "rolling" (an manteniendo su capacidad de unir sus ligandos). Interesantemente, las integrinas 4, que son tambin capaces de mediar "rolling", se localizan igualmente en las microvellosidades del linfocito, no as otras integrinas como LFA-1 que no median "rolling". Se piensa que esta localizacin dejara estas molculas estratgicamente posicionadas para un primer contacto eficiente con el endotelio. Los ligandos para selectinas (tanto en el endotelio como en el linfocito) son glicoprotenas del tipo sialil-Lewis-X, y que comparten en comn el ser fucosiladas, sialiladas y sulfatadas. Estos ligandos se encuentran expresados en forma constitutiva en el endotelio de los ganglios linfticos constituyendo lo que se denomina Peripheral Node Addressin (PNAd) (ligandos para L-selectina), y tambin se encuentran en linfocitos como ligandos para P y E-selectina, aunque la expresin de estos ligandos en linfocitos estara restringida a algunos subtipos funcionales, que sern descritos ms adelante. La importancia de la etapa de "rolling" queda ilustrada en experimentos en los cuales luego de bloquear ya sea L-selectina o sus ligandos (PNAd), se bloquea casi el 100% de la adhesin a HEV de ganglios linfticos. Adicionalmente, en humanos se ha descrito una enfermedad conocida como LAD-2 (Leukocyte Adhesion Deficiency-2) en la cual existe una mutacin en una enzima clave involucrada en la sntesis de ligandos para selectinas (una fucosiltranferasa). Estos pacientes presentan una importante inmunodeficiencia

secundaria al defecto de adhesin leucocitaria. La etapa siguiente conocida como activacin, est fundamentalmente mediada por quimioquinas presentes en el endotelio y los receptores de quimioquinas presentes en los linfocitos. Respecto a las quimioquinas presentes en los endotelios, actualmente no es claro en qu medida el endotelio de los diferentes tejidos participa directamente en la produccin de estas quimioquinas. Sin embargo, s es claro que el endotelio es capaz de presentar algunas quimioquinas producidas en el estroma del tejido o que vienen desde sitios distantes (como la piel). Se ha demostrado que estas quimioquinas (ej. IL8 y ELC) pueden ser transportadas transcelularmente y presentadas por proteoglicanos en la superficie apical del endotelio a los linfocitos. De cualquier manera, el resultado final es que un linfocito que est en la etapa de "rolling", encuentra a estas quimioquinas en el endotelio, y a travs de sus receptores de quimioquinas gatilla una cascada de transduccin de seales dependiente de protena G, la que finalmente lleva al aumento de la adhesin mediada por integrinas (lo que se denomina en general como activacin). Esta activacin de las integrinas estara dada por al menos dos mecanismos: (i) Aumento en la afinidad intrnseca del dmero de integrina, producido por un cambio en la estructura terciaria y cuaternaria del dmero, y (ii) un aumento en la avidez, dado fundamentalmente por un acercamiento de las integrinas entre s en la membrana del linfocito. Esta etapa de activacin es independiente de la etapa precedente de "rolling", ya que en linfocitos en los cuales se ha bloqueado la activacin mediada por quimioquinas por el tratamiento con toxina pertussis (inhibidor de protena G) se bloquea tambin la adhesin firme ("sticking") sin afectar la capacidad de hacer "rolling". Estos linfocitos nunca logran adherirse y finalmente se sueltan y vuelven a la circulacin. Este fenotipo, que puede lograrse experimentalmente, se encuentra presente en los ganglios linfticos de animales que son naturalmente mutantes y que carecen de las quimioquinas ELC y SLC (ligandos para el receptor de quimioquina CCR7). En estos animales los linfocitos T son incapaces de adherirse firmemente a las vnulas de endotelio alto (HEV) de los ganglios linfticos, an cuando efectan el rolling sin problema. El mismo fenotipo se observa en ratones "knockout" para CCR7. Por otro lado, el paso de activacin puede ser sobrepasado

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artificialmente si las integrinas se activan previamente usando steres de forbol (ej. PMA) o anticuerpos activadores de integrinas. La etapa siguiente en la transvasacin linfocitaria, ya enunciada anteriormente, se denomina adhesin firme o sticking, y depende totalmente de molculas de adhesin heterodimricas conocidas como integrinas, presentes en los linfocitos. Experimentos donde se han usado anticuerpos monoclonales bloqueadores de estas molculas, han demostrado una abolicin de la adhesin firme de los linfocitos (sin afectar el "rolling" de stos). Por otro lado, en humanos existe una enfermedad en la cual los linfocitos son incapaces de adherirse firmemente al endotelio de los tejidos, produciendo una importante inmunodeficiencia que con el tiempo es letal. En esta enfermedad (afortunadamente rara), conocida como LAD-1 ("Leukocyte Adhesion Deficiency-1"), los pacientes presentan una mutacin de la cadena de integrina 2, con lo cual carecen de las integrinas que posee esta cadena, principalmente LFA-1, la cual es esencial en casi todos los fenmenos de adhesin estudiados. Los ligandos para las integrinas, molculas de la superfamilia de las inmunoglobulinas (ej. ICAM1 y -2, MAdCAM-1, VCAM-1), se encuentran presentes en el endotelio de los tejidos, ya sea en forma constitutiva (en los OLS y algunos tejidos extralinfoides) o en forma inducible en tejidos inflamados. Por ltimo, una etapa que hasta el da de hoy est muy pobremente caracterizada es la transmigracin linfocitaria (y leucocitaria en general). Una dificultad para estudiar esta etapa en forma aislada es el hecho de que adems de ser dependiente de las etapas anteriores, es probable que requiera tambin de las mismas molculas que participan en las etapas previas (ej. quimioquinas). Por otro lado, se debe tener en cuenta que para que un linfocito pueda acceder finalmente al tejido, debe ser capaz de disociar (al menos transitoriamente) las uniones entre las clulas endoteliales, luego la membrana basal endotelial, y finalmente abrirse paso entre los elementos de matriz extracelular. Cada una de estas etapas adicionales podra, en teora, estar regulada y requerir nuevos elementos tanto del linfocito (ej. metaloproteasas) como del tejido, por lo cual decir meramente transmigracin puede demostrar ser a la larga una sobresimplificacin de este fenmeno. En la seccin siguiente se profundizar en la

descripcin de las molculas de adhesin que ya se enunciaron en el contexto de la cascada de adhesin, para lo cual se han agrupado de acuerdo a caractersticas estructurales en diferentes familias.

3. RECEPTORES DE ADHESIN Y SUS LIGANDOS Tres grandes familias de receptores de adhesin ejercen su accin reguladora en el sistema inmune, receptores de la Familia de las Integrinas, receptores pertenecientes a la Superfamilia de las Inmunoglobulinas (SFIg) y receptores de la Familia de las Selectinas. Ms recientemente se ha incorporado la creciente Familia de las Quimioquinas y sus Receptores. Si bien es cierto, las quimioquinas y sus receptores no participan como pares de adhesin ligando-receptor clsicos, como se discuti previamente, se sabe que su papel es fundamental en la cascada de adhesin, y adicionalmente y como se discutir ms adelante, actualmente se acepta cada vez ms que tienen un papel muy importante en la regulacin de especificidad fina del "homing" tejido-especfico de las clulas inmunes (y tambin dentro del microambiente del tejido linfoide). Sin embargo, dado que las quimioquinas y sus receptores son descritos en detalle en el captulo 11, slo se mencionarn aqu en el contexto de la cascada de adhesin, as como tambin aquellas involucradas en el "homing" tejido-especfico de los linfocitos. Otros receptores de adhesin, o sus ligandos que no pertenecen a ninguna de estas familias sern presentadas desde un aspecto funcional durante este captulo. Los receptores de adhesin se expresan en la membrana de los linfocitos u otras clulas inmunes mientras que sus contrarreceptores o ligandos se encuentran, fundamentalmente, en clulas no inmunes, tales como clulas endoteliales, clulas accesorias (clulas dendrticas, clulas dendrticas foliculares, monocitos, etc.), en otros linfocitos o en la matriz extracelular. En este captulo, se nombrar como receptor de adhesin a las molculas que se encuentran en la superficie de los linfocitos u otras clulas inmunes (clulas NK, etc.) y como ligando a aquellas molculas que interactan con el receptor y que se localizan en la clula a la cual se une el linfocito, aunque en muchos casos molculas de la misma familia deban considerarse como receptor de adhesin cuando se encuentra en el linfocito o como ligando si se encuentra en otra clula.

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3.1. Receptores de adhesin de la familia de las integrinas Las integrinas son molculas heterodimricas de transmembrana que se unen a diferentes ligandos extracelulares y transmiten seales al interior de la clula a travs del citoesqueleto. Las integrinas estn constituidas por dos cadenas polipeptdicas, + y , unidas en forma no covalente (figura 12-1), cuyos extremos aminoterminales forman una estructura globular que contribuye a la asociacin no covalente entre ambas cadenas y tambin a la unin con su ligando. Esta unin al ligando es dependiente de cationes divalentes (Ca2+ y Mg2+), y su participacin es esencial para la actividad de las integrinas. Originalmente, las integrinas fueron clasificadas en tres subfamilias, de acuerdo a la cadena+,+en las cuales cada una de las tres cadenas ++se asociaba con diferentes cadenas ,++generando diferentes heterodmeros. Recientemente la familia de las Integrinas se ha visto expandida por el descubrimiento de nuevas cadenas y por el hecho que una misma cadena pueden asociarse con ms de una cadena . Actualmente se conocen 15 cadenas + y 7 cadenas . La asociacin entre las distintas cadenas + y imparten al heterodmero su especificidad frente al ligando, dndose que diferentes combinaciones ++pueden actuar como receptor para un mismo ligando. Por ejemplo, la cadena 1 puede combinarse con varias cadenas , dos de las cuales, 4 y 5 imparten al heterodmero la capacidad de unir

fibronectina. Por otro lado, la cadena V correspondiente al clsico receptor para vitronectina 3 puede tambin formar combinaciones con las cadenas 1,+5,+6, y 8, adquiriendo diferentes especificidades de unin. Actualmente se han descrito ms de 20 diferentes combinaciones . Los receptores de la familia de las integrinas 1 conocida tambin como VLA ("Very Late Antigen") comparten la cadena comn 1 (CD29) y se encuentran ampliamente distribuidas tanto en linfocitos B como T. Al menos 9 diferentes cadenas ++(tabla 12-1) han sido identificadas en asociacin con 1.++Estas integrinas 1 tienen como ligandos una serie de protenas de la matriz extracelular (MEC) tales como fibronectina (fn), colgeno (col), vitronectina (vn), y laminina (lm). Entre las integrinas expresadas por los linfocitos, la integrina+51+(VLA-5) tiene como ligando el tripptido RGD (Arg, Cly, Asp) de la fn. Por otro lado, la integrina 41++(VLA-4) la ms abundante en linfocitos, tiene como ligandos un pptido de la regin CS-1 de la fn, adems de VCAM-1 ("Vascular Cell Adhesion Molecule-1"), una molcula que se expresa en la superficie de las clulas endoteliales en tejido inflamado y en el endotelio de los rganos linfoides secundarios (ver molculas de adhesin de la Superfamilia de las Inmunoglobulinas ms adelante). Cuatro diferentes cadenas + (CD11) se asocian con la cadena 2++(CD18) formando una subfamilia (tabla 12-1). Los linfocitos circulantes expresan fundamentalmente la molcula LFA-1 ("Lymphocyte Function Associated Molecule-1")

Figura 12-1. Molculas de adhesin celular. Se muestra esquemticamente la estructura de las molculas de adhesin. (A) Familia de las Integrinas, (B) Superfamilia de las Inmunoglobulinas y (C) Familia de las Selectinas.

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o L2 formada por la combinacin de CD11a con CD18. Esta integrina juega un papel central en el proceso de transmigracin linfocitaria y ha sido tambin directamente involucrada en la actividad de los LT citotxicos (CD8+) as como tambin en la actividad de clulas T "helper" y clulas "natural killer" (NK). Las otras molculas de la familia 2 (CD11b, CD11c, CD11d) se expresan principalmente en monocitos, neutrfilos y clulas NK. Desde el punto de vista de la recirculacin linfocitaria, dos de los principales ligandos de la integrina CD11aCD18 (LFA-1) son CD54 (ICAM1, "Intercelular Adhesion Molecule-1") y CD102 (ICAM-2) receptores de adhesin pertenecientes a la Superfamilia de las Inmunoglobulinas (ver ms adelante). Otro receptor de adhesin perteneciente a la familia de las Integrinas, que cumple un rol de importancia en la migracin y alojamiento de los linfocitos en placas de Peyer y tejido mucoso es la molcula 47, una molcula que comparte la misma cadena + presente en 41. El principal ligando para 47.corresponde a MAdCAM-1 (Mucosal Addressin Cell Adhesion Molecule-1), una glicoprotena presente en las clulas endoteliales del tejido mucoso, aunque 47++tambin se liga (luego de la activacin linfocitaria) a fn y VCAM-1 (ver tabla 12-1). 3.2. Receptores de adhesin de la superfamilia de las inmunoglobulinas (SFIg) Los receptores de esta familia comparten el llamado dominio de inmunoglobulina, compuesto de 90-100 residuos de aminocidos dispuestos en dos lminas formadas por cadenas de estructura anti-paralelas estabilizadas por enlaces disulfuro (captulo 6). Las molculas pertenecientes a este grupo pueden dividirse en dos categoras; aquellas involucradas en la interaccin de los linfocitos con el antgeno (ej. Inmunoglobulinas y receptores de clulas T, (TCR) o con clulas presentadoras de antgeno (molculas MHC-I y MHC-II, CD4, CD8) y aquellas que participan en fenmenos adhesivos ms generales, tales como CD2, CD54 (ICAM-1), CD102 (ICAM-2), CD106 (VCAM-1) y MAdCAM-1. Aquellas involucradas en el reconocimiento de antgenos se expresan fundamentalmente en linfocitos, mientras que aquellas que actan en fenmenos de adhesin ms generales se expresan en el endotelio a excepcin de CD2 que se encuentra en linfocitos. Central en los procesos de migracin

transendotelial de los linfocitos, as como en la interaccin de stos con otras clulas durante la respuesta inmune es la molcula CD54 (ICAM1). Esta molcula, presente en el endotelio se induce durante los procesos inflamatorios y se une, a travs de su primer dominio inmunoglobulina amino terminal, a la integrina CD11 a CD18 (LFA1) presente en linfocitos, que como se mencion cumple un rol muy importante en la etapa de adhesin firme o "sticking" de los leucocitos. Otra molcula de esta familia, CD102 (ICAM-2) se expresa en forma constitutiva en el endotelio y en algunas clulas presentadoras de antgeno, y participara en los procesos iniciales de transmigracin y activacin linfocitaria. Un miembro ms reciente de este grupo de receptores de adhesin es CD106 (VCAM-1). CD106 existe en dos formas en la membrana, una dominante que contiene 7 dominios Ig, y otra que surge del procesamiento del mRNA generando una molcula con 6 dominios Ig. Esta molcula no se expresa en el endotelio vascular normal y es inducida por citoquinas pro-inflamatorias como IL-1, IFN o TNF, participando as en el proceso de transmigracin linfocitaria durante la inflamacin. Datos ms recientes indican que VCAM-1 se expresara en forma constitutiva en el endotelio columnar (HEV, "High Endothelial Venules") de los rganos linfoides, y participara en el ingreso de los linfocitos a estos rganos durante los procesos normales de vigilancia y respuesta inmune. Por otro lado, CD106 ha sido implicada en los procesos de diferenciacin temprana de linfocitos B a partir de precursores hematopoyticos en la mdula sea, as como tambin en las etapas finales de diferenciacin de linfocitos B en los folculos secundarios. El ligando para VCAM-1 es 41 (VLA-4). Un miembro ms reciente de esta familia de receptores de adhesin es MAdCAM-1, el ligando ms importante de 47. Esta molcula se expresa tanto en HEV de placas de Peyer como de ganglio mesentrico, y tambin en vnulas postcapilares de la lmina propia de mucosa intestinal. Se han descrito dos formas funcionales de MAdCAM-1, una que est presente en placas de Peyer y que tiene capacidad de unir tanto 47 como L-selectina, y otra que se encuentra en lmina propia con capacidad de unir slo 47. MAdCAM-1 acta como domicilina de mucosa ("mucosal addressin"), es decir, participa en la adhesin de linfocitos efectores o de memoria con "homing" hacia mucosa intestinal (ver ms

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Tabla 12-1. Receptores de adhesin y sus ligandos. Molcula de adhesin Distribucin Ligando Papel en la adhesin Selectinas *Todas unen estructuras tipo Sialil-LewisX L-Selectina Todos los leucocitos, excepto PNAd, PSGL-1, Homing a ganglios (CD62L) subgrupos de linfocitos MAdCAM-1, linfticos y placas de Peyer efectores/de memoria E-Selectina E-Selectina Clulas endoteliales PSGL-1, ESL-1 (EHoming de linfocitos (CD62E) Selectin Ligand-1), efectores y de memoria a la CLA piel y sitios de inflamacin P-Selectina Clulas endoteliales, PSGL-1, CD24, PNAd Homing de LT Th1 a (CD62P) plaquetas sitios de inflamacin, adhesin de plaquetas a HEV Ligandos de Selectinas Sialil-LewisX Clulas mieloides, algunos LT Todas las Selectinas Depende de la molcula (sCD15) Th1, HEV que lo exprese PSGL-1 Todos los leucocitos Ligando esencial para Homing de LT Th1 a (CD162) E-Selectina, tambin sitios de inflamacin, une une P- y L-Selectina plaquetas activadas PNAd HEV en ganglios linfticos, L-Selectina y PHoming de LT vrgenes y Selectina en plaquetas activadas LT de memoria centrales a sitios de inflamacin crnica ganglios linfticos CLA (HECA-452) LT con homing a piel, E-Selectina Homing de linfocitos clulas dendrticas, efectores /de memoria a la piel granulocitos Integrinas+2 + L2 Todos los leucocitos ICAM-1, 2, 3, 4, y 5 Homing de todos los (LFA-1, CD11aCD18) linfocitos a los ganglios linfticos, placas de Peyer, la mayora de los sitios de inflamacin M2 Clulas mieloides, algunos LT ICAM-1, Factor X, Desconocido (Mac-1, CD11bCD18) activados fibringeno, C3bi X2 Clulas dendrticas Fibringeno, C3bi Desconocido (p150,95, CD11cCD18) D2 Monocitos, macrfagos, VCAM-1, ICAM-1 y -3 Desconocido (CD11dCD18) eosinfilos Integrinas+ 4 + 41 La mayora de los leucocitos, VCAM-1, fibronectina, Homing de linfocitos (VLA-4) excepto neutrfilos integrinas 4 efectores y de memoria a tejidos inflamados 47 Linfocitos, clulas NK, MAdCAM-1, Homing de linfocitos (LPAM-1) mastocitos, basfilos, fibronectina, dbil a a tejidos mucosos intestinales monocitos VCAM-1 Superfamilia de las Inmunoglobulinas ICAM-1 Mayora de los tipos celulares integrinas L2, M2, Ligando crtico para (CD54) y fibringeno integrinas 2 ICAM-2 Clulas endoteliales, integrina L2 Desconocido (CD102) plaquetas VCAM-1 Clulas endoteliales, estroma Integrinas 41, 47, Homing de linfocitos (CD106) de mdula sea, clulas y D2 efectores/de memoria a foliculares dendrticas tejidos inflamados MAdCAM-1 HEV de placas de Peyer, Integrina 47, LHoming de linfocitos a lmina propia, bazo, glndula Selectina tejidos mucosos intestinales mamaria lactante

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adelante), aunque la forma con capacidad de unir L-selectina participa tambin en la adhesin de linfocitos vrgenes a HEV de placas de Peyer. 3.3. Molculas de adhesin de la familia de las selectinas La familia de las selectinas est formada slo por tres protenas caracterizadas por poseer un dominio amino-terminal similar al de una lectina tipo-C, y por lo tanto capaz de ligar carbohidratos (ver figura 12-1), aunque de manera Ca2+-dependiente. Dos de estas receptores, E-selectina (CD62E) y P-selectina (CD62P) se expresan en clulas endoteliales, mientras que el tercer miembro de la familia, L-selectina (CD62L) se expresa en leucocitos, a excepcin de linfocitos de memoria/efectores (para distinguirlos de los linfocitos de memoria centrales que seran CD62L+. Adems de poseer un dominio N-terminal de tipo Clectina que aporta la especificidad a cada selectina, estas molculas se caracterizan por poseer, inmediatamente a continuacin de este dominio, una secuencia similar al factor de crecimiento epidermal (EGF, "Epidermal Growth Factor") seguido por un nmero variable de dominios SCR ("Short Consensus Repeats) anlogos a los encontrados en las protenas reguladoras del complemento (2 en L-selectina, 6 en E-selectina y 9 en P-selectina) seguido por una secuencia de transmembrana y una cola citoplasmtica. E-selectina (CD62E) se induce fuertemente en las clulas endoteliales durante la inflamacin. Durante los procesos de inflamacin crnica Eselectina se expresa en forma permanente en la piel donde es reconocida por un ligando sialilado (tipo SLex) denominado en linfocitos T como CLA ("Cutaneous Lymphocyte-associated Antigen"), el cual se expresa preferentemente en una subpoblacin de LT que migran a piel. Se sabe que CLA es a su vez una modificacin postraduccional de otra protena ms general llamada PSGL-1 ("P-Selectin Glycoprotein Ligand1"), la cual puede ser modificada adems para formar ligandos para P-selectina. P-selectina fue inicialmente caracterizada en plaquetas demostrndose posteriormente su presencia en clulas endoteliales. Tanto en plaquetas como en clulas endoteliales, P-selectina se acumula en grnulos (grnulos en las plaquetas y cuerpos de Weibel-Palade en las clulas endoteliales) desde donde se moviliza a la membrana celular durante el proceso de activacin. El

principal ligando para P-selectina es una estructura del tipo SLex que se forma por modificacin postraduccional sobre PSGL-1 y probablemente otras glicoprotenas. Cabe destacar que para la formacin de ligandos tanto para P- como para ESelectina participan unas enzimas denominadas fucosiltransferasas, en particular la Fuc-IV y la Fuc-VII. La expresin de estas enzimas es modulada por citoquinas (en particular IL-12 y IL-4), que a su vez regulan la presencia o no de ligandos para estas selectinas en los linfocitos. L-selectina, originalmente designada como un receptor de migracin y posicionamiento de linfocitos ha sido ms recientemente detectada en prcticamente todos los leucocitos. Sin embargo, y como veremos ms adelante, esta molcula est expresada diferencialmente en diferentes subpoblaciones de LT, otorgndoles a su vez propiedades migratorias o de "homing" diferenciales. Dos ligandos tipo mucina (que poseen carbohidratos sulfatados, sialilados y fucosilados) parecen ser ligandos para L-selectina; GlyCAM1 ("Glycosilation-dependent Cell Adhesion Molecule-1") y CD34, los cuales son sintetizados por las HEV de los ganglios linfticos perifricos (donde colectivamente se denominan PNAd: "Peripheral Node Addressins"). Ms recientemente se ha demostrado que adems de 47,+la forma de MAdCAM-1 presente en HEV de placas de Peyer tambin acta como receptor de L-Selectina. Un listado de los receptores de adhesin descritos en el sistema inmune y sus ligandos se resume en la tabla 12-2.

4. INTERACCIONES LINFOCITO-ENDOTELIO Estudios que datan de ms de 30 aos han demostrado que los linfocitos tienen normalmente la capacidad de migrar entre la sangre y la linfa, y pasar desde la sangre a los OLS tales como ganglios linfticos perifricos (axilares, inguinales), ganglios mesentricos, placas de Peyer, etc. transvasando a travs del endotelio especializado de estos rganos. Este endotelio, denominado endotelio columnar alto (HEV: "High Endotelial Venules"), est formado por clulas endoteliales de morfologa columnar, altamente especializadas en el trfico linfocitario, lo cual se logra probablemente en parte por la expresin constitutiva de ligandos para L-selectina (ej. PNAd, MAdCAM) y para integrinas (ej. ICAM-

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Tabla 12-2. Caractersticas de los linfocitos T vrgenes, de memoria centrales y de memoria efectores. LT vrgenes Fenotipo Molculas de adhesin CD45RA+/ CD44LOW L-Selectina HIGH LFA-1+ CCR7+ Sin especificidad tisular Expansin clonal (requiere priming por CD) IL-2 (retardada) IL-4 Ninguna OLS, mdula sea LT de memoria centrales CD45RO+/ CD44HIGH L-Selectina HIGH LFA-1+ CCR7+ Sin especificidad tisular Proliferacin rpida Dan origen a LT efectores de memoria IL-2 (rpida), sin IFN- ni Varias OLS (ganglios, placas de Peyer) LT de memoria efectores CD45RO+/ CD44HIGH L-selectina NEG 47++CLA LFA-1+ CCR7NEG CCR9, CCR4, CCR6 o CCR10 Proliferacin rpida Actividad efectora inmediata (citoquinas o CTL) IL-2, IFN, IL-4 Muchas Tejidos terciarios (piel, mucosa intestinal)

Receptores de quimioquina Respuesta funcional al Ag Respuesta de citoquinas al Ag Divisiones inducida por el Ag Tejidos blanco de homing

1, MAdCAM). El concepto actual es que el fenotipo HEV de estas vnulas sera dinmico (y reversible) y probablemente generado por el microambiente del OLS (entre otras cosas por la salida de elementos solubles va linfticos). Por otro lado, se sabe que los linfocitos son capaces de atravesar el endotelio vascular plano de los diferentes tejidos (no linfoides) slo en casos donde existan procesos de inflamacin, aunque en el caso de algunos tejidos terciarios como la lmina propia del intestino parece existir expresin constitutiva de molculas de "homing" como MAdCAM-1 y probablemente la quimioquina TECK (ver ms adelante). La comprensin de los procesos de trfico y de extravasacin linfocitarios se ha visto incrementada en los ltimos aos gracias al avance en el conocimiento de los receptores de adhesin y por los estudios de las estructuras moleculares presentes en el endotelio que permiten el trfico transepitelial. Uno de los conceptos importantes que ha surgido de esta nueva informacin es que existen vas migratorias diferentes para los linfocitos vrgenes versus los linfocitos efectores/de memoria. Este aspecto del trfico linfocitario se ver ms adelante en el punto 4 (regulacin del posicionamiento o "homing" de los linfocitos). Un segundo aspecto que ha surgido de investigaciones recientes es el papel central que juegan algunas citoquinas y quimioquinas en la transvasacin linfocitaria en la inflamacin.

Finalmente, dentro de los resultados importantes que han emergido en los ltimos aos se encuentra el descubrimiento de que existen marcadas diferencias en la dotacin de receptores y ligandos de adhesin en los diferentes endotelios. Primeramente, el endotelio plano normal (no inflamado) de los rganos no linfoides no presenta en su superficie luminal ligandos que permitan la extravasacin linfocitaria de manera importante. Estos ligandos se inducen durante el proceso inflamatorio. Por otro lado, el epitelio columnar de los OLS presenta diferentes receptores y ligandos de adhesin dependiendo del sitio anatmico donde ste se encuentre. As, dependiendo de sus estructuras adhesivas encontramos al menos tres grandes correlaciones; (i) HEV de los ganglios linfticos perifricos; (ii) HEV de los ganglios mesentricos, placas de Peyer y vnulas postcapilares de lmina propia intestinal y (iii) vnulas postcapilares de la piel. Cada uno de estos endotelios posee ligandos adhesivos propios que le permiten seleccionar subpoblaciones linfocitarias especficas. Algunos autores han postulado adems la existencia de estructuras adhesivas propias en otros sitios tales como el pulmn y el tejido sinovial, aunque an es controversial si existen en realidad vas de migracin eficientes y especficas para esos tejidos. A continuacin se revisarn los mecanismos

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involucrados en el trfico en cada uno de estos endotelios y de las estructuras adhesivas implicadas. 4.1. Trfico linfocitario a travs del endotelio inflamado En personas que sufren de LAD-1 ("Leukocyte Adhesion Deficiency-1"), enfermedad en la cual los pacientes muestran una especial susceptibilidad frente a infecciones bacterianas recurrentes, los leucocitos son incapaces de atravesar el endotelio y acumularse en los sitios de inflamacin. Estudios de adhesin realizados in vitro con leucocitos de estos pacientes demostraron que stos son incapaces de adherirse a monocapas de clulas endoteliales. Estos datos constituyeron las primeras evidencias de que los receptores de adhesin son requeridos en el proceso de transvasacin leucocitaria in vivo. Una serie de estudios en estos pacientes demostr una deficiencia en la expresin de la cadena+2++(CD18) de las integrinas, implicando a esta integrina en el mecanismo de migracin de los leucocitos desde el lumen vascular a los tejidos durante los procesos inflamatorios. Estudios ms recientes han involucrado a varios otros receptores de adhesin en la transvasacin, demostrando adems la complejidad de este proceso. Una de las primeras seales de inflamacin es la captura de linfocitos y leucocitos por el endotelio (figura 12-2). Una serie de trabajos que incluyen elegantes estudios de microscopa intravital han ayudado a caracterizar una secuencia de interacciones adhesivas involucradas en la migracin de los leucocitos desde la sangre a los sitios de inflamacin. Bajo condiciones normales de flujo, la interaccin de los leucocitos con el endotelio es un fenmeno enteramente al azar observndose que los leucocitos ruedan ("rolling") a lo largo del vaso sanguneo. En las cercanas de un sitio donde haya ocurrido un dao vascular o un proceso inflamatorio, la produccin de citoquinas y otros mediadores de la inflamacin inducen una disminucin de la velocidad del flujo leucocitario observndose el aplanamiento de los leucocitos sobre el endotelio y su firme adhesin a ste. Posteriormente, algunos de los leucocitos se arrastran por el endotelio buscando un sitio por el cual atravesarlo, pasando finalmente por entre las clulas endoteliales (diapdesis). Una vez que los leucocitos se encuentran en el tejido subendotelial, stos continan su migracin hacia

el sitio de la inflamacin. Todos estos procesos, desde la interaccin al azar de los leucocitos con el endotelio hasta la migracin final de stos al sitio de inflamacin estn regulados por interacciones mediadas por molculas de adhesin. Una serie de estudios con anticuerpos especficos indican que el rodar de los leucocitos sobre el endotelio luego de una lesin del tejido, est mediado por mltiples interacciones de baja afinidad. Estos contactos involucran predominantemente la interaccin entre selectinas y sus respectivos ligandos tipo Sialil L-X. As, en esta etapa se han demostrado la interaccin de LSelectina presente en los leucocitos con sus ligandos en el endotelio (GlyCAM-1 y CD34) as como la de P-Selectina (constitutiva en el endotelio) y E-Selectina (inducida en el endotelio por accin de citoquinas pro-inflamatorias) con sus correspondientes estructuras sialiladas y fucosiladas expuestas en la membrana del leucocito (SLex). De este modo, el "rolling" de los leucocitos sobre el endotelio est fuertemente regulado por las selectinas que actuaran en forma coordinada. Estudios ms recientes han implicado, adems de las selectinas, la accin de integrinas en el "rolling" de los leucocitos sobre el endotelio. Ciertas lneas celulares linfoides usan 47+para rodar sobre VCAM-1 o sobre MAdCAM-1 en el endotelio de las mucosas como se enunci anteriormente. En una segunda fase del proceso de transmigracin leucocitaria se produce un aumento en la fuerza de la adhesin lo que lleva a una adhesin firme de los leucocitos al endotelio y su detencin sobre ste ("sticking"). En este proceso de adhesin firme participan receptores de adhesin de la familia de las integrinas en los leucocitos y de la SFIg en el endotelio. La participacin de estos receptores de adhesin ocurre luego de un proceso de activacin de las integrinas (por cambios conformacionales en el heterodmero), o por mecanismos que actan para modular la avidez de las integrinas presentes en los leucocitos, as como tambin por un aumento en la expresin de novo de receptores de la SFIg. Entre stos encontramos la accin de ciertas quimioquinas (IL-8 o MIP-1), citoquinas como IL-5, o quimioatractantes como C5a producidos localmente en el sitio de la inflamacin). Por otro lado, el entrecruzamiento de ciertas protenas en la superficie de los linfocitos tales como CD2, CD3, CD44 as como de las selectinas E y P del endotelio por sus respectivos ligandos inducen un

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Figura 12-2. Modelo de las interacciones adhesivas que actan en la migracin transendotelial. Los leucocitos toman contacto al azar con el endotelio sobre el cual ruedan (rolling). En las cercanas del sitio en que ocurre un proceso inflamatorio disminuyen la velocidad, sufriendo aplanamiento y adhesin firme al endotelio. Posteriormente los leucocitos salen del vaso sanguneo, pasando entre las clulas endoteliales (diapdesis) y llegan al sitio de inflamacin. Obsrvese la participacin de distintas molculas de adhesin por parte de los leucocitos y clulas endoteliales, en las diferentes etapas del proceso.

aumento en la avidez de las integrinas 2,+en especial CD11aCD18 (LFA-1). As tambin, la adhesin de LT al endotelio mediante CD31 (PECAM-1) una molcula de adhesin de la SFI presente tanto en el endotelio como en leucocitos (que promueve la adhesin a travs de interacciones homotpicas CD31-CD31) aumenta la actividad funcional de las integrinas 1. Por otro lado, molculas tales como TNF-1, IFN e IL1 inducen en el endotelio la expresin de VCAM1 y de ICAM-1, ligandos de las integrinas linfocitarias 41 y CD11aCD18 (LFA-1), respectivamente. El resultado final de la induccin de nuevas molculas de adhesin o del aumento de la afinidad y avidez de receptores preexistentes originan nuevas interacciones adhesivas entre integrinas y molculas de la SFIg con sus respectivos ligandos provocando la adhesin firme de los leucocitos al endotelio. Luego de este proceso de adhesin firme, la gran mayora de los

leucocitos adheridos al endotelio comienzan a arrastrarse sobre la superficie de ste mediante un proceso que requiere la modulacin cclica de la actividad de las integrinas y sus ligandos. Algunos leucocitos logran introducirse en las uniones entre las clulas endoteliales para pasar por diapdesis al espacio extravascular. Este fenmeno de transmigracin est fuertemente regulado por la accin de quimioatractantes como IL-8 y citoquinas como IL-1 y TNF producidos localmente. Dado que la adhesin es un requisito de la diapdesis, los estudios dirigidos a identificar los receptores involucrados en el proceso de diapdesis se han visto complicados por la dificultad de distinguir entre la participacin de los receptores de adhesin en la adhesin propiamente tal o en la transmigracin. Sin embargo, los resultados obtenidos a la fecha involucran la participacin de ICAM-1 y su receptor CD11aCD18 (LFA-1) y del par VCAM-

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1/41 en el fenmeno de migracin transendotelial de los leucocitos. Una vez que los linfocitos han atravesado la pared vascular, deben adherirse a las clulas del epitelio o a los elementos de la matriz extracelular. La evidencia experimental sugiere que la activacin de los LT in vivo produce un aumento de la avidez de las integrinas 1 y 2++ por largos perodos, lo que permitira la mantencin de los LT activados en el microambiente local del sitio de la inflamacin. Molculas de la matriz extracelular tales como fibronectina y trombospondina jugaran a travs de su interaccin con 41 y 51 un rol central en este fenmeno. Un efecto similar tendra la interaccin entre la integrina 31 con epiligrina, una molcula de la membrana basal de los epitelios. Aquellos linfocitos que hayan disminuido la afinidad/avidez de sus integrinas u otros receptores de adhesin abandonaran el sitio de la inflamacin para volver a la circulacin va linfticos. 4.2. Trfico linfocitario a travs del endotelio columnar (HEV) En los ganglios u otros rganos linfoides secundarios tales como en las placas de Peyer, amgdalas, etc. el endotelio venular se encuentra formado por un tipo especfico de clula endotelial, la clula endotelial columnar (HEV: "High Endothelial Venules"). Estas clulas expresan receptores de adhesin diferentes que las clulas endoteliales planas de la vasculatura perifrica y estn especializadas en la migracin de los linfocitos hacia el interior de los rganos linfoides secundarios. Aproximadamente un 25% de los linfocitos que circulan por el endotelio columnar lo atraviesan para entrar al OLS, comparado con el bajo nmero de linfocitos que atraviesan el endotelio vascular normal. Esto se debe a que las HEV expresan vas de adhesin en forma constitutiva, mientras que en el endotelio normal estas vas de adhesin slo se activan durante la inflamacin. Los mecanismos adhesivos que actan en las HEV son diferentes y dependiendo del rgano en cuestin, ya que diferentes receptores de adhesin se expresan en los ganglios perifricos comparadas por ejemplo con aquellas expresadas por las HEV de placas de Peyer, ganglios mesentricos, u otras mucosas. En el bazo, por otro lado, la entrada de los linfocitos no ocurre a travs del endotelio sino que se efecta, fundamentalmente, por la

descarga directa de stos a los sinusoides en la llamada circulacin abierta. Endotelio Columnar Ganglionar. En los ganglios perifricos se han encontrado dos ligandos especficos para L-Selectina denominados domicilinas (addressins); GlyCAM-1 ("Glycosylation-dependant Cell Adhesion Molecule-1") y CD34. Ambos ligandos son mucinas que portan cadenas laterales de carbohidratos que requieren estar sialiladas, y sulfatadas para unir LSelectina. Estos ligandos, que se expresan en mayor abundancia en el endotelio de los ganglios perifricos que en cualquier otro rgano, permitiran la recirculacin de linfocitos vrgenes (Lselectina+), as como tambin de un subgrupo de linfocitos de memoria (centrales) CD62L+ hacia estos ganglios. ICAM-1, presente en las HEV tambin ha sido involucrado en la recirculacin de linfocitos a los ganglios perifricos ya que anticuerpos contra esta molcula bloquean la migracin de los linfocitos desde la sangre a los ganglios. Puesto que CD11aCD18 (LFA-1), el ligando de ICAM-1 presente en los linfocitos, se encuentra normalmente en un estado inactivo, ste debe ser activado previamente para que se una a su receptor, lo cual est dado por las quimioquinas SLC y/o ELC, las cuales se unen al receptor CCR7, el que se encuentra expresado especficamente en LT vrgenes y de memoria centrales. El papel e importancia crucial de las quimioquinas en la cascada de adhesin ya se ilustr al inicio de este captulo, pero baste recordar que se ha demostrado que la presencia tanto de CCR7 como de sus ligandos son esenciales para permitir la adhesin firme del linfocito T. Para ilustrar an ms la importancia del modelo secuencial de mltiples pasos, esta cascada permite explicar por qu por ejemplo los neutrfilos (que no poseen CCR7) son incapaces de adherir y transmigrar en ganglios perifricos (an cuando expresan L-selectina). Aunque el entrecruzamiento del TCR es capaz de producir activacin de las integrinas, se sabe que en el endotelio esto ocurre por una va independiente de la estimulacin del LT por su antgeno ya que los linfocitos vrgenes que entran a los ganglios como parte del proceso de vigilancia inmune normal no se encuentran necesariamente activados. Estudios recientes en endotelio aislado de amgdala humana indican que VCAM-1 se expresara en forma constitutiva en este endotelio, sugiriendo la participacin del par VCAM-1/41 en la entrada de los linfocitos a este rgano.

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Endotelio columnar de placas de Peyer. Estudios de bloqueo de la adhesin con anticuerpos especficos permitieron la identificacin de una nueva molcula de adhesin llamada MAdCAM-1 ("Mucosal Addressin Cell Adhesion Molecule-1"), la cual es virtualmente especfica del endotelio de mucosa intestinal. MAdCAM-1 se expresa principalmente en el endotelio de placas de Peyer, en el endotelio de la lmina propia del intestino, y en las vnulas de la glndula mamaria. Esta molcula, que presenta dominios tipo Ig y tipo mucina, tiene dos receptores descritos. Uno de ellos es una molcula de la familia de las integrinas que presenta la cadena 4 ligada a la cadena 7. El otro es LSelectina, aunque como se mencion, L-selectina slo se une a la forma de MAdCAM presente en placas de Peyer. Experimentos de adhesin han demostrado que clulas portadoras de 47 pero no 41 son capaces de adherirse a HEV de placas de Peyer o a MAdCAM-1 directamente. Por otro lado, y de acuerdo con el modelo secuencial de mltiples pasos, recientemente se ha descrito que el receptor de quimioquina CCR9 est presente preferentemente en LT efectores y/o de memoria de lmina propia y tambin en linfocitos intraepiteliales (IEL) de intestino delgado. Interesantemente, su expresin est fundamentalmente restringida a LT 47+, por lo que se ha planteado que ste sera el receptor de quimioquina encargado especficamente de activar la adhesin mediada por esta integrina en la mucosa del intestino delgado. Adicionalmente, el nico ligando descrito para CCR9, la quimioquina TECK (CCL25) se ha descrito en endotelio de lmina propia. En resumen, la presencia o ausencia de ciertos receptores de adhesin en los linfocitos, o de determinados ligandos en el endotelio columnar de diferentes rganos linfoides definiran las subpoblaciones de linfocitos que migraran a los diferentes rganos. As, a los ganglios perifricos migran linfocitos con un fenotipo L-Selectina+/ +CR7+/+LFA+, mientras que los linfocitos que migran a placas de Peyer y lmina propia intestinal tendran un fenotipo L-selectina-/low/+CR9+/ 47+. 4.3. Trfico linfocitario hacia la piel Estudios recientes han demostrado que el endotelio de la piel expresa E- y P-Selectina de manera inducible y tambin constitutiva (aunque

dbil). E-Selectina se induce preferencialmente en las vnulas de la piel durante los estados de hipersensibilidad de tipo retardada y durante las inflamaciones crnicas de la piel, proporcionando uno de los elementos centrales que influencia el paso de linfocitos T a la piel. En humanos, estudios efectuados en linfocitos localizados en la piel, han demostrado que stos expresan un carbohidrato especfico denominado Cutaneous Lymphocyteassociated Antigen (CLA). Esta molcula, la cual, como se mencion, es una modificacin postraduccional de PSGL-1, parece encontrarse exclusivamente en linfocitos T de tipo memoria/ efector en la dermis y est ausente en otras subpoblaciones linfocitarias provenientes de otros epitelios. CLA aparece como el principal ligando de E-Selectina en esos tejidos. Dado que ESelectina se expresa tambin en otros tejidos adems de la piel, se ha sugerido que la interaccin CLA/E-Seletina no sera suficiente para explicar la exquisita segregacin de los linfocitos CLA+ en la piel. A este respecto, y al igual que para otros tejidos, se ha planteado recientemente que un elemento de especificidad adicional (y probablemente determinante), sera el grupo de receptores de quimioquina que estara presente en LT CLA+. En particular, se ha planteado que CCR4, y ms recientemente CCR10 y CCR6 tendran un papel importante en la determinacin de especificidad migratoria fina de LT a piel, donde adems se han identificado las quimioquinas y/o ligandos para estos receptores (MDC/TARC, CTACK, y MIP3, respectivamente). Sin embargo, hasta el momento esto ltimo es controversial, ya que se ha identificado que por ejemplo CCR4 se encuentra tambin en LT CLA negativos y que se expresa adems en linfocitos Th2, por lo cual su especificidad en relacin a "homing" a piel es, a la fecha, cuestionable.

5. REGULACIN DEL POSICIONAMIENTO ("HOMING") DE LINFOCITOS Qu determina que un linfocito virgen adquiera despus de activarse un potencial de "homing" tejido-especfico?. Para ilustrar la importancia de esta pregunta, vale la pena recordar que los LT vrgenes pueden migrar indistintamente por todos los OLS (ganglios perifricos, mesentrico y placas de Peyer), pero que slo despus de activarse y pasar a ser LT de memoria y/o efectores adquieren preferencia para migrar a

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determinados tejidos y no otros, fenmeno que se ha denominado "homing" o posicionamiento tejido-especfico (ej. aquellos con "homing" a mucosa intestinal no migran a piel y viceversa). Es importante mencionar que el hecho de que los linfocitos presenten restriccin y especificidad en cuanto al "homing" a determinados tejidos es determinante para el desarrollo o no de una respuesta inmune adecuada, especialmente si se considera que aquellos linfocitos que presentan "homing" tejido-especfico son los llamados efectores y/o de memoria, y que justamente son los que estn encargados de proteger ms eficientemente frente a un segundo encuentro con el antgeno. Adicionalmente, en modelos animales de algunas enfermedades autoinmunes intestinales (ej. enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa) se ha demostrado que el bloqueo de una de las molculas implicadas en el "homing" a mucosa intestinal ( 4 7 ) tendra la capacidad de disminuir importantemente la severidad de la enfermedad. Esto tiene la ventaja de que al posibilitarse la respuesta inmune en otros tejidos, no sera necesario inmunosuprimir a los pacientes (como lo hacen las terapias inmunosupresoras estndar en uso actualmente). Sin embargo, la meta ms ambiciosa final sera poder bloquear el "homing" a un tejido slo de aquellos clones implicados en la respuesta patolgica, dejando la posibilidad de que otros clones no patognicos puedan responder a otros antgenos en ese tejido, es decir, en el fondo un modo de establecer tolerancia especfica por esta va. Volviendo a la pregunta inicial de qu determina el "homing" tejido-especfico en un linfocito al activarse y pasar a ser linfocito efector y/o de memoria, partiremos mencionando que existen al menos cuatro teoras conceptualmente diferentes que intentan explicar este mismo fenmeno. Aunque algunas de ellas tienen mayor o menor aceptacin, todas estn basadas en algunos hechos comunes. Se ha demostrado que si se reinfunde en un animal linfocitos tomados desde un tejido, stos preferentemente migrarn al tejido desde donde fueron aislados (en este sentido presentan "homing" por el tejido de origen) y que linfocitos efectores/de memoria tomados desde piel o mucosa intestinal, presentan preferentemente receptores de "homing" especficos para piel o mucosa intestinal respectivamente. A continuacin se discutir brevemente las diferentes teoras que intentan dar cuenta de los hechos descritos anteriormente, para

lo cual se mencionar antecedentes que permiten apoyarlas como tambin algunas de sus debilidades. a) La teora actualmente ms aceptada es aquella que propone que el sitio de entrada del antgeno determinara de algn modo el fenotipo de "homing" de un linfocito. A este respecto, existen dos trabajos que muestran (en humanos) que un antgeno que entra por va oral produce un significativo mayor nmero de clones que expresan la molcula de migracin especfica a la mucosa intestinal+47+y que son, al mismo tiempo, especficos contra el antgeno, comparados con el mismo antgeno inoculado por va parenteral (lo cual de hecho produce clones especficos contra el antgeno, pero que son 47+negativos). Estos trabajos tienen el valor de haber sido hechos en humanos, pero al mismo tiempo presentan el problema de haber usado antgenos complejos (con muchos potenciales eptopos); cabe as la posibilidad de inducir la respuesta de diferentes clones T y por tanto cabra la posibilidad de que no sea la misma especificidad de linfocito la que se expande preferentemente al inmunizar por una u otra va, con lo cual existe la posibilidad de que en un caso se expandan clones predeterminados para ser+ 4 7+positivos y en el otro, clones predeterminados para ser+47+negativos. Al mismo tiempo, el hecho de administrar el antgeno por una u otra va no garantiza que la activacin se producir slo localmente en el tejido de entrada (de hecho, se ha demostrado que un antgeno que entre por va oral puede activar tambin linfocitos en el bazo). Aunque esta es una hiptesis teleolgicamente atractiva, puesto que tiene sentido fisiolgico que un linfocito vuelva donde encontr por vez primera su antgeno, es bueno ser cautelosos al interpretar los datos que la sustentan. b) Otra hiptesis sostiene que la dotacin de receptores de "homing" estara fuertemente asociada al fenotipo Th1 o Th2 de un linfocito. En lo concreto, se ha demostrado que clulas cultivadas en condiciones de polarizacin Th1, pero no Th2, adquieren expresin de ligandos para P y E-selectinas y por lo tanto capacidad de "homing" a piel y otros tejidos inflamados. Tratando de conciliar este modelo con el anterior, cabe destacar que en mucosa intestinal se ha descrito una desviacin del equilibrio de linfocitos hacia Th2, lo cual est de acuerdo con el hecho de que los linfocitos activados en ese microambiente no expresaran ligandos para P/E-selectinas. Sin

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embargo, otro trabajo logr demostrar que in vivo no existira una asociacin predominante entre el ligando de E-selectina CLA ("homing" a piel) con el fenotipo Th1 o Th2, lo que sugiere que si bien es cierto que bajo condiciones in vitro sera posible encontrar una asociacin con un fenotipo o molcula de "homing", esta asociacin no necesariamente ocurre in vivo. c) Otros autores han propuesto que el hecho de encontrar linfocitos con un fenotipo predominante en un tejido dependera de diferencias en la tasa de proliferacin y/o apoptosis de estas clulas en el tejido, es decir, linfocitos activados en un tejido determinado tendran una mejor posibilidad de sobrevivir y/o proliferar en ese mismo tejido. De esta manera, los partidarios de esta hiptesis sostienen que la acumulacin de linfocitos en un tejido determinado no dependera de la entrada preferencial de estas clulas al tejido (es decir no dependera de mayor adhesin de esos linfocitos al endotelio), sino que de una mayor o menor proliferacin y/o apoptosis de estas clulas en el tejido. Sin embargo, los datos que sustentan esta hiptesis podran tambin ser explicados en el contexto de una preferencia en el "homing" en vez que en diferencias de proliferacin y/o apoptosis. d) Finalmente, una hiptesis que ha sido planteada recientemente es que sera el tejido en s el que seleccionara los linfocitos con el fenotipo de "homing" adecuado. Hasta el momento no existen datos que apoyen directamente esta hiptesis, aunque a decir verdad tampoco existe evidencia formal que permita descartarla totalmente. Sin embargo, los autores de esta hiptesis sostienen que a la luz de los datos actuales no se puede excluir que el hecho de encontrar linfocitos preferentemente con un determinado fenotipo de "homing" en un tejido podra ser el resultado de un evento inicial estocstico donde los linfocitos al activarse adquieran una dotacin de receptores de homing al azar, y que sea el tejido en s (con su dotacin especfica de addressins) el que seleccione aquellos linfocitos con la dotacin de receptores adecuada o necesaria para entrar. De este modo, por ej. si el antgeno entra por va mucosa, esto favorecera la proliferacin y sobrevida de aquellos linfocitos 47+ que pudieron entrar al tejido mucoso, pero no de aquellos 4 7 que no ingresaron, lo cual a su vez contribuira an ms a la seleccin adecuada y proliferacin de determinados clones. Con esto, el resultado final

sera el mismo, es decir, slo se encontraran en un tejido linfocitos con un determinado fenotipo de "homing" pero no otro, sin que necesariamente exista un evento instructivo inicial en este fenotipo. Aunque esta es una hiptesis altamente provocativa, como se mencion anteriormente no existen evidencias que la apoyen directamente. De todas las hiptesis enunciadas anteriormente, la ms aceptada actualmente es que el sitio de entrada del antgeno, es decir el tejido donde el linfocito encontrara su antgeno, jugara un rol determinante en la induccin de "homing" tejido-especfico. La mayor popularidad de esta hiptesis se debe probablemente a que pensado desde un punto de vista funcional es ms atractivo fisiolgicamente pensar que el potencial de "homing" pueda ser instruido por el microambiente del tejido donde es presentado el antgeno, de manera tal que el linfocito predominantemente regrese al sitio donde es ms probable que vuelva a encontrar el antgeno, y al mismo tiempo donde realmente se necesita esta respuesta inmune, disminuyendo por otro lado la probabilidad de dao en tejidos donde esta respuesta no se necesita. Desde hace ms de 10 aos que se piensa que el potencial de "homing" tejido-especfico de un linfocito podra ser instruido por el microambiente del tejido en el cual este linfocito es activado. Sin embargo, actualmente es completamente desconocido qu elementos en el tejido seran los encargados de determinar esta propiedad en los linfocitos. Poder contestar esta pregunta no slo es importante desde el punto de vista mecanstico, sino porque adems dara la posibilidad de poder modular la respuesta inmune en forma ms especfica. En nuestro laboratorio hemos abordado esta pregunta planteando como hiptesis que los elementos que determinaran el "homing" dentro de un tejido seran las DC presentadoras de antgeno. Esta hiptesis se basa, entre otras cosas, en el hecho de que para que un linfocito adquiera un potencial de "homing" tejido-especfico debe en primer lugar ser activado, y que actualmente se acepta que las nicas clulas presentadoras de antgeno capaces de activar eficientemente linfocitos T virgen son las CD. Dado lo anterior, estas clulas seran al menos elementos necesarios en este proceso. Los resultados de nuestro laboratorio estn plenamente de acuerdo con nuestra hiptesis ya que muestran que comparadas con CD de ganglios linfticos perifricos (PLN) o bazo las CD derivadas de placas de Peyer son

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capaces de inducir una significativa mayor expresin de la integrina de "homing" a mucosa+47 en linfocitos T y una clara respuesta a la quimioquina TECK, que como se discuti anteriormente son las dos molculas que han sido postuladas como receptores de "homing" para mucosa intestinal. En acuerdo con estos resultados hemos logrado demostrar adems que estas diferencias fenotpicas se traducen efectivamente en una diferencia funcional in vivo, ya que linfocitos activados con CD de placas de Peyer migran significativamente ms a placas de Peyer y dramticamente mejor a lmina propia del intestino comparados con aquellos activados con CD de PLN. Finalmente, en nuestros ensayos hemos encontrado que la mayor expresin de+47+inducida por CD de placas de Peyer no se asocia a una mayor o menor produccin de IFN , lo que nos ha llevado a pensar que el fenotipo de "homing" no necesariamente se correlaciona con una u otra respuesta T "helper". En su conjunto, nuestros resultados destacan una forma completamente nueva en la cual CD pueden educar a LT. Un concepto propuesto recientemente es que, en general, existiran diferentes subpoblaciones de LT, a saber: LT nave, LT de memoria centrales, y

LT de memoria efectores. Esta clasificacin est basada en la expresin diferencial de las isoformas CD45RA y CD45RO y de las molculas de "homing" L-selectina y CCR7, as como tambin por caractersticas funcionales diferenciales. Esto ha planteado un nuevo paradigma para estudios subsecuentes, por lo cual creemos importante mencionar las propiedades generales de estas subpoblaciones descritas (tabla 12-3). La existencia de subpoblaciones de LT de memoria efectores se correlacionara con lo que actualmente conocemos en relacin a "homing" de LT a tejidos terciarios, tejidos en los cuales se encuentran predominantemente LT con fenotipo CD44HIGH / CD45RO / L-SelectinaNEG / y con dotacin de molculas de "homing" especficas para el tejido analizado (ej. 47 / CCR9 para mucosa intestinal y CLA para piel). Por otro lado, la funcionalidad de los putativos LT de memoria centrales sera mantener un pool de LT de memoria (con rpida respuesta al antgeno) que mantenga la capacidad de acceder a OLS en el caso que el antgeno (o uno relacionado) entre por una va diferente a aquella que utiliz la primera vez. A su vez, frente a una segunda estimulacin antignica, estos LT de memoria centrales daran origen a LT de memoria efectores, los cuales per se tendran

Tabla 12-3. Caractersticas de los LT nave, de memoria central y memoria efector LT Nave Fenotipo Molculas de adhesin LT de memoria central LT de memoria efector CD45RO+/ CD44 High L-Selectina Neg 47+/+/+CLA+/LFA-1+ CCR7_ CCR9+/+/ CCR4+/ CCR6+// CCR10+/ Proliferacin rpida Actividad efectora inmediata (citoquinas o CTL) IL-2, IFN, IL-4 Muchas Tejidos terciarios (piel, mucosa intestinal, otros?)

CD45RA+/CD44Low CD45RO+/ CD44 High L-SelectinaHigh 47-+/+CLA_ LFA-1+ CCR7+ Sin especificidad tisular L-Selectina High 47-+/+CLA _ LFA-1+ CCR7+ Sin especificidad tisular

Receptores de quimioquina Respuesta funcional al Ag

Expansin clonal Proliferacin rpida (requiere priming Dan origen a LT por CD) efectores de memoria IL-2 (retardada) Ninguna OLS, mdula sea IL-2 (rpida), sin IFN- ni IL-4 Varias OLS (ganglios, placas de Peyer)

Respuesta de citoquinas al Ag Divisiones inducidas por el Ag Tejidos blanco de homing

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un compromiso ms restringido para circular por ciertos tejidos terciarios y no otros (pero no por OLS). Es importante mencionar, que aunque esta subdivisin de los LT de memoria es atractiva y permite explicar algunos fenmenos, su funcionalidad in vivo en trminos de migracin diferencial de estas diferentes subpoblaciones an no ha sido demostrada. Por otro lado, esto se ha descrito hasta el momento en humanos, y no es conocido actualmente si existe un ejemplo murino para estos diferentes subtipos de LT. Tampoco se conoce qu factores determinan que durante una estimulacin antignica determinados LT progresen hasta el estadio de LT de memoria centrales y otros hasta LT de memoria efectores. A modo de resumen, y tomando en cuenta esta ltima subdivisin mencionada, los linfocitos LT podran ser clasificados de acuerdo a su potencial de "homing" como se indica en la tabla 12-4.

involucradas an no se han definido con certeza.

6. RECEPTORES DE ADHESIN EN LA DIFERENCIACIN Y ACTIVACIN LINFOCITARIA 6.1. Receptores de adhesin y diferenciacin temprana en la mdula sea Aunque son escasos los estudios que ligan la participacin de molculas de adhesin y sus ligandos en la diferenciacin de linfocitos B en la mdula sea, algunos resultados en conjunto con datos de experimentos realizados in vivo con anticuerpos versus receptores de adhesin en primates, demuestran en forma clara la importancia de los receptores de adhesin y sus ligandos en la linfopoyesis temprana.

Tabla 12-4. Potencial de homing de los linfocitos T segn su estado de diferenciacin. "Tethering"/"Rolling" Activacin LT Endotelio LT Endotelio LT nave y LT de memoria centrales Migracin a OLS Sin restriccin L-selectin PNAd CCR7 SLC /ELC (GlyCAM1, CD34) / MAdCAM1 LT de memoria efectores MAdCAM-1 CCR9? TECK? "Sticking" Endotelio

LT

LFA-1

ICAM-1

Migracin a mucosa 47 intestino delgado

47 LFA-1? ICAM-1? LFA-1 41?

MAdCAM1

Migracin a piel

CLA / Otros ligandos de P/Eselectina?

E / Pselectinas

CCR4? CCR6? CCR10?

MDC /TARC? MIP3__ CTACK?

ICAM-1 VCAM-1?

En relacin a "homing" tejido-especfico de linfocitos a otros territorios, al da de hoy se piensa que, en efecto, existiran otras vas de migracin. A este respecto, cabe mencionar que se han postulado vas de "homing" especfico a pulmn, articulaciones, mucosa de intestino grueso, mdula sea, y eventualmente sistema nervioso central, aunque su especificidad y las molculas

Las clulas estromales de la mdula sea, en conjunto con receptores de la matriz extracelular (MEC) proporcionan el microambiente necesario para la linfopoyesis y la hematopoyesis en general. Algunas de las clulas que conforman el complejo estroma medular proporcionan las citoquinas requeridas para la diferenciacin de los linfocitos B en la mdula, mientras que otras

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seales necesarias para esta diferenciacin provienen de la interaccin directa entre las clulas estromales y los precursores linfocitarios. In vivo, la interaccin entre los precursores linfoides y el microambiente medular es compleja; durante las primeras etapas de diferenciacin los precursores deben permanecer en ciertas zonas cercanas a la periferia de la mdula para moverse luego hacia el centro donde su interaccin con clulas reticulares y macrfagos de la mdula promueve la diferenciacin. Finalmente las clulas pasan al seno central de la mdula, en donde su interaccin con las clulas endoteliales permite a los linfocitos maduros salir finalmente a la circulacin como linfocitos B vrgenes. Estos procesos e interacciones requieren de la participacin de receptores de adhesin y sus respectivos ligandos, de manera que estas molculas juegan un papel central en la regulacin de la linfopoyesis. Algunas de las interacciones que han sido reconocidas en este proceso incluyen contactos entre la integrina 41+(VLA-4) presente en los precursores linfoides y su ligando VCAM-1 presente en clulas del estroma medular o con fibronectina presente en la MEC. Anticuerpos anti-VLA-4 o contra VCAM-1 bloquean la adhesin de progenitores de lneas celulares B a cultivos de mdula sea e inhiben la diferenciacin de clulas B en cultivos de mdula sea de larga duracin. Un receptor de adhesin presente en los linfocitos y que no pertenece a ninguna de las familias antes mencionadas es CD44. Esta molcula, que tiene como ligando al cido hialurnico, es una protena de membrana que como resultado de un proceso de "splicing" alternativo de su mRNA presenta mltiples isoformas en la membrana celular (una de las cuales est presente en los linfocitos efectores y de memoria). CD44 participa en varias etapas durante la linfopoyesis as como en la recirculacin linfocitaria. Los progenitores B presentan altos niveles de CD44 en su membrana, niveles que disminuyen durante la maduracin para volver a aumentar en el linfocito B maduro. Anticuerpos anti-CD44 bloquean la interaccin entre los precursores B y lneas celulares derivadas de la mdula sea e interesantemente son capaces de inhibir la diferenciacin de linfocitos B en cultivos de mdula sea. Por otro lado, y aunque no cabe duda de la participacin de receptores de adhesin en la diferenciacin de linfocitos T en el timo, la contribucin de molculas de adhesin especficas en este proceso es menos clara, debido

fundamentalmente a la insuficiencia de los modelos experimentales con que se cuenta para estudiar las interacciones celulares en el timo. La participacin de receptores de adhesin en las interacciones entre las clulas T maduras y clulas accesorias o con los linfocitos B durante la ayuda inmune se discutir ms adelante. 6.2. Receptores de adhesin y diferenciacin en el microambiente de los OLS Los receptores de adhesin participan tambin en las etapas finales de la diferenciacin de los linfocitos B activados en el microambiente de los OLS. Estas interacciones incluyen entre otras: (i) contactos que ocurren en las zonas T del OLS entre linfocitos T especficos para un cierto antgeno y las DC interdigitantes (DC-I), que a su vez son un subgrupo de las CD y (ii) interacciones en el centro germinal entre los linfocitos B activados con las DC foliculares (DCF) y los LT especficos para el mismo antgeno. Las DC-I se encuentran en la zona T de los OLS y en otros rganos no linfoides tales como corazn, pulmones, riones, etc. Estas clulas presentan una alta expresin de antgenos MHC clase II y como se discuti son centrales en la iniciacin de la activacin de LT, actuando como clulas presentadoras de antgeno y entregando adems una segunda seal coestimulatoria a los LT (ej. CD80, CD86, CD2-Ligando), seal que depende de la interaccin ntima entre el LT y la DC-I. Las DC-I expresan adems numerosos receptores de adhesin, incluyendo CD11aCD18 (LFA-1), ICAM-1, ICAM-2 y CD44. Experimentos realizados con anticuerpos contra diferentes receptores de adhesin o sus ligandos bloquean la respuesta de LT estimulada por DC-I. Estos resultados sugieren que la interaccin funcional entre las DC-I y los LT requiere de interacciones entre los pares adhesivos ICAM-1/LFA-1, y ICAM2/LFA-1. En particular, se sabe que la interaccin ICAM-1/LFA-1 es esencial para la respuesta CD8 CTL, ya sea primaria o secundaria. Por otro lado, las DC-F actan como un importante sistema para atrapar antgeno en el tejido linfoide ya que ellas ligan complejos antgeno-anticuerpo en forma altamente eficiente en los denominados icosomas. Se postula que la interaccin de los linfocitos B con los complejos icosomas presentes en la superficie de las DC-F y con los LT especficos para el mismo antgeno (previamente activados en la zona T por las DC-

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I), conjuntamente con la produccin local de citoquinas en el centro germinal, jugaran un papel central en mecanismos tan importantes como salvar a los LB de la apoptosis, en la induccin de la sntesis de anticuerpos, en los cambios de clase de inmunoglobulina, en la llamada maduracin de afinidad de los LB, y probablemente en la mantencin de LB de memoria. Aunque el detalle de los mecanismos moleculares involucrados en estos procesos se desconoce, existe evidencia de que los receptores de adhesin tendran un papel central en estos importantes fenmenos. Recientemente se ha demostrado la presencia de VCAM-1 e ICAM-1 en DC-F. Experimentos con anticuerpos contra estas molculas o contra los respectivos receptores de adhesin 41++y CD11aCD18 (LFA-1) presentes en los LB, han permitido establecer la participacin de estos pares adhesivos en las interacciones celulares en el centro germinal. En relacin al "homing" de los LB en el microambiente de los folculos linfoides, se ha demostrado que el receptor de quimioquina CXCR5 presente en LB, al igual que su ligando BLC (CXCL13) producida especficamente por DC-F en el folculo de los OLS (excepto en ganglios perifricos, donde se piensa que este rol es cumplido por MIP-3 o MIP-3) son requeridos para la localizacin del LB en los folculos linfoides. Tambin se ha implicado al par SDF-1 y a su receptor CXCR4 (CXCL12) en el "homing" microambiental de LB, aunque su rol ha sido menos documentado. En los centros germinales, aquellos LB que no son seleccionados por el antgeno para transformarse en clulas de memoria (ya sea porque no responden al antgeno o porque pierden afinidad por ste en el proceso de maduracin de afinidad) son eliminados a travs de un proceso de apoptosis. Estudios de inhibicin de la adhesin con anticuerpos especficos sugieren que la adhesin de los LB a las DC-F va los pares adhesivos ICAM-1/LFA-1 y VCAM-1/ 41 es necesaria para salvar a los LB de la apoptosis, contribuyendo en conjunto con el antgeno a la seleccin de los linfocitos B. La informacin presentada en este captulo muestra claramente la importancia de la participacin de los receptores de adhesin en los diferentes mecanismos y procesos involucrados en la respuesta inmune tanto normal como patolgica. Es evidente que estos mltiples receptores y ligandos proporcionan seales que controlan, conjuntamente con los receptores especficos para el antgeno, la especificidad, la iniciacin y la

duracin de la respuesta inmune, as como tambin la actividad efectora, recirculacin y posicionamiento o "homing" especfico de los linfocitos en los diferentes tejidos. Asimismo, cada vez es ms claro que los linfocitos, tienen vas de "homing" especficas para determinados tejidos, lo cual contribuye a hacer ms eficiente y especfica una respuesta inmune. De esta manera, el "homing" tejido-especfico sera el equivalente a dotar a los linfocitos efectores y de memoria de una clave para entrar al tejido donde es ms probable que vuelvan a encontrar su antgeno, y al mismo tiempo al bloquear la entrada a otros tejidos, se disminuyen las posibilidades de que estos linfocitos ya armados puedan producir dao al organismo (en la forma de hipersensibilidad o autoinmunidad). Finalmente, el hecho de que el "homing" tejidoespecfico de un linfocito sea una caracterstica que probablemente perdure en el tiempo, dara fundamento a la idea de considerarlo como parte de la memoria inmunolgica.

LECTURAS SUGERIDAS Bradley, L., Watson, S., Lymphocyte migration into tissue, Curr Opin In Immunol 8: 312-320, 1996. Cinamon, G.; Grabovsky, V.; Winter, E.; Franitza, S.; Feigelson, P; Shamri, R.; Dwir, O.; Alon, R., Novel chemokine functions in lymphocyte migration through vascular endothelium under shear flow, J Leukoc Biol 69 (6) 860-6, 2001. Dunon, D.; Piali, L.; Imhof, B.A., To stick or not to stick: the new leukocyte homing paradigm, Curr Opin cell Biol 8( 5):714-23, 1996. Moser, B., Loetscher, P., Lymphocyte traffic control by chemokines, Nature Immunol 2(2):1238, 2001. Taub, D.D., Chemokine-leukocyte interactions. The voodoo that they do so well, Cytokine Growth factor Rev. 7(4): 355-76, 1996. Worthylake, R.A., Burridge, K., Leukocyte transendothelial migration: orchestrating the underlying molecular machinary, Curr Opin Cell Biol 13(5):569-577, 2001.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 13
ONTOGENIA Y DIFERENCIACIN DE CLULAS B Y T
Rodrigo Naves P. y Mario Rosemblatt S.

1. Introduccin 2. Regulacin gnica de la diferenciacin linfocitaria 3. Diferenciacin y maduracin de linfocitos B 3.1. Etapa antgeno-independiente 3.2. Etapa antgeno-dependiente 4. Diferenciacin y maduracin de linfocitos T 4.1. Migracin de los precursores de linfocitos T 4.2. Diferenciacin 4.3. Seleccin tmica

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RESUMEN La produccin de clulas B o T maduras y funcionales involucra la conversin de una clula troncal pluripotente, cuyo fenotipo est fundamentalmente definido por la expresin de la molcula CD34, en una clula comprometida con uno de varios linajes. Este proceso est sometido a un estricto programa de regulacin gnica en el cual diversos genes son activados o reprimidos mediante la accin concertada de factores de transcripcin. Involucra tambin la diferenciacin y proliferacin de estas clulas en un microambiente apropiado. Los precursores linfoides ms inmaduros no estn plenamente identificados, aunque existe una serie de marcadores que han permitido adjudicar un cierto fenotipo a este precursor. La evidencia experimental indica que existira una clula progenitora linfoide comn para linfocitos B y T. Las seales de proliferacin y diferenciacin para cada tipo celular estaran dadas por el microambiente particular interacciones celulares y los factores solubles- en el cual madura cada uno de estos tipos celulares, el timo para las clulas T, y la mdula sea y los rganos linfoides secundarios (OLS) para las clulas B. Aunque an se desconoce muchas de estas seales. En la diferenciacin de los linfocitos B encontramos una etapa antgeno independiente que ocurre en la mdula sea y una etapa antgeno dependiente que ocurre fundamentalmente en los OLS. Los linfocitos B que emigran de la mdula sea (linfocitos B virgen) expresan simultneamente receptor para antgeno tipo IgM e IgD. Luego de su encuentro y seleccin por el antgeno en los OLS los linfocitos B sufren un cambio de clase de inmunoglobulinas y, a travs de un proceso de mutaciones, un aumento en su afinidad por el antgeno. Estos cambios de afinidad se llevan a cabo con una mantencin fiel de la especificidad por el antgeno. Los procesos de diferenciacin tanto en la mdula sea como en los centros germinales de los OLS estn regulados por las interacciones celulares y por citoquinas producidas localmente. La produccin de linfocitos T maduros ocurre fundamentalmente en el timo. Los progenitores hematopoyticos generados en la mdula sea migran al timo donde pasan por un activo proceso de diferenciacin y proliferacin. Los precursores T que llegan al timo no muestran ninguno de los marcadores tpicos de los linfocitos T maduros, son CD4-CD8- (dobles negativos) y TCR-. A partir de estas clulas se producen timocitos dobles positivos (CD4+CD8+) que expresan a su vez el TCR maduro. Finalmente estas clulas dobles positivas terminan generando la poblacin madura de linfocitos circulantes T "helper" (LTh) CD4+ y linfocitos T citotxicos (TLc) CD8+. Los timocitos dobles positivos pasan por una doble seleccin antes de transformarse en simples positivos y salir a la circulacin; una seleccin positiva que permite generar linfocitos T maduros que reconocen antgeno en funcin de su propio MHC (eliminndose los linfocitos T que no reconocen a su propio MHC) y una seleccin negativa que elimina los linfocitos T autorreactivos (que reconocen antgenos propios).

1. INTRODUCCIN Los estudios de los procesos de diferenciacin de linfocitos B y T han sido, tal vez, una de las reas ms estudiadas de la inmunologa en la ltima dcada. Aunque esta rea no ha estado libre de controversias y muchas de las cuales an persisten, sus resultados han sido espectaculares y han sentado las bases de numerosos procesos en otras facetas de la biologa celular y molecular.

En este captulo es abordarn los principales mecanismos que llevan a la maduracin de los linfocitos hacia clulas efectoras capaces de montar una respuesta inmune adaptable afectiva y se discutir a nivel celular y molecular cmo esta respuesta llega a ser eficaz contra patgenos, evitando el reconocimiento de los antgenos propios. Los mecanismos de diferenciacin deben asegurar que el repertorio, tanto de linfocitos B como T se genere en forma continua de manera de poder

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reconocer los antgenos forneos manteniendo la eficacia de la respuesta inmune. Estos mecanismos llevan en ltima instancia a la expresin, en la superficie de los linfocitos, de receptores especficos para antgeno y de molculas co-estimuladoras que aseguran la respuesta inmune. Por otro lado, muchos de estos linfocitos se transforman en clulas de memoria que persisten durante largo tiempo. En este captulo se discutirn estos mecanismos y se definirn las etapas que llevan a la generacin de clulas inmunocompetentes.

2. REGULACIN GNICA DE LA DIFERENCIACIN LINFOCITARIA La maduracin de linfocitos implica la progresin secuencial de una clula troncal pluripotente a travs de estados intermedios de diferenciacin para llegar finalmente a una clula absolutamente funcional. Se ha observado que las clulas progenitoras troncales expresan bajos niveles de los genes especficos de los diferentes linajes celulares que ellas son capaces de originar. Esto ha llevado a proponer que una vez que la clula troncal se compromete en la diferenciacin de un linaje celular particular ocurrira la consolidacin de la expresin gnica especfica de ese linaje y la represin de los genes que participan en la diferenciacin de los restantes linajes. En base a estudios de expresin gnica diferencial y al anlisis de ratones deficientes en la expresin de genes especficos se ha podido establecer la participacin jerrquica y combinatorial de nuevos factores de transcripcin implicados en la diferenciacin de los estados ms tempranos de las clulas linfoides (figura 13-1). Por ejemplo, los factores de transcripcin PU.1 e Ikaros participan en la diferenciacin de la clula troncal hematopoytica al estado de clula progenitora linfoide. PU.1 participa en la regulacin de la expresin del receptor de IL-7 que es requerido en la etapa de proliferacin de la clula progenitora linfoide. Ratones deficientes en la expresin de PU.1 mueren a las pocas horas o das de haber nacido y exhiben ausencia de clulas linfoides y mieloides lo que pone de manifiesto su importancia en la generacin de una clula progenitora comn para ambos linajes. Por su parte, Ikaros es capaz de interactuar con los factores de transcripcin Aiolos y Helios y participa en la especificacin, diferenciacin y homeostasis linfocitaria. Un defecto en la expresin de Ikaros impide el desarrollo de clulas precursoras tempranas.

Diversas evidencias han demostrado que la activacin del programa de expresin gnica especfica de las clulas B en el siguiente estado de diferenciacin (pre-pro-B) est controlado por la accin coordinada y cooperativa de los factores de transcripcin codificados por el gen E2A (E12 y E47) y por el factor de clulas B temprano EBF. Estos factores regulan la expresin y el rearreglo de los genes de IgH e Igk y son requeridos para la adecuada expresin de los genes activadores de las enzimas de recombinacin (Rags). Dentro de los genes regulados por E2A y EBF se encuentra el gen que codifica para el factor transcripcional Pax-5 el cual acta en el siguiente estado de diferenciacin conocido como pro-B. Se ha observado que clulas pro-B impedidas de expresar Pax5 presentan un fenotipo de clulas comprometidas en el linaje de clulas B pero continan expresando varios genes relacionados con otros linajes celulares. Este resultado sumado al hecho de que Pax-5 puede actuar como un activador transcripcional cuando es expresado en bajas concentraciones y como un represor a altas concentraciones, han llevado a proponer que la induccin de expresin de Pax-5 llevara a la represin de los genes asociados con los otros linajes celulares. En el caso de la maduracin de los linfocitos T una serie de decisiones deben ser tomadas a lo largo del proceso de diferenciacin. En primer lugar la clula progenitora linfoide puede seguir por la va de maduracin que conduce hacia el linaje de las clulas B o T. Luego, el linfocito T puede diferenciarse en clulas que expresan un TCR o un TCR y despus, en el caso de los linfocitos TCR, la eleccin debe ser tomada entre seguir hacia el linaje CD4+ o CD8+. Seales proporcionadas a travs del pre-TCR, el TCR, factores solubles e interacciones celulares son determinantes en el destino final de los linfocitos T en la diferenciacin. Al igual que en la maduracin de las clulas B, el programa de diferenciacin de las clulas T est sometido a un estricto control transcripcional. Entre los factores de transcripcin que participan en estos procesos, las protenas Notch cumplen un destacado papel de regulacin. Las protenas Notch corresponden a una familia de receptores de transmembrana que regulan procesos de diferenciacin neuronal y epidermal. Trabajos publicados recientemente han mostrado que la inactivacin inducible del gen Notch-1 en ratones recin nacidos o en clulas troncales de mdula sea conducen a un bloqueo temprano del

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Figura 13-1. Regulacin transcripcional de la diferenciacin linfocitaria. La diferenciacin de una clula troncal hematopoytica en una clula progenitora linfoide o en una clula progenitora mieloide es capaz de dar origen a todas las clulas sanguneas maduras. La activacin de los factores de transcripcin Ikaros y PU.1 es clave en la etapa de diferenciacin haca una CPL. La posterior maduracin de esta clula en un linfocito B o T depender de la accin concertada de otros factores transcripcionales, los cuales activarn o reprimirn la actividad de diversos genes involucrados en el programa de diferenciacin especfico de cada linaje celular. Algunos de ellos, tales como Ikaros, E2A (E47 y E12) y Notch participan en varias etapas de la maduracin de linfocitos B y T. Abreviaturas utilizadas: DN, doble negativo; DP, doble positivo; SP, simple positivo; PGM, progenitor granulocito/ macrfago; PME, progenitor megacariocito/eritrocito.

proceso de diferenciacin de las clulas T sin afectar el desarrollo de los linfocitos B o de algn otro linaje hematopoytico. La observacin ms interesante fue que las clulas del timo de estos ratones expresaban marcadores del linaje de clulas B y que fenotpicamente se asemejaban a clulas B inmaduras. Por otro lado, estudios complementarios mostraron que ratones irradiados trasplantados con clulas troncales de mdula sea, que expresan constitutivamente la forma activa de Notch-1 (dominio intracelular) dieron origen a una poblacin de clulas que expresaron marcadores del linaje de clulas T. Lo destacado de este experimento es que el desarrollo de los linfocitos T se llev a cabo en la mdula sea, independiente de la influencia del ambiente tmico y que la diferenciacin de las clulas B fue abortado en el temprano estado pre-pro-B. Sin embargo, la diferen-

ciacin del linaje de clulas mieloides no fue afectada. A nivel molecular, se ha mostrado que la va de transduccin de seales de Notch es capaz de interferir con la actividad de la protena E47 codificada por el gen E2A lo que explicara la represin del programa de diferenciacin de las clulas B. Tambin hay evidencias que muestran que Notch-1 participara en la determinacin del linaje de linfocitos T que expresan un TCR o un TCR, as como tambin en la diferenciacin hacia CD4+ versus CD8+. Todos estos resultados demuestran que Notch es esencial en la determinacin del destino de las clulas T. Ya que se ha encontrado que el ligando de Notch est presente tanto en la mdula sea como en el timo. La pregunta que an queda por responder es cmo se controla la va de transduccin de seales de Notch para que slo se active en el timo. La respuesta

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tendra que especular la participacin de factores adicionales especficos de estos ambientes celulares, que regulan la capacidad de las clulas progenitoras para responder a los ligandos de Notch. En base a todos los recientes antecedentes que hemos descrito se ha propuesto un modelo de diferenciacin de clulas linfoides basado en la actividad diferencial de diversos factores transcripcionales (figura 13-1). Segn este modelo, en la mdula sea las clulas progenitoras linfoides seran refractarias a la estimulacin del ligando de Notch-l debido a la ausencia de un estmulo adicional apropiado, lo que las conducira a travs de la diferenciacin de clulas B. En estados tempranos de esta maduracin la accin coordinada de los factores E2A y EBF activara la expresin del programa de diferenciacin gnica de las clulas B entre los cuales se encuentra Pax5. A su vez, la sobreexpresin de Pax-5 reprimira la expresin de los genes especficos de los otros linajes celulares. Por su parte, la clula progenitora linfoide que migra desde la mdula sea hacia el timo, encontrara en este microambiente las seales necesarias para activar la va de transduccin de seales de Notch. A su vez, Notch inhibira la funcin del factor de transcripcin codificado por el gen E2A bloqueando as el programa de diferenciacin de clulas B en el timo.

3. DIFERENCIACIN Y MADURACIN DE LINFOCITOS B El proceso de maduracin de los linfocitos B involucra dos etapas generales claves; una etapa antgeno-independiente, que ocurre en la mdula sea y una etapa antgeno-dependiente que ocurre, fundamentalmente, en los OLS, lugar en el cual los linfocitos B especficos para un determinado antgeno, toman contacto con ste. 3.1 Etapa antgeno-independiente En los mamferos, clulas troncales hematopoyticas pluripotentes provenientes del hgado fetal colonizan la mdula sea reclutadas por la accin de la quimioquina CXCL12 secretada por las clulas del estroma medular. Estas clulas troncales tienen la capacidad de renovarse permanentemente y de dar origen a la totalidad de las clulas sanguneas maduras (linfoides y

mieloides). Recientemente, se ha identificado una clula progenitora (linfoide) capaz de diferenciarse especficamente hacia el linaje de las clulas linfoides (clulas B, T y NK). Esta clula progenitora linfoide correspondera al estado ms temprano de diferenciacin linfocitaria, que se caracteriza por una alta actividad mittica. Estudios de mutacin gnica y el anlisis de inmunodeficiencias primarias (ver captulo 30), han evidenciado el requerimiento de interleuquina7 (IL-7) en esta etapa de alta proliferacin. Posteriormente, y debido a la activacin de un programa gentico especfico las clulas progenitoras linfoides son conducidas hacia la diferenciacin del linaje B. La clasificacin de los siguientes estados de diferenciacin de las clulas B est definido, principalmente, por el rearreglo de los genes de cadena liviana y pesada de las inmunoglobulinas y por la ausencia o presencia de marcadores de superficie celular. Las clulas en el estado pro-B no producen inmunoglobulinas y se distinguen por la expresin de los marcadores CD19, CD43 y B220. En el siguiente estado de diferenciacin, denominado pre-B, ocurre la recombinacin de los genes V-D-J de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas (ver captulo 6) y la sntesis y expresin citoplasmtica de la cadena pesada (H) . Sin embargo, estas clulas no expresan inmunoglobulinas en su membrana, ya que an no sintetizan la cadena liviana (L), y por lo tanto son incapaces de reconocer o responder a antgeno. Posteriormente, algunas de las cadenas H se asocian a una "cadena L de reemplazo", molcula estructuralmente similar a la cadena L normal pero que no posee la regin variable de sta. La combinacin de la cadena H con la cadena L de reemplazo constituyen el receptor de clulas pre-B (pre-BCR), el que regulara la sntesis ulterior de las cadenas L y la consiguiente maduracin de los linfocitos B. En la etapa siguiente de maduracin (linfocitos B inmaduros) ocurre la recombinacin de los genes VJ de las cadenas livianas y por tanto la sntesis de las cadenas livianas ( o ) las cuales se asocian con la cadena pesada++para generar una molcula de IgM en el citoplasma. Estos linfocitos B no pueden generar nuevas regiones variables (de cadenas L o H) en la mdula sea y se les considera funcionalmente inmaduros. De hecho, su encuentro con antgenos propios puede llevarlos a un estado anrgico (inactivacin funcional) o de muerte celular ms que a una activacin. Sin embargo, esta es una importante etapa de seleccin negativa

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de linfocitos B autorreactivos que eventualmente podran ocasionar enfermedades autoinmunes. Posteriormente, los linfocitos B son capaces de coexpresar molculas de IgM y de IgD en la membrana celular, las cuales pueden actuar como receptores especficos para antgeno. En esta etapa los linfocitos adquieren competencia funcional y son denominados clulas B maduras (figura 13-2). Adems de la regulacin gnica mediada por diversos factores de transcripcin y de IL-7, se conoce que protenas tirosina quinasa de la familia Src y ciertos procesos adhesivos entre los linfocitos B en desarrollo y los elementos del estroma de la mdula sea (ver captulo 12) actan como factores inductores de la diferenciacin de clulas B. Los linfocitos B virgen que expresan en su

das o semanas. La capacidad del sistema inmune de producir inmunoglobulinas de diferentes especificidades y combatir infecciones est determinada por la posterior diferenciacin de los linfocitos B virgen en los rganos linfoides secundarios, lugar donde se produce el cambio de clase de inmunoglobulinas y la maduracin de la afinidad. Estos cambios se producen con una fiel mantencin de la especificidad por antgeno. En este sentido es importante hacer notar dos caractersticas importantes del proceso de diferenciacin de los linfocitos B que aseguran la mantencin de la especificidad antignica: (a) la llamada "exclusin allica" fenmeno que permite que aunque cada individuo heterocigoto recibe dos alelos de los genes para inmunoglobulina (uno de cada padre)

Figura 13-2. Etapas en la maduracin de los linfocitos B.

membrana receptores especficos para un determinado antgeno, salen de la mdula sea y entran en la circulacin perifrica. Estudios in vitro han mostrado que a partir del estado de clulas B inmaduras los linfocitos experimentaran una disminucin en su respuesta a la quimioquina CXCL12 lo que les permitira escapar a la accin reclutadora de este factor y abandonar la mdula sea. En la periferia, los linfocitos B vrgenes migran a los rganos linfoides secundarios donde completarn su proceso de diferenciacin. Estas clulas B virgen expresan, simultneamente, IgM e IgD de la misma especificidad en su membrana y de no encontrar antgeno mueren en unos pocos

slo uno logra expresarse en cada linfocito y (b) la denominada "exclusin del isotipo de cadena liviana" que regula la expresin de las cadenas L de manera que cada linfocito B produce ya sea cadenas k o pero nunca las dos. 3.2 Etapa antgeno-dependiente En las etapas siguientes de la diferenciacin de los linfocitos B participan como elementos centrales el antgeno y los linfocito T de ayuda (Th). Ciertos antgenos, fundamentalmente antgenos no proteicos tales como los polisacridos y lpidos, no requieren de la ayuda de los LTR. Estos antgenos,

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son llamados Timo-independientes. Por otro lado, los linfocitos B que reconocen antgenos Timodependientes s requieren de la colaboracin de los linfocitos Th. Estos antgenos son encontrados por los linfocitos en los diferentes OLS: en el bazo para los antgenos introducidos por la va sangunea, en los ganglios para los antgenos colectados por la linfa, en las Placas de Peyer y tejido mucoso para antgenos ingeridos o inhalados y en la piel. Es as que la respuesta humoral a antgenos T-dependientes propiamente tal comienza en las zonas T de los OLS donde los linfocitos B antgeno-especfico toman contacto con los LTh capaces de reconocer el mismo antgeno. Los linfocitos B migran posteriormente a los folculos donde entran en contacto con elementos celulares del estroma llegando a formar los Centros Germinales (CG), zona de alta proliferacin celular. Los linfocitos B de los CG presentan una muy baja expresin de la protena anti-apopttica Bcl2, de manera que aquellos linfocitos B que no son rescatados por las Clulas Foliculares Dendrticas (CFD) a travs de antgeno y de otras interacciones adhesivas mueren, pasando a otro compartimento donde son destruidos por los macrfagos de cuerpos tangibles que se encuentran en gran nmero en la zona B de los OLS. Con el fin de revisar estas etapas del desarrollo del linfocito B un poco ms en detalle se considerar los eventos que ocurren en un ganglio linftico como ejemplo de los mecanismos que llevan a la diferenciacin final y a la proliferacin de los linfocitos B maduros (figura 13-3).

Los linfocitos B (al igual que los linfocitos T) entran al ganglio a travs del epitelio columnar que tapiza las vnulas post capilares de los OLS (ver captulo 12) donde entran en contacto breve con los linfocitos T de ayuda, migrando posteriormente a los folculos linfoides para formar all, luego de un proceso de diferenciacin y de una activa proliferacin, los CG. En el folculo, los linfocitos B entran en contacto con las CFD. Estas clulas estn especializadas en retener y presentar al linfocito B, antgeno sin procesar y en forma nativa (formando un complejo con el anticuerpo, conocido como icosoma). Esta interaccin involucra, adems del antgeno y el respectivo receptor (IgM/IgD) por parte del linfocito B, una serie de molculas de adhesin y sus respectivos ligandos. Estas interacciones tienen como resultado la produccin de citoquinas que inducen en el linfocito B nuevos procesos de diferenciacin con cambios en la clase de inmunoglobulina y activa proliferacin. Como resultado de estos cambios se generan los CG, los cuales poseen una estructura fina que contiene una zona oscura de centroblastos en activa proliferacin y una zona clara que contiene los llamados centrocitos, clulas no proliferantes. Esta zona clara contiene adems la ms alta densidad de CFD y una pequea proporcin de linfocitos T, probablemente antgeno-especficos. Es en estos CG donde se generan los linfocitos B de memoria y donde ocurren las hipermutaciones de las regiones V de las inmunoglubulinas. Estas mutaciones son consideradas necesarias para la llamada maduracin de

Figura 13-3. Etapas que marcan el desarrollo final de los linfocitos B en un ganglio linftico perifrico.

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la afinidad de los anticuerpos sricos las cuales pueden llevar a cambios de afinidad pero tambin a cambios de especificidad. Los procesos que regulan este fenmeno deben asegurar la seleccin de los mutantes de alta afinidad y la eliminacin de los mutantes de baja afinidad as como tambin de los linfocitos B autorreactivos que pudieran resultar del proceso de hipermutaciones. La maduracin de la respuesta inmune humoral favorece el aumento de la afinidad, ya que aquellos linfocitos cuya afinidad disminuye a causa de las mutaciones, debern competir por antgeno, presentado en la superficie de las CFD, con aquellos de ms alta afinidad. Las seales y mecanismos que median los procesos finales de migracin, de diferenciacin, de proliferacin y de mutacin de los linfocitos B dentro del CG son en gran parte desconocidos, aunque los indicios experimentales involucran claramente la participacin de molculas de adhesin y citoquinas. Por ejemplo, la administracin in vivo de anticuerpos capaces de bloquear la interaccin entre CD40 con su ligando CD40L o entre las molculas coestimulatorias CD28 (B7) con CTLA-4 bloquean las reacciones de los CG. Mucho queda por investigar en esta importante rea de la respuesta inmune humoral, especialmente en lo que respecta al posible papel de las citoquinas en las etapas finales de diferenciacin y proliferacin. Hasta ahora, tanto IL-2 como IL10 han sido involucradas en la ayuda proporcionada por los linfocitos T y en la "decisin" final de los linfocitos B de tomar el camino de un linfocito B de memoria o de una clula plasmtica productora de anticuerpos.

procesos deben generar un repertorio de linfocitos T maduros que cumpla dos requisitos fundamentales: primero que reconozca antgeno en funcin del propio MHC (restriccin MHC) y segundo que estos linfocitos T no reconozcan antgenos propios (tolerancia). 4.1. Migracin de los precursores de linfocitos T Se desconoce la naturaleza exacta de la clula precursora que da origen a los linfocitos T. En humanos, una putativa clula precursora de la lnea T ha sido identificada en base a la expresin de la molcula de superficie CD34. Esta molcula se expresa en las clulas troncales pluripotentes de la mdula sea que dan origen no slo a los linfocitos T sino que tambin a los linfocitos B, a las clulas dendrticas y a clulas endoteliales de la vasculatura. Estas clulas CD34+ de la mdula sea (o del hgado fetal) se transforman, al ser colocadas en un microambiente tmico en cultivo, en linfocitos T, desconocindose sin embargo los mecanismos que llevaran a los progenitores T de la mdula sea a migrar al timo in vivo. Se postula, sin embargo, que estos precursores expresaran en su superficie receptores de adhesin que se ligaran selectivamente al endotelio tmico permitiendo su entrada al interior del rgano. Uno de estos receptores podra ser la misma molcula CD34 ya que existen evidencias que esta molcula interactuara con la L-Selectina, una molcula de adhesin presente en los linfocitos. Una vez en el timo los precursores de los linfocitos T mantienen una alta capacidad proliferativa. Alrededor de 1 a 10 clulas precursoras pueden repoblar un timo al ser implantadas en ste y estudios in vitro han demostrado que una sola clula progenitora es capaz de generar alrededor de 105 linfocitos T maduros en un perodo de 10 a 15 das, con TCRs de una amplia gama de especificidades distintas. Por otro lado, estudios efectuados con timos irradiados han demostrado que a pesar de la alta capacidad de divisin de los precursores, stos, una vez en el timo pierden su capacidad de autorrenovacin, y deben ser constantemente reemplazados por nuevas clulas progenitoras a partir de la mdula sea. 4.2. Diferenciacin Los estudios de la ontogenia y diferenciacin de los linfocitos T se han realizado fundamentalmente usando como modelo el ratn. En este ani-

4. DIFERENCIACIN Y MADURACIN DE LINFOCITOS T Es generalmente aceptado que los linfocitos T se originan en la mdula sea a partir de un precursor capaz de migrar al timo, el principal rgano donde se lleva a cabo la diferenciacin de los linfocitos T. Este proceso de maduracin de los linfocitos T en el timo (denominados timocitos en oposicin a los linfocitos T maduros que se encuentran en circulacin), y la generacin del repertorio de receptores de LT puede dividirse en tres etapas ntimamente relacionadas: (a) la migracin de los progenitores de la mdula sea al timo, (b) la diferenciacin de estas clulas progenitoras y (c) un proceso de seleccin. Estos

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mal, los primeros precursores T se detectan en el timo en el da 11 de gestacin (correspondiente aproximadamente a la semana 7-8 en humanos) ubicndose en la zona cortical de ste. A medida que los timocitos migran hacia zonas ms internas de la corteza stos van avanzando en su proceso de diferenciacin. En estados finales de maduracin los linfocitos T pasan desde la corteza hacia la mdula y finalmente salen del timo a la periferia a travs de las vas linfticas o venas. El ambiente tmico representado por las interacciones fsicas que se establecen entre los timocitos y los diferentes tipos celulares que all se encuentran (clulas epiteliales, dendrticas y macrfagos) y los factores solubles que son liberados al medio externo son claves en los procesos de maduracin y seleccin. Una serie de trabajos sugieren que el patrn diferencial de expresin de ciertas quimioquinas y de sus receptores, en particular CXCL12, CCL17, CCL19, CCL21, CCL22 y CCL25, estara relacionado con la migracin de los timocitos a travs de los diferentes subcompartimentos tmicos. Entre las diferentes citoquinas que las clulas estromales tmicas secretan, se ha identificado a IL-7 como un modulador directo de la sobrevida, diferenciacin, transcripcin y rearreglo gnico del TCR. Adems, la diferenciacin de linfocitos T est sometida a un estricto control de expresin gnica mediada por factores transcripcionales tales como GATA-3, E12, E47, HEB, NF-kB, Ikaros y Notch. Dos marcadores de superficie presentes en las clulas T han sido de gran utilidad en proporcionar informacin sobre los procesos de diferenciacin de los linfocitos T, stos son las molculas CD4 y CD8. En base a la expresin de estos dos marcadores, la poblacin de linfocitos T en un individuo adulto puede ser dividida en cuatro grupos: los linfocitos T dobles negativos (CD4CD8-), los dobles positivos (CD4+ CD8+) que representan poblaciones ms o menos inmaduras de linfocitos T y los simples positivos (CD4+ CD8y CD4- CD8+) que corresponden a las poblaciones ms maduras de linfocitos T. En los estudios de los procesos y mecanismos que conducen a la formacin de la poblacin de linfocitos T maduros, los principales esfuerzos han estado dirigidos a definir los mecanismos que llevan a la generacin, a partir de un precursor nico, de las dos principales subpoblaciones de linfocitos T maduros, los linfocitos Th que presentan el fenotipo CD4+ CD8- y los linfocitos T citotxicos (Tc) cuyo fenotipo es CD4- CD8+, y a explicar la elimina-

cin durante el proceso de diferenciacin, de aquellos clones de linfocitos T autorreactivos capaces de reconocer antgenos propios. Las primeras clulas del linaje T que aparecen en el timo se detectan en la corteza tmica externa y no expresan los marcadores CD4, CD8, TCR ni CD3, un marcador comn de clulas T. Este estado de maduracin es conocido como proT y los timocitos son denominados dobles negativos. Estas clulas, que representan aproximadamente el 5% de los timocitos expresan CD44 (una glicoprotena adhesiva de membrana), Thy-1 (en el ratn) y HSA (antgeno estable al calor). En este momento de la diferenciacin (da 13 a 14 de gestacin), los genes del TCR se encuentran an en la configuracin germinal. En el siguiente estado de maduracin conocido como pre-T, se inicia la recombinacin y expresin de los genes de la cadena del TCR (da 15 de gestacin) la cual se asocia con una protena invariante llamada pT y con las protenas del complejo CD3 (,+,++,+) para dar origen al receptor de clulas pre-T o pre-TCR. Este complejo proteico es capaz de transducir seales a travs de la va de protenas tirosina quinasa Src y su actividad es esencial para la continuacin hacia los posteriores estados de maduracin. Aproximadamente, el 80% de estas clulas dobles negativas pasan por una etapa en la cual expresan transitoriamente la molcula CD8 (y el HSA) para dar origen, posteriormente, a un precursor CD4+ CD8+ doble positivo (ver figura 13-3). Estas clulas dobles positivas se encuentran en una etapa activa de rearreglo de los genes que codifican para la cadena del receptor de las clulas T sin que logre detectarse expresin del TCR en el citoplasma o en la membrana (da 17 de gestacin). Los primeros rearreglos gnicos y la aparicin del TCR completo ocurren en forma coordinada con la expresin de los otros marcadores del linaje T, esto es CD4, CD8 y CD3 (ver ms adelante). En este estado de clulas dobles positivas el TCR es completamente funcional y puede responder a antgeno lo que permite que los linfocitos sean sometidos a los eventos de seleccin positiva y negativa. El 20% restante de las clulas dobles negativas probablemente nunca expresan CD4 o CD8 pero s expresan un TCR con las cadenas . Estas clulas son los primeros linfocitos T que maduran en el timo y representan clulas que se diferenciaran por una va independiente de los linfocitos T . Aunque las clulas expresan un TCR funcional 2 das antes que las clulas la expresin

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de las cadenas rpidamente sobrepasa la expresin de de manera que al momento del nacimiento los ratones tienen un repertorio de linfocitos T con un 90% de clulas cuyo TCR es fundamentalmente del tipo . Posteriormente, los timocitos migran hacia la regin tmica medular donde se diferenciarn en dos poblaciones distintas de clulas simples positivas; los LTh con fenotipo CD4+ CD8- (restringidos por MHC clase II) y los LTc con un fenotipo CD4- CD8+ (restringidos por MHC clase I). Estos dos tipos celulares expresan en su membrana altos niveles de TCR y son clulas totalmente competentes capaces de migrar fuera del timo. El curso temporal del proceso de maduracin de los linfocitos T se muestra en la figura 13-3. 4.3. Seleccin tmica En el timo ocurren dos importantes eventos de seleccin que son centrales en la generacin del repertorio de linfocitos T maduros circulantes. Uno de estos procesos permite la generacin de autotolerancia eliminando o silenciando aquellos linfocitos T que poseen una alta afinidad por antgenos propios (Seleccin Negativa). El otro proceso de seleccin deriva en la generacin de linfocitos T maduros con un TCR capaz de reconocer el MHC (Complejo Principal de Histocompatibilidad) propio asegurando que la respuesta inmune sea restrin-

gida por MHC (Seleccin Positiva). Estos eventos de seleccin, que llevan a la produccin de linfocitos T "efectivos" ocurren en el timo luego de la expresin del TCR, CD4 y CD8 y antes que estas clulas salgan a la periferia (figura 13-3). a) Seleccin Positiva. En este proceso el microambiente tmico, elemento central en la llamada educacin tmica, interacciona con los timocitos en desarrollo de manera de permitir la sobrevida slo de aquellas clulas que expongan en su superficie un TCR capaz de interaccionar con un pptido presentado por su propio MHC (figura 13-4). De esta manera aquellos linfocitos T que no presenten afinidad por su propio MHC mueren en el timo. En esta etapa de seleccin todos aquellos linfocitos T que por azar en el reordenamiento de sus genes del TCR generaron un receptor que no est restringido por el MHC propio son eliminados, ya que, posteriormente, ellos sern incapaces de interactuar con las clulas presentadoras de antgeno (CPA) y reconocer antgeno. Dado que los linfocitos T no sufren el proceso de hipermutacin somtica que les permita cambiar la afinidad o especificidad antignica de su receptor, como ocurre con los linfocitos B, el proceso de seleccin positiva permite asegurar la mantencin de una poblacin de linfocitos T cuyos TCR pueden actuar en forma efectiva durante la respuesta inmune.

Figura 13-4. Seleccin positiva y negativa. Etapas en la diferenciacin de los linfocitos T en el timo

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Utilizando como modelo ratones transgnicos para un TCR que reconoce a antgeno en el contexto de determinados MHC de clase I y de clase II, se determin la presencia de linfocitos T en la periferia solamente si el ratn expresaba el MHC homlogo con aquel reconocido por el TCR transgnico. Estos experimentos, conjuntamente con otros de la misma ndole, lograron clarificar el papel central del haplotipo de las clulas de la corteza tmica en la seleccin positiva de los linfocitos T. Estos experimentos lograron demostrar tambin que la mayora de los timocitos producidos en el timo no son capaces de reconocer antgeno en el contexto del MHC apropiado, no logran su estado final de maduracin, y son eliminados por apoptosis. Pero no slo el haplotipo MHC de las clulas de la corteza tmica juega un papel importante en la seleccin positiva, el pptido contenido en el bolsillo del MHC tambin participa como elemento de seleccin. Experimentos de mutacin de la molcula de MHC que alteran la unin del pptido al bolsillo reducen en forma significativa la seleccin positiva. Los resultados de stos y otros experimentos indican que existen ciertas combinaciones de pptido-MHC particularmente efectivas en la seleccin positiva, probablemente debido a un reconocimiento directo del pptido por el TCR. La evidencia experimental parece indicar entonces que la gran mayora de los timocitos CD4+ CD8+ sufren un proceso de muerte programada en el timo y que la seleccin positiva los rescatara de la apoptosis. Este rescate estara mediado por seales generadas por el TCR al enganchar al MHC del haplotipo correcto y que contiene a su vez un complemento de pptidos adecuados. Resultados experimentales demuestran adems que la generacin, a partir de los timocitos CD4+ CD8+ (dobles positivos), de los linfocitos T simples positivos, (CD4+CD8- o CD4-CD8+), sera un proceso al azar a travs del cual un timocito perdera en forma estocstica la expresin de uno u otro co-receptor (CD4 o CD8) sin la influencia de la especificidad del TCR. En otras palabras, si por azar un timocito termina con una combinacin apropiada de CD4 y TCR restringido por el MHC clase II entonces ese timocito ser estimulado y rescatado de la apoptosis mediante la seleccin positiva. Igualmente un timocito que por azar termin con la molcula CD8 en su superficie, ser rescatado si tiene la combinacin apropiada de TCR restringido por MHC de clase I.

b) Seleccin Negativa. El proceso de Seleccin Positiva recientemente descrito, genera una poblacin de linfocitos T cuya nica restriccin es la de reconocer antgeno en funcin de su propio MHC. Es concebible entonces que dentro de esta poblacin existan clones de linfocitos T capaces de reconocer antgeno propios generados y presentados en el estroma tmico. Esto resultara en un importante nmero de linfocitos T capaces de generar autoinmunidad. Sin embargo, esto no es la situacin normal sino ms bien la excepcin. Actualmente se sabe que la autotolerancia, es decir la incapacidad del sistema inmune de reaccionar contra antgenos propios se debe principalmente (aunque no nicamente) a la eliminacin o silenciamiento, durante la diferenciacin de las clulas T en el timo, de los clones autorreactivos. Este proceso de delecin fsica o de eliminacin funcional (anergia) de clones autorreactivos en el timo se conoce como Seleccin Negativa. Este proceso funciona de tal forma que solamente aquellos linfocitos T que posean un TCR capaz de reconocer un pptido extrao presentado por un MHC propio sern finalmente seleccionados para salir a la periferia como linfocito T maduro. La eliminacin de los clones T autorreactivos ocurre en la etapa en la cual los timocitos CD4+CD8+TCR+ se unen a un pptido propio presentado por molculas MHC propios de las clulas dendrticas presentes en el timo. La eliminacin de los timocitos autorreactivos ocurre aparentemente por mecanismos de muerte celular programada causada, en este caso, por la activacin de los timocitos provocada por los autoantgenos. La evidencia experimental indica que las seales intracelulares que se generan a travs del TCR en un linfocito inmaduro en el timo seran diferentes de las generadas en un linfocito T maduro, de manera tal que en un caso causan apoptosis mientras que en el otro causaran activacin y generacin de una respuesta inmune.

LECTURAS SUGERIDAS Akashi, K.; Reya, T.; Dalma-Weiszhausz, D. and Weissman, I.L., Lymphoid precursors, Curr. Opin. Immunol. 12: 144-150, 2000. Ansel, K.M. and Cyster, J.G., Chemokines in lymphopoiesis and lymphoid organ development, Curr. Opin. Immunol. 13: 172-179, 2001.

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Busslinger, M.; Nutt, S.L. and Rolink, A.G., Lineage commitment in lymphopoiesis, Curr. Opin. Immunol. 12: 151-158, 2000. Deftos, M., and Bevan, M., Notch signaling in T cell development, Curr. Opin. Immunol. 12: 166172, 2000. Kee, B.L. and Murre, C., Transcriptional factor regulation of B lineage commitment, Curr. Opin. Immunol. 13: 180-185, 2001. Osborne, B., Transcriptional control of T cell development, Curr. Opin. Immunol. 12: 301-306, 2000.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 14
REGULACIN DE LA RESPUESTA INMUNE
Ulises Vergara C., Claudio Ziga M. e Ivn Palomo G.

1. Introduccin 2. Regulacin de la respuesta inespecfica 3. Regulacin de la respuesta inmune especfica 3.1. Mecanismos inmunolgicos y no inmunolgicos de regulacin 3.2. Delecin y anergia clonal. Tolerancia inmunolgica 3.3. Activacin de linfocitos T supresores 3.4. Regulacin mediante linfocitos Th1 y Th2 3.5. Regulacin idiotpica o red idiotipo-anti-idiotipo 3.6. Regulacin "feedback" por anticuerpos y complejos inmunes 3.7. Regulacin por Prostaglandinas 3.7.1. Prostaglandina E2 (PGE2). 3.7.2. Prostaglandina 15-d PGJ2

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RESUMEN El repertorio linfocitario disponible para la activacin por distintos antgenos, la autotolerancia y el desarrollo de una respuesta inmune especfica, estn controlados por diversos mecanismos de regulacin tanto inmunolgicos como no inmunolgicos. Los mecanismos no inmunolgicos de regulacin implican relaciones recprocas entre el eje hipotlamo-hipfisisadrenal (HHA) y citoquinas inflamatorias como IL-1, IL-6 y TNF. Citoquinas, hormonas como ACTH, prolactina, progesterona y hormonas tiroideas, neurotransmisores como acetilcolina, catecolaminas y endorfinas y mediadores biolgicos como histamina, serotonina y bradiquinina, parecen integrados en un poderoso circuito inmunorregulador o red inmuno-neuro-endocrina. Los mecanismos inmunolgicos de regulacin del sistema inmune implican la disponibilidad del antgeno mismo, la interaccin entre distintas clulas inmunocompetentes, la activacin de diversas subpoblaciones linfocitarias con liberacin de una combinacin particular de mediadores solubles como citoquinas, leucotrienos y prostaglandinas, la regulacin idiotpica (red idiotipo-anti-idiotipo) y la regulacin o "feedback" por anticuerpos y complejos inmunes. Estos mecanismos inmunolgicos de regulacin del sistema inmune pueden operar tanto a nivel central como perifrico y pueden controlar la recirculacin y "homing" de las distintas subpoblaciones linfocitarias, el procesamiento y la presentacin de antgenos y la activacin, proliferacin y diferenciacin de las distintas clulas inmunocompetentes.

1. INTRODUCCIN La respuesta inmune es esencialmente destructiva y orientada a la neutralizacin y eliminacin, tanto de agentes infecciosos y de clulas y molculas extraas, como detritus y productos moleculares de clulas propias y de clulas envejecidas, transformadas o tumorales. Esto implica, necesariamente, la existencia de un sofisticado mecanismo de regulacin que permita responder, agresivamente, contra lo extrao, al tiempo que se acepta, tolera o no se reacciona contra las clulas propias, que estn envejecidas, alteradas o transformadas y expresen marcadores ACAMP (Apoptosis Cell Associated Molecular Pattern). En el presente captulo se describen distintos mecanismos de regulacin tanto de la respuesta inmune inespecfica como de la respuesta especfica.

2. REGULACIN DE LA RESPUESTA INESPECFICA Adems de las barreras fsicas a la infeccin, los individuos estn provistos de mecanismos

inespecficos de proteccin como el sistema del complemento y la actividad fagoctica y destructiva de neutrfilos y macrfagos. La estrategia de la respuesta inmune inespecfica, a diferencia de la respuesta adquirida, no es reconocer un gran nmero de eptopos sino ms bien unas pocas molculas PAMP ("Pathogen-Associated Molecular Patterns"), altamente conservadas y compartidas por un gran nmero de microorganismos. Estos patrones moleculares son reconocidos por receptores PRR ("PatternRecognition Receptor") expresados en distintas clulas del Sistema Innato. Los ejemplos ms conocidos de PAMPs son lipopolisacridos (LPS), pptidoglicanos, cido lipoteicoico, mananos, DNA bacteriano y RNA de doble hebra. La mayora de estas molculas son expresadas slo por microorganismos, lo que implica una muy baja probabilidad de respuesta autoinmune por reaccin cruzada con patrones moleculares de los agentes infecciosos. El reconocimiento de molculas PAMPs por receptores PRR en las clulas del hospedero, inducirn cambios que sern muy importantes en el desarrollo tanto de la respuesta innata como de la respuesta adquirida. As, macrfagos activados iniciarn la sntesis de las

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llamadas citoquinas de alarma (IL-1, IL-6, IL12, TNF), la produccin de interferones (IFN) - y -, con la consiguiente inhibicin de la replicacin viral y la activacin de clulas NK. La activacin de hepatocitos por IL-6 inducir la sntesis de protenas de fase aguda PCR y MBP (Protena C Reactiva y Mannose Binding Protein, respectivamente), con el consiguiente reclutamiento y activacin del sistema del complemento por la ruta de las lectinas Adems las diversas citoquinas van a regular o determinar la calidad de la respuesta inmune especfica induciendo la expresin de molculas de presentacin antignica, de seales accesorias de coestimulacin CD28, CD80, CD86, CD40, CD40L) y la polarizacin hacia una respuesta inmune de tipo Th1 o Th2. La sntesis de IL-12 resulta fundamental en la desviacin hacia una respuesta Th1 y es regulada por un mecanismo de "feedback" positivo, mediado por IFN o por un mecanismo de "feedback" negativo mediado por de IL-10. Por otro lado, se ha descrito que la unin del receptor CR3 del sistema del complemento, con anticuerpos o partculas unidas a iC3b, inhiben la sntesis de IL-12 en monocitos/macrfagos humanos y de ratn. Lo anterior, sumado al hecho que CR2 participa en la activacin de linfocitos B, implica que el sistema del complemento no slo es un mecanismo efector sino que puede tambin actuar como elemento regulador positivo de la respuesta humoral y regulador negativo de la respuesta celular. Una vez activados, los mecanismos efectores inespecficos pueden actuar agresivamente, no slo sobre el agente infeccioso invasor, sino tambin sobre clulas propias y deben, por lo tanto, ponerse en marcha mecanismos de regulacin que eviten el dao tisular. 2.1. Regulacin del sistema del complemento. La activacin del sistema del complemento es regulada a travs de una rpida degradacin o inactivacin de algunos de sus componentes mediante protenas reguladoras unidas a membrana o solubles en el plasma. (Ver captulo 18): Inhibidor de C1 (C1 Inh). Factor de aceleracin del decaimiento (DAF o CD55) de las convertasas de C3 y C5. Asociacin del factor I y diversos cofactores (factor H, C4bp, MCP o CD46 y CDR1 o CD35) para la disociacin o degradacin de C4b y/o C3b.

Carboxipeptidasa N que acta como inhibidor de las anafilotoxinas C3a, C4a y C5a. Inhibidores del complejo de ataque a la membrana ("Membrane Attack Complex") como la protena S o vitronectina, SP40, el factor de restriccin homlogo (HRF) y CD59 o MIRL ("Membrane Inhibitor of Reactive Lysis").

2.2. Regulacin de la accin de clulas NK En un individuo inmunocompetente normal, una alta y prolongada respuesta NK puede conducir a una respuesta autoinmune puesto que las clulas NK son capaces de lisar clulas autlogas normales (precursores de linfocitos B, timocitos y clulas de la mdula sea) o suprimir la proliferacin de clulas troncales eritroides. Ratones atmicos y ratones con inmunodeficiencia severa combinada (SCID), aun cuando son incapaces de generar una respuesta T especfica al virus de la coriomeningitis linfoctica (LMCV), presentan una respuesta NK ms elevada y ms prolongada (14 das) que los ratones normales, en los cuales la activacin NK no se prolonga ms all de los 3 a 4 das. Se ha sugerido que la actividad citotxica de las clulas NK sera negativamente regulada por interleuquina-4 (IL-4) y factor de crecimiento beta (TGF- "Transforming growth factor beta"), sintetizado por linfocitos T CD8+ y T CD4+ del tipo Th2 (ver punto 3.4 y captulo 11).

3. REGULACIN DE LA RESPUESTA INMUNE ESPECFICA El desarrollo de una respuesta inmune celular y/o humoral requiere el reconocimiento antignico por el receptor de linfocitos T (TCR) o linfocitos B (BCR), respectivamente. Por otro lado, la mantencin de la respuesta inmune en el tiempo requiere la presencia continua del antgeno, pero su sola administracin y la existencia de clones linfocitarios especficos no aseguran el desarrollo de una respuesta inmune dado que la naturaleza, forma fisicoqumica, dosis y va de administracin del antgeno son factores importantes para estimular o inhibir la activacin de linfocitos T y/o B especficos. As, polisacridos bacterianos inducen una respuesta IgM mientras los antgenos proteicos inducen tanto una respuesta inmune humoral, como una respuesta celular. Por otra parte, antgenos administrados por va sub-

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cutnea, intramuscular o intradrmica inducen respuesta inmune, mientras los antgenos administrados por va oral o va intravenosa inducen tolerancia, fundamentalmente mediante supresin y anergia de clones linfocitarios. Dosis bajas del antgeno inducen supresin mientras las dosis altas favorecen la anergia. Ratones inoculados primaria y secundariamente con extracto de mdula espinal en coadyuvante completo de Freund, desarrollan Encefalitis Alrgica Experimental (EAE), lo que no ocurre en ratones inoculados con el extracto medular luego de una administracin primaria por va oral, de protena bsica de mielina (MBP). Los ratones que desarrollan encefalitis ponen en marcha una respuesta celular T CD4 especfica para MBP, caracterizada por la secrecin de IFN-, mientras los ratones que no manifiestan la enfermedad desarrollan una respuesta T CD8 caracterizada por la produccin de TGF- e IL-4. Las citoquinas estn involucradas en la regulacin cualitativa y cuantitativa de la respuesta inmune dado que participan en el control de una serie de eventos asociados a la activacin, proliferacin y diferenciacin de linfocitos, con la consiguiente adquisicin de diversas funciones efectoras o la apoptosis de las distintas subpoblaciones linfocitarias (ver captulo 11). Estos mediadores son liberados por, virtualmente, todas las clulas involucradas en la respuesta inmune como linfocitos T, linfocitos B, clulas NK, macrfagos, granulocitos y clulas dendrticas, as como clulas derivadas del endoderma (clulas del epitelio tmico), ectoderma (queratinocitos) o mesnquima (clulas endoteliales). Las interacciones mutuas entre las diversas citoquinas y la modulacin de sus receptores determinan la intensidad de la respuesta inflamatoria y el curso de la respuesta inmune especfica al determinar si la exposicin a un antgeno determinado conducir a tolerancia o al desarrollo de una respuesta inmune celular y/o humoral. Tanto inmunidad como tolerancia son fenmenos especficos que pueden tener consecuencias catastrficas para el individuo si no operan mecanismos que permitan regular el desarrollo de la respuesta inmune. As, con no poca frecuencia, las consecuencias patolgicas de una enfermedad infecciosa no son resultado directo de la accin del agente infeccioso, sino de una respuesta inmune normal o muchas veces aberrante contra el patgeno. Un antgeno extrao induce generalmente una respuesta que conduce a la diferenciacin de c-

lulas efectoras derivadas de linfocitos B o linfocitos T y la sntesis de anticuerpos y/o citoquinas, con la consiguiente eliminacin del antgeno y generacin de memoria inmunolgica. Un antgeno propio, en cambio, puede inducir un fenmeno denominado "ignorancia" o estimular una respuesta negativa que conduce a la eliminacin (deleccin), supresin o inactivacin (anergia) de clones autorreactivos especficos. El reconocimiento antignico y seales accesorias de coestimulacin y citoquinas desempean un rol fundamental, tanto en la deleccin o anergia de los clones linfocitarios autorreactivos, como en la expansin clonal y la diferenciacin que conducen al desarrollo de una respuesta inmune efectora y a la eliminacin del antgeno, al tiempo que se generan clulas de memoria para responder a un nuevo encuentro con el antgeno. La eliminacin del antgeno se convierte entonces en un importante mecanismo accesorio para regular el curso de la respuesta inmune, puesto que las clulas efectoras y los productos de la activacin linfocitaria (anticuerpos, citoquinas), son por lo general de corta vida media. 3.1. Mecanismos inmunolgicos y no inmunolgicos de regulacin En general, la regulacin del sistema inmune incluye tanto mecanismos inmunolgicos como no inmunolgicos. Los mecanismos no inmunolgicos implican relaciones recprocas entre el eje hipotlamohipfis-adrenal (HHA) y citoquinas inflamatorias como IL-1, IL-6 y TNF (ver captulo 15). Citoquinas, hormonas (ACTH, prolactina, progesterona, hormonas tiroideas), neurotransmisores (acetilcolina, catecolaminas, endorfinas) y mediadores biolgicos como histamina, serotonina y bradiquinina parecen integrados en un poderoso circuito inmunorregulador denominado red inmuno-neuro-endocrina. La activacin del eje hipotlamo-hipfisisadrenal, por las citoquinas inflamatorias IL-1, IL6 y TNF, resulta en la produccin de hormona liberadora de corticotrofina (CRF) por neuronas paraventriculares del hipotlamo y la secrecin de hormona corticotrfica (ACTH) por la hipfisis. ACTH acta sobre el sistema nervioso simptico, con la secrecin de epinefrina y norepinefrina, y sobre la corteza suprarrenal estimulando la sntesis y secrecin de glucorticoides que tienen efecto antiinflamatorio, inhibiendo la sntesis de

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citoquinas, al tiempo que aumentan la expresin de receptores para estas citoquinas. Los glucorticoides tienen un efecto inmunosupresor sobre linfocitos B, linfocitos T y clulas NK (disminuyendo la produccin de anticuerpos, la sntesis y secrecin de citoquinas y la actividad citotxica de linfocitos T y clulas NK). Los mecanismos inmunolgicos de regulacin de la respuesta inmune pueden operar a nivel central en los rganos linfoides primarios (mdula sea y timo) o a nivel perifrico en los rganos linfoides secundarios o en los distintos rganos y tejidos. Durante el reordenamiento gnico y la diferenciacin celular que conducen a la generacin de linfocitos B (en la mdula sea) o de linfocitos T (en el timo) se producen tanto linfocitos capaces de reconocer antgenos extraos como linfocitos contra lo propio. Deben, por lo tanto, ponerse en marcha mecanismos de regulacin que permitan la expansin de los linfocitos contra lo extrao y la eliminacin (deleccin) o la inactivacin (anergia) de los clones linfocitarios autorreactivos. A nivel perifrico el desarrollo de una respuesta inmune efectiva requiere el reconocimiento de antgenos por el receptor linfocitario, seales accesorias de coestimulacin (principalmente las interacciones CD80/CD86/CD28 y CD40/ CD40L) y el efecto regulador de diversas citoquinas a travs de receptores especficos. Una respuesta inmune efectiva requiere entonces la interaccin entre distintas clulas inmunocompetentes y los mecanismos de regulacin de esta respuesta pueden operar tanto a nivel de la recirculacin y "homing" de las distintas clulas, como a nivel del procesamiento y presentacin de antgenos y la activacin, proliferacin o diferenciacin de los clones linfocitarios especficos. A nivel de la recirculacin y "homing" de las distintas subpoblaciones celulares, los mecanismos de regulacin operan a travs de la expresin de receptores especficos en el endotelio vascular de los ganglios linfticos o en distintos tejidos no linfoides y la expresin de ligandos especficos expresados en las distintas subpoblaciones celulares inmunocompetentes. Un ejemplo clsico, es la molcula PSLG-1, receptor de P-Selectina (CD62P), expresada slo en linfocitos Th1 lo que permite a estas clulas migrar preferencialmente a ciertos tejidos (por ejemplo a piel inflamada). En general, los mecanismos de regulacin de la respuesta inmune a nivel perifrico implican la interaccin entre distintas subpoblaciones celulares

(linfocitos B, linfocitos T y clulas NK; macrfagos y clulas dendrticas para la presentacin antignica y clulas accesorias como neutrfilos, eosinfilos, basfilos y mastocitos), la secrecin de mediadores solubles (citoquinas, leucotrienos y prostaglandinas), la activacin de linfocitos T supresores, la regulacin idiotpica (red idiotipo-antiidiotipo) y el "feedback" por anticuerpos. 3.2. Delecin y anergia clonal. Tolerancia inmunolgica Durante la diferenciacin de linfocitos T en el timo, se ponen en marcha una serie de eventos que aseguran la exclusin allica del receptor T y la seleccin de linfocitos T capaces de reconocer fragmentos peptdicos en asociacin con molculas MHC de clase I o de clase II en la superficie de clulas del epitelio tmico o de clulas dendrticas (seleccin positiva) al tiempo que se eliminan (deleccin) o inactivan (anergia) aquellos linfocitos autorreactivos que reconocen con alta avidez y afinidad los antgenos propios (seleccin negativa) (ver captulo 13). La afinidad del receptor TCR, del correceptor CD4 o CD8, de las molculas MHC y de otras molculas de adhesin, as como la concentracin del pptido, parecen fundamentales para determinar la avidez de la interaccin entre el linfocito T y la clula presentadora del antgeno. Experimentos utilizando ratones transgnicos han permitido demostrar que existe una correlacin entre la especificidad del receptor TCR por molculas de MHC de clase I o de clase II y el desarrollo o maduracin de linfocitos CD8 o CD4, respectivamente. Adems ratones mutantes deficientes en la expresin de molculas MHC de clase I debido al "knock out" del gen de la 2 microglobulina o del gen TAP, no contienen clulas CD8, mientras ratones deficientes en molculas de clase II contienen muy pocos linfocitos CD4. As y de acuerdo con el modelo instructivo de diferenciacin, la unin coordinada de la molcula MHC de clase I con el receptor TCR y con el correceptor CD8, inhibe la expresin de CD4 en los linfocitos T doble positivos (CD4+ y CD8+) originando linfocitos citotxicos T CD8+, mientras la unin coordinada de la molcula de clase II con TCR y el correceptor CD4 inhibe la expresin de CD8 para dar origen a linfocitos Th CD4. En contraposicin a este modelo instructivo se ha planteado un modelo estocstico de diferenciacin que postula que la inhibicin en la expresin de CD4 o CD8 es al

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azar e independiente de la especificidad de TCR por la molcula MHC de clase I o de clase II, de manera que slo aquellos linfocitos doble positivos en los que TCR y el correceptor reconocen la misma molcula MHC podrn diferenciarse en linfocitos T CD4 o linfocitos T CD8. Eventos de seleccin positiva y negativa ocurren tambin durante la diferenciacin de linfocitos B en la mdula sea para la expansin de los clones linfocitarios B maduros (que expresan IgM e IgD) capaces de reconocer antgenos extraos al tiempo que se eliminan aquellos clones inmaduros (slo expresan IgM) que unen con avidez antgenos propios multimricos o multivalentes de superficie o se inactivan aqullos que unen antgenos solubles oligovalentes (ver captulo 13). Aun cuando linfocitos T y linfocitos B utilizan distintos genes para generar el receptor antignico y presentan requerimientos estructurales y funcionales distintos para reconocer el antgeno, los mecanismos generales de diferenciacin en el rgano linfoide primario son similares y en ambos casos se produce deleccin o anergia de los clones linfocitarios autorreactivos. Los individuos resultan as, especfica y naturalmente tolerantes a sus propios antgenos. Ahora bien, la tolerancia producida por la deleccin o anergia clonal, puede ocurrir tanto a nivel central como a nivel perifrico (dependiendo de si el autoantgeno se expresa en los rganos linfoides primarios o en la periferia) y es el resultado del reconocimiento antignico en condiciones tales que la unin al receptor linfocitario no conduce a la activacin celular sino ms bien a su eliminacin o inactivacin debido a la ausencia de las seales adecuadas de coestimulacin o a la puesta en marcha de un programa de muerte celular o apoptosis. Durante el desarrollo de una respuesta humoral y luego del "switching" isotpico (o cambio isotpico de la cadena pesada de la inmunoglobulina) e hipermutacin somtica del receptor BCR en el centro germinal, slo aquellos linfocitos B que han desarrollado un receptor con alta afinidad por el antgeno sern positivamente seleccionados para continuar su diferenciacin en clulas plasmticas o en clulas memoria, mientras el resto muere por apoptosis. Por ltimo es importante sealar que la tolerancia no slo puede ser inducida contra lo propio por deleccin o anergia de clones linfocitarios autorreactivos, sino tambin contra lo extrao mediante diversos mecanismos de supresin de la

respuesta inmune celular y/o humoral. As, las clulas presentadoras de antgeno, y linfocitos T y linfocitos B especficos, pueden ser destruidos por citotoxicidad directa mediada por linfocitos T citotxicos o clulas NK, por citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC) o funcionalmente inactivados por accin de mediadores solubles como prostaglandinas y diversas citoquinas. Adems es posible encontrar, tanto a nivel perifrico como a nivel central, linfocitos con una muy baja densidad de su receptor o una escasa afinidad del mismo, de manera tal que cuando se encuentran con el antgeno, simplemente no se activan o lo ignoran completamente (ignorancia antignica). 3.3. Activacin de linfocitos T supresores Durante el desarrollo de una respuesta inmune pueden muchas veces activarse distintas subpoblaciones de linfocitos T reguladores que inhiben linfocitos T o linfocitos B especficos para el antgeno, y actan por lo tanto como linfocitos T supresores. La forma como se activan estos linfocitos T supresores y los mecanismos utilizados para inhibir el desarrollo de una respuesta inmune celular y/o humoral no estn an definidos y son todava materia de controversia, pero s est claro que la mayora de estas clulas T supresoras son linfocitos T CD8+ y slo una pequea fraccin corresponden a linfocitos T CD4+. Los linfocitos T supresores pueden inhibir el desarrollo de una respuesta inmune mediante 3 mecanismos distintos. El primero implica citolisis por contacto directo con liberacin de perforina y granzimas A y B, que activan la cascada de las caspasas y conducen a la apoptosis de la clula blanco (linfocitos T, linfocitos B especficos o cualquier clula que presente antgenos a estos linfocitos). El segundo se basa en la expresin aumentada de FasL (CD95L), que inicia la muerte programada por agregacin de Fas (CD95) y activacin de va de las caspasas en la clula blanco. Finalmente, el tercer mecanismo implica la secrecin de citoquinas citotxicas como TNF y linfotoxina TNF. Los linfocitos T supresores (CD4 o CD8), pueden secretar adems citoquinas que inhiben la respuesta inmune, como ocurre con TGF- (que inhibe la activacin y proliferacin de clulas NK y linfocitos T y) , con IFN (que inhibe linfocitos Th2 y el "switching" isotpico hacia IgE en linfocitos estimulados por IL-4) y con IL-4 e IL-10 (que inhiben linfocitos Th1 y la activacin de macrfagos).

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3.4. Regulacin mediante linfocitos Th1 y Th2 Los linfocitos T "helper" (Th) cumplen un rol fundamental en el desarrollo y la regulacin, tanto de la respuesta inmune celular, como de la respuesta humoral. Luego del reconocimiento antignico y la estimulacin por IFN o por IL-4, los linfocitos T CD4+ pueden diferenciarse en linfocitos Th1 o linfocitos Th2, respectivamente. Los linfocitos Th1 secretan predominantemente IL-2, IFN y linfotoxina (TNF-) que activan macrfagos y son los principales efectores de la inmunidad celular contra patgenos intracelulares y de las reacciones de hipersensibilidad retardada. Los linfocitos Th2 en cambio, secretan principalmente IL-4, IL5, IL-6, IL-9, IL-10 e IL-13 (tabla 14-1) y son los inductores de los altos niveles de IgG e IgE, de la eosinofilia, de la citotoxicidad mediada por eosinfilos y de la activacin de mastocitos.

Tabla 14-1. Citoquinas producidas por distintas subpoblaciones de linfocitos T. CITOQUINA IFN IL-2 TNF TNF GM-CSF IL-3 IL-4 IL-5 IL-6 IL-10 IL-13 Th1 ++ ++ ++ ++ ++ ++ Th2 + + ++ ++ ++ ++ ++ ++ T CD8 ++ +/+ ++ ++ + -

La induccin de una respuesta Th1 y la produccin de IL-2 e IFN inhibir el desarrollo de una respuesta Th2, mientras la activacin de linfocitos Th2 y la secrecin de IL-4 e IL-10 inhibir el desarrollo de una respuesta Th1. Sin embargo, tanto linfocitos Th1 como linfocitos Th2 colaboran en el desarrollo de la respuesta humoral y promueven el "switching" a diferentes subclases de IgG: en el ratn Th2 promueve el cambio a IgG1 e IgE y Th1 promueve el cambio a IgG2a. El desarrollo de una respuesta Th1 o Th2 es fundamental en la evolucin de diversas enferme-

dades infecciosas por bacterias, virus, hongos o parsitos y la produccin de IL-12 o de IL-4, luego de la estimulacin inicial del sistema inmune, parece un evento crucial en la diferenciacin de linfocitos Th1 o Th2 a partir de T CD4+ precursores (linfocitos Thp) que slo secretan IL-2. Luego de la estimulacin inicial por el antgeno, macrfagos y clulas dentrticas secretan IL-12, activando clulas NK y promoviendo la produccin IFN. Altos niveles de esta citoquina, producidos por clulas NK y/o linfocitos T, actan sobre linfocitos Thp favoreciendo la diferenciacin hacia Th1, al tiempo que inhiben la produccin de citoquinas que favorecen la diferenciacin de Th2 (IL-4, IL-10) (figura 14-1). El efecto beneficioso de la respuesta Th1 es, al menos en parte, mediada por la secrecin de IFN que tiene efecto antiviral directo, promueve la citotoxicidad de clulas NK y linfocitos T citotxicos (LTc) y activa la capacidad destructiva de macrfagos estimulando la produccin de radicales superxidos, xido ntrico y proteasas. La fuente inicial de IL-4 para la diferenciacin de linfocitos Th2 no est claramente definida, pero la evidencia experimental sugiere que linfocitos TABNK1.1 (clulas TNK), linfocitos T- y mastocitos y basfilos son capaces de secretar esta citoquina. El desarrollo de una respuesta con exclusin de la otra (Th1 versus Th2), parece tener efectos importantes en la susceptibilidad o resistencia a diversas infecciones y la supresin de las funciones efectoras que se observa en infecciones crnicas, es a menudo el resultado de la produccin diferencial de citoquinas en etapas tempranas de la misma. En ratones, la induccin de una respuesta Th1 tiene un efecto protector contra el parsito Leishmania major, lo que no ocurre contra el parsito Trichuris muris, donde la respuesta protectora es de tipo humoral y por lo tanto activada por Th2. Por otro lado, la infeccin experimental con Leishmania major induce una respuesta protectora de tipo Th1 en los ratones de la cepa resistente CBA/J, mientras los ratones de la cepa susceptible Balb/c desarrollan una respuesta Th2 y mueren rpidamente durante la infeccin. Estos resultados sugieren que el desarrollo de una respuesta Th1 o Th2 es de alguna manera dependiente del repertorio gentico del individuo y la inoculacin de IL-12 en los ratones susceptibles Balb/c inhibe el desarrollo de una respuesta Th2 y los ratones se hacen resistentes a la infeccin experimental con Leishmania major.

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Figura 14-1. Diferenciacin de linfocitos Th1 y Th2. (A) Macrfagos y clulas dendrticas (CPA) procesan y presentan antgenos en el contexto de molculas MHC de clase II a linfocitos T precursores (Thp) y secretan IL-12 activando clulas NK y produciendo IFN que favorece la diferenciacin de linfocitos Th1 a partir de los linfocitos Thp que slo secretan IL-2. Los linfocitos efectores Th1 secretan predominantemente IL-2, IFN y TNF con efecto antiviral directo (IFN) y activacin de una respuesta celular mediada por linfocitos T citotxicos y macrfagos activados. (B) La presentacin antignica en el contexto de molculas MHC de clase II a linfocitos Thp y la estimulacin por IL-4 (producida por linfocitos CD4 NK 1.1+, linfocitos T o mastocitos) favorecen la diferenciacin hacia linfocitos Th2 que estimulan la respuesta inmune humoral promoviendo la sntesis y secrecin de IgE y eosinoflia.

En general las infecciones parasitarias se asocian con frecuencia a la estimulacin de una de las subpoblaciones Th1 o Th2. As una respuesta Th2 con elevados niveles de IgE y una marcada eosinofilia es caracterstica de las infecciones por helmintos como Toxocara, Filaria y Schistosoma. De manera similar las infecciones por protozoos como Toxoplasma, Trypanosoma y Plasmodium estn asociadas a inmunidad celular y fenmenos de hipersensibilidad retardada que son activados por una respuesta Th1. La regulacin de la respuesta Th1 por IL-10 es fundamental para evitar los efectos nocivos de una respuesta celular aberrante. As, ratones normales son resistentes y sobreviven a la infeccin con Toxoplasma gondii, mientras ratones genticamente manipulados para hacerlos defi-

cientes en IL-10 (pero producen altos niveles de IL-12 e IFN) mueren por dao tisular caracterizado por infiltrado celular y necrosis, y no por una infeccin descontrolada. Ahora bien, puesto que la respuesta inmune contra diversas enfermedades infecciosas parece estar determinada por la particular combinacin de citoquinas secretada por los linfocitos Th, se ha sugerido que la incapacidad para controlar la evolucin de una enfermedad infecciosa es muchas veces el resultado de una respuesta inmune inapropiada o aberrante y no de una respuesta insuficiente. As una respuesta inflamatoria Th1 que tiene indiscutibles efectos beneficiosos en el control de diversos microorganismos, es tremendamente nociva si se pone en marcha contra antgenos propios y, en muchos casos de enfermedades autoinmunes rgano-especficas, la activacin de una respuesta inmune Th1 desempea un rol fundamental en la patognesis de la enfermedad. As ocurre en la tiroiditis autoinmune, la esclerosis mltiple, la enfermedad de Crohn, la artritis reumatoide y la diabetes mellitus tipo I, de manera que cualquier intento de inhibicin de la respuesta Th1 o la administracin de citoquinas como IL-4 e IL-10 que inhiben la respuesta Th1, puede tener enorme impacto en la prevencin o tratamiento de estas enfermedades. Por el contrario, en cuadros atpicos (como la fiebre de heno, el asma bronquial y la dermatitis atpica) y en el lupus eritematoso sistmico (LES) en los que una respuesta humoral dependiente de linfocitos Th2 parece estar involucrada en la inmunopatognesis de la enfermedad, el tratamiento debe estar orientado a la inhibicin de esa respuesta Th2. Se describe una subpoblacin de LT CD4+ denominados Tr1 o Th3, que sintetizan IL-10,TGF- y pequeas cantidades de IFN pero no IL-4. Se ha estudiado el papel regulador de estas clulas en el epitelio intestinal; es probable que estn involucradas en la regulacin de la respuesta inmune frente a la flora intestinal normal y por otro lado, alteraciones en relacin a estas clulas podran estar involucradas en patologas como la Enfermedad de Crohn, donde existe una respuesta celular exagerada. 3.5. Regulacin idiotpica o red idiotipo-antiidiotipo El desarrollo de respuesta inmune contra un antgeno conduce a la proliferacin o expansin de clones linfocitarios T o B antgeno especficos

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y a la sntesis y secrecin de anticuerpos especficos. El receptor de estos linfocitos (TCR o BCR) y los anticuerpos sintetizados pueden luego activar linfocitos capaces de reconocer determinantes antignicos o idiotopos de la porcin variable del receptor linfocitario o del anticuerpo antgenoespecfico (figura 14-2), poniendo en marcha un mecanismo de control idiotpico o red idiotipoanti-idiotipo que regular la activacin de los clones linfocitarios antgeno-especficos y determinar la evolucin de la respuesta contra el antgeno original.

Figura 14-2. Regulacin idiotpica. La red idiotipo-antiidiotipo incluye tanto: (A) linfocitos B o anticuerpos que reconocen idiotopos en el receptor de un linfocito T o de un linfocito B como (B) linfocitos T cuyo receptor reconoce pptidos idiotpicos de un receptor T o de una inmunoglobulina presentados en el contexto de una molcula MHC, por una clula presentadora de antgeno o por un linfocito B que procesa su propio receptor BCR.

Durante el reordenamiento gnico y la diferenciacin celular que ocurren en el timo o en la mdula sea, para la generacin de las distintas poblaciones linfocitarias, existe una muy baja probabilidad de originar linfocitos con la misma secuencia y especificidad en su receptor TCR o BCR, pero s pueden generarse linfocitos cuyo receptor reconoce o tiene especificidad por la regin variable del receptor de otro linfocito T o linfocito B. La secuencia aminoacdica de la regin variable del receptor linfocitario constituye, por lo tanto, una estructura nica y seala la individualidad de cada linfocito T o linfocito B y las diferencias que existen entre los determinantes antignicos o idiotopos de los distintos receptores, tienden a concentrarse en las regiones hipervariables de los mismos. Adems los anticuerpos anti-idiotpicos, que reconocen idiotopos de un receptor linfocitario o de una molcula de inmunoglobulina, pueden separarse en los que reconocen idiotopos ubica-

dos en el sitio de combinacin del receptor (son por lo tanto "imgenes internas" o similares al eptopo antignico original) y aqullos que reconocen idiotopos ubicados por fuera del sitio de combinacin, en el dominio variable del receptor linfocitario. Los receptores antignicos de los linfocitos T (TCR), de los linfocitos B (BCR) o las molculas de inmunoglobulina se encuentran en niveles muy bajos durante el periodo neonatal y seran por lo tanto, incapaces de poner en marcha mecanismos de tolerancia a la estructura idiotpica propia del dominio variable del receptor linfocitario. En el repertorio linfocitario de un individuo pueden, por lo tanto, encontrarse linfocitos T y/o linfocitos B, capaces de reconocer idiotopos y de originar una respuesta anti-idiotpica contra todos los idiotopos de ese receptor. De esta manera la regulacin idiotpica del sistema inmune controlara el repertorio linfocitario disponible para activacin por un antgeno y, en ltimo trmino, estara involucrada en el desarrollo de inmunidad o de tolerancia a diversos antgenos. El aislamiento de anticuerpos neonatales, de baja afinidad y elevada multirreactividad con diversos antgenos e idiotipos linfocitarios, que se producen de manera natural en ausencia de estimulacin antignica evidente, y la existencia en el suero normal humano de anticuerpos anti-idiotpicos de clase IgG que reaccionan o reconocen anticuerpos naturales parecen apoyar la participacin de la red idiotipoanti-idiotipo en el control del repertorio linfocitario. Los idiotopos son entonces estructuras nicas de la porcin variable de un receptor linfocitario o de un anticuerpo. El conjunto o la suma de todos los idiotopos de un receptor linfocitario particular constituye el idiotipo de ese receptor o de esa molcula de inmunoglobulina. En consecuencia una respuesta anti-idiotpica estar dirigida contra todos los idiotopos de un receptor linfocitario o de una molcula de anticuerpo e incluir a todos y cada uno de los linfocitos T y linfocitos B anti-idiotpicos que han sido especficamente activados.

3.6. Regulacin o "feedback" por anticuerpos y complejos inmunes La administracin pasiva de anticuerpos especficos contra un antgeno puede regular la respuesta inmune estimulando o inhibiendo el desa-

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rrollo de la respuesta humoral y/o celular dependiendo del isotipo de los anticuerpos administrados. La administracin pasiva de IgM por ejemplo, puede estimular la sntesis de anticuerpos contra el antgeno favoreciendo el procesamiento y presentacin del antgeno por fagocitos profesionales que incorporan los complejos antgeno-anticuerpo por la va de receptores Fc, o poniendo en marcha un mecanismo de regulacin idiotpica que amplifica la respuesta contra el antgeno. La administracin pasiva de anticuerpos IgG en cambio, tiende a inhibir el desarrollo de la respuesta inmune debido probablemente a: a) La neutralizacin de eptopos especficos y la eliminacin del antgeno, lo que evidentemente conduce a la remocin del estmulo antignico necesario para activar diversas subpoblaciones linfocitarias. b) La activacin de un mecanismo de regulacin idiotpica que inhibe el desarrollo de la respuesta inmune. c) La unin de complejos inmunes que contienen antgenos multideterminantes inhibir la activacin de los linfocitos B antgeno-especficos debido a que la doble seal de reconocimiento generada por la unin simultnea del antgeno al receptor linfocitario por una parte y la unin del dominio Fc del anticuerpo a receptores Fc por la otra, impide la generacin de segundos mensajeros indispensables para la activacin linfocitaria (figura 14-3).

d) La unin, la regin Fc de los anticuerpos que forman parte de complejos inmunes al receptor Fc de linfocitos T, promueve la puesta en marcha de mecanismos de supresin de la respuesta inmune. En clnica la administracin de inmunoglobulina intravenosa representa un tratamiento de primera lnea en pacientes con inmunodeficiencia humoral y es un agente inmunomodulador alternativo o complementario en pacientes con desrdenes inflamatorios sistmicos y enfermedades autoinmunes (tabla 14-2), en los cuales suprime, previene o retarda las manifestaciones clnicas. Los efectos de la administracin de inmunoglobulina intravenosa se manifiestan a distintos niveles y a travs de distintos mecanismos de accin como el bloqueo de receptores Fc en macrfagos esplnicos, la neutralizacin de autoanticuerpos circulantes, inhibicin del dao mediado por complemento y la modulacin de la sntesis y secrecin de citoquinas inflamatorias (tabla 14-3).

Tabla 14-2. Enfermedades autoinmunes y cuadros inflamatorios sistmicos en los que se ha mostrado efecto benfico de inmunoglobulina intravenosa.

Prpura trombocitopnico idioptico Neutropenias autoinmunes Anemias hemolticas autoinmunes Eritroblastopenia autoinmune Enfermedad de von Willebrand Sndrome de Kawasaki Dermatomiositis Lupus eritematoso sistmico Artritis reumatoide Polimiositis Sndrome de Gillain-Barr Miastenia gravis Esclerosis mltiple Diabetes mellitus insulino dependiente Colitis ulcerativa Enfermedad de Crohn

Figura 14-3. Regulacin o "feedback" por anticuerpos o complejos inmunes. La doble seal de reconocimiento generada por la unin simultnea al receptor linfocitario y a receptores Fc, de complejos inmunes formados en fase fluida, impide la generacin de segundos mensajeros indispensables para la activacin linfocitaria. Mientras el antgeno multiepitpico del complejo se une al receptor linfocitario, el dominio Fc de anticuerpos del mismo complejo se une a un receptor Fc, inactivando al linfocito B.

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Tabla 14-3. Mecanismos de accin de la inmunoglobulina intravenosa

Bloqueo de receptores Fc en macrfagos esplnicos Unin de fragmentos C3b y C4b e inhibicin del dao por complemento Modulacin de la sntesis y secrecin de citoquinas inflamatorias (IL-1, IFN, TNF). Neutralizacin anti-idiotpica de autoincuerpos circulantes Modificacin de la solubilidad, clearance y propiedades inflamatorias de los complejos inmunes Neutralizacin de superantgenos y toxinas (Sndrome de Kawasaki) Regulacin idiotpica de linfocitos B y linfocitos T

3.7. Regulacin por Prostaglandinas Las prostaglandinas son pequeas molculas lipdicas que regulan numerosos procesos orgnicos, incluyendo funcin renal, agregacin plaquetaria, liberacin de neurotransmisores y modulacin de la respuesta inmune. En respuesta a un estmulo inflamatorio, la produccin de prostaglandinas se inicia con la Fosfolipasa A2 que libera cido araquidnico desde los fosfolpidos de membrana. El cido araquidnico es luego transformado en endoperxidos cclicos (PGH2) por accin de la Cicloxigenasa (Cox-1 y Cox-2). La Cox-1 se expresa constitutivamente en la mayora de los tejidos y acta en procesos de regulacin mucosa; Cox-2, en cambio, es una enzima inducible involucrada en los procesos de regulacin de la inflamacin. Prostaglandina sintetasas especficas transforman PGH 2 en distintas prostaglandinas (PGI2, PGF2, PGD2 y PGE2 ) que, una vez liberadas de las clulas, actan cerca de su sitio de produccin unindose a receptores de membrana especficos. De la PGD2 deriva la molcula 15-d PGJ2 que es producida por diversas clulas. 3.7.1. Prostaglandina E2 (PGE2)

trado que la PGE2 induce la apoptosis en clulas T inmaduras (doble positivas TCD4+/CD8+) y en clulas T maduras inactivas, pero inhibe la apoptosis de clulas T maduras y activadas. En este ltimo caso se ha observado que disminuye la expresin del mRNA que codifica FAS-L (FAS ligand). La PGE2 favorece adems la produccin de IL2, IL-5 e IL-10 (respuesta Th2), probablemente mediada por AMPc, e inhibe la produccin de IFN e IL-2 (respuesta Th1). En los linfocitos B, la PGE2 induce apoptosis de las clulas inmaduras, pero no en las clulas maduras. Por otra parte, en linfocitos B estimulados con LPS e IL-4, la PGE2 estimula la produccin de la IgG1 e IgE, en desmedro de la produccin de IgG3 e IgM, mediante un mecanismo dependiente de AMPc En clulas presentadoras de antgeno (CPA) de tejidos perifricos, la PGE2 activa CPA profesionales (clulas dendrticas, macrfagos), pero una vez que stas han migrado a los rganos linfoides secundarios, su maduracin y por tanto su capacidad de presentar antgenos, son inhibidas por PGE 2. Tambin se ha observado que en macrfagos, la PGE2 inhibe la sntesis de TNF, IL-1, IL-8 e IL12. 3.7.2. Prostaglandina 15-d PGJ2

La PGE2 es producida por diversas clulas (incluyendo fibroblastos y macrfagos) y ejerce su accin unindose a uno o varios de los receptores: EP1 EP2 EP3 EP4. En linfocitos T, la PGE2 inhibe la proliferacin de linfocitos T helper y T citotxicos y an cuando el mecanismo de accin no est bien establecido, se ha sugerido que inhibira la liberacin de Ca2+ intracelular y la actividad de la tirosina kinasa p59. Por otra parte, se ha demos-

Esta prostaglandina es producida por diversas clulas (mastocitos, clulas T, plaquetas y macrfagos alveolares) y deriva de la PGD2. Se desconoce su mecanismo de ingreso a las clulas, pero probablemente lo hace a travs de un mecanismo activo o por una molcula transportadora aninica. En linfocitos T y linfocitos B la prostaglandina 15-d PGJ2 inhibe la proliferacin

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celular e induce apoptosis. En neutrfilos, esta prostaglandina inhibe la produccin de radicales libre de oxgeno y en macrfagos se ha descrito que inhibe la produccin de sintetasa de xido ntrico (NOS), de TNF y de IL-1, mediante un mecanismo que involucra la inhibicin de diversas quinasas.

LECTURAS SUGERIDAS Aste-Amezaga, M., et al., "Molecular mechanisms of the induction of IL-12 and its inhibition by IL10 ", The Journal of Immunology, 160: 59365944,1998. Cobbold, S. and Waldmann, H. "Infectious Tolerance", Current Opinion in Immunology, 10:518524, 1998. Finkelman, F., et al., "The role of IL-13 in helminth-induced inflammation and protective immunity against nematode infections", Current Opinion in Immunology, 11:420-426, 1999. Groux, H. and Powrie, F., "Regulatory T cells and inflammatory bowel disease", Immunology Today, 10: 442-445, 1999. Kalinski, P., et al., "T-cell priming by type-1 and type-2 polarized dendritic cells: the concept of a third signal", Immunology Today, 12:561-567, 1999. Medzhitov, R. and Janewey Jr., C., "Innate Immunity ", The New England Journal of Medicine, 343:338-344, 2000. Noben-Trauth, N., et al., "Conventional, naive CD4+ T cells provide an initial source of IL-4 during Th2 differentiation", The Journal of Immunology, 165: 3620-3625, 2000. Sarah, G., et al., Prostaglandins as modulators of immunity, Trends in Immunology, 23(3):143-150, 2002. Von Andrian, U. and Mackay, C., "T-cell function and migration", The New England Journal of Medicine, 343:1020-1033, 2000.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 15
NEUROINMUNOLOGA
Hugo Folch V., Miguel Barra M. y Patricio Esquivel S.

1. Introduccin 2. Interacciones entre el sistema nervioso central, sistema endocrino y sistema inmune 2.1. Inervacin de los rganos linfoides 2.2. Existencia de un eje Sistema nervioso central-hipfisis-sistema inmune 2.3. El SNC tiene "conocimiento" de la entrada de antgeno al organismo y responde a l 2.4. El sistema inmune produce hormonas 2.5. El sistema inmune tiene receptores para hormonas y neuropptidos 2.6. Otras seales derivadas del sistema inmune tienen efecto en el sistema neuroendocrino 3. Resultante de la interaccin del sistema nervioso, sistema endocrino y el sistema inmune: evidencias en el organismo vivo que demuestran su efecto en la respuesta inmune

3.1. Efecto del "stress" en la respuesta inmune 3.2. Depresin e inmunidad 3.3. Efecto de los factores sociales en la respuesta inmune 3.4. Las drogas psicoactivas alteran el funcionamiento del sistema linfoide 3.5. Las hormonas sexuales modulan la respuesta autoinmune 4. Algunos casos en que el sistema inmune origina cambios o trastornos en el sistema nervioso 4.1. Efecto de los anticuerpos a nivel del sistema nervioso 4.2. Efecto de complejos antgeno-anticuerpo en el sistema nervioso central 4.3. Rol patognico de linfocitos T, macrfagos y citoquinas en el tejido nervioso

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RESUMEN El funcionamiento del sistema inmunolgico depende de mltiples factores que regulan cada uno de los eventos, tanto celulares como moleculares, que se ponen en marcha en el momento de la entrada del antgeno. Los factores que condicionan la respuesta inmune pueden clasificarse en intrnsecos, los que se originan en el propio sistema inmune, y en factores extrnsecos que provienen del medio interno del organismo, alguno de los cuales se encuentran condicionados por el entorno en que el individuo desarrolla su actividad. De los factores reguladores externos al sistema inmune, el sistema neuroendocrino juega un papel preponderante. El sistema neuroendocrino influye sobre el sistema inmune directamente mediante la inervacin de los rganos linfoides, los productos del eje hipotlamo-hipofisiario y otras hormonas o neuropptidos, para los cuales los linfocitos tienen receptores especficos. Por otro lado, los linfocitos producen hormonas y neuropptidos, que junto con las citoquinas que induce el estmulo antignico, pueden ser percibidos por el sistema nervioso central y modificar su actividad. La demostracin de la interaccin de los sistemas neuroendocrinos e inmunolgico, permiten explicar el efecto inmunodepresor producido por circunstancias que inducen "stress", factores sociales adversos, consumo de drogas psicoactivas o las hormonas sexuales, entre otras.

1.

INTRODUCCIN

El sistema inmune puede ser considerado como un rgano sensorial capaz de reconocer estmulos no cognoscitivos como bacterias, virus y tumores, mientras que el sistema nervioso central reconoce estmulos cognoscitivos clsicos: qumicos, fsicos y emocionales. Los sistemas inmune, nervioso central y neuroendocrino interactan a travs de la liberacin de citoquinas y hormonas con un circuito de retroalimentacin. En este circuito la va aferente est representada por el sistema inmune que informa al sistema nervioso central y estimula el eje hipotlamohipofisiario-adrenal a travs de la liberacin de productos de linfocitos activados. La respuesta inmune, elemento efector elaborado especficamente frente a un antgeno, depende de una gran cantidad de factores, que pueden englobarse en aquellos dependientes del medio interno del organismo y aquellos dependientes del medio externo. Entre los factores del medio externo cabe destacar temperatura ambiental, radiacin solar, ciclos estacionales, ciclo da-noche, etc. Entre los factores del medio interno destacan, por un lado, los elementos propios del sistema inmune como linfocitos T, linfocitos B, molculas de ad-

hesin expresadas en su superficie, citoquinas y anticuerpos y por otro, elementos ajenos al sistema inmune, pero que condicionan el medio interno en el cual se desarrolla la respuesta inmune: citoquinas secretadas por clulas que no pertenecen al sistema inmune, temperatura, nutrientes, pH, vitaminas, hormonas y neuropptidos; elementos stos que, a su vez, sufren la influencia de factores ajenos al individuo (figura 15-1). Esta visin integradora del sistema inmune, lo hace aparecer como interdependiente del resto del organismo, contrapuesta con la posicin sostenida hasta no hace mucho tiempo, en que se consideraba al sistema inmune prcticamente como autnomo. Probablemente uno de los avances ms significativos del ltimo tiempo, haya sido el poner en evidencia la interdependencia del sistema nervioso central (SNC), sistema endocrino y sistema inmune, que establecen una red interactiva que regula y condiciona fuertemente la respuesta inmune. Este aspecto queda demostrado por la existencia de receptores en la membrana de linfocitos para neurotransmisores y hormonas, se sabe que los linfocitos producen hormonas y que existen clulas del sistema neuroendocrino que producen citoquinas que hasta hace poco eran atribuidos slo al sistema linfoide (figura 15-2).

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Figura 15-1. Algunos de los aspectos ms relevantes que condicionan el accionar de clulas B, T y macrfagos. stos se encuentran divididos en 3 categoras: (a) los factores reguladores que provienen del propio sistema inmune, ( b) factores externos al sistema linfoide, provenientes del medio interno del organismo y (c) elementos externos al individuo que juegan un rol en la respuesta inmune actuando sobre el sistema linfoide o el medio interno.

Figura 15-2. Interaccin entre el sistema neuroendocrino y el sistema inmune. El esquema muestra cmo adems de las funciones propias cada uno de estos dos sistemas homeostticos pueden producir linfoquinas, hormonas y neuropptidos y que las clulas de ambos, tienen receptores para estos factores de regulacin.

2. INTERACCIONES ENTRE EL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL, SISTEMA ENDOCRINO Y SISTEMA INMUNE El sistema inmune est constantemente interactuando con el sistema neuroendocrino lo

que asegura que las respuestas inmunes e inflamatoria estn en armona con otras funciones del organismo. Estos sistemas usan similares ligandos y receptores para establecer una comunicacin fisiolgica intra e intersistema, lo que juega un papel relevante en la homeostasis. As,

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no slo las hormonas clsicas pueden ser producidas por clulas del sistema inmune, sino que una variedad de citoquinas (originalmente descritas como producidas por monocitos y linfocitos) son sintetizadas y liberadas por una variedad de glndulas endocrinas y tejido nervioso. Adems, receptores especficos para estas molculas pueden encontrarse en los sistemas inmune y neuroendocrino. A continuacin se desarrollar brevemente algunos expuestos de esta interaccin: 2.1 Inervacin de los rganos linfoides Los rganos del sistema inmune estn conformados por un estroma de clulas y fibras organizadas en una red tridimensional, que da soporte a las diferentes poblaciones celulares directamente involucradas en la respuesta inmune. Las clulas del sistema inmune son en su mayora mviles, dispuestas en compartimentos y sujetas a sbita proliferacin o extensos procesos de muerte programada producto de la estimulacin antignica. En la cintica de estos procesos la inervacin del estroma juega un papel importante: el anlisis de los neurotransmisores que contienen los axones de un rea en particular de tejido linfoide, ha permitido demostrar en sus terminaciones norepinefrina, neuropptido Y, substancia P, el pptido relacionado con el gen de la calcitonina y el pptido intestinal vasoactivo. Todas estas substancias son vasoactivas y como tales pueden modificar el flujo sanguneo local, influyendo de esta forma en el trfico celular. Por otra parte, tambin se ha descrito una accin directa de estas substancias de origen nervioso sobre los linfocitos, derivado del hecho de que estas clulas tienen receptores especficos para la mayora de dichos productos. Su accin sobre la clula linfoide se traduce en la elevacin de los niveles intracelulares de segundos mensajeros, lo que con seguridad contribuye a la estimulacin linfocitaria y a la generacin de una respuesta inmune compartamentalizada. Esto ltimo se deriva de la diferente inervacin que es posible observar en reas T, reas B o zonas de interaccin celular T-B como la zona marginal del bazo. 2.2 Existencia de un eje Sistema nervioso central-hipfisis-sistema inmune La literatura provee mltiples evidencias sobre la existencia de circuitos reguladores que se originan en el SNC y lo conectan con la hipfisis,

que mediante sus productos de secrecin puede actuar directamente sobre las clulas del sistema inmune o activar a glndulas perifricas del sistema endocrino como tiroides, suprarrenales o gnadas, cuyos productos hormonales a su vez pueden actuar sobre el sistema linfoide. La estrategia ms usada para poner en evidencia la existencia de este eje regulatorio es la lesin selectiva en determinadas reas del SNC o de la hipfisis. Al respecto se ha demostrado que la destruccin selectiva del hipotlamo anterior reduce la celularidad del timo y bazo, deprime la respuesta proliferativa de las clulas T a mitgenos, disminuye la actividad NK (de clulas natural killer), induce una baja en la produccin de anticuerpos e inhibe el "shock" anafilctico. Se puede concluir as, de estos experimentos, que el hipotlamo anterior tiene la capacidad de influir la respuesta inmune tanto celular como humoral. La hipofisectoma, a su vez, produce una baja en la celularidad de la mdula sea, una discreta anemia y una involucin tmica. En animales que presentan hipfisis hipofuncional, el bazo y los ndulos linfticos se presentan atrofiados. En general los reportes coinciden en que la hipofisectoma reduce la respuesta inmune celular y humoral. Por otra parte, experimentos de diferenciacin de clulas T in vitro han demostrado que cocultivos de explantes hipotalmicos (regin medio basal), con hipfisis y timo representan un eje de accin que culmina con la diferenciacin de clulas de mdula sea en clulas Thy1+. Este efecto opera a travs del lbulo anterior de la hipfisis y es dependiente de la presencia de hipotlamo, lo que indica la produccin por parte de esta estructura nerviosa de factores reguladores que actuaran sobre hipfisis la cual a su vez liberara factores que actuando sobre timo inducen a sus clulas para liberar hormonas tmicas, responsables finales de la diferenciacin de clulas T. En el eje de diferenciacin de clulas T descrito antes (hipotlamo-hipfisis-timo) se ha demostrado que la hipfisis participa liberando prolactina (PRL) e IL-6 que seran, al menos parcialmente, responsables de la liberacin de hormonas tmicas en esta glndula linfoide. Estudios in vivo, demuestran que la administracin de extractos hipotalmicos provenientes de animales jvenes, restauran los niveles de timulina circulante en animales viejos, en los cuales esta hormona es inexistente. Adems, estos animales viejos que presentan una respuesta inmune T dependiente disminuida, cuando reciben extractos

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hipotalmicos provenientes de ratones jvenes, presentan una respuesta T de niveles tan altos como los detectados en el animal joven. Esto indicara que el "envejecimiento" del sistema inmune sera ms bien responsabilidad del hipotlamo como elemento regulador central. Se sabe que la hipfisis libera una serie de hormonas bien conocidas, cuya secrecin se encuentra bajo la influencia de factores hipotalmicos. De las hormonas hipofisiarias conocidas, PRL y hormona del crecimiento (GH) parecen jugar papeles importantes en la estimulacin de la funcin inmune. Por otra parte, la hormona adreno-corticotrofina (ACTH) tambin aparece involucrada, jugando generalmente un papel inhibitorio de la respuesta inmune, ya que estimula la secrecin de glucocorticoides (ver tabla 15-1). Adicionalmente, se ha demostrado que la secrecin hipofisiaria de otros factores de crecimiento e interleuquinas, tambin tienen influencia en el desarrollo de la respuesta inmune (figura 15-3). 2.3 El SNC tiene "conocimiento" de la entrada de antgeno al organismo y responde a l Se sabe que el proceso de inmunizacin induce, a nivel del SNC, por un aumento de las descargas elctricas en regiones discretas del hipotlamo. Esto probablemente, es derivado de

su estimulacin va linfoquinas que, mediante la interaccin con su receptor neuronal son capaces de activar las clulas del sistema nervioso, directa o indirectamente, generando un efecto estimulatorio de cascada en un sistema de neuronas interconectadas. Al respecto, existen evidencias que el lipopolisacrido bacteriano induce la liberacin de interleuquinas en estructuras del sistema nervioso y de la hipfisis, siendo esa una seal importante de entrada de antgenos bacterianos al organismo. 2.4 El sistema inmune produce hormonas Antiguos experimentos de Pierpaoli, demostraron que ratones enanos hipo-hipofisiarios podan mejorar en parte sus severos trastornos endocrinos, si eran transfundidos con linfocitos singeneicos de animales normales, dando pie para pensar que las clulas inmunes eran capaces de producir algunas hormonas. Ms tarde pudo ser demostrado que leucocitos perifricos de animales infectados con virus o bacterias producen ACTH y endorfinas, idnticas a las producidas en la adenohipfisis. Igual cosa se ha demostrado para linfocitos T estimulados con superantgeno estafiloccicos, los que producen tirotrofina (TSH), GH y gonadotrofina corinica (GC). Adicionalmente, en lneas celulares tanto

Tabla 15-1. Modulacin de la respuesta inmune por hormonas hipofisiarias Hormona Corticotropina Efecto Modulador Sntesis de anticuerpos Produccin de IFN- Crecimiento de clulas B. Sntesis de anticuerpos. Actividad de clulas NK. Aumenta sntesis de anticuerpos. Comitognico con ConA. Clulas T citotxicas. Aumenta respuesta inmune. Produccin de citoquinas. Aumenta respuesta inmune. Induce receptores a IL-2

Endorfinas Tirotropina Hormona del crecimiento (GH) Hormona luteinizantes (LH) y Hormona folculo estimulante (FSH) Prolactina (PRL)

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Figura 15-3. Esquema de interacciones positivas (+), negativas (-) o de ambos tipos () que ocurren entre hipotlamo-hipfisis y glndulas endocrinas, hipotlamo, hipfisis y glndulas endocrinas con el timo, accin de las hormonas tmicas sobre los linfocitos perifricos, efecto de hormonas provenientes de las diferentes glndulas endocrinas y de neuropptidos ya sea origen central o provenientes de terminaciones nerviosas perifricos, sobre los linfocitos maduros y posible accin de productos de linfocitos sobre estructuras nerviosas y endocrinas.

B como T se ha demostrado la presencia de mRNA para la mayora de las hormonas conocidas. Tambin se ha demostrado que las clulas nodrizas del timo, son capaces de producir oxitocina y vasopresina, pudiendo as, postularse para el sistema inmune una funcin en la modulacin del sistema endocrino y ms an su fortificacin directa en el "concierto endocrino" del organismo. 2.5 El sistema inmune tiene receptores para hormonas y neuropptidos La real comunicacin de hormonas y neuropptidos con las clulas linfoides, necesita de la demostracin de receptores para estas substancias. As, las primeras evidencias de la existencia de receptores opioides en la membrana de los linfocitos, surgieron de la demostracin del efecto inmuno-modulador que posee la morfina y

la metenkephalina sobre la funcin T. En efecto, receptores opioides de alta afinidad han sido identificados en lneas celulares linfoides de diferente origen. En la tabla 15-2 se presenta un resumen de los receptores para algunas hormonas y neuropptidos en clulas linfoides. 2.6 Otras seales derivadas del sistema inmune con efecto en el sistema neuroendocrino El estudio de elementos del sistema inmune que pueden afectar el sistema nervioso, sirviendo de comunicadores entre ambos sistemas, se ha centrado en las citoquinas, elementos clsicos de comunicacin dentro del sistema inmune. Al respecto se sabe que IL-1 aumenta los niveles de ACTH y corticosterona en el torrente sanguneo de ratas y ratones, actuando directamente sobre la hipfisis y paralelamente estimulando

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la produccin de factor liberador de corticotrofina (CRF) en el hipotlamo. Adicionalmente, IL-1 induce una hipofuncin de la glndula tiroides. Por otro lado, IL-6 y TNF (Factor de necrosis tumoral) aumentan los niveles de ACTH y junto con INF- se ha demostrado afectan los mecanismos reguladores del sueo a nivel del SNC. En la tabla 15-3 se presenta el efecto de diferentes citoquinas en

el sistema neuroendocrino. LH, Hormona luteinizante Otros mensajeros inmunolgicos potenciales son serotonina e histamina producidos en grandes cantidades en determinados procesos inmunes. Fuera de los mediadores sealados existen mltiples otras substancias generadas en el sistema inmune, candidatos a ejercer funciones parecidas y cuyo efecto especfico espera ser demostrado.

Tabla 15-2. Receptores para hormonas y neuropptidos en clulas linfoides Pptido Corticotropina Enkefalinas Endorfinas Tirotropina Hormona del Crecimiento Prolactina Oxitocina VIP Somatostatina Sustancia P Clulas que presentan receptores Linfocitos T y B Linfocitos T y B Linfocitos T y B Linfocitos T Linfocitos T Linfocitos T, B y macrfagos Timocitos Linfocitos T Linfocitos T y B Linfocitos T

Tabla 15-3. Efecto de citoquinas en el sistema neuroendocrino Hormonas Neuroendocrinas Citoquina IL-1 IL-2 IL-6 IFN- TNF ACTH E E E E E TSH I E I I I PRL E E O O E GH E I I I E LH I I O Nd Nd

E, Estimula; I, Inhibicin; O, Sin efecto; Nd, No determinado. ACTH, Hormona adrenocorticotrofina; TSH, Tirotrofina; PRL, Prolactina; GH, Hormona del crecimiento;

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3. RESULTANTE DE LA INTERACCIN DEL SISTEMA NERVIOSO, SISTEMA ENDOCRINO Y EL SISTEMA INMUNE: EVIDENCIAS EN EL ORGANISMO VIVO QUE DEMUESTRAN SU EFECTO EN LA RESPUESTA INMUNE Al considerar al organismo como un todo, y mediante la evaluacin de parmetros inmunolgicos se hace evidente los efectos que los sistemas nervioso y endocrino tienen sobre el sistema linfoide. Sobresalen al respecto los efectos del stress, de factores sociales, de drogas psicoactivas y de las hormonas sexuales. 3.1 Efecto del "stress" en la respuesta inmune En el hombre es conocido el efecto depresor que, sobre el sistema inmune, tienen los cambios en las relaciones interpersonales de los individuos. Ejemplos clsicos en este aspecto son el fallecimiento de uno de los cnyuges o el divorcio. El efecto del "stress" crnico, como el de una familia que cuida a alguno de sus miembros afectados de demencia, o individuos que sufren diversos grados de depresin, tambin es detectado por el sistema inmune cuyos parmetros generales, en estos casos, estn bajo la mediana de una poblacin normal. Los individuos bajo condiciones estresantes presentan, en general, un mayor riesgo a contraer enfermedades virales y representan un grupo de riesgo en relacin a la ocurrencia de neoplasias. Los hallazgos ms recurrentes en estos casos son una pobre respuesta blastognica de los linfocitos perifricos, alteracin de la relacin de los linfocitos T CD4+/CD8+ y una baja notable en el nmero de las clulas NK. En animales, el efecto depresor del "stress" en el sistema inmune ha sido probado mediante un aumento de la morbilidad y mortalidad por neoplasias inducidas o trasplantadas. Los animales sometidos a "stress" presentan, igual que en el hombre, alteraciones importantes en la respuesta de sus linfocitos a mitgenos, una marcada disminucin del nmero relativo de las clulas NK en los rganos linfoides perifricos y alteraciones en las clulas macrofgicas, que demuestran una menor capacidad fagoctica y una baja capacidad germicida intracelular. Los efectos descritos tienden a explicarse, a menudo, por el efecto estimulador que tiene el "stress" sobre el eje hipotlamo-pituitaria-glndula suprarrenal y al aumento de los corticoides

plasmticos que se produce por esta va. Sin embargo, reconociendo su importancia, parece ser que los efectos inmunolgicos del "stress" no obedecen slo a esa causa, ya que cuidadosos estudios en animales adrenalectomizados con la correspondiente terapia de reemplazo, han dado resultados controversiales. 3.2 Depresin e inmunidad La depresin mayor es un cuadro de bastante frecuencia. Est estrechamente asociado al stress considerndose como una respuesta exagerada a l desde el punto de vista biolgico y clnico. La depresin se acompaa de cambios neuroendocrinos, particular y notoriamente un aumento en la actividad del eje hipotlamohipfisis adrenal. Por otra parte las manifestaciones de la depresin incluyen cambios en las funciones vegetativas tales como sueo, apetito y otras. Dado que hay muchas evidencias que las citoquinas estn involucradas en la mayora de estas caractersticas de la depresin, es altamente probable su participacin independiente del papel de otros neurotransmisores. 3.3 Efecto de los factores sociales en la respuesta inmune En la especie humana se correlacionan positivamente con una buena respuesta inmune: una buena calidad de vida, un entorno social agradable y una familia bien avenida. Esta correlacin positiva aumenta si a esta condicin se adiciona un buen estatus socio-econmico y un alto nivel de educacin. Estudios en roedores demuestran, por otra parte, que el tamao del grupo, su composicin y grado de hacinamiento influyen en forma importante en la respuesta inmune. Tambin el aislamiento o la privacin del contacto materno en los primeros das de vida inducen cambios medibles en la maduracin del sistema inmune. Ms an, animales mantenidos en un grupo cerrado muestran diferencias en sus parmetros inmunolgicos de acuerdo a la jerarqua social que ocupan en la colonia. Como corolario de esto, se puede suponer que los factores sociales que rodean a cada individuo influyen en su resistencia a las enfermedades infecciosas, crecimiento de neoplasias y enfermedades autoinmunes, an cuando este punto requiere mayor investigacin.

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3.4 Las drogas psicoactivas alteran el funcionamiento del sistema linfoide Es conocido que los opiceos, la cocana y la marihuana adems de su efecto estimulatorio para el SNC, ejercen un efecto depresor de diversos parmetros inmunolgicos. En general, los fumadores crnicos de marihuana al igual que los animales de experimentacin que recibieron 9tetrahidrocananbinol, uno de sus principios psicoactivos ms potentes, demuestran importantes alteraciones en el sistema macrofgico, una reducida respuesta blastognica de los linfocitos T y B, un bajo porcentaje de clulas NK y baja produccin de IL-2 e IFN. Los efectos de la cocana parecen ser an ms pronunciados. 3.5 Las hormonas sexuales modulan la respuesta autoinmune El hecho que para la mayora de las enfermedades autoinmunes, el gnero ms afectado sea el femenino, tanto en el hombre como en los animales de experimentacin, permite suponer que las hormonas sexuales juegan un papel importante en la patognesis de estas enfermedades. Esta nocin se refuerza cuando se constata que el embarazo o el climaterio cambia a menudo en las mujeres el curso de la enfermedad autoinmune. En animales experimentales la gonadectoma o la administracin de esteroides gonadales permite demostrar claramente el papel inmuno-regulador de estos compuestos, el que puede ser ejercido directamente sobre las diversas subpoblaciones linfocitarias o a travs del efecto modulador que estas substancias tienen sobre la glndula tmica. 4. ALGUNOS CASOS EN QUE EL SISTEMA INMUNE ORIGINA CAMBIOS O TRASTORNOS EN EL SISTEMA NERVIOSO Por ltimo, pero no menos importante para la vida de los individuos, es posible afirmar que una respuesta inmune persistente como la que se da en las enfermedades autoinmunes o en las infecciones virales crnicas pueden alterar profundamente el funcionamiento del SNC, causando cambios en el comportamiento de hombres y animales, estados de letargo y an demencia. Los agentes desencadenantes de estos cuadros neurolgicos parecen ser fundamentalmente tres: anticuerpos que dan reaccin cruzada con estructuras del cerebro, complejos inmunes y pro-

ductos de la respuesta inmune celular: 4.1 Efecto de los anticuerpos a nivel del sistema nervioso Los anticuerpos unidos a receptores de membrana de la clula nerviosa pueden bloquear, estimular o alterar la funcin de estas estructuras. Pueden, ms an, inducir lisis celular a travs de la activacin de la cascada del complemento, y junto con esto mediante la accin de sus sub-productos moleculares puede amplificar y diversificar los efectos de la noxa primaria. Adicionalmente los anticuerpos dirigidos contra estructuras intracelulares pueden bloquear el transporte axonal y causar otros trastornos en las clulas nerviosas. 4.2 Efecto de complejos antgeno-anticuerpo en el sistema nervioso central El depsito de complejos inmunes a nivel de vasos sanguneos cerebrales, plexo corodeo y neuronas, al activar la cascada del complemento altera la barrera hemato-enceflica y los productos bioactivos del complemento, al igual que en el caso anterior, pueden producir inflamacin y dao tisular local. 4.3 Rol patognico de linfocitos T, macrfagos y citoquinas en el tejido nervioso La inmunidad celular, que a menudo tiene como blanco componentes de la mielina o directamente constituyentes de las clulas neuronales, pueden generar infiltrados linfocitarios y/o monocticos con una alta produccin local de citoquinas, que en suma producen destruccin o alteracin del tejido nervioso circundante.

LECTURAS SUGERIDAS Adder, R, Felten, D. and Cohen, N. (Eds.) Psychoneuroimmunology, second edition, Academic Press Inc., 1991. Immune-neuroendocrinology, special issue, Immunol Today, 15: 503-552, 1994. Goetzl, E., Adelman, D.C. and Sreedharan, S.P. Neuroimmunology. Advances in Immunology 48: 161-184, 1990.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 16
INMUNIDAD DE MUCOSAS

Ulises Vergara C. e Ivn Palomo G.

1. Introduccin 2. Sistema inmune de mucosas 2.1. Organizacin estructural 2.2. Transporte y presentacin de antgenos 3. Funciones efectoras de la inmunidad de mucosas 3.1. Respuesta inmune de anticuerpos 3.2. Respuesta inmune celular 4. Inmunizacin a travs de mucosas 4.1. Uso de adyuvantes 5. Tolerancia inducida a travs de mucosas

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RESUMEN El compartimiento ms conocido del sistema inmune es el sistmico, sin embargo el compartimiento epitelial que agrupa los tejidos linfoides asociados a la piel, mucosas y glndulas secretoras, tiene tambin gran importancia. El tejido linfoide asociado a mucosas (MALT) se ubica en mucosas de los tractos gastrointestinal, genitourinario y respiratorio. En los tractos intestinal y respiratorio son muy importantes las clulas M, especializadas en el transporte de antgenos desde el epitelio que tapiza los folculos linfocitarios, a los sitios de induccin de la respuesta inmune. All se encuentran clulas dendrticas, que capturan y procesan los antgenos para ser presentados a los linfocitos T (LT). La respuesta inmune de mucosas puede ser de tipo humoral y/o celular. En el primer caso tiene una fundamental participacin la IgA de secrecin. La inmunidad celular, por su parte, junto con participar en la eliminacin de microorganismos a travs de LT especficos, proporciona seales accesorias de coestimulacin para la diferenciacin de linfocitos B. En este captulo, adems, se describe las caractersticas que tiene la inmunizacin a travs de mucosas y las diferencias que sta presenta respecto de la inmunizacin va sistmica.

1. INTRODUCCIN Desde un punto de vista estructural, el sistema inmune puede separarse en dos compartimientos distintos y finamente regulados: (i) el compartimiento sistmico, que incluye a la mdula sea, bazo y ganglios linfticos y (ii) el compartimiento epitelial, que incluye tejido linfoide asociado a la piel, las superficies mucosas y glndulas secretoras (glndulas lagrimales, glndulas salivales y glndulas mamarias). Cada compartimiento incluye tanto clulas asociadas a la respuesta inmune humoral, como aqullas asociadas a la respuesta inmune celular. Sin embargo la naturaleza y propiedades de la respuesta inmune son distintas en cada compartimiento. As, la inmunizacin a travs de las mucosas resulta frecuentemente en la estimulacin tanto de una respuesta a nivel de mucosas, como de una respuesta sistmica. La inmunizacin parenteral, en cambio, slo induce una respuesta sistmica, sin activacin del sistema inmune asociado a mucosas. Los anticuerpos asociados al compartimiento sistmico son principalmente de isotipo IgG, cuya funcin se asocia, generalmente, a la neutralizacin de agentes patgenos en el torrente circulatorio. Los anticuerpos asociados al compartimiento epitelial, son por el contrario, pri-

mariamente de isotipo IgA, que previenen la entrada de agentes patgenos a travs de mucosas. La respuesta inmune sistmica puede eliminar de manera muy efectiva las infecciones sistmicas, pero generalmente falla en la proteccin de las superficies mucosas. As, el desarrollo de una activa respuesta inmune local, es esencial para la prevencin de la mayora de las enfermedades infecciosas. Las mucosas del tracto respiratorio y gastrointestinal estn continuamente expuestas a una gran variedad de antgenos y macromolculas, pero un nmero muy limitado de ellas entran al organismo y causan enfermedad. Las barreras epiteliales representan la primera lnea de defensa contra el ambiente externo, rico en potenciales patgenos. Sin embargo, el tejido linfoide asociado a distintos epitelios difiere en su organizacin celular y en las estrategias utilizadas en la captura y presentacin de antgenos, no slo para proporcionar resistencia a distintos agentes infecciosos, sino tambin para distinguir entre agentes dainos y substancias inocuas. Esto es particularmente importante en el tracto digestivo, donde respuestas no deseadas contra antgenos alimentarios o contra la flora intestinal, puede conducir a alergias alimentarias, inflamacin y otros problemas.

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Aun cuando la produccin de anticuerpos polimricos (particularlmente IgA) constituye un componente claramente importante del sistema inmune de mucosas, la respuesta IgE est tambin asociada a la exposicin a antgenos a travs de las mucosas (alergenos). Alergias alimentarias y asma son ejemplos comunes de reacciones mediadas por IgE en las mucosas. Adems, existe una subpoblacin de linfocitos que residen en los epitelios (linfocitos intraepiteliales) y pueden constituir la primera lnea de defensa contra infecciones en las mucosas, cumpliendo tanto funciones efectoras citotxicas como funciones reguladoras de la respuesta inmune. Las clulas citotxicas son particularmente importantes en la proteccin contra infecciones virales que son comunes en las superficies mucosas. Por ltimo, la incorporacin oral de antgenos puede inducir una tolerancia perifrica antgenoespecfica, conocida como tolerancia oral. Esta tolerancia oral prevendra las alergias alimentarias y las reacciones inflamatorias contra antgenos inocuos derivados de la microflora normal y puede tener un enorme potencial en el tratamiento de enfermedades autoinmunes y de enfermedades inflamatorias.

marcadamente reducidos en animales de laboratorio mantenidos en un ambiente libre de grmenes y expandidos en condiciones de elevada estimulacin antignica. 2.1. Organizacin estructural El tejido linfoide MALT incluye una coleccin de linfocitos y clulas accesorias ubicadas en el epitelio y lmina propia de las mucosas asociadas a los tractos gastrointestinal, genitourinario y respiratorio. En el tracto gastrointestinal el tejido linfoide (GALT: Gut Associated Lymphoid Tissue), incluye las placas de Peyer, apndice y ndulos linfoides aislados. En el tracto respiratorio, el tejido linfoide incluye el tejido linfoide asociado a nasofaringe que est constituido por amgdalas palatinas y adenoides (NALT: Nasopharyngeal-Associated Lymphoid Tissue) y el tejido linfoide asociado al rbol bronquial (BALT: Bronchus-Associated Lymphoid Tissue). En el tracto intestinal, la barrera epitelial est formada por una capa nica de clulas epiteliales que contiene fundamentalmente enterocitos y clulas globosas o caliciformes productoras de mucus. Las clulas epiteliales estn selladas por uniones estrechas, en la regin apical de sus membranas. El tejido linfoide asociado a la mucosa se ubica a lo largo del tracto gastrointestinal y contiene folculos linfocitarios distribuidos individualmente o en forma de grupos que constituyen estructuras organizadas como las placas de Peyer y el apndice. El epitelio que tapiza los folculos linfocitarios recibe el nombre de epitelio asociado al folculo (FAE: FollicleAssociated Epithelium) y se distingue del epitelio de otros sitios del intestino, por la presencia de clulas M especializadas en el transporte de antgenos, a los sitios de induccin de respuesta inmune en las mucosas (figura 16-1). Estas clulas pueden ocupar hasta el 10% del epitelio FAE en las placas de Peyer de humanos y ratones y hasta el 50% en conejos. Los enterocitos pueden tambin realizar transcitosis de macromolculas y probablemente de partculas inertes, pero este transporte parece muy poco eficiente en la estimulacin de una respuesta inmune, debido a que se realiza en sitios alejados del tejido linfoide MALT.

2. SISTEMA INMUNE DE MUCOSAS El sistema inmune de mucosas puede ser morfolgica y funcionalmente separado en dos tipos de estructuras: (i) tejido estructuralmente organizado en la forma de tejido linfoide asociado a mucosas (MALT: Mucosal-Associated Lymphoid Tissue) y (ii) tejido linfoide difuso que consiste de linfocitos intraepiteliales y clulas presentadoras de antgeno, localizados en la lmina propia del tejido mucoso. El tejido MALT representa las reas linfoides aferentes o inductivas, donde se produce el encuentro con los antgenos, su captura y procesamiento por clulas presentadoras (clulas dendrticas subepiteliales y macrfagos) y, una posterior y adecuada presentacin a linfocitos T y B, para el desarrollo de una respuesta inmune efectiva. Por su parte, las regiones de tejido difuso representan las reas linfoides eferentes donde los antgenos entran en contacto con clulas efectoras diferenciadas, anticuerpos y/o clulas citotxicas. El desarrollo, tanto del tejido linfoide estructuralmente organizado, como del tejido linfoide difuso, es altamente antgeno dependiente, de manera tal que estn

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Figura 16-1. La estructura general del tejido linfoide asociado a mucosas es representada por el esquema de una seccin transversal de placa de Peyer. El epitelio asociado al tejido linfoide (FAE) tapiza los folculos linfocitarios (placas de Peyer) y se distingue del epitelio de otras regiones del intestino, por la presencia de clulas, especializadas en el transporte de antgenos. La parte inferior de la figura, muestra un esquema ampliado del epitelio FAE (Follicle-Associated Epithelium) con clulas M que presentan un nmero reducido de microvellosidades irregulares en su regin apical y una profunda invaginacin basolateral o bolsillo intraepitelial que contiene linfocitos T, linfocitos B y eventualmente, macrfagos o clulas dendrticas.

mentos celulares necesarios para inducir y regular una respuesta inmune, pero organizados de manera tal que facilitan el desarrollo de inmunidad. Existen reas de linfocitos B (folculos B) que estn rodeadas por linfocitos T. Aunque los centros germinales contienen linfocitos B en activa divisin, existen relativamente pocas clulas plasmticas en comparacin con sitios similares de ganglios linfticos y bazo. El rea entre los folculos y el epitelio de la mucosa intestinal es rica en linfocitos B, linfocitos T, macrfagos y clulas dendrticas que estn estratgicamente ubicados para responder a los distintos antgenos, bacterias o partculas transportadas a travs del epitelio mucoso especializado ubicado por encima de las placas de Peyer. En el tracto gastrointestinal, linfocitos activados en el tejido linfoide GALT y, probablemente clulas presentadoras de antgeno, pueden adems migrar a los ganglios mesentricos que drenan las placas de Peyer, con la consiguiente expansin de la respuesta inmune puesto que diferentes clulas efectoras pueden ahora migrar a superficies mucosas y otros tejidos. Clulas efectoras tal como clulas productoras de IgA, linfocitos T helper (LTh), linfocitos T citotxicos, linfocitos T y otras poblaciones celulares migrarn a la lmina propia submucosa y al epitelio de la mucosa intestinal. La regin submucosa conocida como lmina propia, es el sitio ms importante de produccin de anticuerpos en las superficies mucosas y, se ha estimado que alrededor del 80% de las clulas productoras de anticuerpos estn localizadas en esta regin de las mucosas (figura 16-2).

Las placas de Peyer, linfondulos y apndice son los mayores sitios de induccin de una respuesta inmune contra antgenos gastrointestinales y microorganismos. Las placas de Peyer y otros linfondulos se encuentran a todo lo largo del tracto gastrointestinal, y en un gran nmero en colon y recto; existen aproximadamente 15 placas de Peyer o linfondulos por cm2 en el colon y 25 por cm2 en el recto. Sin embargo, este nmero no es estable, dado que existe una reduccin de hasta el 50% en el nmero de placas de Peyer de los 20 a los 50 aos de edad. Las placas de Peyer contienen todos los ele-

Figura 16-2. Representacin esquemtica de la respuesta inmune, en el tejido linfoide asociado a la mucosa intestinal. Antgenos o bacterias son transportados a las placas de Peyer por transcitosis a travs de clulas epiteliales especializadas (clulas M). Clulas dendrticas capturan estos antgenos para su procesamiento y presentacin a linfocitos foliculares. Linfocitos activados y eventualmente clulas presentadoras de antgeno migran luego a los ganglios linfticos que drenan las placas de Peyer y, despus de expansin y maduracin, clones linfocitarios migrarn a la lmina propia (linfocitos B comprometidos en la produccin de IgA) o al epitelio de la mucosa intestinal (linfocitos T citotxicos).

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2.2. Transporte y presentacin de antgenos La forma como los antgenos son adquiridos, procesados y presentados por clulas profesionales, es fundamental para la induccin de inmunidad a nivel de epitelios y a nivel sistmico. El tejido linfoide asociado a mucosas es morfolgicamente distinto del tejido linfoide sistmico y recibe antgenos a travs de los diversos epitelios, ms que de la circulacin linftica o sangunea. El epitelio estratificado de la cavidad oral, amgdalas, faringe, esfago, uretra y vagina carece de uniones estrechas, pero la ntima asociacin entre las clulas epiteliales y las glicoprotenas de la matriz intercelular, determinan que los epitelios sean impermeables a la mayora de los antgenos, agentes infecciosos y vacunas. Protenas o macromolculas no pueden difundir pasivamente a travs de estos epitelios estratificados. Por lo tanto, los antgenos son obtenidos por clulas dendrticas que migran y se prolongan hasta el lmite exterior del epitelio para capturar antgenos y luego presentarlos en el tejido linfoide local o en un tejido linfoide distante. En el tracto gastrointestinal, la induccin de una respuesta inmune requiere que antgenos, bacterias o partculas sean transportadas desde el lumen del epitelio hacia las placas de Peyer. La superficie mucosa del intestino est cubierta por una capa nica y continua de clulas epiteliales selladas por uniones estrechas, y cubiertas por un fuerte glicocalix formado por una capa de glicoprotenas ancladas a las membranas celulares. Se agregan adems mucinas, enzimas digestivas, lactoferrina, lisozima, pptidos antimicrobianos e IgA secretora, como mecanismos adicionales de proteccin de las superficies mucosas, formando una formidable barrera contra potenciales patgenos y antgenos. En los epitelios simples del tracto intestinal y del tracto bronquial, en los cuales los espacios intercelulares estn sellados por uniones estrechas, existen sin embargo, clulas epiteliales especializadas (clulas M) que por transporte transepitelial desde el lumen, entregan macromolculas, partculas y microorganismos, directamente al tejido linfoide asociado a la mucosa. Luego de entrar al tejido MALT, los antgenos son rpidamente capturados y procesados por clulas presentadoras de antgeno, tales como clulas dendrticas subepiteliales y macrfagos, para su presentacin a linfocitos T y B. Luego de la estimulacin

antignica, los linfocitos B proliferan y diferencian en clulas comprometidas en la sntesis y secrecin de IgA, IgM e IgE. Las clulas M se caracterizan por la presencia de microvellosidades cortas, pequeas vesculas citoplasmticas y la existencia de un gran dominio membranoso endoctico para la incorporacin de macromolculas, partculas y agentes patgenos. Sin embargo, las clulas M son altamente selectivas y no permiten la entrada de todos los antgenos o microorganismos. As, slo patgenos y toxinas bacterianas que pueden estimular los mecanismos de transporte intracelular, pueden atravesar el epitelio intestinal va clulas M, para su captura, procesamiento y presentacin por clulas dendrticas y macrfagos alojados en los bolsillos intraepiteliales. La cara basolateral de las clulas M est profundamente invaginada formando un gran bolsillo intraepitelial a travs del cual se entregan por transcitosis macromolculas y partculas. Estos bolsillos intraepiteliales pueden contener linfocitos B, linfocitos T y eventualmente macrfagos o clulas dendrticas (figura 16-1). De esta manera el transporte de antgenos solubles y partculas a travs de las clulas M, constituye el primer paso en la induccin de una respuesta inmune en las mucosas del tracto bronquial y del tracto intestinal. Las clulas M son adems, capaces de sintetizar IL-1 y, se ha sugerido que pueden proporcionar seales accesorias de coestimulacin para la activacin de linfocitos T y linfocitos B, en el tejido linfoide asociado a la mucosa. Las Clulas dendrticas ubicadas en la regin subepitelial o domo de las placas de Peyer, son probablemente las clulas ms importantes en el procesamiento y presentacin de los antgenos transportados a travs del epitelio y en la regulacin de la respuesta inmune humoral y celular que pondr en marcha en el tejido linfoide asociado a la mucosa intestinal. Las clulas dendrticas estn fundamentalmente posicionadas para capturar y procesar antgenos solubles transportados por las clulas M, mientras antgenos particulados y bacterias sern fagocitados y procesados por los macrfagos alojados en las invaginaciones de las clulas M. Antgenos ya degradados sern luego liberados por los macrfagos, para su captura y presentacin por las clulas dendrticas subepiteliales. Se produce as una colaboracin entre clulas dendrticas y macrfagos para la induccin de una respuesta inmune protectora: los macrfagos induciran fundamentalmente una res-

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puesta Th1 con la consiguiente activacin de linfocitos T citotxicos, mientras las clulas dendrticas seran responsables de la induccin de una respuesta Th2 con la consiguiente activacin de linfocitos B y un switching isotpico (cambio de clase) preferencial hacia anticuerpos IgA (ver captulos 6 y 14).

3. FUNCIONES EFECTORAS DE LA INMUNIDAD DE MUCOSAS Luego de la estimulacin antignica en los sitios de induccin, clulas efectoras antgeno especficas, abandonan el tejido MALT va vasos linfticos aferentes y alcanzan la circulacin sangunea va conducto torcico. Desde ah se diseminan hacia los sitios efectores de respuesta inmune, en la lmina propia y el epitelio de mucosas de los tractos respiratorio, gastrointestinal y genitourinario (figura 16-2). Las clulas efectoras incluyen clulas plasmticas productoras de IgA, clulas productoras de IgM y, eventualmente clulas comprometidas en la sntesis y secrecin de IgE. Se agregan linfocitos efectores T de colaboracin y T citotxicos, adems de linfocitos T y otras clulas. En adultos, alrededor del 80% de los linfocitos B activados, se localizan en la lmina propia. Los otros linfocitos residen en el epitelio y se les conoce como linfocitos intraepiteliales, que cumplen tanto funciones efectoras, como funciones inmunorreguladoras. 3.1. Respuesta inmune de anticuerpos Una caracterstica fundamental de la inmunidad de mucosas es la produccin local de IgA, que constituye ms del 80% de los anticuerpos en los tejidos mucosos, en los cuales son inducidos, transportados y regulados por mecanismos distintos de aqullos que caracterizan a la inmunidad sistmica. La IgA de secrecin es de primaria importancia en la defensa inmunolgica y acta no slo en la resistencia a agentes patgenos restringidos a mucosas, sino tambin contra microorganismos que producen infecciones sistmicas, a pesar que inicialmente colonizan superficies mucosas (especialmente en los tractos respiratorio o gastrointestinal). La IgA de secrecin corresponde a un homodmero unido por una cadena J; el denomi-

nado componente secretor la protege de la accin de proteasas en las secreciones (ver captulo 6). Luego de la activacin por el antgeno, los linfocitos B proliferan y hacen switching isotpico a clulas comprometidas en la produccin de IgA, las cuales eventualmente abandonan el tejido linfoide asociado a la mucosa y migran al sitio inicial de induccin de la respuesta inmune para su diferenciacin final en clulas plasmticas secretoras de IgA (figura 16-3). As, linfocitos B, comprometidos en la secrecin de IgA, migrarn desde el tejido linfoide nasofarngeo, al tracto digestivo alto, mientras el tracto genitourinario recibe preferentemente clulas productoras de IgA desde el tracto digestivo bajo. El tracto gastrointestinal recibe en cambio clulas desde GALT. La migracin preferencial hacia las mucosas, de linfocitos estimulados en el tejido linfoide asociado al epitelio, se asocia claramente a la expresin de molculas de adhesin especficas en los linfocitos y, de sus respectivos ligandos en clulas endoteliales de vasos sanguneos de tejido mucoso y/o en clulas epiteliales de la mucosa. La principal funcin de la IgA secretada es mantener la integridad de las barreras mucosas de potenciales agentes infecciosos o txicos. En el lumen, la IgA secretada puede neutralizar virus, toxinas bacterianas, enzimas y prevenir la entrada de virus, la adherencia microbiana y la absorcin de antgenos. Durante su transporte a travs de las clulas epiteliales de las mucosas, los dmeros de IgA pueden unir antgenos intracelulares e inhibir el ensamblaje de algunas partculas virales. En la lmina propia, la IgA dimrica elimina antgenos que cruzan la barrera epitelial, unindose a ellos y transportndolos a lumen o va hepatocitos hacia el conducto biliar. Adems, como consecuencia de su resistencia a la proteolisis y alta avidez por el mucus, la IgA secretada retiene sus capacidades de unin y transporte en las secreciones mucosas. Aunque la secrecin de IgA es un componente importante de la inmunidad de mucosas, la respuesta mediadas por IgE est tambin asociada con la exposicin transmucosal a antgenos (alergenos). Alergias alimentarias y asma, son ejemplos comunes de reacciones mediadas por IgE, luego de la exposicin a antgenos en las superficies mucosas. Respuestas IgE especficas, son tambin importantes en la defensa contra enfermedades parasitarias.

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Figura 16-3. Movilizacin de linfocitos desde sitios de induccin de la respuesta inmune en los tejidos inmunes MALT a los sitios efectores de la respuesta inmune. Luego de la estimulacin antignica en los sitios de induccin de una respuesta inmune en las mucosas (GALT, BAT, NALT), linfocitos activados clulas abandonan el tejido linfoide va vasos linfticos aferentes, para alcanzar la circulacin sangunea a travs del conducto torcico. Va sistmica, los distintos clones linfocitarios pueden ahora diseminarse a los distintos sitios efectores de la respuesta inmune (epitelio y lmina propia de mucosas y glndulas excretoras).

3.2. Respuesta inmune celular La induccin de una respuesta inmune efectiva a nivel de mucosas, requiere la activacin de linfocitos T especficos, los cuales no slo contribuyen a la eliminacin de infecciones, sino tambin proporcionan las seales accesorias de coestimulacin para la diferenciacin de linfocitos B, en clulas productoras de IgA o IgE y la secrecin de citoquinas y quimioquinas esenciales en el desarrollo de la respuesta inmune. Linfocitos Th. Los LTh son mediadores cruciales en la induccin de una respuesta inmune humoral y/o celular a nivel de mucosas y su polarizacin hacia linfocitos Th1 o Th2 est influenciada por citoquinas, quimioquinas y otras molculas expre-

sadas por clulas dendrticas y/o macrfagos. Linfocitos Th1, linfocitos Th2 o una combinacin de ambos, parecen importantes en la mantencin de la respuesta IgA secretada. La respuesta Th2 es importante para la diferenciacin terminal de los linfocitos B y citoquinas como interfern gamma (IFN-) producida por linfocitos Th1, parece inducir la expresin del receptor de Ig polimricas, requerido para el transporte de IgA en las mucosas. La induccin de una respuesta Th1 es esencial en la proteccin contra patgenos intracelulares. La respuesta Th2 en cambio, parece ms importante en la proteccin de patgenos como Helicobacter pylori y de parsitos helmintos y en el control de enfermedades inmunomediadas como los desrdenes autoinmunes rgano-especficos y la enfermedad de Crohn.

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La subpoblacin Th2 proporciona seales accesorias de coestimulacin para la activacin de linfocitos B y el cambio de clase hacia anticuerpos de isotipos IgA e IgE, mediante la expresin de molculas de adhesin y la secrecin de citoquinas como IL-4, IL-5, IL-6 IL-10 e IL-13. Aunque las citoquinas Th2 desempean un rol importante en la diferenciacin de linfocitos B comprometidos en la produccin de IgA, el factor transformante beta (TGF-), producido por LTh1 y otras clulas, es fundamental en el switching IgA. Desafortunadamente, TGF- tambin suprime la proliferacin de linfocitos y as, ratones deficientes en este factor, mueren como consecuencia de una masiva enfermedad linfoproliferativa dentro de las primeras 4 semanas de vida. La subpoblacin Th1 en cambio, se caracteriza por la secrecin de IL-12, linfotoxina, factor estimulador de colonias granulocito-monocito (GM-CSF) e IFN- y determina la inmunidad celular regulando la funcin de macrfagos y clulas T citotxicas, que resultan particularmente importantes en el control de agentes patgenos intracelulares que penetran las mucosas. Los linfocitos Th1 estimulan adems el switching isotpico hacia subclases de IgG, que caracteriza la respuesta sistmica inducida como consecuencia secundaria de la activacin del sistema inmune asociado a mucosas. Luego de su transporte a travs de clulas M, bacterias intracelulares que afectan la mucosa del tracto intestinal (como Salmonella), penetran en las placas de Peyer para infectar y sobrevivir en los macrfagos. Macrfagos infectados producirn IL-12 que promueve el desarrollo de una respuesta Th1 con la consiguiente produccin de linfotoxina e IFN- que determinan la activacin de los macrfagos infectados y de linfocitos T citotxicos. Linfocitos Tc. En la mucosa del tracto intestinal, cerca del 80% de los linfocitos intraepiteliales pertenecen a la subpoblacin T CD8+, en contraste a lo que ocurre en la lmina propia, donde la mayora de los linfocitos T residentes pertenecen a la subpoblacin T CD4+. Los linfocitos T de la subpoblacin T, puede alcanzar hasta el 50% de los linfocitos intraepiteliales en algunas cepas de ratones; pero en humanos los linfocitos T pueden constituir slo cerca del 13% de los linfocitos intraepiteliales

4. INMUNIZACIN MUCOSAS

TRAVS

DE

La estimulacin adecuada del sistema inmune asociado a la mucosa es un requisito indispensable para el desarrollo de una proteccin efectiva de las superficies mucosas contra la colonizacin e invasin por diferentes agentes patgenos. La eficacia con la cual los antgenos administrados por va oral son transportados a travs del epitelio intestinal depende de la sobrevida de las molculas en el ambiente hostil del tracto gastrointestinal. El acceso a la membrana de las clulas epiteliales es inhibido por la capa de mucus, por el empaquetamiento apretado de las microvellosidades y por el glicocalix celular. Todas estas estructuras en conjunto retienen diversas enzimas y crean un ambiente altamente degradativo en la regin apical de las clulas epiteliales y se hace, por lo tanto, indispensable que los antgenos persistan en el lumen intestinal el tiempo necesario para un eficiente contacto con las clulas epiteliales y su posterior transporte hacia el tejido MALT. Como consecuencia de lo anterior, el desarrollo de un sistema exitoso de inmunizacin a travs de las mucosas debe cumplir una serie de requerimientos: (i) el sistema debe ser resistente al ambiente enzimtico y hostil del tracto gastrointestinal y debe ser capaz de guiar los antgenos a travs de la capa mucosa hasta los sitios de induccin que contienen clulas presentadoras de antgeno para el desarrollo de una respuesta inmune efectiva y no de tolerancia, (ii) la respuesta debe inducir inmunidad local en la mucosa (y en algunos casos en sitios efectores de mucosas distantes), adems del desarrollo de una fuerte inmunidad sistmica y (iii) debe activar mecanismos efectores que incluyan la produccin de citoquinas y el desarrollo de una respuesta local (anticuerpos IgA) y sistmica (IgG) y de una respuesta Th1 que incluya la activacin de linfocitos T citotxicos para la proteccin contra agentes infecciosos intracelulares. Se han desarrollado as, diversas estrategias para prolongar la permanencia en el intestino de drogas y vacunas administradas por va oral. Se han utilizado, por ejemplo, bioadhesinas como lectinas y adhesinas bacterianas que se unen al mucus intestinal (muco-adhesinas) o a la regin apical de las clulas del epitelio intestinal. De manera similar se han desarrollado partculas sintticas como liposomas, ISCOMs (Immune

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Stimulating Complex) y micropartculas del copolmero poli-DL-lactide-co-glycolide, y diversos vehculos recombinantes vivos, de origen viral (Vaccinia, Herpes, Adenovirus, Poxvirus) o bacteriano (Salmonella), destinados a la proteccin de los antgenos recombinantes extraos, del ambiente hostil intraluminal del intestino. Adems la conjugacin de antgenos con ligandos como lectinas, adhesimas microbianas o anticuerpos, que se unen a receptores de membrana de las clulas M, constituyen una excelente estrategia para facilitar el transporte de antgenos a travs del epitelio. 4.1. Uso de adyuvantes Los antgenos administrados a travs de las mucosas, son generalmente poco inmuno-

gnicos y requieren, por lo tanto, adyuvantes que al ser coadministrados con los antgenos, estimularn el desarrollo de una respuesta inmune protectora. Los adyuvantes pueden aumentar la vida biolgica o inmunognica de los distintos antgenos, facilitar su transporte y captura a travs de los epitelios, estimular la produccin de citoquinas y el desarrollo de una respuesta Th1 y/o Th2. En la tabla 16-1 se muestra algunos adyuvantes que se han usado con xito en diferentes modelos experimentales y utilizando distintas vas de inmunizacin a travs de mucosas.

Tabla 16-1. Adyuvantes que, coadministrados en el antgeno, estimulan el sistema inmune asociado a mucosas Adyuvante Toxinas bacterianas* Modelo experimental Ruta de inmunizacin Antgeno utilizado Ratn Ratn Ratn Ratn IL-12 Muramyl dipptido CpG oligonucletidos Avridina MonofosforilLpido A Almina MF59 Ratn Ratn Rata Ratn Ratn Rata Ratn Rata Ratn Ratn Ratn Oral o intranasal Intranasal Oral Intranasal Intranasal Oral, intranasal Intraintestinal Intranasal Oral Intraintestinal Intraintestinal Intraintestinal Intranasal Intranasal Intranasal Virus papiloma humano Protena de H. nfluenzae Ureasa recombinante de H. pylori Pptido sinttico de Virus Respiratorio Sincicial Vacuna influenza Toxina tetnica Rotavirus y Virus Sendai Porina de N. gonorrhoeae Ag superficie Hepatitis B Virus influenza muertos Toxina del clera Ovoalbmina Toxina del clera Toxoide tetnico Subunidad de vacuna virus influenza Protena envoltura Virus Respiratorio Sincicial

* Toxina del clera producida por V. cholerae y Txina lbil al calor producida por E. coli. ISCOM, Immune Stimulating Complex.

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5. TOLERANCIA INDUCIDA A TRAVS DE MUCOSAS La infeccin con patgenos que afectan las mucosas conduce generalmente al desarrollo de una activa respuesta inmune protectora. Sin embargo, la administracin oral de antgenos solubles puede conducir al fenmeno llamado tolerancia oral, que se caracteriza por la ausencia de respuesta inmune perifrica, luego de la inoculacin sistmica del mismo antgeno. La tolerancia oral parece afectar tanto a la inmunidad humoral como a la inmunidad celular, pero el tipo de respuesta tolerada parece depender de la naturaleza del antgeno y de su forma de ingestin. As, la respuesta celular y la respuesta humoral mediada por IgE se hacen fcilmente tolerantes con bajas dosis de antgeno. La tolerancia de tipo IgM o IgG ocurre en cambio, con altas dosis de antgeno. La tolerancia oral puede producirse por deleccin de clones linfocitarios, anergia clonal o debido a una activa supresin de la respuesta inmune producida por factores liberados por linfocitos T (Ej.:TGF-). La tolerancia oral, mediada por anergia o deleccin clonal, se produce fundamentalmente a altas dosis de antgeno. La ingestin de bajas dosis de antgeno, conduce en cambio a tolerancia mediada por subpoblaciones linfocitarias T CD4+ y T CD8+ que suprimen activamente el desarrollo de una respuesta inmune o de una respuesta inflamatoria. Aun cuando la tolerancia puede constituir una dificultad en el desarrollo de vacunas que se administren por va oral, la habilidad de la tolerancia oral para prevenir reacciones adversas puede utilizarse para tratar diferentes enfermedades inmunolgicas y/o inflamatorias, incluyendo enfermedades autoinmunes y el rechazo al trasplante de tejidos.

Chen, H., Recent advances in mucosal vaccine development, J. Controll. Rel. 67: 117-128, 2000. Hoyne, G. F., et al., Immunological tolerance to inhaled antigens, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162: 5169-5174, 2000. Jepson, M.A., Clark, M.A. Studying M cells in Peyers patches of the intestine, Int. Rev. Cytol. 167: 91-159, 1998. Kaiserlian, D., Etchart, N., Entry sites for oral vaccines and drugs: a role for M cells, enterocytes and dendritic cells?, Semin. Immunol. 11: 217-224, 1999. Kraehenbuhl, J.P., Neutra, M.R., Epithelial M cells: Differentiation and function. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 16: 301-332, 2000. McCluskie, M.J., Davis, H.L. Mucosal immunization with DNA vaccines, Microbes and Infection 1: 685-698, 1999. Reseigno, M., Borrow,P. The host-pathogen interaction: New Themes from Dendritic Cell Biology, Cell 106: 267-270, 2001. Strobel, S., Mowat, A.M., Immune response to dietary antigens: oral tolerance. Immunol. Today 19: 173-181.,1998. Vasquez-Torres, A., Fang, F.C., Cellular routes of invasion by enteropathogens Curr. Opin. Immunol. 3: 54-59, 2000.

LECTURAS SUGERIDAS Brandtzaeg, P., et al., Regional specialization in the mucosal immune system: what happens in the microcompartments?, Immunol. Today 20: 141151, 1999. Brandtzaeg, P., Farstad, I.N., Haraldsen, G., Regional specialization in the mucosal immune system: primed do not always home along the same track, Immunol Today 20: 267-277, 1999.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 17
INMUNOLOGA DE LA REPRODUCCIN
Mnica Imarai B. y Juana Villegas M.

1. Introduccin 2. El sistema inmune asociado a la mucosa reproductiva 2.1. El sistema inmune asociado a la mucosa reproductiva de la hembra 2.2. El sistema inmune asociado a la mucosa reproductiva del macho 3. Induccin de la respuesta inmune en la mucosa reproductiva 3.1. Induccin de la respuesta inmune en la mucosa reproductiva de la hembra 3.2. Respuesta inmune a las infecciones en la mucosa reproductiva de la mujer

4. El sistema inmune local en el embarazo 4.1. La Interfase materno fetal 4.2. Expresin de MHC en las clulas trofoblsticas 4.3. Las clulas NK de la decidua 4.4. Los linfocitos T de la decidua 4.5. Citoquinas en la preez 5. Factores inmunolgicos que afectan la fertilidad 5.1. Aborto espontneo recurrente de causa inexplicada 5.2. Anticuerpos antiespermticos

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RESUMEN El sistema inmune asociado a la mucosa reproductiva de los mamferos constituye la primera lnea de defensa frente a infecciones que afectan al tracto reproductor. Las clulas inmunocompetentes presentes en la mucosa reproductiva del macho y de la hembra (incluido el ser humano), estn constituidas por linfocitos T y B, macrfagos, clulas dendrticas, y en el tero, por clulas pertenecientes al linaje de las clulas NK. Los microorganismos patgenos infectan a travs de los epitelios y pueden alcanzar las clulas del estroma, en donde clulas presentadoras como los macrfagos y clulas dendrticas inducen la respuesta inmune. Algunos de los epitelios que expresan MHC clase II podran tambin presentar antgenos al sistema inmune. La inmunidad humoral mediada por IgA e IgG juega un papel fundamental en la proteccin a la infeccin por algunos microorganismos como N. gonorrhoeae, mientras que para microorganismos de infeccin intracelular como Chlamydias y virus Herpes, la inmunidad mediada por clulas (Th1), tiene una funcin importante en la eliminacin del patgeno. En los mamferos, la capacidad del sistema inmune local de reconocer y eliminar elementos inmunolgicamente extraos debe regularse para evitar el rechazo del feto durante el embarazo o preez. Algunos mecanismos parecen estar relacionados con la ausencia de MHC clase II y clase I polimrficos en el tejido fetal que se encuentra en contacto con las clulas inmunocompetentes maternas (trofoblasto). Adems, la presencia de MHC clase I no polimrficos en el trofoblasto, podra mantener seales inhibitorias para la poblacin NK de la decidua, que son las clulas inmunocompetentes ms abundantes durante la preez. Por otro lado, la desviacin de la respuesta inmune hacia la activacin de clulas Th2 y la presencia de citoquinas inmunosupresoras tambin contribuyen a mantener una relacin de tolerancia al feto. Alteraciones de esta condicin de inmunotolerancia podran generar algunas patologas del embarazo en la mujer como el aborto espontneo recurrente y tanto en mujeres como en hombres, infertilidad mediada por anticuerpos antiespermticos.

1. INTRODUCCIN Dos de las ms interesantes reas del conocimiento en el campo de la Inmunologa de la Reproduccin son la respuesta inmune a las infecciones del tejido reproductivo y la inmunobiologa del embarazo o preez. La problemtica de las infecciones por diversos microorganismos patgenos que producen enfermedades de transmisin sexual, entre las que se incluye el SIDA, ha motivado el desarrollo de la investigacin destinada a caracterizar el sistema inmune local asociado a la mucosa reproductiva, conocer los mecanismos de induccin de respuesta inmune local y los mecanismos de inmunidad frente a las infecciones. Por otro lado, se ha desarrollado un creciente inters en entender cmo opera el sistema inmune durante el embarazo y los complejos me-

canismos de regulacin que llevan a la madre a tolerar al feto, en la creencia de que este conocimiento permitir desarrollar exitosas terapias de tratamiento para la infertilidad. En este captulo se describe el sistema inmune local asociado a la mucosa reproductiva del macho y de la hembra y la induccin de respuesta inmune frente a algunos microorganismos. Adems, se analiza las caractersticas del sistema inmune local de la madre durante el embarazo y la posible regulacin relacionada con los tejidos fetales. Por ltimo, se describe algunos aspectos del sistema inmune local que se asocian a infertilidad.

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2. EL SISTEMA INMUNE ASOCIADO A LA MUCOSA REPRODUCTIVA 2.1. El sistema inmune asociado a la mucosa reproductiva de la hembra En la hembra de especies como el ratn, la rata y en la especie humana, los leucocitos son componentes normales de la mucosa del oviducto, tero y vagina. Los leucocitos son linfocitos T del fenotipo CD4+ y CD8+, macrfagos y granulocitos, y se encuentran dispersos en el estroma de la mucosa. Tambin se encuentran linfocitos distribuidos en el tejido epitelial. Los leucocitos propios de la mucosa reproductiva tambin residen en los ganglios linfticos regionales que drenan estos rganos, pudiendo recircular a otros tejidos mucosos (ver captulo 16). En la mujer, el tejido linfoide del tero tiene caractersticas que dependen del ciclo menstrual. En el estrato basal del endometrio, que no presenta variacin con el ciclo, la poblacin leucocitaria corresponde principalmente a linfocitos T, linfocitos B, macrfagos y ocasionalmente clulas natural killer (NK). Los leucocitos se encuentran en agregados, generalmente adyacentes a las glndulas y dispersos en el estroma, con excepcin de los linfocitos B que slo se encuentran en

los agregados leucocitarios. En el estrato funcional del endometrio, los leucocitos son linfocitos T, macrfagos y linfocitos granulares grandes (LGL: CD56+ CD16-). Estas clulas LGL son una poblacin caracterstica del endometrio y pertenecen al linaje de las clulas NK. Por su parte, los linfocitos B, clulas plasmticas y clulas NK convencionales, son muy escasos en este tejido y los granulocitos polimorfonucleares slo aparecen durante la menstruacin. En esta zona del endometrio, la proporcin y distribucin de los leucocitos vara segn la fase del ciclo (figura 171). En la fase proliferativa y secretora temprana, los leucocitos constituyen el 10% de las clulas totales del estroma y se encuentran ms bien dispersos en el tejido, mientras que en la fase secretora tarda, stos constituyen ms del 20% de las clulas estromales y se encuentran agregadas, adyacentes a las glndulas y vasos sanguneos. Este incremento se debe en gran parte al aumento de LGL y a un pequeo aumento en el nmero de macrfagos. Los linfocitos T, dispersos en el estroma, epitelio glandular y superficial del endometrio, no varan durante las fases del ciclo menstrual. Tal como ocurre en la mucosa gastrointestinal y respiratoria, el sistema inmune local del tracto reproductor responde frente a los antgenos

Figura 17-1 Variacin de las poblaciones leucocitarias en el estrato funcional del endometrio durante las fases del ciclo menstrual y embarazo temprano. La poblacin leucocitaria del endometrio aumenta en la fase secretora del ciclo menstrual. Los leucocitos que aumentan son los linfocitos granulares grandes (LGL) y, en menor magnitud, los macrfagos.

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secretando inmunoglobulinas a la superficie mucosa. En estos sitios, la primera lnea de defensa frente a las infecciones son las inmunoglobulinas. En la mucosa reproductiva de la mujer, las inmunoglobulinas estn presentes en el fluido oviductal, secrecin uterina, moco cervical, fluido cervico-vaginal y fluido vaginal. Las inmunoglobulinas secretadas son del isotipo IgG e IgA y, en menor proporcin, IgM. La IgG es transferida desde el suero por difusin intercelular, endocitosis de fase fluida y otros mecanismos que en conjunto se denominan transudacin. La IgA se produce localmente en las clulas plasmticas del estroma de la mucosa reproductiva y se une al receptor de inmunoglobulinas polimricas presente en la cara basal del epitelio de estos rganos. El complejo IgA-receptor es transportado en vesculas a travs del epitelio y la inmunoglobulina es liberada en el lumen unida a un polipptido derivado de la protelisis del receptor. Este polipptido se denomina componente secretor y permanece unido a la IgA. Esta forma de inmunoglobulina se denomina IgA secretada (IgAs) (ver captulo 6). La presencia de clulas plasmticas productoras de IgA y del receptor de inmunoglobulinas polimricas (receptor Igp), no es uniforme en los diferentes rganos del tracto reproductor de la mujer, existiendo adems importantes diferencias entre especies (tabla 17-1). En el oviducto, endocervix y vagina de la mujer existen numerosas clulas plasmticas productoras de IgA, pero el receptor Igp slo se encuentra en el epitelio columnar simple del oviducto y endocervix y no existe en los epitelios estratificados de la vagina y ectocervix. Esto indica que los rganos que pro-

ducen y secretan IgA en la mucosa reproductiva de la mujer son principalmente el oviducto y el endocervix. En el tero, las clulas plasmticas productoras de IgA son ms bien escasas por lo que en este rgano la IgA debe ser transportada desde el suero. Una excepcin notoria a la generalidad de las especies es la que se observa en el tero del ratn, donde el estroma uterino contiene numerosas clulas plasmticas productoras de IgA, lo que asociado a la presencia del receptor en el epitelio indica que esta inmunoglobulina se produce localmente. No se conoce el significado fisiolgico de estas diferencias entre especies. Aparte de las inmunoglobulinas, en los rganos reproductivos de la hembra se produce una gran variedad de citoquinas (ver captulo 11). Las citoquinas tienen la funcin de promover la proliferacin celular y recambio del tejido, de establecer comunicacin entre las clulas y entre los sistemas reproductivo e inmune y de regular la respuesta inmune local. Todas estas funciones son necesarias en el tracto reproductor. En el tero de la mujer se sintetizan en abundancia Factor estimulador de colonias 1 (CSF-1), Factor de crecimiento epidermal (EGF), Factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), Factor de necrosis tumoral (TNF-), Factor transformador de crecimiento (TGF-), Interleuquina 1 (IL-1), Interleuquina 2 (IL-2), Interfern (IFN) y Factor transformador de crecimiento (TGF-). Algunas de las funciones propuestas para estas citoquinas son el reclutamiento de macrfagos, estimulacin o inhibicin de la proliferacin, angiognesis, diferenciacin trofoblstica, desarrollo del miometrio, funcin en la implantacin y menstruacin, etc. Algunos de los genes que codifican para estas

Tabla 17-1. Clulas plasmticas (CP) secretoras de IgA y componente secretor (CS), en el tracto reproductor de la mujer Especie Oviducto CP Humana Ratn Rata Equina + + ND + CS + ND ND CP ++ + tero CS + + + + Cervix CP ++ +/+ CS +/+ + Vagina CP + +/+ CS Trazas + + -

ND: no determinado Tabla adaptada de Parr MB, Parr EL (1997)

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citoquinas contienen sitios de respuesta a estrgenos, indicando que en los rganos reproductivos existe una relacin de regulacin muy estrecha entre los niveles de hormonas esteroidales sexuales y las citoquinas producidas localmente. Los niveles de estradiol y/o progesterona regulan la sntesis uterina de CSF-1, EGF, FGF, TNF, TGF, IL-6 e IFN. 2.2. El sistema inmune asociado a la mucosa reproductiva del macho El tejido mucoso del epiddimo, de glndulas accesorias (prstata, vescula seminal y glndula bulbo-uretral) y de la uretra del hombre, contiene tambin las clulas efectoras y presentadoras del sistema inmune, tales como macrfagos, linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+. Adems, la uretra contiene gran nmero de clulas plasmticas productoras de IgA indicando que este rgano, que es puerta de entrada para infecciones por diversos microorganismos, tiene gran actividad en la respuesta inmune local. La secrecin prosttica y lquido seminal contienen inmunoglobulinas del isotipo IgG e IgA. Tambin puede detectarse pequeas cantidades de IgM en el fluido prosttico. La presencia de componente secretor asociado a la IgA indica que este isotipo de inmunoglobulina es de origen local. La uretra masculina tambin contribuye a la produccin local de inmunoglobulinas ya que, adems de las clulas plasmticas productoras de IgA, contiene el receptor Igp, presente adems en el tejido epitelial. Varias citoquinas son sintetizadas en el testculo y glndulas accesorias. Algunas como CFS1, IFN-, IFN-, IL-1, IL-1, TNF y TGF podran tener funciones de regulacin de la respuesta inmune local de la mucosa reproductiva masculina. Sin embargo, esto slo se ha demostrado en el caso de CFS-1, porque los ratones deficientes en CSF-1 knock-out, presentan ausencia o extremada disminucin de macrfagos en el tejido reproductivo.

de experimentacin. Por lo tanto, en esta seccin slo se describe la respuesta inmune local en el tracto reproductor femenino. 3.1. Induccin de la respuesta inmune en la mucosa reproductiva de la hembra Una etapa crtica en la induccin de la respuesta inmune es la incorporacin y presentacin de antgenos. En el tracto reproductor femenino, el antgeno se incorpora a la mucosa a travs del epitelio donde aparentemente no existen clulas especializadas para ello, como son las clulas M del intestino delgado. Donde mejor se ha descrito este proceso es en el ratn. La incorporacin del antgeno al epitelio en la vagina y cervix del ratn es dependiente de los niveles de estradiol y progesterona, de manera que sta ocurre en mayor magnitud en diestro y preez temprana. Las protenas presentes en el tero del ratn y rata, son endocitadas en el epitelio en perodos progestacionales, incluyendo preez temprana y tambin en sitios inyectados con progesterona. Durante el estro y despus de la administracin de estradiol no se produce incorporacin de protenas al epitelio. Las clulas epiteliales del cervix, tero y oviducto de varias otras especies, incluyendo el humano, tambin endocitan protenas, partculas y bacterias. En estos casos, no est claramente definida la influencia de las hormonas esteroidales sexuales en el proceso. Una vez que el antgeno ha ingresado al estroma de la mucosa, las clulas presentadoras de antgenos que infiltran el tejido (clulas de Langerhans, clulas dendrticas y macrfagos), pueden a su vez incorporar, procesar y presentar el antgeno a los linfocitos de la mucosa o de los glanglios regionales, induciendo la respuesta inmune local. Se ha postulado que las clulas epiteliales tambin pueden procesar y presentar antgenos. El epitelio uterino y oviductal de la mujer y hembras de otras especies, contienen en su superficie molculas MHC de clase II y molculas coestimuladoras como ICAM-1 e ICAM-2 (ICAM: Molcula de adhesin intercelular). Sin embargo, hasta la fecha no hay evidencias directas que demuestren que estas clulas epiteliales induzcan efectivamente activacin de linfocitos T frente a un antgeno especfico. Los estudios realizados en la mujer y en animales de experimentacin revelan que despus de la inmunizacin local con protenas y microorganismos, se puede inducir secrecin de inmunoglo-

3. INDUCCIN DE LA RESPUESTA INMUNE EN LA MUCOSA REPRODUCTIVA La induccin de la respuesta inmune en las mucosas del sistema reproductor se conoce mucho mejor en el tracto reproductor de la mujer y de las hembras de algunas especies de animales

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bulinas especficas (IgA e IgG), en la mucosa reproductiva. Esto indica que en este tejido mucoso existen todos los elementos para la presentacin y reconocimiento del antgeno. Cuando la inmunizacin se realiza va sistmica se produce una baja o nula respuesta en la mucosa, mientras que la inmunizacin en otros tejidos mucosos como el rectal y la cavidad peritoneal, produce incluso mejores niveles de respuesta en la mucosa reproductiva. Esto se debe a que existe un sistema inmune mucoso comn, en el que las clulas inmunocompetentes circulan y colonizan todos los tejidos mucosos (ver captulo 16). La induccin de respuesta inmune celular mediada por los linfocitos helper tipo Th1 (ver captulos 11 y 14) tambin ocurre en la mucosa reproductiva de la mujer y de animales de experimentacin. Los linfocitos Th1 estimulan la activacin de macrfagos, linfocitos citotxicos y produccin de anticuerpos que activan el complemento. Estos mecanismos efectores son los ms importantes en la eliminacin y resistencia a la infeccin por microorganismos intracelulares. 3.2. Respuesta inmune a las infecciones en la mucosa reproductiva de la mujer Los microorganismos que producen infecciones de transmisin sexual, como Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, virus Herpes simplex 2 y otros virus que producen infecciones sistmicas como el virus de la inmune deficiencia humana (HIV), hepatitis B y hepatitis C, infectan la mucosa del tracto reproductor del hombre, de la mujer y de animales de experimentacin. La infeccin involucra unin, invasin, replicacin y transporte de los patgenos al tejido subepitelial, donde normalmente inducen respuesta inmune local. En esta seccin, se describe a modo de ejemplo algunas caractersticas de la respuesta inmune local, que se produce frente a los tres microorganismos que infectan con mayor frecuencia el tracto reproductor de la mujer: Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae y virus Herpes simplex 2. En el hombre la respuesta inmune a la infeccin ha sido mucho menos estudiada y no se describe en esta seccin. Chlamydia trachomatis infecta el cuello uterino de la mujer y ocasionalmente asciende al endometrio y la trompa de Fallopio. La persistencia de la infeccin puede llegar a producir salpingitis e infertilidad. La respuesta inmune a la infeccin es de tipo humoral, sistmica y local, y

de tipo celular, mediada por linfocitos Th1 y por linfocitos T CD8+. En la respuesta de tipo humoral, se producen anticuerpos contra la protena principal de membrana externa. Las inmunoglobulinas especficas son secretadas y se detectan en el moco cervical de la mujer. Estos anticuerpos neutralizan la infeccin de clulas en cultivo o la infeccin de animales de experimentacin, adems, la presencia de estos anticuerpos en las secreciones se correlaciona con un menor nmero de Chlamydias recuperadas desde el cuello uterino. Esta correlacin no se produce con las imunoglobulinas IgG e IgM especficas presentes en el suero, sugiriendo que son los anticuerpos producidos localmente, presentes en las secreciones del tracto reproductor, los que estn involucrados en la eliminacin del patgeno. Respecto a la respuesta inmune celular, se ha demostrado que tanto en la mujer como en el ratn, siendo los linfocitos Th1 los mediadores ms importantes en la eliminacin y resistencia a la infeccin por Chlamydias. Los linfocitos Th1 estimulan la activacin de macrfagos, linfocitos citotxicos y produccin de anticuerpos que activan el complemento. Adems, estos linfocitos producen IFN- que tiene efectos citotxicos en las clulas infectadas por Chlamydias. Se ha encontrado que animales deficientes en IFN- o que no expresan el receptor para IFN-, eliminan ms lentamente a la bacteria. Los linfocitos T citotxicos CD8+ tambin reconocen clulas infectadas por Chlamydias. Sin embargo, ratones deficientes en estos linfocitos controlan la infeccin por Chlamydias, indicando que la deficiencia es compensada por la respuesta celular mediada por macrfagos y por la produccin de inmunoglobulinas especficas en el tracto reproductivo del ratn. Neisseria gonorrhoeae infecta la mucosa del cuello uterino y de la trompa de Fallopio de la mujer. En este caso se ha caracterizado muy bien la respuesta inmune humoral pero no se sabe si la respuesta inmune celular juega un papel importante en la proteccin. En la mujer, las infecciones por esta bacteria inducen anticuerpos de los isotipos IgA e IgG, detectables en la secrecin cervico-vaginal. La IgA es producida localmente por las clulas plasmticas que invaden el estroma del endocervix y las trompas de Fallopio cuando se produce la infeccin. El mecanismo efector de las inmunoglobulinas es diferente segn el isotipo y las caractersticas de la mucosa reproductiva. IgA e IgG pueden activar el complemento presente en

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la secrecin cervical que durante la infeccin por N. gonorrhoeae se encuentra activado y unido a la bacteria. La opsonizacin mediada por IgG promueve la fagocitosis por neutrfilos, mientras que, IgA funciona principalmente neutralizando una variedad de molculas y de esta manera inhibiendo la unin de la bacteria a los epitelios y la infeccin. Adems, los complejos inmunes formados por IgA y antgeno estimulan la produccin de secrecin mucosa, lo que contribuye a impedir el acceso del patgeno desde el canal cervical a la cavidad uterina. El virus Herpes simplex 2 infecta la mucosa oral y reproductiva del ser humano. Despus de la infeccin primaria se localiza en los ganglios sensoriales desde donde puede reinfectar la mucosa. Como respuesta a la infeccin por virus Herpes simplex 2 se producen IgG e IgA sricas que reconocen glicoprotenas de la envoltura y cpside viral. En las secreciones cervicales, se observa una respuesta IgG, IgA e IgM de especificidad similar a la de las inmunoglobulinas sricas. El papel que estas inmunoglobulinas juegan en proteccin no est claro, sin embargo, estos anticuerpos diluidos pueden bloquear in vitro la infeccin de clulas epiteliales, indicando que in vivo se encuentran en concentracin suficiente como para proteger de la infeccin. La concentracin de IgA producida localmente se ha correlacionado con la disminucin de partculas virales recuperadas del tracto reproductor de la mujer, sugiriendo que esta inmunoglobulina estara involucrada en la eliminacin del virus. La infeccin de la mucosa reproductiva por virus Herpes simplex 2 produce estimulacin de linfocitos T CD4+ Th1 y de linfocitos T citotxicos (CD8+) en la mujer y en ratones. Estos linfocitos se encuentran en las lesiones y en los ndulos linfticos regionales y transferidos a animales no inmunes, producen proteccin de la infeccin.

induccin de tolerancia inmune al feto. 4.1. La interfase materno fetal Una caracterstica fundamental de la preez de los mamferos es la formacin de la placenta, el rgano que permite la interrelacin entre la madre y el feto en desarrollo. El desarrollo de la placenta involucra una serie de eventos conocidos como implantacin. Durante este proceso el blastocisto se adhiere, penetra e invade el endometrio (decidua) y las clulas del trofoblasto del embrin se diferencian para formar la placenta. En la mujer este proceso es particularmente invasivo ya que las clulas trofoblsticas infiltran incluso el miometrio. Desde el punto de vista anatmico en la mujer embarazada se pueden establecer tres zonas de interfase materno-fetal (figura 17-2). En estas zonas es donde el tejido inmune de la madre puede reconocer los antgenos fetales de origen paterno. Una de estas zonas de interfase corresponde a las vellosidades placentarias, donde las clulas del sinciciotrofoblasto de origen fetal estn en contacto directo con la sangre materna. Otra zona de interfase la constituyen las arterias espirales del endometrio y miometrio, donde el endotelio materno es reemplazado por clulas fetales derivadas del trofoblasto, denominadas citotrofoblastos extravellosidades. Estos citotrofoblastos estn en contacto directo con el tejido endometrial. La tercera zona de interfase es la zona de la membrana corinica que se encuentra en contacto con la decidua. 4.2. Expresin de MHC en las clulas trofoblsticas Las clulas trofoblsticas que estn en contacto directo con las clulas inmunocompetentes de la decidua no expresan los genes del MHC de clase II, an despus de la estimulacin con IFN. Tampoco expresan dos de los principales genes polimrficos del MHC de clase I, HLA-A y HLAB. Sin embargo, las clulas trofoblsticas expresan HLA-G, un gen MHC de clase I conocido como no-clsico (ver captulo 8). Varias caractersticas de la protena HLA-G sugieren que su funcin est relacionada con la tolerancia maternofetal. Primero, esta protena se encuentra casi exclusivamente en el citotrofoblasto extravellosidades y en la membrana corinica. Adems del timo, no existe evidencia concluyente de que esta

4. EL SISTEMA INMUNE LOCAL EN EL EMBARAZO La respuesta inmune en la mucosa reproductiva de la hembra de los mamferos, ha debido adaptarse para tolerar al feto y a los espermatozoides, que de otra manera seran rechazados al igual que los trasplantes alogeneicos (ver captulo 37). A continuacin se describe el sistema inmune de la mujer durante el embarazo, destacando aquellas caractersticas que pueden explicar la

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Figura 17-2 Zonas de interfase materno-fetal en la placenta. Se distingue al menos dos zonas de interaccin materno-fetal: a) los sinciciotrofoblastos y la sangre materna de los espacios intervellosidades y b) los citotrofoblastos extravellosidades y tejido linfoide del endometrio. En estas zonas de interaccin, el sistema inmune de la madre puede ser estimulado por los antgenos fetales de origen paterno.

protena se exprese en otros tejidos. Segundo, a diferencia de MHC-I clsico, el gen HLA-G casi no presenta polimorfismo, es decir, tiene muy pocas variantes allicas. Esto implica que durante la preez, la protena trofoblstica heredada de los genes paternos ser idntica o levemente diferente a la protena materna y por lo tanto, estas molculas no inducirn respuesta alogeneica de rechazo. Tercero, una caracterstica propia del gen HLAG es que el mRNA sufre splicing alternativo y se genera una forma soluble que tambin podra tener funciones reguladoras sobre el sistema inmune materno. Las clulas trofoblsticas expresan otros dos genes MHC de clase I, HLA-E y HLA-C. El gen HLA-E codifica tambin para una protena de clase I no clsico, que une un grupo de pptidos muy restringido. Se postula que su funcin sera inhibir el ataque al trofoblasto por parte de las clulas NK. HLA-C es un gen MHC de clase I clsico pero se expresa en niveles mucho ms bajos que HLA-A y HLA-B en tejidos normales y su funcin es desconocida. 4.3. Las clulas NK de la decidua Las clulas NK de la decidua (LGL: CD56+, CD16-), difieren fenotpicamente de las encontradas en la periferia (CD56+, CD16+). En el ratn las clulas NK corresponden a las clulas GMG

(clulas granulares de la glndula metrial). A partir de la fase lutea del ciclo menstrual y en la primera etapa del embarazo, las clulas NK aumentan en nmero hasta llegar a ser las ms abundantes en la decidua. Tanto en la mujer como en el ratn, estas clulas disminuyen notablemente al trmino de la preez. Las clulas NK se encuentran en estrecha relacin anatmica con las clulas trofoblsticas, distribuidas especialmente alrededor de las arterias espirales, glndulas endometriales y junto a los trofoblastos que invaden el tejido materno. Aunque la funcin de las clulas NK durante la preez es desconocida, se sabe que estas clulas tienen actividad citoltica similar a las clulas NK de sangre perifrica. Las clulas NK de la decidua expresan los receptores inhibitorios (KIR) por lo que se cree que su actividad ltica es inhibida en la interfase materno fetal por la presencia de los ligandos HLA-G y HLA-C (figura 17-3). 4.4. Los linfocitos T de la decidua Los linfocitos T se encuentran dispersos en la decidua y no varan en nmero durante la preez. En la mujer, los linfocitos T deciduales no proliferan en respuesta a las clulas trofoblsticas ni frente a linfocitos alogeneicos, indicando que los linfocitos T de la decidua se encuentran en un estado de anergia similar al encontrado en los

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Figura 17-3 Expresin de MHC de clase I (HLA.G y HLA.C) en las clulas trofoblsticas. La actividad ltica de las clulas NK de la decidua que es estimulada por los receptores de activacin KAR, puede permanecer inhibida por la unin del MHC del trofoblasto a los receptores KIR.

linfocitos de la mucosa intestinal. En ratones transgnicos existe tolerancia sistmica a los antgenos paternos, lo que se produce por una disminucin transiente de los linfocitos especficos para las molculas MHC paternas durante la preez. Tambin a nivel sistmico se produce desviacin de la respuesta inmune hacia una respuesta humoral mediada por linfocitos Th2, evitando de esta manera el posible dao que una respuesta celular mediada por Th1 pudiera producir en la preez. 4.5. Citoquinas en la preez Las citoquinas tienen una funcin importante durante la preez y son producidas en tejidos fetales y la decidua. En estos tejidos se sintetizan citoquinas inflamatorias tales como IL-1, TNF, IL-6 e IL-8; linfoquinas tales como IFN-, IL-2 e IFN-; factores de crecimiento tales como el Factor estimulador de colonias de granulocitos (GCSF), Factor estimulador de colonias de granulocitos y macrfagos (GM-CSF), Factor estimulador de colonias de macrfagos (M-CSF) y factores inmunosupresores como TGF1, TGF2 e IL-10 (ver captulo 11). Algunas citoquinas producidas por los tejidos embrionarios o maternos, tienen efectos regulatorios sobre la implantacin, el desarrollo del embrin y de la placenta. Su efecto se produce a travs de los receptores que se encuentran en los tejidos blanco. Por ejemplo, IL-11 se produce en las clulas del endometrio e induce diferenciacin de las clulas del estroma a clulas deciduales favoreciendo de esta manera la implantacin. Otras citoquinas como CSF-1, que se produce en el citotrofoblasto, promueven la invasin y diferenciacin del

trofoblasto. Otras como IGF-1, TNF-, IL-6 y CFS-1 promueven la sntesis y secrecin de hormonas placentarias. Varias de las citoquinas producidas en estos tejidos tienen adems funciones inmunorregulatorias, as por ejemplo, IFN- estimula la respuesta inmune Th1 (inmunidad celular), IL-10 inhibe la respuesta inmune tipo Th1 y TGF presenta actividad inmunosupresora. El equilibrio entre los niveles de tales citoquinas en el tracto reproductor, puede estar relacionado con la capacidad de discriminacin del sistema inmune local, entre clulas inmunolgicamente extraas pero normales al individuo (tales como los espermatozoides y el embrin) y una variedad de microorganismos patgenos que infectan el tracto reproductor. De esta manera, el sistema inmune local puede ser capaz de iniciar una respuesta inmune de carcter y extensin apropiados al estmulo, es decir, una respuesta de tolerancia a los espermatozoides y al embrin y de rechazo a los microorganismos patgenos. Este es un campo de la inmunologa de la reproduccin de activa investigacin.

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FACTORES INMUNOLGICOS QUE AFECTAN LA FERTILIDAD

Dada la relevancia de la respuesta inmune en todos los procesos involucrados en la reproduccin, no es raro que fallas a este nivel conduzcan a fallas en la fertilidad. En humanos existe una intensa investigacin para conocer ms exactamente los mecanismos subyacentes y poder desarrollar mejores terapias. A continuacin, se describen como ejemplos de fallas de la fertilidad por causa de factores inmunolgicos, la alteracin en la implantacin del embrin que conduce al aborto espontneo recurrente y tambin, la produccin de anticuerpos antiespermticos, que pueden ser causa de falla en la fertilidad al dificultar la fecundacin. 5.1. Aborto espontneo recurrente de causa inexplicada El aborto espontneo recurrente de causa inexplicada se ha relacionado con la desrregulacin de varios aspectos de la respuesta inmune que se requieren para la implantacin del embrin a pesar de que ste puede ser considerado como un aloinjerto, al portar los antgenos he-

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redados del padre. La implantacin es un proceso esencial para la reproduccin humana en la que se produce invasin del endometrio materno por parte del concepto. Este hecho pone inevitablemente al conceptus en contacto con las clulas inmunocompetentes maternas y por ello, la interaccin materno-fetal durante el perodo peri-implantacional es crucial para determinar el xito o el fracaso del proceso reproductivo. Cmo escapa normalmente el feto a la vigilancia por parte de las clulas NK endometriales que son el tipo linfocitario predominante en el sitio de implantacin?. Una posible explicacin surge del hallazgo de que mujeres y hombres de la misma edad poseen claras diferencias en la actividad de las clulas NK. Las mujeres tienen menor actividad de clulas NK que los hombres de su misma edad. Asimismo, el nivel de actividad de las clulas NK previo a la concepcin, puede predecir el resultado del embarazo, ya que mujeres con alto nivel de actividad NK tienen mayor riesgo de aborto. Por otra parte, se ha postulado que la ausencia de las molculas MHC polimrficas, HLA-A, HLA-B y de clase II, en la interfase con el tejido materno y a la presencia de molculas MHC clase I HLA-G, con un bajo polimorfismo en el sinciciotrofoblasto influyen positivamente en la sobrevida del injerto fetal. Sumados estos hechos, se plantea que es a travs de estos determinantes no polimrficos, sumado a la ausencia de otras molculas MHC, que se logra localmente la inhibicin de la citotoxicidad por las clulas NK y de linfocitos T. De tal manera que tanto una perturbacin en la expresin de HLA-G, como en el estado de activacin de las clulas NK influye en la sensibilidad del trofoblasto a la lisis y en el equilibrio mantenido en el sitio de implantacin. La actividad de clulas NK es influenciada por numerosas citoquinas, entre ellas las citoquinas secretadas por los linfocitos Th1 que son capaces de activarlas se han encontrado asociadas con el aborto. Por otro lado, TGF- sera una citoquina protectora del embarazo al disminuir el grado de activacin de las clulas NK. Ya sea como resultado de una mayor activacin o una reduccin en la inmunosupresin, las clulas NK de pacientes abortadoras parecen estar sujetas a un ambiente proclive a la activacin, reflejado en un nivel de actividad de clulas NK mayor que en embarazos normales. Recientemente se han acumulado evidencias del importante papel que desempean las citoquinas T helper en el rechazo del embarazo, el cual es mediado por el predominio de citoquinas

Th1 en el endometrio peri-implantacional, mientras que normalmente un predominio Th2 confiere proteccin. La falla del embarazo puede explicarse por varios mecanismos inmunolgicos secundarios a cambios en las proporciones normales de los 2 grupos de citoquinas, sobre todo a nivel local en la interfase materno-fetal. Entre las citoquinas Th1, IL-12 sirve de estmulo para la diferenciacin de clulas Th0 a Th1, las que por efecto de IFN- y TNF-, culminan en el desarrollo de una respuesta citotxica de rechazo del conceptus. El aumento anormal de citoquinas Th1 puede ser provocado por antgenos del trofoblasto, del espermatozoide, microbianos u otros, que estimulan a las clulas inflamatorias e inmunes maternas hacia el desarrollo de respuesta inmune celular. El aborto recurrente de causa no explicada se ha asociado adems, con la expresin de molculas HLA-DR1 y con la presencia de autoanticuerpos rgano inespecficos como anticardiolipinas y antinucleares. Esto puede deberse a la hipersecrecin de TNF-, dado que existe un desequilibrio de ligamiento entre HLA-DR1 y TNF-. 5.2. Anticuerpos antiespermticos Anticuerpos con especificidad por el espermatozoide o alguno de sus componentes se pueden encontrar en diferentes secreciones corporales de hombres y mujeres, pero su significado como posible causante de alteraciones de la fertilidad es muy variable. El hallazgo de anticuerpos antiespermticos en el suero no tiene relevancia en fertilidad, en cambio s puede tenerla cuando estn presentes en el tracto reproductivo (tabla 17-2). Dichos anticuerpos pueden desarrollarse en forma primaria sin una causa reconocible. En otros casos, los anticuerpos se desarrollan secundariamente a una alteracin en los mecanismos normales de supresin de la respuesta inmune, ya que el espermatozoide es altamente inmunognico tanto para la mujer como para el mismo hombre que lo produce. Esto sucede en el hombre porque los antgenos espermticos aparecen durante la pubertad, es decir despus que ya se ha establecido la tolerancia a los antgenos propios. Actualmente se considera que dichos anticuerpos son una causa de reduccin de la fertilidad, alterando la capacidad antiespermticos fecundante del espermatozoide, inhibiendo interacciones gamticas por aglutinacin o por

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Tabla 17-2. Hallazgo de anticuerpos antiespermticos en secreciones humanas Muestra Suero (hombre) Suero (mujer) Moco cervical Plasma seminal Espermatozoide a
a

Isotipo de Ig IgG, IgM IgG, IgM IgG, IgA IgG, IgA IgG, IgA

Relevancia en fertilidad Ninguna Ninguna Posible Posible Posible

los anticuerpos aparecen adheridos a la superficie del espermatozoide Referencia: Bohring C., Krause W., Reproduktionsmedizin 16: 3-7, 2000.

inmovilizacin del gameto masculino, o tambin, influenciando negativamente el desarrollo del embrin. Se ha sugerido que los anticuerpos unidos a la superficie espermtica participan en citotoxicidad mediada por complemento o fagocitosis por macrfagos activados. Los antgenos, blancos de reacciones inmunolgicas asociadas con infertilidad, son molculas expresadas en la superficie, accesibles en el espermatozoide intacto para reaccionar con linfocitos o anticuerpos. Se ha intentado caracterizar los antgenos espermticos relevantes en fertilidad, sin lograrlo completamente hasta ahora porque la especificidad de los anticuerpos antiespermticos parece ser extremadamente heterognea. Un ejemplo es el denominado antgeno de fertilizacin (FA1), que fue caracterizado como una glicoprotena de 49 kDa presente en espermatozoides de varias especies de mamferos. Se afirm inicialmente que este antgeno era el blanco de anticuerpos presentes en el suero de hombres y mujeres infrtiles, sin embargo, tambin lo sera para anticuerpos presentes en individuos frtiles, con lo que su relevancia para la reproduccin permanece en discusin. Posteriormente se ha detectado una serie de antgenos de peso molecular entre 23 y 72 kDa, mediante electroforesis bidimensional y Westernblot con los anticuerpos presentes en el plasma seminal de hombres infrtiles. Esto parece confirmar la heterogeneidad ya mencionada de la especificidad de los anticuerpos antiespermticos. Debido a que el espermatozoide no est presente en la etapa de desarrollo del individuo cuando se establece la tolerancia a los antgenos propios, es necesario su aislamiento del sistema inmune para evitar el reconocimiento y rechazo como clulas extraas. La primera lnea de defensa contra el desarrollo de una respuesta autoinmune

antiespermtica es la barrera hemato-testicular constituida por las ajustadas uniones entre las clulas de Sertoli en el testculo, luego por el epitelio mucoso del tracto genital masculino, suplementado por una barrera inmunosupresora local de linfocitos T supresores abundantes en el tejido intersticial del testculo y en la submucosa del epiddimo. Las clulas de Sertoli tambin fagocitan y degradan espermatozoides y productos residuales de la espermatognesis, evitando as el contacto con el sistema inmune. Por ltimo, los factores inmunosupresores del plasma seminal protegen al espermatozoide incluso al encontrarse en el tracto genital femenino. Todo lo anterior explica que la formacin de anticuerpos antiespermticos se asocia en el hombre con la inflamacin o infecciones del tracto genital, trauma o torsin testicular, lesin y/u obstruccin parcial de los conductos reproductivos masculinos, vasectoma y tumores. La prdida de continuidad en la superficie mucosa de los conductos testiculares o eferentes permite el acceso de macrfagos al tracto reproductivo, los que engloban y degradan espermatozoides, para luego presentar antgenos al sistema inmune. Confirmando lo anterior, alrededor del 50% de los hombres vasectomizados presenta anticuerpos antiespermticos en el suero y parece haber un control gentico de la tendencia a formar estos anticuerpos ya que en el grupo de hombres vasectomizados que desarrollaron anticuerpos se encontr mayor frecuencia de HLA-A28 y Bw22. En la mujer, el depsito de espermatozoides en el tracto genital puede conducir al desarrollo de anticuerpos antiespermticos. En el caso de ruptura de las barreras mucosas, hay ingreso de antgenos espermticos, los que son reconocidos por linfocitos B subepiteliales que desarrollan una

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respuesta de anticuerpos con predominio de IgA. La aparicin de estos anticuerpos tambin puede reflejar una falla de los factores supresores del plasma seminal. La presencia de anticuerpos antiespermticos en el tracto genital femenino interfiere con la fecundacin ya sea, porque impide la migracin de los espermatozoides a travs del moco cervical y con ello las interacciones gamticas, o porque influye negativamente en el desarrollo del embrin.

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SECCIN

III

MECANISMOS EFECTORES DE LA RESPUESTA INMUNE

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 18
SISTEMA DEL COMPLEMENTO
Arturo Ferreira V. y Julio Scharfstein

1. Introduccin 2. Generalidades sobre la activacin y regulacin del Sistema del Complemento 2.1. Generacin de enlaces covalentes por parte de C3b y C4b, al reaccionar con estructuras de las superficies atacadas por el sistema. 2.2. Las C3 y C5 convertasas de las rutas clsica y alterna son funcionalmente homlogas: 3. Ruta clsica: algunos detalles moleculares 3.1. Unin C1 3.2. Activacin de C4 y C2 3.3. Convertasa de C3 3.4. Convertasa de C5 3.5. Mecanismos que confinan la activacin del complemento a las membranas blanco (target) o culpables

3.6. Ruta de las lectinas 4. Ruta alterna: algunos detalles moleculares 4.1. Activacin de la ruta alterna 4.2. Papel de la properdina 5. Fase terminal: generacin del complejo destructor de membranas 5.1. Generacin de C5-8 5.2. Polimerizacin de C9 5.3. Efecto funcional de la insercin del MHC en las membranas 5.4. Perspectivas futuras del estudio de la fase final de la activacin del complemento 6. Algunos aspectos genticos del Complemento 7. Complemento y Enfermedad

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RESUMEN El Complemento es un sistema extremadamente pleiotrpico conformado por alrededor de 40 protenas, que interrelacionan en el sistema inmune mltiples funciones efectoras, frecuentemente mediadoras de mecanismos inflamatorios. Durante su activacin se generan tres grupos de pptidos con funciones que, en condiciones fisiolgicas, promueven la fagocitosis, la inflamacin, la destruccin de membranas biolgicas de agentes agresores y la estimulacin tanto de mecanismos inmunes innatos, como adquiridos. La activacin del sistema puede ocurrir a travs de dos rutas, involucrando en la ruta clsica la presencia de complejos inmunes. La ruta alterna se activa por superficies biolgicas con caractersticas bioqumicas particulares, en ausencia de anticuerpos. Una variante de la ruta clsica involucra ciertos carbohidratos y enzimas que generan directamente la convertasa clsica de C3, sin participacin del componente C1, ni de anticuerpos. Estos mecanismos generan la convertasa de C3 que activa enzimticamente al tercer componente C3, depositndolo sobre las membranas biolgicas prximas al sitio de la activacin. El tercer componente se une covalentemente a estas membranas por medio de enlaces hidroxister o amidoster. Estos mecanismos de accin generan tambin convertasas de C5 (clsica y alterna) que activan enzimticamente al quinto componente C5, continuando una serie de interacciones no enzimticas, que involucra a los componentes C6-C9, culminando con el ensamblaje del MAC. Estos complejos son estructuras macromoleculares anfifilicas, que se insertan en membranas biolgicas agresoras, generando verdaderos tubos o canales que causan profundas alteraciones en las membranas, culminando con la lisis celular. La activacin del sistema es controlada meticulosamente por protenas presentes en la fase soluble y tambin unidas a membranas. Estas protenas controladoras pueden mediar la degradacin enzimtica de componentes activos, particularmente C3b y C4b. Tambin pueden impedir la generacin de convertasas o desensamblar aquellas ya generadas. La regulacin tambin puede ocurrir a nivel de la generacin del MAC. Aunque la mayora de los genes que codifican las protenas del complemento se encuentran dispersos en el genoma, algunos de ellos se encuentran ligados en cromosomas definidos. As, por ejemplo, los genes que codifican el segundo y cuarto componente de la ruta clsica (C2 y C4) y el factor B de la ruta alterna, se encuentran todos ligados en el centro del MHC, desconocindose las implicancias funcionales de este ligamiento. En sntesis, el arte del sistema del complemento consiste en generar funciones opsonizantes y lticas concentradas sobre membranas agresoras culpables y no sobre membranas vecinas, propias, inocentes, favorecido esto por la funcin de las anafilotoxinas que facilitan el acceso al sitio de la agresin, de numerosos elementos inmunocomponentes. La marcacin indeleble u opsonizacin de muchas superficies antignicas por C3b y C4b, las direcciona hacia rganos linfoides, donde se inicia la respuesta inmune especfica. La incorporacin de C3b y C4b sobre complejos inmunes puede mediar la solubilizacin de stos. La activacin descontrolada del sistema puede generar una serie de patologas, al igual que la deficiencia de algunos componentes.

1. INTRODUCCIN Si aceptamos que el sistema inmune existe porque existe la agresin exgena (virus, bacterias, hongos, parsitos en general) y endgena (clulas neoplsicas principalmente), entonces, la funcin principal de este sistema sera el reconocimiento y destruccin de estos agresores. De este encuentro, reconocimiento y destruccin, resulta

un estado de inmunidad que le permitir al individuo reaccionar en forma ms efectiva en la eventualidad probable de reencuentros futuros con el agente agresor. En el proceso de reconocimiento participan, como componentes esenciales, clulas y anticuerpos. Entre las clulas, los linfocitos T citotxicos (LTc) pueden reconocer y destruir clulas infectadas en forma autosuficiente. Los LTc

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sintetizan complejos macromoleculares que, luego de contactar estrechamente con las clulas infectadas, los insertan en la membrana de stas, destruyndolas. Por otra parte, las clulas B producen anticuerpos, altamente especficos, que les sirven como receptores integrales de membrana y como productos de exportacin, o sea, como verdaderas sondas que reconocen al agente patgeno, incluso a gran distancia del punto de produccin. Sin embargo, estas sondas, por s solas, normalmente no pueden matar ni destruir a los organismos invasores. Excepcionalmente, los anticuerpos podrn ser suficientes si bloquean, por ejemplo, un ligando para un receptor celular presente en un parsito, cuyo ciclo biolgico implica necesariamente una etapa intracelular. (En este captulo, el trmino parsito ser utilizado en un sentido amplio, refirindose a agentes agresores tales como bacterias, virus, hongos, protozoos, etc.). En otras palabras, los anticuerpos son molculas cuya funcin principal es reconocer, pero, frecuentemente, el reconocimiento, aunque necesario, no es suficiente. En este contexto, el Sistema del Complemento representa un mecanismo srico auxiliar, eficiente de defensa innata. Es uno de los primeros sistemas de amplificacin biolgica cuyos mecanismos moleculares fueron descritos en detalle, sirviendo como ejemplo sofisticado y didctico sobre mecanismos de regulacin proteoltica. Debido a la gran versatilidad de las interacciones protena-protena, la investigacin sobre su modo de activacin y regulacin ofrece ejemplos importantes sobre la relacin entre estructura y funcin de protenas, sobre la influencia de la variabilidad gentica y sobre las consecuencias en clnica mdica. Capaz de generar una gama de actividades biolgicas, el sistema est formado por aproximadamente 40 molculas, presentes en el plasma o sobre membranas biolgicas, en todos los vertebrados estudiados hasta ahora. Tal como ocurre con los procesos de activacin de las serino-proteasas responsables de la coagulacin y de la hemostasis, la activacin del sistema del complemento implica la activacin sucesiva (cascada) de precursores enzimticos de serino proteasas plasmticas. Las principales consecuencias biolgicas de este proceso son: a) Formacin de un Complejo Destructor (ltico) de membrana, conocido tambin como "Killer Complex" o "MAC (Membrane Attack

Complex). Este es un complejo macromolecular formado por la asociacin de seis molculas: C5b, C6, C7, C8, C8 y C9. La generacin de este complejo est orientada al ataque de membranas biolgicas. Tiene propiedades fsico-qumicas anfiflicas (hidrofbicas e hidroflicas) que le permiten insertarse en membranas biolgicas fosfolipdicas que se encuentren en la proximidad inmediata al sitio de activacin, alterando profundamente su estructura. Generan en ellas verdaderos forados que cambian drsticamente sus propiedades de permeabilidad. Una ilustracin clsica y dramtica de esto se logra al sensibilizar glbulos rojos con anticuerpos especficos. Los glbulos pueden incluso aglutinarse, pero estarn intactos. Al agregar suero fresco como fuente de complemento, las clulas se lisarn. Si una de estas clulas se mira al microscopio electrnico se ver la membrana perforada por una multitud de orificios circulares, simtricos, equidistantes, provocados por el MAC. b) Opsonizacin de antgenos por fragmentos C3b y C4b. Estas opsoninas se unen covalentemente a la superficie de clulas invasoras cercanas al sitio de activacin. Por s solas no producen dao, pero si las clulas extraas sensibilizadas con ellas, son detectadas por una clula fagoctica profesional, como el macrfago, sern fagocitadas muy eficientemente y luego destruidas intracelularmente. Estas clulas fagocticas tienen receptores de superficie para estos fragmentos opsonizantes. Adems de contribuir a la fagocitosis, estas opsoninas pueden contribuir a la focalizacin de antgenos hacia ndulos y ganglios linfticos, donde hay una gran concentracin de linfocitos B. Esto sucede porque, similar a lo que ocurre con los macrfagos, los linfocitos B tambin expresan receptores para los fragmentos de C3 y C4. Adems, las clulas dendrticas foliculares tambin son portadoras de estos receptores. Esto otorga al sistema una importante funcin estimuladora de la respuesta inmune, si consideramos que, para ser inmunognicos, los antgenos deben llegar a los rganos linfoides. Por otra parte, como los complejos inmunes pueden activar al sistema, una tercera funcin de estos fragmentos sera impedir formacin de agregados de complejos inmunes insolubles en el organismo. c) Un tercer grupo de productos generados se conoce como anafilotoxinas. Son fragmentos de

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bajo peso molecular (alrededor de 5 kDa) que se generan a partir de C3, C4 y C5. Se llaman C3a, C4a y C5a. Han sido cristalizadas a homogeneidad. Inoculadas subcutneamente, en cantidades de nanomoles, inducen una violenta reaccin inflamatoria local con un gran edema. Su funcin principal es aumentar la permeabilidad capilar. Son agentes fundamentales en el fenmeno inflamatorio fisiolgico que, frecuentemente, acompaa a muchas infecciones. Por el hecho de tener una potente actividad biolgica, estos factores tienen vida media corta, siendo rpidamente destruidos por caboxi-peptidases plasmticas. El nombre de anafilotoxinas es incorrecto (se conserva por razones histricas) ya que no son toxinas y no inducen shock anafilctico, que es una reaccin generalizada. Las anafilotoxinas inducen la liberacin local de varios productos de las clulas mastodeas, siendo el ms importante la histamina. Una reaccin similar ocurre con los basfilos circulantes que tienen receptores para C3a y C5a. Los neutrfilos, en cambio, tienen receptores slo para C5a, induciendo en ellos una fuerte actividad leucotxica.

2. GENERALIDADES SOBRE ACTIVACIN Y REGULACIN DEL SISTEMA DEL COMPLEMENTO. El complemento puede activarse a travs de dos rutas principales (clsica y alterna) presentadas, en forma muy resumida, en la figura 18-1. C3 ocupa una posicin central en el sistema, siendo un objetivo principal de estas rutas el activarlo. Ruta clsica: Requiere de la participacin de complejos inmunes. Implica la activacin de C1 a C9. Con una sola excepcin, la secuencia de nmeros refleja la secuencia de pasos en el proceso de activacin. La excepcin tiene orgenes histricos (C4 es activado antes que C2 y C3, pero C2 y C3 fueron descubiertos antes que C4). En la ruta clsica, la participacin de iones Ca2+ y Mg2+ es esencial. En ausencia de estos iones la activacin no ocurre. As, si a un suero fresco se le agrega EDTA, (cido etelendiaminotetraactico), suficiente para quelar todo el Ca2+ y Mg2+ y luego agregamos glbulos rojos sensibilizados con anticuerpos, no habr lisis. El Ca2+

Figura 18-1. Resumen de las dos vas principales de activacin del Sistema del Complemento

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estabiliza a C1, formado por la asociacin de 3 protenas: C1q, C1r, C1s. Como veremos ms adelante, la manosa, carbohidrato presente en una variedad de agentes agresores exgenos, puede mediar la activacin de la ruta clsica, prescindiendo de la participacin de complejos inmunes y de C1, constituyendo as lo que se conoce como bypass de las lectinas. Ruta alterna: Su objetivo tambin es activar a C3. No requiere la participacin de C1, C2, C4, ni de complejos inmunes. Participan, en cambio, los factores B, D y properdina (P). Requiere de la participacin de Mg2+. Regulacin: El sistema del complemento, por su potencial destructor para el hospedero, debe ser cuidadosamente regulado. Este trabajo es realizado por varias protenas que funcionan en diferentes puntos de la cascada. Estas protenas estn presentes en el suero o unidas a membranas biolgicas. Las mejor caracterizadas son: En el suero: a) Inhibidor de C1 (C1INH) b) C4 binding protein (C4-bp) (Protena ligante de C4) c) Inactivador de C3b y C4b (I) d) Factor H (H) e) Protena S f) Inactivador de anafilotoxinas g) SP40, 40 h) Properdina (P) Como parte integral de membranas o actuando sobre ellas: a) CR1 : Receptor de C3b y C4b b) DAF: "Decay accelerating factor". (Factor acelerador del decaimiento, de convertasas). c) CR2: Receptor de C3d y C3dg, iC3b d) MCP: "Membrane Cofactor Protein" (Protena cofactor de membrana) I es el nico factor regulador que posee actividad enzimtica. Para inactivar irreversiblemente las enzimas C3 convertasas clsica y alterna, I depende crticamente de la interaccin reversible de co-factores especializados (C4-bp, H y CR) con sus ligandos respectivos, C4b en la ruta clsica y C3b en la ruta alterna. MCP y DAF, aceleran el decaimiento de las enzimas convertasas clsica y alterna, ensambladas

en la superficie de la clula hospedadora. Como se mencion, la activacin en cascada es siempre acompaada de la liberacin de muchos pptidos biolgicamente importantes. Como convencin, los pptidos o fragmentos se designan con letras minsculas. Por ejemplo, C3 puede generar varios fragmentos, no todos con funciones conocidas. As, a partir de C3 se genera C3b, C3a, C3c, C3g, C3d, C3dg; de C4 se genera C4a, C4b, C4c, C4d; de C5: C5a, C5b; de B: Bb, Ba; de C2: C2a, C2b. Los fragmentos b son de tamao mayor que los a, sin excepcin. (A pesar que esto ya fue resuelto en un taller de nomenclatura internacional, hace ya ms de 15 aos, algunos libros an mantienen una excepcin representada por C2, en que el fragmento mayor sera a y el menor b. En este texto usaremos lo convenido en ese taller). En la literatura, con frecuencia, se puede encontrar una raya sobre un componente o enzima activada. Por ejemplo C1, significa C1 activado. Algunas molculas del complemento son muy interesantes, en cuanto a estructura, como es el caso de C1q y C4-bp. Estas molculas, al igual que IgG e IgM, presentan al microscopio electrnico imgenes que parecen racionales si se piensa en sus funciones. Las caractersticas generales de los componentes del complemento se resumen como sigue: a) C2, C3, C4, C5, B se fragmentan durante la activacin generando C2a, C2b; C3a y C3b; C4a y C4b; C5a y C5b, Ba y Bb. C1r y C1s tambin se fragmentan pero los productos generados se designan simplemente como mayor y menor b) Todos los componentes son glicoprotenas c) La concentracin srica flucta entre 1-2 mg/ ml (C3) y menos de 1 ug/ml (D) d) El peso molecular flucta entre 20 kDa (D) y 750 kDa (C1: q, r, s) e) N de cadenas: 18 (C1q); 7 (C4-bp); 3 (C4; C8); 2 (C3, C5, C1r, C1s); 1 (C2, C6, C7, C9, B) f) Precursores (no funcionales) por proteolisis limitada se hacen funcionales en una reaccin en cascada unidireccional (C1r, C1s, C4, C2, C3, C5, C3, B) g) La regulacin ocurre en varios puntos de la cascada h) Durante la activacin se generan mecanismos moleculares que concentran la accin ltica y opsonisante sobre membranas biolgicas blanco ("culpables") y no sobre clulas vecinas inocentes i) Algunos componentes se preasocian estratgicamente en ausencia de estmulo

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Los genes estructurales de estas protenas estn dispersos en el genoma. Curiosamente, sin embargo, los genes para C2, B y C4 se encuentran en un cluster en el centro del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC), en todas las especies estudiadas hasta ahora. Hay otras curiosidades genticas. El gen estructural de C3 en el ratn est en el cromosoma 17, ligado a H-2, pero a una gran distancia gentica, 13 centimorgans, telomrico a la regin D. En humanos, en cambio, el gen estructural de C3 est en el cromosoma 19, no ligado a HLA, complejo gentico que se en-

cuentra en el cromosoma 6. Se desconoce la razn por la cual C2, B y C4 estn siempre formando parte integral del MHC. C8 est formado por dos protenas cuyos genes estructurales estn, en humanos, en el cromosoma 1. Un gen codifica las cadenas alfa-gamma, que son secretadas como un precursor de una cadena. Otro gen codifica la cadena beta. Las tres cadenas se integran postsintticamente para formar la molcula funcional de tres cadenas que conocemos como C8. Dos cadenas (alfa y gamma) estn unidas covalentemente, la otra no. La tabla 18-1 resume estos datos.

Tabla 18-1. Caracterstica generales de las protenas del Sistema del Complemento Componente PM (kDa) 462 Cadenas N kDa 18(6A+6B+6C) Cromosoma humano 1 1 1 12 12 6 Concentracin (ug/ml suero) 80

kDa A: 26.5 B: 26.5 C: 24 --: 97 : 75 : 33 -: 110 : 75 --: 115 : 75 --: 64 : 64 : 22 --55 : 55 : 30 -56 ----

Sustrato ---

C1q

C1r C1s C4

83 83 205

1 1 3 (,,)

50 50 600

C1r, C1s C4, C2 ---

C2 C3 D B C5 C6 C7 C8

102 185 24 92 190 120 110 150

1 2 (,) 1 1 2(,) 1 1 3 (,,)

6 19 X? 6 9 1 5 1 1 9 5 11 1 4 17 20 1 1 1

20 1300 1 210 70 55 56 55

C3, C5 --B C3, C5 ---------

C9 C1 INH C4-bp I S P H CR1 DAF

71 110 500 88 83 220 150 205 73

1 1 7 2 1 4 1 1 1

59 200 250 35 505 5 560 ---

------C4b, C3b -----------

*Se designa como substrato slo a aquellas molculas que son degradadas proteolticamente

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De acuerdo a lo mencionado, muchas de las serino proteasas del sistema complemento circulan como precursores no funcionales (zimgenos). La activacin del complemento puede ser definida entonces como una cascada de reacciones en que precursores enzimticos no funcionales son activados por proteolisis limitada y especfica en un proceso unidireccional e irreversible. As, la protena que en una etapa es substrato, al sufrir la ruptura de un enlace peptdico se transforma en una enzima nueva, a veces alterando sutilmente su especificidad enzimtica, lo que le permite actuar sobre un substrato distinto. La consecuencia principal de esto es que un pequeo estmulo inicial puede ser amplificado tremendamente (efecto de cascada). Mecanismos de este tipo evidentemente requieren de un sistema de control riguroso, que opera en diversas etapas de la cascada. Una caracterstica muy interesante del sistema del complemento es que, incluso en ausencia de estmulo, muchas protenas circulan en el plasma ya laxamente asociadas entre s, listas para actuar, tal es el caso de: a) C1q, C1r, C1s (todos necesarios para la activacin de C4 y C2). b) C4, C2, C4bp (C4 y C2 forman la convertasa clsica de C3. C4-bp es cofactor de I para inactivar a C4). c) C3, P, B (participan en la convertasa alterna de C3). d) C5, C6, C7, C8, C9 (Forman el "killer complex" o Complejo de Ataque de Membranas, MAC). Se trata entonces de un conjunto de verdaderos organelos flotantes, dispersos en el plasma, listos para actuar. En general, varios de ellos copurifican, cuando se intenta aislarlos por

procedimientos bioqumicos estndares. Las enzimas (convertasas de C3 y de C5) participan en la cascada, son complejas y se generan durante la activacin: a) En la ruta clsica, la convertasa de C3 (C4b, C2b), generada por la accin secuencial de C1 sobre C4 y C2 (figura 18-2), acta sobre C3 generando dos fragmentos, C3b y C3a. El sitio enzimtico activo de la C3 convertasa est localizado en el fragmento C2b. C2 y C4 circulan preasociados. C4 al liberar su fragmento C4a, por accin de C1s, cambia en su conformacin terciaria y esto induce un cambio en la conformacin de C2 el que, al igual que C4, expondra un sitio susceptible de ser digerido por C1s. C4 se une covalentemente a estas membranas. A su vez, C2 slo puede unirse a travs de C4 a la membrana que est siendo atacada. C2b, disociado de C4b, es prcticamente inactivo, debe combinarse con C4b para poder actuar sobre C3. Se cree que la funcin de C4b en la C3 convertasa es modular (acomodar) al substrato C3 en la posicin adecuada para ser digerido por C2b. En otras palabras, C4b es un cofactor enzimtico: es esencial para que la subunidad cataltica C2b pueda romper un enlace peptdico en C3. La C3 convertasa genera muchos fragmentos C3b. La mayor parte de ellos pasa a la fase fluida, una proporcin menor acta como opsoninas y tambin para direccionar antgenos hacia rganos linfoides b) C5 convertasa clsica: Como paso posterior a la activacin de C3 en la ruta clsica, ocurre la generacin de la convertasa de C5 de la misma ruta (figura 18-3).

Figura 18-2. Esquema simplificado de la generacin de la convertasa de C3.

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Figura 18-3. Esquema simplificado de la generacin de la convertasa de C5.

Una proporcin menor de los fragmentos C3b, generado por la convertasa respectiva, se asocian a la misma. Se produce as un cambio en la especificidad del sitio enzimtico presente en C2b. El complejo tendr ahora especificidad por C5, ya sea a travs de la modulacin de C2b por C3b (modulacin de enzimtica) o de la modulacin de la molcula de C5 (modulacin de substrato), al contactar con C3b. 2.1. Generacin de enlaces covalentes por parte de C3b y C4b, al reaccionar con estructuras de las superficies atacadas por el sistema Uno de los aspectos ms importantes y caractersticos del sistema del complemento es que, despus de la activacin, las molculas de C3b y C4b tienen un tiempo muy corto (fracciones de segundo) para unirse covalentemente a la membrana atacada. Si no lo hacen, decaen. A nivel molecular, esto significa que el sitio de unin neoformado tiene vida corta. Este sitio es hidroflico y aparece despus de la fragmentacin de las molculas por C1s (C4) o por C4b,2b (C3). En el centro de la cadena alfa de C3 y C4, se encuentra un enlace tioster, formado por interaccin del grupo carboxilo de un cido glutmico y el grupo sulfhidrilo de una cistena. (Este tipo de enlace tambin es compartido por la 2-macroglobulina, un inhibidor de proteasas). La activacin de estos enlaces es uno de los eventos ms importantes en el plasma para la eliminacin de agresores que activan al complemento. Se generan as enlaces covalentes de tipo hidroxister o amidoster con grupos hidroxilos y aminos presentes en las superficies antignicas agresoras. De esta manera, C3b y C4b, presentes en convertasas

o como opsoninas se unen indeleblemente a una variedad de agresores. Como puede predecirse, la formacin de estos enlaces requiere proximidad entre C3 o C4 con clulas. La reaccin puede ocurrir con estructuras aceptoras presentes en diversos patgenos, aunque accidentalmente puede involucrar a membranas de clulas del hospedero. Es inespecfica, desde el punto de vista inmunolgico. Esta proximidad, calculada en 40 nm desde la convertasa o desde C1s (lugares en que se genera C3b y C4b, respectivamente), es un elemento clave del sistema que centra la accin en las membranas atacadas y no sobre membranas vecinas inocentes. En humanos existen dos isotipos de C4, codificados en el complejo HLA. Mientras el enlace tioster del isotipo C4A reacciona directamente con nuclefilos aminos de la superficie atacada, el isotipo C4B es ms complejo. Una vez activado (por digestin de su cadena por C1s), la histidina en posicin 1106 (cido asprtico en C4A) ataca al enlace tioster formando un intermediario acil-imidazol. E tiol liberado acta luego como una base para catalizar la transferencia posterior del grupo acil a nuclefilos hidroxlicos, incluyendo el agua. Es posible que estos mecanismos bsicos tambin operen en otras especies. De hecho, en el ratn tambin existen dos isotipos de C4, codificados en el complejo H2. Los vertebrados disponen as de un mecanismo defensivo de alta eficiencia que les permite unir covalentemente, C3b y C4b a la superficie atacada. Estos conceptos se resumen en la figura 18-4.

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Figura 18-4. Generacin de enlaces covalentes entre componentes activados y superficies receptoras.

En concordancia con lo anterior, C3 y C4 pueden ser inactivados por amonio o hidrazima (H2NNH2), que pueden atacar nucleoflicamente el enlace tioster. 2.2. Las C3 y C5 convertasas de las rutas clsica y alterna son funcionalmente homlogas Esta homologa se basa en que ambos tipos de convertasas (clsica y alterna) generan productos idnticos (figura 18-5) y sus componentes tienen homologa estructural y gentica. Basado en estos resultados se puede proponer que:
Figura 18-5. Resumen de los productos generados por las convertasas de C3 y C5 de las rutas clsica y alterna.

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a) Es posible que C3 y C4 sean productos de genes duplicados ya que existe alta homologa de secuencia primaria en los vecindarios de los enlaces tioster en la cadena alfa de ambas molculas. En otras palabras, la homologa va ms all de la presencia del cido glutmico y de la cistena involucrados en el enlace. b) En ambas convertasas de C3, C3b o C4b actan como cofactores de las enzimas (C2b o Bb). c) Es posible que tanto en las C3 convertasas como en las C5 convertasas de ambas rutas, las proenzimas (C2, B) sean productos de genes duplicados. d) Las convertasas de C5 clsicas y alternas no difieren en lo fundamental. En la alterna, C4b es reemplazado por molculas de C3b que, posiblemente, representan una duplicacin gnica de C4 o viceversa. e) Los productos de la accin de las convertasas clsicas y alternas son los mismos. porcin resiste la accin de colagenasas y conserva la capacidad de unirse a complejos antgeno anticuerpo an despus de tratada con la enzima. C1r y C1s se unen a la porcin fibrilar de C1q, en forma no covalente. Por su parte, C1q se une, en forma no covalente, a travs de sus porciones globulares, a las molculas de anticuerpo del complejo antgeno-anticuerpo. Especficamente, C1q se une al dominio CH2 de la porcin Fc de la molcula de anticuerpo. Se une eficientemente a IgG1,2,3. Complejos inmunes formados por IgG4 no activan al complemento. Las IgG no activan al complemento cuando estn libres en el suero porque C1q debe formar un complejo con 2 molculas de Ac cuyos fragmentos Fc deben estar a una distancia crtica de 30-40 nm. Se ha demostrado experimentalmente que el nmero de pares de molculas de IgG adecuadas para unir C1q, aumenta exponencialmente cuando el nmero total de molculas de IgG unidas aumenta linealmente. Ej: En un glbulo rojo que tiene 1.000 molculas de IgG unidas, slo un 1% forma pares adecuados (problema estadstico que asume que los antgenos estn distribuidos al azar en la superficie). Este 1% aumenta al 20% cuando se unen 2.000 molculas de IgG por glbulo rojo. En la IgM los fragmentos Fc estn a una distancia adecuada, ya que es un pentmero de monmeros de inmunoglobulina tetramrica. Sin embargo, no activa al complemento cuando se

Figura 18-6. Estructura de C1q.

3. RUTA CLSICA: ALGUNOS DETALLES MOLECULARES 3.1. Unin de C1 La presencia o generacin de complejos antgeno - anticuerpo desencadena la cascada a travs de la etapa de reconocimiento, que requiere la participacin de C1. C1 est formado por las subunidades q, r, s. El reconocimiento mismo es efectuado por C1q. Al microscopio electrnico, C1q tiene una estructura con un notable parecido a un ramo de 6 tulipanes. La figura 18-6 resume estos conceptos. Cada una de las seis unidades de C1q (cada tulipn) consta de una porcin fibrilar y una porcin globular, participando tres tipos de cadenas de peso aproximado a 25 kDa. C1q tiene entonces 18 cadenas, lo que da un peso total aproximado de 400 kDa. Las cadenas (A,B,C) son muy similares, pero no idnticas y probablemente representan el producto de tres genes duplicados (ligados en la cromosoma 1 en humanos). Los tulipanes estn unidos en pares a travs de sus cadenas C, por lo cual hay tres dmeros C-C y seis dmeros A-B. Todos unidos por puentes disulfuro. La parte fibrilar tiene una estructura similar al colgeno por lo cual es sensible a la colagenasa. La parte globular es la responsable del reconocimiento de los complejos antgeno-anticuerpo. Esta

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encuentra libre en el suero. Se sabe tambin que una sola de estas molculas es suficiente para lisar un glbulo rojo (de all que se dice que es hemolticamente ms eficiente que la IgG y que, incluso, se la llame hemolisina). La IgM, al reaccionar con antgenos sobre una membrana celular cambia su estructura plana a una forma tridimensional, semejante a un corchete, exponiendo el dominio CH3 que une la porcin globular de C1q. Con antgenos solubles, o en ausencia de antgenos, tender a asumir la forma plana. La IgM es la molcula diseada para mediar el ataque temprano de membranas biolgicas por parte del complemento. C1s y C1r son serino esterasas. Se unen no covalentemente a la porcin fibrilar de C1q, en forma de dmeros de frmula 2C1r: 2C1s, generando un tetrmero lineal (figura 18-7). Las molculas de C1s estn en los extremos de la cadena que tiene una longitud de 50 nm. La estructura y contenido aminoacdico de ambas es parecido, lo que sugiere que se originaron por duplicacin gnica. Cada monmero tiene un peso de 83 kDa y est formado por una sola cadena polipeptdica. Al activarse, cada cadena se fragmenta y el sitio cataltico aparece en el fragmento menor. Este y el mayor permanecen unidos por un puente disulfuro, lo cual implica la existencia de al menos una cistena en cada fragmento. Esto permite que la actividad enzimtica se mantenga incorporada al complejo C1q-Ac-Ag. Se desconoce el mecanismo exacto de la autoactivacin de C1r que ocurre cuando la porcin globular de C1q interacta con los fragmentos Fc de los complejos inmunes. La explicacin

ms aceptada es que C1r, como muchos otros zimgenos, tendra una capacidad limitada de autoactivarse. Esta posibilidad se basa en la observacin que C1r purificado forma dmeros en solucin y que en estos dmeros se produce la autoactivacin, o sea que cada miembro del par es capaz de activar al otro. Es posible entonces que cuando C1 se combina con los complejos inmunes, a travs de la porcin globular de C1q, las relaciones espaciales en el tetrmero 2(C1r:C1s) sean favorables para que se produzca la autoactivacin de por lo menos una molcula de C1r, la que podra activar a la otra. Las dos molculas de C1r activado estaran as en condiciones de activar a las dos molculas de C1s. Evidentemente, este mecanismo implica una considerable flexibilidad dentro del tetrmero para que se realice la activacin o autoactivacin, considerando que las molculas de C1r estn en los extremos del mismo. 3.2. Activacin de C4 y C2 Esta etapa cumple al menos 3 funciones, todas derivadas de la asociacin covalente de C4b y C3b sobre la superficie activante: a) Se facilita la fagocitosis a travs de la unin a los receptores para C3b y C4b presentes en la superficie de los fagocitos profesionales (CR1). b) Se genera C3 y C5 convertasas, utilizando C4 y C2, de modo que la activacin pueda proseguir hasta la activacin de C3 y C5. c) El depsito covalente de C3 y C5, direcciona los antgenos hacia rganos linfoides, facilitando as la induccin de la respuesta inmune especfica. La molcula de C4 no es una enzima sino que acta como matriz o cofactor positivo para el ensamblaje de las C3 y C5 convertasas. Es una molcula extremadamente verstil. Tiene al menos siete dominios importantes y topogrficamente diferentes que le permiten interactuar con: a) b) c) d) C1s de la ruta clsica, o MASP de la ruta de las lectinas, lo que determina su activacin. Membranas biolgicas atacadas (unin covalente). C2, para formar la convertasa de C3. CR1, de clulas fagocticas, lo que le permite actuar como opsonina.

Figura 18-7. Unin de C1s y C1r a C1q.

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e) f) g)

C4bp, lo que media su inactivacin, cuando pasa a fase fluida. I, lo que media su inactivacin en fase fluida, cuando es reconocido por C4bp. C3, requisito para la activacin de ste por parte de C2b. As, C3 puede actuar como opsonina, o formar parte de la convertasa de C5.

presente en fase fluida, generando gran cantidad de C3b. C3 es digerido en su cadena alfa por el sitio cataltico presente en C2b del complejo C4b,2b (C3 convertasa). Esta etapa tiene al menos 3 funciones, derivadas tambin del depsito covalente de C3b sobre membranas biolgicas: a) Facilitar la fagocitosis.

Una vez iniciada la activacin de C4 y C2, la reaccin puede ocurrir en muchos puntos de la membrana simultneamente, alejndose en forma radial desde el punto en que se produjo la reaccin Ag-Ac (figura 18-8). La fragmentacin de C4 en C4b + C4a es un punto de amplificacin de la cascada. As, por cada molcula de C1s activado se generan alrede-

b) Proporcionar un sitio de unin para C5, de manera tal que C5 es modulado y puede ser digerido por C2b presente en la nueva convertasa generada (convertasa de C5 o C4b,2b,3b). c) Direccionar antgenos hacia rganos linfoides, facilitando as la induccin de la respuesta inmune adquirida. Esta funcin sera compartida con

Figura 18-8. Esquema de la secuencia desde el reconocimiento antignico hasta la implantacin del Complejo de Ataque a Membrana.

dor de 30 molculas de C4b que se unirn a la membrana, lo que representa no ms del 5% del C4b generado por esa molcula de C1s. Qu ocurre con los C4b que pasan a la fase fluida? Para evitar el ataque a membranas propias, inocentes, vecinas, es importante inactivarlos. 3.3. Convertasa de C3 Las molculas de C3 convertasa generadas sobre la membrana biolgica reaccionarn con C3,

C4, dado que el receptor CR1 de los linfocitos B es comn para C3b y C4b. C3 es una molcula de 190 kDa, sintetizada como una sola cadena que es luego digerida a una cadena alfa de 115 kDa y una cadena beta de 75 kDa, que permanecen unidas por puentes disulfuro. Hoy, existe considerable evidencia que los genes estructurales de C3 y C4 se originaron por duplicacin. Esta aseveracin se basa en que, aparte de la importante homologa gnica, son funcionalmente anlogos: Se unen covalentemente

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a las superficies celulares y son capaces de generar las C3 y C5 convertasas por accin de dos serino proteasas que tambin son anlogas (C2b y Bb). El 10-15% del total del C3b generado se une a las clulas. Es otro paso de amplificacin ya que aproximadamente 200 molculas de C3b se depositan sobre la clula por cada C3 convertasa. Al igual que en el caso de C4b, la gran cantidad de C3b que pasa a la fase fluida debe ser inactivada. 3.4. Convertasa de C5 La C5 convertasa fragmenta a C5 en C5a y C5b. Este es el ltimo paso enzimtico en la activacin del complemento. C5 circula preasociado con C6-C7-C8-C9. Al generarse C5b, el complejo C5b-C9 cambia de hidroflico a anfiflico, exponiendo sectores hidrofbicos que le permiten insertarse en membranas biolgicas. C6, C7, C8 y C9 en el complejo destructor MAC se encuentran en proporciones estequiomtricas definidas. C9 se polimeriza alrededor de un pilar formado por C5b-C8, formando una especie de tubo que se inserta en la membrana. Esta estrategia es similar a la usada por las clulas T killer o citotxicas y NK que destruyen a la clula blanco insertando una estructura tubular (perforina) en sus membranas plasmticas. Es un verdadero misil que las clulas T insertan en las membranas que ellas, con sus receptores especficos, reconocen como extraas. Esta estructura tubular tiene una notoria similitud al MAC. En la membrana celular atacada por la activacin de la ruta clsica podemos distinguir tres tipos de sitios topogrficamente definidos. El primero, donde se realiza el reconocimiento antignico por los anticuerpos; el segundo, donde se generan las C3 y C5 convertasas y, el tercero, donde se inserta el MAC. 3.5. Mecanismos que confinan la activacin del complemento a las membranas blanco (target) o culpables, en la ruta clsica. a) La activacin de C1 requiere la unin de por lo menos un par de inmunoglobulinas a una distancia crtica o de una molcula de IgM unidas a la superficie antignica. b) Slo C2b, modulado por combinacin con C4b unido a superficies antignicas, puede formar las C3 y C5 convertasas.

c) La corta vida de los sitios de unin de C3b y C4b restringe la unin de estas molculas a un rea circular de 40 nm de radio, cuyo centro est dado por la molcula de C1s o por la C3 convertasa. Finalmente, en la figura 18-9 se muestran las etapas en que ocurre amplificacin.

Figura 18-9. Etapas de amplificacin en la activacin del Sistema del Complemento.

3.6. Ruta de las lectinas La ruta de las lectinas, descrita ms recientemente, puede considerarse como un bypass de la ruta clsica. Al igual que la ruta alterna, se activa en forma independiente de anticuerpos. Cuando los macrfagos fagocitan bacterias u otros agentes agresores, son estimulados para secretar citoquinas como IL-1, IL-6 y TNF. stas actan sobre los hepatocitos, los que responden produciendo protenas de fase aguda, entre las cuales se encuentra la lectina que une manosa (mannose binding lectin o MBL). Siendo la manosa un componente principal de las glicoprotenas de la pared bacteriana (y probablemente de otros agresores), la MBL se une a las bacterias y otros patgenos, actuando, no slo como una potente opsonina, sino tambin mediando la activacin del complemento. Concretada esta unin, un complejo proenzimtico, unido en forma dimrica a MBL (MBL -associated serine protease o MASP) se activa, actuando sobre C4 y C2, en una manera aparentemente idntica a como lo hace C1s activado, presente en el complejo macromolecular C1qC1r2-C1s2 (figura 18-10).

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Figura 18-10. Ruta de las lectinas. La manosa de la superficie bacteriana se une a MBL (mannose binding ligand). La MASP2 (MBL-associated serine protease, forma dimrica), forma complejo con MBL (MBL - MASP2) que hidroliza a C2 y C4. Se muestra adems la activacin de la ruta clsica a travs de un complejo antgeno-anticuerpo (Ag-Ac).

Parece, entonces, que habra similitudes funcionales y estructurales importantes entre los complejos C1q-C1r2-C1s2 y MBL-MASP2. As, MBL tiene similitudes estructurales importantes con C1q (de hecho, al microscopio electrnico, tambin presenta una estructura semejante a un ramillete de tulipanes) y, en MASP2, un monmero sera similar a C1r y, el otro, a C1s. La deficiencia de MBL ha sido asociada con susceptibilidad a un amplio rango de enfermedades bacterianas. MBL tambin puede unirse a IgA polimrica, induciendo la activacin del complemento, lo cual podra explicar mecanismos defensivos mediados por IgA, a nivel de mucosas.

4. ACTIVACIN DE LA RUTA ALTERNA La ruta alterna proporciona al hospedador un mecanismo de defensa innata, muy efectivo. Este mecanismo se realiza en ausencia de anticuerpos

especficos, caracterstica fundamental de esta ruta, al igual que la ruta de las lectinas. Difiere de la ruta clsica mediada por anticuerpos, en que proporciona una lnea de defensa que est inmediatamente disponible pues no requiere de inmunizacin previa. Participan en ella seis protenas plasmticas: C3, B, D, H, I y P. De stas, B, D y P participan exclusivamente en esta ruta. Las seis protenas realizan una vigilancia continua que escapa un poco a los conceptos inmunolgicos convencionales. Por ello, esta ruta y la de las lectinas corresponden esencialmente a mecanismos de inmunidad innata Cmo ocurre la discriminacin entre molculas del hospedador y molculas extraas si no participan los anticuerpos? Una de las consecuencias inevitables del inicio de los mecanismos de amplificacin descritos, anteriormente, es la generacin de una gran cantidad de molculas C3b que se unen indiscriminadamente a clulas del organismo

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agresor activador y a clulas del hospedador (no activadoras o inocentes o bystanders). En el hospedador existe una serie de protenas reguladoras que inactivan rpidamente a las molculas de C3b que atacan a sus propias clulas. Estas protenas reguladoras estn presentes en el plasma y tambin como protenas integrales de las membranas celulares del hospedador. Los organismos sensibles al ataque de la ruta alterna incluyen bacterias, hongos, virus, clulas tumorales inducidas por virus, otras lneas de clulas tumorales y eritrocitos humanos carentes de DAF (factor acelerador del decaimiento de convertasas). El C3b que se deposita en estos tipos de partculas puede funcionar como opsonina o pasar a formar parte de C3 o C5 convertasas alternas. Las C3 convertasas neoformadas pueden generar ms C3b que se deposita hasta que la superficie es saturada o hasta que se agota el stock de C3. La ruta alterna del complemento puede depositar hasta 2 millones de molculas C3b en la superficie de un glbulo rojo en un perodo menor de 5 min. Las caractersticas principales de las protenas que participan en la ruta alterna son las siguientes: B: Contiene histidina, cido esprtico y serina en posiciones homlogas con otras serino proteasas. Sin embargo, en el extremo amino terminal tiene 300 residuos adicionales con secuencia diferente a las de otras serino proteasas. Esta es tambin una caracterstica de C2. Circula en forma activa. Es una proteasa altamente especfica, ya que su nico substrato conocido es B. Rompe un enlace Arg-Lys en B slo cuando est unido a C3b, liberando el fragmento Bb. Juega un papel similar al de C1s de la ruta clsica. No se sabe si hay homologa de secuencia primaria entre estas dos enzimas. Cofactor regulador negativo. Se une a C3b y slo en estas condiciones, la cadena alfa de ste se torna sensible a la digestin por I. Serino proteasa que acta como factor regulador negativo. Digiere las cadenas alfa de C3b y C4b. Requiere de los cofactores H, (sobre C3b), CR1 (sobre C3b y C4b, ambos unidos a membranas) y C4-bp (sobre C4b, en fase fluida), para ejercer su funcin enzimtica.

P:

Regulador positivo. Existe en dos formas, activa e inactiva. Se activa en presencia de C3b,Bb (C3b convertasa alterna) y estabiliza este complejo. Tambin estabiliza a la C5 convertasa alterna, (C3b)n,Bb, (n>1)

4.1. Activacin de la Ruta Alterna Se desconoce el mecanismo exacto de generacin de las primeras molculas de C3b metaestables (enlace tioster activado). Est claro que participan slo las seis molculas mencionadas. Los pasos ms aceptados se ilustran en la figura 18-11. Se distinguen cuatro etapas: Iniciacin, Depsito de C3b, Reconocimiento y Amplificacin. a) Iniciacin. En la Iniciacin se generara una forma de C3 alterado por hidrlisis de su enlace tioster (sin proteolisis de la cadena alfa, como ocurre en la ruta clsica y en la ruta de las lectinas). Designaremos a este C3 como C3(H20). Se formara muy lentamente en soluciones acuosas fisiolgicas (0,005% del C3 disponible) o 50 - 100 ng/ml (cercano a la concentracin de D). La concentracin de C3 es 1 - 2 mg/ml en todas las especies vertebradas estudiadas. En la ruta alterna, C3(H2O), tendra todas las propiedades funcionales de C3b excepto que, por un perodo corto de tiempo, esta protena sera resistente a la inactivacin por H e I, dado que mantiene intacto el extremo amino terminal de su cadena alfa. C3(H2O) forma un complejo con B nativo, en presencia de concentraciones fisiolgicas de Mg2+. Esta propiedad aparece inmediatamente despus de la hidrlisis del enlace tioster. El complejo C3(H2O),B es activado por D formndose una C3 convertasa de fase fluida C3(H2O), Bb. (Ntese que en esta enzima C3 no ha sido digerido proteolticamente). Esta C3 convertasa de fase fluida es la primera enzima capaz de generar C3b metaestable. La enzima misma est confinada a la fase fluida (a diferencia de la ruta clsica y de las lectinas, donde la C3 convertasa, C4b, 2b, est confinada a la superficie de la clula atacada, unida covalentemente a travs de C4b). El C3b metaestable generado puede difundir durante 60 seg, hasta encontrar una superficie receptiva. Ntese que la iniciacin no necesita de partculas activantes, es espontnea, y estara ocurriendo siempre. Se podra decir que la ruta alterna est siempre iniciada. Si contina o no depender de la naturaleza de la superficie receptiva.

D:

H:

I:

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Figura 18-11. Activacin de la Ruta Alterna. En este proceso se distinguen 4 etapas: Iniciacin, Depsito de C3b, Reconocimiento y Amplificacin.

b) Depsito de C3b. La habilidad del enlace tioster del C3b metaestable para reaccionar con una amplia variedad de carbohidratos (grupos hidroxilos), protenas (grupos aminos), capacita a esta ruta para depositar C3b sobre una amplia gama de microorganismos. Es muy posible entonces que el primer factor de resistencia del hospedero que encuentra un microorganismo invasor, es C3b, generado constantemente por C3(H2O), Bb en fase fluida. C3b se unir covalentemente a su superficie y lo har apetecible para los fagocitos profesionales. Una caracterstica muy particular de la ruta alterna es que el depsito covalente de C3b parece continuo e indiscriminado tanto sobre las clulas del hospedador como sobre las de los organismos agresores. El hospedador resuelve este problema con molculas reguladoras negativas que inactivan a C3b. Ms adelante se ver cmo se resuelve este problema. c) Reconocimiento. La discriminacin entre

activadores y no activadores ocurre poco despus del depsito inicial de C3b. Esta discriminacin es el resultado de una capacidad diferencial de los factores reguladores para controlar el proceso de amplificacin, dependiendo si se trata de una superficie activadora o no activadora. En general, C3b en fase fluida y C3b unido a superficies o membranas del hospedador (no activadores por definicin) es rpidamente inactivado por H e I. En cambio, cuando C3b se une a partculas invasoras activantes, la C3 y C5 convertasas son protegidas de la destruccin mediada por las protenas reguladoras de la fase fluida. Aparentemente, esto es determinado por la eficiencia con que el factor H pueda interactuar con el C3 unido a la superficie. As, se ha determinado que C3b, unido a superficies activantes, no muestra afinidad por el factor H, mientras que su afinidad por el factor B y la properdina permanece inalterada. En otras palabras, la habilidad para distinguir entre superficies activadoras y no activadoras de la ruta alterna es un atributo de C3b o de H o de ambos y

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este atributo es expresado o modulado por caractersticas bioqumicas de la superficie de la partcula. An no est claro qu estructuras moleculares son reconocidas por la ruta alterna. Un aspecto comn de todos los activadores es la presencia de carbohidratos, pero la gran variedad y complejidad de las estructuras glucosdicas hace difcil visualizar cules son los determinantes moleculares compartidos que son reconocidos. Un aspecto comn a la mayora de los activadores es la presencia de concentraciones muy bajas de cido silico. Es notorio el hecho que los glbulos rojos de oveja, que activan muy mal la ruta alterna humana, se convierten en activadores eficientes si se elimina o modifica el cido silico de su superficie, por ej. con neuraminidasa. Es poco probable, sin embargo, que ste sea el nico factor implicado. Es posible que el cido silico cumpla una funcin moduladora cuyo mecanismo no est definido. d) Amplificacin y Regulacin La retroalimentacin positiva, dependiente de C3b, es una caracterstica exclusiva de la activacin de la ruta alterna del complemento, o sea, la convertasa de C3 es capaz de generar muchas molculas de C3b que tienen la capacidad potencial de generar nuevas convertasas de C3 y C5. Es importante sealar que D convierte B en Bb slo cuando ste est unido a C3b. Este proceso es controlado por los factores H e I. As, C3b depositado en una superficie activadora es relativamente resistente a la inactivacin por H e I. Lo mismo ocurre con las convertasas de C3 que se generen sobre este tipo de superficie. Este balance entre amplificacin y control permite a la ruta depositar C3b de la fase fluida al azar sobre partculas activantes y no activantes. Sin embargo, tambin le permite, amplificar slo aquellas pocas molculas que se han unido a superficies activantes. La convertasa de C3 estabilizada, C3b, Bb, P, al actuar sobre C3, genera una gran cantidad de fragmentos C3b parte de los cuales, en presencia de Mg2+, pueden combinarse con el factor B que se hace sensible a la accin de D. Se genera as la convertasa de C3 alterna que puede repetir el proceso. En sntesis, el depsito de C3b sobre partculas activadoras tiene cuatro caractersticas importantes: a) Depende del tipo de partcula activante, b) Tiene un perodo de latencia, probablemente correspondiente a la etapa de reconoci-

miento, c) Aumenta exponencialmente, debido a la amplificacin o retroalimentacin y, d) Alcanza un plateau, correspondiente al agotamiento de componentes o de receptores de superficie. La vida media de C3b,Bb (Mg2+) es alrededor de 90 segundos. La presencia de concentraciones fisiolgicas de H acelera la disociacin del complejo, bajando la vida media a menos de 1 segundo. 4.2. Papel de la properdina La properdina se une slo a la convertasa de C3 o de C5 alterna que se encuentran unidas a membranas. Su participacin comienza slo despus que se ha iniciado el proceso de amplificacin. As, C3b,Bb,P tiene una vida media dos logaritmos ms larga que C3b,Bb. Este efecto condujo a algunos investigadores a creer que la ruta alterna no poda ser activada en ausencia de properdina.

5. FASE TERMINAL: GENERACIN DEL COMPLEJO DESTRUCTOR DE MEMBRANAS En esta fase participan siete componentes del Sistema del Complemento (tabla 18-2). El ensamblaje del MAC puede visualizarse en dos etapas: a) ensamblaje del complejo C5b-8 y b) polimerizacin de C9. 5.1. Generacin de C5b-8 C5 no tiene enlace tioster a pesar de tener homologa de secuencia primaria con C4, C3 y alfa 2 M. Por lo tanto, no forma enlaces covalentes con membranas. El pilar C5b-8 se encuentra unido, por medio de C5b, a C3b de las convertasas de C5 clsica o alterna. A su vez, ese C3b se encuentra unido covalentemente a la superficie de la clula agresora. Los componentes terminales del complemento son hidroflicos en su estado no activado. Para expresar su funcin, consistente en destruir o alterar drsticamente las membranas externas de los organismos invasores, estos componentes deben sufrir una transicin del estado hidroflico o un estado anfiflico, para poder insertarse en la fase lipdica de las membranas. Esta transicin es una caracterstica que define a las protenas terminales del complemento. Bsicamente, implica una serie de interacciones protena-protena que

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Tabla 18-2. Propiedades de las protenas terminales del Complemento Componente C5 Subunidades alfa (S-S)n beta 1 cadena 1 cadena alfa (S-S)n gamma beta 1 cadena 1 cadena Peso molecular (kDa) 124 76 120 110 64 22 64 73 80

C6 C7 C8()

C8() C9 S S-S : Puente disulfuro.

se traducen en el ensamblaje de complejos macromoleculares heteropolimricos que expresan simultneamente dominios hidroflicos e hidrofbicos. La activacin proteolitca de C5 es realizada por cualquiera de las dos C5 convertasas. C5 se une a C3b de la C5 convertasa donde sufre modulacin de substrato y posterior accin proteoltica, ya sea por parte de las sub-unidades catalticas C2b (clsica) o Bb (alterna). Como productos se libera C5a y el fragmento C5b permanece unido a la sub-unidad C3b de la C5 convertasa y modula a C6, para iniciar la formacin de un pilar (formado por C5b a C8) sobre el cual se ordenar C9 para formar el tbulo. C5-C9 circulan preasociados laxamente, con caractersticas hidroflicas. C5b se une estequiomtricamente con C6. El complejo C5b-6 permanece an unido al C3b de la convertasa y modula a C7 producindose una transicin irreversible de un complejo hidroflico a un complejo anfiflico. Esta es la primera oportunidad en la activacin del complemento en que se realiza la transicin hidroflica anfiflica. Considerando que C5b est unido al C3b de las convertasas, este complejo est muy prximo a la membrana por lo cual la insercin es muy eficiente y se acerca al 100%. Por otra parte, si la

superficie activante no es parte de una membrana fosfolipdica, como el caso de los complejos inmunes y las membranas de ciertos tipos de hongos, como el zimosan mismo, C5b-7 no tendr dnde unirse y el complejo ser liberado a la fase fluida. Este complejo es peligroso para el hospedador pues puede insertarse en membranas inocentes vecinas y generar el MAC. Esto es evitado por un conjunto de protenas plasmticas o inhibidores de C5b-7. C8 se une al pilar heteropolimrico a travs de su subunidad beta. C8 alfa-gama es necesario para iniciar la polimerizacin de C9. Por lo tanto, ambas unidades, la beta y la alfa-gamma son necesarias para que C8 exprese su funcin. Un defecto gentico en cualquiera de los tres genes involucrados en la generacin de las 3 cadenas de C8, resulta en la incapacidad de formar el MAC, con las consecuencias patolgicas que corresponde (susceptibilidad aumentada a una serie de infecciones bacterianas). La porcin alfa-gamma de C8 pasa a formar parte del dominio hidrofbico del heteropolmero. 5.2. Polimerizacin de C9 C9 monomrico es hidroflico, globular de 50-80Ao de dimetro. Si se incuba en forma pura a 37oC, en condiciones fisiolgicas, se produce la

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polimerizacin de aproximadamente 17 molculas, generando un complejo tubular anfiflico (poli C9). La velocidad de polimerizacin es fuertemente aumentada in vitro si se incluye C5b-8. Poli C9 tiene una estructura de 160Ao de largo, 100A o de luz y est formado por 17 protmeros. Este tbulo tiene un dominio hidrofbico localizado en la cara externa de uno de los extremos del homopolmero y un ensanchamiento en el otro extremo. El interior del tbulo parece ser hidroflico. El dimetro de los tbulos en solucin y el dimetro de las lesiones producidas por el complemento es similar, lo cual indica que esta estructura forma parte importante del MAC. Si poli C9 es agregado a una suspensin de glbulos rojos inducir la lisis de stos de manera similar a como lo hace el MAC. Esta lisis ocurrir incluso si los glbulos rojos y el poli C9 son de un mismo individuo. En condiciones fisiolgicas. Esto no ocurre, pues el proceso de polimerizacin de C9 y su insercin a membranas biolgicas requiere de la presencia tutelar de C5b-8, complejo que acta como aceptor de C9. La polimerizacin de C9 ocurre simultneamente con el desplegamiento de los monmeros que, en su forma globular hidroflica no activa, tienen un dimetro de 50Ao. Se genera as una forma alargada anfiflica de 160Ao de longitud. El homopolmero tubular formado por C9 en solucin es resistente a la disociacin por SDS. La estabilidad del tbulo frente a SDS se explica por la generacin de enlaces disulfuro entre los monmeros. Es probable que esta estabilidad bioqumica de poli C9 es un prerrequisito para que pueda cumplir su funcin citoltica en el MAC, resistiendo las defensas proteolticas de las clulas atacadas.

En el MAC, el receptor de poli C9, esto es C5b-8, es detectado como un apndice de 150 Ao ubicado en la salida del tbulo. Este apndice se disocia en presencia de SDS, mientras que la estructura tubular permanece intacta. La estructura tubular del MAC es diferente a la de poli-C9 ensamblado in vitro. El MAC est compuesto de una molcula de C6, una de C7, C8 alfa-gamma, C8 beta y 10-17 molculas de C9. Se trata entonces de una estructura heteropolimrica. La figura 1812 compara la estructura del MAC y de poli C9. Es muy posible que C6, C7, C8 y C9 sean protenas codificadas por genes duplicados pues muestran cierta homologa de secuencia primaria y reactividad cruzada con algunos anticuerpos. 5.3. Efecto funcional de la insercin del MAC en las membranas El MAC, insertado en la membrana, ocupa una rea del 10.000 (AO)2. Si se insertan grandes nmeros de este heteropolmero, por ej. sobre membranas bacterianas, la superficie total de la bacteria puede aumentar ms de dos veces. Evidentemente, esta expansin dramtica puede ser devastadora si consideramos slo el efecto mecnico implicado. Si los atacados son glbulos rojos, la insercin de slo 800 MAC har que estas clulas pierdan su forma bicncava y adoptarn una forma esfrica. Es muy posible que slo el efecto mecnico de la insercin de los MACs provoque la muerte celular independientemente de otros efectos osmticos o metablicos que los canales puedan inducir. Entre estos otros efectos estn: 1. Entrada de Ca2+ al ambiente intracelular con la activacin indiscriminada de una variedad de rutas metablicas.

Figura 18-12. Complejo de ataque a membrana (MAC) comparado con poli C9.

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2. Salida K+, entrada Na+. La clula activa una serie de mecanismos de bombeo compensatorio lo cual conduce a desembolso indiscriminado de ATP, con altos gastos de energa, sucesos que pueden acelerar la muerte celular. Existen algunos tipos celulares que han desarrollado mecanismos de escape al ataque por MAC. As, las bacterias Neisseria gonorrhea, Salmonella minesota, ciertos tipos de Escherichia coli, y algunas lneas de clulas neoplsicas, activan el complemento, hasta la formacin del MAC, pero, usando diferentes mecanismos, resisten la accin de este complejo. 5.4. Perspectivas futuras del estudio de la fase final de la activacin del complemento El descubrimiento de la polimerizacin de C9 como el mecanismo subyacente al dao de membranas biolgicas mediado por el complemento hizo renacer el inters en el estudio de esta fase de la activacin. Por otra parte, se ha descubierto que los linfocitos T citotxicos y clulas NK pueden destruir clulas agresoras o extraas, insertando en sus membranas protenas citolticas o perforinas. La perforinas polimerizan en el citoplasma de estas clulas en poliperforinas, en una manera muy similar a poli-C9. La reactividad inmunolgica cruzada entre C9 y poliperforina, sugiere relaciones de homologa entre los genes que los codifican. Las imgenes al microscopio electrnico de lesiones producidas por clulas NK o clulas T citotxicas y aquellas producidas por el complemento son muy similares. Probablemente, los mecanismos moleculares de polimerizacin, cambios conformacionales, transicin hidroflica-anfiflica, insercin en membranas y formacin de canales transmembranas, son similares para C9 y perforinas. Es muy probable entonces que C9 y las perforinas sean miembros de familias genticamente relacionadas cuya funcin es la destruccin de las membranas de agentes invasores y, posiblemente, de clulas tumorales. Evidentemente, existen diferencias importantes en las estrategias seguidas por las perforinas y por C9 para lograr la insercin del misil en las membranas extraas, pero el resultado final sera el mismo: muerte celular. En el primer caso, el complejo macromolecular citotxico es ensamblado intracelularmente para ser luego transferido a la clula blanco, que contacta a la clula citotxica.

6. ALGUNOS ASPECTOS GENTICOS DEL COMPLEMENTO C2, B y C4:. Los genes que codifican C2, B y C4, sin excepcin, se encuentran en el centro de los MHC de todas las especies vertebradas estudiadas. Son componentes especiales, porque participan en la formacin de los 2 tipos de convertasas de C3 y de C5. C3: El gen que codifica C3 se encuentra en el cromosoma 17 del ratn, a 13cM de la regin D. En humanos se encuentra en el cromosoma 19, no ligado a HLA. C4-bp, H, CR1 (CD35), CR2 (CD21), DAF (CD55), MCP (CD46): Constituyen un conjunto de protenas reguladoras, que actan ya sea en fase fluida (C4-bp, H o como molculas integrales de membranas (CR1, CR2, DAF, MCP). Todas estas protenas presentan propiedades estructurales similares y los genes que las codifican se encuentran ubicados en un solo cromosoma (1, en humanos y ratones). Con excepcin de DAF, todos son cofactores de I, ya sea en fase fluida o en membranas, mediando as la degradacin de molculas de C3b o C4b que se hayan insertado accidentalmente en membranas propias o que hayan pasado a la fase fluida. C8: Est formado por la asociacin del producto de 3 genes. C8 alfa es codificado en el cromosoma humano 1 (se desconoce la ubicacin del gen en el ratn). C8 beta es codificado en los cromosomas 1 y 4, mientras que C8 gamma es codificado en los cromosomas 9 y 2, en humanos y ratones, respectivamente. A nivel proteico, las cadenas alfa y gamma estn unidas covalentemente, mientras que la cadena beta se asocia al dmero en forma no covalente. El dmero y el monmero se ubican en posiciones diferentes en el pilar molecular C5b C9.

7. COMPLEMENTO Y ENFERMEDAD El sistema del complemento ha evolucionado como un medio rpido para destruir agentes agresores, ya sea directamente lisndolos o, indirectamente, mediando la activacin de clulas fagocticas profesionales. El arte del sistema del complemento consiste en focalizar la accin ltica y opsonizante sobre membranas biolgicas de agresores. Esta tarea no es trivial, considerando que las distancias entre membranas de clulas pro-

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pias, inocentes, y clulas agresoras, culpables, son frecuentemente virtuales. Por lo tanto, el complemento puede, accidentalmente, mediar dao a tejidos propios. Durante la activacin del sistema se generan una serie de fragmentos flogsticos que en situaciones particulares pueden mediar inflamaciones severas. Ms conocidas son las consecuencias patolgicas de las deficiencias en componentes del sistema. As, las deficiencias de C3, gentica o derivada de la accin de protenas reguladoras, conduce a problemas de opsonizacin, que se manifiestan en susceptibilidad aumentada a una serie de infecciones. Las deficiencias parciales de MBL conducen a infecciones piognicas que afectan principalmente a nios que ya han perdido la inmunidad pasiva materna. Las deficiencias asociadas con componentes del MAC se asocian con infecciones principalmente con Neisseria. Deficiencias de C1q, C1r, C1s, C4 y C2: Se asocian con enfermedades tipo lupus eritematoso sistmico (SLE). La patogenia de estas enfermedades estara asociada con la capacidad del complemento para solubilizar complejos inmunes. La deficiencia del inhibidor de C1r y C1s (C1-INH) conduce a una activacin descontrolada de las serino proteasas, lo que conduce a angioedema hereditario, enfermedad que afecta principalmente a mujeres. Finalmente, la interaccin de MBL con IgA polimrica podra explicar el depsito de protenas del complemento en nefropatas mediada por IgA.

Morgan, B.P. and Harris, C.L., Complement Regulatory Proteins, Academic Press, N.Y, USA, 1999. Morley, B.J. and Walport, M.J., The Complement Facts Book, Academic Press San Diego, USA, 2000. Reid, K., The Complement System a Major Effector Mechanism in Humoral Immunity, The Immunologist, 3: 206-209, 1995. Ross, G., Immunobiology of the Complement System. An Introduction for Research and Clinical Medicine, Academic Press, INC, 1986.

LECTURAS SUGERIDAS Abbas, AK.; Lichtman, AH.; Pober J.S., Cellular and Molecular Immunology, Fourth Edition. W.B. Saunder Company. Pennsylvania, USA, 2000. Janeway, Ch.A.; Travers, P.; Walport, M. and Shlomchik, M., Immunobiology, Fifth Edition, Garland Publishing, NY, USA, 2001. Male, D.; Cooke A.; Owen, M.; Trowsdale, J. and Champion, B., Complement, Advanced Immunology, MOSBY, New York, USA, 1996.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 19
INMUNIDAD MEDIADA POR CLULAS
Luz Blanco P. y Javier Puente P.

1. Introduccin 2. Citolisis mediada por linfocitos T 2.1. Mecanismo membranoltico 2.2. Mecanismo dependiente de la interaccin FasL-Fas 3. Citolisis mediada por clulas NK 3.1. Citotoxicidad mediada por clulas NK 3.2. Receptor FcRIIIA (CD16) 4. Mtodos de estudio del proceso citoltico 5. Hipersensibilidad retardada (HR)

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RESUMEN Los principales linfocitos citotxicos son los linfocitos T CD8+ citotxicos (LTc) pertenecientes a la respuesta inmunolgica especfica y las clulas NK, pertenecientes a la respuesta inmunolgica innata. Los primeros, como una caracterstica general de los LT, basan su especificidad en el reconocimiento del antgeno a travs del TCR; las clulas NK, que son TCR-, poseen una amplia variedad de receptores de activacin y de receptores de inhibicin de la citotoxicidad para interactuar con la clula blanco, lo que apoya su falta de especificidad. Uno de los receptores de las clulas NK es el receptor para la porcin Fc de las IgG (FcRIII o CD16), el cual permite explicar la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC). El mecanismo de citolisis es muy similar en ambos casos e implica las siguientes etapas: reconocimiento y unin de la clula sensible o clula blanco; activacin de la clula citotxica: transduccin de seales y reorientacin de los elementos del citoesqueleto hacia la zona de contacto con la clula blanco; secrecin de los componentes de los grnulos, perforina y granzimas (enzimas proteolticas de los grnulos) que van a provocar dao a la membrana de la clula blanco (mecanismo membranoltico) y adems los componentes de los grnulos pueden ingresar a la clula blanco y activar el mecanismo de muerte celular programada o apoptosis de la clula blanco. La interaccin FasL - Fas inicia el proceso de apoptosis que se caracteriza por la activacin de enzimas proteolticas (caspasas) y la posterior fragmentacin del DNA. Ambos mecanismos participan simultneamente en los linfocitos citotxicos granulares, en cambio los linfocitos agranulares y otros subtipos minoritarios de LT, produciran lisis solamente a travs del mecanismo de apoptosis. Finalmente, ocurre la lisis de la clula blanco y la apoptosis o el reciclamiento de la clula efectora, la cual puede transformarse en una clula de memoria en el caso de los LTc. Los monocito/macrfagos activados pueden ejercer la destruccin de microorganismos por fagocitosis y de clulas eucariticas por citotoxicidad. Un mecanismo que refleja muy bien estas acciones es el de hipersensibilidad retardada, en el cual se logra la activacin de los macrfagos a travs de las citoquinas producidas por los LT CD4+ y CD8+ post contacto con la clula presentadora del antgeno, inicindose un complejo proceso que culmina con la activacin de los macrfagos.

1. INTRODUCCIN La citotoxicidad mediada por clulas la ejercen principalmente los linfocitos T citotxicos (LTc) y las clulas natural killer (NK) o agresoras naturales. Si bien ambos tipos celulares poseen una serie de propiedades comunes, existen importantes diferencias. Slo las clulas NK, que forman parte de la inmunidad innata, poseen citotoxicidad espontnea y expresan constitutivamente las molculas citotxicas determinantes del proceso ltico; en cambio, las clulas T constituyentes de la inmunidad adquirida, requieren del proceso de seleccin por el antgeno y no expresan en reposo los genes de las molculas citotxicas; es decir, en este caso corresponden a genes inducibles. Las clulas sensibles a su accin o clulas blanco son fundamentalmente: c-

lulas tumorales, clulas transformadas por virus, clulas infectadas con bacterias patgenas intracelulares; y adems, tambin lisan bacterias y parsitos libres. La unin entre los linfocitos citotxicos y las clulas blanco resulta en una interaccin caracterstica que culmina con la lisis de la clula blanco, proceso que ser analizado en el presente captulo. La primera etapa del proceso citoltico es la etapa de unin entre la clula citotxica y la clula blanco. La unin en el caso de los LTc, implica el reconocimiento del antgeno asociado al Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) de la clula blanco por el receptor T (TCR) y adems participan numerosas molculas de adhesin de la superficie de las clulas en contacto. En el caso de las clulas NK, clulas altamente heterogneas, pueden participar en la interaccin

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con la clula blanco una gran variedad de receptores de activacin e inhibicin de la citotoxicidad y molculas de adhesin; uno de stos es el receptor para la porcin Fc de las inmunoglobulinas G: FcRIII (CD16), responsable de la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC). Las clulas NK tambin son capaces de reconocer las molculas MHC en la clula blanco, a travs de receptores especficos, tanto de inhibicin (en la mayora de los casos) que genera una seal inhibitoria de la actividad ltica como tambin de activacin de la citotoxicidad. La etapa siguiente denominada etapa de activacin, implica cambios importantes en ambos tipos celulares, en los linfocitos citotxicos se inicia este proceso a travs de la transduccin de seales (ver captulo 10); reordenamiento de los elementos del citoesqueleto y finalmente cambios en la expresin gnica y cambios morfolgicos. Esta unin conducente a la activacin de los linfocitos citotxicos, es tambin determinante para la clula blanco, pues genera en stas la seal letal que marca el punto irreversible conducente a su muerte. Esta seal letal puede ocurrir por dos mecanismos: (a) La interaccin de las molculas de la superficie celular ligando de Fas o FasL y Fas (FasL - Fas), puede iniciar el fenmeno de muerte celular programada o apoptosis de la clula blanco, el cual se caracteriza por la fragmentacin inicial del DNA; FasL es inducido en las clulas citotxicas post-contacto con la clula blanco. (b) A travs de la secrecin de componentes citotxicos de los grnulos, constituidos por protenas formadoras de poro (PFP o perforina) y enzimas proteolticas, denominadas en general granzimas. Estos componentes provocan dao en la membrana de la clula blanco lo que culminar con la lisis celular (mecanismo membranoltico). Bajo estas circunstancias, las perforinas, granzimas y otros componentes de los grnulos pueden ingresar a la clula blanco y activar la va de la apoptosis. Adems, tanto los LTc como las clulas NK producen y secretan una serie de citoquinas que pueden participar directamente en el proceso ltico o bien, estimular a otras clulas del sistema inmune. Es importante sealar que la muerte de la clula blanco ocurre generalmente a travs de mecanismos mixtos, membranoltico y mediado por la interaccin FasL-Fas; sin embargo, existen subpoblaciones minoritarias de LTc y clulas NK sin grnulos en su citosol, capaces de provocar citlisis aparentemente mediada slo por apoptosis. La etapa de lisis propiamente tal, es

independiente de la clula efectora, las que pueden reciclarse e iniciar nuevamente el proceso o quedar como una clula de memoria en el caso de los LTc. Tambin, estas clulas efectoras activadas pueden sufrir apoptosis inducida por el contacto con la clula blanco y post-activacin, proceso que experimentan tanto los LTc como las clulas NK. Por su parte, la clula blanco queda bajo la accin de los mecanismos intracelulares que gobiernan la apoptosis y bajo la accin ltica de las molculas citotxicas que culminarn con su muerte. Finalmente, en este captulo se analiza la accin efectora de los macrfagos en un tipo especial de hipersensibilidad, denominada hipersensibilidad retardada en que la interaccin de clulas presentadoras de antgeno (CPA) con linfocitos T CD4 (Th1) provoca la generacin de citoquinas y otros mediadores endgenos que permitirn la migracin y activacin de los macrfagos y otros leucocitos en una reaccin localizada.

2. CITOLISIS MEDIADA POR LINFOCITOS T El establecimiento de una respuesta inmune requiere la interaccin concertada de linfocitos T y B activados por sus respectivos antgenos. El reconocimiento del antgeno especfico por los receptores B o T de los linfocitos maduros, conduce a su proliferacin y por lo tanto, a la expansin clonal. Parte de la poblacin de linfocitos que ha reconocido a su respectivo antgeno se diferencia en clulas hiperreactivas al antgeno y de larga duracin, denominadas clulas de memoria. Dentro de las clulas T existen diferentes subtipos, por lo que pueden ocurrir diferentes respuestas efectoras: tales como la produccin de citoquinas a travs de los linfocitos CD4+ o la generacin de una actividad citotxica, predominantemente mediada por los linfocitos T CD8+ (LTc). Estas clulas citotxicas se encargan de lisar selectivamente clulas del individuo infectadas o transformadas por mecanismos citotxicos dependientes del contacto clula-clula. Por lo tanto, la accin principal defensiva de las clulas citotxicas es complementar la accin de los anticuerpos encargados fundamentalmente de reconocer antgenos forneos en el organismo y activar mecanismos efectores para su destruccin. Los LTc se caracterizan por el siguiente fenotipo bsico: TCR+, CD3+, CD8+; en algunos casos pueden ser tambin CD4+. Algunos son pequeos agranulares, otros grandes y granulares,

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lo que explica la existencia de los diversos mecanismos citolticos. Originalmente se pensaba que la interaccin del LTc con la clula blanco ocurra nicamente entre el complejo TCR-CD3 con el pptido presentado en conjunto con las molculas de MHC clase I o II; sin embargo, la fuerza de esta interaccin es muy dbil y son numerosas las molculas adicionales cuya participacin es necesaria, tales como: CD2, CD8, CD28 y LFA-1 y en la clula blanco, B7, CD22, ICAM-1 o 2 y LFA3. Entre las principales molculas inducidas postcontacto con las clulas blanco se encuentra la protena de superficie celular FasL, conocida tambin como Apo1L y CD95L. La contribucin de estas molculas no est limitada solamente a la unin intercelular, sino que tambin pueden generar seales coestimuladoras para los LTc que complementan la seal iniciada por la interaccin entre los complejos TCR-CD3 y MHC-pptido. En esta etapa los LT interactan con su clula presentadora o clula blanco, formando una estructura fsica y funcional importante o sinapsis inmunolgica, la que permite una unin ptima entre los receptores y sus respectivos ligandos, y la liberacin de los mediadores en forma localizada. Como ya se ha analizado previamente, los LTc requieren presentacin del antgeno, generalmente un pptido proveniente del medio intracelular unido al MHC tipo I (ver captulo 9). En nuestro organismo existen alrededor de 1013 clulas nucleadas y slo unos cientos de LTc vrgenes. Luego, es prcticamente imposible que cada LTc est permanente vigilando esta enorme cantidad de clulas en bsqueda del antgeno contra el cual est predeterminado. De hecho, raramente se encuentran circulando LTc en los tejidos perifricos. Recientemente, se ha caracterizado a la clula capaz de realizar la vigilancia inmunolgica en la periferia y de transportar a los rganos linfoides los antgenos desde ubicaciones distantes en el organismo. Esta es una clula presentadora derivada de la mdula sea, que internaliza protenas forneas (derivadas de virus o patgenos intracelulares) o directamente fagocita a las clulas infectadas, transformadas o los restos celulares y luego migra al rgano linfoide para presentar los antgenos as adquiridos; an no est definido molecularmente cmo esta clula logra presentar antgenos exgenos en el contexto de molculas MHC clase I, tericamente destinado exclusivamente a la presentacin de antgenos endgenos. En estudios realizados in vitro se ha demostrado que tanto macrfagos como clulas

dendrticas son capaces de presentar antgenos exgenos en el contexto de molculas MHC clase I, por lo cual estas clulas son los principales candidatos para realizar la labor de muestreo antignico permanente. Las clulas T CD8+ que han reconocido a su antgeno se encuentran capacitadas para lisar a las clulas blanco y esta funcin efectora debe ser ejercida para que se generen LTc de memoria. La interaccin de LTc con la clula blanco es fuertemente dependiente de Mg2+, este requerimiento reside principalmente en la unin LFA-1 - ICAM1; Ca2+ no puede reemplazar al Mg2+ aunque presenta un comportamiento sinrgico a concentraciones sub-ptimas de este ltimo. La figura 19-1 esquematiza el proceso citoltico general: (a) unin a la clula blanco (conjugacin); (b) activacin de la clula efectora (reconocimiento/ transduccin de seales); (c) generacin de la seal letal en la clula blanco, que abarca a los mecanismos de muerte celular por mecanismos: membranoltico (exocitosis de grnulos) y/o a travs de la interaccin FasL Fas que induce la muerte celular programada o apoptosis de la clula blanco y (d) separacin y reciclamiento de la clula efectora y lisis propiamente tal de la clula blanco.

Figura 19-1. Diagrama representativo de las principales etapas de la citotoxicidad mediada por clulas T y NK.

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En el programa de transduccin de seales, durante la activacin de los LT (ver captulo 10) ocurren bsicamente una serie de eventos de fosforilacin/desfosforilacin de protenas, mediados por protena quinasas PK y/o fosfatasas, la generacin de segundos mensajeros inositol trifosfato (IP3), diacilglicerol (DAG) y Ca2+ como seales positivas y otras mediadas ya sea por fosfatasas encargadas de la desfosforilacin de las protenas activadas (por fosforilacin) o por mediadores que desarrollen su accin a travs de AMP-cclico, actan como seales negativas. Este programa tambin ocurre en los LTc, por lo cual es conveniente tenerlo presente en el anlisis del proceso de citotoxicidad. De particular importancia, es la participacin de las isoenzimas de la PKC en el proceso de exocitosis de los grnulos; este tipo de enzimas es estimulado por DAG y Ca2+, y el proceso de exocitosis es imitado por steres de forbol e ionforos de calcio. Los inhibidores de protenas tirosina kinasas y de protena kinasa C,

inhiben el proceso citoltico. Adems, en general, aquellos mediadores endgenos (hormonas, neurotrasmisores) o exgenos (frmacos) que acten a travs de influjos de Ca2+, en los linfocitos citotxicos estimulan la citoxicidad y aquellos que producen aumento de AMPc se comportan como inhibidores. Estudios realizados principalmente in vitro han demostrado que los LTc pueden quedar en un estado anrgico o tolerante al reconocer a su antgeno en ausencia de las molculas coestimuladoras o cuando reconocen a un antgeno modificado respecto del original (con ciertos aminocidos cambiados respecto del pptido antignico). La seal letal en la clula blanco, definida como el punto a partir del cual la clula blanco queda irreversiblemente programada para la lisis, se puede generar en base a cualquiera de los dos mecanismos: membranoltico o dependiente de la interaccin FasL Fas apopttico, (figura 19-2)

Figura 19-2. Representacin esquemtica de la citotoxicidad de los LTc CD8+, frente a clulas blanco (CPA) Fas+ y Fas-. En el primer caso ocurren simultneamente los dos mecanismos de citolisis: membranoltico e interaccin Fasl-Fas; FasL es inducido postcontacto con la CPA. En este tipo de lisis hay formacin de poros y apoptosis. En el caso de clulas Fas-, solamente ocurre el mecanismo membranoltico. En algunos casos ocurre slo la interaccin FasL Fas: LT agranulares y otros sub-tipos minoritarios de LT, el mecanismo de lisis est basado solamente en esta interaccin.

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los que sern analizados en detalle a continuacin: 2.1. Mecanismo membranoltico Como su nombre lo indica, el mecanismo membranoltico implica la secrecin, por parte de los LTc de diversos componentes contenidos en los grnulos (ej: perforina, granzimas y proteoglicanos) los que participan en la destruccin de la membrana celular y por tanto de la clula blanco. Un evento importante y previo a la secrecin, es el reordenamiento de los elementos del citoesqueleto hacia la zona de contacto. Este reordenamiento ocurre nicamente en la clula efectora (en este caso LTc), no en la clula blanco favoreciendo la fusin de los grnulos con la membrana para la liberacin de su contenido al exterior. Muy rpidamente, luego de la unin con la clula blanco, el centro organizador de microtbulos (MTOC) de la clula efectora se orienta hacia la zona de contacto; es por esto que los agentes perturbadores de los microtbulos son potentes inhibidores de la citolisis, enfatizando la importancia de esta etapa. La secrecin de los grnulos, como ya se mencion, es un proceso dependiente de Ca2+. La perforina o protena formadora de poro (PFP), inicialmente tambin denominada citolisina, se encuentra en los grnulos de secrecin, es la principal protena citotxica y por lo tanto la candidata esencial para explicar la citotoxicidad mediada por los linfocitos. Es una protena inducible en los LT, que se expresa con su funcin citotxica a las 18-30 horas post-induccin; es decir, luego de la activacin del TCR o bien por accin de citoquinas, tales como IL-2 o IL-7. La perforina (65 kDa) presenta y homologa estructural con los componentes C6-C9 del complemento. La PFP es secretada al medio intercelular donde se une a la membrana plasmtica de la clula blanco y polimeriza a poliperforina, proceso que tambin depende de Ca2+. La PFP se une a fosfolpidos de la membrana, especialmente a residuos de fosforil-colina. De esta forma, se generan lesiones similares a las observadas por accin del complemento, pero en este caso mediadas por un solo tipo de protena. De hecho, la PFP en presencia de Ca2+ puede lisar directamente una gran variedad de clulas nucleadas, eritrocitos y vesculas lipdicas; sin embargo, tambin hay clulas resistentes a su accin. Recientemente, se ha descrito una enfermedad gentica muy poco frecuente y fatal en humanos, denomi-

nada Linfohistiocitosis hemofagoctica en la cual se encuentra mutado el gen que codifica para perforina o PFP. Estos pacientes tienen descontrolada su respuesta inmune predominando los LTc y macrfagos activados y tambin altas concentraciones de IFN- y TNF- en la sangre. En base a estos antecedentes, se ha propuesto una funcin adicional para esta protena la cual sera esencial para el control de la respuesta inmune ya que permitira la eliminacin de las clulas activadas y/o de las clulas presentadoras de antgeno. Las granzimas (enzimas de los grnulos) son tambin importantes en el proceso de lisis de la clula blanco. La mayor parte de stas (ms del 90% de las protenas de los grnulos) presentan actividad de serina-proteasa y pueden ser divididas en dos grupos: granzimas B, C, D, E, F y G que son altamente homlogas entre s (aproximadamente 6090%) y granzima A que est menos relacionada (aproximadamente 54-62%). Si bien su actividad proteoltica las ajusta muy bien a la accin citotxica de los LT, tambin se encuentren en los linfocitos CD4+ no citotxicos, por lo cual podran tener otras funciones como por ejemplo la separacin de la clula blanco de la clula efectora, permitiendo el reciclaje de esta ltima. A travs del estudio acucioso de los poros formados por poliperforina, se pudo demostrar el paso de granzimas, especialmente de la granzima B, hacia la clula blanco y de esta forma pueden activar a las enzimas proteolticas cistena proteasas o caspasas que inician la cascada de reacciones bioqumicas conducentes a la apoptosis de la clula blanco. Se ha demostrado adems, que la granzima B ingresa a la clula blanco a travs de la interaccin con receptores y una posterior endocitosis; es decir, por un mecanismo independiente de la formacin de poros. En estas condiciones tambin puede iniciar la cascada de activacin de las caspasas. Otros constituyentes de los grnulos son enzimas hidrolticas como fosfatasa cida, catepsina D y L-glucosidasa, las que tambin pueden activar la apoptosis de la clula blanco. Recientemente se ha descrito un nuevo componente de los grnulos, la protena granulisina que tiene una muy limitada actividad ltica sobre diversas clulas. Pertenece a las protenas que unen lpidos activando a enzimas que degradan lpidos como glucosilceramidasa, con lo cual aumenta la concentracin de ceramidas; las ceramidas son tambin activadoras de la cascada de caspasas. Mediante miscroscopa electrnica se ha demostrado que la

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granulisina provoca dao a la pared de bacterias tanto libres como intracelulares que infectan a clulas. Esta importante observacin sugiere un nuevo papel a los LTc que les permite actuar directamente en la destruccin de patgenos libres e intracelulares. El mecanismo de accin de esta protena es la separacin de la membrana externa del citoplasma, con la consiguiente acumulacin de lquido en el citoplasma, alteracin de la permeabilidad de la membrana conducente a la lisis osmtica de la bacteria. Los LTc sintetizan y almacenan en sus grnulos proteoglicanos, mayoritariamente condroitinsulfato A; estos compuestos tambin son secretados en el proceso citoltico y se les atribuye un papel protector de la clula efectora contra las molculas citotxicas, ya que los LTc no son destruidos en el proceso ltico. Adems, al pH de los grnulos, estos proteoglicanos se unen a la PFP y granzimas evitando la degradacin o inactivacin de estos componentes mientras se encuentran almacenados. Para explicar la citotoxicidad mediada por los linfocitos, se han postulado diversos mecanismos efectores alternativos, no necesariamente excluyentes entre s. Los LT activados tambin secretan una gran variedad de citoquinas, tales como: TNF y (linfotoxina) e IFN-. In vitro TNF- presenta actividad citotxica frente a una amplia variedad de clulas, an cuando no se ha demostrado su participacin directa en la accin de los LTc. Finalmente, tambin se ha postulado un papel citotxico a la molcula de ATP; este nucletido es efectivamente secretado al medio intercelular por los LTc activados y a travs de receptores purinrgicos en la clula blanco gatilla la lisis y defragmentacin del DNA en distintos tipos celulares. Los LTc son resistentes a esta accin aparentemente gracias a la presencia de una activa ecto-ATPasa. El mecanismo membranoltico entonces implica la participacin combinada de diversos agentes citotxicos que permiten explicar el dao en la clula blanco: muerte celular por la lisis osmtica y por apoptosis. 2.2. Mecanismo dependiente de la interaccin FasL-Fas Los CTL agranulares y tambin los granulares presentan la posibilidad de lisar directamente a la clula blanco a partir solamente de la interaccin de receptores y ligandos. Se ha demos-

trado que el bloqueo de la expresin de PFP no impide la activacin ni la proliferacin de las clulas T y adems, en cepas de ratones deficientes en PFP se ha demostrado la existencia de un mecanismo citotxico totalmente independiente de PFP. Esta actividad citotxica ocurre a travs de la interaccin de FasL, presente en las clulas efectoras activadas, y el receptor Fas (Apo1, CD95) presente en las clulas blanco. El receptor Fas es una glicoprotena de 35 kDa, perteneciente a la superfamilia de receptores para TNF; se encuentra expresado en linfocitos maduros, en linfocitos transformados por infeccin viral (HTLV-1, HIV, EBV) y en diversos tejidos no linfoides. Los anticuerpos anti-Fas pueden inducir el proceso de apoptosis en las clulas que poseen estas molculas; por lo que el conjunto de la informacin existente permite sugerir una directa correlacin entre la presencia de Fas en la clula blanco y su probabilidad de sufrir apoptosis. La molcula FasL es una protena transmembrana de 40 kDa, que aparece en los linfocitos activados; puede ser tambin liberada de la membrana por accin de una metaloproteinasa y de esta forma transformarse en CD95L soluble que acta como una molcula efectora citotxica. La interaccin LTc con la CPA respectiva, provoca la induccin de FasL en los primeros; si la CPA es Fas+ se producir la interaccin que inicia la cascada de activacin de caspasas. El receptor Fas se encuentra asociado a la protena adaptadora FADD (protena con dominio de muerte asociada a Fas) y con la aspartil-proteasa, enzima convertidora de interleuquina-1- (ICE), que es la enzima iniciadora de la cascada de activacin de las cistena proteasas o caspasas (cistenaaspart-asas) va que permite la activacin de nucleasas con el consiguiente dao al DNA y muerte celular por apoptosis. Algunas de las enzimas de esta va participan tambin en otros procesos fisiolgicos tales como la activacin de citoquinas pro-inflamatorias. Las caspasas se encuentran como pro-enzimas, las que una vez activadas, por protelisis limitada, pueden propagar esta accin mediante su actividad proteoltica sobre residuos especficos de cido asprtico. La induccin del proceso de apoptosis provoca una elevacin pre-ltica del Ca2+ intracelular lo que favorece la accin de las enzimas encargadas del desenrrollamiento y fragmentacin del DNA (topoisomerasas y endonucleasas) que son dependientes de Ca2+. En suma la apoptosis de la clula blanco se caracteriza por la condensacin de la

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cromatina, la formacin de estructuras tipo burbuja en la membrana plasmtica y la fragmentacin del DNA. Posteriormente, ocurre estrechamiento celular, dilatacin del retculo endoplsmico y finalmente fragmentacin celular con la formacin de fragmentos membranosos sellados denominados cuerpos apoptticos, los cuales son eficientemente removidos por fagocitosis evitando de este modo la generacin de una respuesta inflamatoria. Los LT activados que expresan simultneamente Fas y FasL, pueden interactuar entre s y autodestruirse, proceso que permite la disminucin de la respuesta inmunolgica. Como ya se ha mencionado, la apoptosis de la clula blanco puede ser inducida tambin por accin de la perforina y de algunas de las granzimas del mecanismo membranoltico. La tabla 19-1 resume las principales caractersticas de los LTc CD8+.

Los mecanismos efectores utilizados por los LTc CD8+ son tambin empleados por otras clulas del sistema inmunolgico. Tanto las clulas NK, como algunos linfocitos T CD4+, expresan o pueden expresar luego de ser activados; perforina, granzimas y FasL, y por lo tanto ejercer funciones citotxicas. En base a mutaciones de cada una de estas vas mediadoras de la lisis se ha comprobado que en el ratn, los LTc CD8 + ejercen citotoxicidad principalmente por exocitosis de los grnulos, mientras que los LTc CD4+, la ejercen principalmente por la interaccin FasL Fas. Un sub-tipo minoritario de LT, descritos principalmente en el ratn, se caracteriza por un fenotipo CD4+ o CD4-, CD8- doble negativo (DN) y NK1.1+ marcador de clulas NK murinas, por lo que se han denominado linfocitos NKT. Este tipo de LT, que tambin se ha identificado en los seres humanos, expresa un TCR constituido por un restringi-

Tabla 19-1. Propiedades generales de las clulas citotxicas Linfocitos T citotxicos Receptores y co-receptores que interactan con la clula blanco1. TCR, CD8, CD28, CD95L2 Funcin citotxica Mecanismo membranoltico: Muerte celular por lisis osmtica y apoptosis Interaccin FasL Fas (CD95L CD95): Muerte celular por apoptosis.

Clulas NK Receptores y co-receptores que interactan con la clula blanco Receptores de activacin NKp46, NKp44, NKp30, NKG2C/D, CD2, CD16, CD28, CD44, 2B4, CD95L2 Receptores de inhibicin3 Superfamilia del tipo lectina C: NKG2A/B; Superfamilia inmunoglobulinas:KIR 2-DL1 (p58.1), KIR2-DL2/3 (P58.2); KIR 3-DL1 (p70). LIR-1. 1 2

Funcin citotxica : Citotoxicidad natural y ADCC. Mecanismo membranoltico: Muerte celular por lisis osmtica y apoptosis Interaccin FasL Fas (CD95L CD95): Muerte celular por apoptosis.

Se incluyen los receptores y co-receptores ms representativos de la funcin citotxica. CD95L es inducido post-contacto con la clula blanco. 3 Algunas sub-poblaciones de LT CD8+ tambin expresan receptores de inhibicin de las familias de protenas sealadas, actuando como inhibidores de la citotoxicidad y de la secrecin de citoquinas. CD: Antgenos de grupo de diferenciacin. KIR: Receptor de citotoxicidad del tipo inmunoglobulinas; LIR: receptor similar a inmunoglobulinas.

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do conjunto de cadenas y una cadena invariante; reconocen a la molcula CD1 de la CPA, que son similares a las molculas MHC-I, pero se encuentran localizadas en el genoma fuera de la regin que codifica para las molculas MHC-I. La molcula CD1 presenta componentes lipdicos bacterianos a las clulas NKT. Los linfocitos NKT estn capacitados para expresar FasL y en respuesta a la IL-12 producen perforina y adquieren funciones citotxicas frente a clulas tumorales. La expresin constitutiva de FasL por algunos tipos celulares ha permitido explicar, al menos parcialmente, la existencia de reas inmunolgicas privilegiadas, definidas como aquellas reas en que una alteracin aun muy menor, puede provocar un dao irreversible. Tal es el caso del ojo, las clulas del parnquima y testculo, las clulas de Sertoli, ambos tipos celulares expresan FasL en forma constitutiva, lo que les permite eliminar clulas T y clulas tumorales que expresen Fas. En estas reas se ha observado tambin un menor rechazo a los trasplantes de tejido. Los LTc que han reconocido y destruido a una clula blanco pueden diferenciarse a clulas de memoria adquiriendo una hiper-reactividad contra el antgeno reconocido y pueden durar meses o aos localizadas en los rganos linfoides secundarios, o pueden sufrir el proceso de apoptosis post-activacin. Las seales que determinan el destino de estos LTc an no estn claramente definidas, pero en base a recientes estudios con ratones transgnicos se ha postulado la participacin de PFP en el control de la expansin de los LTc y de IFN- en la regulacin de la inmunodominancia y la fase de muerte de los LTc. Sin duda, en el desarrollo de vectores adecuados para vacunas que requieran la induccin de inmunidad celular es importante considerar que para obtener LTc de memoria deben cumplirse todas las etapas previamente descritas, es decir no basta con la sola presentacin del antgeno, sino adems se requiere que los LTc hayan desplegado su capacidad citotxica en respuesta al antgeno reconocido.

mielomonocticas en base a su origen, fenotipo y funcionalidad. Provienen de la mdula sea y se encuentran en la sangre y tejidos linfticos, especialmente el bazo. Una de las funciones ms caracterstica de las clulas NK es la citolisis ejercida sobre una gran variedad de clulas: clulas tumorales, clulas transformadas por virus, clulas infectadas por bacterias intracelulares y diversos microorganismos tales como bacterias, hongos y parsitos. Una segunda caracterstica importante es la secrecin de citoquinas, especialmente IFN-. Morfolgicamente las clulas NK corresponden a linfocitos granulares grandes y su fenotipo ms aceptado es: CD3-, TCR-, CD2, CD8 , CD16 + , CD56 + . Existen tambin subpoblaciones minoritarias agranulares. Las clulas NK pueden activarse a travs del contacto con clulas sensibles o clulas blanco o por la accin de mediadores solubles, principalmente citoquinas. La accin citoltica mediada por estas clulas, es mayoritariamente espontnea, es decir no requiere activacin previa y no est restringida a la presencia del Complejo Principal de Histocompatibilidad. Este concepto actualmente ha cambiado pues se ha descrito una gran variedad de receptores que reconocen a los complejos MHC clase I de la clula blanco pero este reconocimiento, a diferencia de lo que ocurre con los LTc, en las clulas NK genera principalmente una seal negativa, inhibindose la lisis de la clula blanco. Existe una amplia variedad de receptores de inhibicin y de receptores de activacin de la citotoxicidad; algunos de ellos tienen como ligandos molculas de MHC-I. Una de las principales diferencias entre las clulas NK y los LTc radica en que la capacidad efectora de estos ltimos depende finalmente del receptor TCR, en cambio, en el caso de las clulas NK, existe una variedad de receptores en la misma clula, algunos capaces de activar y otros capaces de inhibir su programa citoltico. 3.1. Citotoxicidad mediada por clulas NK La citotoxicidad mediada por las clulas NK (CMC-NK) ocurre tambin en etapas; la primera es la etapa de reconocimiento y unin a la clula blanco. Esta etapa no es determinante en el proceso citoltico, ya que las clulas NK se unen con la misma afinidad tanto a clulas sensibles como a clulas resistentes. Sin embargo, cuando se unen a una clula sensible (clula blanco), o se estimu-

3. CITOLISIS MEDIADA POR CLULAS NK Las clulas NK, pertenecientes al sistema inmunolgico innato, son una tercera poblacin muy heterognea de linfocitos, que se puede diferenciar de los linfocitos B, T y clulas

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la alguno de los receptores activadores de la citolisis se produce la activacin, es decir la serie de procesos bioqumicos que caracteriza a esta etapa, fosforilacin de protenas y enzimas, especialmente protena quinasas y protenas adaptadoras y la generacin de los segundos mensajeros (ver Captulo 9). La citotoxicidad es la funcin ms reconocida de estas clulas, la que les confiere un amplio papel defensivo frente a enfermedades infecciosas y neoplsicas. La CMCNK puede ser de dos tipos: a) Citotoxicidad natural; la ejercen sobre clulas tumorales, transformadas por virus, infectadas por bacterias patgenas intracelulares y sobre algunos tipos de clulas normales; se basa en el reconocimiento celular por mecanismos an no del todo comprendidos, pero que es espontneo y no requiere activacin previa. Existe descrito hasta ahora un amplio repertorio de receptores de activacin y de inhibicin, que permiten explicar, en parte, la citotoxicidad natural. b) Citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC), ha sido hasta ahora la ms estudiada y es dependiente del receptor Fc de baja afinidad de IgG (FcRIII o CD16); este receptor reconoce al fragmento Fc de los anticuerpos que recubren a la clula blanco. Los mecanismos de lisis celular son similares a los descritos para los LTc; membranoltico e interaccin FasL Fas, conducente a apoptosis de la clula blanco. En el mecanismo membranoltico participan, perforina, granzimas, un factor citotxico de las clulas NK (NKCF), que corresponde a una protena con actividad citotxica y tambin la protena granulisina con actividad ltica bacteriana. En el caso de la lisis por la interaccin FasL Fas; FasL es inducido y expresado en la superficie de las clulas NK postcontacto con la clula blanco. El modelo de citotoxicidad natural ms aceptado hasta ahora, implica la participacin simultnea de receptores de activacin e inhibicin de las clulas NK en su interaccin con la clula blanco. Los receptores de activacin al ser activados ponen en marcha la maquinaria citotxica de las clulas que implica una amplia fosforilacin de protenas y los receptores de inhibicin al estar asociados a fosfatasas, se encargan de bloquear la activacin. Bajo esas circunstancias (figura 193) en el balance global de la respuesta, prima la inhibicin y no hay lisis de la clula blanco. Durante mucho tiempo se buscaron receptores de activacin que permitieran explicar la citotoxicidad, sin embargo el mayor conocimiento de este fenmeno hasta ahora ha provenido del

estudio de los receptores de inhibicin que en su gran mayora reconocen a las molculas MHC-I. Cuando disminuye o desaparece la expresin de estos complejos, como es el caso de la infeccin viral o la transformacin tumoral, mecanismo que les permite evadir a la respuesta inmune especfica, desaparece la seal de inhibicin y ocurre la lisis de la clula blanco. En este principio se basa la actividad anti-viral y anti-neoplsica de las clulas NK. Se ha observado adems, por anlisis in vitro, que muchas clulas tumorales expresan tipos de MHC-I que las protegen de la lisis de las clulas NK al ser reconocidos por los receptores de inhibicin de la citotoxicidad, mecanismo que aparece como una nueva posibilidad de evasin de la respuesta inmune.

Figura 19-3. Activacin de clulas NK. (a) La activacin conjunta de receptores de activacin y de inhibicin de las clulas NK representa la situacin en que no hay lisis de la clula blanco. (b) Si la clula blanco, pierde o disminuye la expresin del complejo MHC-I, y estn simultneamente presentes los receptores de activacin adecuados, hay lisis de la clula blanco. En la activacin de las clulas NK se induce la expresin de FasL; si la clula blanco expresa Fas puede ocurrir tambin lisis mediada por esta interaccin. RA: Receptor de Activacin; RI: Receptor de Inhibicin. LA: Ligando Activador.

Existen dos grandes familias de receptores de inhibicin que reconocen a las molculas de MHC-I, la superfamilia de las lectinas del tipo C y la superfamilia de las inmunoglobulinas (tabla 19-1). Los representantes de las lectinas se encuentran localizados en el cromosoma 6 murino y 12 humano y los de la superfamilia de inmunoglobulinas humana en el cromosoma 19. Todos estos receptores poseen en su extremo

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citoplasmtico secuencias ITIM (dominio o motivo de inhibicin basado en tirosina del inmunorreceptor). Qu es lo que reconocen los receptores de inhibicin en las molculas MHCI? Para poder responder esta pregunta nos referiremos en primer lugar a los receptores KIR (receptores de inhibicin de clulas NK) que han sido los ms estudiados. Estos receptores reconocen molculas MHC-I de los tipos A, B, C y G, especficamente a regiones polimrficas de los dominios 1, aminocidos 77 a 83. Si bien los pptidos presentados por estas molculas pueden afectar la conformacin de la molcula en el sitio de la interaccin con los KIR, no hay ninguna evidencia hasta ahora, sobre una interaccin directa entre el receptor y los pptidos antignicos presentados. Por otra parte, la interaccin KIR MHC-I presenta una estequiometra 1:1 y una constante de disociacin (Kd), del orden de 10 -6 M; valor que se encuentra en el rango de otras interacciones clula clula. La interaccin de los receptores tipo lectina, con los complejos MHC-I, ocurre tambin a travs del reconocimiento de secuencias de los dominios 1 y 2. Las clulas NK expresan diversas combinaciones de receptores, incluyendo los receptores de inhibicin, lo que refuerza el papel del conjunto heterogneo de estas clulas en el reconocimiento celular y desarrollo de sus funciones. Los receptores de inhibicin, descritos inicialmente en las clulas NK, se encuentran tambin en los LT, especialmente en los LT CD8+ de memoria. En este tipo de linfocitos se han descrito las mismas funciones; es decir inhibicin de la citotoxicidad y de la secrecin de citoquinas. Los receptores de inhibicin del tipo lectina, que carecen de las secuencias ITIM, receptores truncados, se comportan como receptores de activacin al interactuar con sus respectivos ligandos; tal es el caso del receptor CD94-NKG2C, asociado a la sub-unidad DAP12, sub-unidad que posee secuencias ITAM (Dominio o motivo de activacin basado en tirosinas del inmunorreceptor) en su extremo citoplasmtico, y que reconoce a molculas MHC-I y del receptor CD94-NKG2D, asociado a la sub-unidad DAP10, que posee secuencias SH2 en su extremo citoplasmtico y que reconoce a la molcula MICA (molcula relacionada a MHC-I de tipo A), una protena homloga distante de las molculas MHC-I inducible por estrs, que funciona como antgeno de los LT y que frecuentemente se encuentra expresada en las clulas epiteliales tumorales. Este ltimo recep-

tor de las clulas NK presenta por lo tanto reconocimiento y activacin por el contacto con clulas tumorales. La mayora de los receptores de activacin de las clulas NK actan en forma independiente del reconocimiento de los MHC-I. Gran parte de estas molculas se conocen desde hace tiempo: CD2, CD16, CD69, CD28 y el coreceptor 2B4, a los que se han sumado recientemente los denominados NCR: NKp46, NKp44 y NKp30. Estos ltimos se encuentran asociados a sub-unidades que poseen secuencias ITAM, y todos activan la citotoxicidad; sin embargo no ha sido fcil encontrar sus respectivos ligandos en las clulas tumorales. Aparentemente existe un escape de la respuesta inmunolgica innata, tal como existe escape de la respuesta inmunolgica especfica, en que la transformacin tumoral impide la expresin de los ligandos correspondientes. Los ligandos conocidos son CD58 para CD2, IgG para CD16; el co-receptor 2B4, reconoce a CD48, pero su participacin depende de la expresin de los NCR para ejercer su contribucin a la citolisis. Las clulas NK pueden ser activadas, a travs del contacto directo con clulas blanco, no existiendo un solo tipo de receptores involucrado en la activacin, lo que explicara en parte la heterogeneidad e inespecificidad de su accin. El FcIIIA o CD16, ha sido uno de los ms estudiados y merece un comentario particular pues da cuenta del proceso de citolisis mediada por anticuerpos (ADCC) (ver captulo 10, figura 10-6). 3.2. Receptor FcRIIIA (CD16) Las clulas NK pueden lisar eficientemente a clulas tumorales o transformadas por virus si stas se encuentran recubiertas u opsonizadas con anticuerpos IgG de determinadas subclases (IgG1 o IgG3 en humanos). Asociados a este receptor se encuentran las sub-unidades y tambin se han descrito las sub-unidades CD3 y CD3, an cuando sin la expresin total del complejo CD3; existiendo por lo tanto una clara similitud entre el TCR y el receptor FcRIIIA, lo cual, permite explicar la similitud en el mecanismo de activacin de las clulas NK y linfocitos T. Las clulas NK slo expresan el receptor de baja afinidad para IgG (FcRIIIA). La activacin de este receptor, que no posee actividad enzimtica, a travs de clulas opsonizadas por anticuerpos o anticuerpos antiCD16 resulta en la ya descrita fosforilacin/

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desfosforilacin principalmente en tirosina de diversas protenas y la posterior produccin de las citoquinas IFN- y del factor estimulador de colonias de granulocito-macrfagos (GM-CSF). La ADCC corresponde entonces al tipo de mecanismo efector en el que las clulas citotxicas carecen de especificidad por el antgeno, reconociendo a travs del receptor Fc la molcula de anticuerpo que acta como puente entre ambos tipos celulares. La tabla 19-1 resume las principales caractersticas de las clulas NK. La generacin de IFN- es de particular importancia en los mecanismos defensivos contra la infeccin, pues existe una extraordinaria coordinacin entre la respuesta de los monocitomacrfagos y las clulas NK, especialmente cuando stos se encuentran infectados con bacterias patgenas intracelulares. El macrfago en su respuesta inicial al agente infeccioso (bacterias, parsitos, toxinas) es capaz de producir una serie de citoquinas (TNF-, IL-1, IL-12, IL-15 e IL-18) que al interactuar con las clulas NK las estimulan para la produccin de IFN-, esta citoquina es capaz de activar al macrfago, estado en el que adquiere mecanismos altamente eficientes contra los microorganismos patgenos. Si bien, obviamente, esta no es la nica va de generacin de IFN-, es importante en la defensa anti-infecciosa temprana y representa otra de las propiedades inherentes de las clulas NK. Las citoquinas liberadas por el macrfago y las clulas NK en este proceso tambin activan a los LT CD4+ y CD8+, es decir, participan los mecanismos de la inmunidad innata y de la inmunidad adquirida en conjunto. La persistente accin estimuladora de algunas de las citoquinas provoca inactivacin y muerte de las clulas NK; as el efecto conjunto in vitro de IL-12 e IL-15 o IL-2 e IL-12 por ejemplo, provoca este efecto en las clulas NK que nos permite dar una respuesta a la situacin fundamental de eliminacin de las clulas citotxicas una vez activadas para evitar su accin sobre las clulas normales. El solo contacto de las clulas NK con clulas sensibles y su posterior activacin, son tambin seales de inactivacin y muerte para las clulas citotxicas; este efecto se ha denominado activacin que induce muerte celular (AIMC) y tambin lo experimentan los LT. En este caso, la repetida estimulacin antignica sumada a la accin de citoquinas como IL-2 y a la induccin de la expresin de FasL favorecer su autoeliminacin.

Finalmente nos referiremos muy brevemente a las principales citoquinas moduladoras de la actividad citoltica de las clulas NK. Entre estas citoquinas estimuladoras se encuentran: IL-2, IL7, IL-12, IL-15, IL-18, TNF- y los diferentes tipos de interfern. De stas, la ms estudiada, del punto de vista teraputico ha sido la IL-2 pues adems de producir la estimulacin de la citolisis es capaz, a largo plazo y bajo determinadas condiciones in vitro, de generar una nueva estirpe celular denominada clulas LAK (clulas citotxicas estimuladas por linfoquinas) que adems de ser muy heterogneas, se caracterizan por ampliar la especificidad y la agresividad de la citotoxicidad. Las clulas LAK se han utilizado como terapia antineoplsica desde mediados de la dcada de los 80. Recientemente se les han incorporado genes de citoquinas estimuladoras como TNF- o IL-2, para optimizar su accin teraputica. Entre las citoquinas inhibitorias de las clulas NK estn los factores de crecimiento TGF- (factor de crecimiento transformante ) y PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas).

4. MTODOS DE ESTUDIO DEL PROCESO CITOLTICO Si bien el anlisis de este tipo de metodologas escapa a los objetivos de este captulo, se har una breve mencin de stos para complementar la comprensin de los dos tipos de mecanismos involucrados en la lisis celular. Para medir la lisis de una clula se pueden utilizar colorantes vitales, los cuales son excluidos de una clula no daada; o tambin se puede medir la liberacin de enzimas citoslicas al medio como ndice de dao, tales como: lctico deshidrogenasa. Sin embargo, uno de los mtodos ms ampliamente utilizado es la incorporacin de sales de Cr radiactivas (Na251CrO4). En este caso las clulas (blanco) captan inespecficamente el Cr+6 y lo reducen Cr+3, este catin se une a las macromolculas intracelulares, principalmente a las protenas. Si la clula blanco radiomarcada sufre dao por accin de las clulas citotxicas, se libera el Cr+3 al medio lo que se utiliza para calcular un ndice de citotoxicidad. Este mtodo no discrimina entre necrosis y apoptosis; sin embargo, mediante el uso de inhibidores de la apoptosis, como agentes secuestradores de Ca2+ intracelular, s se puede cuantificar la contribucin de cada uno de estos mecanismos en la lisis final de la clula blanco.

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Para la determinacin de apoptosis existen diversas metodologas, generalmente orientadas al anlisis de la fragmentacin del DNA; esto principalmente se logra usando precursores radiactivos (125I-timidina) que se incorporan al DNA de la clula blanco y posteriormente durante la apoptosis se liberan como seal de fragmentacin ocurrida. Los mtodos ms utilizados actualmente son el anlisis directo de los fragmentos de DNA producidos mediante electroforesis en geles de agarosa y el anlisis del DNA mediante microscopa o citometra de flujo. Tambin es posible la deteccin de las enzimas proteolticas caspasas activadas intracelulares de las clulas blanco, como ndice de apoptosis, para lo cual se utilizan anlogos de sustrato de estas enzimas, unidos a fluorocromos, como rodamina, utilizando citometra de flujo para su deteccin.

5. HIPERSENSIBILIDAD RETARDADA (HR) Los linfocitos T, especialmente CD4+, participan en este particular tipo de reaccin, en que producto de la interaccin entre la CPA y LT CD4+, se secretan diversas citoquinas que producen a su vez mltiples efectos. Algunas de estas citoquinas activan a las clulas endoteliales de las vnulas para reclutar leucocitos en el sitio y otras se encargan de activar a los monocitos para transformarlos en macrfagos que puedan eliminar a los antgenos. Es decir, el mecanismo efector final en la HR es el efecto citotxico mediado por los macrfagos activados. Este mecanismo participa en la eliminacin de los patgenos intracelulares, tales como: Listeria monocytogenes y Mycobacterium tuberculosis; estos microorganismos no pueden ser eliminados por los monocitos en reposo y requieren de las citoquinas activadoras derivadas de los LT y clulas NK para activarse. Este mismo tipo de mecanismo puede ser iniciado por otro tipo de antgenos inocuos, tales como: antgenos proteicos solubles o haptenos qumicos. En este caso, sin la participacin de microorganismos patgenos, la activacin de los macrfagos puede generar dao tisular en el sitio de la reaccin, de aqu deriva el trmino de hipersensibilidad. Los modelos animales para el estudio de HR son por ejemplo cobaya inmunizada, a la cual se le aplican pinceladas del antgeno o bien inyecciones intradrmicas de ste, observndose entre

las 24 a 48 hrs. una reaccin tpica localizada en la piel de enrojecimiento y edema. La HR tambin ocurre en los seres humanos, como por ejemplo debido a la administracin intradrmica del derivado proteico purificado (PPD), del Mycobacterium tuberculosis, a individuos que han padecido de tuberculosis o que han sido vacunados contra esta enfermedad, provocar en ellos la reaccin de HR. El mecanismo involucrado en el inicio de la HR experimental es a travs del contacto entre el antgeno extrao y LT CD4+ y CD8+ especficos, logrndose de este modo la activacin, expansin y proliferacin de los LT especficos. La siguiente etapa implica nuevamente el contacto entre el antgeno y los LT a nivel perifrico local donde se produce como resultado la secrecin de las citoquinas TNF- y TNF-, IL-2 e IFN-. Las CPA que inician la HR, pueden ser tambin clulas endoteliales venosas que activan a los LT; estas clulas tienen una activa participacin en diversos procesos fisiopatolgicos: pueden interactuar con otras clulas y tambin producir mediadores, especialmente de la inflamacin. El encuentro con el antgeno provoca la diferenciacin de las clulas T CD4+ a clulas del tipo Th1, que se caracterizan por la secrecin de las citoquinas. El IFN- es un potente activador de los macrfagos, aumenta la capacidad fagoctica e induce la expresin de molculas de MHC-II. La IL-2 es un estimulador de las clulas T, que en este caso puede actuar en forma autocrina y adems estimular a clulas T no especficas para el antgeno. El TNF- y o linfotoxina son dos citoquinas que ejercen su accin preferentemente sobre las clulas endoteliales, las cuales producen (a) mediadores de la inflamacin como prostaciclina, xido ntrico (NO) que aumentan el flujo sanguneo local aumentando la llegada de los leucocitos al sitio de la inflamacin; (b) quimioquinas, que son pptidos relativamente pequeos con potente actividad quimioatractante y de activacin de los leucocitos; un ejemplo de quimioquina es la IL-8; (c) aumento de la expresin de molculas de adhesin que favorecen la migracin y diapedesis de leucocitos hacia el sito de la HR. La IL-12 producida por los macrfagos tambin provoca la diferenciacin a Th1, de modo que es importante su participacin en el mecanismo general. En su conjunto entonces, los cambios producidos por estos mediadores explican: la vasodilatacin, la adhesin de leucocitos y el aumento de la permeabilidad vascular. El papel efector final lo cumplen los macrfagos activa-

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dos que han migrado y que presentan una mayor capacidad de produccin de metabolitos reactivos del oxgeno, NO y enzimas lisosomales; aumento de la expresin de molculas MHC y del coestimulador B7 y un aumento tambin en su capacidad productora de citoquinas. Por ello pueden ejercer diversas funciones, tales como: destruccin de microorganismos por fagocitosis, secrecin a su vez de potentes mediadores de la inflamacin, citoquinas y factores de crecimiento e inclusive pueden adquirir citotoxicidad contra clulas tumorales. Morfolgicamente, la HR se caracteriza por acumulacin de clulas mononucleares en el tejido subcutneo y dermis. Esta acumulacin es notable en venas y vnulas producindose permeabilidad microvascular, prdida de protenas plasmticas, edema y depsito de fibrina, estas seran las causas del proceso de induracin caracterstico de las lesiones en la piel observadas en esta reaccin. Ms tardamente en la HR, especialmente si no se ha logrado eliminar a las clulas infectadas se forman los denominados granulomas. stos consisten en un acmulo de clulas y materiales de desecho rodeados por macrfagos que han calcificado formando, como ltima medida de seguridad, una barrera fsica de contencin para impedir la diseminacin del patgeno. En este fenmeno resulta muy importante la participacin de la IL-12 y Eta-1 u osteopontina (citoquina de activacin temprana de los linfocitos). La Eta-1 es requerida tempranamente para aumentar y potenciar la secrecin de IL-12, la producen los LT en el sitio de la infeccin y tiene tambin un papel en el reclutamiento de los monocitos y en la posterior inhibicin de la IL-10, citoquina inhibitoria de la formacin de los granulomas. Los agentes ms estudiados que activan directamente a los monocitos y otras clulas importantes del sistema inmunolgico, son la endotoxina bacteriana conocida como lipopolisacrido (LPS) y las lipoprotenas bacterianas; estas molculas interactan con receptores en el monocito tales como: CD14 en el caso del LPS y los recientemente caracterizados del tipo Toll (TLR), que reconocen tanto el LPS como las lipoprotenas bacterianas. La descripcin de los TLR, que en su regin extracelular son homlogos a la protena Toll de Drosophila, ha llenado un importante vaco en el mecanismo de accin del LPS, pues corresponde a una molcula transmembrana. CD14 es una protena anclada en la superficie externa de la membrana plasmtica. Dentro de la amplia

familia descrita de receptores TLR, los TLR2 y TLR4 reconocen a componentes bacterianos; TLR4 a LPS y TLR2 a componentes de bacterias Gram positivas. La activacin de estos receptores (CD14 y TLR) desencadena una serie de eventos (especialmente de fosforilacin de protenas) que comunican la superficie celular del monocito con el ncleo y que permiten explicar molecularmente los importantes cambios morfolgicos experimentados durante la diferenciacin a macrfago activado y la expresin de las diferentes citoquinas y otros productos secretados, que sern capaces de actuar en estrecha coordinacin con diversos tipos celulares. Por su parte, las clulas NK tambin poseen receptores TLR no as CD14, lo cual explicara su capacidad de responder al LPS en ausencia de CD14.

LECTURAS SUGERIDAS Kgi, D., Lederman, B., Brki, K., Zinkernagel, R. & Hengartner, H., Molecular mechanisms of lymphocyte-mediated cytotoxicity and their role in immunological protection and pathogenesis in vivo. Annu Rev Immunol. 14, 207-232 (1996). Moretta, A., Biassoni, R., Bottino, C., Mingari, M. & Moretta, L. Natural cytotoxicity receptors that trigger human NK-cell-mediated cytolysis. Immunology Today, 21, 228-234 (2000). Trapani, J., Davis, J., Sutton, V.R. & Smyth, M., Proapoptotic functions of cytotoxic granule constituents in vitro and in vivo. Curr Opin Immunol. 12, 323-329 (2000).

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 20
RESPUESTA INMUNE MEDIADA POR IgE
Arnoldo Quezada L. y Edgardo Carrasco C.

1. 2. 3. 4.

Introduccin Caractersticas de la IgE Mastocitos y Basfilos Receptores para IgE y liberacin de mediadores 5. Regulacin de la sntesis de IgE 6. Rol biolgico de la respuesta mediada por IgE 7. Aplicaciones biomdicas

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RESUMEN La respuesta inmune mediada por IgE se refiere a la unin de un antgeno con su IgE especfica que ocurre en la superficie de mastocitos o basfilos y determina la liberacin de numerosos mediadores inflamatorios con accin biolgica sobre vasos sanguneos, glndulas secretorias, terminaciones nerviosas y msculo liso. Se describen las caractersticas de la IgE, de los mastocitos y basfilos, enfatizando la presencia de receptores para IgE en estas clulas y la liberacin de mediadores. En la regulacin de la sntesis de IgE se describen las clulas involucradas, destacando las subpoblaciones de LTh y las citoquinas que participan en los mecanismos de promocin e inhibicin. En relacin al rol biolgico se sealan las enfermedades que cursan con altos niveles sricos de IgE, y la participacin de stas en enfermedades alrgicas y parasitarias. Finalmente, se comenta las aplicaciones biomdicas de la respuesta mediada por IgE.

1. INTRODUCCIN La respuesta inmune mediada por inmunoglobulina E (IgE), como su nombre lo indica se refiere a la unin de un antgeno con su IgE especfica en la superficie de un mastocito o basfilo que determina la liberacin de numerosos mediadores inflamatorios con accin biolgica sobre vasos sanguneos, glndulas secretorias, terminaciones nerviosas y msculo liso. La serie de eventos que supone esta reaccin presenta varias particularidades que se describirn en este captulo. Las primeras observaciones que facilitaron la identificacin de este tipo de reaccin se atribuyen a Prausnitz y Kstner quienes al inyectar un extracto antignico de pescado en la piel de sujetos alrgicos indujeron una reaccin cutnea de roncha y eritema. Si inyectaban suero de sujetos alrgicos al pescado en la piel de sujetos sanos, y los inoculaban con el antgeno, podan transferir pasivamente esta reaccin local. Basados en estas observaciones se otorg la denominacin de reaginas a los anticuerpos presentes en el suero de enfermos alrgicos, susceptibles de ser detectados en la piel, con la propiedad adicional de ser transferidos mediante suero a sujetos sanos. En los ltimos aos de la dcada del sesenta, Johansson e Ishizaka en forma independiente lograron identificar a la IgE como responsable de esta actividad reagnica.

2. CARACTERSTICAS DE LA IgE La estructura molecular de la IgE es semejante a las otras clases de inmunoglobulinas en cuanto a la presencia de dos cadenas pesadas y dos cadenas livianas (ver captulo 6). Sin embargo, su peso molecular es 190 kDa y las cadenas pesadas (psilon) poseen cinco dominios. No acta como opsonina, ni activa el complemento, pero tiene una alta citofilia y posee dos sitios de unin a las clulas cebadas o mastocitos, basfilos y otras clulas (clulas de Langerhans, macrfagos, linfocitos, eosinfilos y plaquetas). La zona de unin a dos tipos de receptores celulares (FcRI y FcRII) se encuentran en los dominios C2 y C3 de la cadena pesada, en el segmento Fc de la inmunoglobulina. La cantidad de IgE srica normalmente es muy baja, 0,003% del total de inmunoglobinas, y aumenta apreciablemente en las enfermedades atpicas. Existe IgE total o libre srica e IgE unida a los receptores de mastocitos y basfilos.

3. MASTOCITOS Y BASFILOS Los mastocitos o clulas cebadas se originan en la mdula sea, a partir de clulas progenitoras que migran a los tejidos y se diferencian in situ. Se encuentran distribuidos principal y abundantemente en la piel, mucosa intestinal y mucosa respi-

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ratoria (nasal y bronquial), alrededor de arteriolas y en conexin con fibras nerviosas sensitivas. Su tamao vara entre 10 y 15 m, poseen un solo ncleo redondeado u oval excntrico y grnulos citoplasmticos de 0.1 a 0.4 m de dimetro, en nmero de 50 a 200 por clula, que contienen histamina y otros mediadores. Estos mediadores producen aumento de permeabilidad vascular, contraccin del msculo liso, hipersecrecin mucosa y estimulacin de terminaciones nerviosas. Los grnulos citoplasmticos electrodensos se encuentran unidos a la membrana celular, se tien con azul de toluidina y dan un color rojo metacromtico o violeta. La superficie celular presenta numerosas proyecciones de la membrana. El contenido de histamina de los grnulos del mastocito es 5 veces mayor que en los basfilos. Se han identificado subtipos de mastocitos: existe una poblacin dependiente de linfocitos T que predomina en pulmones y mucosa gastrointestinal y contienen triptasa (una proteasa neutra que se encuentra en los grnulos citoplasmticos), y otra poblacin denominada TC (del tejido conectivo intersticial), que predomina en la piel y en la submucosa gastrointestinal, que contienen triptasa, quimasa y heparina. Los basfilos (ver captulo 3) comparten muchas de las caractersticas de los mastocitos, pero tambin muestran claras diferencias. Se originan en la mdula sea, como los otros polimorfonucleares y son elementos predominantemente circulantes, constituyendo el 0.5 a 1% de la frmula leucocitaria granuloctica del hemograma normal. Miden 5 a 7 m y poseen un ncleo bilobular o multilobulado, con cromatina densa en la periferia. La superficie celular es lisa y con cortos pseudopodios irregulares. Contienen grnulos citoplasmticos con histamina y presentan acmulos electrodensos de glucgeno que no se encuentran en los mastocitos. Si bien comparten con los mastocitos la particularidad de presentar receptores de membrana de alta afinidad para la IgE, la importancia de los basfilos en la inmunidad y en la hipersensibilidad est an por definirse, aunque se sabe que participan en la fase tarda de la hipersensibilidad inmediata. A diferencia de mastocitos, tienen molculas de adhesin (Mac-1 y LFA-1) que les permite migrar del torrente sanguneo a los sitios de inflamacin alrgica, atrados por receptores de molculas de adhesin del endotelio vascular.

4. RECEPTORES PARA IgE Y LIBERACIN DE MEDIADORES Los mastocitos y basfilos poseen en su membrana celular receptores de alta afinidad para la IgE (FcRI) (figura 20-1). Estos receptores tienen una estructura tetramrica conformada por una cadena , una cadena y dos cadenas idnticas. El sitio de unin se ubica en la porcin terminal de la cadena del receptor que se une a una porcin de 76 aminocidos ubicada en segmentos de los dominios C2 y C3 de la cadena de la IgE (segmento Fc). Otras clulas (eosinfilos, plaquetas, monocitos/macrfagos, linfocitos B y linfocitos T) poseen receptores de menor afinidad (FcRII).

Figura 20-1. Estructura del receptor de IgE.

La unin de la IgE con el receptor de alta afinidad desencadena la degranulacin de mastocitos y basfilos cuando dos molculas de IgE se unen a un antgeno (Ag) multivalente. Las cadenas y de los receptores son protenas de membrana que aparentemente participan en la transduccin de seales y activacin de mastocitos y basfilos. La interaccin Ag + IgE especfica + FcRI en la superficie de estas clulas induce la liberacin de mediadores inflamatorios preformados (histamina, proteasas, proteoglicanos y factores quimiotcticos de eosinfilos y polimorfonucleares) y la generacin posterior de productos tales como leucotrienos C4, D4 y E4, prostaglandina D2 y factor activador de plaquetas (PAF) (figura 20-2).

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Figura 20-2. Papel de la IgE en la respuesta inmune.

En la reaccin de la IgE con su antgeno especfico sobre mastocitos se ha descrito una fase inmediata o precoz que se inicia a los 5-10 minutos, dura 1 a 2 horas, y es responsabilidad de histamina, leucotrienos y prostaglandina D2 (figura 20-3). Como consecuencia de ella hay contraccin del msculo liso, vasodilatacin y aumento de la secrecin de mucus. Sin mediar un nuevo estmulo antignico, a las 3 a 6 horas se produce una fase tarda, que dura 24-48 horas, caracterizada por un fuerte influjo tisular de clulas inflamatorias provenientes de la circulacin: eosinfilos, macrfagos, basfilos y linfocitos T. En la fase inmediata participan molculas de adhesin de tipo ICAM-1 del endotelio vascular, y LFA-1 y MAC-1 de los leucocitos, que detienen a las clulas inflamatorias, las hacen rodar sobre el endotelio, y facilitan su migracin transendotelial (ver captulo 12). En la fase tarda participan interleuquinas liberadas desde los mastocitos y desde las otras clulas inflamatorias, especialmente eosinfilos,

basfilos, macrfagos y linfocitos Th2, con lo cual se amplifica enormemente la inflamacin. Por tal motivo se ha denominado tambin a esta fase como inflamatoria, y est relacionada con la perpetuacin o mantencin de la reaccin alrgica, y el estado de hiperreactividad que caracteriza a alguna de sus manifestaciones clnicas (rinitis y asma alrgicas). Las dos etapas en la reaccin de hipersensibilidad inmediata han sido demostradas tanto en la piel, como en la nariz y bronquios, cuando se hace una provocacin con el antgeno especfico. Tambin se ha demostrado la expresin de un receptor de alta afinidad para IgE (FcRI) en las clulas de Langerhans de la piel. En enfermos con dermatitis atpica, estudios in vitro revelaron que las clulas de Langerhans que tienen unida IgE son capaces de captar caros del polvo de habitacin (Dermatofagoide) para su presentacin antignica; en cambio en ausencia de IgE unida a las clulas de Langerhans no era posible estimular clulas T especficas contra este tipo de artr-

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Figura 20-3. Activacin de mastocitos y basfilos. Etapas de la reaccin de hipersensibilidad inmediata. Cuando dos molculas de IgE contiguas son ocupadas por un antgeno polivalente, se produce activacin de los receptores de IgE de alta afinidad, que dan lugar a estimulacin del mastocito, con generacin de una fase inmediata y otra tarda de la reaccin de hipersensibilidad.

podos. Estos antecedentes inducen a pensar que la presencia de IgE en la superficie de clulas presentadoras de antgeno facilita el procesamiento antignico y ayuda a explicar las reacciones alrgicas que se desencadenan por contacto con alergenos a nivel de la piel. Los receptores de baja afinidad para IgE (FcRII o CD23) se encuentran presentes en va-

rios tipos celulares, principalmente linfocitos B, macrfagos, linfocitos T activados, plaquetas y eosinfilos. Se desconoce su funcin en forma definitiva. En enfermedades alrgicas se observa una mayor expresin del receptor FcRII en los cuatro primeros tipos celulares enumerados, indicando que hay un aumento de la sntesis de IL-4 que participa en la regulacin de la expresin de

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este receptor. Adems es posible que el FcRII participe en la regulacin de la sntesis de IgE, en la endocitosis de complejos antigno-anticuerpo (IgE) y en la liberacin de mediadores inflamatorios a partir de macrfagos, eosinfilos y plaquetas, consecutiva a la interaccin entre alrgeno y su IgE especfica unida a estas clulas.

IL-4, IL-5 e IL-13 actan como estimuladoras. Adems del contacto directo de linfocitos y de la presencia de IL-4 participan molculas de adhesin celular en la induccin de sntesis de IgE, especialmente B7-1 en la clula presentadora y CD28 en el linfocito Th2. La clula presentadora de antgeno, que puede ser una clula dendrtica, un macrfago o un linfocito B, posee una IgE especfica de superficie que capta el antgeno correspondiente, lo internaliza y lo procesa, de manera que lo presenta en su superficie en forma de pptidos asociados a molculas del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC, HLA) de clase II que interactan con el receptor TCR del LTh2 inductor. Como consecuencia de esta interaccin se produce la activacin de LTh2 con liberacin de IL-4 e IL-13 que activan al linfocito B para secretar IgE especficas. Adems de la accin de IL-4, para completar la activacin del LB, se requiere del estmulo del receptor CD40 del LB por su ligando CD40L expresado en la superficie del LT activado (contacto fsico del LT y LB). Adems de estas dos vas T dependientes, es posible inducir sntesis de IgE por va T independiente, mediante activadores directos del LB tales como virus de Epstein-Barr, hidrocortisona y anticuerpos monoclonales antiCD40, pero siempre se requiere de la accin de la IL-4 (figura 20-4). Se ha demostrado que varias citoquinas pueden modular la sntesis de IgE. Adems de IL-4, inducen la sntesis de IgE las IL-5, IL-6 y TNF, y en cambio actan como inhibidores IFN, IFN, IL-12, IL-18, TNF, TGF, IL-8, PGE2, PAF y los neuropptidos VIP y somatostatina. En individuos atpicos los mastocitos pueden producir IL-4 y de esta manera facilitan la sntesis de IgE cuando un sujeto se expone a su alergeno especfico. Adems, la IL-4 producida por mastocitos condiciona una expansin de las clulas Th2 en individuos alrgicos. Estas clulas Th2 como ya vimos son estimuladas por clulas presentadoras de antgeno que poseen en su superficie IgE para el alergeno inductor, y al activarse liberan ms IL-4 y facilitan la sntesis de IgE especfica por el linfocito B. Por otro lado, la IL-4 inhibe la produccin de IFN y la diferenciacin de clulas Th1.

5. REGULACIN DE LA SNTESIS DE IgE Los mecanismos celulares y moleculares que participan en la regulacin de la sntesis de IgE han sido materia de mucho inters. En la etapa de induccin se requieren dos seales: la primera es isotipo-especfica y es dependiente de IL-4 liberada por los linfocitos T helper (LTh), y la segunda debe ser proporcionada por el contacto fsico entre el linfocito B y el linfocito T inductor, o por activadores de los linfocitos B que actan en forma sinrgica con la IL-4 para inducir la sntesis de IgE. El papel de los linfocitos T en la sntesis de IgE por los linfocitos B es fundamental. Inicialmente, se demostr en ratones la existencia de subpoblaciones de LTh con diferentes patrones funcionales y secreciones de citoquinas. Los Th1 producen IL-2, IFN y linfotoxina y participan en la inmunidad celular e hipersensibilidad retardada. Los Th2 secretan IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 y seran responsables de la sntesis de IgE por los linfocitos B y la proliferacin y diferenciacin de los eosinfilos. Estudios en humanos han identificado en individuos atpicos subpoblaciones de LT con caractersticas similares a los Th2, en cuanto a sus propiedades funcionales y a su capacidad de producir citoquinas en forma diferencial. Un rea de gran inters para los investigadores es poder establecer los mecanismos que regulan la diferenciacin de los precursores T (Th0) hacia las subpoblaciones Th1 o Th2. Entre los factores involucrados en este proceso se han definido a la naturaleza del antgeno, su va de administracin, las citoquinas presentes en el medio tisular en el momento de la diferenciacin, las caractersticas genticas del husped y las clulas presentadoras de antgeno. Numerosas investigaciones han revelado posteriormente que las subpoblaciones de linfocitos T juegan un rol importante en la respuesta de IgE. Las clulas Th1 que secretan IFN e IL-2 actan como supresoras, en cambio las Th2 que secretan

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Figura 20-4. Mecanismo involucrado en la reaccin de hipersensibilidad inmediata y su regulacin. Representacin esquemtica del proceso iniciado por el procesamiento del antgeno por la clula presentadora de antgenos (CPA), exposicin del eptopo alergnico unido a antgenos HLA-II, y estmulo del receptor TCR del linfocito Th2. En la activacin del linfocito B para sintetizar IgE especficas, se requiere la participacin de IL-4 e IL-13 liberadas por el LTh2, y la interaccin de la molcula CD40 del LB con su ligando CD40L del linfocito Th2. Dos IgE fijas en la superficie de los mastocitos, al unirse por una molcula antignica dan lugar a la liberacin de los mediadores de la reaccin de hipersensibilidad inmediata. Este mecanismo es regulado por el linfocito Th1, a travs de la secrecin de IFN y el sistema monocito-macrofgico por liberacin de IL-12 e IL-18.

6. ROL BIOLGICO DE LA RESPUESTA MEDIADA POR IgE En condiciones normales, los niveles de IgE en el suero alcanzan valores muy bajos comparados con las otras inmunoglobulinas (aproximadamente 0.05 mg/dL). Estos niveles se elevan en forma significativa en varias enfermedades, particularmente en las condiciones llamadas alrgicas, tales como Rinitis alrgica, Asma bronquial, Dermatitis atpica y Aspergillosis broncopulmonar alrgica. Tambin se encuentra aumentada en enfermedades parasitarias, en algunas inmunodeficiencias primarias como el Sndrome de Hiper-IgE, la Ataxia telangectasia y el Sndrome de Wiscott-Aldrich; en la Reaccin de injerto contra husped y en el Mieloma mltiple IgE, caracterizado por proliferacin de plasmocitos con produccin de IgE monoclonal. En las enfermedades alrgicas es posible detectar anticuerpos IgE dirigidos contra antgenos ambientales (plenes, caros, epitelios animales, hongos), venenos de insectos, alimentos, frmacos

y diversos compuestos qumicos. Se considera a esta IgE como la responsable, por su unin a receptores de alta afinidad en las clulas cebadas, de la ulterior degranulacin de stas al contactar con el antgeno especfico. La inflamacin mediada por IgE es responsable de la llamada alergia atpica causante de rinitis, asma y dermatitis, y tambin de reacciones generalizadas como urticaria y anafilaxia. Se ha postulado adems, que por la capacidad de producir vasodilatacin rpida, la IgE podra tener una funcin facilitadora en la inflamacin mediada por complejos inmunes y en la inflamacin mediada por clulas, al permitir una va de entrada rpida de factores solubles y de clulas circulantes hacia los tejidos. Es difcil aceptar la existencia de mecanismos que participen solamente en reacciones de dao tisular. As, se han acumulado evidencias de la participacin de la IgE en la proteccin contra la infestacin por parsitos helmnticos y se han identificado anticuerpos de clase IgE relacionados con la inmunidad protectiva contra parsitos.

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En la esquistosomiasis, la equinococosis, la triquinosis, la ascaridiasis y la toxocariasis existen anticuerpos de clase IgE que pueden participar en reacciones de citotoxicidad celular mediada por eosinfilos contra huevos, larvas y gusanos. Adems, anticuerpos IgE pueden desencadenar reacciones anafilcticas, por ejemplo, ante la ruptura de un quiste hidatdico, o por la picadura de abejas. En modelos animales y en enfermos humanos se ha demostrado que el incremento notable de la sntesis de IgE frente a una infestacin parasitaria se produce contra antgenos del parsito y adems en forma de IgE no especfica, traduciendo una alteracin en la regulacin de la sntesis normal de IgE. Existen controversias si este aumento de IgE no especfica es tambin un mecanismo protectivo o por el contrario, es un fenmeno inducido por el parsito para evadir los efectos de la IgE especfica.

LECTURAS SUGERIDAS Busse, W., Calhoun, W., Sedgwick, J., Mechanism of airway inflammation in asthma, Am Rev Respir Dis, 147:520-4, 1993. Capron, A., Capron, M., Grangette, C., Dessaint, J., IgE and inflammatory cells, Ciba Foundation Symposium, 147:153-70, 1989. Hagan, P., IgE and protective immunity to helminth infections, Parasite Immunol, 15:1-4, 1993. Hamawy, M., Mergenhagen, S., Siraganian, R., Adhesion molecules as regulators of mast-cell and basophil function, Immunol Today, 15:62-6, 1994. Janeway, CH. Travers, P., Walport, M., Capra, D., Immunobiology, Ed. Masson, 2000. Leung, D., Mechanisms of the human allergic response: clinical implications, Ped Clin N Amer, 41:727-43, 1994. Pritchard, D. Immunity to helminths: is too much IgE parasite-rather than host-protective?, Parasite Immunol., 15:5-9, 1993. Romagnani, S., Induction of TH1 and TH2 responses: a key rol for the natural immune response?, Immunol Today, 13:379-81, 1992. Schwartz, L., Mast cells: function and contents, Curr Opin Immunol, 6:91-7, 1994. Stites, D., Terr, AI., Basic and Clinical Immunology, Ed. Appleton & Lange, USA, 1994. Wasserman, S., Mast cells and airway inflammation in asthma, Am J Respir Crit Care Med, 150:539-41, 1994.

7. APLICACIONES BIOMDICAS La determinacin de IgE srica y de anticuerpos IgE especficos, ya sea directamente en el suero, o indirectamente a travs de las pruebas cutneas, son tiles en el diagnstico de enfermedades alrgicas, parasitarias e inmunodeficiencias. El mejor conocimiento de la regulacin de la sntesis de IgE y de la respuesta mediada por IgE permitir el desarrollo de frmacos o factores teraputicos tiles en el tratamiento de enfermedades en que se involucra este tipo de reaccin inmunitaria. La inmunoterapia con alergenos produce una accin teraputica favorable, desviando la reaccin mediada por el linfocito Th2 a linfocito Th1. El IFN producido por linfocitos Th1 y las IL-12 e IL-18 generados por macrfagos bloquean la accin de los LTh2 y sus linfoquinas, con lo cual el LB no sintetiza IgE. Otra aplicacin es el uso de anticuerpos monoclonales para suprimir la IgE, procedimiento que se est usando con xito en el tratamiento de rinitis y asma alrgicas. Finalmente, la informacin ms completa sobre los antgenos parasitarios y su capacidad para inducir anticuerpos protectivos IgE, permitir el desarrollo de vacunas para la prevencin y el control de las enfermedades parasitarias.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

SECCIN

IV

INMUNOLOGA CLNICA

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 21
HIPERSENSIBILIDAD
Arnoldo Quezada L. y Ximena Norambuena R.

1. Introduccin 2. Clasificacin de las reacciones de hipersensibilidad 3. Hipersensibilidad inmediata mediada por IgE (tipo I) 4. Hipersensibilidad citotxica (tipo II) 5. Hipersensibilidad mediada por complejos inmunes (tipo III) 6. Hipersensibilidad retardada mediada por clulas (tipo IV)

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RESUMEN La hipersensibilidad puede definirse como una condicin adquirida de reaccionar inmunolgicamente a una sustancia antignica de manera tal que esta respuesta inmune causa una alteracin patolgica o expresin clnica de dao tisular en el husped. Aunque existen ciertas discrepancias, la clasificacin actualmente ms aceptada de las reacciones de hipersensibilidad corresponde a Gell y Coombs quienes describieron cuatro tipos de respuesta de dao inmunolgico. Se seala las principales caractersticas que tipifican a las reacciones mediadas por IgE, las reacciones citotxicas, las reacciones mediadas por complejos inmunes y las reacciones de hipersensibilidad mediada por clulas. Se enfatiza en los fenmenos biolgicos que las caracterizan y se da ejemplos de situaciones clnicas y enfermedades producidas por cada tipo de reaccin.

1. INTRODUCCIN La necesidad de comprender la inmunopatogenia de algunas enfermedades humanas y los principios bsicos de la respuesta inmune relacionados con diferentes expresiones patolgicas han permitido profundizar en el conocimiento del sistema inmune y su relacin fisiopatolgica con los mltiples factores del medio ambiente. El rol fisiolgico de la respuesta inmune es, en trminos muy generales, la proteccin del individuo frente a la agresin de agentes nocivos. Las enfermedades del sistema inmune comprenden varios tipos: a) las inmunodeficiencias: incapacidad o falta de respuesta; b) la hipersensibilidad, respuesta no protectora que causa dao; c) la autoinmunidad: respuesta dirigida contra las estructuras propias; y d) neoplasias del sistema inmune. En 1906 von Piquet reconoci que los antgenos eran capaces de inducir cambios en los individuos inmunizados, sealando que la capacidad de respuesta frente a agentes extraos era independiente del resultado. Si esta respuesta resultaba protectora para el husped se denominaba inmunidad, en cambio si sta era una reaccin adversa para el sujeto la llamaba hipersensibilidad. La hipersensibilidad podra definirse como la condicin adquirida de reaccionar inmunolgicamente a una sustancia antignica de manera tal que esta respuesta inmune causa una

alteracin patolgica o expresin clnica de dao tisular en el husped. En las reacciones de hipersensibilidad, los mecanismos inmunes estn funcionando dentro de los marcos habituales, pero provocan diferente dao tisular dependiendo de la interaccin de los elementos humorales y celulares involucrados. Desde fines del siglo XVIII ya los investigadores biomdicos se esforzaban por controlar y mejorar el tratamiento de las enfermedades infectocontagiosas, principal problema de salud y causa significativa de la mortalidad de esa poca. As, la inmunologa surgi unida a la microbiologa y gracias a los trabajos cientficos y descubrimientos de destacados personajes como Jenner, Pasteur y von Behring se perfeccion el mtodo de vacunacin o profilaxis al introducir pequeas dosis de microorganismos con virulencia atenuada o de material antignico para prevenir la enfermedad infecciosa correspondiente en los sujetos inyectados (ver captulo 2). Por otra parte, las evidencias experimentales de Erlich al describir el horror autotxico, planteaban que el sistema destinado a proteger a los individuos era incapaz de reaccionar contra sus propias estructuras. Tales planteamientos retrasaron la interpretacin de los fenmenos de autoagresin. Las primeras evidencias de resultados adversos a un procedimiento de inmunizacin con fines protectores son atribuidas a Richet y Portier, quienes inyectaron a sus perros con extractos de

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una anmona en un intento por protegerlos contra el veneno de estas actinias y observaron, en algunos animales, una aparente proteccin, en cambio frente a inyecciones sucesivas otros perros presentaban una reaccin dramtica que en la mayora de los casos, determinaba la muerte. Denominaron a este fenmeno antifilaxis o anafilaxis como trmino opuesto a profilaxis. Junto a los procedimientos de vacunacin, se desarroll la seroterapia como mtodo preventivo y teraputico. Prausnitz y Kstner demostraron en esa poca que el suero de pacientes alrgicos era capaz de transferir en forma pasiva la reaccin cutnea a individuos no alrgicos. Esta reactividad podra ser detectada en la piel y dieron el nombre de reaginas a estas sustancias involucradas en la produccin de reacciones de dao. En 1925 Coca y Cooke, sealaron la predisposicin especial de algunos sujetos, que denominaron atpicos para formar reaginas, con lo cual se obtuvieron las primeras observaciones sobre el control gentico en la respuesta inmune de este tipo.

c)

Ubicacin del compromiso Localizadas : afectan a un solo rgano (piel, mucosa nasal, bronquial, etc.) Generalizadas: si presentan manifestaciones generales (hipotensin, fiebre, etc.)

d) Naturaleza de la sensibilizacin Reacciones de hipersensibilidad propiamente tal: si est dirigida contra antgenos externos Fenmenos de autoinmunidad: si est dirigida contra antgenos propios e) Mecanismo fisiopatolgico. Una de las clasificaciones vigentes ms aceptada es la propuesta por Gell y Coombs que las divide en cuatro categoras de reacciones de hipersensibilidad: Tipo I. Es la denominada reaccin anafilctica o hipersensibilidad inmediata. El alergeno o antgeno reacciona con la IgE unida a las clulas tisulares denominadas mastocitos y los basfilos circulantes induciendo degranulacin y activacin celular que determina la liberacin de mediadores activos de la inflamacin. Tipo II. Llamada tambin hipersensibilidad citotxica, en la cual un anticuerpo especfico reacciona con componentes de la superficie celular producindose opsonizacin, citotoxicidad y activacin del complemento con el consiguiente dao celular y tisular. Tipo III. Reacciones mediadas por complejos inmunes. Se produce por formacin de complejos inmunes que activan el sistema de Complemento, inducen agregacin plaquetaria, activacin de leucocitos polimorfonucleares y liberacin de enzimas proteolticas que causan microtrombos, vasculitis y necrosis. Tipo IV. Hipersensibilidad retardada o celular en la cual los linfocitos T que se han sensibilizado y frente al estmulo antignico liberan citoquinas que inducen infiltracin y transformacin principalmente de clulas mononucleares. Se produce sin la participacin de anticuerpos.

2. CLASIFICACIN DE LAS REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD Las reacciones de hipersensibilidad requieren de una etapa de sensibilizacin para la formacin de anticuerpos y/o linfocitos T sensibilizados a un agente inductor especfico. ste, llmese alergeno o antgeno, produce un espectro de respuestas en la persona sensibilizada, cada vez que se exponga al agente o que ste persista en el organismo sin ser neutralizado. Debe considerarse que la respuesta en el husped ser diferente si esta relacin es crnica o es recurrente. En la actualidad las reacciones de hipersensibilidad se pueden clasificar segn diferentes criterios: a) b) Tipo de mecanismo inmunolgico involucrado Humorales: mediadas por anticuerpos Celulares : mediadas por linfocitos T sensibilizados Tiempo entre la exposicin al antgeno o alergeno y la expresin de la respuesta Inmediatas: unos pocos minutos Mediatas : algunas horas Retardadas: entre 48 a 72 horas

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3. HIPERSENSIBILIDAD INMEDIATA MEDIADA POR IgE (TIPO I) Las reacciones de hipersensibilidad en que participa este tipo de respuesta se llaman tambin anafilcticas, reagnicas o inmediatas. Las caractersticas de la respuesta inmune mediada por IgE y mastocitos/basfilos fueron descritas en el captulo 20. Brevemente, luego de una exposicin previa con el antgeno (fase de sensibilizacin), los mastocitos tisulares y los basfilos a nivel sanguneo que tienen IgE especfica unida a los receptores celulares, en un nuevo contacto con el antgeno liberan mediadores qumicos contenidos en los grnulos del citoplasma y producen una reaccin inflamatoria tisular local provocando edema, broncoespasmo, vasodilatacin o anafilaxia (figura 21-1). Estos mediadores qumicos son los que participan en las manifestaciones clnicas agudas de rinitis alrgica, asma, urticaria y anafilaxia.

Figura 21-1. Representacin de hipersensibilidad de tipo I o inmediata

Los modelos utilizados para su estudio han demostrado que en animales previamente inmunizados o sensibilizados con un antgeno proteico, es posible desencadenar a los pocos minutos de la provocacin con el antgeno una reaccin caracterizada por dificultad respiratoria marcada, asfixia, convulsiones, shock y muerte. En la

autopsia de los animales as tratados, es posible evidenciar hiperdistensin pulmonar secundaria a broncoconstriccin y signos de dilatacin vascular generalizada. Las alteraciones descritas corresponden a la denominada anafilaxia generalizada en su forma ms grave, el shock anafilctico, cuyas manifestaciones varan en las diferentes especies. En el hombre, la anafilaxia generalizada se presenta con prurito intenso, erupcin urticarial, eritema, vmitos, clicos intestinales, deposiciones lquidas, dificultad respiratoria, edema larngeo, obstruccin bronquial e hipotensin arterial. La broncoconstriccin y la vasodilatacin que son causales de muerte pueden ser contrarrestadas con la administracin de adrenalina. Este cuadro grave puede presentarse en reacciones adversas a drogas como penicilina y procana y por picaduras de insectos en sujetos sensibilizados. En clnica humana son ms frecuentes las reacciones localizadas en las vas respiratorias (rinitis alrgica, asma bronquial alrgica) y en la piel (urticaria). La descripcin clsica incluida en la clasificacin de Gell y Coombs como reaccin inmediata comprende los fenmenos que ocurren a los 15 a 30 minutos de la interaccin del alergeno con la IgE especfica unida al receptor de alta afinidad en la membrana del mastocito, que determina la degranulacin y liberacin de mediadores de la fase inmediata. La activacin del mastocito tambin incrementa la sntesis de mediadores de la respuesta inflamatoria generados en el metabolismo del cido araquidnico tales como prostaglandina A2, tromboxano y leucotrienos los que amplifican la respuesta tisular. Adems participan linfocitos Th2 que generan citoquinas caracteristicas de la fase tarda como componente de la misma reaccin (IL4, IL-5, IL-10). En esta fase tarda se produce infiltracin celular por eosinfilos, linfocitos y macrfagos, responsables de inflamacin local iniciada por la interaccin del alergeno y la IgE. La persistencia de la hiperreactividad bronquial en el asma y de la hiperreactividad nasal en la rinitis alrgica es atribuida a la infiltracin celular tpica de la fase tarda. Estos conocimientos han permitido un tratamiento ms racional de estas enfermedades que requieren frmacos antagonistas de los mediadores (antihistamnicos) o frmacos que reviertan los efectos de los mediadores sobre los receptores celulares (broncodilatadores) en la fase aguda combinados con uso prolongado de medicacin antiinflamatoria (corticoides) para tratar la fase tarda

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de infiltracin celular responsable de la mantencin de la hiperreactividad. Los mecanismos desencadenados adems producen en los tejidos locales un aumento en la permeabilidad capilar con el ingreso de molculas biolgicamente activas, anticuerpos sricos y clulas circulantes en los rganos blancos. Adems, la degranulacin de mastocitos puede ser provocada sin la interaccin antgeno-anticuerpo, por frmacos como morfina, codena entre otras, por anafilotoxinas derivadas del sistema complemento y por accin de mediadores qumicos de los linfocitos T.

efectores en este tipo de reaccin: a) El anticuerpo se une a los antgenos en las clulas o tejidos y activa la va clsica del sistema del complemento produciendo citolisis y muerte celular. Ej: algunas reacciones hemolticas.

4. HIPERSENSIBILIDAD CITOTXICA (TIPO II) Este tipo de lesin mediada inmunolgicamente se caracteriza por la presencia de anticuerpos dirigidos contra antgenos celulares o tisulares. En la actualidad, su importancia es menos significativa, ya que la presencia de tales anticuerpos es menos fundamental que la participacin de complejos inmunes en las lesiones de los tejidos. Pueden existir diferentes mecanismos

b) El anticuerpo citotxico se une al antgeno celular o tisular y expone los fragmentos Fc que son reconocidos por clulas fagocticas las cuales pueden destruir a la clula recubierta de anticuerpos o liberar enzimas o componentes que lesionan un tejido, en el caso de antgenos unidos a membranas basales. Ej: Sndrome de Goodpasture. c) Los anticuerpos unidos a su antgeno tisular actan como mediadores de la llamada reaccin citotxica celular dependiente de anticuerpo (ADCC), en la cual las clulas efectoras pueden ser linfocitos, macrfagos o clulas NK. En esta situacin, la clula efectora guiada por el anticuerpo citotxico libera componentes que daan el tejido donde se encuentra el antgeno (figura 21-2).

Figura 21-2. Representacin de hipersensibilidad de tipo II o citotxica.

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El modelo experimental mejor conocido en que se ha estudiado este tipo de reaccin es la llamada nefritis nefrotxica que se produce en animales inyectados con suero que contenga anticuerpos contra la membrana basal del glomrulo. Estos anticuerpos son en su mayora de tipo Ig G y pueden fijar complemento. En clnica humana, en el sndrome de Goodpasture que se manifiesta por hemorragia pulmonar, glomerulonefritis y anemia, es posible detectar anticuerpos circulantes antimembrana basal del capilar glomerular y pulmonar conjuntamente con depsitos lineales de inmunoglobulinas en las membranas basales del tejido renal y pulmonar mediante inmunofluorescencia. Otras enfermedades en que participara este mecanismo de dao citotxico son: reacciones transfusionales, enfermedad hemoltica del recin nacido, anemia hemoltica autoinmune, citopenias por hipersensibilidad a drogas y rechazo hiperagudo de trasplantes, que se produce en sujetos receptores que tienen anticuerpos contra el tejido injertado.

5. HIPERSENSIBILIDAD MEDIADA POR COMPLEJOS INMUNES (TIPO III) Corresponde al dao tisular provocado por la formacin de complejos inmunes que no han sido eliminados oportunamente por el sistema fagoctico. Los anticuerpos que participan en este tipo de reaccin son de diferente clase (isotipo) y su unin al antgeno puede ser reversible. El anticuerpo habitualmente de clase IgM e IgG se une al antgeno y forma un complejo inmune que induce la activacin del sistema complemento a partir de C1q (va clsica). La activacin del complemento genera anafilotoxinas y factores quimiotcticos cuya accin determina aumento de permeabilidad vascular y activacin e infiltracin de neutrfilos, que ingieren los complejos inmunes y liberan enzimas lisosmicas daando las clulas y tejidos donde se encuentran depositados los complejos inmunes (figura 21-3). El tipo de antgeno que participa en estas reacciones puede ser extrnseco o autoantgeno. Se manifestar como una enfermedad autoinmune cuando el antgeno corresponda a un autoantgeno o cuando presente reaccin cruzada con un antgeno propio.

Figura 21-3. Representacin de la hipersensibilidad de tipo III o por complejos inmunes.

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Hay que considerar que no todos los complejos inmunes que constantemente se estn formando desencadenan una respuesta nociva. Aquellos inmunocomplejos que s son capaces de despertar respuesta de dao lo harn a travs de la activacin del complemento, de aminas vasoactivas que se liberan luego de la activacin de los basfilos y de mastocitos. Los inmunocomplejos se depositarn en tejidos u rganos determinados segn el tamao de los complejos inmunes, de factores hemodinmicos como reas de turbulencias que ocasionan dao endotelial y tambin depender de la afinidad de unin del antgeno al anticuerpo. Este grupo comprende dos tipos de reacciones por inmunocomplejos en que se produce dao tisular: el fenmeno de Arthus y la enfermedad del suero. En el primer tipo se produce una precipitacin de inmunocomplejos extravasculares con necrosis tisular local, con liberacin de sustancias proteolticas locales e infiltracin neutroflica en las paredes de los vasos. En las primeras horas aparece eritema y edema que aumentan progresivamente hasta tres a seis horas, para desaparecer en diez a doce horas. Las manifestaciones en esta fase son ms agudas. Ejemplos de este subgrupo de reacciones se observan en las etapas agudas de las enfermedades pulmonares denominadas neumonitis por hipersensibilidad o alveolitis alrgicas extrnsecas que se producen en sujetos expuestos por va inhalatoria a partculas orgnicas (esporas de hongos, protenas aviarias, entre otras). Los enfermos as sensibilizados desarrollan sntomas generales como fiebre y escalofros conjuntamente con disnea, tos, leucocitosis e infiltrados pulmonares, y tienen anticuerpos precipitantes en circulacin, detectables mediante las pruebas especficas. La reaccin se produce cuatro a seis horas despus de la exposicin al antgeno por va inhalatoria, generando una intensa inflamacin de la va area y el tejido pulmonar que puede resolverse en 12 a 18 horas. La persistencia de las lesiones pulmonares con progresin a fenmenos de alveolitis y fibrosis parecen depender de la participacin de otras clulas inflamatorias especialmente linfocitos, macrfagos y fibroblastos. Otros ejemplos son las reacciones post-inmunizaciones, reacciones a drogas e intolerancia insulnica. En la enfermedad del suero la formacin de inmunocomplejos ocurre en el compartimento intravascular y el depsito posterior se produce

en diferentes territorios tales como rin, piel, articulaciones y vasos sanguneos. La denominacin de enfermedad del suero proviene de las observaciones hechas en las primeras dcadas del siglo XX cuando se utilizaba principalmente suero de caballo como antisuero para el tratamiento de la difteria, el ttanos u otras enfermedades infecciosas. Hasta un 50% de los enfermos tratados con este suero heterlogo presentaban fiebre, compromiso general, lesiones cutneas urticariales y eritematosas, artralgias, linfoadenopatas y esplenomegalia. Actualmente ocurren reacciones similares en casos de alergia a la penicilina y otras drogas y en enfermos trasplantados que reciben suero antilinfocitario como tratamiento o prevencin del rechazo. Existen numerosos ejemplos de enfermedades humanas en las cuales es posible encontrar complejos inmunes circulantes y depsitos en los tejidos, destacando la glomerulonefritis postestreptoccica, la endocarditis infecciosa, la infeccin por virus de hepatitis y enfermedades autoinmunitarias como artritis reumatoide y lupus eritematoso sistmico, especialmente en la nefritis lpica.

6. HIPERSENSIBILIDAD RETARDADA MEDIADA POR CLULAS (TIPO IV) Se ha definido como hipersensibilidad tarda o retardada a las reacciones en que participan linfocitos T. A comienzos del presente siglo, von Pirquet denomin "alergia tuberculnica" a la respuesta cutnea positiva obtenida en sujetos infectados con bacilo tuberculoso, al estimular la piel con preparados del mycobacterium. En 1942, Landsteiner y Chase demostraron que era posible transferir en forma pasiva esta reaccin tarda utilizando clulas inmunes y esto no ocurra con suero inmune. Existen algunas dificultades para separar la inmunidad mediada por clulas y la hipersensibilidad retardada, ya que ambos trminos describen el mismo fenmeno inmunolgico, y se refieren a la respuesta inflamatoria mediada por linfocitos T que reaccionan con su antgeno especfico, sin considerar si el resultado final es protectivo o nocivo para el individuo. En sentido ms estricto las funciones efectoras del linfocito T se pueden definir como la citotoxicidad directa ejercida por linfocitos citotxicos y la inmunidad mediada por clulas e hipersensibilidad tarda ejercida por LTH1.

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Las respuestas inflamatorias de este tipo son importantes en la eliminacin de agentes infecciosos intracelulares, pero pueden dirigirse contra sustancias ambientales normalmente inocuas y causar enfermedad. Estas respuestas mediadas por clulas se expresan en 48 a 72 horas en el sujeto previamente sensibilizado y se caracterizan por el infiltrado inflamatorio predominantemente por clulas mononucleares, a diferencia de la hipersensibilidad mediada por anticuerpos que ocurre en minutos o algunas horas y presentan infiltrado de tipo polimorfonuclear. El mecanismo de respuesta supone que LT inductores son activados por clulas presentadoras de antgeno, con liberacin de citoquinas que expanden el clon de TH1 los cuales secretan IL-2, IFN, TNF, IL-3, GM-CSF, como principales mediadores activos que atraen y activan macrfagos, producen vasodilatacin, depsitos de fibrina, formacin de granulomas y destruccin tisular local (figura 21-4).

Figura 21-4. Representacin de la hipersensibilidad de tipo IV o mediada por clulas.

Las caractersticas histopatolgicas de las reacciones retardadas muestran infiltrados con predominio de linfocitos y monocitos, depsitos de fibrina, edema y destruccin tisular que en lesiones avanzadas origina la tpica necrosis caseosa. El elemento tpico es el granuloma constituido por acmulos de linfocitos, neutrfilos escasos, clu-

las plasmticas, clulas epiteloideas y clulas gigantes multinucleadas. Su formacin se interpreta como estimulacin local persistente por antgenos de baja solubilidad y degradacin que dan como resultado final esta respuesta local de clulas mononucleares transformadas. Aparece en procesos infecciosos, hipersensibilidad retardada a metales y partculas orgnicas y en sarcoidosis y otras enfermedades granulomatosas. La inmunidad mediada por clulas y la hipersensibilidad retardada se pueden inducir por inmunizaciones y por contacto en la piel y mucosas con sustancias qumicas sensibilizantes que muchas veces son haptenos que se unen a una protena transportadora como en el caso de dermatitis por contacto. Tambin se adquiere en forma natural en infecciones por patgenos intracelulares: virus, bacterias, hongos, protozoos y helmintos. As, se pueden describir cuatro tipos de reacciones en la hipersensibilidad retardada: a) la sensibilidad de contacto, b) la reaccin tipo tuberculina, c) la reaccin granulomatosa y d) la reaccin de Jones Mote. La reaccin de sensibilidad por contacto es mxima a las 48 horas, es inducida por haptenos como el nquel que son capaces de atravesar las barreras cutneo mucosas y se unen a las protenas. Este complejo formado por hapteno y protena transportadora es capaz de inducir la respuesta de linfocito T, con abundante infiltrado mononuclear en la epidermis tal como se ha observado en el eczema. La reaccin de hipersensibilidad de tipo tuberculina se observa entre las 48 y 72 horas manifestndose con infiltracin linfoctica mononuclear en la dermis. La reaccin granulomatosa es la observada en la sarcoidosis y se produce por persistencia del antgeno en el macrfago favoreciendo la formacin de clulas epitelodeas y clulas gigantes multinucleadas. La reaccin de Jones Mote es mxima a las 24 horas y se caracteriza por predominio de basfilos intralesionales. Las pruebas cutneas para hipersensibilidad retardada son tiles y sencillas para la evaluacin general de la inmunocompetencia y en el diagnstico de enfermedades infecciosas. Cuando se usan para diagnstico, las pruebas positivas no necesariamente implican enfermedad y en la evaluacin de la competencia inmunolgica deben considerarse variables que pueden modificar sus resultados. La reactividad cutnea representa la capacidad individual de expresar la hipersensibilidad retardada a los antgenos inyectados y su

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expresin depende de interacciones entre clulas linfoides y monocitarias. La anergia es la ausencia de reaccin cutnea retardada a un grupo de antgenos habituales y bajo ciertas circunstancias puede considerarse como un estado de depresin de la inmunidad mediada por clulas. Existen numerosas condiciones clnicas relacionadas con anergia: inmunodeficiencias congnitas y adquiridas, infecciones y errores en el procedimiento tcnico. Las reacciones de hipersensibilidad tipo IV han demostrado ser parte de varias enfermedades autoinmunes organoespecficas como la tiroiditis de Hashimoto y enfermedades del tejido conectivo como Polimiositis. Tambin se observa en la Reaccin Injerto contra Husped y el Eritema nodoso. Como se coment anteriormente la clasificacin de Gell y Coombs sigue siendo la ms aceptada, sin embargo varios autores recientemente han propuesto modificaciones que ayudan a explicar las relaciones entre los mecanismos efectores, los elementos celulares y humorales involucrados, los efectos iniciales y la expresin final del dao tisular. Estas modificaciones incluyen subdivisiones de las reacciones clsicas que facilitan la comprensin de los avances en la interpretacin de los mecanismos patognicos de varias enfermedades inmunolgicamente mediadas (tabla 21-1)

LECTURAS SUGERIDAS Galli, S.J., Lantz, C.S., Allergy en Paul WE., Fundamental Immunology, 4 ed., Philadelphia, Lippincott Raven,1999, pp. 11271174. Janeway C.A. Jr, Travers, P., Immunobiology: The immune system in health and disease, New York, Garland Publishing Inc.,1994. Kay, A.B., Allergy and allergic diseases N Engl J Med, 344:30-37, 2001. Quezada A., Gimpel, S., Miranda, D., Las Heras, J., Andreis, M., Ultrastructural features of alveolar cells in experimental hypersensitivity pneumonitis, Respiration 51: 127-36, 1987. Quezada, A., von Stowasser, V., Murray, G., Andreis, M., Modelo experimental de neumonitis por hipersensibilidad en ratas, Rev Med Chil 111(4):389-396, 1983. Terr, A., Mecanismo de hipersensibilidad en Inmunologa Bsica y Clnica, Editores: Stites y Terr. Manual Moderno Mxico, captulo 29, pp. 425-38, 1993.

Tabla 21-1. Clasificacin de las reacciones de hipersensibilidad de Gell y Coombs modificada

TIPO I
a IgE ANTIGENO Antgeno soluble. Alergeno Activacin de clulas cebadas Rinitis Alrgica Asma Anafilaxia Ig G Alergeno asociado a una clula o tejido Complemento Clulas FcR+ Fagocitos y NK Alergia a penicilina Reaccin transfusional Anemia Hemoltica AI* Receptores de superficie celular Seales alteradas por anticuerpo Enfermedad de Graves Miastenia Gravis

TIPO II
b

TIPO III
IgG Antgeno soluble a1 Th 1 Antgeno soluble Activacin de macrfagos Dermatitis de contacto Reaccin tuberculnica

TIPO IV
a2 Th 2 Antgeno soluble Eosinfilos Basfilos b LT citotxico Antgeno asociado a una clula Citotoxicidad directa

MECANISMO EFECTOR EJEMPLO

Clulas FcR+, complemento Lupus Eritematoso Sist. Enfermedad del suero

Inflamacin Rechazo alrgica crnica trasplante Diabetes Mellitus

*AI=Autoinmune

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Captulo 22
ANAFILAXIS
Patricia Daz A.

1. Introduccin 2. Fisiopatologa 2.1. Mastocitos 2.2. Degranulacin de mastocitos y basfilos 2.3. Participacin de cascadas de la inflamacin en la reaccin anafilctica y anafilactodea 2.4. Alteraciones funcionales 3. Causas de anafilaxis 3.1. Frmacos 3.2. Ltex 3.3. Picaduras de himenpteros 3.4. Alimentos 3.5. Anafilaxis inducida por inmunoterapia 3.6. Anafilaxis inducida por ejercicio 3.7. Anafilaxis idioptica

4. Causas de reacciones anafilactodeas 4.1. Aditivos 4.2. Medios de contraste 4.3. cido acetil saliclico (AAS) y anti-inflamatorios no esteroidales (AINE) 5. Reacciones anafilcticas y anafilactodeas en pabellones quirrgicos 6. Signos y sntomas 7. Laboratorio 8. Tratamiento

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RESUMEN Las reacciones anafilcticas son un conjunto de manifestaciones clnicas producidas por la descarga masiva de mediadores de la inflamacin desde los mastocitos. La liberacin de mediadores puede ser derivada de la reaccin antgeno-IgE unido a mastocito (anafilaxis) o por la descarga de mediadores no mediada por IgE (reacciones anafilactodeas). Las manifestaciones clnicas son las mismas en ambos casos e incluyen: urticaria, enrojecimiento de piel, obstruccin respiratoria, clicos abdominales, diarrea, hipotensin y shock. Las causas son mltiples e incluyen todas aquellas condiciones capaces de desencadenar la activacin de mastocitos en individuos sensibilizados y no sensibilizados. Es un cuadro clnico que puede ir de leve a severo, requiere tratamiento de emergencia y aquellos individuos a riesgo deben aprender a tomar medidas preventivas y de automanejo de primeros auxilios.

1. INTRODUCCIN El trmino anafilaxis fue acuado por Portier y Richet en 1902 cuando, al intentar inducir inmunidad, sensibilizaron a perros con veneno de anmona de mar. Estos animales en contactos posteriores con el veneno, hicieron reacciones anafilcticas fatales con pequeas dosis del antgeno. Estos investigadores, llamaron anafilaxis o sin proteccin a esta reaccin como opuesto al trmino profilaxis o proteccin. Actualmente, anafilaxis se refiere a los signos y sntomas derivados de la reaccin inmunolgica de hipersensibilidad inmediata mediada por IgE, que produce una descarga masiva de mediadores de la inflamacin desde los mastocitos y basfilos, alterando fundamentalmente vasos sanguneos y msculo liso. Aunque en un sentido estricto podramos incluir en la definicin de anafilaxis las reacciones locales como los sntomas de rinitis alrgica al inhalar y depositarse un antgeno, este trmino se usa para la reaccin generalizada, multiforme y alejada del sitio de entrada del alergeno. Esta reaccin es indistinguible desde el punto de vista clnico de la reaccin anafilactodea, en que la descarga de mediadores no es mediada por IgE.

2. FISIOPATOLOGA 2.1. Mastocitos Los mastocitos humanos son un grupo heterogneo, multifuncional de clulas con roles en diversas condiciones como alergia, infestacin parasitaria, angiognesis y remodelacin tisular. Se originan de clulas hematopoyticas derivadas de la mdula sea, entran a la circulacin como precursoras de clulas mononucleadas que expresan mRNA de stem cell factor(SCF) y receptores para SCF en su membrana. De la sangre migran a los tejidos donde bajo la influencia de los factores microambientales, se diferencian y maduran como mastocitos. Su origen es muy diferente a los basfilos que derivan de los precursores de granulocitos al igual que los eosinfilos y entran a la circulacin cuando ya estn maduros. Al mismo tiempo, los basfilos no migran hacia los tejidos en condiciones normales, esta migracin se ha descrito en la fase tarda de la respuesta alrgica. Los estudios inmunocitoqumicos han demostrado la presencia de dos fenotipos de mastocitos, dependiendo del contenido de proteasas neutrales: mastocitos Mt que contienen slo triptasa y mastocitos Mtc que contienen triptasa y quimasa. Al comienzo se atribuy su presencia a las diferentes localizaciones, mucosas y tejido conectivo. Actualmente, sabemos que la presencia de ellos depende ms de la patologa que del tipo de tejido as los Mt estaran relacio-

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nados con el sistema inmune con un rol importante en la defensa y localizados preferentemente en las mucosas, estn aumentados en nmero en reas donde hay infiltracin linfocitaria y en enfermedades alrgicas. En cambio los Mtc que se encuentran preferentemente en submucosas y tejido conectivo, no estaran relacionados con el sistema inmune y tendran una funcin primaria en angiognesis y remodelacin tisular. Las reacciones de hipersensibilidad inmediata se inician cuando las molculas de alergeno se unen a dos molculas de IgE en la superficie celular del mastocito, entrecruzando sus regiones Fab (ver captulo 20). Esto permite as el movimiento de los receptores Fc que inducen la activacin de la membrana celular y los eventos citoplasmticos que culminan en la liberacin de mediadores preformados contenidos en los grnulos y la generacin de nuevos productos como los eicosanoicos y citoquinas. 2.2. Degranulacin de mastocitos y basfilos Las manifestaciones clnicas de las reacciones anafilcticas y anafilactodeas se deben a la liberacin de mediadores desde los mastocitos y basfilos a saber:

a) Mediadores preformados Varias molculas se encuentran preformadas en los mastocitos y basfilos (tabla 22-1). La Histamina o B-imidazoletilamina, fue sintetizada en 1907 y denominada histamina o derivada de tejidos (del griego histos). Posteriormente, al inyectar histamina por va endovenosa, fue posible reproducir los sntomas de animales sensibilizados, por lo que se consider ser el mediador humoral de las reacciones alrgicas. La histamina es sintetizada en el aparato de Golgi de los mastocitos y basfilos, a partir de la decarboxilacin de la histidina su aminocido precursor. Una vez formada la histamina se une a los residuos cidos de la cadena de glicosaminoglican de la heparina u otro proteoglicano. La cantidad de histamina en mastocitos humanos aislados de pulmn, piel, tejido linfoide e intestino delgado es de 3-8 pg por clula. Niveles bajos de histamina son secretados en forma continua, pero se desconoce su estmulo, niveles ms altos de secrecin se produce cuando la clula es estimulada con antgenos, anti-IgE, concanavalina A, substancia P, poliaminas, opiceos, compuesto 48/80 y una variedad de citoquinas. Hay evidencias que sugieren que subpoblaciones de mastocitos difieren

Tabla 22-1. Mediadores preformados de mastocitos humanos Tipo de mediador Amina biognica Proteasas neutrales Hidrolasas Mediador Histamina Triptasa Quimasa B-hexosaminidasa B-glucoronidasa B-D-galactosidasa Arilsulfatasa Heparina Condroitin sulfato Superoxidismutasa Peroxidasa ECF-A NCF-A Funcin Contraccin msculo liso y clulas Endoteliales Rompe C3 y C3a Activa fibroblastos Rompe neuropptidos Hidrolisa carbohidratos complejos Hidrolisa carbohidratos complejos Hidrolisa carbohidratos complejos Hidrolisa sulfatos esteres aromticos Anticoagulante Desconocida Convierte O2 a H2O2 Convierte H2O2 a H2O Atrae y activa eosinfilo Atrae y activa neutrfilos

Proteoglicanos Enzimas oxidativas Factores quimiotcticos

ECF-A, Factor quimiotctico de eosinfilo; NCF-A, Factor quimiotctico de neutrfilos

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segn el estmulo, tanto en la variedad como velocidad de liberacin de los diferentes mediadores. La histamina extracelular es rpidamente metabolizada a travs de dos vas enzimticas, metilacin (70%) y oxidacin (30%). La metilacin es catalizada por una enzima intracelular la N-metiltransferasa transformndola a N-metilhistamina que es excretada por el rin. Parte de este producto metilado es oxidado por la monoaminoxidasa y excretada como cido metilimidazol actico. Tambin, la histamina puede ser directamente oxidada por la diaminoxidasa (histaminasa) y eliminada como cido imidazol actico. La histamina acta en una gran variedad de tejidos mediante receptores especficos. Gracias al desarrollo de substancias qumicas que antagonizan en forma especfica una variedad de efectos farmacolgicos de la histamina, ha sido posible determinar tres subtipos de receptores: H1, H2 y H3. La ocupacin de los receptores H1 de la histamina produce contractura de la musculatura lisa gastrointestinal y de la va rea. La inhalacin de histamina es usada en clnica como test para determinar el grado de hiperreactividad bronquial no especfica en el asma bronquial. La inyeccin intradrmica de histamina, causa una triple respuesta, (a) eritema local producto de la vasodilatacin arteriolar mediada por receptores H1 y H2; (b) una respuesta algo ms tarda con mayor enrojecimiento producido por neuropptidos con accin vasodilatadora como el pptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) y (c) luego se forma una ppula que es consecuencia del edema que sigue a la contraccin de las clulas endoteliales de las vnulas postcapilares y la exudacin de plasma. La mayor parte de la formacin de mcula y ppula es por respuesta de receptores H1, los receptores H2 juegan un rol secundario. b) Mediadores neoformados La degranulacin de mastocitos y basfilos produce tambin la liberacin de otros mediadores que activan otras vas de la inflamacin, as la quininogenasa de mastocitos y la calicrena de basfilos puede activar el sistema quinina. La triptasa puede activar la calicrena, el sistema complemento y el fibringeno. El factor activador de plaquetas puede activar el sistema de coagulacin y producir coagulacin intravascular diseminada. Factores quimiotcticos atraen eosinfilos que

pueden intensificar y prolongar la inflamacin. Por otro lado la heparina al inhibir la plasmina y calicrena, inhibe la coagulacin. La quimasa es capaz de convertir la angiotensina I en angiotensina II y podra, tericamente, aumentar la respuesta compensatoria a la hipotensin. En la tabla 22-2 se muestran mediadores neoformados. Productos derivados del cido araquidnico Los productos derivados del cido araquidnico no estn preformados, se forman al activarse la clula. Ellos son prostaglandinas, leucotrienos, tromboxanos y lipoxinas. Al activarse el mastocito mediante entrecruzamiento de los receptores para Fc de la IgE u otro estmulo, se activa la fosfolipasa (PLA2) mediante aumento de calcio y su fosforilacin por una quinasa. El cido araquidnico es metabolizado por dos vas, mediante las enzimas cicloxigenasa (COX) y lipoxigenasa formando prostaglandinas y leucotrienos respectivamente. La enzima COX se encuentra en dos formas, COX 1 que se encuentra en forma constitutiva en diferentes tipos de clulas. COX2 que es altamente inducible por la accin de citoquinas pro-inflamatorias, endotoxinas, steres del forbol (PMA), y factores de crecimiento. Tanto la enzima como su mRNA es reducido con los corticoides. La generacin de prostanoides mediante COX2 en macrfagos, mastocitos y polimorfonucleares se asocia a inflamacin, dolor y fiebre. Los mastocitos humanos y no los basfilos producen prostaglandina D2 (PGD2) lo que ha servido para identificar su presencia en reacciones alrgicas ya que ambas clulas producen histamina. El cido araquidnico puede ser metabolizado por una variedad de lipoxigenasas, cuando es metabolizado por la 5-lipoxigenasa se producen los leucotrienos. As el arquidonato es convertido a 5HPTE y luego a leucotrieno A4. LTA4 es convertido a dihidroxil leucotrieno LTB4 y luego a cisteinil leucotrieno LTC4. El rompimiento de glutamina y glicina produce los metabolitos LTD4 y LTE4, respectivamente. Factor activador de plaquetas El Factor activador de plaquetas (PAF) es un fosfolpido ligado a un grupo ter. El PAF es sintetizado por accin de la fosfolipasa A que hidrolisa 1-O alquil-2 acilgliceril-3 fosforilcolina para producir lisoPAF. Este metabolito es transformado a

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Tabla 22-2. Mediadores generados durante la activacin de mastocitos Mediador LTC4, LTD4, LTE4 Funcin Contraccin msculo liso Aumento secrecin va area Dilatacin y aumento de permeabilidad vasos Disminuye la contractilidad miocrdica Contraccin arterias coronarias y cerebrales Hiperreactividad va area Quimiotaxis y activacin neutrfilos Aumenta adherencia leucocitos a endotelio Aumenta funcin clulas NK Dilatacin y aumento permeabilidad de vasos Broncodilatacin Broncocontriccin Broncocontriccin Contriccin vasos pulmonares Broncocontriccin Aumenta adherencia leucocitos Aumento agregacin y adherencia plaquetaria Agregacin plaquetaria Quimiotaxis y degranulacin de eosinfilos y neutrfilos Aumenta permeabilidad vascular Broncocontriccin

LTE4 LTB4

PGE2 PGD2 PGF2alfa TxA2

PAF

PAF mediante la acetilacin por una enzima acetiltransferasa. La produccin de PAF fue descrita en un comienzo por activacin de basfilos de conejos. Mastocitos humanos purificados de pulmn tambin producen PAF y en menor cantidad lisoPAF, que tiene menor actividad que PAF. En contraste con las plaquetas de conejo, las humanas son menos sensibles a la accin de PAF. Sin embargo, este mediador tiene accin importante en neutrfilos humanos, en los cuales ejerce una accin quimiotctica, cambios estructurales, liberacin de enzimas lisosomales y generacin de radicales libres. Estas acciones tambin pueden ser producidas por la generacin de LTB4. PAF tambin tiene accin quimiotctica de eosinfilos tanto in vitro como in vivo, lo que ha hecho especular que tendra un rol importante en la infiltracin eosinoflica en alergias. La inhalacin de PAF produce bronco-contriccin en individuos asmticos y no asmticos. Sin embargo, potentes antagonistas de PAF no son capaces de inhibir la bronco-

contriccin inducida por inhalacin de alergenos en individuos asmticos sensibilizados. Por lo tanto es dudoso su rol en el asma bronquial pero en anafilaxis no ha sido descartado. Citoquinas Mastocitos purificados de pulmn humano incubados con SCF y anti-IgE expresan mRNA para diversas citoquinas como: IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, GM-CSF y TNF (ver captulo 11). Factor de Necrosis Tumoral-alfa (TNF-): se encuentra preformado en los grnulos de mastocitos. En mucosa nasal y bronquial se encuentra asociado a la subclase de mastocitos Mt y en mastocitos de piel se encuentra asociado a la subclase Mtc. En individuos con rinitis alrgica TNF es liberado junto con triptasa a los minutos de la provocacin con alergeno. Esto contrasta con las clulas cl-

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sicas productoras de TNF como macrfagos y linfocitos que no guardan esta citoquina preformada y se libera despus de su activacin y transcripcin y por lo tanto de manera mucha ms lenta que de los mastocitos. La rpida liberacin de TNF por mastocitos puede tener gran importancia en la inflamacin alrgica, ya que TNF es crucial para la activacin de NFkB, factor de transcripcin que aumenta la expresin de mRNA de GM-CSF, IL,8, IL-6, E-Selectina, VCAM-1 e ICAM-1 en diversas clulas epiteliales y endoteliales. Interleuquina-5 (IL-5): es crucial para la maduracin, activacin y sobrevida de eosinfilos. La produccin de IL-5 se inicia con la activacin de mastocitos mediante entrecruzamiento de los receptores para IgE. Se produce slo en la subclase MTt, mastocitos que estn bajo control de clulas T y estn aumentados en sitios de inflamacin alrgica crnica. Interleuquina-4 (IL-4): es responsable del estmulo y mantencin de la proliferacin de linfocitos Th2 y de la sntesis de IgE por clulas B. Por tcnicas inmunocitoqumicas se ha determinado la presencia de IL-4 en el 80% de mastocitos de la mucosa bronquial. Se encuentra en los grnulos de mastocitos Mt y Mtc.

veridad de la reaccin anafilctica se ha correlacionado con los niveles de la anafilatoxina C3a, indicando una participacin de la cascada del complemento. Otros estudios han demostrado la participacin del sistema calicrena en el desarrollo de angioedema durante una crisis de anafilaxis. La participacin de los sistemas de complemento, coagulacin, y calicrena-quinina, puede ser consecuencia de la liberacin de triptasa y quininogenasa de los mastocitos y calicrena desde los basfilos, sin embargo la hipoxia y el dao endotelial producido durante el shock pueden activar estos sistemas, como ha sido descrito en otros shock con hipotensin severa (cardiovascular, endotxico). Ms recientemente en modelos experimentales animales, se ha demostrado la participacin del xido ntrico (NO) durante la anafilaxis. El NO es producido por el endotelio vascular en forma constitutiva, y su produccin puede ser inducida en diferentes clulas como mastocitos, clulas del msculo liso y otras, por numerosos mediadores, incluyendo histamina, leucotrieno C4, bradiquinina y substancia P. El NO causa relajacin del msculo liso y aumenta la permeabilidad vascular produciendo hipotensin. 2.4. Alteraciones funcionales La mayora de los signos y sntomas de la reaccin anafilctica pueden ser explicados por la accin de los mediadores analizados anteriormente. Aunque cualquier rgano puede estar afectado, lo ms frecuente es que haya compromiso de piel, tracto respiratorio, gastrointestinal y cardiovascular. stos pueden comprender: eritema cutneo, prurito, sensacin de calor que puede ir progresando hasta llegar a la urticaria generalizada y angioedema. Los signos y sntomas respiratorios incluyen estornudos, laringoespasmo con estridor inspiratorio, broncoespasmo con sibilancias, y disnea. Algunos pacientes presentan nuseas, vmitos, diarrea y dolores abdominales. El compromiso cardiovascular se manifiesta por hipotensin acompaada de taquicardia y con menos frecuencia bradicardia y arritmias. La resistencia al flujo de la va area y la cada de la PO2 se puede atribuir al efecto contrctil directo de la histamina y otros mediadores que actan sobre el msculo liso bronquial. Tambin a la accin de la histamina puede deberse la aparicin de urticaria, sensacin de calor, angioedema y sntomas gastrointestinales. Los estudios sobre

2.3. Participacin de cascadas de la inflamacin en la reaccin anafilctica y anafilactodea Los diversos mediadores producidos por mastocitos y basfilos pueden activar un gran nmero de vas inflamatorias incluyendo: sistema de las quininas, sistema del complemento, sistema de la coagulacin y fibrinolisis. La participacin de estas cascadas proinflamatorias ha sido demostrada en individuos alrgicos sometidos a inmunoterapia controlada. Cuando el individuo sufre una reaccin slo urticarial, no experimenta cambios de sus niveles sanguneos de histamina ni otros mediadores. Sin embargo, cuando estos pacientes han experimentado shock, se elevan significativamente los niveles de histamina en sangre perifrica, la que se correlaciona con la severidad de la hipotensin y en algunos pacientes con episodios ms severos se observa disminucin de factores de la coagulacin como factor V, factor VIII, fibringeno, quiningeno, y de los componentes C3, C4 del complemento. La se-

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hipotensin durante las reacciones anafilcticas y anfilactodeas, se han realizado cuando estos episodios han ocurrido durante anestesia o cateterizacin cardaca. Esto ha permitido medir los fenmenos hemodinmicos, con lo cual se ha determinado que el evento inicial es la vasodilatacin con prdida masiva de lquido del intravascular y paso al extravascular, llegando hasta perder el 50% del volumen en 10 minutos. La cada de la presin arterial se correlaciona con elevacin de histamina, triptasa y C3a. Como mecanismo compensatorio se liberan catecolaminas; norepinefrina y epinefrina; se activa el sistema angiotensina con conversin de angiotensina I a angiotensina II. La respuesta vasopresora compensatoria es variable, en algunos pacientes, la resistencia vascular perifrica se eleva en forma anormal, mientras en otros cae a pesar de la masiva liberacin de catecolaminas. As, estos pacientes pueden estar en vasocontriccin mxima y no responden a agentes vasopresores, por lo tanto como la causa de hipotensin en el shock anafilctico es la prdida de lquido del espacio intravascular, la terapia de eleccin es el reemplazo de lquido y los expandedores de volumen. 3. CAUSAS DE ANAFILAXIS Los alergenos que han sido involucrados como agentes causales de anafilaxis son generalmente protenas o fosfolpidos grandes. Sin embargo, molculas pequeas que acten como haptenos unindose a protenas del organismo pueden desencadenar reacciones alrgicas. La respuesta requiere de la exposicin previa al antgeno y la sntesis de anticuerpo IgE. Sin embargo, la exposicin al antgeno puede pasar inadvertida y presentarse una reaccin anafilctica frente a antgenos que se desconoce estar sensibilizados. 3.1. Frmacos. Los antibiticos son los frmacos que con ms frecuencia producen reacciones alrgicas y entre ellos los betalactmicos y sulfas. Es ms probable que se produzca una reaccin anafilctica cuando la va de ingreso del antibitico es inyectable. Se ha descrito reacciones anafilcticas a la primera inyeccin de penicilina, condicin que es rara, indicando que la sensibilizacin puede ocurrir sin que el individuo est consciente de haber recibido la droga. La alergia a drogas no es ms frecuente en atpicos que en la poblacin general pero s lo es cuando hay antece-

dentes familiares de alergia a drogas. La incidencia de alergia a penicilina es de alrededor de 2% de las personas en tratamiento y reacciones fatales de 1 en 32.000 inyecciones. Cuando un individuo ha sufrido una reaccin alrgica a drogas la conducta futura es evitarla y slo cuando esto no es posible, intentar un tratamiento desensibilizante. 3.2. Ltex. Hasta 1980 esta reaccin era poco frecuente, actualmente con el aumento del uso de ltex ha aumentado su frecuencia y constituye un problema de salud pblica para grupos de riesgo. Entre 8-17% de los trabajadores de la salud en USA, estn sujetos a reacciones al ltex. Entre los dadores de sangre se ha demostrado que alrededor de un 6% tiene IgE anti-ltex lo que explica las reacciones alrgicas producidas con ltex en individuos que desconocen estar en riesgo. 3.3. Picaduras de Himenpteros. Varios grupos de insectos que se caracterizan por tener lanceta por la cual inyectan el veneno estn comprendidos en esta clasificacin, a saber las Apidae, Vespidae y Formicidae. Los alergenos contenidos en el veneno de los himenpteros son protenas y muchos son enzimas. Tambin contienen pptidos que no son alergnicos pero son responsables de las manifestaciones txicas. Adems de las protenas y pptidos contienen aminas vasoactivas como: histamina, 5-hidroxitriptamina, dopamina, norepinefrina y acetilcolina. Las reacciones reportadas por veneno de abeja varan entre un 0.4-3%. En USA alrededor de 25-50 personas mueren anualmente por picaduras de himenpteros, algunos de ellos sin tener antecedentes de reaccin alrgica a insectos. La manera ms rpida, simple y econmica de identificar individuos sensibilizados, es el test cutneo. La presencia de test cutneo positivo a veneno de himenpteros, determina sensibilizacin previa, pero no predice la forma de reaccionar del individuo, y no discrimina entre aquellos individuos con reaccin local de los con reaccin sistmica. Niveles elevados de IgE se observan slo en el 80% de los individuos con test cutneo positivo. Adems no hay correlacin entre el nivel de IgE y el grado de sensibilizacin del individuo. 3.4. Alimentos. De los pacientes atendidos por anafilaxis en un servicio de urgencia, en un tercio la causa es una reaccin alrgica a alimentos. Hay gran variedad de alimentos que pueden ser causa de sensibilizacin, pero los ms frecuentes en pro-

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ducir reacciones anafilcticas son: mariscos, clara de huevos, man, nueces, castaas de caj, soya, y pescados. 3.5. Anafilaxis inducida por inmunoterapia. Durante el tratamiento con inmunoterapia con extractos alergnicos a pacientes con rinitis alrgica y asma bronquial alrgica, se pueden producir reacciones anafilcticas. Esto ha llevado a que en pases como el Reino Unido su uso sea prohibido y en otros como USA, comits de expertos han dado pautas de recomendaciones de uso, poniendo especial cuidado en el manejo de pacientes asmticos, ya que tienen ms riesgo de hacer reacciones fatales. 3.6. Anafilaxis inducida por ejercicio. El sndrome de anafilaxis inducida por ejercicio fue descrito en una serie de individuos que presentaban prurito de piel, urticaria, angioedema, sibilancias e hipotensin en relacin a ejercicio. En estos pacientes se ha demostrado degranulacin de mastocitos y elevacin de histamina aunque sta no se correlaciona con los sntomas que presentan. Cerca del 70% de pacientes con este sndrome son atpicos. Hay una variante que es la anafilaxis inducida por ejercicio en relacin a comidas. Se ha descrito en pacientes que han presentado anafilaxis con ejercicio cuando han ingerido mariscos entre 2 y 24 horas antes. En otros pacientes la sintomatologa se habra manifestado despus de la ingesta de apio y ellos presentaban un test cutneo positivo a apio. En este subgrupo de pacientes, las manifestaciones de anafilaxis se presentan slo cuando hay ingesta de determinados alimentos y ejercicio simultneamente. 3.7. Anafilaxis idioptica. En alrededor de dos tercios de los pacientes que presentan una reaccin anafilctica no es posible determinar su causa. Afortunadamente estos casos son raramente fatales. 4. CAUSAS DE REACCIONES ANAFILACTODEAS 4.1. Aditivos. Los aditivos en los alimentos cumplen diversas funciones como colorantes, saborizantes y preservantes. Hay cerca de 3000 substancias permitidas de ser agregadas en alimentos. En general se usan en pequeas cantidades y la gran mayora no causa reacciones adversas.

Algunos de estos aditivos han sido causantes de reacciones sistmicas, en que no ha sido demostrada la IgE especfica. Entre ellos los colorantes sintticos (anhilinas) como la tartrazina, carmasina, amaranto, ndigo y otros; los preservantes como los derivados de sulfitos que cumplen mltiples funciones, los benzoatos y parabene. Estos son los que con mayor frecuencia han sido sealados como agente causal de reacciones anafilactodeas. 4.2. Medios de contraste. Las reacciones a medios de contraste utilizados en exmenes radiolgicos han disminuido con la introduccin de agentes de baja osmolaridad. Las reacciones con agentes hiperosmolares se estimaron en un 1%. En USA alrededor de 8 millones de personas reciben anualmente medios de contraste y de ellas alrededor de 2700 hacen reacciones severas y 500 mueren. 4.3. cido acetil saliclico (AAS) y antiinflamatorios no esteroidales (AINE). La patogenia de la reaccin inflamatoria inducida por AAS y AINE es debida a la unin inmediata de estos medicamentos con la cicloxigenasa COX-1 que previene la sntesis de prostaglandinas incluyendo PGE2, permitiendo la metabolizacin del cido araquidnico por la va de la lipoxigenasa con la formacin de leucotrienos. Se ha demostrado que las clulas mononucleares de los individuos sensibles a la aspirina tienen gran susceptibilidad por la inhibicin de COX-1 con AAS comparados con los individuos que no reaccionan a estas drogas. Con la provocacin oral con aspirina en individuos que reaccionan con rinorrea, se ha determinado aumento de histamina, LTC4, triptasa y una disminucin de PGE2 en lquido de lavado nasal, indicando la participacin de mastocitos. La sintomatologa puede ser prevenida con el uso de antileucotrienos que inhiben sus receptores o su sntesis. La incidencia reportada vara dependiendo de la poblacin seleccionada para el estudio. sta va desde 2% en grupos de nios hasta 97% en adultos con asma y rinosinusitis o plipos nasales. En un estudio de 51.979 pacientes que estaban ingiriendo estos medicamentos se report 35 casos de shock pero en un grupo de pacientes que haban presentado reaccin anafilctica slo el 3% tena como agente causal a la AAS.

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5. REACCIONES ANAFILCTICAS Y ANAFILACTODEAS EN PABELLONES QUIRRGICOS Se desconoce la incidencia de estas reacciones en el acto operatorio. Hay mltiples agentes utilizados durante el acto operatorio que pueden causarlas, incluyendo el ltex, ralajantes neuromusculares derivados de amonio terciario y cuaternario, sustitutos del plasma y la aplicacin de otras drogas endovenosas como opioides, protaminas y otras. Hay estudios que muestran que las reacciones anafilcticas y anafilactodeas durante la anestesia estaran aumentando. Las cifras varan entre 1 en 5.000 y 1 en 25.000 con una mortalidad de 3-4%. En el Reino Unido un 4.3% de las muertes en el acto operatorio se deberan a reacciones a drogas. Las reacciones a anestsicos como tiopental varan entre 1 en 15.000 a 1 en 30.000. Los expandedores de volumen se asocian a reacciones anafilactodeas variando su incidencia entre 1 en 17.000 con hidroetilalmidn y 1 en 2.600 con gelatina.

6. SIGNOS Y SNTOMAS En la tabla 22-3 se indica la frecuencia de aparicin de signos y sntomas en reacciones anafilcticas. La serie comprende diversos estudios incluyendo 747 pacientes con episodios anafilcticos de diferente origen y a pesar de la diversidad de agentes causales, la frecuencia de signos y sntomas son similares, indicando que el mecanismo fisiopatolgico es el mismo. La urti-

caria y el angioedema son las manifestaciones ms comunes, seguidas de alteraciones respiratorias con obstruccin respiratoria alta, disnea y sibilancias y en un 33% mareos e hipotensin. Con menor frecuencia se dan las manifestaciones gastrointestinales incluyendo vmitos, diarrea y dolor abdominal. Se ha descrito colapso cardiovascular inmediato sin ser precedido por sntomas respiratorios o urticaria pero en un 30% precedidos por sntomas gastrointestinales y en el 85% haba signos neurolgicos de alteracin de conciencia, temblor y espasmos musculares. El comienzo de los sntomas se produce entre 5-30 minutos despus de haber recibido el antgeno va inyectable. Cuando el antgeno es ingerido los sntomas aparecen habitualmente alrededor de las 2 horas, pero tambin pueden aparecer mas tardamente. Hay correlacin entre la velocidad de aparicin de los sntomas y la severidad del ataque. Un episodio puede desaparecer y reaparecer despus de varias horas, es lo que se llama anafilaxis bifsica. Adems los episodios pueden mantenerse y reaparecer despus de varios das con mltiples recurrencias y largos intervalos asintomticos. La muerte por anafilaxis se debe a la obstruccin de la va area y/o colapso cardiovascular. En estudios post morten de pacientes con obstruccin respiratoria se observa pulmn hiperinflado y edema de las vas areas, la obstruccin de la va area se debe a una combinacin de espasmo muscular edema de la submucosa, y acumulacin de secreciones en el lumen. Tambin se observa infiltracin celular especialmente de eosinfilos en vasos pulmonares, en la lmina propia del

Tabla 22-3. Signos y sntomas en reacciones anafilcticas Signos y sntomas Frecuencia (%)

Urticaria, Angioedema Disnea, Sibilancias Mareos, Hipotensin Nuseas, Vmitos, Diarrea, Dolor abdominal Enrojecimiento Edema va area alta Dolor de cabeza Rinitis Dolor retroesternal

88 47 33 30 46 56 15 16 6

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tracto gastrointestinal. Cuando predomina el colapso vascular es posible encontrar signos de isquemia miocrdica. Individuos que han muerto por una reaccin anafilctica bien documentada se ha demostrado niveles altos de triptasa. Es posible obtener IgE especfica y niveles de triptasa en suero de cadveres hasta 15 horas post morten, esto permitira en casos de muerte sbita, determinar si sta ha ocurrido por una reaccin anafilctica. 7. LABORATORIO El diagnstico de anafilaxis es clnico. Sin embargo en algunas circunstancias cuando ste no es claro o se debe descartar otros diagnsticos, puede ser de utilidad la cuantificacin de los niveles de histamina y de triptasa srica y de histamina en orina, ya que indica que ha habido descarga de mediadores de mastocitos. La histamina plasmtica se eleva a los 5-10 minutos y permanece elevada 30-60 minutos. No ayuda si el paciente es visto despus de una hora de ocurrida la reaccin. En este caso se puede cuantificar histamina o sus metabolitos en orina los que permanecen elevados por ms tiempo. Los niveles de triptasa srica aumentan entre una a una hora y media de ocurrido la reaccin y permanecen elevados por alrededor de cinco horas. En algunas ocasiones es posible determinar el agente causal, especialmente cuando se trata de alimentos, medicamentos o ltex mediante la presencia de IgE especfica contra el antgeno sospechoso. Hay que considerar que la sospecha diagnstica del agente etiolgico se realiza mediante una detallada y acuciosa anamnesis y el laboratorio sirve para confirmar la sospecha. En alrededor de dos tercios de los casos de anafilaxis se desconoce el agente causal.

picaduras de insecto (abejas), alimentos etc. 2. Cuando es factible realizar IgE especfica para antgeno sospechoso. 3. Evitar el alergeno incluyendo aquellos que tengan reactividad cruzada. 4. Si se identifica el alergeno causal de reacciones anafilcticas, se debe usar identificacin (brazalete, medalla) que lo seale. 5. Ensear al paciente a usar epinefrina inyectable para una emergencia (picadura de abeja). 6. Pacientes en riesgo deben evitar ser tratados con beta bloqueadores, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, y de la angiotensina II e inhibidores de la monoamino-oxidasa. Estas drogas disminuyen la efectividad de la epinefrina, e interfieren con la respuesta endgena compensatoria de la hipotensin. Tratamiento del episodio agudo El tratamiento del episodio agudo debe comenzar en el sitio donde ocurre, de inmediato acudir a un servicio de urgencia, y si no cede hospitalizar al paciente. Es importante una rpida evaluacin del paciente, ver la permeabilidad de la va area, estado de conciencia, medicin de presin arterial y pulso. Si no presenta obstruccin bronquial, colocar al paciente en posicin supina y levantar los pies. Si la reaccin anafilctica fue por una inyeccin colocar torniquete en la zona proximal al sitio de inyeccin y remover cada 5 minutos mientras se realiza la terapia. Tratamiento inmediato: 1. Epinefrina: dosis y va segn gravedad Segn evaluacin 2. Oxgeno 3. Antagonistas H1y H2 4. Corticoides 5. Broncodilatadores 6. Vasopresores 7. Infusin de lquidos endovenosos Estas ltimas medidas deben ser administradas en unidad de cuidados intensivos. Es posible que la anafilaxis ocurra en episodios bifsicos, por lo que el paciente debe ser observado por lo menos 2 horas si el episodio agudo ha sido leve y al menos 24 horas si ha requerido hospitalizacin.

8. TRATAMIENTO En el tratamiento de la anafilaxis hay que considerar dos aspectos: a) el tratamiento preventivo para reducir la incidencia de reacciones anafilcticas y anafilactodeas y b) el tratamiento del episodio agudo. Medidas para reducir la incidencia de anafilaxia: 1. Anamnesis detallada de alergia a drogas, ltex,

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LECTURAS SUGERIDAS Gordon J.R., Burd, P.R., Galli, S.J., Mast cells as a source of mutifunctional cytokines, Immunol Today, 11: 458-464, 1990. Lieberman, P., Anaphylaxis and anaphylactoid reactions in Middeleton Jr., E., Reed, C.E., Ellis, E.F., Adkinson Jr., N.F., Yunginger, J.W., Busse W.W. editors, Allergy: principles and practice, 5 ed., St Louis Mo, Mosby, p. 1079, 1998. Songzhu, An, Goetzl, E.J., Lipid mediators of hypersensitivity and inflammation in Middeleton, Jr. E., Reed, C.E., Ellis, E.F., Adkinson Jr. N.F., Yunginger, J.W., Busse W.W. editors, Allergy: principles and practice, 5 ed., St Louis Mo, Mosby, p.168, 1998. Stevens, R.L., Austen, K.F., Recente advances in the cellular and molecular biology of mast cells, Immunol Today, 10: 381-386, 1998. Terr, A.I., Anaphylaxis and Urticaria in Stites, D.P., Terr, A.I. editors, Basic and Clinical Immunology, 7 ed., Singapur, Lange Medical Publication, p. 400, 1991.

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Captulo 23
AUTOINMUNIDAD
Ana Mara Agar M. y Mara Anglica Marinovic M.

1. Introduccin 2. Formas clnicas y caractersticas comunes 3. HLA y enfermedades autoinmunes 4. Patogenia de las enfermedades autoinmunes 5. Autotolerancia 5.1. Falla de la tolerancia central del linfocito T 5.2. Falla de la tolerancia perifrica del linfocito T 5.3. Falla de la tolerancia del linfocito B 6. Citoquinas y enfermedades autoinmunes 7. Nuevos tratamientos

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RESUMEN Una de las propiedades fundamentales del sistema inmune radica en la capacidad de discriminar entre antgenos propios y no propios. Es as, como los linfocitos maduros funcionalmente competentes son capaces de reconocer y responder a antgenos extraos, pero no pueden reconocer y/o responder a antgenos propios. A travs de mecanismos de autotolerancia se impide la respuesta contra estructuras propias. Cuando se pierde esta autotolerancia se producen reacciones inmunes contra los antgenos propios, reacciones denominadas de autoinmunidad y las patologas que ellas causan se denominan enfermedades autoinmunes. Las enfermedades autoinmunes se caracterizan por la produccin de anticuerpos y/o clulas T efectoras inmunes que son autorreactivas. Dado que las respuestas de clulas B en humanos requiere de clulas T inductoras, la produccin de autoanticuerpos implica un desorden del control inmunorregulatorio de las clulas T. Existen varios factores asociados a la aparicin de una enfermedad autoinmune, entre ellas la herencia juega un rol importante en el desarrollo de la autoinmunidad. Sin embargo, los patrones hereditarios de estas enfermedades son, a menudo, complejos. En la actualidad las bases genticas de la autoinmunidad estn enfocadas en los genes del Complejo Principal de Histocompatibilidad. Se ha evidenciado la participacin de diversas citoquinas dentro de los mecanismos efectores involucrados en las enfermedades autoinmunes. La inmunomodulacin de estas sustancias tendra importancia en la intervencin teraputica de ellas.

1. INTRODUCCIN Una de las propiedades fundamentales del sistema inmune, radica en la capacidad de discriminar entre antgenos propios y no propios. Es as, como los linfocitos maduros funcionalmente competentes son capaces de reconocer y responder a antgenos extraos, pero no pueden reconocer y/o responder a antgenos propios. El sistema inmune posee una enorme diversidad, y el repertorio de especificidades antignicas expresadas por las poblaciones de clulas T y B incluyen muchas dirigidas contra autocomponentes, sin embargo a travs de mecanismos de autotolerancia (no respuesta del sistema inmune a los antgenos propios) no se producen reacciones autoinmunes. Cuando se pierde esta autotolerancia se producen reacciones inmunes contra los antgenos propios, reacciones denominadas de autoinmunidad y las patologas que ellas causan se denominan enfermedades autoinmunes. Las enfermedades autoinmunes se caracterizan por la produccin de anticuerpos y/o de clu-

las efectoras inmunes que son autorreactivas. Dado que las respuestas de clulas B en humanos requieren de clulas T inductoras, la produccin de autoanticuerpos implica un desorden del control inmunorregulatorio de las clulas T. La presencia de autoanticuerpos no es indicadora de enfermedad autoinmunitaria, es as como ttulos bajos de autoanticuerpos contra ciertas estructuras es un hecho, incluso, fisiolgico.

2. FORMAS CLNICAS Y CARACTERSTICAS COMUNES Las enfermedades asociadas con el fenmeno autoinmune tienden a distribuirse en un espectro que va desde las enfermedades rgano especficas, como la Tiroiditis de Hashimoto, en las cuales los anticuerpos y las lesiones destructivas estn orientadas slo contra un rgano del cuerpo, mientras en el otro polo se encuentra como ejemplo tipo, el Lupus eritematoso sistmico (LES), en el cual los anticuerpos estn dirigidos contra antgenos ampliamente distribuidos en el organismo y las lesio-

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nes caractersticas de la enfermedad son tambin ampliamente diseminadas (tabla 23-1). Una serie de caractersticas en relacin al antgeno, tipo de lesiones y sobreposicin con otras enfermedades caracterizan a las enfermedades rgano especficas y rgano inespecficas (tabla 23-2). A pesar de que puedan afectar diversos rganos y adems en forma muy distinta, las enfermedades autoinmunes poseen caractersticas comunes, entre las que figuran: a) Induccin experimental: la mayora de las en-

fermedades autoinmunes humanas se pueden reproducir en animales de experimentacin, si bien los mtodos de induccin varan para cada una de ellas. b) Edad: su aparicin es mucho ms frecuente en las personas adultas, existiendo una correlacin positiva entre la edad y la frecuencia de estas enfermedades. Es muy comn tambin encontrar autoanticuerpos no patognicos en personas de edad avanzada. Un 5% de mujeres de ms de 50 aos poseen ttulos bajos a anticuerpos antinucleares. c) Sexo: son ms frecuentes en las mujeres. As ocurre con la artritis reumatoidea, el LES, la miastenia gravis, la hepatitis crnica activa, la cirrosis biliar primaria y muchas otras. En los animales de experimentacin se ha observado la existencia de una relacin entre el nivel de estrgenos y presencia e intensidad de procesos autoinmunes.

Tabla 23-1. Espectro de enfermedades autoinmunes

rgano especficas

rgano inespecficas

Enfermedad autoinmune Tiroiditis de Hashimoto Mixedema primario Tirotoxicosis Anemia Perniciosa Gastritis atrfica autoinmune Enfermedad de Addison Menopausia prematura(*) Diabetes juvenil Sndrome de Goopasture Miastenia Gravis Infertilidad masculina(*) Pnfigo vulgar Penfigoide Oftalmia del Simptico Uveitis Facognica Esclerosis Mltiple Anemia hemoltica autoinmune Prpura trombocitopnico inmune Leucopenia idioptica Cirrosis biliar primaria Hepatitis crnica activa con AgHBs Cirrosis criptognica(*) Colitis ulcerosa Sndrome de Sjogren Artritis reumatoidea Dermatomiositis Esclerodermia Lupus eritematoso discoide Lupus eritematoso sistmico

d) Factores genticos: existe una clara predisposicin familiar a sufrir estas enfermedades. Es frecuente observar la presencia de diversos procesos autoinmunes en distintos miembros de una misma familia. e) Patologa linfocitaria: las enfermedades primarias del sistema inmunolgico se acompaan con frecuencia de procesos autoinmunes. De esta manera, por ejemplo, se observa la aparicin de anemias hemolticas autoinmunes en la leucemia linftica crnica. Factores ambientales: las infecciones virales y bacterianas se asocian con autoinmunidad, y los perodos pre-infecciosos, a menudo, preceden las manifestaciones clnicas de enfermedad autoinmune. En la mayora de estos casos, el microorganismo no est presente en las lesiones y no es detectable en el individuo cuando la autoinmunidad se desarrolla. Es as como, las lesiones por autoinmunidad no se deben al agente infeccioso mismo, sino son producto de la respuesta inmune del husped que pueden ser gatilladas o disreguladas por el microbio. Entre los muchos posibles efectos de las infecciones se encuentran la activacin policlonal de linfocitos, la inflamacin tisular local que lleva a un aumento en la expresin de coestimuladores, la alteracin de autoantgenos creando neoantgenos que,

f)

(*) algunos casos

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Tabla 23-2. Comparacin entre las enfermedades rgano especficas y las rgano inespecficas Enf. rgano especficas Antgeno Especialmente localizado al rgano dado El antgeno en el rgano es blanco para el ataque inmunolgico Enf. rgano inespecficas Ampliamente distribuido en el organismo Los complejos se depositan en forma sistmica particularmente en piel, rin y articulaciones Con otras enfermedades rgano inespecficas

Lesiones

Sobreposicin

Con otras enfermedades rgano especficas

parcialmente, presentan reacciones cruzadas y dao tisular que lleva a la liberacin de antgenos anatmicamente secuestrados. g) Alteraciones anatmicas en los tejidos: tales como inflamacin o trauma pueden llevar a la exposicin de autoantgenos que habitualmente no estn expuestos al sistema inmune. Tales antgenos secuestrados no habran inducido autotolerancia. Al liberarse estos autoantgenos, pueden interactuar con linfocitos inmunocompetentes e inducir respuestas inmunes especficas. Entre los antgenos anatmicamente secuestrados se encuentran las protenas intraoculares y el semen. La uveitis pos-traumtica y la orquitis post-vasectoma, se cree que se deben a respuestas autoinmunes contra autoantgenos que son liberados de su localizacin normal. La inflamacin tisular puede tambin producir alteraciones estructurales en autoantgenos y la formacin de nuevos determinantes capaces de inducir reacciones autoinmunes. La inflamacin puede llevar a la activacin macrofgica por citoquinas de produccin local, y estas citoquinas estimulan la expresin de coestimuladores cuyo resultado final puede ser la prdida de la tolerancia perifrica.

3. HLA Y ENFERMEDADES AUTOINMUNES La herencia juega un rol importante en el

desarrollo de la autoinmunidad. Sin embargo los patrones hereditarios de estas enfermedades son, a menudo, complejos. En la actualidad las bases genticas de la autoinmunidad estn enfocadas en los genes del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC, HLA en humanos). El estudio de los HLA en grandes grupos de pacientes con varias enfermedades autoinmunes ha mostrado que algunos alelos de HLA aparecen con una mayor frecuencia en estos pacientes que en la poblacin general. A partir de estos estudios ha sido posible determinar el riesgo relativo de desarrollar una enfermedad en individuos portadores de varios alelos de HLA (tabla 23-3). La asociacin ms fuerte se encuentra entre la Espondilitis anquilosante, una enfermedad inflamatoria y presumiblemente autoinmune de las articulaciones vertebrales, con el alelo B27 de los HLA clase I. Los individuos HLA B27 positivos tienen entre 90100 veces ms posibilidades de desarrollar la Espondilitis anquilosante que los individuos que carecen del antgeno B27. Se desconocen los mecanismos de esta enfermedad y las bases de la asociacin con el haplotipo sealado. Recientemente la investigacin en enfermedades autoinmunes se ha enfocado fundamentalmente hacia los loci pleomrficos de HLA DR y HLA DQ (molculas clase II). Esto debido a la participacin de las molculas MHC clase II en la seleccin y activacin de las clulas T CD4+ , y en consideracin de que las clulas T CD4+ regulan tanto las respuestas humorales como celulares a antgenos proteicos.

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Tabla 23-3. Ejemplos de enfermedades inmunolgicas ligadas a HLA Enfermedad Artritis reumatoidea Pnfigo vulgar Hepatitis crnica activa Sindrome Sjogren Enfermedad celaca Espondilitis anquilosante Alelo HLA DR4 DR4 DR3 DR3 DR3 B27 Riesgo relativo* 6 24 14 10 12 90

* Posibilidad de desarrollar una enfermedad en individuos con un alelo particular en comparacin con individuos que carecen de ese alelo.

4. PATOGENIA DE LAS ENFERMEDADES AUTOINMUNES Existe un gran nmero de vas por las cuales se puede iniciar una reaccin autoinmune. Sin embargo para la mayora de las enfermedades autoinmunes existe un evento crtico comn que es la activacin de linfocitos T autorreactivos, los cuales promueven distintos mecanismos efectores responsables del dao (figura 23-1). En la mayora de las enfermedades autoinmunes existe una mezcla de las clsicas respuestas Th1 y Th2 en diversa proporcin. Las subpoblaciones Th1 favorecen la respuesta inmune celular, la caracterstica patognica ms prominente de las enfermedades rgano especficas (tiroiditis, diabetes mellitus insulinodependiente), con activacin de macrfagos, linfocitos T citotxicos y produccin de citoquinas como TNF alfa y beta. En cambio las subpoblaciones Th2 favorecen una respuesta humoral, caracterstica de las enfermedades rgano inespecficas (LES), en las cuales hay un efecto directo de los autoanticuerpos sobre la clula blanco, inducido por lisis mediada por complemento, fagocitosis, formacin y depsito de complejos inmunes, y en menor medida citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Adems existe un nmero de enfermedades autoinmunes mediadas por anticuerpos contra receptores de superficie celular, los cuales causan exceso de actividad o inhibicin de la funcin del receptor. Se desconoce los mecanismos etiolgicos de las enfermedades autoinmunitarias, tampoco existe una opinin unnime en relacin a las causas que

puedan ser ms probables. En condiciones normales el sistema inmunitario del husped rene una doble condicin: a) desarrolla respuestas inmunitarias con un repertorio de especificidades tan amplio como la gran diversidad de sustancias extraas a l y b) mantiene un estado de tolerancia para los componentes propios (autotolerancia) o un grado de respuesta imperceptible clnicamente. Esta doble y contradictoria condicin es un rasgo esencial del sistema inmunitario para que pueda actuar como un mecanismo clave en el mantenimiento de la integridad del husped. Cuando se quiebra la autotolerancia ocurre autoinmunidad.

5. AUTOTOLERANCIA En el ao 1949 Burnett propuso la teora de la seleccin clonal para explicar la autoinmunidad, l postulaba que los clones de linfocitos autorreactivos eran eliminados o delecionados durante su desarrollo para prevenir las reacciones autoinmunes. Actualmente sabemos que esto es parcialmente correcto. La autoinmunidad resulta de la falla de los mecanismos normalmente responsables de mantener la autotolerancia. La autoinmunidad puede resultar de alteraciones primarias de linfocitos T, B o ambos. Actualmente se le da un rol protagnico al linfocito T por 2 razones principales: (a) el linfocito T helper es el regulador de todas las respuestas inmunes a protenas. (b) muchas enfermedades autoinmunes estn genticamente asociadas o unidas al MHC, y la funcin de las molculas MHC

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Figura 23-1. Mecanismos iniciadores y efectores de autoinmunidad. Los linfocitos T CD4 autorrectivos que han escapado de la seleccin negativa en el timo, pueden ser activados por diversos mecanismos. Estos linfocitos T a travs de mecanismos efectores producirn citoquinas del tipo Th1 o Th2, lo cual se traducir ya sea en la produccin de una respuesta inmune mediada por clulas o la formacin de autoanticuerpos.

es presentar pptidos antignicos a la clula T. Por lo tanto se cree que la falla de la autotolerancia de linfocitos T es un mecanismo importante de enfermedad autoinmune . 5.1. Falla de la tolerancia central del linfocito T. La tolerancia central es el mecanismo de seleccin negativa de los linfocitos T inmaduros autorreactivos que deleciona clulas que poseen receptores de alta afinidad para autoantgenos. 5.2. Falla de la tolerancia perifrica del linfocito T. La tolerancia perifrica en linfocitos T maduros autorreactivos es mantenida por anergia, delecin por apoptosis, supresin por clulas reguladoras. La autoinmunidad que resulta de la falla de cada uno de estos mecanismos ha sido demostrada en distintos estudios experimentales: (a) expresin aberrante de coestimuladores en tejidos puede resultar en quiebre de la anergia del

LT y reaccin autoinmune tejido especfica, (b) anergia del LT puede fallar debido a defectos en las molculas que normalmente inactivan estas clulas, (c) mutaciones que interfieren con los mecanismos de apoptosis de linfocitos maduros, puede resultar en enfermedades autoinmunes, por ejemplo: mutaciones del ligando Fas, (d) defectos en la supresin mediada por LT: se ha postulado que algunos autoantgenos normalmente inducen LT reguladores que producen citoquinas inmunosupresoras que funcionan manteniendo la autotolerancia, lo cual se puede perder. 5.3. Falla de la tolerancia del linfocito B: Se cree que muchas enfermedades autoinmunes causadas por autoanticuerpos son debidas a falla en la tolerancia del linfocito B. Exposicin de linfocitos B a activadores policlonales como lipopolisacridos, pueden activar un gran nmero de estas clulas, incluyendo algunas que son especficas para

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autoantgenos. Debe destacarse que en individuos normales, la falla para producir autoanticuerpos contra antgenos propios puede deberse a delecin o anergia de LT colaboradores y no a tolerancia de linfocitos B. En estos casos, defectos en la mantencin de tolerancia del LT puede resultar en produccin de autoanticuerpos. Este mecanismo sera importante en la patogenia de varias enfermedades mediadas por anticuerpos, como por ejemplo: miastenia gravis o enfermedad de Graves. Los antgenos propios pueden considerarse como antgenos T dependiente. Considerando a los antgenos T dependientes como conjuntos hapteno-portador y que los linfocitos B reconocen a la parte haptnica, mientras que los linfocitos T cooperadores reconocen al portador, la ruptura de la autotolerancia puede deberse a diferentes mecanismos: a) Mecanismo de "bypass" de las clulas T colaboradoras tolerantes para el portador de los autoantgenos. Esta situacin puede alcanzarse a travs de varias vas: Reaccin cruzada de una sustancia extraa con un antgeno propio de forma que el hapteno de sta y el del extrao se parezcan, siendo reconocido por los linfocitos B dirigidos contra el antgeno propio, mientras el portador del antgeno extrao ser reconocido por otros linfocitos T cooperadores no tolerados, que se activarn y ayudarn a los B a producir anticuerpos contra el antgeno propio. Drogas o frmacos se podran unir a la parte portador de un antgeno propio, formndose un neo-antgeno que ser reconocido por clulas T colaboradoras que ayudarn a las clulas B especficas para el hapteno del antgeno propio a producir anticuerpos contra ste, llegndose a una situacin similar a la anterior. Una droga o un virus, se podran unir a la molcula presente en la membrana de una clula, si sta posee molculas clase II lo presentar a los linfocitos T colaboradores y stos ayudarn a linfocitos B especficos para un autoantgeno (presente en la membrana de esta clula) a producir autoanticuerpos contra el mismo.

determinado patgeno, dando lugar a una fuerte respuesta de anticuerpos cuyo idiotipo estimule la produccin de anti-idiotipos que tengan reaccin cruzada con autoantgenos. c) Activacin de las clulas B mediante ciertas sustancias, activadores policlonales de clulas B, capaces de activar inespecficamente a los linfocitos B sin necesidad de colaboracin de los linfocitos T. En estos casos se producira una respuesta pluriespecfica dirigida contra muchas sustancias, entre las cuales se encontraran las propias. Los lipopolisacridos y endotoxinas se encuentran entre los activadores policlonales de clulas B ms importantes. d) Induccin de respuestas autoinmunitarias es especialmente aplicable a las endocrinopatas. Segn esta hiptesis los linfocitos T helper no se habran hecho tolerantes frente a estructuras muy concretas y selectivas de ciertas clulas, como por ejemplo protenas y receptores presentes en la membrana, y el hecho de que normalmente no existiera una respuesta de anticuerpos sera debido a que estas clulas no expresan molculas clase II, por lo tanto, los linfocitos T colaboradores no pueden reconocer a estas estructuras, no ayudando as a los linfocitos B a producir anticuerpos contra ellas. Si estas estructuras en un momento dado expresan molculas clase II, entonces podran presentar adecuadamente estos antgenos de la membrana a los linfocitos T colaboradores que ayudaran a los linfocitos B a producir anticuerpos. La expresin ectpica de las molculas clase II en clulas que normalmente no la expresan puede ser inducida por linfoquinas como los interferones (IFNs) y factor de necrosis tumoral (TNF). Es probable que ello no sea una condicin suficiente, ya que se ha visto expresin ectpica de molculas clase II, sin que exista una respuesta autoinmunitaria contra ellas, probablemente sea adems necesario que los autoantgenos DR (o molculas clase II) sean de un determinado tipo.

6. CITOQUINAS Y ENFERMEDADES AUTOINMUNES Las citoquinas son mediadores proteicos involucrados en virtualmente, todos los procesos biolgicos: inmunidad, inflamacin, diferenciacin y proliferacin celular. Debido a su importancia en inmunidad e inflamacin no es sorprendente que estn involucrados en las enfermedades

b) Estimulacin persistente del husped por un

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autoinmunes. En el mecanismo de produccin de las enfermedades autoinmunes se pueden distinguir 3 compartimientos: un aspecto inicial de induccin, la patognesis y perpetuacin (figura 23-2).

de que el TNF es la citoquina central de la artritis reumatoidea. Estos hallazgos sugieren que las reacciones Th1 predominan en la sinovitis reumatoidea, lo cual apoyara el concepto de un

Figura 23-2. Mecanismos de produccin de las enfermedades autoinmunes.

En relacin al rol de las citoquinas en la induccin de enfermedades autoinmunes, las molculas mas ntimamente involucradas son los IFN. Entre los interferones destaca el IFN, el cual regula la presentacin antignica y la expresin de HLA clase II, caractersticas necesarias para la induccin inmune. Ensayos teraputicos con IFN alfa en pacientes con cncer, mostraron que la infusin de altas dosis de IFN induce tiroiditis autoinmune. Resultados similares han sido reportados para la infusin de IL-2, pero con una menor frecuencia. Un segundo aspecto en el cual las citoquinas son de importancia en las enfermedades autoinmunes, es en la fase efectora de la enfermedad. En lquido sinovial de pacientes con artritis reumatoidea se han encontrado prcticamente todas las citoquinas (TNF, IL-1, IL-6, IL-8, GMCSF y TGF-) lo cual no es sorprendente dado que el tejido consiste en clulas T activadas, macrfagos, fibroblastos y endotelio. Sin embargo, al estudiar la regulacin de la produccin de citoquinas en las clulas sinoviales se observ que el TNF- alfa era la seal regulatoria principal de IL-1 a nivel articular, llevando al concepto actual

desbalance entre las clulas Th1 y Th2 , y puesto que las citoquinas Th2 ejercen un efecto anti-inflamatorio La predominancia de las clulas Th1 podra indicar su importancia pro-inflamatoria. Todas estas investigaciones han permitido disear estrategias teraputicas dirigidas contra citoquinas pro-inflamatorias (IL-1 y TNF-) utilizando anticuerpos monoclonales.

7. NUEVOS TRATAMIENTOS Como regla general el tratamiento de las enfermedades autoinmunes est enfocado hacia dos objetivos, el primero es restablecer la funcin perdida, como por ejemplo la tiroiditis crnica con la administracin de hormona tiroidea. El segundo objetivo de la terapia es disminuir la respuesta autoinmune patolgica con el fin de deprimir la respuesta inmune en general, es as como se emplean antimetabolitos, corticoesteroides y drogas anti-inflamatorias las cuales son tiles en desrdenes complejos, como LES y otras enfermedades del tejido conectivo. Sin embargo esta terapia presenta efectos co-

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laterales y el riesgo de efectuar una inmunosupresin excesiva. Basado en los mecanismos descritos, nuevos mtodos de terapia ms especficos pueden esperarse en el futuro. Vacunas de clulas T. Experimentos en animales sugieren que clones inactivados de clulas T autorreactivas pudieran ser utilizadas como "vacunas" preventivas administrndolas al animal antes de que se genere una respuesta autoinmune. Bloqueo de las molculas MHC. Por otra parte la activacin de la clula T puede ser prevenida bloqueando la unin del pptido autorreactivo a la molcula MHC de la clula presentadora de antgeno. Pptidos competitivos que unen el MHC pero fracasan en gatillar la proliferacin de clulas T previniendo la respuesta inmune especfica. Bloqueo coestimulatorio. Con el fin de efectuar la activacin, la clula T no slo debe reconocer su determinante antignico correspondiente a travs de su TCR, sino que tambin debe recibir seales estimulatorias a travs de co-receptores o mediadores solubles. Si las seales coestimulatorias no son recibidas, la clula T se hace inactiva o anrgica. Es as como el bloqueo de seales co-estimulatorias parece otra alternativa para obviar la respuesta autoinmune. Cambio en balance Th1-Th2. Una cuarta posibilidad de tratar enfermedades autoinmunes, es cambiar el balance de clulas Th1 y Th2. La administracin de citoquinas particulares o inhibidores de citoquinas tendran este efecto. Tolerancia oral. Los antgenos administrados oralmente pueden inducir un estado de no respuesta. La induccin de tolerancia oral est bajo investigacin clnica para el tratamiento de varias enfermedades incluyendo la esclerosis mltiple, artritis reumatoide, diabetes mellitus y uveitis. Terapia gnica. Actualmente se estn diseando estrategias de tratamiento en que se utiliza terapia gnica. Cada uno de los enfoques teraputicos descritos tiene ventajas y desventajas. El objetivo final a largo plazo es suprimir la respuesta autoinmune patognica sin disminuir la inmunidad protectora contra patgenos.

LECTURAS SUGERIDAS Abbas A., Cellular and Molecular Immunology, 4ta Edicin, Captulo 10, pp. 208-230; Captulo18, pp. 416-423, WB Saunders, , 2000. Janeway, Ch., Travers, P., Walport, M., Immunobiology The Immune System in Health and Disease, 4ta Edicin, Captulo 6, pp. 209-211, Captulo 7, pp. 228-234; Captulo 13, pp. 520-536, 1999. Rose, N., Autoimmune Diseases: Tracing the Shared Threads. Hospital Practice, Abril 15: pp. 147-154, 1997. Theofilopoulos, A, The basis of autoimmunity: Part I, Immunology Today, 16(2): 90-97, 1995. Theofilopoulos, A., The basis of autoimmunity: Part II, Immunology Today, 16(3): 150-57, 1995.

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Captulo 24
ENFERMEDADES REUMTICAS
Sergio Jacobelli G. y Santiago Rivero D.

1. Introduccin 2. Artritis Reumatodea 2.1. Patogenia 2.1.1. Gentica 2.1.2. Infecciones 2.1.3. Autoinmunidad 2.2. Clnica y tratamiento 3. Lupus eritematoso sistmico 3.1. Etiopatogenia 3.1.1. Factores genticos 3.1.2. Factores ambientales 3.1.3. Disregulacin del sistema inmune 3.2. Clnica y tratamiento

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RESUMEN En los ltimos aos se han registrado importantes avances en la comprensin de la respuesta inmune y de algunos mecanismos operacionales en la autoinmunidad. Esto ha sido especialmente relevante en la relacin entre inflamacin y respuesta inmune. En efecto, la descripcin de las redes de citoquinas involucradas en la respuesta inmune, ha permitido disear ahora, tratamientos altamente especficos para la Artritis Reumatodea con resultados sorprendentes y alentadores para muchos enfermos. Sin embargo, estos tratamientos slo detienen la enfermedad, la que reaparece al suspenderlos. Tanto para el Lupus como para la Artritis, necesitamos an otro nivel de comprensin, que nos indique los antgenos iniciales y los mecanismos de control sobre los que pudiramos actuar para prevenir el dao tisular y el desarrollo de la enfermedad.

1. INTRODUCCIN La autoinmunidad sistmica se refiere a enfermedades autoinmunes en las cuales la autorreactividad, no est circunscrita a un slo rgano o tejido. Esta definicin incluye enfermedades como la Artritis Reumatodea y el Lupus Eritematoso Sistmico. Sin embargo no es fcil presentar una definicin satisfactoria, porque la demostracin que la causa de la enfermedad es autoinmune es difcil, ya que requiere la replicacin de la enfermedad por transferencia de anticuerpos o clulas, datos que son difciles de generar. De este modo, la inferencia que una enfermedad es autoinmune, se hace por el hallazgo de autoanticuerpos, complemento y linfocitos T en las lesiones tisulares. Estas enfermedades tienen algunas caractersticas comunes, que de algn modo tendrn que ser explicadas al dilucidar su patogenia. La primera, es su curso tan variable entre uno y otro enfermo, marcado por exacerbaciones y remisiones, a veces sin mediar tratamiento. Esto podra implicar potentes mecanismos de control para regular la respuesta autoinmune. La segunda es la susceptibilidad aumentada del sexo femenino, hecho que se observa an en los modelos animales experimentales. La influencia hormonal en la respuesta inmune no est suficientemente aclarada. Una tercera caracterstica sorprendente, es la presentacin ocasional de la sobreposicin de manifestaciones clnicas de varias enfermedades autoinmunes en

un slo enfermo, lo que no tiene una explicacin adecuada. En general estos enfermos, a pesar de tener un aumento en la produccin de autoanticuerpos, no responden tan normalmente a antgenos exgenos, de ah que los pacientes con Lupus y con Artritis Reumatodea, sufren con mayor frecuencia de infecciones que los controles, lo que se acenta con los tratamientos que reciben. La infeccin por inmunosupresin teraputica es un lamentable efecto secundario de los tratamientos ms comunmente usados en estas afecciones.

2. ARTRITIS REUMATODEA La Artritis Reumatodea (AR) es una enfermedad crnica, sistmica, cuya expresin clnica ms importante es articular, lo que lleva a grados variables de invalidez. Es la forma ms comn de artropata inflamatoria, con una prevalencia estimada en Chile de 0,5% de la poblacin adulta, afectando ms frecuentemente a mujeres, con una proporcin estimada de 3 a 4 es a 1. Desde el punto de vista patolgico, el sitio primario de activacin inmune est en la articulacin. Los aspectos ms caractersticos son la infiltracin celular de la membrana sinovial con mononucleares, especialmente linfocitos T y macrfagos y la hiperplasia de las clulas de la ntima de la membrana sinovial. Aunque la etiologa de la AR es an desconocida, parece cada vez ms evidente que su

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patogenia se caracteriza por la accin concertada de distintos tipos celulares, que a travs de diferentes cascadas de seales, interactan entre s y finalmente llevan a la destruccin de la articulacin. Si bien se considera a la AR una enfermedad articular, es importante sealar que tambin tiene una gran cantidad de manifestaciones extraarticulares, lo que pone de manifiesto su carcter sistmico capaz de producir dao en distintos rganos mayores. En realidad, uno de los misterios de esta enfermedad, es por qu la membrana sinovial es el principal rgano blanco. Parece clave para entender estos hechos, la comprensin del artrotropismo de los antgenos y de las clulas inflamatorias y el papel que juegan receptores especficos y gradientes quimiotcticas para localizar la inflamacin en la articulacin. La idea que la AR es un proceso multifactorial que requiere una combinacin de factores genticos, ambientales e inmunolgicos, ha ido adquiriendo mayor aceptacin, aunque el conocimiento de la forma cmo estos factores se relacionan es an incompleto. 2.1. Patogenia 2.1.1. Gentica La existencia de una predisposicin gentica a la AR deriva, fundamentalmente, de la alta concordancia que se observa en gemelos univitelinos. La prevalencia de esta enfermedad es de alrededor de 0,5-1% en la poblacin general, siendo menor en algunas (0,1-0,3% en poblaciones china y africana) y mayor en otras (5% en indios Pima en Estados Unidos). En gemelos univitelinos estudiados en consultorios de la especialidad, la concordancia es de 30-50%, la que baja a 12% si se estudian enfermos en la comunidad, no en ambiente hospitalario. En gemelos bivitelinos, la concordancia es de 2-5%, similar a la de los parientes de primer grado. Se ha estimado que alrededor de la mitad de la predisposicin gentica reside en el Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC), estando el resto en otros loci que actualmente estn siendo activamente investigados. Varios productos proteicos codificados por los genes del MHC son responsables de la presentacin de pptidos antignicos a los linfocitos T (LT). En la dcada de los setenta, se describi la asociacin del HLA DR4 con la AR. En enfermos caucsicos con AR seropositiva se encontr que el 60-70% eran HLA DR4 positivos comparado con el 30%

de los controles. La descripcin de subtipos de DR4 permiti plantear una hiptesis general sobre esta asociacin. Los genes DRB1*0401, DRB1*0404 y DRB1*0405 codifican los subtipos DR4 Dw4, Dw14 y Dw15 respectivamente, que se asocian con AR en poblaciones caucsica y japonesa, en tanto que en ciertas poblaciones nativas norteamericanas y en israeles, la asociacin se encontr con genes que codificaban HLA que no eran DR4 sino DR6 (DRB1*1402) o DR1 (DRB1*0101) Nomenclatura HLA, ver captulo 41. Al conocerse la secuencia de aminocidos (aa) y la estructura tridimensional de las molculas del MHC, se pudo precisar que cada alelo DRB1 asociado con susceptibilidad a la AR porta la secuencia QKRAA o QRRAA del aminocido 69 a 74 de la cadena DR, en tanto que los alelos DR que no se asocian a la enfermedad tienen secuencias diferentes en esta regin. (Q, glutamina; K, lisina; R, arginina; A, alanina). Esta secuencia de 5 aa se ha denominado el "eptopo compartido"(EC), destacando que la susceptibilidad para la AR estara conferida por una pequea "casete" de aa que se encuentran en distintos DR y no slo en el DR4. Al considerar este eptopo, algunos estudios lo encuentran en hasta el 96% de los pacientes en algunas poblaciones, pero esto no es tan notorio en otras, como griegos, pakistanes y poblacin negra en Estados Unidos. En Chile un estudio encontr una prevalencia de este eptopo en 56% de los enfermos comparado con 34% en los controles. En los ltimos aos ha comenzado a ser evidente que el EC podra ser ms un marcador de gravedad de la enfermedad que de susceptibilidad. Un estudio demostr que los ndulos reumatodeos, signo de gravedad, se presentaron en el 100% de los pacientes que eran homocigotos para el EC, en tanto que los enfermos que slo tenan un alelo que codificaba para el EC tenan ndulos en el 59%. Al mismo tiempo, los enfermos que tenan doble dosis tenan compromiso de rganos mayores en el 61% comparado con 11% de los enfermos con un slo alelo. Estudios chilenos tambin han encontrado una asociacin entre la aparicin de erosiones seas y la presencia del EC, especialmente en doble dosis. Estos datos sugieren que hay una relacin "dosis-efecto" de los genes MHC, lo que implicara que la mayor contribucin de los genes del MHC a la AR es en la gravedad y no en la susceptibilidad. Esto no es aceptado universalmente, porque resultados de otros estudios

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similares no han sido concluyentes, lo que se ha atribuido a la inclusin de enfermos con AR leve o transitoria y a variaciones relacionadas con el trasfondo tnico y racial. Es un hecho conocido que en las mujeres con AR que tienen un embarazo en el curso de su enfermedad, su artritis entra en remisin en alrededor del 70% de los casos. Trabajos recientes han descrito que a mayor disparidad materno-fetal de los alelos de clase II, DR y DQ, mayores son las posibilidades de remisin, en tanto que la persistencia de la actividad artrtica a pesar del embarazo, se asoci con mayor identidad materno-fetal en estos alelos. Esto sugiere que la mejora de la AR que experimentan las mujeres con el embarazo se debe a fenmenos inmunolgicos especficos y no a una supresin inmunolgica general del embarazo. Hay una variedad de genes que se ubican en el sitio del MHC, pero que no estn directamente involucrados en la presentacin de antgenos. Estos genes que no son clase I ni clase II codifican un grupo heterogneo de protenas que se llaman colectivamente MHC clase III. Polimorfismo asociado con el gen del factor de necrosis tumoral (TNF), con la protena de "shock" trmico 70 y con el componente C4 del sistema del complemento, se han relacionado con la susceptibilidad a la AR. Otros genes fuera del MHC han presentado cierto grado de asociacin con la AR, como alotipos especficos de IgG y el gen del receptor de la quimioquina CCR5. Recientemente ha habido un gran inters en la relacin entre la AR y las alteraciones en el gen que codifica la lectina que une a la manosa (MBL). En la actualidad debe considerarse como preliminares todas las asociaciones genticas con la AR con excepcin de la de los genes del MHC clase II.

2.1.2. Infecciones A pesar de los grandes esfuerzos realizados, no existe an evidencia convincente que demuestre una etiologa infecciosa de la AR. Como el inicio de la AR no se agrupa en tiempo ni espacio, se ha planteado que un microorganismo ubicuo, posiblemente no patognico, pudiera gatillar la AR en una persona con el apropiado trasfondo gentico. Por otro lado, es posible que si existiera una infeccin, sta pudiera agruparse en tiempo y espacio, pero no ser detectable por ser subclnica requiriendo perodos variables de latencia antes de la aparicin de la inflamacin articular. La idea prevalente es que la infeccin, si es importante en la AR, no necesariamente debe estar presente en las articulaciones, sino que puede ser un fenmeno inicial, que desencadena un proceso patolgico, en un ambiente gentico apropiado. Modelos animales de artritis han sugerido la posibilidad que agentes bacterianos tengan un papel en la etiologa o en la patogenia de esta enfermedad, aunque esto no ha podido ser comprobado fehacientemente en la enfermedad humana. El virus Epstein-Barr ha recibido especial atencin, por ser un activador policlonal de linfocitos B, por estar presente con mayor frecuencia en enfermos con AR que en controles y por la homologa de secuencias entre el EC y la glicoprotena Gp110 de este virus. Sin embargo, los datos de prevalencia son circunstanciales y la Gp110 es una de muchas xenoprotenas que contiene la secuencia QKRAA. As por ejemplo, la protena dnaj de la E. Coli, que es una protena bacteriana de shock trmico, tambin tiene esta secuencia y pudiera representar una unin potencial entre las bacterias intestinales y la artritis crnica.

Tabla 24-1. Posibles causas infecciosas de la artritis reumatodea Potencial Agente Infeccioso Mecanismo patognico

Micoplasma Parvovirus B19 Retrovirus Bacterias entricas Mycobacterias Virus Epstein-Barr Membrana celular bacteriana

Infeccin sinovial directa; superantgenos Infeccin sinovial directa Infeccin sinovial directa Imitacin molecular (QKRAA) Imitacin molecular (QKRAA) Imitacin molecular (QKRAA) Activacin de macrfagos

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La hiptesis que una o ms infecciones virales pueda servir de agente gatillante de la AR en un husped susceptible es atractiva. Se ha planteado que esta infeccin debera ser con un agente similar a los lentivirus, los cuales tienen una expresin restringida dentro de las clulas y pueden permanecer ocultos a los mecanismos de defensa del husped. 2.1.3. Autoinmunidad a) Autoanticuerpos En la membrana sinovial de la AR crnica, la infiltracin de linfocitos de predominio clulas T CD4 (CD45RO positivo) puede organizarse como un ndulo linftico y se distribuye perivascular, en tanto que los escasos linfocitos B estn en el centro de este cuerpo linfoide y las clulas plasmticas migran fuera de l al diferenciarse. De este modo, el tejido sinovial es un rgano productor de anticuerpos en AR. En la tabla 24-2 se indican los diferentes tipos de autoanticuerpos encontrados en la AR.

magnitud mayor que la del FR que se ve en la enfermedad de Waldenstrm o en la crioglobulinemia y (f) La evidencia disponible seala que el FR representa una va importante para la amplificacin de la enfermedad articular y para el desarrollo de complicaciones extra-articulares. Los anticuerpos anticolgeno II (natural y denaturalizado), tienen un indudable inters potencial a juzgar por los datos obtenidos en modelos animales de artritis. La mayora de los datos en humanos son consistentes con la hiptesis que la AR no es producida por el desarrollo de estos anticuerpos, sino que la respuesta inflamatoria es amplificada por ellos. La calpastatina es un inhibidor natural de las calpainas, que son un subgrupo de cistenasproteasas. Anticuerpos anticalpastatina se encuentra en un 50% de los enfermos con AR, lo que ha hecho plantear que la neutralizacin de este inhibidor podra promover la sobreactivacin de estas proteasas en el tejido sinovial. Los anticuerpos antinucleares, los anticitoplasma de neutrfilos y los anticardiolipinas, no parecen tener un papel en la patogenia. b) Inmunidad Celular Habitualmente se ha considerado que los linfocitos T CD4+ son cruciales en la patogenia de la AR, considerando para ello la masiva infiltracin de stos en la membrana sinovial. En la tabla 24-3 se presentan algunas evidencias que refuerzan esta hiptesis. Tabla 24-3. Evidencias a favor del papel de los Linfocitos T en la AR LT y CPA estn presentes en gran cantidad en la membrana sinovial. LT sinoviales expresan marcadores de activacin y de memoria. Parece existir cierto grado de oligoclonalidad en los linfocitos T sinoviales. Las citoquinas T, IFN- y la IL-17 presentes en la articulacin reumatodea, son mediadores de efectos biolgicos relacionados con la inflamacin y el dao articular. Citoquinas que promueven la activacin T y la diferenciacin Th1, como la IL-12 y la IL15 estn en la articulacin en concentraciones significativas.

Tabla 24-2. Autoanticuerpos en Artritis Reumatodea ______________________________________________ Factor Reumatodeo Antinucleares Anticolgeno tipo II Anticolgeno tipo IX Anticardiolipina Anticitoplasma de neutrfilos Antikeratina Antifactor perinuclear Anticalpastatina ____________________________________________ Los Factores Reumatodeos (FR) son autoanticuerpos que reconocen la regin Fc de la IgG. El descubrimiento del FR ha sido un hito en el desarrollo de conceptos de autoinmunidad, aunque su papel en la patogenia de la AR es slo parcialmente comprendido. Algunos datos avalan su importancia en esta enfermedad: (a) La mayora de los enfermos con AR tienen ttulos elevados de FR. (b) Los ttulos altos de FR correlacionan con enfermedad ms grave. (c) La produccin de FR es abundante en la membrana sinovial y muestra evidencias de maduracin de afinidad dirigida por antgeno. (d) El FR puede aumentar la formacin de complejos inmunes. (e) La avidez del FR de la AR por la regin Fc de la IgG es varias rdenes de

LT, linfocitos T; CPA, clulas presentadoras de antgeno

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Por otro lado, los tratamientos dirigidos a disminuir la cantidad de LT, no siempre han sido exitosos, aunque hay que destacar que la linfopenia en sangre perifrica no siempre se correlaciona con la realidad en la articulacin. Los LT sinoviales son en su mayora de memoria (CD45RO+) que expresan un fenotipo curioso con marcadores de actividad tarda y reciente como por ejemplo, HLA clase II y CD69 y muy poca expresin de CD25 (receptor de IL-2) que aparece en forma intermedia en la activacin. Las clulas T tambin expresan molculas coestimuladoras que reciben y transducen seales durante la activacin, tales como, CD28, CD2, LFA-1, CD6, CD60 y CD40. Por lo tanto, los LT no slo son abundantes en la sinovial, sino que tambin expresan estructuras de superficie que facilitan las interacciones con ligandos en las CPA adyacentes. Persisten sin embargo, algunas observaciones que no aclaran el papel de los LT. As por ejemplo, no se ha podido demostrar que exista un autoantgeno especfico, al cual respondan los linfocitos T, capaz de gatillar o perpetuar la AR. Esto es, no se ha podido demostrar que la AR sea una enfermedad autoinmune en su origen. Adems, las citoquinas derivadas de LT son menos abundantes en la sinovial, que las producidas por otras clulas y las erosiones que aparecen en el curso de la enfermedad no siempre se correlacionan con el grado de inflamacin clnica observable en los pacientes. Aunque la importancia relativa de distintos blancos antignicos para las clulas T an no es clara, se han hecho esfuerzos grandes para identificar clones de linfocitos patognicos. Las diferencias en expansiones clonales encontradas en distintos enfermos, sugieren que la inflamacin en curso puede reflejar respuestas a una diversidad de antgenos propios o extraos, que son procesados y presentados a los LT sinoviales por cualquiera de las diferentes CPA en la membrana sinovial. La asociacin del eptopo compartido con la AR, hizo pensar en el papel crucial de los LT en la patogenia, sin embargo no es claro el mecanismo de esta asociacin que puede representar entre otras posibilidades, seleccin tmica particular, reactividad cruzada, desequilibrio de unin con otros genes o alteraciones en la transduccin de seales. Recientes publicaciones han sealado la existencia de una probable alteracin en la homeostasis de la respuesta inmune en esta enfermedad.

Citoquinas en AR. Muchas citoquinas se han detectado en la membrana sinovial y en el lquido sinovial de enfermos con AR, algunas de ellas en concentraciones muy elevadas. La sorprendente respuesta obtenida con tratamientos dirigidos a prevenir el efecto de algunas de ellas, ha reforzado la idea del papel preponderante de las citoquinas en la inflamacin y destruccin articular. En general se ha considerado la AR como una enfermedad Th1 cuya funcin se asocia con hipersensibilidad retardada y con respuestas celulares T citotxicas. Los niveles de IFN- en la articulacin, son sin embargo muy bajos, aunque los efectos atribuidos por lo menos en parte a esta citoquina, como la fuerte expresin de molculas MHC en una variedad de tipos celulares, es evidente. Tambin se encuentra IL-12, que favorece la activacin hacia Th1. La IL-15 y la IL-18, fcilmente detectables en la sinovial reumatodea, actan probablemente en forma sinrgica con la IL-12 en promover la diferenciacin hacia Th1. La IL-2 es apenas detectable y muy pocas clulas expresan el receptor de alta afinidad para esta citoquina. Especialmente interesantes son el TNF y la IL-1, ambas producidas por macrfagosmonocitos aunque tambin pueden ser sintetizadas por clulas T activadas. Estas citoquinas son muy abundantes en la sinovial lo que unido a su potente actividad biolgica proinflamatoria, las ubica en un papel central en la patogenia de la inflamacin y destruccin articular. La reciente introduccin de tratamiento dirigido a bloquear la accin de estas citoquinas, ha sido un avance importante en el tratamiento de esta enfermedad. Tambin estn presentes en la sinovial, inhibidores o antagonistas fisiolgicos de citoquinas y de metaloproteinasas, sin embargo su concentracin es inferior a lo que se requiere para abrogar la respuesta inflamatoria. c) Interacciones intercelulares La unin de leucocitos circulantes al endotelio activado, va molculas de adhesin, es un requisito indispensable para el desarrollo de una inflamacin crnica. La combinacin de selectinas, integrinas y quimioquinas puede crear un ambiente nico en la sinovial inflamada para atraer una gran diversidad de poblacin leucocitaria. La respuesta de los LT son gatilladas por la interaccin con las CPA (clulas dendrticas, macrfagos y LB). As por ejemplo, clulas dendrticas activadas estn presentes en la mem-

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brana y en el lquido sinovial y se puede observar al microscopio, que interactan con "nidos" de linfocitos. Recientemente se ha encontrado que los LT tambin interactan con fibroblastos sinoviales. La relacin de los macrfagos con los fibroblastos se realiza, principalmente, a travs de citoquinas, pero es posible pensar que tambin hay interaccin intercelular. Por otro lado, los fibroblastos entregan seales a los LB que previenen su apoptosis. Esta variada interaccin celular y la red de citoquinas presente, pudiera explicar el patrn inhabitual de diferenciacin celular que se encuentra en la sinovial reumatodea. En este sentido es notable el fenotipo nico que exiben los fibroblastos reumatodeos, con caractersticas de clulas transformadas, de crecimiento agresivo, que invaden tejidos vecinos y que acumulan mutaciones de genes que suprimen tumores como el p53. La dilucidacin de si estas anomalas son enteramente secundarias a la inflamacin crnica o si reflejan acontecimientos primarios relacionados con la etiologa de la enfermedad es un objetivo actual central en la investigacin sobre esta enfermedad. 2.2. Clnica y tratamiento Clnicamente la AR se manifiesta con mayor frecuencia, como una artritis de comienzo insidioso que afecta especialmente las articulaciones de las manos y muecas y que progresivamente va comprometiendo otras articulaciones. Ms raramente, el comienzo puede ser como artritis aguda poliarticular. Finalmente tambin se encuentra un comienzo intermedio entre estas dos formas. El tratamiento de esta enfermedad ha ido cambiando conceptualmente con el tiempo. De una etapa que consider a la AR como una enfermedad relativamente benigna, en la cual haba que tratar de usar slo antiinflamatorios no esteroidales y slo ms adelante drogas que pudieran detener el curso de la enfermedad, a otra etapa, a partir de los setenta, en que los mdicos conscientes de los estudios epidemiolgicos que comenzaban a sealar el curso devastador que puede tener, comenzaron a aconsejar la introduccin precoz de drogas potentes con el fin de detener el curso de la enfermedad, antes que aparecieran erosiones articulares. En la actualidad el uso de inmunosupresores, como el Metotrexato es usual en los primeros meses de hecho el diagnstico. La reciente incorporacin de medicamentos ahora generados a travs de ingeniera gentica, capaces de blo-

quear citoquinas especficas, abren un camino novedoso y aparentemente muy eficaz para controlar las manifestaciones de esta devastadora enfermedad.

3. LUPUS ERITEMATOSO SISTMICO El Lupus Eritematoso Sistmico (LES) es una enfermedad inflamatoria, de tipo autoinmune, de causa desconocida y que afecta con mayor frecuencia a las mujeres (relacin 9:1). 3.1. Patogenia En el LES el dao inflamatorio celular o tisular, est mediado por mecanismos inmunolgicos, especialmente por autoanticuerpos y complejos inmunes, dirigidos contra antgenos propios. Parece claro que el LES es una enfermedad multifactorial por lo que se deben considerar diversos aspectos en su etiopatogenia. Los factores principales que interactan desarrollando la enfermedad, pueden agruparse en: Factores genticos, Factores ambientales, Disregulacin del sistema inmune e Inflamacin y dao celular/ tisular crnico (tabla 24-3).

Tabla 24-4. Principales factores que participan en la patagonia del LES Factores genticos - Antecedentes familiares - Marcadores genticos - Expresin clnica y marcadores genticos Factores ambientales - Drogas - Luz ultravioleta - Infecciones Disregulacin del sistema inmune - Prdida de la tolerancia - Aumento en la expresin de autoantgenos - Alteraciones funcionales linfocitarias - Desbalance de citoquinas - Hormonas sexuales y eje neurohipotlamo hipofisiario Inflamacin y dao celular/tisular

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3.1.1. Factores genticos La susceptibilidad gentica en el LES, parece indiscutible. Apoyan su papel preponderante varias observaciones bien conocidas y demostradas. a) Estudios familiares. Los gemelos monocigotos tienen un alto grado de concordancia para la enfermedad (14-57%) y los parientes de pacientes con LES llegan a presentarla en un 5-12%. b) Marcadores genticos. Los pacientes con LES tienen mayor frecuencia de ciertos marcadores genticos especficos, comparados con la poblacin general. stos incluyen fenotipo HLA clase I (B-8) y clase II (DR-2, DR-3, DQW1). Las deficiencias genticas de alguno de los componentes del sistema del complemento (C1, C2 y C4) se asocian fuertemente al desarrollo LES. Tambin se han descrito trastornos genticos para el receptor Fc, para el receptor de C1 y para genes promotores de distintas citoquinas (IL-1, IL-10). Algunos modelos animales han demostrado gran importancia de trastornos de la apoptosis celular inducida por genes ( FAS-L, ligando de FAS), y es probable que este trastorno intervenga tambin en el LES humano. c) Expresin clnica y marcadores genticos. Ciertos genes tipo HLA clase II se asocian con la produccin de autoanticuerpos definidos que pueden influir en ciertas manifestaciones clnicas especficas: DR3, DR2 y DQ a Ac anti-DNA, DR7 a Ac-anti Sm, DR2 a Ac anti-P ribosomal, DR3 a Ac anti-Ro (SSA), DR4 y DR2 a Ac Anti-U1-RNP, y los Ac antifosfolpidos a DR4, DR7 y DR53. Aunque el papel de la predisposicin gentica al desarrollo de esta enfermedad, parece importante y bien demostrado, se estima que el factor gentico como nica causa de LES no sera posible, y necesita de la interaccin de otros factores que sern comentados. Est bien establecido que su influencia sera multigentica, y se ha calculado que entre 4 a 8 genes estaran comprometidos en la predisposicin gentica. 3.1.2. Factores ambientales. Su importancia en el desarrollo del LES no ha sido an bien determinada, pero se estima que actuaran como desencadenantes de la enfermedad en aquellos sujetos genticamente susceptibles. Se han descrito diversos factores ambientales importantes:

a) Drogas. Numerosas drogas y medicamentos pueden inducir el desarrollo de autoanticuerpos, algunos con capacidad patognica, determinando un cuadro clnico de LES inducidos por drogas. Generalmente ste se manifiesta en pacientes que son genticamente acetiladores lentos (condicin que favorece el aumento de molculas relacionadas a la respuesta inmune). b) Luz ultravioleta (LUV). La LUV produce distintas alteraciones inmunolgicas en la piel, que pueden favorecer o reactivar el LES. Altera la expresin de autoantgenos en los keratinocitos y los estimula a producir citoquinas inductoras de la produccin de autoanticuerpos por linfocitos B (IL-3, IL-6, GM-CSF, TNF). Activa a los macrfagos en el procesamiento de autoantgenos. Favorece el depsito de autoanticuerpos en la membrana basal dermoepidrmica, por alteracin de su estructura. c) Infecciones. Los microorganismos pueden activar el LES a travs de infecciones. Es bien conocida la capacidad de producir anticuerpos de reactividad cruzada con autoantgenos, que tengan similitud estructural con antgenos microbianos. Tambin, especialmente las bacterias producen superantgenos que pueden estimular en forma inespecfica a clones de linfocitos T y/o B autorreactivos, induciendo de esta forma respuestas autoinmunes. 3.1.3. Disregulacin del sistema inmune. Constituye el factor crucial en el desarrollo del LES. Esta alteracin permite el desconocimiento de los antgenos propios (prdida de la tolerancia) y la produccin de una respuesta inmune humoral y celular dirigida contra stos, capaz de producir un dao patognico sobre clulas y/o tejidos que pueden manifestarse clnicamente como una enfermedad potencialmente fatal. Se han reportado numerosas alteraciones inmunolgicas en pacientes con LES, que podran agruparse en distintos aspectos. a) Prdida de la tolerancia. Constitiuye el defecto ms significativo en la patogenia del LES, y permite el desarrollo de una respuesta inmune contra distintos antgenos propios. Como se sabe, el timo a travs de un proceso de seleccin, elimina o inactiva a aquellos clones capaces de reaccionar contra antgenos propios (Seleccin tmica negativa o Tolerancia central; ver captulo 13). En

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los pacientes con LES se describen disfuncin tmica que rompe la tolerancia central, lo que permite la presencia de clones de linfocitos T autorreactivos, capaces de generar una respuesta autoinmune bajo estmulos adecuados. La tolerancia perifrica, que se realiza en el sistema inmune perifrico, tambin est alterada. Se describe dficit de linfocitos T supresores (CD8+) y activacin de clones autorreactivos perifricos de LT "helper" (LTh) (CD4+). Ambas situaciones favorecen el desarrollo de autoinmunidad patognica. Se describen trastornos de la tolerancia B con prolongacin de su vida media, tal vez por defectos en la apoptosis o deficiencias del complemento. b) Autoantgenos. La expresin de los autoantgenos en pacientes con LES, est aumentada, probablemente como expresin de apoptosis celular exagerada, que permite el desarrollo aumentado de nucleosomas, que resultan del plegamiento nuclear de la clula en apoptosis y que contienen una alta expresin de autoantgenos nucleares (protenas, histonas, DNA). Al respecto se han descrito alteraciones de genes de apoptosis en pacientes con LES y en modelos murinos. La generacin de nucleosomas podra inducir la respuesta autoinmune inicial en el LES, expresada en autoanticuerpos antinucleosomas. La interaccin de stos con los autoantgenos nucleares permitira la expresin de sectores antignicos que naturalmente no se expresan (antgenos crpticos) y que aparecen en esta situacin desencadenando respuestas autoinmunes sucesivas (expansin del repertorio autoinmune), responsable de la gran diversidad del autoanticuerpos antinucleares (por ejemplo antiDNA nativo, anti-U1-RNP, anti-Sm, anti-Ro (SSA), anti-La (SS-B). En ciertas circunstancias algunos autoantgenos podran ser inmunognicos, al ser procesados por clulas APC especiales, o en el contexto de distintas molculas de adhesin, que induzcan respuestas T B autoinmunes. c) Alteraciones funcionales linfocitarias. Se han descrito numerosas alteraciones inmunes en linfocitos T y B de pacientes con LES, sin embargo su papel en la patogenia de la enfermedad no se conoce. As, se ha reportado: (i) disminucin de linfocitos T citotxicos y T supresores (normalmente frenan la respuesta inmune), aumento LTh, (ii) activacin policlonal de LB en fases tem-

pranas de la enfermedad, (iii) disfuncin del sistema de seales entre clulas inmunes, que se manifiestan en aumento de respuestas del calcio, hiperfosforilacin de sustratos proteicos citoslicos y disminucin del factor nuclear kappa B, y (iv) dependencia de la produccin de citoquinas Th2 (favorecen la produccin de anticuerpos). El resultado final de stas y otras numerosas alteraciones funcionales linfocitarias, se traduce en la produccin descontrolada de una gran profusin y diversidad de autoanticuerpos, eje central de la patogenia del LES. d) Desbalance de citoquinas. Los pacientes de LES tienen en general un desbalance de citoquinas con aumento de aquellas proinflamatorias y disminucin de las inmunorreguladoras, creando el entorno favorable para el desarrollo de autoinmunidad. Se ha descrito aumento de IL-4, IL-6 e IL10; stas inducen a que las clulas B autorreactivas se activen, proliferen y se diferencien hacia clulas B que producen un exceso de autoanticuerpos contra muchos antgenos nucleares. No relacionados directamente a hiperreactividad B, los linfocitos T lpicos producen y responden menos a IL-2, producen menos IFN, IL-12, TGF, TNF e IL-1. Estos ltimos hallazgos no tienen an un rol patognico conocido. e) Hormonas sexuales y eje neurohipotlamo hipofisiario. Es un hecho bien conocido, e independiente del grupo tnico, que el LES afecta preferencialmente a mujeres jvenes, en periodo frtil, por lo que el papel de las hormonas femeninas en su patogenia, se ha planteado desde siempre. An hoy, no ha podido establecerse con certeza esta predileccin por el sexo femenino hormonalmente activo. Sin embargo, hay ciertos elementos de la influencia de las hormonas sexuales en el sistema inmune que se conocen. La administracin de estrgenos a mujeres postmenopusicas parece duplicar su riesgo a desarrollar LES. La hidroxilacin del estradiol en posicin C-16 es mayor en LES, tanto mujeres como hombres, lo que acarrea ms metabolitos estrognicos. Los estrgenos estimulan los timocitos, los linfocitos T CD8+ y CD4+, los linfocitos B, los macrfagos, la liberacin de ciertas citoquinas proinflamatorias, y la expresin de molculas HLA y de adhesin en clulas endoteliales. La suma de estos efectos favorece

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las respuestas autoinmunes de tipo humoral. Adems presenta un efecto favorecedor del cambio de clase, desde autoanticuerpos IgM a IgG; este ltimo isotipo presentara mayor poder patognico. Por otra parte se ha observado disminucin de andrgenos en mujeres con LES, y tambin inadecuada produccin de progesterona. Tambin se describe en casi todos los pacientes con LES disminucin en los niveles sricos de DHEA (Deshidroepiandrosterona) y de compuestos intermediarios de la sntesis de testosterona. En comparacin a los estrgenos, los andrgenos tienen un efecto inmunosupresor. La progesterona y la prolactina afectan tambin, al sistema inmune. La progesterona frena la proliferacin T y aumenta el nmero de CD8+, y la hiperprolactinemia se ha asociado a exacerbaciones del LES. Algunos estudios demuestran disregulacin del eje hipotlamo hipofisiario, con deficiente produccin de cortisona asociado a hiperproduccin de prolactina, estableciendo un balance favorable a una hiperreactividad inmune. 3.1.4. Inflamacin y dao celular/tisular La caracterstica inmune, ms destacada en el LES, es la gran profusin y diversidad de autoanticuerpos, los cuales inducen dao a travs de mecanismos directos de interaccin con su antgeno (alteraciones funcionales celulares), por activacin del sistema del complemento (citlisis) y por linfocitotoxicidad dependiente de anticuerpos. Sin embargo, el mecanismo clsico de dao tisular en pacientes con LES, lo constituye sin duda, la formacin de complejos autoinmunes y su depsito en la pared vascular (por ejemplo: glomerulonefritis lpica, o vasculitis por complejos DNA anti DNA). Algunas manifestaciones clnicas son tambin producto de dao inmune por inmunidad celular o LT sensibilizados (por ejemplo: nefritis intersticial). La generacin de un anticuerpo como efecto de una respuesta inmune induce la produccin de un segundo anticuerpo dirigido contra el idiotipo del anticuerpo inicial. Esta secuencia induce una red de idiotipo anti-idiotipo que tiene efectos inmunorreguladores sobre la respuesta inmune inicial (ver captulo 14). Esta red estara defectuosa en LES, favoreciendo el desarrollo de mltiples autoanticuerpos y tambin aumento en la activacin de LT CD4+.

Es importante destacar que adems de la produccin exagerada de complejos inmunes patognicos en el LES, se han reportado (a) trastornos en la depuracin (clearence) de stos, mediados por disminucin de receptores CR1, saturacin de stos y de los receptores Fc de IgG (FcR), hipocomplementemia, y (b) disfuncin de la fagocitosis del sistema fagoctico mononuclear. La combinacin de ambos factores favorecera entonces el dao tisular mediado por complejos inmunes. El LES es una enfermedad autoinmune, inflamatoria, crnica, por lo que los mecanismos patognicos deben perpetuarse por tiempo prolongado. Para este objeto la respuesta autoinmune debe mantenerse. La prdida de tolerancia persiste para ciertos autoantgenos, mantenindose una activacin permanente de clones linfocitarios autorreactivos. Los trastornos de la regulacin inmune (disfuncin de clulas T y B, red idiotipoanti-idiotipo, desbalance de citoquinas) persisten. Los mecanismos de eliminacin de complejos inmunes estn superados. El resultado final es la persistencia de la autoinmunidad y su dao secundario a travs del tiempo, planteando as las caractersticas clnicas de la enfermedad. Como resumen general, se puede decir que la etiopatogenia del LES est sustentada en la suceptibilidad gentica, factores ambientales y hormonales y en la disregulacin inmune. Por lo tanto es multifactorial, cada uno de ellos interactuando con los otros. Probablemente la participacin de cada uno de stos sea variable en cada enfermo. El mejor conocimiento de su etiopatogenia permitir desarrollar tratamientos ms eficientes, ms especficos y con menos efectos secundarios. 3.2. Clnica y tratamiento El LES es una enfermedad inflamatoria que puede comprometer diferentes rganos. Sus manifestaciones clnicas ms frecuentes son: sndrome febril y compromiso del estado general; lesiones eritemato papulares de la piel y rash malar, ambos fotosensibles; poliartralgias y poliartritis; alopecia; fenmeno de Raynaud: pleuro-pericarditis; anemia por enfermedad inflamatoria o hemoltica; leucopenia; linfopenia; trombopenia y prpura trombopnico; y velocidad de eritrosedimentacin elevada. Es frecuente, y muy importante para el pronstico, el compromiso renal, que puede manifes-

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tarse por distintos tipos de glomerulonefritis. La ms grave, y que puede llegar a insuficiencia renal, es la glomerulonefritis proliferativa difusa, caracterizada por depsito de complejos inmunes glomerulares e inflamacin secundaria. Otra manifestacin clnica potencialmente muy grave, es el compromiso del sistema nervioso central, con dao difuso o focal y eventualmente convulsiones. Todas estas manifestaciones clnicas son muy variables entre distintos pacientes. El diagnstico de LES se establece frente a la sospecha clnica, con las alteraciones inespecficas del laboratorio general, y la presencia de distintos autoanticuerpos, especialmente anticuerpos antinucleares y anti DNA, que tienen mayor valor diagnstico. El LES no tiene una causa conocida por lo que no tiene un tratamiento especfico. Est encaminado a combatir la inflamacin en forma efectiva (corticoesteroides); o frenar los mecanismos inmunes que la originan (inmunosupresores). La insuficiencia renal y el compromiso neurolgico son las causas ms importantes de mortalidad ligadas a la enfermedad. Otra causa frecuente es la infeccin o la enfermedad vascular ateroesclertica, que estn relacionadas al tratamiento agresivo y prolongado.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 25
SNDROME ANTIFOSFOLPIDO
Ivn Palomo G., Antonio Cabral, Silvia Pierangeli y Ricardo Forastiero V.

1. Introduccin 2. Antgenos y anticuerpos 2.1. Antgenos 2.2. Anticuerpos 3. Mecanismos de trombosis 3.1. Biosntesis de eicosanoides e isoeicosanoides 3.2. Sistema antitrombtico de la protena C 3.3. Va del factor tisular 3.4. Sistema fibrinoltico 3.5. Anexinas y activacin celular 3.6. Inmunidad celular y perfil de citoquinas 3.7. Asociacin con factores genticos de riesgo trombtico

4. Manifestaciones clnicas 4.1. Manifestaciones vaso-oclusivas 4.2. Manifestaciones hemocitopnicas 4.3. Otras manifestaciones 5. Laboratorio 5.1. Anticardiolipina por ELISA 5.2. Anticoagulante Lpico 5.3. Pruebas de laboratorio ms especficas para el diagnstico de SAF 5.4. Qu pruebas de laboratorio se deben usar en el diagnstico de SAF? 6. Tratamiento

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RESUMEN Los anticuerpos antifosfolpidos (aFL) son un grupo heterogneo de anticuerpos que se encuentran en pacientes con enfermedades del tejido conectivo, infecciones y en asociacin al uso de drogas. Su presencia se ha relacionado al Sndrome Antifosfolpido (SAF) que se caracteriza por presentar trombosis, abortos a repeticin y trombocitopenia. La mayora de los anticuerpos aFL patognicos presentan especificidad para algunas protenas con afinidad por fosfolpidos aninicos, la ms estudiada es la beta 2-glicoprotena I (2GPI). Varios hallazgos se asocian a los mecanismos trombognicos de los anticuerpos aFL, destacando los efectos inhibitorios sobre los inhibidores fisiolgicos de la coagulacin y los efectos que conducen a la activacin celular. La pesquisa de los anticuerpos aFL se realiza por ELISA anticardiolipina (aCL) y por pruebas de coagulacin (anticoagulante lpico, AL), incorporndose ms recientemente ensayos ms especficos como el ELISA para anti-2GPI. En el manejo del SAF se utiliza principalmente anticoagulacin.

1. INTRODUCCIN Los anticuerpos aFL se conocen desde comienzos del siglo XX, primero se los pesquis por el mtodo de fijacin de complemento, posteriormente, en los aos cuarenta, a travs de la prueba para serologa de sfilis, luego, entre los aos cincuenta y sesenta, con pruebas de coagulacin. En los ochenta, Harris y colaboradores, mediante un radioinmunoanlisis que utilizaba cardiolipina en fase slida, aumentaron significativamente la sensibilidad en la pesquisa de los anticuerpos aFL, llamados a partir de esa fecha aCL. Posteriormente se desarroll un ELISA para detectar aCL. Los anticuerpos aFL en asociacin con las complicaciones clnicas definen al SAF primario o secundario a otras enfermedades o frmacos. A partir de fines de los ochenta, los anticuerpos aFL han sido objeto de mltiples investigaciones tendientes a conocer sus especificidades, mecanismos de unin y su participacin en la patogenia de las complicaciones. En este captulo se describirn los siguientes aspectos sobre el SAF: especificidad antignica de los anticuerpos aFL, sus mecanismos patognicos de trombosis, y algunos aspectos sobre los mtodos de pesquisa en el laboratorio, manifestaciones clnicas y tratamiento.

2. ANTGENOS Y ANTICUERPOS Hasta antes de 1990 se pensaba que los anticuerpos aFL reconocan fosfolpidos aninicos, lo que justifica su nombre. Actualmente se sabe que la mayora de los anticuerpos aFL patognicos tienen especificidad contra algunas protenas con afinidad por FL con carga negativa; por esta razn tambin se les denomina Anticuerpos antifosfolpido-protenas. 2.1. Antgenos Entre las protenas blanco de los anticuerpos aFL se destacan la 2GPI y protrombina (PT). Adems se han descrito otras especificidades: protena C, protena S, anexina V, kiningeno de alto peso molecular, trombomodulina, etc. Dada la importancia de la 2GPI como blanco de los anticuerpos aFL, a continuacin se describen algunos aspectos sobre su estructura y actividad biolgica. 2GPI. Es una protena plasmtica sintetizada en el hgado, que se une a molculas con carga negativa, como FL aninicos, heparina y lipoprotenas, y a plaquetas activadas. Se sabe que inhibe la va intrnseca de la coagulacin in vitro, la actividad protrombinasa de las plaquetas y la agregacin plaquetaria inducida por ADP. Sin

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embargo, la funcin de la 2GPI in vivo no es an totalmente conocida. La 2GPI es una glicoprotena formada por una cadena polipeptdica de 326 aminocidos (50 kDa). Presenta cinco dominios de aproximadamente 60 residuos. Los dominios I-IV presentan la estructura tpica de los miembros de la superfamilia de protenas de control del complemento (CCP) tambin llamados dominios sushi. El quinto dominio, que se encuentra hacia el extremo carboxilo, presenta 82 aminocidos que incluyen dos cistenas adicionales (figura 25-1). El gen que codifica para la 2GPI humana fue clonado y secuenciado. Se han identificado los dominios de unin de la 2GPI a los FL aninicos y a los anticuerpos aFL. Se ha demostrado que la CL se une a la

secuencia aminoacdica presente en el quinto dominio de la protena (C 281KNKEKKC 288), secuencia con carga positiva debido a la presencia de cuatro lisinas (K) y que se encuentra en la superficie de la protena. Se ha postulado que tambin participara el primer dominio. Por otra parte, se ha establecido que el dominio de unin para los anticuerpos anti-2GPI est principalmente en el cuarto dominio de la 2GPI, en un eptopo crptico que se expone cuando la protena interacciona con los FL aninicos (figura 25-2). Evidencia ms reciente indica que el dominio I presenta el eptopo de una gran parte de los anticuerpos anti-2GPI. Existen dos teoras que explican la interaccin entre los anticuerpos anti2GPI y la 2GPI: (a) unin de los anticuerpos a eptopos crpticos expresados en la protena como resultado de la interaccin con FL y (b) unin de los anticuerpos a eptopos nativos de la protena donde la interaccin se produce slo cuando hay alta densidad antignica sobre superficies celulares o placas de ELISA. Actualmente el consenso general es la unin de acuerdo a la segunda teora debido a la reconocida baja afinidad de estos anticuerpos. Se han descrito cuatro polimorfismos genticos en la 2GPI: en el segundo dominio (Ser88Asn) y en el quinto dominio (Val247Leu, Cys306Gly, Trp316Ser). 2.2. Anticuerpos

Figura 25-1. Estructura de la 2GPI. Esta glicoprotena posee cinco dominios (I-V) de aproximadamente 60 aminocidos cada uno. , glicosilacin; c, cistena.

Los anticuerpos aFL pueden ser de clase IgG, IgM e IgA, teniendo mayor significacin clnica el

Figura 25-2. Modelo de unin de los anticuerpos anti-2GPI a la 2GP. La interaccin de la 2GPI a fosfolpidos aninicos permite la exposicin de un eptopo crptico en la 2GPI, regin a la que se unen los anti-2GPI.

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isotipo IgG, seguido de IgM. Los anticuerpos aFL convencionales (aCL y AL) se asocian a trombosis venosa y arterial, y a abortos a repeticin. Los anticuerpos aFL estn presentes en el 1-3% de individuos normales, generalmente en ttulos bajos. En cambio, alrededor de un 50% de los pacientes portadores de Lupus Eritematoso Sistmico (LES) presentan algn tipo de anticuerpos aFL. Las embarazadas normales presentan cifras iguales a la poblacin general normal, en cambio alrededor del 20% de las pacientes que desarrollan abortos a repeticin presentan aCL y/o AL. Se han distinguido dos clases de aCL: aCL independientes de 2GPI y aCL dependientes de 2GPI. Los primeros se han encontrado principalmente en pacientes con enfermedades infecciosas; se uniran a CL en ausencia de 2GPI y no seran patognicos. Los segundos en cambio, se encuentran en pacientes con enfermedades autoinmunes; se unen a 2GPI en presencia de CL y tendran un rol patognico. Dos especificidades de los anticuerpos aFL han sido las ms estudiadas, anticuerpos anti2GPI y anti-PT. Ambos se pueden pesquisar a travs de ELISAs especficos. Los anticuerpos anti-2GPI son evaluados adems en el ELISA para aCL porque uno de los reactivos usados (suero fetal bovino) y el suero del paciente contiene 2GPI. Anticuerpos anti-2GPI. En el SAF la mayora de los anticuerpos aFL se unen a 2GPI y el hallazgo de anticuerpos anti-2GPI presenta alta especificidad para el SAF. Algunos anticuerpos anti-2GPI presentan actividad AL. Fisiolgicamente la unin de la 2GPI a los FL aninicos es dbil, en cambio en presencia de anticuerpos anti2GPI la unin de la 2GPI a los FL es ms fuerte, compitiendo as con los factores de la coagulacin. Anticuerpos anti-PT. En el caso de los anticuerpos anti-PT la asociacin con trombosis no es clara. Se sabe que la mayora de los anti-PT presentan actividad AL y el mecanismo sera similar al descrito para los anticuerpos anti-2GPI, en este caso interfiriendo con la formacin del complejo protrombinasa. 3. MECANISMOS DE TROMBOSIS La asociacin de los anticuerpos aFL con las complicaciones tromboemblicas sugiere que

estos anticuerpos juegan un rol fundamental en la patogenia del SAF. Varios mecanismos (tabla 251) han sido propuestos teniendo en cuenta que los FL y las protenas que unen fosfolpidos tienen un papel crucial en el mantenimiento de la hemostasia e intervienen en una gran variedad de funciones celulares. A continuacin se presentan los hallazgos ms relevantes en el campo de la fisiopatogenia del SAF:

Tabla 25.1. Sistemas involucrados en la patogenia del SAF Biosntesis de eicosanoides e isoeicosanoides Sistema antitrombtico de la protena C Va del Factor Tisular Sistema Fibrinoltico Anexinas y Placenta Plaquetas y Monocitos Inmunidad celular y Citoquinas Combinacin con Trombofilias hereditarias

3.1. Biosntesis de eicosanoides e isoeicosanoides. Estos componentes se sintetizan a partir del cido araquidnico de las membranas celulares por va enzimtica (eicosanoides) o por accin de radicales libres (isoeicosanoides). Varios estudios in vitro demostraron que algunos anticuerpos aFL interferan con la produccin de prostaciclina (PGI2), eicosanoide producido por las clulas endoteliales (CE), inhibiendo la liberacin de cido araquidnico o la actividad de las enzimas involucradas. Estudios ms recientes mostraron que las IgG de pacientes con SAF estimulan la sntesis de la cicloxigenasa inducible sin afectar la expresin de la enzima constitutiva endotelial. La sntesis in vitro de tromboxano A2 (TXA2), eicosanoide de origen plaquetario, es incrementada en presencia de 2GPI y de anticuerpos aFL purificados de pacientes con SAF. Este efecto no se observ al utilizar anticuerpos aFL de pacientes con sfilis. La activacin plaquetaria parece ser dependiente de la unin del fragmento Fc de las IgG al receptor celular Fc-RIIA. La biosntesis de eicosanoides puede ser evaluada a travs de la eliminacin urinaria de sus metabolitos. En estudios ex vivo se encontr un disbalance en la relacin TXA2/PGI2 con un incremento mayor del metabolito plaquetario indicando una alteracin in vivo que podra tener relevancia en el desarrollo

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de trombosis. El aumento del metabolito plaquetario se asoci a la presencia de anticuerpos aFL dependientes de 2GPI de isotipo IgG. Los isoeicosanoides reflejan los fenmenos de peroxidacin lipdica in vivo y poseen accin vasoconstrictora y de activador plaquetario, postulndose que tendran un rol importante en los eventos involucrados en el desarrollo de aterosclerosis y trombosis en las lesiones vasculares. En estudios recientes se hall un aumento en la excrecin urinaria de los isoeicosanoides que se asociaba con el incremento plasmtico de los marcadores de generacin de trombina y de factor tisular (FT) soluble. Recientemente se encontr que los niveles urinarios de los metabolitos de eicosanoides e isoeicosanoides se correlacionan. Estos hallazgos apoyan la hiptesis que involucra a los fenmenos de estrs oxidativo e inflamacin en el desarrollo del SAF. 3.2. Sistema antitrombtico de la protena C. Este mecanismo fisiolgico de control de la hemostasia es uno de los ms importantes, y varios estudios han evaluado la relacin entre anticuerpos aFL y este sistema. En lo que respecta a la accin de los anticuerpos aFL sobre la activacin de la protena C (PC) mediada por trombomodulina hay resultados contradictorios, pero existe consenso general de que estos anticuerpos inhiben la funcin de la PC activada (APC). En particular, los anticuerpos aFL previenen la inactivacin del factor Va por la APC sobre las superficies fosfolipdicas generando un estado adquirido de resistencia a la APC con el consecuente efecto protrombtico. Esto es evidente principalmente con los anticuerpos aFL dependientes de 2GPI. Otra de las alteraciones frecuentemente encontradas en este sistema es la reduccin en los niveles plasmticos de la protena S (PS) libre (cofactor de la PC) en los pacientes con anticuerpos aFL. La 2GPI ejerce un efecto inhibitorio fisiolgico en la unin PS-protena de unin a C4b (C4bBP) que es reducido en presencia de anticuerpos aFL y se propone que los anticuerpos aFL aumentan la afinidad de la PS por C4bBP e inducen una reduccin en los niveles de PS libre. 3.3. Va del factor tisular. La estimulacin inducida por los anticuerpos aFL sobre la actividad procoagulante de CE y monocitos es debida al aumento en la expresin de FT en las superficies celulares. Los anticuerpos aFL autoinmunes in

vitro no slo aumentan la expresin del FT sino que adems incrementan la sntesis proteica y el mRNA del mismo. La elevacin simultnea in vivo en los niveles plasmticos del factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF) y de FT sugiere que los anticuerpos aFL promueven la liberacin del VEGF, que a su vez inducira la expresin del FT con la consecuente activacin de coagulacin. Recientemente se demostr adems que los anticuerpos aFL dependientes de 2GPI suprimen la actividad anti-factor Xa del inhibidor de la va del factor tisular incrementando la generacin de factor Xa por el FT. 3.4. Sistema fibrinoltico. Este sistema a travs de la transformacin del plasmingeno en plasmina disuelve el cogulo de fibrina. Diversos estudios han demostrado un incremento en los niveles plasmticos del inhibidor (PAI-1) del activador tisular del plasmingeno (tPA). Una hiptesis muy reciente propone que el estado adquirido de hipofibrinolisis en este sndrome es causado por la unin de los anticuerpos anti-PT con el plasmingeno inhibiendo su activacin. La 2GPI parece proteger al t-PA de la inhibicin por el PAI-1 y este efecto es revertido en presencia de autoanticuerpos aFL que alteran esta funcin de la 2GPI. 3.5. Anexinas y activacin celular. La anexina V tiene un rol importante al prevenir las reacciones de coagulacin sobre la superficie placentaria. Algunos datos indican que los anticuerpos aFL reducen la concentracin de anexina V sobre las superficies trofoblsticas placentarias y CE acelerando la activacin de coagulacin sobre las mismas por la mayor exposicin de FL. La activacin endotelial ha recibido mucha atencin en estos aos y la evidencia indica el cambio del fenotipo normal antitrombtico del endotelio a un fenotipo protrombtico por accin de los anticuerpos aFL dependientes de 2GPI. Adems de lo ya mencionado (PGI2, FT, anexina V), otros estudios han demostrado un fenotipo proadhesivo y proinflamatorio al expresar varias molculas de adhesin que conducen a la adhesin y posterior activacin de leucocitos al endotelio. El aumento en plasma de estas molculas de adhesin es muy frecuente en pacientes con autoanticuerpos aFL y se correlaciona con el aumento de los marcadores que indican actividad trombnica. Utilizando un modelo animal de microcirculacin (msculo cremster de ratones) se hall que los anticuerpos

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aFL incrementan la adhesin de leucocitos al endotelio. Se demostr el rol fundamental de las molculas de adhesin al no observar el efecto trombognico en el modelo de trombosis y de activacin endotelial por parte de los anticuerpos aFL cuando se usaron animales knock-out en las molculas de adhesin. Recientemente se demostr la presencia de micropartculas endoteliales (EMP) en pacientes con autoanticuerpos aFL. La liberacin de EMP en circulacin podra diseminar las actividades procoagulantes y proadhesivas ms all del sitio de formacin de las EMP y contribuir al estado protrombtico del SAF. Un trabajo reciente indica que la 2GPI y los anticuerpos aFL dependientes de 2 GPI se acumulan en los endosomas tardos de las CE induciendo un cambio en la movilizacin intracelular de protenas que podra contribuir a la patogenia del SAF. 3.6. Inmunidad celular y perfil de citoquinas. El rol de la inmunidad celular en el SAF est siendo recientemente evaluado. Sin embargo, los ensayos in vitro muestran datos contradictorios en si las clulas T CD4 especficas para 2GPI producen citoquinas del tipo Th1 o Th2. El cambio de fenotipo Th1 a Th2 podra tener implicancias clnicas ya que el tratamiento con anticuerpos especficos anti-idiotipo result ser efectivo atenuando las manifestaciones clnicas y serolgicas del SAF experimental en ratones. Los resultados sugieren que las clulas Th2 tienen un rol importante en el desarrollo del SAF y que el cambio Th2 a Th1 se asocia con induccin de remisin del SAF. En un estudio reciente se hall que la respuesta inmune del tipo 2 caracteriza a los pacientes con SAF primario y que aquellos con anticuerpos aFL sin SAF, al igual que en los controles normales, predomina el patrn de citoquinas del tipo Th1. Estos hallazgos en pacientes con anticuerpos aFL indicaran que el cambio de fenotipo Th1 a Th2 tambin tendra un cierto rol en el desarrollo del SAF en humanos. 3.7. Asociacin con factores genticos de riesgo trombtico. Los eventos trombticos son multifactoriales y existen algunos pocos estudios publicados sobre la prevalencia de factores genticos de riesgo trombtico en pacientes con anticuerpos aFL. En una serie de 105 pacientes consecutivos con anticuerpos aFL se evaluaron el factor V Leiden, el polimorfismo del gen de la protrombina G20210G, la variante termolbil de la metilentetrahidrofolato reductasa y el genotipo

4G/4G en el promotor del PAI-1. Los datos indican que la combinacin de factores genticos se asocia al SAF y podra contribuir al estado protrombtico en algunos pacientes con anticuerpos aFL. En resumen los mecanismos de trombosis o prdidas fetales mediados por autoanticuerpos en el SAF pueden ser la consecuencia de dos tipos de interacciones: (a) la unin de los anticuerpos a los antgenos unidos a membranas altera la cintica de las reacciones dependientes de FL y (b) la unin de los anticuerpos a los antgenos unidos a los receptores de membranas celulares induce seales de transduccin y activacin celular.

4. CLNICA (Antonio R. Cabral) Las manifestaciones clnicas asociadas a los anticuerpos aFL pueden agruparse en: (a) Vasooclusivas, (b) hemocitopnicas y, tal vez, (c) las que podran deberse a la accin directa de los anticuerpos con tejidos ricos en fosfolpidos, v. gr., sistema nervioso central y trofoblasto. 4.1. Manifestaciones vaso-oclusivas La manifestacin clnica distintiva del SAF es la trombosis venosa y/o arterial, ambas suelen ser recurrentes; las oclusiones arteriales pueden tener vasculopata con gran proliferacin de la ntima y de la media como factor asociado. Otras manifestaciones son el livedo reticularis, lceras en piernas asociadas a lesin proliferativa probablemente debida tambin a microtrombosis y prdida fetal repetida. Cuando sta ocurre en el tercer trimestre del embarazo, parece deberse a lesin trombtica y proliferativa de los vasos placentarios. Otras manifestaciones que en series grandes de pacientes han probado tener asociacin significativa con anticuerpos aFL son la hipertensin pulmonar y la mielitis transversa. Igualmente, la vasculitis, neuropata perifrica, convulsiones e isquemia cerebral transitoria son manifestaciones clnicas ms frecuentes en pacientes con portadores de LES y anticuerpos aFL que en los seronegativos. La prevalencia de infarto del miocardio (IM) en pacientes con SAF primario o secundario a LES vara del 4 al 7%, mientras que la de aCL en el suero de pacientes con IM, pero sin enfermedad autoinmune, oscila entre el 3 y 80%. Esta diferen-

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cia quiz dependa del momento de la toma de la muestra, de algunas variaciones en la sensibilidad de los ensayos entre los diferentes laboratorios o de la seleccin de pacientes. Por otro lado, en una cohorte de 133 pacientes con IM o muerte cardiaca, anidada en un estudio prospectivo de 4081 hombres sanos, los aCL a ttulos altos aumentaron el riesgo de desarrollar IM alrededor de 2 veces ms que en los sujetos sanos sin aCL; tal riesgo fue independiente del tabaquismo, la tensin arterial sistlica y de los niveles sricos de lipoprotenas de alta y baja densidad. Varios autores han mostrado que los pacientes con LES y aCL tienen mayor prevalencia de vegetaciones valvulares que los pacientes seronegativos. Igualmente, en un estudio ecocardiogrfico de 55 pacientes con SAFP hubo una prevalencia del 38% de vegetaciones valvulares, particularmente de las vlvulas mitral y artica, y slo del 4% en el mismo nmero de personas sanas. Los pacientes con LES y AL o con aCL positivos tienen mayor frecuencia de microtrombos glomerulares, pero no de nefritis lpica. En un grupo de 667 pacientes con LES, hubo asociacin negativa de aCL sricos y sndrome nefrtico, quiz debida a la excrecin urinaria de los aCL IgG. Adems de los microtrombos glomerulares, los pacientes con SAFP pueden tener lesiones tipo microangiopata trombtica o proliferacin mesangial. Las trombosis hemorrgicas de las glndulas suprarrenales son alteraciones bien reconocidas en el SAF primario. Por ejemplo, de 38 casos con hipoadrenalismo asociado a aCL, 30 tuvieron SAF primario, en la mayora (70%) de los cuales la insuficiencia suprarrenal fue de iniciacin sbita. La obstruccin del flujo heptico secundaria a trombosis de venas suprahepticas, sndrome de Budd-Chiari, es una manifestacin clnica bien reconocida en los sndromes primario y secundario de anticuerpos aFL. En la actualidad se considera que el SAF primario es una de las principales causas de Budd-Chiari. 4.2. Manifestaciones hemocitopnicas La trombocitopenia fue la primera manifestacin hemocitopnica reconocida como parte del SAF. Algn tiempo despus la anemia hemoltica autoinmune se asoci a anticuerpos aFL, particularmente al isotipo IgM, que reconocen a la fosfatidilcolina como blanco antignico. La sin-

crona de prpura trombocitopnica con anemia hemoltica autoinmunes (sndrome de Evans) en pacientes con LES sucede casi siempre en presencia de anticuerpos aFL. Una asociacin en la que se hace poco nfasis, pero que varios autores han informado su asociacin con anticuerpos aFL en pacientes con lupus, es la neutropenia. La tabla 25-2 muestra la frecuencia de algunas manifestaciones clnicas vaso-oclusivas y hemocitopnicas en el SAF primario y sus diferencias con el secundario a LES. 4.3. Otras manifestaciones Algunas manifestaciones clnicas del SAF podran deberse a la unin del anticuerpo a fosfolpidos presentes en el sistema nervioso central o en el trofoblasto. stas incluyen la mielitis transversa, desmielinizacin, la prdida fetal durante el primer trimestre y, tal vez, algunos embarazos anembrinicos.

5. LABORATORIO Los ensayos que detectan anticuerpos aFL tienen importancia porque ayudan al mdico en el diagnstico del SAF. Estos anticuerpos se pueden detectar mediante ensayos de fase slida (aCL) o por medio de pruebas de hemostasia que detectan la prolongacin de reacciones de la coagulacin en las que los fosfolpidos aninicos actan como catalizadores, y que no pueden ser corregidas con plasma normal (AL). El diagnstico de SAF se basa en un ttulo de moderado a alto de aCL y/o en una prueba positiva para AL (al menos en dos ocasiones distintas), en pacientes que presentan alguna de las manifestaciones clnicas propia del SAF (punto 4). El ELISA aCL, aunque ha probado ser una prueba de laboratorio altamente sensible, resulta positiva tambin en otras enfermedades que incluyen a saber: enfermedades del tejido conectivo, enfermedades infecciosas como la sfilis, fiebre Q y SIDA y en algunos sndromes inducidos por frmacos. Se sabe, sin embargo que los anticuerpos aFL son clnicamente significativos solamente cuando estn presentes en pacientes con SAF y particularmente si los ttulos son elevados; es as que se ha intentado modificar el ensayo en muchas oportunidades para hacerlo ms especfico para el diagnstico de SAF. A continuacin se revisarn las diferentes tc-

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Tabla 25-2. Frecuencia de algunas manifestaciones clnicas vaso-oclusivas y hemocitopnicas en el SAF primario y sus diferencias con el secundario a LES. Manifestacin clnica SAF primario SAF secundario a LES p

VASO-OCLUSIVAS Arteriales Prdida fetal repetida Livedo reticularis Valvulopata cardiaca 18/41 (44%) 20/25 (80%) 14/44 (32%) 19/58 (37%) 13/101 (13%) 23/50 (46%) 73/101 (72%) 29/56 (63%) 0.0001* 0.01* 0.00001* <0.005**

HEMOCITOPNICAS Anemia hemoltica Neutropenia Trombocitopenia 5/44 (12%) 4/58 (7%) 0 13/45 (28%) 28/101 (28%) 12/56 (21%) 6/56 (11%) 53/101 (53%) 0.05* <0.05** <0.05** 0.01*

* Tomado de Cardiel H, Grupo Multicntrico de la Ciudad de Mxico: Sndrome de antifosfolpido primario (SAFP). Informe inicial de 51 pacientes. Grupo Multicntrico de la Ciudad de Mxico. Rev Mex Reumatol 1992; 7:4. ** Tomado de Vianna JL, Khamashta MA, Ordi-Ros J, Font J, Cervera R, Lopez-Soto A, Tolosa C, Juliane F, Selva A, Ingelmo M, Hughes GRV: Comparison of the primary and secondary antiphospholipid syndrome: a European multicenter study of 114 patients. Am J Med 1994; 96:3-9.

nicas usadas para validar y mejorar la determinacin de aCL, as como aspectos concernientes a la especificidad del ensayo. Tambin se discutirn nuevas pruebas que han demostrado ser ms especficas para el diagnstico de SAF. 5.1. Anticardiolipina por ELISA La asociacin de una prueba aCL positiva con manifestaciones clnicas de SAF ocurre, principalmente, cuando los ttulos de aCL son moderados o altos, particularmente si son del isotipo IgG, que es ms prevalente que el IgM. Sin embargo, existen reportes de que la presencia de aCL de tipo IgA y IgM ocasionalmente tambin estn asociados con manifestaciones clnicas de SAF. Frecuentemente se encuentra que los resultados se expresan en rangos de positividad y adems en unidades GPL y MPL. Se ha demostrado que la variacin entre laboratorios es menor en estos casos. La prueba aCL es sensible y se lo encuentra positivo en ms del 80-90% de los pacientes con

SAF. El problema es que este ensayo es tambin positivo en otras enfermedades que no son SAF. Sin embargo, debido a que los pacientes con SAF generalmente tienen niveles altos de aCL, la mayor precisin en el diagnstico se puede lograr usando puntos de corte ms altos para el ensayo. Tambin se han empezado a usar otros antgenos para cubrir las placas de ELISA que aumentan la especificidad de la prueba y sern descritos en el punto 5.3. El primer ensayo de aCL fue un radioinmunoensayo. Muchos laboratorios adoptaron el ensayo de inmediato y esto acarre la aparicin de algunos problemas. Por ejemplo, con la tcnica utilizada, interpretacin de los resultados, etc. Para asegurar que la prueba presentaba valor diagnstico para el SAF, sera entonces necesario identificar anticuerpos por isotipo y cuantificar los resultados. Tambin se destac la necesidad de establecer cules eran los mtodos vlidos as como procedimientos estandarizados para realizar esta determinacin. Se llev a cabo entonces, el primer taller internacional de estandarizacin

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en 1986, seguido por otros dos talleres del mismo tipo. Desde el momento que el ensayo se puso en marcha, se han hecho algunos cambios tendientes a: reducir la unin inespecfica, estandarizar la cuantificacin de los resultados y los tiempos y temperaturas de incubacin. Se recomend, por ejemplo, el uso de suero fetal bovino en vez de gelatina en la solucin de bloqueo y en el diluyente porque ello mejoraba la unin de los anticuerpos a los FL. Este fenmeno fue atribuido posteriormente a la presencia en el suero de 2GPI. Tambin se enfatiz en la necesidad de estandarizar el procedimiento para obtener valores cuantitativos precisos, dada la importancia de esos valores en el diagnstico apropiado de la enfermedad. Estandarizacin del ensayo de aCL por ELISA En el primer taller de estandarizacin de aCL, se discutieron y estudiaron los mtodos que deban usarse para medir los ttulos de aCL. Se establecieron unidades de medida, y se propuso el uso de seis calibradores para que los laboratorios en distintas partes del mundo pudieran realizar la determinacin de aCL con mejor precisin. En el segundo taller se demostr que cuando los aCL se median en forma semicuantitativa, en vez de cuantitativa, era posible obtener mejor acuerdo (correlacin o precisin) en los resultados obtenidos en distintos laboratorios. En el tercer y cuarto taller se discutieron temas controvertidos, particularmente con respecto a la especificidad del ensayo, los antgenos que estos anticuerpos reconocen y se analizaron y compararon equipos comerciales para la deteccin de aCL. 5.2. Anticoagulante Lpico El AL est presente en el SAF con menos frecuencia que aCL. Se sabe que el AL es una prueba ms especfica para la deteccin de anticuerpos aFL, ya que generalmente no se encuentra positiva en enfermedades que no sean el SAF. Este ensayo de AL mide la habilidad de los anticuerpos aFL de prolongar las reacciones de la coagulacin dependientes de FL. En publicaciones recientes, se ha demostrado que los anticuerpos aFL son heterogneos y que los dos tipos de anticuerpos tal vez sean entidades distintas. Se sabe tambin que aunque la mayora de los pacientes con SAF tienen positivas esas dos pruebas de laboratorio, aproximada-

mente un 10-16% de los pacientes con SAF son AL positivo y negativo para aCL y alrededor de un 25 % son solamente positivos para aCL. 5.3. Pruebas de laboratorio ms especficas para el diagnstico de SAF Como se destac anteriormente, uno de los mayores problemas del ensayo de ELISA para aCL es el nmero de falsos positivos que presenta, es decir una gran variedad de pacientes con enfermedades que no son SAF, particularmente de origen infeccioso tienen aCL positivos. ltimamente se han desarrollado modificaciones al ensayo de aCL. stas incluyen por ejemplo, cubrir las placas 2GPI, con fosfatidilserina o con una mezcla de fosfolpidos aninicos (APhL ELISA Kit) en vez de cardiolipina, y estas modificaciones han resultado en una mayor especificidad del ensayo. Estudios publicados que utilizan 2GPI+como antgeno, particularmente cuando se cubren placas de poliestireno de high binding o oxidadas, han demostrado que el ensayo es relativamente especfico para la deteccin de anticuerpos presentes en pacientes con SAF. Estudios publicados provenientes de distintos laboratorios indican que la sensibilidad del ensayo vara del 40 al 90%. La especificidad tambin vara entre los distintos grupos de investigadores, dependiendo de la seleccin de los sueros de los pacientes y de la tcnica utilizada. Varios estudios han demostrado que el ensayo que utiliza la mezcla de fosfolpidos aninicos es un mtodo sensible y especfico para la identificacin de pacientes con SAF. 5.4. Qu pruebas de laboratorio se deben usar en el diagnstico de SAF? La correcta y precisa identificacin de pacientes con SAF es importante ya que estos pacientes deben someterse a tratamientos para prevenir la incidencia de trombosis a repeticin, que incluyen anticoagulacin de por vida, o debe decidirse si tratar o no a una mujer embarazada para prevenir la recurrencia de prdidas fetales. Adems, existen muchas otras causas de trombosis y ms an de prdidas fetales. Es entonces importante realizar el diagnstico de SAF con precisin. En general se acepta que el AL y el ensayo de aCL por ELISA se deben usar para confirmar el diagnstico presuntivo de SAF. En resumen, el diagnstico de SAF se puede

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confirmar en pacientes que presenten sntomas clnicos de SAF (trombosis arteriales y/o venosas y/ o prdidas fetales) y que tengan un ttulo de medio a alto de aCL (particularmente IgG, ms de 40 unidades GPL) y/o AL positivo. Sin embargo, hay situaciones en las que la confirmacin del SAF puede obtenerse con uno de los ensayos ms especficos que se discutieron en la seccin anterior, el ELISA para anticuerpos anti-b2GPI o el APhL ELISA Kit: Pacientes con trombosis venosas y/o arteriales o con prdidas fetales que son positivos bajos IgG para aCL, o solamente positivos para IgM o IgA aCL. Pacientes que presentan manifestaciones clnicas no frecuentes en el SAF como por ejemplo trombocitopenia, tromboflebitis, ateroesclerosis, prdidas fetales en el primer trimestre, livedo reticularis, lceras en las piernas, corea, lesiones cardacas valvulares, en ausencia de manifestaciones clnicas primarias de SAF.

Pacientes con manifestaciones clnicas de SAF pero con pruebas de AL y aCL negativas.

El algoritmo mostrado en la figura 25-3 muestra que primero se deben realizar las pruebas de aCL y de AL. Si estas pruebas (cualquiera de las dos) son negativas, se debe realizar una prueba ms especfica que pueden incluir el ensayo de anti-b2GPI o el APhL ELISA Kit. Debido a que la sensibilidad del citado kit es similar a la del ensayo de aCL, aquel ensayo que usa la mezcla de FL puede remplazar al aCL y usarse en el primer nivel junto con el AL.

6. TRATAMIENTO (Antonio R. Cabral) Adems de su relevancia biolgica, el conocimiento de que el SAF es parte del lupus eritematoso tiene gran importancia teraputica, ya que las manifestaciones de ste, particularmente las vaso-oclusivas, requieren tratamiento antiagre-

Figura 25-3. Algoritmo de la secuencia de diagnstico de laboratorio en pacientes que presentan clnica de SAF. Tomado de: Harris EN, Pierangeli S. Equivocal Antiphospholipid Syndrome. J Autoimmunity 15: 81-5, 2000.

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gante plaquetario y/o anticoagulante y no el corticoesteroideo o el inmunosupresor. Esta ltima nocin deriva de que el bajar los niveles de anticuerpos aFL no tiene efecto positivo en las manifestaciones del sndrome. Por otra parte, para que tales niveles bajen se requieren dosis mayores de corticoesteroides e incluso de inmunosupresores a largo plazo, quiz mayor al que lo requieren las manifestaciones clnicas clsicas del lupus. La prdida fetal repetida se puede prevenir mediante la administracin de aspirina a dosis de 65 a 100 mg/da. Para ello, la aspirina debe iniciarse temprano en el embarazo y, de preferencia, antes. La administracin de heparina subcutnea durante el embarazo aumenta las probabilidades de tener productos vivos y puede disminuir la aparicin de preeclampsia. Pese a su costo, se favorece el uso de heparina de bajo peso molecular dada la duracin que deber tener su administracin. Otra forma de tratamiento que puede aumentar las probabilidades de xito es la administracin de gamaglobulina endovenosa. El alto costo, sin embargo, limita su uso a situaciones elitistas. Se ha propuesto a la prednisona para el tratamiento de la prdida fetal, pero esta medida no confiere ventaja alguna; de hecho, su uso durante toda la gestacin confiere mayor riesgo de dao que de beneficio. Debido a que la exposicin de fosfolpidos aninicos en la superficie de las plaquetas activadas o agregadas parece tener un papel crucial en la patogenia de la trombocitopenia, se ha propuesto tratar sta con aspirina a dosis bajas. Los resultados positivos de esta medida en pacientes con SAF primario no se han reproducido en los del secundario a LES, probablemente debido a los varios autoanticuerpos antiplaquetarios presentes en el suero de estos pacientes. En pacientes con LES el tratamiento de la trombocitopenia, como el de la anemia hemoltica, s requiere corticoesteroides a dosis altas por tiempos variables y descensos lentos despus de la recuperacin, as como inmunosupresores u otras terapias como el danazol, la gamaglobulina endovenosa y, como medida extrema aunque no siempre efectiva, esplenectoma. El tratamiento preventivo de la trombosis por SAF es an muy imperfecto. Parece haber consenso, sin embargo, en que requiere anticoagulantes a dosis ajustadas para obtener una intensidad cercana al 3.0 de INR (international normalization ratio). Debe tomarse en cuenta que en presencia de anticoagulante lpico, el INR quiz

no refleje el real estado de anticoagulacin; por ello, se pueden determinar los niveles del factor X cromognico y del tiempo de protrombinaproconvertina. La decisin de iniciar tratamiento anticoagulante debe considerar el hecho de que puede necesitarse a largo plazo y tal vez de por vida. La suspensin de los anticoagulantes pide mucha prudencia, debe hacerse gradualmente y evitar la administracin de vitamina K, pues la suspensin repentina del tratamiento anticoagulante puede inducir hipercoagulabilidad generalizada grave.

LECTURAS SUGERIDAS Alarcn-Segovia, D.; Delez, M.; Oria, C.V.; Snchez-Guerrero, J.; Gmez-Pacheco, L.; Cabiedes, J.; Fernndez, L.; Ponce de Len, S., Antiphospholipid antibodies and the antiphospholipid syndrome in systemic lupus erythematosus. A prospective analysis of 500 consecutive patients, Medicine 1989; 68:353-365. Alarcn-Segovia, D.; Prez-Vzquez, M.E.; Villa, A.R.; Drenkard, C.; Cabiedes, J., Preliminary classification criteria for the antiphospholipid syndrome within systemic lupus erythematosus, Semin Arthritis Rheum 1992; 21:275-286. Alarcn-Segovia, D., On the catastrophic adjective for the antiphospholipid syndrome, Clin Exp Rheumatol 1993; 11:587-588. Amengual, O.; Atsumi, T.; Khamashta, M.; Hughes, G., Clinical significance of anti-B2 glycoprotein I antibodies, Ann Med Intern 1996; 147: 15-17. Asherson, R.A., The catastrophic antiphospholipid syndrome (Editorial), J Rheumatol 1992; 19:508-512. Cabiedes, J.; Cabral, A.; Alarcn-Segovia, D., Clinical manifestations of the antiphospholipid syndrome in patients with systemic lupus erythematosus associate more strongly with anti-2 glycoprotein 1 than with antiphospholipid antibodies, J Rheumatol 1995; 22: 1899-1906. Cabral, A.R.; Cabiedes J., Alarcn-Segovia, D., Hemolytic anemia related to an IgM autoantibody to phosphatidylcholine that binds in vitro to stored and to bromelain-treated erythrocytes, J Autoimmunity 1990; 3:773-787.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 26
CITOPENIAS INMUNES
Ivn Palomo G., Jaime Pereira G. y Marcela Vsquez R.

1. Introduccin 2. Anemias hemolticas inmunes 2.1. Sistemas antignicos de los glbulos rojos 2.2. Anemias hemolticas inmunes 2.2.1. Anemias hemolticas aloinmunes 2.2.2. Anemias hemolticas autoinmunes 3. Trombocitopenias inmunes 3.1. Sistemas antignicos de las plaquetas

3.2. Trombocitopenias inmunes 3.2.1. Trombocitopenias aloinmunes 3.2.2. Trombocitopenias autoinmunes 4. Neutropenias inmunes 4.1. Sistemas antignicos de los neutrofilos 4.2. Neutropenias inmunes 4.2.1. Neutropenias aloinmunes 4.2.2. Neutropenias autoinmunes

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RESUMEN Las citopenias (anemia, trombocitopenia y leucopenia) pueden estar asociadas a mecanismos inmunes. En este captulo se describen los antgenos ms relevantes de los glbulos rojos, plaquetas y neutrfilos y las citopenias mediadas por alo y autoanticuerpos en cada tipo celular. Se privilegia la informacin sobre fisiopatologa ms que sobre diagnstico y tratamiento.

1. INTRODUCCIN En general la disminucin de los glbulos rojos (anemias), de las plaquetas (trombocitopenia) y de los leucocitos (leucopenias) se asocian con dos mecanismos fisiopatolgicos: Disminucin de la produccin en la mdula sea y aumento de la destruccin a nivel perifrico. En este ltimo caso los eritrocitos, plaquetas y granulocitos pueden ser el blanco de anticuerpos (alo o autoanticuerpos) que promueven su destruccin o remocin acelerada desde la circulacin. En este captulo se aborda la fisiopatologa y se esboza el cuadro clnico, diagnstico y tratamiento de cada una de las citopenias inmunes: Anemias hemolticas inmunes, Trombocitopenias inmunes y Neutropenias inmunes.

2. ANEMIAS HEMOLTICAS INMUNES Los glbulos rojos son clulas anucleadas y bicncavas de, aproximadamente, 7,5 m de dimetro; tienen como funcin fundamental el transporte de oxgeno a los tejidos. Presentan una sobrevida de alrededor de 120 das, periodo despus del cual son retirados desde la circulacin por el Sistema Fagoctico Mononuclear (SFM). En condiciones normales la masa de glbulos rojos (hemates o eritrocitos) circulante permanece constante gracias a los mecanismos de control, los cuales estn finamente regulados para satisfacer los requerimientos corporales de oxgeno. Anemia, es un trmino usado para denotar una condicin asociada a la disminucin del nmero de eritrocitos y como consecuencia de la hemoglobina disponible para el transporte de

oxgeno. Las anemias pueden ser clasificadas en tres grupos de acuerdo al mecanismo que induce la disminucin de los eritrocitos: Anemias hipoproliferativas (disminucin en la produccin de hemates), Anemias hemolticas (destruccin aumentada de eritrocitos) y Anemias por hemorragias. En las Anemias Hemolticas (AH), la destruccin puede ocurrir intravascularmente o en el bazo y desde el punto de vista fisiopatolgico se les puede clasificar en dos grupos; AH intracorpusculares que corresponde a alteraciones propias de los hemates (membranopatas, enzimopatas y hemoglobinopatas) y AH extracorpusculares, en las cuales los glbulos rojos son normales y factores externos a la clula son los que inducen la hemlisis. Las AH extracorpusculares se pueden clasificar en: no inmunes (destruccin mecnica, agentes infecciosos, componentes plasmticos alterados y toxinas) e inmunes; en este ltimo grupo participan anticuerpos antieritrocitarios (alo o autoanticuerpos) que provocan las denominadas Anemias Hemolticas Inmunes (AHI). 2.1. Sistemas antignicos de los glbulos rojos Se han descrito ms de 250 antgenos eritrocitarios que se agrupan en 25 sistemas sanguneos, 7 colecciones y 2 series. Los antgenos eritrocitarios residen en molculas de diversa estructura y funcin. Alguno de ellos adems de expresarse en glbulos rojos lo hacen en tejidos no eritroides; en la mayora de los casos el rol biolgico sobre las clulas es desconocido. La bioqumica y la gentica molecular han permitido establecer la estructura y gentica de la mayora de estos antgenos.

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Los sistemas sanguneos pueden ser divididos de acuerdo a la naturaleza bioqumica de los antgenos. Tambin se les puede clasificar de acuerdo a la funcin del producto gnico que da origen al antgeno, en cinco categoras (tabla 261). Recientemente se han incorporado algunos de los antgenos eritrocitarios a la nomenclatura CD ("cluster of diferentiation"). Sistema ABO. El sistema ABO sigue siendo el ms importante en la prctica transfusional, la

especificidad antignica reside en estructuras oligosacridas, producto de la accin de varias glicosiltransferasas que actan secuencialmente sobre el tetrasacrido precursor o paraglobsido. La sntesis de estos antgenos requiere de la accin de enzimas codificadas por genes ubicados en los cromosomas 9 (ABO) y 19 (H). En 1990 se dilucidaron las bases genticas de los tres principales alelos del locus ABO. Los antgenos del sistema han sido identificados en glbulos rojos, en secreciones y sobre la mem-

Tabla 26-1. Clasificacin funcional de los productos gnicos de sistemas sanguneos Funcin Transporte o canales Sistema (smbolo ISBT)* Rh (RH) Kidd (JK) Diego(DI) Colton (CO) Kx (XK) MNSs (MNS) P (P1) Duffy (FY) Cromer (CROMER) Knops (KN) Lutheran (LU) Xg (XG) Landsteiner-Wiener (LW) Indian (IN) ABO (ABO) Kell (KEL) Lewis (LE) Yt (YT) Hh (H) Gerbich (GE) Nmero de antgenos 51 3 18 3 1 42 1 6 10 5 20 1 3 2 Nomenclatura CD CD240 CD233

Receptores

CD235 CD234 CD55

Adhesin

CD242 CD44

Enzimas

4 26 6 2 1 7

CD238 CD174 CD173 CD236

Protenas Estructurales Otros

Scianna (SC) Dombrock (DO) Chido/Roger (CH/RG) OK Raph

3 5 9

* ISBT = International Society of Blood Transfusion

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brana de clulas epiteliales y endoteliales. Adems, estructuras antignicas similares han sido detectadas en diversos organismos tales como microorganismos y plantas. La estructura ms detallada de los antgenos de este sistema sanguneo se ha mostrado en el captulo 5. Sistema Rh. El sistema Rh es el ms polimrfico e inmunognico de los sistemas sanguneos humanos y el segundo en importancia clnica. El sistema est compuesto por aproximadamente 50 antgenos, los cuales son codificados por 2 genes estrechamente unidos, ubicados en el cromosoma 1; uno de ellos codifica la protena RhD que expresa el antgeno D y sus variantes, y el otro codifica la protena RhCE que expresa los antgenos C, c, E, e y sus variantes. Las protenas RhD y RhCE tienen pesos moleculares que fluctan de 30 a 34 kDa (figura 26-1). Se ha descrito la glicoproteina Rh 50, llamada glicoprotena asociada al Rh (RhAG, CD241), codificada por un gen ubicado en el cromosoma 6 y que sera esencial para el ensamblaje de las protenas Rh en la membrana eritrocitaria, as como para la inmunogenicidad. Existe adems un grupo de "protenas accesorias del Rh" conformadas por un grupo de otras glicoprotenas (glicoprotena LW, glicoforina B, banda 3, protenas asociadas a integrinas y glicoprotena Duffy); por esta razn se considera al sistema Rh como un "complejo de protenas Rh". Las protenas RhD y RhCE tienen un 92% de homologa entre s y una homologa del 38,5% y 39.2% con la RhAG respectivamente, adems ellas muestran una gran similitud en la topologa, por ejemplo todas presentan 12 regiones transmembrana, sugiriendo que todas pertenecen a una misma familia de protenas. El antgeno D es el ms importante del sistema. En la poblacin blanca aproximadamente el 15% de los individuos son designados como Rh negativos por carecer de la protena D en sus glbulos rojos, y el 80% de ellos se aloinmunizan en respuesta al contacto con eritrocitos Rh positivos. Estos aloanticuerpos son usualmente del tipo IgG y pueden causar reacciones hemolticas (ver punto 2.2.1). Los dems sistemas sanguneos cobran importancia clnica en la medida en que los anticuerpos desarrollados causen reacciones hemolticas transfusionales o enfermedad hemoltica del recin nacido. La especificidad de los anticuerpos que ms frecuentemente causan

Figura 26-1. Topologa de las protenas RhD, RhCE y glicoprotena Rh50 (RhAG). Las protenas del sistema Rh presentan doce regiones transmembrana. Los crculos indican los 35 aminocidos diferentes entre la protena D y la CE. En la protena CE se indican los aminocidos en posicin 103 y 226 donde radica el polimorfismo C/c y E/e, respectivamente.

estos cuadros clnicos son para antgenos de los sistemas Kell, Duffy, Kidd y MNS. 2.2. Anemias Hemolticas Inmunes (AHI) Las Anemias Hemolticas Inmunes (AHI) se pueden agrupar segn participen alo o autoanticuerpos (tabla 26-2). Las Anemias Hemolticas Aloinmunes, son producidas por anticuerpos que aparecen en una persona que se expone a antgenos encontrados en la misma especie, pero que no estn presentes en sus propias clulas. Por su parte las Anemias Hemolticas Autoimunes se producen por alteraciones del sistema inmune que inducen la formacin de autoanticuerpos (ver captulo 23).

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Tabla 26-2. Clasificacin de la Anemias Hemolticas Inmunes Anemias hemolticas aloinmunes Enfermedad hemoltica del recin nacido Reaccin hemoltica transfusional Anemias hemolticas autoinmunes Por anticuerpos calientes Primaria Secundaria Sndromes linfoproliferativos Mesenquimopatas Infecciones virales Enfermedades inmunolgicas Por anticuerpos fros Enfermedad de las aglutininas fras Hemoglobinuria paroxstica a frigori Inducidas por drogas

2.2.1. Anemias Hemolticas Aloinmunes Dos son las AHI cuyo mecanismo est mediado por aloanticuerpos, la Enfermedad Hemoltica del Recin Nacido (EHRN) y las Reacciones Hemolticas Transfusionales. a) Enfermedad hemoltica del recin nacido La EHRN es una condicin en la cual los glbulos rojos del feto o del neonato son destruidos por anticuerpos maternos, dirigidos contra un antgeno presente en sus glbulos rojos, el cual es heredado del padre. Solamente los anticuerpos IgG son transportados activamente a travs de la placenta y por lo tanto capaces de sensibilizar los glbulos rojos fetales que posteriormente son retirados por el sistema fagoctico mononuclear (SFM). Los aloanticuerpos maternos pueden haberse generado por embarazos o transfusiones previas. La incompatibilidad ABO es la causa ms comn de EHRN, la que usualmente es leve, mientras que el anti-D es el anticuerpo asociado con la mayora de los casos de EHRN moderada a severa. Anticuerpos con otras especificidades tambin pueden causar esta enfermedad. Sin embargo, cuando la madre es ABO incompatible con el feto, disminuye la incidencia de inmunizacin frente

al antgeno D del sistema Rh, dado que los hemates fetales Rh positivos, ABO incompatibles, seran rpidamente hemolisados en la circulacin materna por accin de los anticuerpos naturales, antes que el antgeno D estimule al sistema inmune materno. El neonato que sufre EHRN presenta anemia, ictericia y hepatoesplenomegalia; el grado de ictericia se correlaciona con la severidad de anemia. El diagnstico se basa en la deteccin prenatal de anticuerpos maternos mediante la prueba de antiglobulina indirecta (PAI) Estudios de ultrasonido (ecografas) y el nivel de bilirrubina en lquido amnitico pueden ayudar a predecir la severidad de la enfermedad y a orientar el manejo obsttrico de las embarazadas. En la etapa postnatal, el estudio de sangre de cordn permite detectar la anemia, reticulocitosis y presencia de eritroblastos; la prueba de antiglobulina directa (PAD) suele ser positiva. El tratamiento en el perodo prenatal, si no es posible interrumpir el embarazo, es la transfusin intrauterina siempre que se cumplan determinadas condiciones. En el perodo postnatal, se utiliza la fototerapia si la hiperbilirrubinemia es leve y en casos ms graves se recurre al recambio sanguneo. Para la prevencin de la EHRN inducida por anti-D, existen protocolos de profilaxis bien establecidos que consisten en la inmunizacin pasiva de madres Rh negativas, con anticuerpos anti-D comerciales (Rho IgG), cuyo objetivo es prevenir que clulas Rh positivas del feto o recin nacido estimule la respuesta inmune materna y que los anticuerpos formados ocasionen problemas en embarazos futuros. b) Reaccin hemoltica transfusional Una reaccin hemoltica transfusional ocurre con posterioridad a la transfusin de glbulos rojos portadores de antgenos extraos para el sistema inmune del receptor, frente a los cuales ste est aloinmunizado. De acuerdo al momento de aparicin de los sntomas, stas se clasifican como inmediatas o tardas. Reaccin hemoltica transfusional inmediata. Este tipo de reacciones ocurre cuando los anticuerpos estn presentes en el plasma del paciente en ttulos altos. La causa ms comn de este tipo de reaccin es la incompatibilidad ABO, la que ocasiona el 86% de las muertes por reaccio-

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nes hemolticas transfusionales. Tambin pueden estar involucrados anticuerpos con especificidades anti-Kell, anti-Jka y anti-Fya. Los anticuerpos que ocasionan estas reacciones son principalmente de clase IgM, ellos reaccionan con su antgeno especfico activando el sistema del complemento (ver captulo 18), la coagulacin y el sistema de las cininas. La activacin del complemento induce la formacin el complejo de ataque a membrana (C5b6789) que provoca hemlisis intravascular en forma inmediata, con liberacin de hemoglobina, estroma y enzimas eritrocitarias. Producto de la activacin del complemento tambin se libera C3a y C5a que actan como potentes anafilotoxinas, responsables de los sntomas de fiebre, escalofros, hipotensin y shock. El estroma eritrocitario contiene sustancias tromboplsticas que activan la cascada de la coagulacin induciendo Coagulacin Intravascular Diseminada (CID). El complejo antgeno-anticuerpo formado, tambin activa el sistema de las cininas, liberando bradicinina, la que provoca hipotensin y liberacin de catecolaminas que causan vasoconstriccin en rganos tales como el rin; esto sumado a la hipotensin y a la CID, inducen un cuadro de insuficiencia renal aguda. Reaccin hemoltica transfusional tarda. Las reacciones hemolticas transfusionales tardas son ms leves que las inmediatas. Se producen cuando el ttulo de los aloanticuerpos presentes en el suero es bajo no siendo detectados por las pruebas pre-transfusionales, luego de la transfusin de sangre incompatible la respuesta anamnstica hace aumentar rpidamente los ttulos del anticuerpo. Los glbulos rojos transfundidos sufren hemlisis extravascular porque se sensibilizan con anticuerpos IgG o fracciones del complemento, siendo secuestrados por los macrfagos hepticos o esplnicos. Los anticuerpos estn dirigidos contra antgenos de los sistemas Kell, Rh (D, E y c), Duffy y Kidd. Este tipo de reacciones transfusionales se presenta con una incidencia de 1 en 3.200 transfusiones. Los pacientes pueden presentar fiebre moderada con escalofros, ictericia leve, eventualmente se puede presentar hemoglobinemia y hemoglobinuria. Para el diagnstico es necesario una muestra postransfusional en la cual se detectar anemia, hiperbilirrubinemia y una PAD positiva. Debido a que este tipo de reacciones ocurre por una respuesta inmune secundaria, resulta de

gran importancia en su prevencin, considerar el historial transfusional, de trasplantes y de embarazos del paciente. 2.2.2. Anemias Hemolticas Autoinmunes Una de las formas ms usadas en la clasificacin de las Anemias Hemolticas Autoinmunes (AHAI) es de acuerdo a la temperatura en que actan los anticuerpos involucrados; as se distinguen las AHAI por anticuerpos calientes y AHAI por anticuerpos fros. Adicionalmente se incluyen en este grupo las AHAI inducidas por frmacos. a) AHAI por anticuerpos calientes El 70-75% de las anemias hemolticas autoinmunes son provocadas por anticuerpos calientes; se presentan a cualquier edad y afectan con mayor frecuencia a las mujeres. De ellas aproximadamente el 30% son de origen idioptico y el 70% restante son secundarias a otras enfermedades, tales como sndromes linfoproliferativos, enfermedades autoinmunes e infecciones (tabla 26-2). La destruccin eritrocitaria ocurre como consecuencia de la fagocitosis de los glbulos rojos sensibilizados con autoanticuerpos IgG. Los responsables de la eritrofagocitosis son macrfagos (presentan receptores para Fc de IgG: FcR), principalmente esplnicos; por ello la hemlisis es de tipo extravascular y como consecuencia se observa hiperbilirrubinemia. La PAD suele ser positiva en la mayora de los casos, confirmando la presencia de glbulos rojos sensibilizados con IgG y en algunos casos, adicionalmente, con fracciones del complemento; la PAI puede ser positiva cuando hay una hemlisis activa. En caso de existir una enfermedad asociada a la AHAI, el tratamiento de sta puede revertir el proceso hemoltico. Adems se requiere el uso de corticoesteroides, los que actan inhibiendo la sntesis de anticuerpos y la fagocitosis de hemates. La esplenectoma est indicada en casos de fracaso a otros tratamientos. b) AHAI por anticuerpos fros Entre las AHAI por anticuerpos fros se reconocen dos cuadros clnicos, Enfermedad de las aglutininas fras y Hemoglobinuria paroxstica a frigori.

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Enfermedad de las aglutininas fras. La enfermedad por aglutininas fras representa aproximadamente el 15% de las AHAI. Esta anemia puede ser idioptica o secundaria a infeccin por Mycoplasma pneumoniae o Virus de Epstein Barr (Mononucleosis infecciosa). La especificidad de estas crioaglutininas es anti-I en un 90% y anti-i en un 8%. En su patogenia participan anticuerpos IgM, que a temperaturas entre 10 y 30C se unen a los glbulos rojos e inducen hemlisis (principalmente intravascular) mediada por complemento. Los episodios de hemlisis ocurren despus de la exposicin a temperaturas bajas que provocan la aglutinacin de los glbulos rojos con obstruccin de la circulacin capilar que se manifiesta por una coloracin azul o roja de las extremidades (fenmeno de Raynaud). En el laboratorio es posible evidenciar aglutinacin de los glbulos rojos a temperatura ambiente, adems se encuentra positiva la PAD, habitualmente por complemento (ttulo del anticuerpo mayor a 1:1000 a 4C). En la enfermedad idioptica no hay tratamiento especfico, salvo que el paciente se mantenga en ambiente temperado. Dado que casi la totalidad de la IgM se encuentra en circulacin, en caso de ser necesario se realiza plasmafresis. Cuando el cuadro hemoltico es secundario a otra enfermedad, generalmente ceder al ser tratada la patologa de base. Hemoglobinuria paroxstica a frigori. Esta enfermedad cuya incidencia no supera el 2%, se produce por la unin a los eritrocitos, despus de la exposicin al fro, del autoanticuerpo de DonathLandsteiner, una autohemolisina bifsica de clase IgG. Los hemates sensibilizados fijan complemento, sistema que se activa al aumentar la temperatura en la circulacin general, provocando hemlisis intravascular. La especificidad principal de los autoanticuerpos es anti-P, pero tambin se han descrito especificidades anti-i y anti-Pr. Esta enfermedad puede tener una etiologa idioptica y secundarios a infecciones virales en nios y a sfilis no tratada en adultos. La prueba de Donath-Landsteiner es positiva y permite pesquisar la hemolisina bifsica. La PAD es positiva y la PAI puede serlo si se realiza a 4C. c) AHAI inducida por frmacos Este tipo de anemias hemolticas se produce

como consecuencia de una reaccin autoinmune tras la administracin de ciertos frmacos. Las AHAI inducidas por frmacos representan entre el 10-20% de las AHAI. Existen tres mecanismos principales por los cuales las drogas pueden inducir la formacin de los anticuerpos asociados a AHAI (figura 26-2). Complejos inmunes. El frmaco se une a protenas plasmticas y estimula la formacin de un anticuerpo anti-droga , el complejo inmune formado, se une inespecficamente al glbulo rojo u otras clulas por su regin Fab conformando un complejo trimolecular (droga-anticuerpo-antgeno de membrana) capaz de activar el complemento con la consiguiente hemlisis intravascular. La droga interactuara de forma no covalente con componentes de membrana generando un neoantgeno que estimulara al sistema inmune. La primera droga que se relacion con este mecanismo, tambin llamado "espectador inocente" fue estibofeno, posteriormente tambin se han descrito otros frmacos, entre ellos: quinidina, quinina, cefotaxima, clorambucil, clorpromacina, isoniacida, rifampicina, sulfonamidas y tiazidas. En el laboratorio se puede encontrar la PAD positiva y la PAI negativa. En esta ltima situacin la prueba puede ser positiva si se preincuba el suero del paciente y los hemates, en presencia de la droga y complemento. Adsorcin de droga (hapteno). El frmaco o alguno de sus metabolitos se fija inespecficamente a la superficie del eritrocito e induce la produccin de anticuerpos IgG anti-droga, los cuales se unen a los glbulos rojos cubiertos con la droga para posteriormente ser secuestrados por el SFM. Este mecanismo se presenta en pacientes que han recibido altas dosis del frmaco. La droga ms caracterstica de este mecanismo es la penicilina; se ha descrito tambin en cefalosporinas y tetraciclinas. Esta anemia cursa con la PAD positiva y la PAI negativa. Es posible confirmar la presencia del autoanticuerpo si los hemates a emplear se sensibilizan con la droga, antes de hacerlos reaccionar con el suero del paciente. Formacin de autoanticuerpos. En este mecanismo la droga induce la formacin de autoanticuerpos IgG que reconocen antgenos eritrocitarios (principalmente antgenos del sistema Rh), sin necesidad de que el frmaco est uni-

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Figura 26-2. Mecanismos de las Anemias hemolticas autoinmunes (AHAI) inducidas por frmacos. Se han descrito tres mecanismos por los cuales los frmacos pueden inducir AHAI: Tipo complejos inmunes, Adsorcin de drogas (hapteno) y Formacin de autoanticuerpos. Las drogas ms representativas de cada mecanismo son estibofeno (droga a), penicilina (droga b) y alfametildopa (droga c), respectivamente.

do a los hemates. La droga ms representativa de este mecanismo es la alfa-metildopa, pero tambin se incluyen levadopa, procainamida y drogas antiinflamatorias no esteroidales. En el laboratorio es posible encontrar la PAD y la PAI positivas.

3. TROMBOCITOPENIAS INMUNES Desde 1950 se sabe que las plaquetas pueden ser destruidas por procesos de tipo inmunolgico. Sin embargo, el progreso para entender la patogenia de las trombocitopenias inmunes se vio retardado por problemas metodolgicos inherentes al estudio de la interaccin plaquetas-

inmunoglobulinas. Avances en el estudio de laboratorio han llevado en los ltimos 15 aos a una explosin de informacin nueva acerca de estas patologas y al reconocimiento que las plaquetas pueden ser destruidas por aloanticuerpos, autoanticuerpos y probablemente complejos inmunes en diferentes situaciones patolgicas. Las plaquetas son elementos celulares anucleados que se originan por fragmentacin del citoplasma de los megacariocitos en la mdula sea, desde donde pasan a la circulacin y viven por 8 a 10 das antes de ser removidas por el SFM. Miden entre 1,5 a 3 m de dimetro y en reposo presentan una forma discoide. Las plaquetas juegan un papel fundamental en las etapas iniciales del proceso hemosttico (hemostasia primaria);

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esta funcin la cumplen gracias a las propiedades de adhesin, agregacin, secrecin del contenido de sus grnulos y expresin de superficie procoagulante. La ocurrencia coordinada y regulada de estos procesos determina la formacin del tapn plaquetario sobre el cual actan los factores plasmticos de la coagulacin para formar el tapn hemosttico o trombo. 3.1. Sistemas antignicos de las plaquetas La membrana plaquetaria presenta glicoprotenas (GP) que son fundamentales en los aspectos inmunolgicos asociados a las plaquetas, ya sea como receptores inmunes especficos o como blancos altamente inmunognicos. Estas glicoprotenas son a su vez receptores funcionales que participan en las reacciones de adhesin y agregacin durante el proceso hemosttico. En la tabla 26-3 se muestran las principales glicoprotenas y sus caractersticas.

agregacin plaquetaria mediada por fibringeno. El complejo heterodimrico GPIIb-IIIa (CD41-CD61), es la protena ms abundante de la superficie de las plaquetas, representando alrededor del 15% de la masa proteica de la membrana con alrededor de 40.000-50.000 copias expresadas por las plaquetas normales en reposo. Debido a que su activacin la transforma en el receptor de fibringeno, su papel en la agregacin plaquetaria es fundamental. Adems de las integrinas, las plaquetas poseen otro receptor glicoproteico de membrana, la GPIb-IX (CD42b.c-CD42a), que pertenece a la familia de "protenas ricas en leucina". Este complejo constituye el receptor para el factor von Willebrand (FvW), considerado el mayor responsable de la unin de las plaquetas a la matriz extracelular. La GPIb-IX en la membrana plaquetaria forma un complejo con la GPV; cada plaqueta contiene 20.000-30.000 molculas del complejo en su superficie.

Tabla 26-3. Caractersticas de las glicoprotenas de membrana de las plaquetas Glicoprotena Integrina Peso molecular no reducido (kDa) 150/130 148/130 148/130 145/95 Funcin en las plaquetas

Ia/IIa Ic/IIa Ic/IIa IIb/IIIa

21 5 1 6 1 IIb/3

Receptor de colgeno Receptor de fibronectina Receptor de laminina Receptor de fibringeno, vitronectina, Factor von Willebrand, fibronectina Receptor del factor von Willebrand Receptor de colgeno y trombospondina Sustrato de trombina Principal receptor de colgeno

Ib/IX IV V VI

160/17 85 82 58

Al menos cinco glicoprotenas pertenecen a la familia de molculas de adhesin Integrinas: el receptor de colgeno Ia-IIa, el receptor de fibronectina Ic-IIa, el receptor de laminina Ic'-IIa, el receptor de vitronectina VnR-IIIa y el receptor activacin-dependiente IIb-IIIa, responsable de la

El complejo GPIa-IIa (CD49b-CD29), formado por cadenas nicas de 167 y 157 kDa, respectivamente, ha sido demostrado como uno de los receptores que median la interaccin de las plaquetas con el colgeno, a travs de la GPla. Las glicoprotenas de la membrana

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plaquetaria han demostrado ser estructuras altamente polimrficas, por lo que aparte de ser importantes receptores fisiolgicos, constituyen estructuras en las que residen sistemas antignicos especficos. Los antgenos plaquetarios pueden ser divididos en dos grupos: (a) Aloantgenos compartidos con otras clulas sanguneas (Ej. Antgenos de los sistemas ABH, Lewis), y clulas de otros tejidos (molculas HLA clase I; HLA: Human Leukocyte Antigen) y (b) Aloantgenos plaquetarios especficos. Aloantgenos compartidos con otras clulas sanguneas Antgenos ABH, Lewis, 1 y P. Los antgenos de grupo sanguneo A y B han sido demostrados en plaquetas, por serologa convencional, por ms de 50 aos. Su importancia clnica se circunscribe a un efecto muy discreto sobre la recuperacin de las plaquetas en el caso de transfusin de plaquetas ABO incompatibles. Se ha descrito tambin que la administracin crnica de plaquetas ABO incompatibles se asocia a mayor tasa de refractariedad a la transfusin de plaquetas. Antgenos HLA. Las plaquetas poseen molculas HLA clase I, pero no clase II. Cerca del 73% del total de los antgenos HLA-A y B presentes en sangre total, estn contenidos en las plaquetas. stas contienen 10.000-20.000 molculas/clula, cifra inferior a la encontrada en linfocitos (>100.000/clula). Los antgenos HLA-C, generalmente se expresan dbilmente. Estudios muestran que la mayor parte de los antgenos HLA clase I son sintetizados endgenamente y son constituyentes de la membrana; pero esto no excluye la posibilidad que una pequea proporcin de antgeno HLA sea adsorbida pasivamente por la superficie plaquetaria desde el plasma. Los antgenos HLA sobre la superficie de las plaquetas constituyen los blancos principales de los aloanticuerpos encontrados en pacientes politransfundidos, lo que se define como refractariedad inmune a la transfusin de plaquetas. Aloantgenos plaquetarios especficos Nomenclatura. Histricamente, a los antgenos

plaquetarios especficos se les asign un nombre basado en aquel del paciente en el cual fue descrito por primera vez. A medida que aument el nmero de antisueros descritos, la confusin de nombres hizo necesario adoptar un sistema simplificado el cual fue propuesto por el ICSH/ISBT (International Committee for Standarization in Hematology/International Society of Blood Transfusion). En este sistema, a cada aloantgeno se le asign un nmero HPA (Human Platelet Antigen) en orden cronolgico de descripcin. Cada sistema HPA representa un polimorfismo biallico debido a una sustitucin de un par de bases en el gen y como consecuencia una diferencia de un aminocido en la protena madura. La anotacin a corresponde siempre al alelo de mayor frecuencia y la w representa una asignacin provisoria hasta que se describan los dos alelos del sistema. Caractersticas. La tabla 26-4 muestra los antgenos plaquetarios especficos descritos hasta ahora, su localizacin y base molecular. La GP ms polimrfica es la GPIIIa, en la cual se han descrito al menos 8 antgenos diferentes. La figura 26-3 muestra un esquema de las GPIIb-IIIa y la GPIb-IX, en las que se indica la ubicacin aproximada de los HPA ms importantes y los sectores donde se han ubicado autoantgenos. 3.2. Trombocitopenias inmunes Las plaquetas pueden ser destruidas por mecanismos inmunes en los que pueden participar aloanticuerpos, autoanticuerpos, anticuerpos dependientes de droga y posiblemente complejos inmunes. El denominador comn de todos estos procesos es una remocin acelerada de las plaquetas de la circulacin y acortamiento de la supervivencia, que se traduce en una disminucin del nmero de plaquetas circulantes (trombocitopenia) cuando sobrepasa la capacidad de la mdula sea de responder a la mayor demanda. En la tabla 26-5 se muestra los diferentes tipos de trombocitopenias inmunes, clasificadas segn el tipo de anticuerpo responsable.

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Tabla 26-4. Caractersticas de los aloantgenos plaquetarios especficos Frecuencia fenotpica (%)* 97.9 28.8 99.3 14.6 80.9 69.8 > 99.9 < 0.1 99.0 19.7 2.4 0.2 < 0.01 0.6 < 1.6 < 0.25 0.4 0.25

Sistema HPA-1 HPA-2 HPA-3 HPA-4 HPA-5 HPA-6w HPA-7w HPA-8w HPA-9w HPA-10

Alelos HPA-1a HPA-1b HPA-2a HPA-2b HPA-3a HPA-3b HPA-4a HPA-4b HPA-5a HPA-5b HPA-6bw HPA-7bw

Sinnimos PlA1, Zwa PlA2, Zwb Kob, Sibb Koa, Siba Leka, Baka Lekb, Bakb Pena, Yukb Penb, Yuka Brb Bra Caa, Tua Mo
a

Localizacin GPIIIa GPIb GPIIb GPIIIa GPIa GPIIIa GPIIIa GPIIIa GPIIb GPIIIa GPIIIa GIb GPIa

Base molecular Leu33Pro33 Thre145Met145 Ile843Ser843 Arg143Glu143 Gln505Lys505 Arg489Glu489 Pro407Ala407 Arg636Glu636 Val837Met837 Arg62Glu62 Arg633His633 Gly15Gln15 Thre799Met799

HPA-8bw Sr HPA-9bw Maxa HPA-10bw Laa Groa Iya Sita

*Frecuencia fenotpica de la poblacin caucsica.

Figura 26.3. Esquema de las GPIIb-IIIa, GPIb-IX y GPIa-IIa. Se muestra los principales HPA (Human Platelet Antigen) y las regiones reconocidas como autoantgenos.

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Tabla 26-5. Trombocitopenias inmunes Trombocitopenias aloinmunes Prpura aloinmune neonatal Prpura post-transfusional Trombocitopenias autoinmunes Prpura trombocitopnico inmune primario Agudo Crnico Trombocitopenias inmunes secundarias Enfermedades autoinmunes Generalizadas (Ej. Lupus Eritematoso Sistmico) rgano especfico (Ej. Tiroiditis) Enfermedades linfoproliferativas Leucemia linftica crnica Linfomas Mieloma mltiple Tumores slidos Infeccin por HIV Post-transplante de mdula sea Infecciones virales Frmacos

equimosis) y sangrado mucoso que se manifiesta en las primeras horas de vida. En la mayora de los casos el PAIN es una enfermedad benigna autolimitada, que remite espontneamente entre 2-15 das; sin embargo, en casos graves puede observarse hemorragia visceral e intracraneana. Esta ltima complicacin se puede presentar en forma antenatal o perinatal en un 10 a 20% de los pacientes con PAIN, lo que puede causar dao neurolgico e incluso la muerte. Patogenia. El PAIN es causado por la transferencia materno-fetal de aloanticuerpos especficos para los aloantgenos plaquetarios HPA-1b, HPA2a, HPA-3a, HPA-3b, HPA-4a, HP-A4b, HPA-5a, HPA-5b y los antgenos de baja frecuencia HPA6w a HPA-10, Groa, Iya y Sita. Alrededor del 50% de los casos de PAIN en las poblaciones caucsicas son el resultado de una incompatibilidad en el sistema HPA-1; incompatibilidad que compromete el sistema HPA-5 es la segunda causa en estas poblaciones. A pesar que es muy frecuente encontrar anticuerpos anti-HLA en las embarazadas, su papel en la patogenia del PAIN es debatido y solamente 2 casos que pueden corresponder a PAIN secundario a anticuerpos anti-HLA-A2 han sido descritos. Evaluacin de laboratorio. En el diagnstico biolgico de las trombocitopenias inmunes en general, se utilizan pruebas comunes a toda trombocitopenia y mtodos que permiten estudiar el carcter inmunolgico de su patogenia: a) Pruebas generales. El recuento de plaquetas, hemograma y mielograma se usa al iniciar la investigacin diagnstica de la mayora de las trombocitopenias. El estudio de sobrevida plaquetaria, de uso excepcional en clnica, requiere marcar in vitro plaquetas del paciente con 51Cr o 111 In; permite estudiar la sobrevida plaquetaria y el o los rganos en que las plaquetas son secuestradas. b) Estudio inmunolgico. Entre los mtodos inmunolgicos ms importantes para el estudio de las trombocitopenias inmunes estn aquellos que permiten pesquisar anticuerpos antiplaquetarios sin estudio de especificidad (IgG asociada a plaquetas y anticuerpos antiplaquetarios circulantes) y los que s permiten estudiar la especificidad de dichos anticuerpos. A continuacin se describen los principios de los

3.2.1. Trombocitopenias aloinmunes Los aloantgenos plaquetarios especficos y polimorfismos de las glicoprotenas de membrana juegan un papel clave en la patogenia de diferentes entidades clnicas como el Prpura aloinmune neonatal, Prpura postransfusional y Refractariedad a la transfusin de plaquetas. Prpura aloinmune neonatal El Prpura aloinmune neonatal (PAIN) es una incompatibilidad feto-materna causada por aloinmunizacin de la madre a antgenos plaquetarios fetales. Su incidencia es de alrededor de 1:2.000 a 1:3.000 embarazos y a diferencia de la enfermedad hemoltica del recin nacido, puede presentarse hasta en un 30% de los casos durante el primer embarazo. El PAIN se presenta tpicamente como una trombocitopenia aislada en un recin nacido (RN) aparentemente sano. En aquellos RN con trombocitopenia ms profunda se puede encontrar sangrado cutneo (petequias y

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mtodos ms usados: IgG asociada a plaquetas y anticuerpos antiplaquetarios circulantes. El estudio inmunolgico inicial tiene como objetivo demostrar IgG asociada a las plaquetas (PAIgG) o anticuerpos antiplaquetarios circulantes (AcAP). Para medir la PAIgG existe un gran nmero de tcnicas que permiten cuantificar la IgG presente en la superficie plaquetaria, o la IgG total si las plaquetas son previamente solubilizadas. Para la determinacin de la PAIgG de superficie, lo ms frecuente es utilizar pruebas de unin directa de un anticuerpo anti-IgG humana marcado con radioistopo enzima o fluorescena; la cantidad de IgG asociada a las plaquetas es directamente proporcional a la cantidad de ligando marcado que permanece unido a las plaquetas. Para la pesquisa de AcAP se utilizan, los mismos mtodos en forma indirecta. Mtodos para estudio de especificidad antignica. Estos mtodos son capaces de identificar la glicoprotena plaquetaria especfica a la que se une el anticuerpo, pero no cuantifica la cantidad de IgG unida. Se han descrito varios mtodos: Western Blot ("Immunoblotting"), Inmunoprecipitacin y las tcnicas de ELISA con captura de antgeno. Estas ltimas son los que se utilizan ms ampliamente en el estudio de especificidad antignica de las citopenias inmunes de distinta etiologa.

vadas para liberarlas de anticuerpos que contiene el plasma. El uso de altas dosis de IgG endovenosa, puede servir como tratamiento de emergencia si no hay plaquetas disponibles. El tratamiento puede ser pre y/o postnatal; en el primer caso la transfusin de plaquetas es intrauterina. Prpura Post-transfusional El Prpura Post-transfusional (PPT) se caracteriza por trombocitopenia aguda, grave que ocurre aproximadamente 5-10 das despus de una transfusin sangunea. Su incidencia se desconoce, aunque es una condicin muy poco frecuente. La transfusin que gatilla esta condicin puede ser de cualquier hemocomponente y habitualmente se acompaa de una reaccin transfusional febril. En el suero del paciente se encuentran potentes anticuerpos antiplaquetarios, sobre el 80% de los casos con especificidad anti-HPA-1a. La patogenia es desconocida pero se han propuesto tres teoras para explicar la destruccin de las plaquetas autlogas gatillada por la transfusin: (a) unin de antgeno soluble presente en el producto sanguneo (b) unin de complejo inmune compuesto por aloantgeno/aloanticuerpo y (c) produccin de autoanticuerpos por reactividad cruzada. Para el diagnstico se debe demostrar el anticuerpo en el suero del paciente; el hallazgo de una trombocitopenia grave y anticuerpos antiplaquetarios especficos, especialmente anti-HPA-1a, hace muy probable el diagnstico de PPT. Refractariedad a la transfusin de plaquetas La Refractariedad a la transfusin de plaquetas (RTP) se define como un aumento insuficiente e inesperado del recuento de plaquetas post-transfusional. En la mayora de los casos la remocin prematura de las plaquetas transfundidas obedece a causas no inmunes tales como septicemia, hemorragia activa, uso de drogas, esplenomegalia y edad de las plaquetas transfundidas. Cuando la causa de la RTP es una aloinmunizacin, en la mayora de los casos (>75%) los anticuerpos reaccionan con determinantes expresados por las molculas HLA presentes sobre la superficie de las plaquetas. En estudios prospectivos no ms del 10% de los casos de RTP ha sido el resultado de anticuerpos antiplaquetarios especficos. El diagnstico de esta condicin se basa en la demostracin de estos anticuerpos en el suero del paciente (ver en punto 3.2.1: Evaluacin de laboratorio).

En casos con sospecha clnica de PAIN el estudio inicial de laboratorio debe incluir la pesquisa de anticuerpos antiplaquetarios, idealmente usando plaquetas del padre del RN para incluir antgenos de baja frecuencia. El hallazgo de anticuerpos antiplaquetarios obliga a su identificacin, para lo cual se utilizan paneles de plaquetas tipificadas en ensayos de ELISA con captura de antgenos. La incompatibilidad antignica se demuestra mediante tipificacin de los antgenos plaquetarios, lo que actualmente se hace mediante biologa molecular. Tratamiento. Al igual que en otras incompatibilidades maternofetales en el PAIN, se debe proporcionar plaquetas antgeno-negativas de la madre o de donantes fenotipificados negativos. Las plaquetas usadas en la transfusin deben ser la-

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3.2.2. Trombocitopenias autoinmunes Prpura trombocitopnico autoinmune primario El Prpura trombocitopnico autoinmune primario (PTI) es una de las causas ms frecuentes de trombocitopenia aislada encontrada en la prctica mdica. La enfermedad es causada por autoanticuerpos que se unen a estructuras de la membrana plaquetaria, acortando su supervivencia. La presentacin clnica es muy variable desde casos agudos, muy sintomticos a hallazgos incidentales de trombocitopenia asintomtica. Debido a sus diferencias clnicas, de manejo y posiblemente fisiopatolgicas, se discutir en forma separada el PTI crnico del adulto, del PTI agudo, cuadro este ltimo que se presenta, fundamentalmente, en nios. a) PTI crnico del adulto Cuadro clnico. El PTI del adulto se presenta ms frecuentemente en mujeres entre la 3 y 4 dcada de la vida, aunque puede ocurrir a cualquier edad en hombres y mujeres. La manifestacin clnica ms caracterstica es el prpura, trmino que denota el sangrado de piel y mucosas. Patogenia. En el PTI crnico las plaquetas son sensibilizadas por autoanticuerpos, predominantemente de clase IgG, con menor frecuencia IgM y ocasionalmente IgA. La destruccin plaquetaria por autoanticuerpos IgG es similar a la fagocitosis extravascular (esplnica) de glbulos rojos, mediada por IgG. El bazo es tambin un importante productor de autoanticuerpos antiplaquetarios. A diferencia de las anemias hemolticas autoinmunes, el mecanismo de accin de los autoanticuerpos de clase IgM es poco claro, as como la importancia relativa del complemento. Se ha asumido que la destruccin plaquetaria acelerada en el prpura trombocitopnico autoinmune, se acompaa de un incremento compensatorio en la produccin de plaquetas por los megacariocitos. Sin embargo, estudios cinticos sugieren que tambin la produccin de plaquetas puede estar disminuida, especialmente en los pacientes ms afectados. Evaluacin de laboratorio. Las pruebas de laboratorio que se utiliza en el estudio de trombocitopenias autoinmunes son bsicamente las mismas descritas en el punto 3.2.1. Brevemente, utilizan-

do tcnicas de desarrollo relativamente reciente, en el plasma o plaquetas de los pacientes con PTI crnico se pueden encontrar anticuerpos de clase IgG o IgM dirigidos contra glicoprotenas de membrana entre las que se incluye: GPIIb/IIIa, GPIb/ IX, GPIa/IIa, GPIV y otras. Estas tcnicas se basan en el principio de captura de antgeno en la cual un anticuerpo monoclonal anti-GP es inmovilizado en una fase slida al cual se agrega un lisado de las plaquetas en estudio o plaquetas normales sensibilizadas con el autoanticuerpo. Esto posibilita la captura del antgeno y cualquier inmunoglobulina (Ig) unida a ste, la que puede ser detectada por una anti-Ig adecuadamente marcada. Tratamiento. El objetivo del tratamiento especfico es restaurar el recuento de plaquetas, o al menos alcanzar niveles que aseguren una hemostasia adecuada. Esteroides, como prednisona oral, seguido de esplenectoma en caso de respuesta insatisfactoria a los esteroides, forma parte del manejo inicial estndar del PTI crnico, con el que se puede alcanzar tasa de remisin cercanas al 80%. En casos de refractariedad a la esplenectoma y esteroides, existe una serie de tratamientos considerados de segunda lnea que incluyen: IgG endovenosa a altas dosis, IgG anti-D, danazol e inmunosupresores. Todos estos tratamientos son de alto costo o se acompaan de importantes efectos colaterales. La transfusin de concentrados plaquetarios en las trombocitopenias inmunes, en general, debe ser excepcional, reservndose para casos de hemorragias por trombocitopenias graves, dado que el efecto sustitutivo es muy escaso por la rpida destruccin de las plaquetas transfundidas. PTI secundario. En alrededor de un 40% de los casos de PTI crnico del adulto ste se asocia a otra enfermedad. Las patologas ms frecuentemente asociadas a PTI son el Lupus Eritematoso Sistmico, enfermedades linfoproliferativas, infeccin por virus de la inmunodeficiencia humana, infecciones y ms raramente otras condiciones como el hipertiroidismo, sarcoidosis, miastenia gravis, etc. La causa de la trombocitopenia se ha atribuido en estos casos a la accin de autoanticuerpos o complejos inmunes. La diferencia ms importante con el PTI crnico primario se encuentra en el tratamiento, ya que en el PTI secundario el manejo de la enfermedad de base se acompaa de mejora en el recuento de plaquetas.

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b) PTI agudo del nio. El PTI en los nios es habitualmente una enfermedad autolimitada que se presenta comnmente con una historia corta de sangrado mucocutneo en nios de 2 a 10 aos de edad, de cualquier sexo. La incidencia es de alrededor de 1 caso por 100.000 nios. Es muy frecuente el antecedente de una infeccin viral reciente o vacunacin. Patogenia. Debido al distinto curso clnico del PTI agudo del nio respecto del crnico, se han sugerido mecanismos patognicos diferentes para los dos sndromes. Hasta ahora, los mecanismos propuestos para el PTI agudo son: (a) interferencia de un virus con la maduracin de los megacariocitos, (b) reactividad cruzada de anticuerpos anti-virales con las plaquetas, (c) unin de complejos inmunes virus-antivirus a la superficie plaquetaria y (d) produccin de un autoanticuerpo verdadero. De los mecanismos propuestos, el que tiene mayor base desde el punto de vista experimental, ha sido el que sostiene que en el PTI agudo existira una produccin de autoanticuerpos plaquetarios verdaderos. Es as como se ha demostrado produccin de IgG por parte de linfocitos esplnicos de nios con PTI agudo, que se une en forma especfica a plaquetas. Por otra parte, en el suero de nios portadores de PTI agudo, se han descrito anticuerpos que reconocen a la que parece ser la GPV de la membrana plaquetaria. Recientemente se ha demostrado que en un porcentaje alto de casos de PTI infantil, se encuentra un anticuerpo IgM con especificidad anti-GPIb. Evaluacin de laboratorio. El estudio de laboratorio del PTI del nio es esencialmente igual al descrito para el cuadro crnico del adulto; sin embargo, a pesar de que en la mayora de los casos se encuentra PAIgG elevada y en un 30% de los casos, anticuerpos antiplaquetarios circulantes, los estudios de especificidad antignica con ELISAs basados en captura de antgeno, son frecuentemente negativos. Tratamiento. Sobre el 80% de los nios con PTI se recuperan en forma espontnea. La hemorragia intracraneana, su complicacin ms grave, se presenta en menos del 1% de los casos. En los casos en que est indicado el tratamiento, una combinacin de esteroides y dosis altas de IgG endovenosa, parece acompaarse de los mejores resultados. Aproximadamente un 10% de los nios que

se presentan como PTI agudo continan con trombocitopenia despus de los 6 meses de iniciado el cuadro, catalogndose en estos casos como un cuadro de PTI crnico similar al del adulto. Trombocitopenias inmunes inducidas por frmacos. La aparicin de trombocitopenia grave asociada al uso de algn frmaco, es una complicacin reconocida desde hace ms de 100 aos. Muchas drogas (ms de cien) han sido implicadas en la patogenia de la trombocitopenia inducida por frmacos, siendo la quinina y la quinidina las ms frecuentemente reportadas y estudiadas. Los anticuerpos asociados con esta condicin generalmente requieren la presencia de la droga soluble para reaccionar con estructuras de la membrana plaquetaria. Estudios recientes han documentado eptopos especficos para la unin de anticuerpos dependientes de droga en la GPIb-IX, GPIIb-IIIa y la molcula de adhesin celular de endotelio y plaquetas (PECAM-1). Ciertas drogas (penicilinas, cefalosporinas), se unen covalentemente a la membrana plaquetaria in vivo y estimulan la produccin de anticuerpos dependientes de hapteno. En otro grupo de pacientes se forman verdaderos autoanticuerpos que se hacen independientes de la droga (metildopa). Aunque las drogas u otras molculas pequeas pueden conjugarse a protenas in vivo, lo que puede inducir una respuesta inmune, existe muy escasa informacin que explique la perturbacin del sistema inmune que lleva a la produccin de autoanticuerpos dependientes de un frmaco. En cuanto al estudio de laboratorio, la demostracin de los anticuerpos dependientes de droga se puede hacer utilizando las mismas tcnicas de unin indirecta de una anti-Ig humana, usando plaquetas blanco normales y la droga apropiada presente en el medio de incubacin. En muchos casos se puede demostrar las glicoprotenas contra las cuales estn dirigidos los anticuerpos, mediante el uso de las tcnicas de ELISA con captura de antgeno, en presencia o ausencia de la droga implicada. El tratamiento de la trombocitopenia inducida por frmacos en la gran mayora de los casos se reduce a la suspensin de la droga responsable, lo que es seguido por una rpida normalizacin del recuento de plaquetas. Trombocitopenia inducida por heparina Aunque en estricto sentido la Trombocitopenia Inducida por Heparina (TIH) es el resul-

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tado del uso de una droga, su patogenia nica, cuadro clnico y frecuencia de presentacin, hacen necesario considerarla en forma separada. La administracin de heparina endovenosa o subcutnea es una causa reconocida de trombocitopenia. La frecuencia de esta complicacin vara de 2 a 5% en diferentes estudios. En la TIH se ha descrito dos formas: (a) tipo I, por accin directa de la heparina sobre las plaquetas, que no es mediada inmunolgicamente y que es habitualmente leve y (b) tipo II, o inmune, por accin de un autoanticuerpo antiplaquetario dependiente de heparina. Lo ms importante de este cuadro es que los pacientes que presentan una trombocitopenia profunda asociada al uso de heparina, se complican paradojalmente de fenmenos de trombosis arterial y menos frecuentemente, venosa. Patogenia. La TIH tipo II se asocia a la presencia de anticuerpos que estn dirigidos contra el complejo formado entre la heparina y el factor plaquetario 4 (PF4), una protena bsica, encontrada normalmente en los grnulos alfa de las plaquetas. Los complejos inmunes formados entre el PF4, la heparina y el anticuerpo, son reconocidos por el receptor FcRIIa de las plaquetas, lo que induce activacin de las plaquetas, liberacin del contenido de sus grnulos y agregacin. Simultneamente, los heparinoides presentes sobre la superficie de la clula endotelial unen PF4 y se forma el complejo con el anticuerpo, que resulta en dao de la clula endotelial que se transforma as en una superficie protrombtica. Evaluacin de laboratorio. El anticuerpo dependiente de heparina se puede demostrar mediante tcnicas inmunolgicas (ELISA) o funcionales. El ensayo de ELISA ms ampliamente utilizado se basa en la fijacin a la fase slida de un complejo PF4:heparina, sobre el cual se agrega el suero en estudio. La unin de los anticuerpos al complejo se demuestra con anti-Ig humana marcada con enzima. Los ensayos funcionales se basan en la capacidad que tienen los anticuerpos dependientes de heparina de activar las plaquetas. Con este fin se ha utilizado la agregacin plaquetaria en presencia del anticuerpo y heparina o la liberacin de 14C-Serotonina en las mismas condiciones. Recientemente se han desarrollado tcnicas de citometra de flujo que identifican las micropartculas liberadas desde las plaquetas durante el proceso de activacin en presencia de heparina.

Tratamiento. El tratamiento de la TIH se circunscribe a la suspensin de la heparina. En casos seleccionados se pueden utilizar anlogos a la heparina que no tienen reactividad cruzada con el anticuerpo.

4. NEUTROPENIAS INMUNES Los neutrfilos al igual que los hemates y plaquetas, se originan en la mdula sea a partir de una clula pluripotencial (ver captulos 3 y 4). Los neutrfilos maduros (segmentados) representan el mayor porcentaje (55-65%) de leucocitos sanguneos en los adultos. Tienen como funcin principal la fagocitosis y destruccin de agentes infecciosos, proceso que es independiente de la especificidad de la respuesta inmune. Despus de permanecer alrededor de 8 horas en circulacin pasan a los tejidos. Se entiende por neutropenia la reduccin del nmero absoluto de neutrfilos en la sangre, valor que puede ser calculado multiplicando el nmero total de leucocitos sanguneos por el porcentaje de neutrfilos (segmentados y baciliformes) obtenido en el recuento diferencial. En general se considera que el lmite normal bajo para nios y adultos es 1500 neutrfilos/L. Se entiende por neutropenia leve, moderada y grave, 10001500, 500-1000 y <500 neutrfilos/L, respectivamente; clasificacin que se asocia con el riesgo de presentar infeccin grave. Los sitios ms comunes de infeccin incluyen cavidad oral y mucosas, piel, y reas perinatal y genital. Los clsicos signos de inflamacin son menos evidentes en pacientes neutropnicos que en los individuos que presentan cifras normales o aumentadas de neutrfilos. Existen varias causas de neutropenia: (i) Disminucin de produccin por insuficiencia medular global (ej. Aplasia y Leucemias), (ii) neutropenias congnitas (ej. Neutropenia cclica), neutropenias adquiridas (ej. Por infecciones, de tipo nutricional, Sndrome de Felty, Hiperesplenismo, por activacin del complemento y de origen inmune) 4.1. Sistemas antignicos de los neutrfilos Los neutrfilos presentan antgenos que comparten con otras clulas (ej. molculas HLA) y antgenos especficos (tabla 24-6). La nomenclatura utilizada para identificar los antgenos especficos de los neutrflos incluye una N (neutrfilo) seguida de una letra (A, B, C, etc.) que identifica

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los diferentes sistemas antignicos) y un nmero (1 2) que representa el alelo. El sistema NA se expresa en la glicoprotena FcRIIIb (CD16) de 50-80 kDa. La glicoprotena, codificada en el cromosoma 1, posee dos dominios extracelulares del tipo inmunoglobulina y se une a los fosfolpidos de membrana a travs de la molcula glicosilfosfatidilinositol (GPI). Existen alrededor de 20.000 molculas/clula. El sistema NA es biallico; los antgenos NA1 y NA2 se diferencian en cuatro aminocidos (figura 26-4) ubicados en el dominio ms distal de la membrana celular.

El sistema NB tambin es biallico; los antgenos NB1 y NB2 residen en una glicoprotena de 5864 kDa -similar a FcRIII- que tambin se une a la membrana de los neutrfilos a travs de GPI. De los sistemas NC, ND y NE, se tiene menos informacin que en relacin a los sistemas NA y NB, y no se han encontrado alelos para los sistemas NC, ND y NE. 4.2. Neutropenias inmunes En analoga a lo que ocurre con los eritrocitos y plaquetas, la destruccin inmune de los neutrfilos puede ser mediada por autoanticuerpos y aloanticuerpos (tabla 26-7). 4.2.1. Neutropenias aloinmunes Al igual que la anemia y trombocitopenia aloinmune, la neutropenia aloinmune puede ser neonatal y postransfusional. La Neutropenia neonatal aloinmune (NNA), es causada por una incompatibilidad feto-materna en que estn involucrados slo los neutrfilos. La incidencia estimada de NNA es similar a la que se presenta en el Prpura aloinmune neonatal (PAN), aproximadamente 1-2 de cada 5000 recin nacidos vivos. Al igual que en la eritroblastosis, ocurrira una isosensibilizacin materna a antgenos heredados del padre y expresados en los neutrfilos del feto. Se han encontrado leucocitos fetales en la sangre materna, especialmente durante el primer trimestre y despus del parto. La especifici-

Figura 26-4. Estructura del receptor FcRIIb (CD16). En la figura se indica el polimorfismo que genera los antgenos NA1 y NA1.

Tabla 26-6. Sistemas antignicos especficos de los neutrflos Sistema antignico NA Antgeno NA1 NA2 NA NB1 NB2 NC1 ND1 NE1 Frecuencia antignica* 54 93 nulo 92 _ 96 96 23

NB

NC ND NE * Poblacin de Estados Unidos

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Tabla 26-7. Clasificacin de las neutropenias inmunes Neutropenias por aloanticuerpos Neutropenia neonatal aloinmune Neutropenia transfusional aloinmune Neutropenias por autoanticuerpos Neutropenias autoinmunes primarias Neutropenia inmune de la infancia Neutropenia primaria crnica del adulto Neutropenias autoinmunes secundarias Neutropenia secundaria a enfermedades Neutropenia autoinmune inducida por drogas

4.2.2 Neutropenias autoinmunes Al igual que en la anemia hemoltica inmune, la tolerancia inmunolgica se puede perder principalmente por: (a) reaccin inmune cruzada de un antgeno extrao con un antgeno propio y (b) disminucin de la actividad supresora de las clulas T sobre un clon de clulas B (ver captulo 23). Como en otras enfermedades autoinmunes, la proliferacin de los linfocitos B es clonal. En la neutropenia autoinmune, los anticuerpos estn dirigidos con mayor frecuencia contra antgenos del sistema antignico NA. La especificidad anti-NA1 se correlaciona con HLA-DR2. Tambin se han detectado autoanticuerpos dirigidos contra el complejo glicoproteico de adhesin CDllb/CD18 y contra actina. La fagocitosis -por macrfagos de mdula sea, bazo y otros rganos linfoides- de neutrfilos sensibilizados con autoanticuerpos, es un importante mecanismo de destruccin de neutrfilos en la neutropenia autoinmune. Si bien, a diferencia de los hemates, los granulocitos resisten la accin ltica del complemento, este mecanismo es importante en la patogenia de la neutropenia, al aumentar el secuestro por parte de los macrfagos esplnicos. Los anticuerpos antineutrfilos, adems pueden afectar la funcin de los neutrfilos. Cuando el antgeno contra el cual est dirigido el autoanticuerpo, tambin est presente en las clulas mieloides ms inmaduras, la granulopoyesis puede estar marcadamente afectada, lo que se traduce en una neutropenia habitualmente grave por falta de regeneracin. Neutropenias autoinmunes primarias En los nios y adultos, la neutropenia aislada, producto de destruccin aumentada de neutrfilos, sin asociacin a otra patologa que pueda explicar el fenmeno, se considera primaria. Frecuentemente estos pacientes presentan anticuerpos anti-neutrfilos, generalmente IgG. La Neutropenia inmune de la infancia se presenta en nios de 3-30 meses, con un promedio de 8 meses. Generalmente los pacientes presentan fiebre e infecciones de piel, odo medio, vas respiratorias o vas urinarias. Al igual que en el PTI infantil, la neutropenia inmune de la infancia generalmente regresa en forma espontnea. La gran mayora de los casos de Neutropenia primaria crnica del adulto se asocia a alteraciones inmunolgicas o hematolgicas. La mayora de

dad ms frecuentemente encontrada para los anticuerpos antineutrfilos ha sido anti-NA1 y anti-NA2. A diferencia de la EHRN y en forma similar al PAN, la NNA puede presentarse en el primer hijo. La mayora de los pacientes presenta infecciones leves. La mayora de las Reacciones transfusionales febriles no hemolticas, se deben a la presencia de anticuerpos antineutrfilos en el receptor, el que reacciona contra leucocitos presentes en la sangre o hemoderivado transfundido. La aloinmunizacin por antgenos HLA y otros antgenos asociados a leucocitos -principalmente NAl y NA2- se presentan en pacientes que reciben transfusiones de granulocitos y plaquetas; especialmente en los politransfundidos Investigacin serolgica de los anticuerpos antineutrflos Los mtodos para estudiar los anticuerpos antineutrfilos se pueden agrupar en: (i) Mtodos para pesquisar inmunoglobulina unida a la superficie de los neutrfilos y (ii) Mtodos que pesquisan el efecto de los anticuerpos antineutrfilos. En el primer caso granulocitos heterlogos se incuban con suero del paciente y control, y se cuantifica la unin de los anticuerpos antigranulocitos. Para esto se pueden usar varios mtodos, como son la inmunofluorescencia, citometra de flujo, enzimainmunoensayos, radioinmunoensayo y protena A estafilocsica. En el segundo caso se ha usado aglutinacin, opsonizacin y citotoxicidad.

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los pacientes son mujeres y presentan celularidad normal o aumentada en la mdula sea. Neutropenias autoinmunes secundarias Esta es la forma ms frecuente de neutropenia inmune en el adulto. La Neutropenia autoinmune secundaria se asocia a otras enfermedades (de tipo autoinmunes, malignas o inmunodeficiencias) y a drogas. En la patogenia de las neutropenias secundarias a otras enfermedades (ej. Lupus Eritematoso Sistmico, Linfomas) podran participar complejos inmunes, activacin del complemento y reaccin cruzada de anticuerpos con los neutrfilos. En la Neutropenia autoinmune inducida por drogas, los frmacos que ms frecuentemente asociados incluyen antibiticos, analgsicos-antinflamatorios, antiarrtmicos, antimalricos y antitirodeos. En el estudio de laboratorio tambin utilizan las pruebas descritas en el punto 4.2.1. El tratamiento depender del tipo particular de neutropenia y cuando corresponda de la enfermedad de base. La neutropenia immune de la infancia remite espontneamente. En otras neutropenias lo indicado es evitar las infecciones a repeticin. Como en otras enfermedades hematolgicas autoinmunes, tambin se han usado como tratamiento esplenectoma, corticoides e IgG intravenosa. Por otra parte, se han usado factores de crecimiento hematopoytico con el propsito de aumentar la proliferacin y acelerar la diferenciacin de las clulas progenitoras mieloides; los factores de crecimiento usados son el factor estimulador de colonias granulocito-macrfago (GM-CSF) y el factor estimulador de colonia granuloctica (G-CSF).

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Captulo 27
GAMMAPATAS MONOCLONALES
Mireya Silva B. y Mauricio Oqueteaux T.

1. Introduccin 2. Estudio inmunolgico de las gammapatas monoclonales 2.1. Pesquisa de una protena monoclonal 2.2. Identificacin de una protena monoclonal 2.3. Cuantificacin de inmunoglobulinas 2.4. Viscosidad srica 2.5. Beta-2 microglobulina 2.6. Protena C reactiva 2.7. Interleuquina-6 2.8. Estudios inmunolgicos en orina 3. Gammapata monoclonal de significado incierto 3.1. Aspectos generales 3.2. Evolucin de las MGUS en el tiempo 4. Mieloma mltiple 4.1. Manifestaciones clnicas 4.2. Pronstico

5. Variedades infrecuentes de mieloma mltiple y otras gammapatas 5.1. Mieloma "indolente" 5.2. Leucemia de clulas plasmticas 5.3. Mieloma osteoesclertico 5.4. Plasmocitoma extramedular 5.5. Plasmocitoma seo solitario 5.6. Macroglobulinemia de Waldenstrm (MW) 5.7. Enfermedad de cadenas livianas 5.8. Amiloidosis primaria 5.9. Enfermedad por cadenas pesadas 6. Diagnstico diferencial entre MGUS y MM 7. Patogenia 7.1. Papel IL-6 y va de la ciclina D1 7.2. Genes supresores de tumores 7.3. Apoptosis de clulas plasmticas 7.4. Papel del estroma en las discrasias de clulas plasmticas 8. Tratamiento

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RESUMEN En este captulo se analizan las Gammapatas monoclonales en relacin con su concepto, estudio, clasificacin, aspectos patognicos y tratamiento. Concepto: se refiere a la definicin de estas patologas y la estructura molecular del componente o protena monoclonal. Clasificacin: se las diferencia en (a) Mieloma Mltiple, (b) Gammapatas Monoclonales de Significado Incierto y (c) Variedades infrecuentes de Mieloma Mltiple y otras gammapatas. Se destacan de ellas sus principales manifestaciones clnicas. Estudio: se analizan, desde el punto de vista inmunolgico, los procedimientos ms importantes que se utilizan para el diagnstico de estas enfermedades. Patogenia: el papel de IL-6 y va de la Ciclina D1, los genes supresores, la apoptosis de Clulas Plasmticas y la probable funcin del estroma son discutidos en este punto. Tratamiento: se plantean, brevemente, alcances teraputicos actuales

1. INTRODUCCIN Las discrasias de clulas plasmticas (CPs) constituyen un grupo heterogneo de enfermedades que se caracterizan por una expansin de CPs monoclonales -es decir, con origen en un clon celular singular- en la mdula sea, y por la produccin de una inmunoglobulina tambin monoclonal o componente M (CM). Las inmunoglobulinas monoclonales producidas por las CPs patolgicas suelen migrar en la fraccin gamma () cuando son sometidas a una electroforesis, razn por la cual estas discrasias son tambin denominadas gammapatas monoclonales. En trminos generales, las inmunoglobulinas monoclonales al igual que las inmunoglobulinas normales - estn constituidas por dos cadenas pesadas de igual clase y subclase (cadenas H) y dos cadenas livianas del mismo tipo (cadenas kappa, o lambda ) (ver captulo 6). Sin embargo, en algunas discrasias es posible detectar slo un fragmento de la molcula de inmunoglobulina, como ocurre en la enfermedad por cadenas pesadas o livianas, con expresin exclusiva de las cadenas , o en el primer caso y o en el segundo (tambin conocida como enfermedad de Bence-Jones). As, salvo estas ltimas excepciones, las inmunoglobulinas comprometidas en estas entidades son estructuralmente similares a su contrapartida normal, estando presentes en cantidades elevadas simplemente por el

gran nmero de CPs clonales que las originan. Desde el punto de vista funcional se ha logrado demostrar, en ensayos in vitro, actividad de anticuerpo contra distintos antgenos, principalmente de origen bacteriano y, ms an, contra protenas autlogas (factores de coagulacin, antgenos eritroides, protenas del SNC, etc). Sin embargo, en la inmensa mayora de los pacientes no se logra demostrar una actividad especfica de la inmunoglobulina monoclonal. Desde un punto de vista clnico, el hecho de tener su origen en un clon celular nico monoclonal no significa, necesariamente, que se trate de una neoplasia, si bien el concepto inverso es vlido para todos los cnceres (es decir, todos ellos son de origen monoclonal), dado que existen diversos ejemplos de expansiones monoclonales que nunca llegan a constituir una neoplasia, al menos clnicamente evidente. El ejemplo ms caracterstico de expansin de CPs que permanece bajo control sin progresin hacia tumor de crecimiento continuo se denomina Gammapata Monoclonal de Significado Incierto (MGUS, "Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance"), mientras que el ejemplo ms genuino de proliferacin de CPs que escapa a los mecanismos de control y desarrolla una enfermedad maligna lo constituye el Mieloma Mltiple (MM). La incidencia de las distintas gammapatas monoclonales est representada en la tabla 27-1.

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Tabla 27-1. Incidencia y frecuencia relativa de las diferentes formas de Gammapata Monoclonal Gammapata Monoclonal Gammapata Monoclonal de Significado Incierto Mieloma Mltiple Macroglobulinemia de Wldenstrom Enfermedad de Cadenas Livianas Enfermedad de Cadenas Pesadas Amiloidosis Crioglobulinemia Incidencia Frecuencia Relativa

1 - 5% 3 - 5* < 1* < 1* < 1* < 1* < 1*

65 -70% 12 - 20% 1 - 4% < 1% < 1% 2% < 1%

* Resultados expresados como nmero de casos nuevos/100.000 habitantes por ao

2. ESTUDIO INMUNOLGICO DE LAS GAMMAPATAS MONOCLONALES Dado que el captulo 40 se refiere a los mtodos inmunoqumicos, aqu slo se aplicar, resumidamente, un esquema operacional para el estudio de las GM (tabla 27-2). 2.1. Pesquisa de una protena monoclonal La protena monoclonal se detecta por una imagen muy particular en el estudio electrofortico de las protenas sricas y/o urinarias, electroforesis que puede realizarse en soportes de acetato de celulosa o agarosa. La imagen consiste en una fraccin proteica concentrada, de mayor o menor intensidad dependiendo de su concentracin y de lmites muy netos con migracin desde las globulinas 2 hasta las globulinas . En el densitograma es caracterstica la presencia de una curva aguzada, elevada y de base estrecha, en relacin con el sitio de migracin de la protena monoclonal (figura 27-1). El componente monoclonal corresponde al producto de la secrecin de muchas clulas provenientes de un clon nico de clulas plasmticas. Son protenas homogneas, idnticas entre s, lo que explica su migracin puntual en la electroforesis de protenas (EFP). Mediante la EFP pueden diferenciarse los componentes monoclonales de los policlonales, correspondiendo estos ltimos a respuestas inmunolgicas fisiolgicas a las estimulaciones antignicas importantes como son las infecciones.

Tabla 27-2. Estudio inmunolgico de las GM En sangre (suero) Electroforesis de protenas Inmunoelectroforesis de protenas (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE, , ) Inmunofijacin de inmunoglobulinas (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE, , ). Cuantificacin de inmunoglobulinas Viscosidad srica 2-microglobulina Protena C reactiva (PCR) IL-6

En orina Proteinuria Proteinuria 24 hrs. Electroforesis de protenas (orina concentrada) Inmunoelectroforesis de protenas (cadenas livianas y = protenas de Bence Jones) Inmunofijacin de cadenas livianas de inmunoglobulinas

Los componentes policlonales constituyen el producto de la secrecin de clulas plasmticas de diferentes clones celulares y son, por lo tanto, protenas heterogneas entre s, expresndose en

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Figura 27-1. Patrn electrofortico de protenas sricas con presencia de componente M en regin de la gammaglobulinas. (a) Trazado electrofortico, (b) densitograma (c) Base celular que lo explica.

la EFP como fracciones aumentadas, pero en forma difusa y en el densitograma como curvas aumentadas pero amplias, suaves y de base ancha (figura 27-2). Un hecho destacable es la asociacin a una fraccin monoclonal de una hipogamaglobulinemia. Este signo es orientador hacia una GM maligna. En ocasiones existiendo una neoplasia monoclonal de clulas plasmticas, el CM no aparece en la EFP sricas. Esta circunstancia puede observarse en la enfermedad de cadenas livianas, mieloma IgD, enfermedad de cadenas pesadas y en el mieloma no secretor, afeccin en la cual la protena monoclonal, indetectable en sangre y orina, puede observarse e identificarse en el interior de los plasmocitos de la mdula sea por inmunofluorescencia directa. Por el contrario, errneamente, pueden considerarse como componentes monoclonales ciertos artefactos como por ejemplo la fibrina que aparece como una fraccin concentrada entre las

globulinas y ; los complejos de hemoglobina haptoglobina, propios de la hemlisis, en globulinas alfa 2, e incluso el punto de aplicacin de la muestra en el soporte de la EFP. 2.2. Identificacin de una protena monoclonal Frente a la pesquisa de un CM electrofortico o an sin detectarlo claramente cuando se sospecha un mieloma mltiple, macroglobulinemia, amiloidosis u otras enfermedades relacionadas se debe realizar una inmunoelectroforesis o una inmunofijacin de inmunoglobulinas sricas. Inmunoelectroforesis. Esta tcnica introducida por Grabar y Williams en 1953 es muy til para la identificacin de la protena monoclonal, es decir la clase de cadena pesada y el tipo de cadena liviana de la inmunoglobulina comprometida. Brevemente, consiste en una electroforesis srica seguida de una inmunoprecipitacin de las cadenas pesadas y livianas de las inmunoglo-

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Figura 27-2. Patrn electrofortico de un componente policlonal. (a) Trazado electrofortico, (b) Densitograma, (c) Base celular que lo explica.

bulinas que contiene la muestra empleando antisueros poli, tri y monovalentes en geles de agarosa (figura 27-3). Inmunofijacin. Esta tcnica, permite objetivar con bastante certeza la cadena pesada y liviana de la inmunoglobulina monoclonal del paciente, empleando al igual que la inmunoelectroforesis, la muestra a investigar (en 6 diferentes posiciones) en placas de agarosa para obtener, por electroforesis, la separacin de las protenas de acuerdo con su carga neta. En la segunda etapa se aplican los anticuerpos monoespecficos en 5 de los 6 trazados electroforticos para que la fijacin ocurra. El informe y por ende el diagnstico se facilita puesto que el procedimiento permite comparar el nivel de migracin del CM, si lo hay, con las lneas de precipitacin de las cadenas monoclonales comprometidas (figura 27-4). La inmunofijacin puede realizarse en suero, orina, lquido cefalorraqudeo, etc. y posee una mayor sensibilidad y poder de resolucin que la inmunoelectroforesis.

Figura 27-3. Patrn Inmunoelectrofortico de componente M formado por IgG (cadenas pesadas ) y cadenas livianas . El esquema representa los arcos de inmunoprecipitacin de las cadenas pesadas , , y livianas y del suero de un sujeto control normal (C) en comparacin con los de un paciente (P) portador de una Gammapata Monoclonal IgG-k. En este ltimo se aprecia deformacin de los arcos de precipitacin de la cadena pesada () de la IgG y de la cadena liviana y disminucin de la concentracin de los arcos de IgA, IgM y lo que es habitual en las patologas avanzadas.

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Figura 27-4. Inmunofijacin de inmunoglobulinas. En los rectngulos del gel de agarosa se aplica suero del mismo paciente, cuyas protenas son separadas por electroforesis de alta resolucin (EF.AR). La aplicacin de antisueros monoespecficos (, , , , ) determina la precipitacin del complejo Ag-Ac y la fijacin, lineal, de las protenas monoclonales en el mismo nivel en que se encuentra el componente monoclonal de la electroforesis de la placa. En este ejemplo, el paciente presenta una gammapata monoclonal IgA-.

2.3. Cuantificacin de inmunoglobulinas La cuantificacin o dosificacin de inmunoglobulinas se realiza mediante tcnicas de inmunodifusin radial y ltimamente por nefelometra. Su medicin permite establecer un ndice pronstico (enfermedad benigna o maligna), mantener un control evolutivo del tratamiento y detectar, precozmente el inicio de una inmunodeficiencia. 2.4. Viscosidad srica Los pacientes portadores de una GM pueden evolucionar con sntomas de hiperviscosidad, como se ha sealado. La hiperviscosidad se define en base al aumento de la viscosidad relativa del suero sanguneo comparada con el agua. El valor normal es de 1.8, es decir el suero sanguneo es hasta 1,8 veces ms viscoso que el agua. Las manifestaciones clnicas suelen aparecer con cifras de 5 a 6 y comnmente esto ocurre cuando el CM corresponde a IgM, IgG3 e IgA.

2.5. Beta-2 microglobulina Esta protena que forma parte de la estructura de las molculas clase I del Sistema Principal de Histocompatibilidad (cadena liviana del heterodmero) se encuentra en la superficie de todas las clulas nucleadas. Puede medirse en suero como en orina y sus niveles constituyen un factor pronstico en los sndromes linfoproliferativos, particularmente en el MM. Los pacientes con niveles elevados tienen una sobrevida significativamente ms corta que los portadores de GM con niveles normales. Las cifras elevadas se relacionan con activacin y destruccin de linfocitos. Los valores normales son 1.15-2.03 mg/l. Como se excreta por el tbulo renal puede aumentar en las insuficiencias del rin. 2.6. Protena C reactiva La cuantificacin de la PCR srica es empleada comnmente para objetivar la presencia de

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un proceso inflamatorio, aunque inespecficamente. Los niveles de esta protena se elevan en los pacientes con GM particularmente en el MM. La IL-6 estimula la produccin de PCR y la medicin de sta, por lo tanto, indirectamente refleja los niveles de IL-6. El empleo de anticuerpos monoclonales anti-IL-6 disminuye la produccin de PCR. Su valor normal es hasta 0.6 mg/dl. 2.7. Interleuquina-6 Se ha sealado que siendo la IL-6 un factor muy importante de crecimiento de la clula plasmtica tumoral, un aumento del nivel srico, constituye un ndice de malignidad, severidad y, por ende, de mal pronstico de las GM. Ha sido comunicado que IL-6 srica es indetectable en sujetos sanos o en GMSI, (<1pg/ml), a diferencia de los enfermos con GMM, en los cuales los niveles pueden ser de 20, 30 o ms pg/ml. 2.8. Estudios inmunolgicos en orina Estos estudios inmunolgicos deben realizarse en orina total de 24 horas, porque es importante conocer el total de la proteinuria diaria y porque para varias tcnicas se requiere concentrar la orina 50, 100 200 veces, para pesquisar concentraciones mnimas de las protenas monoclonales excretadas. La electroforesis de protenas ha de hacerse con orina concentrada, particularmente cuando la proteinuria es pequea, para destacar el CM urinario en el trazado electrofortico, para lo cual se utilizan soportes de acetato de celulosa o agarosa. La inmunoelectroforesis y/o inmunofijacin de protenas urinarias tienen por objeto identificar las protenas de Bence Jones, que como se dijo corresponden a las cadenas livianas monoclonales o de las molculas de inmunoglobulinas. Las protenas de Bence Jones pueden observarse durante la evolucin de una GM tpica y en la enfermedad de cadenas livianas en la cual hay una gran produccin de cadenas livianas o monoclonales.

de las CPs, presente entre un 1% y un 5% de la poblacin mayor de 50 aos y hasta en un 10% de los mayores de 80 aos cuando se analiza la presencia de una protena monoclonal con tcnicas como la electroforesis. Sin embargo, si se utilizan tcnicas de mayor sensibilidad estas cifras se elevan an ms. As, se han reportado incidencias de hasta un 5% en individuos sanos entre 22 y 65 aos y de 7-8% sobre los 55 aos cuando se utiliza electroforesis de acetato de alta resolucin. Esta entidad se caracteriza por la proliferacin de un clon singular -o en un 2 a 3% de los casos de dos clones diferentes- de CPs, con la capacidad de producir una protena monoclonal o CM, pero en ausencia de elementos sugerentes de MM, macroglobulinemia, amiloidosis, etc. En trminos generales, los pacientes con MGUS presentan un componente-M < 3g/dL, menos de un 10% de CPs en mdula sea, escasa o nula cantidad de protena-M en la orina y ausencia de compromiso sistmico como lesiones seas, anemia, hipercalcemia o compromiso de la funcin renal. 3.2. Evolucin de las MGUS en el tiempo Desde el punto de vista evolutivo, la MGUS puede dar origen a un MM caracterstico, situacin que se observa, sin embargo, en slo una minora de los pacientes. En un estudio realizado en la Clnica Mayo, de 241 pacientes seguidos durante 24 a 38 aos, 42 de ellos (17,4%) desarrollaron un MM, 7 (2,9%) una macroglobulinemia y 8 (3,3%) una amiloidosis primaria; un 10% adicional de pacientes incrementaron el componente monoclonal en suero, aunque sin llegar a tener elementos clnicos de enfermedad. Considerando esta informacin, la tasa actuarial de transformacin de las MGUS es de 14% a 10 aos y de 29% a 20 aos, para los casos con IgG como protenaM, y de 18% y 37%, respectivamente, para aquellas MGUS IgA. Sin embargo, tanto en el citado estudio, como en otros, no se ha podido establecer patrones que permitan predecir con claridad qu grupo de enfermos tienen un mayor riesgo de sufrir progresin a MM. Por esta razn, y desde el punto de vista clnico, el avance desde una entidad benigna a una maligna est dada por dos grupos de signos, que requieren necesariamente de un seguimiento estrecho del paciente: (a) Un aumento sostenido en la cantidad del componente monoclonal detectable en el suero y (b) La aparicin de dolores seos con lesiones lticas seas no detectadas previamente. La aparicin de cualquiera

3. GAMMAPATA MONOCLONAL DE SIGNIFICADO INCIERTO 3.1. Aspectos generales MGUS es la alteracin clonal ms frecuente

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de estos signos es evidencia suficiente para evaluar la enfermedad como progresiva, de modo que se requiere una intervencin teraputica en la mayora de los casos que la presentan. 4. MIELOMA MLTIPLE El mieloma mltiple (MM) es una neoplasia de la lnea linfoide B caracterizada por la acumulacin en mdula sea de una poblacin clonal de clulas de esta estirpe en su estadio final de diferenciacin, es decir, de clulas plasmticas, y por la produccin de lesiones osteolticas (y el dolor seo secundario a ellas) que, junto a la presencia e incremento del componente M (ya sea en suero y orina), representan los hallazgos patolgicos ms frecuentes de la enfermedad. Las primeras observaciones sobre esta enfermedad fueron realizadas por Henry Bence-Jones en el ao 1845, aunque los trminos de mieloma mltiple o enfermedad de Kahler no fueron introducidos sino hasta los aos 1873 y 1889, respectivamente. El MM tiene su mayor incidencia durante la 7 y 8 dcada de la vida, si bien un nmero significativo de casos es diagnosticado en edades ms tempranas (un 15% de los casos tienen menos de 50 aos). El nmero de casos nuevos por cada 100.000 habitantes y ao es de 3 a 5, por lo que el MM constituye aproximadamente el 1% de todas las neoplasias y el 10% de las neoplasias hematolgicas. A continuacin se resumen algunas caractersticas clnicas ms relevantes de la enfermedad: 4.1. Manifestaciones clnicas Dolor seo. El sntoma ms tpico y frecuente del MM es el dolor seo, que se puede encontrar en un 70-75% de los pacientes en el momento del diagnstico, si bien esta incidencia se ha reducido en las ltimas dcadas debido probablemente al diagnstico precoz, siendo actualmente de alrededor de un 40%. ste se debe a la presencia de lesiones generalmente de fcil reconocimiento por medio de mtodos radiolgicos (osteoporosis, osteolisis o fracturas patolgicas). Sus localizaciones ms frecuentes son el crneo (imagen de apolillamiento), la columna vertebral (aplastamientos vertebrales y fracturas), las costillas, la pelvis y los huesos largos a nivel proximal. Estas lesiones tienen un origen multifactorial, destacando en su generacin la activacin de osteoclastos secundaria a la presencia de citoquinas como el factor de necrosis tumoral

(TNF) o la interleuquina-1 beta (IL-1). Manifestaciones neurolgicas. Con relativa frecuencia existen en el MM otras dos manifestaciones clnicas asociadas a la patologa sea, como son la hipercalcemia y las alteraciones neurolgicas. Estas ltimas se presentan frecuentemente como radiculopatas o como un sndrome de compresin medular, motivadas por la compresin de una raz nerviosa por una lesin vertebral o por el compromiso, ya sea traumtico (secundario a una fractura por aplastamiento) o por el crecimiento de un plasmocitoma (tumor de CPs) a la cavidad medular, respectivamente. Si bien existen casos en que la manifestacin neurolgica es dependiente de una polineuropata secundaria a la presencia de paraproteinemia, esta situacin es ms bien excepcional. En estos casos la protena anmala actuara como anticuerpo dirigido contra determinantes antignicos de la mielina. Hipercalcemia. La presencia de hipercalcemia (>11,5 mg/dL tras correccin por los niveles de albmina) ocurre en alrededor de un tercio de los pacientes. Dentro de su patogenia se ha descrito una alteracin en el balance entre la actividad osteoclstica (reabsorcin sea) y la osteoblstica (formacin sea), de modo que la primera prevalece sobre la segunda. Este desbalance estara explicado por la presencia y mayor actividad de ciertas interleuquinas: factor de necrosis tumoral (TNF) y a la IL-1b, ambos influenciados estrechamente por la actividad de IL-6. Sntomas generales. En los pacientes con MM es frecuente la presencia de sntomas constitucionales, tales como astenia, prdida de peso, fatigabilidad, etc., muchas veces relacionados a la presencia de anemia y, en algunas oportunidades, al estado de hipermetabolismo que implica la enfermedad tumoral, como ocurre en los infrecuentes casos de leucemia de CPs. Sndrome anmico. El valor medio de la hemoglobina (Hb) en la mayor parte de las series de pacientes con MM al diagnstico es de alrededor de 10,5 g/dL, existiendo grados variables de anemia en el 60-70% de los casos. Adems, alrededor de un 20-25% de ellos presentan anemia severa, con valores de Hb inferiores a 8,5 g/dL. La anemia en el MM es de origen multifactorial en que, adems del mecanismo clsico de anemia de enfermedades crnicas, existen otros factores de importan-

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cia, como son: (a) reemplazo de la hematopoyesis normal por CPs tumorales, (b) actividad regenerativa disminuida del tejido hematopoytico residual, (c) insuficiencia renal, (d) deficiencia de hierro y (e) disminucin de la sobrevida del glbulo rojo. Adems, en los ltimos aos ha quedado de manifiesto el papel de la eritropoyetina (Epo) y otras citoquinas en la patogenia de la anemia en el MM, sugirindose que en estos enfermos existira una respuesta inadecuada a la Epo (para el grado de anemia) y/o una respuesta proliferativa disminuida de las clulas eritropoyticas a niveles normales de esta sustancia. Por ltimo, se ha demostrado que algunas citocinas (IL-1, TNF, TGF e IFN-) pueden disminuir tanto la eritropoyesis como la produccin de Epo. Insuficiencia renal. La falla renal es un rasgo caracterstico del MM y es uno de los factores pronsticos ms importantes, representando la segunda causa de muerte en estos pacientes. Aproximadamente un 30% de ellos presentan niveles de creatinina 2 mg/dL, incidencia que aumenta durante el curso de la enfermedad. Sin embargo, la mayora de los enfermos son asintomticos. Su etiologa es tambin multifactorial, influyendo en ella la eliminacin de cadenas livianas, hipercalcemia (estas dos causas presentes en un 90% de los casos afectados) e hiperuricemia, deshidratacin, infecciones urinarias a repeticin, hiperviscosidad, uso de drogas nefrotxicas (especialmente antibiticos), amiloidosis e infiltracin tumoral. El trmino rin mielomatoso se usa para designar la formacin de cilindros tubulares y est invariablemente asociado a la presencia de proteinuria de Bence-Jones. Infecciones bacterianas. Constituyen la principal causa de morbilidad y mortalidad en el MM, siendo su incidencia global entre 0,5 y 3 episodios infecciosos por paciente/ao (alrededor de 7 a 15 veces superior a la poblacin normal de la misma edad). La causa ms importante es la alteracin de la inmunidad humoral, tanto por depresin de la produccin de inmunoglobulinas normales (hipogammaglobulinemia) como por un hipercatabolismo de las mismas. Otros factores que parecen influir en la predisposicin a las infecciones incluyen: (a) supresin de la produccin de anticuerpos y de la proliferacin de clulas B por parte de los monocitos/macrfagos estimulados por las CPs mielomatosas; (b) reduccin en la produccin de interleucina 4 (IL-4), responsable

de la activacin inicial de las clulas B en reposo; (c) presencia de clulas T con actividad inmunosupresora; (d) defectos en la inmunidad celular (disminucin de clulas CD4 y alteracin de las clulas NK); (e) alteracin funcional de la actividad del complemento; (f) presencia de granulocitopenia, secundaria tanto a infiltracin medular como al tratamiento quimioterpico; (g) insuficiencia renal. Los focos y agentes ms frecuentemente comprometidos son el pulmonar (Streptococcus pneumoniae) y el urinario (bacilos Gram negativos). Si bien la mayor parte de las infecciones en el MM son de origen bacteriano (90%), tambin se reconocen en estos pacientes infecciones de origen viral (Herpes Zoster) y fngicas (Cndida lbicans, etc). Otras manifestaciones clnicas. El sndrome de hiperviscosidad es menos frecuente que en otros sndromes linfoproliferativos (Macroglobulinemia de Waldenstrm), pero puede presentarse en algunos casos de mielomas IgA o IgG3. Otro problema de relativa frecuencia lo constituye la amiloidosis, presente en alrededor de un 10-15% de los casos, generalmente mielomas Bence-Jones con excrecin de cadena L lambda. 4.2. Pronstico La evolucin de los pacientes portadores de MM es muy variable, con casos que cursan con una enfermedad agresiva que los lleva a la muerte en pocos meses y otros con un curso estable y sobrevida que puede superar incluso los 10 aos, situndose la mediana de supervivencia en torno a los 3 aos. Esta variabilidad en el curso clnico se debe a la presencia de diferentes factores pronsticos, entre los que destacan el estado general, la edad, la presencia de insuficiencia renal, la anemia, la hipercalcemia y la hipoalbuminemia. En cuanto al tipo de MM parecen ser de peor pronstico el IgD y el Bence-Jones. La clasificacin pronstica ms utilizada hasta ahora es la de Durie Salmon, resumida en la tabla 27-3. En los ltimos aos se han reconocido nuevos factores pronsticos como el nivel de beta-2-microglobulina (2M), de IL-6, protena C reactiva, la actividad proliferativa de las CPs (el llamado labelling index), la expresin de ciertos antgenos en la clula plasmtica, las alteraciones cromosmicas, la hipodiploida y la expresin del gen de resistencia mltiple a drogas (MDR-1), algunos de los cuales sern revisados brevemente.

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Tabla 27-3. Criterios de Etapificacin de Durie-Salmon Estadio I (baja masa tumoral: < 0,6 x 1012/m2) Hemoglobina > 10g/dL IgG < 5g/dL; IgA < 3g/dL; Bence Jones < 4g/24h Nivel de Calcio normal Presencia de mximo una lesin osteoltica Estadio II (masa tumoral intermedia: 0,6 1,2 x 1012/m2) Criterios intermedios entre estadio I y III Estadio III (alta masa tumoral: > 1,2 x 1012/m2) Hemoglobina < 8,5g/dL IgG > 7g/dL; IgA > 5g/dL; Bence Jones > 12g/24h Nivel de Calcio > 12mg/dL (ajustado por la albmina srica) Presencia de lesiones osteolticas mltiples A Creatinina < 2mg/dL B Creatinina 2mg/dL

2-microglobulina. La 2M es uno de los factores pronsticos relevantes y se correlaciona estrechamente tanto con la masa tumoral, el compromiso renal y la clasificacin de Durie-Salmon. Como factor independiente es capaz de predecir la supervivencia mejor que cualquiera de los otros parmetros, por lo que debe estar incorporado en los protocolos de estudio y tratamiento en todos los pacientes. Protena C Reactiva. La concentracin de la PCR es un reflejo de la actividad de IL-6, citoquina fundamental en la proliferacin y sobrevida de las CPs. El valor predictivo de este parmetro parece ser independiente de la 2M, lo que ha permitido construir algoritmos de estratificacin de riesgo basados en estos dos parmetros. ndice Proliferativo de las CPs. El PCLI ("plasma cell labelling index") refleja la actividad proliferativa de las CPs que suele incrementarse con la progresin de la enfermedad. La sobrevida de los pacientes con PCLI < 3% es de 56 meses, que disminuye a 19 meses cuando este valor es 3%. Citogentica. Las alteraciones de la composicin cromosmica tienen un reconocido valor en enfermedades hematopoyticas como las leucemias. Hasta hace pocos aos la informacin en el MM era escasa debido a que este es un tumor de clulas esencialmente maduras con baja tasa

proliferativa y menor posibilidad de obtener metafases analizables. Sin embargo, entre un 30 y 50% de los pacientes tienen un cariotipo anormal (20-30% al diagnstico y 35-60% post-tratamiento). Por otro lado, con tcnicas de mayor sensibilidad como hibridacin in situ (FISH) o citometra de flujo se puede observar cantidades anormales de DNA (aneuploidas de DNA) en hasta un 80% de los casos. Las alteraciones ms frecuentes son traslocaciones (51%) y trisomas (45%). De particular inters ha resultado el valor pronstico ominoso de la prdida de un cromosoma 13 (monosoma 13) o de alteraciones de 11q.

5. VARIEDADES INFRECUENTES DE MIELOMA MLTIPLE Y OTRAS GAMMAPATAS 5.1. Mieloma indolente Corresponde a pacientes con criterios diagnsticos inequvocos de mieloma pero en ausencia de anemia, insuficiencia renal, hipercalcemia o lesiones lticas mltiples. Estos pacientes tienen usualmente niveles de protena M > 3g/dL pero < de 4,5g/dL y > 10% de CPs atpicas en mdula sea. Estos pacientes suelen ser asintomticos y no requieren tratamiento hasta que se evidencie una progresin de la enfermedad, lo que ocurre con una mediana de 26 meses.

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5.2. Leucemia de clulas plasmticas Los pacientes con esta inhabitual presentacin (< 5% de los pacientes) tienen un recuento absoluto de CPs 2 x 106/L. Se debe diferenciar entre la variedad de novo y la transformacin en Leucemia de Clulas Plasmticas de un mieloma previamente conocido. El tratamiento de estos pacientes suele ser ineficaz y la mediana de supervivencia es de slo 2 meses. 5.3. Mieloma osteoesclertico La principal caracterstica de esta enfermedad es la presencia de una polineuropata inflamatoria crnica desmielinizante causante de gran incapacidad motora. Esta alteracin aparentemente es secundaria a una inmunoglobulina con toxicidad para las fibras nerviosas perifricas. Adems, en esta variedad es frecuente la asociacin de alteraciones endocrinolgicas (sndrome de POEMS). La mdula sea de estos pacientes usualmente tiene proporciones normales de CPs (< 5%) y el diagnstico debe confirmarse con la biopsia de una lesin ltica. Desde un punto de vista bioqumico, y comparado con los pacientes con MM clsico, estos pacientes suelen exhibir niveles ms elevados de IL-1, TNF- e IL-6, pero niveles inferiores de TGF-, con un desbalance que favorece las citoquinas proinflamatorias. 5.4. Plasmocitoma extramedular Esta rara entidad suele afectar con mayor frecuencia el tracto respiratorio superior aunque ocasionalmente afecta el tracto digestivo y otros rganos, en ausencia de criterios diagnsticos de un MM convencional. El tratamiento, al igual que en el caso de un plasmocitoma seo solitario, es la radioterapia, con lo cual se observan excelentes resultados, incluyendo la curacin en muchos de ellos. 5.5. Plasmocitoma seo solitario Corresponde a una lesin osteoltica nica constituida por CPs clonales, en ausencia de infiltracin en mdula sea. Suelen tener cantidades pequeas de componente M ya sea en suero y/o en orina, la que desaparece tras radioterapia sobre la lesin. Lamentablemente slo un 50% de estos casos puede ser curado, dado que la otra mitad de los pacientes evoluciona hacia un MM clsico en

los aos siguientes. En este sentido, es posible que, an en ausencia de criterios clsicos de MM en mdula sea, en aproximadamente un 50% es posible demostrar la presencia de CPs clonales en mdula sea por medio de citometra de flujo, sugiriendo que desde un comienzo se trata de un MM con manifestacin primariamente tumoral y no infiltrativa. 5.6. Macroglobulinemia de Waldenstrm (MW) Entidad descrita por primera vez en 1944 por Waldenstrm en 2 pacientes con fatiga, sangramiento de mucosas, adenopatas y anemia normocrmica asociada a un aumento de la viscosidad plasmtica secundaria la presencia de grandes cantidades de protena IgM circulante. A nivel de mdula sea se observa una infiltracin de clulas linfoplasmocitoides productoras de la protena IgM monoclonal, con frecuente presencia de basfilos tisulares (mastocitos) que ayudan en el diagnstico. La edad media de presentacin es sobre los 60 aos, siendo ms frecuente en el sexo masculino. Si bien la presencia de hiperviscosidad es la regla, slo un 20% presenta sntomas relacionados a ella (cefalea, alteraciones visuales, etc). En todo caso, elevaciones de sobre 4 veces el valor normal confiere un riesgo de complicaciones clnicas que obligan a considerar la plasmafresis como una de las medidas teraputicas en estos casos. En alrededor de un 10% de los casos se observa una neuropata desmielinizante sensitivo-motora crnica a nivel perifrico; en la mitad de estos casos la paraprotena IgM est dirigida contra los eptopos carbohidratos de la glicoprotena asociada a la mielina (MAG). En trminos generales la MW tiene una evolucin larvada, con una mediana de supervivencia de alrededor de 5 aos. 5.7. Enfermedad de cadenas livianas La enfermedad de cadenas livianas o mieloma de Bence Jones se caracteriza por la produccin monoclonal exclusivamente de la cadena liviana kappa o lambda, en ausencia de la cadena pesada correspondiente. En esta entidad es frecuente la asociacin a dao renal de diversa magnitud secundario al paso de esta inmunoglobulina a travs de la membrana glomerular. Adems, y especialmente cuando la cadena liviana es de tipo lambda, el depsito de esta protena a nivel del glomrulo

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y mesangio puede dar origen a una amiloidosis renal capaz de producir un sndrome nefrtico frecuentemente irreversible. 5.8. Amiloidosis primaria Se caracteriza por la formacin de fibrillas con configuracin espacial de tipo a partir de cantidades variables de cadenas livianas monoclonales, siendo mucho ms frecuente de observar en casos de clonalidad . Al igual que el MM, la amiloidosis suele presentarse durante la sptima dcada de la vida (mediana 62 aos) y se caracteriza clnicamente por fatigabilidad, baja de peso, compromiso del estado general y alteraciones neurovegetativas (parestesia, mareo, sncope, etc) que resultan progresivas y muy limitantes; asimismo, un tercio de los pacientes presenta sndrome nefrtico. Esta enfermedad suele ser tratada en forma similar al MM, sin embargo, la respuesta puede ser pobre, con compromiso progresivo que lleva inexorablemente a la muerte. 5.9. Enfermedad por cadenas pesadas Corresponden a enfermedades linfoproliferativas infrecuentes caracterizadas por la produccin monoclonal de Igs que carecen de cadenas ligeras. El primer reporte fue hecho en un caso de cadena pesada (enfermedad de Franklin). Sin embargo, dentro de estos sndromes es ms frecuente la enfermedad por cadenas (enfermedad de Seligmann) la menos frecuente compromete a la cadena . Cadenas pesadas La edad media es de 60 aos y usualmente se presenta con un cuadro semejante a un linfoma agresivo, con adenopatas, compromiso del estado general, anemia, fiebre y hepatoesplenomegalia y raramente a diferencia del MM tradicional- con lesiones osteolticas. Si bien hay casos de evolucin prolongada, la enfermedad suele cursar agresivamente, con una mediana de supervivencia de alrededor de 12 meses. Cadenas pesadas La mayor parte de los pacientes son de origen mediterrneo, con una presentacin en edades ms precoces que las otras variantes (segunda a tercera dcada de la vida). La enfermedad com-

promete frecuentemente el tracto digestivo, con sndrome de malabsorcin como sntoma habitual de presentacin y tiene una evolucin agresiva y fatal. Cadenas pesadas En esta entidad es frecuente encontrar hepatoesplenomegalia y, en cambio, es infrecuente la presencia de lesiones osteolticas. La electroforesis de protenas puede ser normal, pero en dos tercios de los casos se observa proteinuria monoclonal. El curso clnico puede ser variable, con evolucin incluso de varios aos.

6. DIAGNSTICO DIFERENCIAL ENTRE MGUS Y MM Adems de la dificultad para definir el grupo de pacientes con riesgo de progresar hacia un tumor clnico, la diferenciacin inicial entre MGUS y MM en algunos pacientes puede presentar dificultades, dado que los parmetros clnicos hasta ahora utilizados no son suficientes para discriminar correctamente en todos los casos, razn por la cual el diagnstico se realiza en presencia de un grupo de criterios clnicos como los definidos por el "Committee of the Chronic Leukemia-Myeloma Task Force", 1973 (tabla 27-4). Asimismo, la cantidad de componente-M srico suele ser uno de los parmetros de mayor utilidad, dado que, mientras mayor sea ste, mayor es la probabilidad de que se trate de un proceso maligno. Los niveles de hemoglobina, el porcentaje de CPs en mdula sea, la presencia de hipercalcemia, lesiones lticas seas, compromiso renal, etc., se utilizan en el diagnstico diferencial entre estas dos entidades. Sin embargo, existen casos de MGUS que presentan, por ejemplo, valores de componente-M mayor de 3 g/dL mantenidos en el tiempo, nivel utilizado como punto de corte en el caso de la IgG. Una caracterstica que parece tener importancia en el diagnstico diferencial es el ndice de proliferacin celular ("labelling index"), que corresponde a la cuantificacin del nmero de CPs en fase de sntesis de DNA durante el ciclo celular, aunque este mtodo presenta una tasa de falsos negativos elevada (hasta un 30% en la evaluacin de pacientes con MM). Por ltimo, los niveles de IL6, citoquina relacionada a la proliferacin de las CPs (ver punto 5), estn incrementados en una minora de los pacientes portadores de MGUS,

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mientras que se elevan en el 35% a 42% de los portadores de MM. El patrn inmunofenotpico evaluado por medio de citometra de flujo presenta menor ndice de error en esta discriminacin; mientras en el MM las CPs son siempre clonales en ausencia de CPs normales, en prcticamente el 100% las MGUS es posible demostrar la coexistencia de CPs clonales del todo similares a las CPs presentes en pacientes con MM- con CPs policlonales inmunofenotpicamente normales. Ms an, con este tipo de metodologa es posible evidenciar la naturaleza aneuploide de las primeras junto a la diploide de las segundas. Resulta interesante cmo este hecho explicara la diferencia muchas veces utilizada como otro criterio clnico diferencial- en la presencia de hipogammaglobulinemia residual en el MM pero no en las MGUS, que mantienen una produccin basal normal de inmunoglobulinas por parte de estas CPs residuales. De cualquier modo, y en un sentido clnico prctico, es importante sealar que sigue siendo fundamental el seguimiento clnico de los pacientes, con mediciones peridicas tanto de su componente-M como el resto de las inmunoglobulinas sricas y la evaluacin de posibles sntomas relacionados, para intentar pesquisar los casos de MM verdadero o aquellos casos de MGUS en transformacin.

7. PATOGENIA 7.1. Papel de IL-6 y va de la ciclina D1 Durante la ltima dcada ha quedado demostrado que uno de los factores de crecimiento ms importantes para las CPs en el MM es la IL-6, que se acompaa, adems, de un aumento en la expresin de la fraccin soluble de su receptor. El origen de este aumento y su accin es tanto autocrino (origen en las propias CPs) como paracrino -a partir del estroma medular- y ocurre en respuesta a otras citoquinas como el TNF o al interfern alfa (IFN-). As, en etapas iniciales de la enfermedad, las CPs son dependientes de IL-6 para su proliferacin, de modo que la suspensin de esta citoquina en estudios in vitro se acompaa de una reduccin en la tasa proliferativa de las clulas tumorales y de un aumento de su apoptosis. A medida que la enfermedad avanza, y probablemente como consecuencia de alteraciones adicionales del ciclo celular, esta dependencia de IL-6 se pierde y las CPs son capaces de mantener un ritmo proliferativo elevado an en su ausencia. Recientemente se ha demostrado que los niveles elevados de IL-6 estimulan la expresin de ciclina D1, con un aumento consecuente en la proporcin de CPs reclutadas a ingresar al ciclo celular y, por

Tabla 27-4. Criterios diagnsticos de Mieloma Mltiple Criterios Mayores Plasmocitoma en biopsia tisular Plasmocitosis medular 30% Cuantificacin de la Protena Monoclonal IgG > 3,5 g/dL IgA > 2 g/dL Bence Jones 1g/24h Criterios Menores Plasmocitosis medular 10 29% Protena M presente en niveles inferiores a los descritos en criterios mayores Lesiones osteolticas Disminucin en las Inmunoglobulinas no comprometidas en el componente M IgM < 50 mg/dL IgA < 100 mg/dL IgG < 600 mg/dL El diagnstico se confirma con al menos un criterio mayor y uno menor o tres criterios menores.

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tanto, a un aumento en la proliferacin celular. Apoyando esta va se ha encontrado una asociacin entre los niveles de expresin de ciclina D1 y la masa tumoral, junto a un incremento en antgenos asociados a proliferacin celular como, por ejemplo, Ki67- y a una mayor inmadurez celular. Por el contrario, se ha descrito variantes de IL-6 con menor afinidad por la gp-130 (constituyente esencial del receptor de IL-6, IL-GR) que se asocian a un "down regulation" en la expresin de ciclina D1, lo que se acompaa a su vez de una menor tasa proliferativa y de un aumento en la apoptosis en las CPs en lneas celulares. Finalmente, resulta interesante la observacin de que en casos de MGUS las CPs no tendran niveles incrementados de IL-6, lo que apoya el papel de esta va regulatoria en el crecimiento tumoral en esta enfermedad. A nivel clnico resulta interesante que la protena C reactiva (PCR) es regulada en su produccin precisamente por la IL-6, por lo que la medicin de este marcador se correlaciona con los niveles de la interleuquina estimuladora y, por lo tanto, de la actividad tumoral, como ya ha sido mencionado. 7.2. Genes supresores de tumores Existen algunas evidencias preliminares sobre el papel de genes supresores en el caso del MM. As, se ha encontrado mutacin de p53 en un subgrupo de pacientes, aunque con baja frecuencia. Otro gen supresor es p16, que compite con la ciclina D1 en su unin a CDK4/CDK6, inhibiendo la actividad kinasa de este complejo. Esto resulta en un aumento en la defosforilacin de pRb (gen de retinoblastoma) y en un aumento del arresto celular en fase G1 (es decir, limita la capacidad proliferativa). La inactivacin de este gen, presente en una serie de tumores, ha sido descrita en algunos casos de MM, tanto a nivel estructural (cromosmico) como por hipermetilacin, con la consiguiente prdida de accin represora sobre el complejo ciclina D1/ CDKs, como se ha evidenciado tanto en lneas celulares de MM como en casos al momento del diagnstico. Un tercer gen supresor en estudio es p21, tambin inhibidor de kinasas dependientes de ciclinas (CDKs) y que contribuyen a mantener pRb en estado defosforilado. Se ha podido demostrar que en la mayora de los casos de MM este gen se encuentra expresado en forma constitutiva y que esta expresin aumenta con el uso de dexametasona (droga conocidamente inductora de

apoptosis en CPs mielomatosas) y disminuye con niveles elevados de IL-6. Todos estos datos ponen en evidencia la importancia del balance entre el estmulo proliferativo inducido por citoquinas particularmente IL-6- sobre la va de las ciclinas, por un lado, y del efecto contrario dado por las protenas inhibidoras de estas kinasas como p16 y p21-, por otro, en la regulacin del ciclo celular en las CPs del MM. 7.3. Apoptosis de CPs La apoptosis -muerte celular programada- es un proceso complejo en su regulacin. Una de las familias de genes ms ampliamente estudiados en los ltimos aos es la familia de BCL-2, dentro de la cual existen genes con accin pro-apopttica (BAX, BCL-X(S)) y otro con funcin antiapoptosis (BCL-2, BCL-X(L)). En el caso del MM no est an bien caracterizado el estatus de esta familia de genes. Sin embargo, se han encontrado diferencias en la expresin de BCL-2 entre CPs de pacientes con MM y MGUS versus las CPs de plasmocitosis reactivas, con menor expresin en estas ltimas y mayor expresin en MM en estadios avanzados. Adems, recientemente se ha reportado que las CPs de MGUS tendran un ndice apopttico mayor que en casos de MM. Por otro lado, existe una segunda va de regulacin de apoptosis en MM aparentemente independiente de BCL-2, constituida por la va de APO/FAS (CD95). Al respecto, se ha podido ver que la apoptosis inducida por el ligando de CD95 (CD95L) se correlaciona con los niveles de CD95 expresados en las CPs en forma independiente del estatus de BCL-2. 7.4. Papel del estroma en las discrasias de CPs Durante los ltimos aos se ha puesto especial nfasis en el papel que parece jugar el estroma en MM a travs de la accin paracrina de IL-6 (producida por las clulas dendrticas del estroma), el posible rol de la infeccin por virus Herpes tipo 8, etc., que exceden el propsito de este captulo pero sobre los que debemos mantener atencin en los prximos aos.

8. TRATAMIENTO El detalle del tratamiento en esta enfermedad es complejo y excede los objetivos de esta

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publicacin, por lo que nos remitiremos a un resumen conceptual de los elementos ms importantes: Terapia de apoyo. Considerando la naturaleza crnica y hasta ahora no curable de esta enfermedad y las mltiples alteraciones clnicas que puede producir, resulta fundamental la evaluacin constante y el tratamiento de los dolores seos y fracturas en hueso patolgico, anemia, hipercalcemia, etc. Tratamiento citotxico. Los pacientes inicialmente asintomticos usualmente tienen una masa tumoral relativamente baja y una velocidad de progresin lenta. En este grupo no se ha demostrado un beneficio en trminos de mediana de supervivencia con tratamiento citotxico precoz. Por esta razn en etapas iniciales de la enfermedad slo est indicado un seguimiento cercano, usualmente evaluando parmetros sencillos como hemograma y cuanta del componente M mediante una electroforesis de protenas. Por el contrario, en aquellos pacientes sintomticos y/o con enfermedad de alta masa tumoral o progresiva est justificado el tratamiento, dado que mejora en forma significativa tanto la calidad como la mediana de supervivencia. El tratamiento considera dos formas esencialmente distintas como son: Dosis convencionales. Las drogas clsicamente ms utilizadas son la combinacin de Melfaln (usualmente 0,2 mg/Kg) y Prednisona (usualmente 2 mg/Kg) dados durante 4 das cada 4 a 6 semanas. Esta terapia suele ser relativamente bien tolerada y poco txica y permite un buen control de la enfermedad tanto en trminos subjetivos como objetivos. As, alrededor de un 50-70% de los pacientes logra una disminucin en su sintomatologa despus de 3 a 6 meses de tratamiento, lo que suele acompaarse de una reduccin en la masa tumoral, pero muy infrecuentemente de una desaparicin del componente M, que se mantiene evidente en la mayora de los casos. En aquellos casos que no responden a estas medidas o que se presentan con alteraciones agudas como insuficiencia renal una segunda alternativa consiste en quimioterapia endovenosa. Si bien existen diferentes protocolos en este sentido, una de las combinaciones de drogas ms utilizadas son la Vincristina, Adriamicina y Dexametasona (VAD), que resulta en un rpido alivio sintomtico en hasta dos tercios de los casos, con escasa toxicidad a la

mdula sea normal. Dosis altas y trasplante de mdula sea. Dado que el incremento menor de dosis de agentes alquilantes no ha logrado un impacto mayor en la sobrevida de los pacientes, se ha intentado un aumento mayor en dosis capaces de producir aplasia medular- apoyado por una reconstitucin de la mdula sea a travs de trasplante de progenitores hematopoyticos autlogos (recolectados del mismo paciente previamente). As, la experiencia del grupo francs demostr recientemente que este tipo de terapia es capaz de lograr una remisin completa de la enfermedad (ausencia de plasmocitosis medular y desaparicin del componente M) en hasta un 50% de los pacientes, logrando una significativa mayor sobrevida comparado con dosis convencionales. Esto ha significado que en pacientes jvenes (hasta 60 o incluso 65 aos) con enfermedad agresiva esta sea, actualmente, la alternativa de eleccin en casi todos los grupos clnicos. Con respecto al trasplante alogeneico -esto es, a partir de un donante histocompatible relacionado- la experiencia es menor esencialmente por la edad de la mayora de los pacientes (lo que disminuye la probabilidad de disponer de un donante) y por la toxicidad propia de l. Sin embargo, tanto la ausencia de contaminacin tumoral de la mdula sea injertada como el posible efecto de sta sobre las CPs tumorales residuales (efecto injerto contra mieloma) han logrado la curacin de un reducido nmero de pacientes y puede ser una alternativa a evaluar en grupos seleccionados de pacientes. Otras drogas. Otras vas teraputicas interesantes de cara al futuro lo constituyen drogas que modulan la respuesta inmune o la actividad celular como respuesta a las CPs tumorales. En esta lnea de pensamiento estn drogas como la talidomida, los interferones y la produccin de vacunas anti-idiotipos especficos para cada paciente, que por su extensin y complejidad no es posible desarrollar en este captulo.

LECTURAS SUGERIDAS Hallek, M.; Bergsagel, P.L.; Anderson, K.C., Multiple myeloma: increasing evidence for multistep transformation process, Blood 1998;91:3-21.

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Kawano, M.M.; Mihara, K.; Huang, N. et al., Differentiation of early plasma cells on bone marrow stromal-cells requires interleukin-6 for escaping from apoptosis, Blood 1995;85:487-94. Klein, B.; Zhang, X.J.; Lu, Z.Y.; Bataille, R., Interleukin-6 in human multiple myeloma, Blood 1995;85:863-72. Kyle, R.A., Monoclonal gammapathies en Clinical Immunology: Principles and Practice, (Rich, R.R.; Fleischer, T.; Schwartz, B.D.; Shearer, W.T.; Strober, W., Editores). Mosby-Year Book, Inc USA, captulo 116, pp. 1801-1811, 1996. Kyle, R.A., The gammmapathies, Seminars in Hematology 1995;32(1):4-79. Kyle, R.A.; Therneau, T.M.; Rajkumar, S.V. et al., A long-term study of prognosis in monoclonal gammopathy of undetermined significance, N Engl J Med 2002;346:564-9. Lemoli, R.M.; Martinelli, G.; Zamagni, E. et al., Engrafment, clinical and molecular follow -up of patients with multiple myeloma who were reinfused with highly purified CD34+ cells to support single or tandem high-dose chemotherapy, Blood 2000;95:2234-9. Lichstentein, A.; Tu, Y.; Fady, C. et al., Interleukin-6 inhibits apoptosis of malignant plasma cells, Cell Immunol 1995;162:248-55. Longo, D.L., Plasma cell disorders en Harrisons Principles of Internal Medicine, 14Ed (Fauci, A.S.; Braunwald, E.; Isselbacher, K.J.; Wilson, J.D.; Martin, J.B.; Kasper, D.L.; Hauser, S.J.; Longo, D.L., Editores), captulo 114, pp. 712-718, McGraw-Hill, USA, 1998. Tricot, G., New insights into role of microenvironment in multiple myeloma, Lancet 2000;355:248-50. Vescio, R.A.; Hong, CH.; Cao, J. et al., The hematopoietic stem cell antigen, CD34, is not expressed on the malignant cells in multiple myeloma, Blood 1994;84:3283-90.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 28
ENFERMEDADES ORALES DE ORIGEN INMUNOLGICO
Benjamn Martnez R.

1. Introduccin 2. Reacciones de hipersensibilidad orales 3. Manifestaciones orales de inmunodeficiencias 3.1. Candidiasis oral en infeccin por VIH 3.2. Leucoplasia pilosa 3.3. Sarcoma de Kaposi 4. Enfermedades autoinmunes orales 4.1. Sndrome de Sjgren 4.2. lcera oral recurrente (aftas)

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RESUMEN La mucosa oral, inclusive la enca, puede presentar distintas lesiones de origen inmunolgico, ya sea expresin por inmunodeficiencias, reacciones de hipersensibilidad, o manifestaciones de enfermedades autoinmunes. Muchas otras enfermedades bucales tienen participacin del sistema inmune (por ejemplo las enfermedades periodontales tales como periodontitis y gingivitis) pero solamente nos referimos en este captulo a aquellas que tienen un origen netamente inmunolgico, algunas de ellas son muy frecuentes en la poblacin como son las aftas (vulgarmente llamadas "fuegos"), otras ocasionan complicaciones bucales severas (sndrome de Sjgren) y otras han adquirido gran importancia en los ltimos aos (Sida y sus manifestaciones bucales).

1. INTRODUCCIN Muchas de las enfermedades de la boca, incluyendo las que comprometen dientes, huesos maxilares, mucosa oral y glndulas salivales, tienen un componente inmunolgico que puede explicar su origen, la forma como se desarrollan, cmo se defiende el organismo ante ellas, o por qu algunos pacientes presentan grados leves y otras grandes alteraciones. El gran avance experimentado por la inmunologa bsica no ha dejado de afectar el mejor conocimiento que se tiene de enfermedades tales como caries, quistes de los maxilares, cncer oral y aftas. Indudablemente que no se puede revisar todas las enfermedades de la boca en un captulo, por lo cual hemos seleccionado aquellas condiciones patolgicas ms interesantes para el inmunlogo clnico y que pueden estar comprometiendo la boca. En este captulo se describirn las manifestaciones orales de enfermedades de origen inmunolgico; se han agrupado en reacciones de hipersensibilidad, enfermedades autoinmunes e inmunodeficiencias.

2. REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD ORALES Las reacciones alrgicas no son extraas de presentarse en la mucosa oral, y lamentablemente muchas veces no son reconocidas por el especialista, ya que adoptan un aspecto clnico variado el cual puede ser una lcera, vescula, lesin blanca,

roja o mezcla, blanco y roja, roja y ulceracin. Las sustancias causales de hipersensibilidad, pueden ser cualquier sustancia que est o no en contacto con la mucosa oral, y la gran mayora provocan una hipersensibilidad tarda o tipo IV de la clasificacin de Gell y Coombs. Es muy raro encontrar otro tipo de reaccin de hipersensibilidad en boca, tal como la reaccin I o anafilctica, pero las tipos II y III prcticamente no se presentan en mucosa oral. La reaccin de hipersensibilidad tipo IV (ver captulo 21) es desencadenada en la boca por diversas sustancias tales como las que se encuentran en obturaciones de dientes como por ejemplo componentes de las amalgamas (plata, mercurio, estao, cobre), de prtesis dentarias (nquel, cromo, cobalto), de otras coronas dentarias (nquel, paladio), o sustancias en contacto con la mucosa, que pueden ser alimentos (naranja, chocolate, nuez, almendra, flor presente en el agua, etc.). Tambin cosmticos tales como lpiz labial. Para establecer el diagnstico es necesario solicitar test de hipersensibilidad a materiales dentales y alimentos. En el caso del producto dental al cual el paciente pudiera haberse sensibilizado, debiera ser reemplazado, por ejemplo las amalgamas por resinas, coronas de metales no nobles por metales nobles. En general la cermica es muy poco alergizante y pudiera preferirse en estos pacientes pero tiene un costo elevado, la otra alternativa son resinas compuestas pero tambin se ha descrito hipersensibilidad a este material. En el caso de los alimentos slo nos queda aconsejar que el paciente evite ingerir dicho alimento. En alergias a pr-

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tesis metlicas dentales, o pacientes con alergia a nquel y que poseen en la boca prtesis metlicas, la alternativa es usar implantes de titanio, las que tienen un elevado costo. Las manifestaciones clnicas que se pueden observar en pacientes con alergias a productos dentales son variadas: lceras mltiples en boca, que aparecen constantemente, similares a lceras orales recurrentes; lesiones dolorosas, con lceras que son de dos a seis u ocho milmetros, rodeadas por halo rojizo, que aparecen constantemente. Esto no significa que las aftas (tambin llamadas lceras orales recurrentes) sean de origen alrgico, pero s en algunos pacientes puede demostrarse una causa de hipersensibilizacin, y estos pacientes se pueden mejorar por completo de sus lceras. Las aftas (ver punto 4.1) no tienen una etiologa clara pero se cree que diversos factores inmunolgicos, tales como inmunodeficiencia celular, u otros pueden contribuir a su desarrollo como estrs, factores hormonales, alimentos, alteraciones hematolgicas, y puede que en muchos pacientes coincidan varios factores. Existe casi completa unanimidad respecto a que la causa no es viral, bacteriana o de origen microbiolgico. Existen pacientes que presentan lesiones de hipersensibilidad en contacto con amalgamas, o grandes obturaciones, en estos casos las lesiones han sido llamadas reacciones liquenoides, y se han confundido frecuentemente con liquen plano. El aspecto clnico de estas lesiones son manchas rojas con halo blanquecino, o estras blancas en la periferia (estras de Wickham descritas en liquen plano). Ambas lesiones han sido difciles de distinguir ya que ni clnica ni histolgicamente pueden diferenciarse por completo; la evaluacin del paciente, en conjunto con la biopsia de la lesin, el test de hipersensibilidad y la evolucin pueden llevar a establecer su origen, y su mejor tratamiento. El liquen plano tiene un componente psicosomtico importante y muchos pacientes tienen cancerofobia al igual como ocurre en el sndrome de boca urente, entidad en la cual se examina al paciente y no se encuentra ninguna alteracin patolgica, pero el paciente se queja de ardor en lengua, labios y a veces en mejillas. Estos pacientes en raras ocasiones pueden tener el sndrome de boca urente por hipersensibilidad y, por lo tanto, es conveniente descartar los agentes que se han mencionado anteriormente. Como se ha sealado a veces los pacientes con reacciones de hipersensibilidad orales pueden presentar lceras tipo aftas, otros presentan lesio-

nes idnticas o similares a liquen plano, otras lesiones blancas tipo leucoplasias, o rojizas tipo candidiasis eritematosa, o sndrome de boca urente y que corresponden a hipersensibilidad. El tratamiento debe iniciarse despus que se ha establecido el agente al cual se ha sensibilizado el paciente, suprimir dicha sustancia y en caso de ser necesario administrar corticoides va sistmica o tpica, logrndose un rpido alivio.

3. MANIFESTACIONES ORALES DE INMUNODEFICIENCIAS La mayora de los pacientes con inmunodeficiencias presenta lesiones orales en algn momento de su evolucin, desde inmunodeficiencias inespecficas, a inmunodeficiencias celulares o humorales. Debido a la importancia de la infeccin por HIV slo se describir sta (ver captulo 30). Desde el inicio de la epidemia por HIV se ha observado frecuentemente el compromiso de la boca por diferentes infecciones oportunistas especialmente ocasionadas por hongos (Cndida) y virus (Epstein-Barr, Herpes). Adems de la importancia que existe en reconocer o detectar un individuo infectado, lo cual eventualmente se puede realizar por las manifestaciones que se observan en la boca, tambin es importante diagnosticar y tratar adecuadamente las lesiones que se presentan ya que pueden ser causa de severa morbilidad. Otro aspecto importante en las lesiones bucales asociadas con HIV, es que algunas de ellas estn asociadas con una evolucin ms corta, en otras palabras, cuando se presenta candidiasis y leucoplasia pilosa, se ha observado que los individuos HIV positivos con dichas lesiones llegan antes a SIDA. Clasificacin de las lesiones orales asociadas con infeccin por HIV (como fue acordado en la Reunin del Grupo de Clasificacin de la C.E.E. para los problemas orales relacionadas con la infeccin por HIV, realizada en Londres, en septiembre de 1992). Todas las lesiones en los tres Grupos aparecen en orden alfabtico. 3.1. Candidiasis oral en infeccin por VIH La infeccin por HIV frecuentemente, ya sea en individuos asintomticos o con SIDA, se acompaa frecuentemente de infeccin por Cndida en

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Tabla 28-1. Clasificacin de las lesiones orales en la infeccin por HIV _____________________________________________________________________________________ Grupo I. Lesiones fuertemente asociadas con infeccin por HIV Candidiasis: Eritematosa, Seudomembranosa Enfermedad periodontal: Eritema gingival linear, Gingivitis Necrotizante (ulcerativa), Periodontitis Necrotizante (ulcerativa) Leucoplasia pilosa Linfoma no Hodgkin Sarcoma de Kaposi Grupo II. Lesiones menos frecuentemente asociadas con infeccin por HIV Estomatitis necrotizante (ulcerativa) Enfermedad de Glndula salival Boca seca por disminucin de flujo salival Tumoracin uni o bilateral de glndulas salivales mayores. Hiperpigmentacin melantica Infecciones bacterianas: Mycobacterium avium-intracelular, Mycobacterium tuberculosis Infecciones virales: Virus Herpes simplex, Virus Papiloma humano (lesiones tipo verrugas), Condiloma acuminado, Hiperplasia epitelial focal, Verruga vulgar, Virus varicela zoster, Herpes zoster, Varicela Prpura trombocitopnica Ulceracin NOS (Sin otra especificacin, del ingls: "Not Otherwise Specified") Grupo III. Lesiones observadas en la infeccin por HIV Aftas recurrentes Alteraciones neurolgicas: Parlisis facial, Neuralgia del trigmino Angiomatosis epitelioide (bacilar) Enfermedad por araazo de gato Infecciones bacterianas: Actinomices israelii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Infecciones por hongos diferentes de candidiasis: Cryptococcus neoformas, Geotrichum candidum, Histoplasma capsulatum, Mucoraceae (mucormicosis/ cigomicosis), Aspergillus flavus Infecciones virales: Citomegalovirus, Molusco contagioso Reacciones a drogas (ulcerativa, eritema multiforme, liquenoide, epidermolisis txica). _____________________________________________________________________________________

la boca. Esta candidiasis puede ser eritematosa, como al parecer, empieza en muchos casos, con enrojecimiento del paladar duro y dorso de lengua, en la cual se observa rea depapilada hacia el centro de ella, generalmente indolora. En la variedad seudomembranosa se presentan manchas blanquecinas, que se pueden desprender al raspado, dejando una superficie rojiza, a veces sangrante. Mucho menos frecuente es la variedad hiperplsica, que generalmente ocurre en cara interna de mejillas. La otra forma de candidiasis, es

queilitis angular, como zona descamativa en las comisuras, con enrojecimiento. Cuando se observe alguna de estas presentaciones de candidiasis en un individuo joven y no hay algn factor predisponente sistmico o localizado para explicar la presencia del hongo en la boca, debiera solicitarse exmenes para descartar la infeccin por HIV. Los factores que favorecen el desarrollo de la candidiasis bucal son muchos, y entre ellos destacan los siguientes: ingestin previa de antibiticos o corticoides, dficit nutricionales,

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alteraciones endocrinas, neoplasias malignas, y otras alteraciones inmunolgicas distintas de la ocasionada por HIV. La candidiasis tambin es una condicin frecuente en los extremos de la vida, recin nacidos y ancianos, portadores de prtesis (especialmente de acrlico), e individuos con xerostoma (sequedad de la boca). Se ha demostrado que individuos con HIV, asintomticos, y que presentan candidiasis, desarrollarn signos de SIDA al cabo de tres meses, en el 59% de ellos. Tambin se sabe que cerca del 70% de individuos con candidiasis oral tienen recuento de LT CD4 menor a 200 clulas/L. El diagnstico de la candidiasis generalmente se puede realizar por su aspecto clnico, pero se puede complementar con frotis y tincin de PAS, o cultivo. El tratamiento de la candidiasis oral es generalmente tpico: nistatina, de 500.000 UI, tres o cuatro veces al da (disolver y despus ingerir), ojal que por lo menos durante un mes en individuos HIV positivos o con SIDA. Pueden utilizarse otros antimicticos tal como fluconazol pero es ms costoso. 3.2. Leucoplasia pilosa En 1984 Greenspan y colaboradores describieron esta nueva lesin en patologa bucal, la cual es una mancha blanca, corrugada en el borde de lengua, bilateral, que no se desprende al raspado y ocasionada por el virus Epstein-Barr (VEB) que se observa ms frecuentemente en individuos HIV positivos, pero que tambin ha sido descrita en otras inmunodeficiencias. Esta mancha blanca tambin se caracteriza porque se encuentran hifas de cndida en la superficie, pero es de origen viral, observndose en las biopsias, hiperplasia epitelial, con marcada paraqueratosis, clulas similares a coilocitos (en ellas se puede demostrar presencia de viriones de VEB), de citoplasma claro con cuerpos de inclusin intranucleares, acantosis, y ausencia de infiltrado inflamatorio. El diagnstico de esta lesin tambin puede realizarse con frotis citolgico teido con Papanicolau. Esta lesin no requiere tratamiento, pero se ha observado que desaparece con algunos antivirales, y su importancia es que est asociada a HIV en la mayora de los pacientes, y que en aquellos casos que se presenta, se observa una evolucin a SIDA ms rpida. 3.3. Sarcoma de Kaposi El Sarcoma de Kaposi (SK) es la neoplasia intraoral ms comn que se observa en el SIDA y

generalmente se presenta en el paladar duro, como una mancha violcea o rojiza de lmite difuso, indolora, que en el 20% de los casos puede ser la primera manifestacin. Esta neoplasia a veces presenta un aspecto tumoral, pero muchas veces se observa como una mcula rojiza. En el primer caso tiene un pronstico peor. La casi totalidad de casos observados en Chile, con SK, han sido hombres homosexuales, y al parecer es raro de observar en otros grupos de riesgo. Este tumor es multifocal y en la boca puede observarse varias lesiones en paladar y/o enca, aunque lo ms frecuente es que el paciente tenga otras lesiones en la piel de las extremidades superiores, trax, o piel de la cara. Histolgicamente este tumor presenta una proliferacin de clulas fusadas, ms o menos arremolinadas, con formaciones de mltiples espacios vasculares, con clulas endoteliales atpicas, y abundante hemorragia antigua y reciente. Lamentablemente cuando se observa, son pocos los meses de vida que le quedan al paciente, y es tambin poco lo que se puede hacer, a no ser que el paciente est en un programa intensivo de terapia anti-retroviral.

4. ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORALES Las enfermedades autoinmunes pueden afectar la boca, y la ms conocida de ellas es el Sndrome de Sjgren, pero existen muchas otras que provocan lesiones severas como son el pnfigo, penfigoide, y en otras que la posible naturaleza de la lesin se cree que es autoinmune. A continuacin se describirn el Sndrome de Sjgren y las aftas, debido a que son las ms frecuentes en la poblacin. 4.1 Sndrome de Sjgren El Sndrome de Sjgren (SS) consiste en una trada de xerostoma, queratoconjuntivitis sicca (sequedad de la conjuntiva ocular) y otra enfermedad autoinmune, la mayora de las veces Artritis reumatodea. Cuando se presenta sin otra enfermedad autoinmune se conoce como "Sndrome Sicca", o SS primario, y el otro caso SS secundario, o sea con artritis reumatodea. Para establecer el diagnstico de (SS), segn criterio europeo, deben presentarse 4 de las 6 siguientes caractersticas, siendo requisito la presencia de (d) (e).

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a) Uno de tres sntomas oculares Ha tenido durante los ltimos tres meses, en forma persistente, molestias por sus ojos secos? Tiene en forma recurrente sensacin de arenilla en los ojos? Utiliza sustitutos de lgrimas ms de tres veces al da? b) Uno de tres sntomas bucales Ha tenido durante los ltimos tres meses, en forma persistente, sequedad de la boca? Ha tenido tumoracin recurrente o persistente de sus glndulas partidas? Frecuentemente toma lquidos para poder deglutir alimentos secos? c) Test de Schirmer (menor o igual a 5 mm/5 min). El test de Schirmer es un test oftalmolgico para la evaluacin de la produccin de lgrimas, en el cual se coloca un papel filtro en ambos ngulos internos del ojo y se observa su humectacin al cabo de 5 minutos. Si ella es menor o igual a 5 mm es sugerente de xeroftalma y podra estar asociada a sndrome de Sjgren, aunque existen muchas causas de ella al igual que en la xerostoma. El valor normal es de 10 mm de humedad para cada ojo despus de 5 minutos. d) Biopsia de glndula salival labial con score mayor o igual a 1 foco/mm2 (Un foco: infiltrado de al menos 50 linfocitos periductales). e) Positivo para alguno de los siguientes autoanticuerpos: Factor reumatodeo (FR), Anticuerpos antinucleares, (ANA), SS-A, SSB f) Positivo en alguno de los siguientes exmenes: cintigrafa, sialografa, flujo salival no estimulado.

El SS es ms comn en mujeres, y muchos pacientes se presentan con sntomas artrticos. La queratoconjuntivitis se manifiesta como sequedad y sensacin de arenilla en los ojos. Las principales caractersticas orales son: disminucin de la saliva, dificultad en la deglucin y masticacin, anomalas en la sensacin del gusto y una mucosa oral lisa y lustrosa. Algunos pacientes pueden presentarse con tumoracin bilateral de las glndulas

salivales, especialmente de la partida. Adems del criterio europeo para el diagnstico de SS, existe el llamado de San Diego, en que el diagnstico se basa en presencia de hallazgos objetivos (compromiso ocular: test de Schirmer o rosa de bengala; compromiso oral: flujo salival, sialografa, scintigrafa), y debe incluir biopsia de glndulas salivales labiales, y adems estudio serolgico positivo (SS-A, SS-B, FR, ANA). Para establecer el compromiso ocular se puede evaluar el flujo de las glndulas lacrimales con el test de Schirmer (explicacin en el punto C). En cuanto a la xerostoma debe medirse el flujo salival, el cual en estos pacientes se hace normalmente con estimulacin con cido ctrico al 5%. De ayuda es la biopsia de glndulas salivales menores, normalmente de cara interna del labio inferior, donde se toman tres o cuatro lobulillos glandulares y se demuestra infiltrado focal linfocitario (ms de un foco con 50 clulas mononucleares, principalmente linfocitos), periductales, que causan reemplazo de acinos glandulares. Otro estudio que se puede hacer es la sialografia (inyeccin de medio de contraste, especialmente en partidas), aunque en la actualidad se prefiere la cintigrafa de las gldulas salivales. Tiende a utilizarse cada vez ms el estudio de anticuerpos: SS-A, el cual est presente en el 70-80% de los pacientes con SS primario y menos del 10% de SS secundario. El anticuerpo SS-B, por otra parte se encuentra en el 50-70% de los SS primarios y menos del 5% de los casos secundarios. La causa del SS es desconocida, pero pueden existir algunos factores genticos y ltimamente se cree que puede estar relacionado a infeccin por VEB. Cerca del 80 a 90% de los casos se observan en mujeres, cercanas a los 40 aos, y en 15% de los pacientes que tienen artritis reumatodea se observa SS. El principal sntoma oral es la xerostoma, causada por la disminucin de la saliva, que a su vez ocasiona fcilmente infeccin por Cndida, en la mucosa del paladar y dorso de lengua, y tambin queilitis angular. Muchas veces la lengua, especialmente en casos avanzados, se observa depapilada, y que arde. La falta de saliva tambin favorece el desarrollo de caries cervicales, dificulta la alimentacin, e impide el uso adecuado de prtesis removibles. Cerca de un tercio de los pacientes pueden tener tumoracin de las partidas en el curso de la enfermedad, generalmente bilateral pero no dolorosa, y recurrente. Debido a la xerostoma no es infrecuente que

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se produzca adems la infeccin glandular. La sialografa, inyeccin de medio de contraste en el conducto de Stensen, permite detectar sialectasia puntiforme y no se observa la trama ductal normal, por lo que se observa un aspecto de "cerezo en flor" o de "frutos sin ramas", pero lo ms importante es determinar la presencia de zonas radiopacas de ms de 2 mm. Tambin con cintigrafa de Tecnecio 99 se puede demostrar retardo en la captacin y retardo en el vaceamiento. El paciente con SS tambin presenta queratoconjuntivitis, y generalmente ms que el dentista, es el oftalmlogo quien realiza o sospecha primero del diagnstico. La queratoconjuntivitis es debido a la xeroftalma, falta de lgrimas, y en el SS no slo estas glndulas estn afectadas sino tambin otras como las que se encuentran en cualquier mucosa (respiratoria, esfago, genital, etc.). Las manifestaciones oculares son menores en la maana y aumentan en la tarde, con sensacin de arenilla, o cuerpo extrao en los ojos. En los exmenes de laboratorio se observan una serie de alteraciones tales como aumento de la velocidad de sedimentacin, aumento de los niveles de inmunoglobulinas, especialmente IgG. El estudio de autoanticuerpos puede ser de utilidad y en los ltimos aos se est utilizando el factor reumatodeo, positivo en el 75% de los casos. AntiSS-A y anti-SS-B, son dos anticuerpos que se encuentran especialmente en pacientes con SS primario. La histopatologa demuestra que todas las glndulas salivales estn afectadas, y por esta razn se utiliza biopsia de glndulas salivales menores, especialmente desde la cara interna del labio inferior, de donde se extirpan tres a cinco lobulillos glandulares, y si se encuentran focos de linfocitos y plasmocitos con 50 o ms clulas cada uno, se confirma el diagnstico de SS (en una rea de 4 mm2 de tejido glandular). Entre ms focos de clulas inflamatorias se observn ms severo es el cuadro, y dichos focos se asocian con un mayor reemplazo de acinos, mayor fibrosis y enfermedad ms severa. El tratamiento del SS es de apoyo en base a lgrimas y saliva artificiales, ya que no existe ningn tratamiento definitivo. Los sialogogos tales como pilocarpina pueden estimular la secrecin salival. Tambin se utilizan corticoides pero el tratamiento debe realizarlo el mdico reumatlogo. El dentista puede colaborar evitando, tratando o ayudando a prevenir las complicaciones que aparecen en la boca, tales como candidiasis, caries

cervicales y enfermedad periodontal. 4.2 lcera oral recurrente (aftas) a) Etiopatogenia La lcera oral recurrente, afta, o estomatitis aftosa recurrente, y vulgarmente llamada "fuego", constituye una alteracin de la mucosa de revestimiento de la boca. Diferentes estudios han demostrado una frecuencia entre 5 y 66% de la poblacin, dependiendo del grupo en estudio. La mayora de los autores distingue factores predisponentes y factores etiolgicos en el origen del afta. Pero la realidad hasta el momento es que la etiologa exacta en la mayora de los casos no se establece, por lo cual es difcil tratar de explicar cmo diferentes factores etiolgicos pueden llegar a ocasionar la ruptura del epitelio, y especialmente en algunas ubicaciones de la boca, tal como en fondo de vestbulo, cara interna de los labios, piso de boca, paladar blando, o sea donde se encuentra la denominada mucosa de revestimiento, pero generalmente no se presentan estas lceras en la mucosa del dorso de la lengua, la enca o el paladar duro. De todas maneras para entender mejor como ocurre esta lesin es importante revisar los factores predisponentes, que en muchos casos puede explicar el origen del afta y demostrar en algunos casos factores que pueden corregirse y mejorar o disminuir la frecuencia de las lceras. La mayora de los pacientes que presentan aftas son en general sanos, pero debe recordarse que a veces se asocia esta lesin con algunas condiciones generales tales como la enfermedad de Behet, neutropenia cclica, sndrome de faringitis y fiebre peridica, dficit nutricionales, alteraciones gastrointestinales tales como colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, y en algunas inmunodeficiencias incluyendo SIDA. Varios estudios han demostrado, especialmente en Inglaterra y Estados Unidos, dficit de fierro, cido flico, o vitamina B12, y se estima que aproximadamente el 20% de los pacientes con aftas presentan este tipo de alteraciones. Debe sospecharse de dichas alteraciones en pacientes con aftas que empeoran, o sea que presentan las lceras cada vez con ms frecuencia o mayor grado de severidad. Algunos pacientes con aftas correlacionan la presencia de las lceras con algunos alimentos, no existen publicaciones con suficiente nmero de casos que corroboren dicha aseveracin, y ra-

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ramente cambios en la dieta alimenticia producen algn beneficio. Tambin existe la posibilidad de reaccin de hipersensibilidad a algn antgeno, que estara ocasionando probablemente un cuadro similar a dermatitis por contacto, o de atopia en algunos pacientes. En algunas mujeres se ha observado que las aftas tienen un ciclo relacionado con la fase ltea del ciclo menstrual, presumiblemente asociado con los cambios en los niveles de progestgenos. Tambin existen factores locales que predisponen a la aparicin de las aftas tales como trauma y en algunas personas predispuestas a la aparicin de estas lesiones, un trauma mnimo puede desencadenar la lesin, en una mucosa no queratinizada; esto se relaciona tambin con la menor frecuencia de aftas que ocurre en fumadores, y la ausencia casi completa de lceras en la mucosa oral queratinizada. De todas maneras es claro que las aftas y su etiologa fundamental no est an clara, y en la actualidad la mayora de los autores concuerda que existe una alteracin mediada por un mecanismo inmunolgico, pero no existe tampoco acuerdo del mecanismo inmunopatognico que ocasiona la ulceracin, que explique la intermitencia de las lesiones, la naturaleza autolimitante de las lceras, y la falta para responder ante drogas inmunomoduladoras. Los estudios histopatolgicos y mediante tcnicas de inmunohistoqumica han permitido demostrar la presencia de linfocitos grandes granulares (clulas NK) y de linfocitos TCD4+, en la etapa pre-ulcerativa, mientras que la fase de ulceracin est asociada con la aparicin de linfocitos TCD8+, y estos son reemplazados por clulas TCD4+, en la fase de reparacin. Tambin se encuentran neutrfilos, pero a diferencia de la enfermedad de Behet donde ellos estn hiperactivos, en el afta no se observa alteracin en la funcin quimiotctica. En la fase ulcerativa los antgenos HLA de clase I y II se encuentran en las clulas basales del epitelio y posteriormente en todos los estratos epiteliales debido probablemente a interfern gamma (IFN) liberado por los linfocitos T. Estos antgenos pueden servir as de target para que las clulas epiteliales sean atacadas por linfocitos CD8+, y es posible observar en biopsias de pacientes con aftas la presencia, ms all de lo normal, de linfocitos intraepiteliales, en el estrato espinoso. De todas maneras el mecanismo inmune, que inicialmente se crey que era mediada por clulas, parece ser ms probable que involucre un mecanismo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos mediada por linfocitos

B, con participacin de complejos inmunes, que incluso se ha observado elevados en algunos pacientes, pero no precisamente en aquellos que tienen aftas menores. Se ha observado depsito de complejos inmunes en biopsias, a nivel del estrato espinoso, y hay algunas evidencias de vasculitis por complejos inmunes que conlleva un deposito de inmunoglobulinas y complemento. Uno de los aspectos que durante muchos aos se ha investigado es la asociacin del afta con algn microorganismo, especialmente de origen bacteriano, y en concreto del grupo de los estreptococos, ya sea como patgeno directo o como estmulo antignico que llevara a la generacin de anticuerpos que podran tener una reaccin cruzada con el epitelio. Inicialmente en el ao 1963 se demostr que sera un Streptococcus sanguis pero posteriormente se seal que sera de la cepa Streptococcus mitis, pero estudios siguientes no han demostrado que haya diferencias entre los sujetos con aftas y controles en cuanto a su respuesta mitgenica linfocitaria. No se ha demostrado la presencia de antgenos y viriones del virus herpes en el afta y es claro que los tratamientos del afta que han empleado antivirales no tienen ningn beneficio. b) Caractersticas clnicas Las lceras orales recurrentes pueden clasificarse, de acuerdo a Lehner, en afta menor, afta mayor y lceras herpetiformes. La asociacin con lesiones extraorales de cualquiera de las variedades anteriores, en la cual se observa compromiso de mucosa genital, piel, y a veces articulaciones y alteraciones neurolgicas se denomina sndrome Behet. Debido a que no hay ningn otro medio para hacer el diagnstico del afta, diferente del reconocimiento de sus caractersticas clnicas, es extremadamente importante que el clnico que examina la mucosa bucal, establezca este diagnstico correctamente. Esta lesin se caracteriza por la recurrencia de una o ms lceras de forma redondeada, dolorosa, a intervalos de unos pocos das o de meses. Generalmente se inicia en la niez o adolescencia y persiste durante varios aos. Lamentablemente no existen suficientes publicaciones que permitan caracterizar los distintos aspectos clnico-patolgicos de las distintas variedades de afta y en general uno encuentra publicaciones que relatan caractersticas para todos los tipos de aftas y parecera conveniente investigar

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si existen algunos factores importantes en la etiologa, la histopatologa y el tratamiento en los distintos tipos de aftas. Afta menor. Es la variedad ms comn, cerca del 80% de todas las lceras orales recurrentes, y se caracteriza por lceras, entre 1 y 5, redondas u ovaladas de menos de 10 mm de dimetro con una seudomembrana blanco-griscea y rodeada por un halo eritematoso. Generalmente este tipo de lcera se presenta en cara interna del labio, mejilla y piso de boca, y excepcionalmente puede encontrarse en la enca y el dorso de la lengua. Estas lesiones sanan dentro de 10-14 das sin dejar cicatriz. Al parecer esta variedad es un poco ms frecuente en mujeres. Muchas veces antes de presentarse existe una fase prodrmica caracterizada por parestesia en el sitio que posteriormente aparece la ulceracin. Afta mayor. Son lceras muy dolorosas, pero afortunadamente menos frecuentes que el afta menor. El paciente generalmente tiene entre 1 y 10 lceras, miden entre 10-30 mm y tambin recidivan con frecuencia. Afectan especialmente el paladar blando, mejillas, cara interna de los labios, pudiendo demorar hasta 6 semanas en sanar y dejando una cicatriz a diferencia de lo que ocurre en el afta menor. Esta lcera se puede distinguir del afta menor, adems del tamao, por que tiene un aspecto crateriforme, y tendencia a presentar bordes levantados, y al igual que el afta menor tambin tiene un exudado fibrinoso amarillento-grisceo, y una periferia rojiza. lceras herpetiformes. Esta variedad de lcera tiene una frecuencia similar con el afta mayor. Se caracteriza por la presencia de hasta 100 lceras pequeas, que pueden afectar de preferencia la mucosa de revestimiento, y ocasionalmente otras zonas, y se inicia como pequeas lceras del tamao de una cabeza de alfiler, que pueden ir aumentando de tamao y coalesciendo entre ellas. Puede haber una permanencia de las lceras en la cavidad oral, pero generalmente sanan a los 14 das. A veces puede haber disfagia, y al igual que en el afta mayor, podra haber perdida de peso por la dificultad para alimentarse.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 29
OTRAS ENFERMEDADES INMUNOMEDIADAS
Cecilia Seplveda C.

1. Introduccin 2. Algunas enfermedades inmunomediadas 2.1. Lupus eritematoso sistmico 2.2. Artritis reumatoidea 2.3. Enfermedades mediadas por anticuerpos 2.4. Otras enfermedades

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RESUMEN Un grupo heterogneo de enfermedades es mediado por mecanismos inmunes. Dicha respuesta inmune puede estar dirigida contra antgenos ajenos al organismo o propios. Entre las enfermedades autoinmunes, el Lupus Eritematoso Sistmico (LES) es una de las ms caractersticas y afecta principalmente a las mujeres. Se caracteriza por ser rgano inespecfica y en su patogenia participan complejos inmunes. Otras enfermedades inmunomediadas, de las que se describe el mecanismo fisiopatolgico en este captulo, son: Artritis reumatoidea, Anemia hemoltica autoinmune, Sndrome de Good Pasteure, Enfermedad de Graves y Miastenia gravis.

1. INTRODUCCIN Las enfermedades mediadas inmunolgicamente comprenden un grupo clnicamente heterogneo. Pueden ser iniciadas por una respuesta inmune dirigida contra antgenos extraos o propios (autoinmunidad). Los mecanismos patognicos incluyen la participacin de complejos antgeno-anticuerpo, autoanticuerpos dirigidos contra antgenos tisulares o de superficie celular, y clulas T. Los mecanismos efectores por los cuales los anticuerpos y los complejos inmunes inducen injuria tisular incluyen activacin del sistema del complemento y de clulas inflamatorias. Las clulas T reclutan y activan macrfagos como los efectores principales de hipersensibilidad retardada e injuria tisular, en otros casos actan directamente clulas T CD8+. En algunas de estas enfermedades el agente etiolgico es desconocido, como por ejemplo en el Lupus Eritematoso Sistmico (LES); en otras de ellas el agente etiolgico se conoce y el dao est mediado por la respuesta inmune que se genera contra ste o bien a travs del mimetismo molecular, cuando la respuesta inmune se produce contra un antgeno extrao que tiene similitud antignica con antgenos propios, como ocurre en la Enfermedad reumtica. Algunas de estas enfermedades son sistmicas, es decir, afectan a varios rganos y sistemas, otras en cambio, son rgano especficas. En este captulo se incluyen algunas de las enfermedades ms frecuentes: Lupus Eritematoso Sistmico, Artritis Reumatoidea, Enfermedades mediadas por anticuerpos y Otras enfermedades.

2. ALGUNAS ENFERMEDADES INMUNOMEDIADAS 2.1. Lupus Eritematoso Sistmico Es el prototipo de las enfermedades sistmicas autoinmunes, aqueja principalmente a mujeres en edad frtil y sus manifestaciones pueden afectar a todos los rganos y sistemas. La mayora de los pacientes presentan alteraciones de la piel (por ejemplo eritema malar en mariposa), dolores y/o inflamacin articular, manifestaciones renales y hematolgicas. Se caracteriza por perodos de actividad de la enfermedad que fluctan con perodos de remisin. Si bien su causa se desconoce, es ampliamente aceptado que se requiere la interaccin de mltiples factores para que el LES se desencadene, entre ellos factores genticos, hormonales, ambientales e inmunolgicos (ver captulo 24). La predisposicin gentica del LES est relacionada con alelos del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC, HLA en humanos), as por ejemplo HLA-DR2 y HLA-DR3 estn aumentados en pacientes con LES, y adems con deficiencias del complemento, por ej. con el alelo nulo C4A. Es frecuente encontrar otros miembros de la familia afectados por enfermedades autoinmunes o bien detectar en ellos la presencia de autoanticuerpos sin manifestacin alguna de enfermedad. Entre los factores ambientales relacionados con el LES de gran importancia es la exposicin a las radiaciones ultravioleta y algunas drogas (LES

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inducido por drogas que es reversible al retirar la droga). Las alteraciones inmunolgicas que se encuentran en estos pacientes incluyen la presencia de autoanticuerpos, aumento de la funcionalidad de las clulas T "helper" cooperadoras, falla de la funcin de clulas T supresoras, disminucin del "clearence" de complejos inmunes. Mltiples autoanticuerpos son caractersticos y frecuentes en el LES, entre ellos los anticuerpos antinucleares dirigidos contra diferentes estructuras nucleares, los que pueden detectarse por la tcnica de inmunofluorescencia indirecta y constituyen un marcador presente en casi el 100% de los casos. Muchos pacientes tienen anticuerpos antiDNA nativo, as como autoanticuerpos dirigidos contra estructuras nucleares extractables en salino (ENA). Tambin pueden tener anticuerpos dirigidos contra clulas sanguneas y otras estructuras. Mltiples causas pueden llevar a la aparicin de estos autoanticuerpos: quiebre de la tolerancia a lo propio, reactividad cruzada y mimetismo molecular, alteracin en el control de la apoptosis, estimulacin policlonal de clulas B, etc. El dao tisular en el LES es causado en gran medida por complejos inmunes, incluyendo dao debido a vasculitis y a glomerulonefritis. En la actualidad el tratamiento del LES permite una expectativa de sobrevida que supera el 90% a los 10 aos del diagnstico, sin embargo, muchos pacientes pueden presentar secuelas por el dao inflamatorio del LES, por ejemplo falla renal. Por otra parte, pueden presentar complicaciones derivadas del tratamiento sostenido con corticoides e inmunosupresores. 2.2. Artritis Reumatoidea (AR) La AR es una enfermedad inflamatoria crnica sistmica, que afecta a alrededor del 1% de la poblacin, siendo ms frecuente en mujeres, al igual que el LES. Si bien su causa se desconoce, ha podido establecerse que esta enfermedad se desencadena en individuos genticamente susceptibles, cuando son expuestos a un agente antignico relevante (ver captulo 24). Muchas evidencias apuntan a que las clulas T, activadas por el antgeno, juegan un rol crtico en el inicio y perpetuacin de la inflamacin sinovial que caracteriza a esta enfermedad. En cuanto a la naturaleza de este antgeno, se han postulado varios agentes infecciosos ubicuos, los que en forma directa o indirecta, desencadenaran el dao. Entre los me-

canismos indirectos por los que podra causar dao este antgeno, se postula entre otros mecanismos, que alterara la inmunogenicidad de las estructuras articulares, actuara a travs de mimetismo molecular, o bien actuar como tipo superantgeno. En la sinovial inflamada se han encontrado mltiples citoquinas, postulndose que un desbalance en su produccin sera un factor decisivo en la fisiopatologa de la AR. As, por ejemplo se encuentran aumentadas citoquinas tales como IL-1, TNF- e IFN-, las cuales pueden favorecer la inflamacin y proliferacin sinovial, la destruccin del cartlago y del hueso adyacente y explicar algunas de las manifestaciones sistmicas de la enfermedad. Su relevancia en la patogenia de la AR ha quedado demostrada al demostrarse que la terapia con anticuerpos monoclonales dirigidos contra el TNF-, logran controlar estas manifestaciones. Al igual que lo descrito en el LES, en la AR intervienen mltiples factores. Entre ellos los factores genticos son de gran relevancia, como por ej. los alelos HLA-DR4, los ms frecuentemente encontrados en estos pacientes. La presentacin clnica caracterstica es la de una poliartritis simtrica, generalmente asociada a sntomas constitucionales como fiebre y fatiga. Se afectan, preferentemente, las pequeas articulaciones de manos y pies, las cuales pueden llegar a deformarse como consecuencia del dao causado por la inflamacin sinovial. En el 75-90% de los casos se encuentra la presencia de factores reumatoides en estos pacientes. Estos son autoanticuerpos (generalmente de clase IgM) reactivos contra la regin Fc de la IgG. Estos autoanticuerpos no son especficos, pueden encontrarse presentes en otras enfermedades (inflamatorias, infecciosas, tumorales), y tambin hasta en un 5% de la poblacin general, especialmente de edad avanzada, en ttulos bajos. 2.3. Enfermedades mediadas por anticuerpos Muchas enfermedades inmunolgicas se asocian con la produccin de autoanticuerpos, o se cree que son causadas por stos. La mayora de estas enfermedades son rgano-especficas (tabla 29-1). La Anemia hemoltica autoinmune y la Trombocitopenia autoinmune son causadas por autoanticuerpos dirigidos contra los glbulos rojos y las plaquetas, respectivamente. Los anticuerpos causan lisis dependiente de comple-

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Tabla 29-1. Enfermedades causadas por autoanticuerpos

Enfermedad Glomerulonefritis (S. de Good Pasture)

Clnica Nefritis, hemorragia pulmonar Anemia hemlisis Vesculas en piel

Mecanismos Complemento, neutrfilos

Autoanticuerpos Anti-membrana basal rin y pulmn Anti-protenas membrana Anti-uniones intercelulares epidrmicas Anti-membrana basal epidrmica

Anemia autoinmune Hemoltica Pnfigo vulgar

Lisis, fagocitosis

Disrupcin adhesin intercelular Disrupcin unin dermoepidrmica Bloqueo receptores acetilcolina Estimulacin receptor TSH

Penfigoide buloso

Vesculas en piel

Miastenia gravis

Debilidad Muscular

Anti-receptor acetilcolina

Enfermedad de Graves

Hipertiroidismo

Anti-receptor TSH

mento de las clulas sanguneas y las opsonizan, llevando a un aumento de la fagocitosis por los fagocitos mononucleares (ver captulo 26). La anemia hemoltica autoinmune y la trombocitopenia autoinmune son generalmente de causa desconocida, aunque algunas veces se producen como una reaccin adversa a algunas drogas. En este ltimo caso, pueden deberse a la presencia de neoantgenos, creados al unirse la droga o sus metabolitos a las membranas celulares. El sndrome de Good Pasture es una enfermedad caracterizada por hemorragias pulmonares y glomerulonefritis. Es causada por un autoanticuerpo que se une a un dominio del colgeno tipo IV presente en las membranas basales de los alvolos pulmonares y capilares glomerulares. La unin de este anticuerpo provoca activacin local del complemento y neutrfilos. Al examen microscpico puede observarse necrosis e infiltrados neutroflicos y por microscopa de fluorescencia pueden detectarse depsitos de anticuerpos a lo largo de las membranas basales. Algunas enfermedades autoinmunes de la

piel se deben a anticuerpos dirigidos contra molculas de adhesin de las clulas epidrmicas o antgenos de la membrana basal. Los anticuerpos alteran la adhesin de las clulas entre ellas o a la membrana basal, causando la formacin de ampollas. Varias formas de vasculitis, inflamacin de los vasos sanguneos, se asocian con autoanticuerpos reactivos con proteinasas de los grnulos de los neutrfilos, stos son los anticuerpos anti-citoplasma de neutrfilos (ANCA) que al reaccionar con el antgeno causan degranulacin de los neutrfilos e injuria alrededor de los vasos sanguneos. El Sndrome antifosfolpido, caracterizado por trombosis venosas y abortos recurrentes, es causado preferentemente por anticuerpos dirigidos contra complejos protenas-fosfolpidos aninicos (ver captulo 25). Anticuerpos dirigidos contra receptores de membrana pueden causar alteraciones funcionales sin involucrar otros mecanismos. As por ejemplo en la Enfermedad de Graves, una enfermedad autoinmune de la glndula tiroides caracteri-

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zada por hipertiroidismo, un autoanticuerpo especfico para el receptor de la hormona estimulante de la tiroides (TSH) presente en las clulas epiteliales tiroideas, se une a stos estimulando a las clulas a producir hormonas tiroideas del mismo modo que lo hace la TSH proveniente de la hipfisis. Un ejemplo de inhibicin de la actividad de un receptor la vemos en la Miastenia gravis, una enfermedad causada por autoanticuerpos que se unen al receptor de la acetilcolina en la placa motora de la unin neuromuscular. La unin de estos anticuerpos interfiere con la trasmisin neuromuscular mediada por acetilcolina. El resultado es una falla muscular para responder a los impulsos nerviosos, que se expresa en debilidad muscular progresiva. Un muy buen ejemplo de enfermedad causada por anticuerpos producidos contra antgenos extraos que tienen reactividad cruzada con antgenos propios ocurre en la Enfermedad Reumtica. Esta enfermedad se presenta como una complicacin tarda de una amigdalitis estreptoccica y se caracteriza por artritis, endocarditis y miocarditis, y alteraciones neurolgicas. Se cree que la injuria miocrdica se debe a un anticuerpo contra una protena de la pared celular del estreptococo, el cual se une a un antgeno del miocardio, con el cual esta protena presenta un mimetismo molecular. 2.4. Otras enfermedades Existen varias otras enfermedades sistmicas autoinmunes, adems del LES y de la AR, como por ejemplo la Esclerosis sistmica progresiva, el Sndrome de Sjgren, Artritis reumatoide juvenil Espondiloartropatas y Vasculits sistmicas. Entre las enfermedades rgano-especficas ms frecuentes cabe destacar enfermedades desmielinizantes del sistema nervioso central, diabetes autoinmune, enfermedades inflamatorias del intestino, varias formas de hepatitis y de nefritis.

Feldmann, M.; Brenan, F.M. and Maini, R.N., Rheumatoid arthritis, Cell 1996; 85: 307-310. Harris, E.D., Rheumatoid arthritis, N Eng J Med 1990; 322: 1277-1281. Naparstek, Y., and Poltz, P.H., The role of autoantibodies in autoimmune diseases, Annual Review of Immunology 1993; 11: 79-104.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 30
INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS
Mnica Cornejo De L. y Marta Zelazko de Ch.

1. Introduccin 2. Inmunodeficiencias primarias 2.1. Aspectos genticos de las IDP 2.2. Estudios de laboratorio inmunolgico para el diagnstico de IDP 2.3. Caractersticas de las IDP 3. Tratamiento de las inmunodeficiencias congnitas

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RESUMEN Existen deficiencias primarias del sistema inmune (defectos genticos que se manifiestan generalmente en la infancia) o ms frecuentemente secundarias a otros procesos patolgicos. El defecto puede ser a nivel de la inmunidad especfica (alteracin de LT, B o ambos) o de la inmunidad innata (defectos de fagocitos o del complemento). Las inmunodeficiencias se manifiestan principalmente por aumento de susceptibilidad a infecciones. La naturaleza de la infeccin recurrente depende del componente del sistema inmune alterado (ej. deficiencias de inmunidad humoral se asocian a infecciones por bacterias pigenas, deficiencias de inmunidad celular a infecciones por virus y microorganismos intracelulares). Existe, adems, asociacin a algunos tipos de enfermedades autoinmunes, mayor frecuencia de tumores (especialmente linforreticulares) y en algunos casos manifestaciones alrgicas. En la mayora de las Inmunodeficiencias Primarias el patrn hereditario es de carcter recesivo (mutaciones en cromosoma X o autosmico). En varias de ellas se ha localizado el cromosoma especfico, es posible detectar portadores y hacer diagnstico prenatal. En el captulo se describen ejemplos seleccionados de deficiencias primarias de clulas B, T, o ambas y defectos de Inmunidad Natural. Las posibilidades teraputicas en la actualidad incluyen el uso de gammaglobulina endovenosa, trasplante de mdula sea, reemplazo enzimtico y, a futuro, reemplazo del gen defectuoso.

1. INTRODUCCIN La integridad del Sistema Inmune (SI) es esencial para la defensa contra organismos infecciosos y sus productos txicos y, por lo tanto, para la sobrevida de los individuos. Defectos en uno o ms componentes del SI pueden llevar a enfermedades graves, ocasionalmente fatales. Estas enfermedades se clasifican en 2 grupos: Inmunodeficiencias Primarias (IDP) que son defectos genticos del Sistema Inmune y se manifiestan generalmente en la infancia e Inmunodeficiencias Secundarias que se desarrollan por una variedad de condiciones patolgicas (como cnceres diseminados, enfermedades metablicas, desnutricin), drogas inmunosupresoras o infecciones de las clulas del Sistema Inmune (ej. Virus de la Inmunodeficiencia humana o VIH) (ver captulo 31). La respuesta deficiente puede resultar a su vez de anormalidades en la inmunidad adquirida o innata. Defectos de inmunidad especfica pueden deberse a desarrollo, activacin o funcin anormal de LT, B o ambos. Alteracin de la inmunidad innata, a defectos a nivel de los Fagocitos o del Sistema de Complemento.

Tanto las Inmunodeficiencias Primarias como Secundarias se manifiestan por un aumento de susceptibilidad a infecciones. La naturaleza de la infeccin depende del componente del Sistema Inmune alterado, as por ejemplo, defectos de inmunidad humoral se asocian a infecciones por bacterias pigenas, mientras que defectos de inmunidad celular principalmente por virus y microorganismos intracelulares. Adems de las infecciones los pacientes con IDP Especficas son especialmente susceptibles a enfermedades malignas de tipo linforreticular (la mortalidad por cncer en las inmunodeficiencias puede ser 10 - 200 veces mayor que lo esperado para poblacin general de la misma edad). Algunas inmunodeficiencias se asocian a enfermedades autoinmunes como anemia hemoltica autoinmune, prpura trombocitopnico idioptico, lupus eritematoso, hepatitis crnica activa, entre otros y puede haber algn papel en el desarrollo de alergias. Desde la descripcin en 1952 de la primera inmunodeficiencia (Agammaglobulinemia, Bruton) a la fecha se han descrito un gran nmero de sndromes que regularmente son clasificados por un grupo de expertos de la Organizacin Mun-

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dial de la Salud (OMS) (tabla 30-1). En los ltimos aos se ha visto un gran avance en terapia y en la identificacin de las bases moleculares de

varias de estas enfermedades lo que ha permitido diagnsticos ms especficos y terapias ms efectivas.

Tabla 30 - 1. Clasificacin de Inmunodeficiencias Primarias Grupo Cientfico OMS (1999) Inmunodeficiencias Combinadas Inmunodeficiencia Combinada Severa (IDCS) T- B+ a) Ligada al cromosoma X (deficiencia c) b) Autosmica recesiva (deficiencia Jak3) Inmunodeficiencia combinada severa T- Ba) Deficiencia de RAG 1/ 2 b) Deficiencia de adenosina desaminasa (ADA) c) Disgenesia reticular Inmunodeficiencia combinada severa T+ Ba) Sndrome de Omenn b) Deficiencia del R+IL - 2 Sndrome Hiper IgM ligado a X Deficiencia de fosforilasa del nucleosido purina (PNP) Deficiencia de CMH clase II Deficiencia de CD3 o CD3 , ZAP-70, TAP-2 Deficiencias Predominantemente de Anticuerpos Agammaglobulinemia ligada al X / Autosmica recesiva Delecin gen cadena pesada Igs Deficiencia cadena Kappa Deficiencia selectiva de Ig Deficiencia anticuerpos con Ig normal o elevada Inmunodeficiencia comn variable (IDCV) Sndrome de Hiper IgM no ligado al X Hipogammaglobulinemia Transitoria de la infancia Inmunodeficiencia Asociada a Otros Defectos Wiskott - Aldrich Ataxia-Telangiectasia Anomala de DiGeorge ID con albinismo Sndrome proliferativo ligado a X Deficiencias de Complemento Deficiencias de Nmero y/o Funcin Fagoctica Neutropenia congnita Neutropenia cclica Defecto de adhesin leucocitaria Deficiencia de grnulos especficos Sndrome de Schwachman Enfermedad Granulomatosa Crnica a) Ligada al cromosoma X b) Autosmica recesiva Deficiencia de glucosa 6 fosfato deshidrogenasa Deficiencia de mieloperoxidasa Defectos micobactericidas a) Deficiencia del receptor IFN b) Deficiencia del receptor IL-12

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2. INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS Las deficiencias de respuesta inmune especfica se clasifican, de acuerdo al Comit de Expertos de la OMS (tabla 30-1), en tres categoras generales: a) Inmunodeficiencias combinadas, b) Deficiencias predominantemente de anticuerpos y c) Inmunodeficiencias asociadas a otros defectos. Por su parte, las deficiencias de inmunidad innata comprenden: a) Deficiencias del sistema del complemento y b) Deficiencias de funcin fagoctica. 2.1. Aspectos genticos de las IDP En un nmero permanentemente creciente de IDP se ha localizado el cromosoma especfico (tabla 30-2) y se ha identificado el error biolgico fundamental. En la mayora de las IDP los patrones hereditarios son de carcter recesivo, algunos causados por mutaciones en genes en el cromosoma X y otras en cromosomas autosmicos. Se ha localizado el gen defectuoso en el cromosoma X en: Agammaglobulinemia ligada al X, Inmunodeficiencia combinada severa ligada al X, Sndro-

me de Wiskott-Aldrich, Enfermedad linfoproliferativa ligada al X, Sndrome Hiper IgM, Deficiencia de properdina, Enfermedad granulomatosa crnica. Algunos ejemplos de mutaciones a nivel de cromosomas autosmicos incluyen: Deficiencia de protenas de adhesin (CD18), Inmunodeficiencias combinadas debidas a defecto de Adenosina Desaminasa (ADA) o Fosforilasa del nuclesido purina (PNP, Purine Nucleoside Phosphorylase). En la actualidad es posible detectar portadores en varias de estas enfermedades, as como tambin hacer diagnstico prenatal estudiando muestras de sangre fetal, clulas amniticas o por biopsia de vellosidades corinicas. La identificacin en la ltima dcada de numerosos genes implicados en la etiologa de las Inmunodeficiencias Primarias nos ha permitido tener una nueva perspectiva al evaluar estas enfermedades. Esta nueva informacin oblig adems a reevaluar los criterios utilizados hasta ahora para hacer diagnsticos de Inmunodeficiencias Primarias. Los nuevos criterios diagnsticos recientemente establecidos por la Sociedad Europea

Tabla 30 - 2. Localizacin cromosmica de inmunodeficiencias primarias Inmunodeficiencia Inmunodeficiencia combinada severa ligada al X Agammaglobulinemia ligada al X Sndrome de Hiper IgM ligado al X Sndrome de Wiskott-Aldrich Enfermedad Granulomatosa Crnica ligada al X Sndrome Linfoproliferativo ligado al X Deficiencia de Adenosina Desaminasa Deficiencia Jak3 Deficiencia de Fosforilasa del Nucleosido Purina Deficiencia de ZAP- 70 RAG-1/RAG-2 Deficiencia de Cadena Kappa Delecin de Cadena Pesada de Ig Ataxia-Telangiectasia Enfermedad Granulomatosa Crnica Autosmica Recesiva p22 phox p47 phox p67 phox Deficiencia de Adhesin Leucocitaria I Sndrome de Chediak - Higashi Cromosoma Xq13.1 - 13.3 Xq21.3 - 22 Xq26 - 27 Xp11.22 - 11.3 Xp21.1 Xq26 20q13 - ter 19p 13.1 14q13.1 2q12 11p12-13 2p11 14q32.3 11q23.1 16q24 7q11.23 1q25 21q22.3 1q4.3

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(ESID) y el Grupo Panamericano de Inmunodeficiencias Primarias (PAGID) se dividen en 3 categoras: Definitivo, probable y posible. El diagnstico definitivo slo puede hacerse, salvo en algunas excepciones de IDP ligadas al X, con la documentacin del defecto molecular para cada caso. El hallazgo de la mutacin es el mtodo diagnstico ms confiable, la ausencia de mRNA especfico o de protena es suficiente para el diagnstico en algunos sndromes, pero no en todos porque el mRNA o la protena se pueden expresar slo transitoriamente o en niveles muy bajos. Los pacientes deben reunir siempre los criterios clnicos de inclusin caractersticos de las distintas enfermedades para evitar la incorporacin de pacientes que tengan variantes polimrficas de los genes asociados con inmunodeficiencias. 2.2. Estudios de laboratorio inmunolgico para el diagnstico de IDP La clnica de las IDP no es claramente distintiva y permite slo sospechar y orientar el diagnstico de los diversos sndromes. En todos los casos, debern realizarse procedimientos apropiados de laboratorio que permitan evaluar la competencia inmunolgica para definir el tipo y grado de compromiso. Se presenta una breve resea de los estudios indicados para los diferentes sectores de la respuesta inmune, que debern incluir siempre la valoracin cuantitativa y funcional: a) Estudio de la respuesta inmune humoral

linfocitos/l Recuento de linfocitos T por expresin de antgenos de diferenciacin: CD3, CD4, CD8. Pruebas de hipersensibilidad retardada a distintos antgenos: PPD, candidina, etc. Respuesta proliferativa in vitro a mitgenos: PHA, ConA, PMA+Ionomicina. Respuesta proliferativa a antgenos (candidina, PPD, toxoide tetnico) y clulas alogeneicas (cultivo mixto linfocitario). Produccin de interleuquinas: IL-1, IL-2, IFN, TNF-alfa, IL-4, etc., en sobrenadantes de cultivos o por deteccin intracitoplasmtica en respuesta a mitgenos. Estudios de actividad enzimtica: ADA, PNP.

c) Estudio de la respuesta inmune inespecfica Fagocitos Determinacin cuantitativa y morfolologa de granulocitos y monocitos. Estudio de mecanismos microbicidas oxgeno dependientes: Prueba de reduccin del nitroazul de tetrazolio (NBT). Quimioluminiscencia, dihidrorodamina (DHR), Produccin de anin superxido. Estudio de la expresin de molculas de adhesin: CD11, CD18, CD15. Estudios de actividad enzimtica: Mieloperoxidasa, Glucosa 6 fosfato dehidrogenasa. Actividad bactericida.

Determinacin de la concentracin srica de IgG, IgM, IgA e IgE. Recuento de linfocitos B por expresin de antgenos de diferenciacin (CD19, CD20). Bsqueda de anticuerpos preexistentes (Isohemaglutininas antiA y antiB) y respuesta de anticuerpos a la inmunizacin activa con antgenos proteicos (anticuerpo anti-tetnico, anticuerpo anti-diftrico) y antgenos polisacridos (anticuerpo anti- neumococo). Determinacin de la concentracin srica de subclases de IgG: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Produccin de inmunoglobulinas in vitro mediante estimulacin con mitgenos (PWM).

Complemento Actividad ltica del complemento: CH50 y AP50. Determinacin de la concentracin srica de componentes del complemento. Evaluacin funcional de componentes del complemento. Determinacin cuantitativa y funcional de inhibidores del complemento.

b) Estudio de la respuesta inmune celular Determinacin del valor absoluto de

El reconocimiento de portadores sanos y el diagnstico prenatal, son dos de las nuevas herramientas incorporadas al arsenal diagnstico de las IDP, que pueden ser realizados con el desarrollo de tcnicas de biologa molecular: Estudios de inactivacin del cromosoma X.

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Segregacin de alelos relacionados con la patologa. Caracterizacin de la mutacin: a) Tcnicas de rastreo Ej. Polimorfismo de DNA de simple cadena (SSCP) y b) Secuenciacin del DNA.

2.3. Caractersticas de las IDP Se describirn a continuacin ejemplos seleccionados de defectos de clulas B, clulas T, ambos y de defectos de Inmunidad Natural. 2.3.1. Defectos predominantemente anticuerpos de

Estas enfermedades fueron las primeras en conocerse debido a que la cuantificacin de inmunoglobulinas (Igs) sricas se usa como mtodo de rutina desde 1950. Se definen como una reduccin o ausencia de uno o ms isotipos o subclases de Igs en ausencia de otra patologa, debido a un bloqueo de la maduracin del LB o respuesta defectuosa de estos linfocitos a las seales de los LT (figura 30-1). Algunos pacientes pueden tener Ig srica normal, pero no responden apropiadamente a patgenos. Se presentan clnicamente como infecciones pigenas recurrentes. A continuacin se describirn algunos ejemplos de dficit de anticuerpos enfatizando el mecanismo del defecto de la clula B. a) Agammaglobulinemia ligada al sexo (XLA). Representa el prototipo del dficit de clulas B puro. Se hereda como un rasgo recesivo ligado al X. Los nios afectados generalmente no presentan sntomas los primeros 9 - 12 meses de vida, porque estn protegidos pasivamente por la IgG transplacentaria adquirida de la madre. Posteriormente tienen infecciones pigenas a repeticin tales como otitis media, sinusitis, conjuntivitis, neumona y piodermitis. Los grmenes ms frecuentes son Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae y menos frecuente Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes. Si no se efecta tratamiento profilctico invariablemente resulta en enfermedad pulmonar obstructiva y bronquiectasias. Pueden presentar adems viremia persistente y adquirir Poliomielitis Paraltica si se usa vacuna con virus vivo. Son susceptibles a Enterovirus y la infeccin con Giardia lamblia induce diarrea crnica; 35% de los nios pueden presentar artritis, en muchos ca-

sos debido a micoplasma. La cuantificacin de Igs de estos pacientes, en la mayora de los casos demuestra: IgG < 100 mg/dL, IgM e IgA no detectable e incapacidad de secretar anticuerpos en respuesta a estmulos antignicos. Las clulas B se encuentran ausentes. En general la inmunidad celular no est afectada. Se ha demostrado el gen de la agammaglobulinemia ligada al sexo en el brazo largo del cromosoma X en posicin xq21.3 - 22. Se ha identificado y clonado adems una molcula transductora de seales codificada por el gen llamado Btk (Bruton tirosine kinase o Tirosina kinasa de la clula B) que se expresa en etapas precoces del desarrollo de la clula B, no se encuentra en clulas T o plasmticas y se expresa adems en clulas mieloides. El gen Btk se supone que tiene una funcin fundamental en la maduracin de la lnea celular B; probablemente sera la seal para que las clulas preB reordenen los genes de cadena liviana, una vez que han aparecido las cadenas pesadas en su superficie. En pacientes agamaglobulinmicos se generan precursores de las clulas B en la mdula sea con la maduracin detenida en el estadio Pre-B. Las mujeres portadoras de la agammaglobulinemia ligada al X son inmunolgicamente normales y presentan 2 poblaciones de precursores de clulas B: una mitad que porta un cromosoma X activo con gen Btk normal y la otra el gen defectuoso. Las clulas que portan Btk mutado en el cromosoma X activo no maduran a clulas B. Slo maduran a clulas B aquellas con cromosoma X activo que tienen el gen normal. La inactivacin no al azar del cromosoma X en las clulas B en las portadoras y, fundamentalmente, el hallazgo de la mutacin en Btk permiten distinguir la XLA de otras formas autosmicas recesivas poco frecuentes de agammaglobulinemia con ausencia de LB como son las mutaciones de la cadena mu de las inmunoglobulinas y mutaciones en el gen lambda 5/14.1 componente del receptor de la clula Pre-B. Algunos casos de inmunodeficiencia comn variable tambin presentan ausencia de LB. b) Sndrome Hiper IgM ligado al sexo: Se describi en 1961 en 2 varones que presentaban un cuadro clnico similar a la agamaglobulinemia ligada al X con concentraciones de IgM srica muy elevada, ausencia de IgA e IgG muy baja (<150 mg/dL). Adems de presentar infecciones pigenas recurrentes, son susceptibles a infecciones opor-

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tunistas en particular por Pneumonicistis carinii y problemas autoinmunes, especialmente neutropenia recurrente, a menudo severa. La infeccin por Criptosporidium es causa frecuente de colangitis esclerosante con dao heptico severo. Aquellos pacientes que sobreviven ms all de la segunda dcada, presentan un mayor riesgo de desarrollar cnceres, especialmente del tracto gastrointestinal, hgado y vescula. El nmero de LB circulantes es normal, pero se detecta slo IgM e IgD de superficie. No se observa desarrollo de centros germinales en ganglios y bazo. El nmero de clulas T es normal, sin embargo no sintetizan o expresan una molcula no funcional del ligando de (CD40L), necesario para la interaccin con la clula B en el cambio de clase de Igs. El gen del sndrome de hiper IgM ligado al X se encuentra en el brazo largo del cromosoma X en posicin q26. En la actualidad es posible efectuar diagnstico prenatal y de portadoras. Teniendo en cuenta que el defecto primario del sndrome se encuentra en los LT, en las ltimas clasificaciones de la OMS el sndrome ha sido incluido en las ID combinadas. Un cuadro idntico en las manifestaciones clnicas y perfil inmunolgico ha sido descrito en mujeres. En esos casos el gen y la expresin del CD40L es normal, por lo que se sospech un defecto en otras molculas implicadas en la sealizacin de CD40. Recientemente se describi y public el defecto gentico de esta forma Autosmica recesiva de Sndrome de Hiper IgM. Se trata de mutaciones en el gen de la citidina deaminasa inducido por activacin (AID). Este hallazgo demuestra que la presencia de AID es un requerimiento absoluto para la diferenciacin terminal del LB y la produccin eficiente de anticuerpos. c) Inmunodeficiencia Comn Variable. El trmino Inmunodeficiencia Comn Variable (IDCV) se usa para designar un grupo de sndromes an no bien definidos, pero caracterizados por formacin defectuosa de anticuerpos y en que se han excluido otros defectos de inmunidad humoral. El patrn hereditario es variado (autosmico recesivo, dominante, ligado al X) siendo lo ms comn los casos espordicos. En poblacin de origen europeo es la ms frecuente de las inmunodeficiencias primarias especficas. Afecta en igual proporcin a hombres y mujeres, generalmente entre los 20 y 30 aos. Su

incidencia se estima entre 1:50.000 a 1:200.000. Clnicamente se presenta como infecciones pigenas sinopulmonares recurrentes. Algunos pacientes pueden presentar infecciones con grmenes inusuales como Pneumocistis carinii, micobacterias y hongos y en algunos casos enterovirus. Los pacientes son altamente susceptibles a otros patgenos entricos como Giardia lamblia y a Herpes simplex y zoster. Existe una alta incidencia de enfermedades malignas linforreticulares y gastrointestinales. Puede observarse una variedad de desrdenes autoinmunes (anemia perniciosa, anemia hemoltica, neutropenia). Los familiares de estos pacientes tienen una mayor incidencia de dficit de IgA, enfermedades autoinmunes y condiciones malignas. La concentracin de IgG y generalmente de IgA e IgM en el suero se encuentra reducida. El nmero de clulas B en general es normal aunque puede estar reducido, pero el defecto no se encuentra a nivel de la diferenciacin sino ms bien de la activacin in vivo de las clulas B. Cerca del 60% de los pacientes tiene una respuesta proliferativa disminuida al estimular el Receptor de Clulas T (TCR), sin embargo no existe una anomala del mismo sino probablemente un defecto en la transduccin de seales. En ausencia de una seal apropiada por LT no se producira proliferacin, diferenciacin ni secrecin de anticuerpos por las clulas B. d) Deficiencia selectiva de IgA. Es una de las IDP ms frecuentes. Se presenta en 1:700 individuos caucsicos y 1:18.500 japoneses. El patrn hereditario es variable, en algunas familias se ha demostrado herencia autosmica recesiva y asociacin a algunos haplotipos HLA (Complejo Principal de Histocompatibilidad, MHC) Las caractersticas clnicas tambin son variables. La mayora de los individuos no presentan enfermedad, otros tienen infecciones sinopulmonares. Su frecuencia es mayor en pacientes con enfermedad pulmonar crnica que en poblacin normal. El dficit de IgA se caracteriza por niveles ausentes o extremadamente reducidos de IgA srica (< de 7 mg/dL) con IgG e IgM normal. Se supone que existe un defecto a nivel de la diferenciacin de clulas B que expresan IgA a clulas plasmticas secretoras de anticuerpos. No se encuentran anormalidades a nivel de clulas T. La deficiencia de IgA es en realidad una inmunodeficiencia ms compleja de lo que se sospechaba. Podra tratarse, de una forma de expre-

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sin menos grave de la IDCV. Las deficiencias de subclases de IgG, de IgA con deficiencia de subclases de IgG y las deficiencias de funcin de anticuerpos, tambin podran considerarse formas intermedias. e) Deficiencia selectiva de Subclases de IgG. Se han descrito pacientes con nivel IgG srico total normal y una o ms subclases de IgG bajo lo normal. Puede asociarse a niveles bajos de IgA. El dficit de IgG3 es ms frecuente en adultos y del IgG2, en nios. El nivel normal de IgG4 vara ampliamente en personas sanas, por lo que es difcil interpretar una deficiencia selectiva de IgG4. En la tabla 30-3, se resumen las caractersticas de algunos ejemplos de IDP cuyo defecto es predominantemente de anticuerpos.

= <2.000/L) en el primer ao de vida. Existe falla en el desarrollo del Timo. Los pacientes presentan retardo del crecimiento, diarrea intermitente o crnica e infecciones persistentes con grmenes oportunistas de baja virulencia (Cndida, Pneumocistis Carinii, citomegalovirus). Estos hallazgos requieren diferenciar de nios con Sndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) efectuando estudios para detectar Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH), como son el aislamiento viral o reaccin de polimerasa en cadena (PCR) para genoma viral. El diagnstico de este tipo de inmunodeficiencia es una emergencia mdica, ya que puede ser rpidamente fatal si el nio afectado no es sometido a un trasplante de mdula sea. Existen numerosos sndromes de Inmunodeficiencia Combinada Severa (IDCS),

Tabla 30 -3. Caractersticas de algunos defectos predominantemente de anticuerpos Enfermedad Agammaglobulinemia ligada al X Agammaglobulinemia autosomica recesiva Igs sricas Todos los isotipos Clulas B Ausentes o marcadamente Ausentes o marcadamente Defecto Mutacin gen Btk Mutacin cadena Mutacin gen lambda 5/14.1 Variable

Todos los isotipos

Inmunodeficiencia Comn Variable Dficit selectivo de IgA

Reduccin en uno o ms isotipos (generalmente IgG) IgA1, IgA2

No

N o SIgA+

Falla en diferenciacin terminal de cel B IgA+ Defecto en diferenciacin de isotipo

Deficiencia selectiva de subclases de IgG

uno o ms subclases de IgG

N o inmadura

2.3.2. Defectos combinados de clulas T y B Se caracterizan clnica e inmunolgicamente por defectos tanto en las clulas T como en las clulas B (figura 30-1). Los criterios diagnsticos incluyen, presentacin desde los primeros meses de vida de infecciones severas potencialmente fatales, graves anormalidades de la inmunidad mediada por clulas, deficiencia de anticuerpos y linfopenia debido al dficit de clulas T (Linfocitos

cuyos defectos genticos son distintos pero que son indistinguibles desde la clnica. Considerando los hallazgos inmunolgicos un grupo de estos sndromes, que podran llamarse formas clsicas o tpicas de IDCS, se presentan con linfopenia marcada, agamaglobulinemia y ausencia de funcin inmune celular y humoral. En este grupo de IDCS clsicas podemos enumerar, entre otras, la IDCS ligada al X (LX), la IDCS autosmica recesiva (AR), la deficiencia de

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Figura 30-1. Defectos combinados de clulas T y B. Estos defectos se caracterizan clnica e inmunolgicamente por defectos tanto en los LT y LB.

Adenosn deaminasa (ADA) y la disgenesia reticular . a) Inmunodeficiencia Combinada Severa ligada al sexo (IDCS-LX). Es la ms frecuente de las IDCS, constituye el 50 a 60% del total, lo que explica que la frecuencia de casos en varones sea 3 veces superior a los casos en mujeres. Se caracteriza por ausencia de linfocitos T y clulas NK con linfocitos B en nmero normal o aumentado pero no funcionales (fenotipo es por lo tanto T-, NK-, B+). El defecto gentico en la IDCS ligada al X ha sido identificado como una mutacin de la cadena del receptor de la IL2 . La cadena es un componente de los receptores de varias citoquinas como IL4, IL7, IL9 , e IL15. De este modo, los

progenitores linfoides al no tener receptores intactos de varias interleuquinas no pueden ser estimulados por los factores de crecimiento necesarios para el desarrollo y diferenciacin normal de los LT, lo que explica la marcada inmunodeficiencia que resulta. El gen anormal se encuentra en la regin Xq13. El conocimiento del gen responsable y la posibilidad de establecer la mutacin mediante tcnicas de biologa molecular permite detectar portadoras y realizar diagnstico prenatal. Recientemente se ha podido corregir el defecto gentico, insertando el gen de la cadena del receptor de interleuquina en las clulas troncales (stem cells) de los pacientes. En los ltimos aos se ha descrito una forma de IDCS , con el mismo fenotipo T-, NK-, B+, pero con patrn de herencia autosmica recesiva.

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Esta entidad se ha relacionado con mutaciones a nivel de JAK-3, molcula que interviene en la trasduccin intracelular de seales postestimulacin de la cadena del receptor de IL-2. b) Inmunodeficiencia Combinada Severa autosmica recesiva (IDCS-AR). Tambin conocida como alinfocitosis. Se presenta con un fenotipo T-, NK+, B-, y representa aproximadamente un 25% del total de las IDCS. Esta entidad podra ser dividida en dos grupos: IDCS-AR sin radiosensibilidad aumentada e IDCS-AR con radiosensibilidad aumentada. En la primera se han encontrado mutaciones en los genes RAG-1 y RAG-2, involucrados en actividades de recombinasa para genes V(D)J de las inmunoglobulinas y del receptor del linfocito T. En la segunda tambin estaran involucrados mecanismos alterados de recombinacion gentica V(D)J, pero posiblemente a travs de una protena nuclear denominada DNA-PK (protein-kinasa dependiente de DNA). c) Deficiencia de ADA. Es otra forma clsica de IDCS (fenotipo variable T-, NK-, B-). Representa aproximadamente el 15% de la totalidad de los casos de estas entidades. Se debe a mutaciones en el gen que codifica la enzima Adenosin Desaminasa, en el cromosoma 20q13. Esta enzima participa en el metabolismo de las purinas y se encuentra distribuida en todos los tejidos, pero con mayor actividad en el timo. La deficiencia de ADA determina la acumulacin de intermediarios txicos de la sntesis de bases pricas (adenosina, 2 deoxyadenosina y 2-0 metiladenosina), que directa o indirectamente llevan a apoptosis de los linfocitos. Recientemente se han identificado variantes de deficiencias de ADA, segn el tipo de mutacin encontrada. Las deleciones de la regin cataltica del gen se relacionan con fenotipos clnicos muy graves, mientras que las mutaciones puntuales que dan lugar a formas inactivas o inestables de la protena, se correlacionan con fenotipos ms benignos de la enfermedad. Es la primera IDP en la que se ha ensayado terapia gnica. Otra deficiencia enzimtica es tambin capaz de producir enfermedad inmunolgica. Se trata de la deficiencia de Fosforilasa del nuclesido purina (PNP), que se debe a defectos en el gen que codifica la enzima localizado en el cromosoma 14q13.1. En su ausencia se acumulan metabolitos

txicos (desoxi guanosina trifosfato). Los LT son particularmente sensibles a la acumulacin de dGTP por lo que se afectan en mayor grado que los LB (a diferencia de dficit de ADA). d) Disgenesia reticular. Es un sndrome muy infrecuente que asocia a la deficiencia inmune con fenotipo T-, NK-, B-, neutropenia y ocasionalmente trombocitopenia. La alteracin que da lugar a esta entidad todava no se conoce, pero tiene semejanzas con una enfermedad murina producida por mutaciones en el gen Pu-1, que afecta la linfo y la mielopoyesis. A diferencia de las formas clsicas que se describieron hasta ahora, las formas atpicas o no clsicas de inmunodeficiencia combinada pueden presentarse con recuentos linfocitarios normales, grados variables de hipogammaglobulinemia y en algunos casos, slo con alteraciones funcionales. An en una misma familia, individuos portadores de la enfermedad, han desarrollado fenotipos clnicos diversos (infecciones severas en un miembro y autoinmunidad en otro) y de distinta gravedad. Dentro de este grupo de entidades se incluye, entre otras: deficiencia de expresin de MHC clase II, deficiencia de CD8 o ZAP-70, deficiencia mltiple de produccin de interleuquinas, deficiencia de IL-2 y las deficiencias de expresin de molculas del complejo CD3 (cadenas y ) (ver captulo 7). a) Defectos en la expresin de MHC. Se llam originalmente Sndrome del linfocito desnudo. Es una inmunodeficiencia heterognea desde el punto de vista gentico ya que puede producirse por mutaciones en distintas protenas que promueven la transcripcin de molculas MHC clase II. Se hereda de forma autosmica recesiva. El nmero de clulas T CD4+ en la mayor parte de los casos est disminuido, pero el recuento de CD8+ es normal. Se presenta con hipogamaglobulinemia y ausencia de respuesta de las clulas T a antgenos especficos, con respuesta normal a estmulos mitognicos. b) Defectos de activacin y funcin de clulas T. Estos defectos, se caracterizan por la presencia de un nmero normal de clulas T pero que no son capaces de proliferar o producir citoquinas en respuesta a estimulacin con mitgenos, antgenos u otras seales de activacin del TCR. La caracterizacin a nivel molecular ha demostrado en algunos de estos casos expresin de-

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ficiente del complejo CD3/TCR debido a mutaciones que dan lugar a deficiencia selectiva de la subunidad o del CD3. Otro de estos sndromes, es el denominado deficiencia de CD8 o de ZAP-70. La ZAP-70 es una protena quinasa fundamental para los mecanismos de sealizacin intracelular del TCR (ver captulo 10). Los pacientes con esta deficiencia muestran valores normales o aumentados de linfocitos, con clulas CD4 aumentadas y ausencia de CD8. El timo muestra estructura normal,

con LT doble positivos, CD4+ CD8+, LT CD4 normales y ausencia de CD8, demostrando que la ZAP 70 es crtica para la diferenciacin intratmica de esta ltima subpoblacin. In vitro, las clulas mononucleares de estos pacientes no responden al estmulo del TCR con anti-CD3, pero la respuesta es normal cuando se estimulan con PMA + ionomicina, evidenciando un defecto temprano de la estimulacin del receptor del LT. En la tabla 30-4, se muestran algunos ejemplos de ID combinadas de clulas T y B.

Tabla 30 -4. Inmunodeficiencias Combinadas Enfermedad IDCS tpicas IDCS Fenotipo T - NK - B+ Herencia Ligada al X AR T- NK+BAR Defecto Gen cadena gama R IL2, 4, 7, 9 y 15 Gen Jak3 Genes RAG1/RAG2 Radiorresistentes Recombinacin Radiosensible Gen ADA ---

AR Deficiencia de ADA Disgenesia Reticular T-B-( progresiva) NK variable T-NK-BGranulocitosAR ---

IDCS atpicas Deficiencia MHC clase II Deficiencia de molculas CD3/TCR Deficiencia de IL2 Def. de mltiples citoquinas Sndrome de Ommen Deficiencia de CD8 Deficiencia de PNP Variable.CD4 CD3 o ausentes Normal Normal Linfocitosis Th2 oligoclonal CD8 ausentes CD3 progresiva AR AR AR --AR AR AR Genes CIITA, RFX5 Genes cadena , ----Genes RAG1/ RAG2 Gen ZAP -70 Gen PNP

IDCS Tpicas: con linfopenia, agammaglobulinemia y falta de repuesta a antgenos y mitgenos. IDCS Atpicas: sin linfopenia, con o sin hipogammaglobulinemia. En algunos casos la respuesta celular in vitro es deficiente slo a antgenos.

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2.3.3. Inmunodeficiencias asociadas a otros defectos Son un grupo de enfermedades que comprometen mltiples sistemas. a) Anomala de DiGeorge. Resulta de un desarrollo defectuoso durante la embriognesis del 3 y 4 arcos farngeos. Estas estructuras dan origen al timo y paratiroides en la sexta a octava semana de gestacin y al arco artico y porciones de los labios y orejas a las 12 semanas de gestacin. La mayora de los pacientes presentan deleciones a nivel del cromosoma 22q11 que se han denominado CATCH-22 debido a las anomalas que se originan: Cardacas, Facie Anormal (dismrfica con micrognatia) Hipoplasia o Aplasia Tmica, paladar hendido (en ingls Cleft) e Hipocalcemia (por ausencia de paratiroides). Se han descrito otros casos que se asocian a consumo de alcohol o diabetes materna. La mayora de los nios afectados presentan tetania y/o falla cardaca neonatal. Slo un 20% de ellos presenta nmero o funcin de LT disminuidos. Los nios que sobreviven pueden adquirir clulas T funcionales y corregir su inmunodeficiencia. Esto es probablemente por la presencia de algo de tejido tmico o porque algn sitio extra tmico pueda asumir la funcin de la maduracin de los LT. La existencia de estos sitios se ha sospechado pero no se han podido definir anatmicamente. b) Sndrome de Wiskott-Aldrich. Se hereda como una enfermedad recesiva ligada al X y se caracteriza por eczema, trombocitopenia y susceptibilidad a infecciones bacterianas. Las plaquetas son pequeas. Existe una expresin reducida de muchas glicoprotenas de superficie (CD43) pero su papel en la inmunodeficiencia no est claro. El gen responsable se encuentra en el brazo corto (p11.22) del cromosoma X. El producto de este gen, una protena rica en prolina llamada WASP, est involucrada en la regulacin de la funcin linfocitaria y plaquetaria. Controla el ensamblaje de filamentos de actina que se requieren para la formacin de microvesculas. La respuesta proliferativa de clulas T est ausente o muy disminuida. Las Igs pueden inicialmente ser normales pero luego disminuye especialmente IgM y suele asociarse con aumento de IgA e IgE. Hay dficit de produccin de anticuerpos especialmente

frente a antgenos polisacridos. Es importante el aumento en el riesgo de enfermedades linfoproliferativas malignas. c) Ataxia telangiectasia. Este sndrome autosmico recesivo se caracteriza por ataxia cerebelar, telangiectasias (en lbulos de las orejas y conjuntivas), y, en la mayora de los pacientes, infecciones sinopulmonares recurrentes y marcada incidencia de tumores. Regularmente se encuentran niveles elevados de feto protena. Desde el punto de vista inmunolgico, la inmunodeficiencia si no est presente se desarrolla posteriormente en el 70% de los casos. Las alteraciones son variables, siendo la ms frecuente la disminucin de Igs (IgG 2, IgG 4, IgA, IgE), y la respuesta a anticuerpos especficos deficiente que conduce a las infecciones recidivantes del aparato respiratorio. La funcin y nmero de LT se encuentra reducido. El defecto gentico asociado a esta enfermedad mapea en el cromosoma 11q23.1 La protena codificada por este gen, ATM, se encuentra relacionada con el control del ciclo celular, transduccin de seales mitognicas, recombinacin meitica y respuesta al dao del DNA. Existe un aumento de la sensibilidad a radiaciones ionizantes debido a reparacin del DNA defectuoso. d) Sndrome de Chediak-Higashi (CHS) y Sndrome de Griscelli (GS). Tanto el CHS incluido por la OMS entre las deficiencias asociadas a otros defectos, como el GS, entidades de herencia autosmica recesiva, se caracterizan fenotpicamente por presentar albinismo parcial oculocutneo, acompaado de disfuncin N, alteraciones en la quimiotaxis y un grado variable de compromiso T. Estas alteraciones redundan en una predisposicin a padecer infecciones pigenas. El CHS, a diferencia del GS, presenta grnulos gigantes intracitoplasmticos en mltiples clulas, siendo fcilmente distinguibles en los neutrfilos. El fenmeno distintivo de estas entidades, es la presencia de fases aceleradas, cuadros sistmicos de activacin descontrolada del sistema inmune, gatilladas generalmente por intercurrencias infecciosas. Estos cuadros son tambin conocidos como sndrome hemofagoctico, linohistiocitosis hemofagoctica o sndrome de activacin macrofgica. Clnicamente se presentan con fiebre, citopenias hemticas (por lo menos dos linajes afectados), esplenomegalia, hipertrigliceridemia y/o hipofibrinogenemia, e

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infiltracin linfohistiocitaria no maligna en mdula sea, ganglio o bazo, acompaada de hemofagocitosis. El tratamiento de estos sndromes se basa en una potente inmunosupresin, pero slo el trasplante de mdula sea despeja la posibilidad de desarrollar nuevamente cuadros similares. A pesar de compartir la gran mayora de sus caractersticas clnicas, el CHS y el GS codifican en cromosomas distintos: el primero mapea para la protena VPS5 en el cromosoma 1q43, mientras que el segundo lo hace para la Myosin 5a, en el cromosoma 15q21. Ambas protenas estn involucradas en trfico intracelular de organelos. e) Inmunodeficiencia con respuesta inadecuada al virus de Epstein-Barr. Es una enfermedad de herencia ligada al cromosoma X, conocida tambin como sndrome de Duncan o Purtilo. Los individuos con este sndrome, son varones aparentemente sanos hasta que contraen la infeccin con el virus de Epstein-Barr y desarrollan mononucleosis infecciosa. La evolucin de la infeccin es fatal en el 60-70% de los pacientes, principalmente debido a una necrosis heptica causada por LT citotxicos activados. La mayora de los que sobreviven desarrollan en distintos tiempos, linfomas B o hipogammaglobulinemia. En los portadores de esta enfermedad, la infeccin con el virus de Epstein-Barr gatilla una respuesta inmune vigorosa y descontrolada, acompaada de una proliferacin policlonal T y B. La respuesta humoral contra el virus se desarrolla normalmente contra el antgeno de la cpside viral (VCA), pero es inexistente contra sus antgenos nucleares (EBNA). Se describe tambin una deficiente respuesta celular especfica contra el virus, a pesar del incremento de los linfocitos CD8+, as como un dficit de la funcin citotxica anticuerpo-dependiente (ADCC), mediada esta ltima por las clulas NK. La alteracin molecular relacionada con esta enfermedad ha sido localizada en el brazo largo del cromosoma X (Xq26) y codifica una protena no cataltica denominada SH2D1A presente en clulas T y NK, cuya funcin sera la de evitar la activacin celular. 2.3.4. Defectos congnitos de inmunidad natural La inmunidad innata es mediada principalmente por los fagocitos y el complemento, y cons-

tituye la principal lnea de defensa contra organismos infecciosos. Los fagocitos y el complemento participan adems en la fase efectora de la respuesta inmune especfica. a) Deficiencias del Complemento. Se han demostrado deficiencias de todos los Componentes del Complemento (C1q, C1, C4, C2, C3, C5, C6, C7, C8, C9) a excepcin de deficiencia de Factor B (ver captulo 18). En todos los casos se transmiten como defectos autosmicos recesivos; los casos heterozigotos pueden detectarse porque su suero contiene aproximadamente la mitad del nivel normal del componente deficiente. Las deficiencias de la va alterna son muy raras. El defecto ms comn es C9 encontrado en donantes de sangre japoneses (sin asociacin a enfermedades). Los defectos de C1, C4 o C2 se asocian a una mayor incidencia de enfermedades autoinmunes y/o por complejos inmunes. La ausencia de C3 con infecciones recurrentes severas por grmenes gram negativos y gram positivos. En pacientes con dficit homozigoto de C5 , C6 , C7 y C8 se han demostrado infecciones recurrentes por Neisserias. (gonococo, meningococo). Se han descrito asimismo deficiencias de Protenas Reguladoras del Complemento solubles y asociadas a membranas: Angioedema Hereditario o Enfermedad de Quincke. Es una deficiencia autosmica dominante del C1INH. Clnicamente se presenta como angioedema de la piel y mucosas causada por traumas o algunas veces infecciones virales que pueden llevar a la muerte por edema larngeo. El compromiso de la mucosa intestinal produce dolor abdominal. Los ataques duran 48 - 72 horas y ceden al caer los niveles de C4 y C2 . En el 85% de los casos hay un defecto en la sntesis de la protena inhibidora de C1, en el resto puede existir una cantidad normal pero hay funcin defectuosa. Las deficiencias de factores reguladores solubles de la va alternativa (Factor I y Factor H) son raras. Deficiencias de protenas reguladoras asociadas a membranas incluyen ausencia de DAF (Decay Acceleratig Factor), HRF (Factor de restriccin homlogo) y CD59. En ausencia de estas protenas se puede producir lisis por activacin del complemento en la superficie de glbulo rojo dando origen a la enfermedad conocida como Hemoglobinuria Paroxstica Nocturna.

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b) Defectos de los fagocitos. Pueden existir defectos en el nmero (neutropenia) o la funcin fagoctica. Esta depende del movimiento en respuesta al estmulo quimiotctico, adherencia, endocitosis y destruccin (Killing) de las partculas ingeridas. La movilidad depende de la integridad del citoesqueleto y del sistema contrctil de la clula. La endocitosis depende de la expresin de ciertos receptores para IgG, C3b y IC3b, y de la fluidez de la membrana. Los defectos de la funcin fagoctica se enumeran en la tabla 30-1 Enfermedad granulomatosa crnica (EGC). Es un grupo de defectos caracterizados por falla en la produccin de radicales superxido, perxido de hidrgeno y otros radicales de oxgeno fundamentales para la muerte intracelular de los microorganismos. Los pacientes afectados desarrollan infecciones recurrentes (adenitis, neumona, osteomielitis, abscesos, hepatitis) por bacterias generalmente productoras de catalasa (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Serratia marcescens), hongos (Nocardia, Aspergillus) y otros, con formacin de granulomas especialmente en ganglios linfticos, hgado y pulmn. La reaccin NADPH + 20 2 NADP+ + 20+ H+ requiere un citocromo b especfico de los 2 fagocitos y NADPH oxidasa. El citocromo b558 es un heterodmero compuesto de una cadena de 91 kDa y otra de 22 kDa. En aproximadamente un 62% de los pacientes la enfermedad es ligada al cromosoma X y se han encontrado mutaciones del gen que codifica la cadena 91 kDa (gp 91 phox). El 38% restante presenta herencia autosmica recesiva debido a mutaciones del gen que codifica la cadena 22kDa o 1 de 2 protenas citoslicas solubles (gp 47 phox o gp 67 phox). In vitro, se ha logrado corregir el defecto por expresin de gp91 phox utilizando retrovirus. Desde el punto de vista clnico el uso de IFN recombinante ha demostrado ser til en prevenir infecciones serias pero no se han comprobado cambios significativos en la produccin de anin superxido por los fagocitos. Deficiencias de adhesin leucocitaria 1 y 2. La deficiencia de adhesin leucocitaria tipo 1 (LAD1) es una enfermedad autosmica recesiva rara que se caracteriza por infecciones de la piel, periodontitis y fstulas intestinales o perianales. Existe adems un retardo en la cada del cordn umbilical y dificultad en la curacin de heridas.

La base molecular del defecto es expresin deficiente o ausente de la cadena (CD18) del subgrupo de integrinas 2 CD11a, CD18, CD11b, CD18 y CD11c CD18). Estas protenas participan en la adhesin de los leucocitos a otras clulas y en la fagocitosis de partculas recubiertas de Complemento. El gen CD18 se ha clonado y secuenciado por lo que esta enfermedad es una ms de las candidatas a terapia gnica. Se ha descrito una segunda forma de deficiencia de adhesin leucocitaria (LAD-2) que se debe a la ausencia del ligando Lewis X para las molculas de adhesin selectina en el endotelio vascular (ver captulo 12)

3. TRATAMIENTO DE LAS INMUNODEFICIENCIAS CONGNITAS En teora, la terapia de eleccin es reemplazar el gen defectuoso. Como se mencion anteriormente, esta terapia se ha iniciado en algunas inmunodeficiencias seleccionadas. En la mayora de los casos, el tratamiento actual tiene como objetivos, controlar las infecciones y reemplazar el componente defectuoso del sistema inmune. Los procesos infecciosos deben ser tratados rpidamente y con dosis apropiadas del antibitico seleccionado segn antibiograma. El uso profilctico de antibiticos de amplio espectro y poco generadores de resistencia, como el cotrimoxasol, es una prctica frecuente y efectiva entre estos pacientes. En todo paciente con deficiencia de la respuesta inmune celular, las transfusiones, si son necesarias, deben realizarse con sangre irradiada y filtrada de leucocitos, por el riesgo de reaccin injerto contra husped. Las inmunizaciones con grmenes vivos como las vacunas Sabin (Poliomielitis) y la BCG (tuberculosis), estn formalmente contraindicadas. Las terapias de reemplazo que han demostrado utilidad, son las siguientes: a) Gammaglobulinas. Se usa en pacientes con deficiencia de anticuerpos, siendo la administracin endovenosa la va de eleccin. Se recomiendan dosis de 400 a 600 mg/kg/mes, que permitan mantener niveles sricos de IgG superiores a los 400-500 mg/dL. Son indicacin absoluta de tratamiento permanente con gammaglobulina la Agammaglobulinemia ligada al sexo, la Deficiencia con hiper IgM, y la Inmunodeficiencia Comn

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Variable. Las deficiencias de subclases de IgG, asociadas o no a deficiencia IgA, se benefician con el tratamiento sustitutivo con gamaglobulina. En la deficiencia selectiva de IgA, el uso de gamaglobulina est contraindicado por sus potenciales efectos adversos. Las Deficiencias Combinadas Severas y otras deficiencias como el Sndrome de Wiskott Aldrich, se benefician con el reemplazo de gamaglobulina como tratamiento auxiliar, pero deben implementarse otros tratamientos para corregir los defectos subyacentes. El desarrollo de efectos adversos, del tipo de las reacciones anafilcticas, se producen con poca frecuencia y por mecanismos no bien aclarados. Con la GGEV, la infusin lenta reduce o elimina estos efectos. b) Trasplante de mdula sea. El trasplante de mdula sea (TMO) de donante HLA idntico (hermanos o miembros HLA idnticos en la familia) que ha llevado a una reconstitucin inmunolgica completa en pacientes con IDCS (incluyendo deficiencia de ADA y PNP), Disgenesia reticular, en Sndrome de Wiskott-Aldrich, Dficit de adhesin leucocitaria y Dficit de molculas MHC clase II. Desafortunadamente 2/3 de los pacientes no tienen un donante compatible . En estos casos puede utilizarse mdula idntica no relacionada proveniente de "Bancos de mdula" o se deber realizar el trasplante con mdula sea haploidntica siendo necesario eliminar las clulas T del injerto para prevenir una complicacin grave del TMO, la Enfermedad de injerto versus husped. La recuperacin inmunolgica post-trasplante puede evaluarse por la mejora clnica, la presencia de linajes celulares inexistentes en el receptor antes del procedimiento. Ejemplo: linfocitos T y NK, en un paciente portador de IDCS-LX, la recuperacin de la actividad enzimtica en los deficientes previos, la presencia de inmunoglobulinas sricas o la deteccin de quimerismo celular (coexistencia de clulas del donante con las del receptor) por tcnicas moleculares, entre otras. c) Reemplazo enzimtico: El reemplazo parcial de ADA o PNP puede efectuarse con glbulos rojos congelados irradiados y ADA bovina modificada por conjugacin con polietilenglicol.

LECTURAS SUGERIDAS Buckley, R., Primary immunodeficiency diseases due to defects in lymphocytes, N Engl J Med, 343:18 1319-1324, 2000. Cavazzana-Calvo, M.; Hacein-Bey, S.; de Saint Basille, G. et al, Gene therapy of human severe combined immunodeficiency (SCID)-X1 disease, Science, 288: 669-672, 2000. Conley, M.E.; Notarangelo L.; Etzioni A., Diagnostic criteria for primary immunodeficiency, Clin Immunol 93:3 190-197, 1999. Chain, M., R. (ed), Primary T-cell immunodeficiencies, Immunol and Allergy Clinics of North America, 20:1, 2000 Chain M., R. (ed), Humoral immunodeficiencies, Immunol and Allergy Clinics of North America, 21:1, 2001. Ochs, H.; Smith, E.; Puck, J., In Primary Immunodeficiency Diseases. A molecular and genetic approach, Oxford University Press, 1999. Pevy, P.; Muto, T.; Levy, Y. et. al., Activation induced cytidine deaminase (AID) deficiency causes the autosomal recessive form of hyper-IgM syndrome (HIGM2), Cell, 102: 565-575, 2000. Primary immunodeficiency diseases: report of an IUS scientific committee, Clin Exp Immunol, 118: Suppl 1:1-28, 1999.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 31
INMUNODEFICIENCIAS SECUNDARIAS
Mara Antonieta Guzmn M. y Cecilia Seplveda C.

1. Introduccin 2. Infeccin por VIH y SIDA 2.1. Magnitud del problema 2.2. Caractersticas del virus 2.3. Progresin de la infeccin por VIH-1 2.4. Ingreso al organismo 2.5. Respuesta inmune anti-VIH 2.6 Diagnstico de labororatorio 2.7. Tratamiento 3. Sistema inmune fetal y neonatal 3.1. Inmunidad celular 3.2. Inmunidad humoral 3.3. Inmunidad innata 4. Envejecimiento y sistema inmune 4.1. Inmunidad celular 4.2. Inmunidad humoral 5. Inmunidad y nutricin 5.1. Inmunidad celular 5.2. Dficit de nutrientes especficos

6. Inmunodeficiencia inducida por ciruga y trauma 7. Inmunodeficiencia secundaria a enfermedades infecciosas 7.1. Inmunodeficiencia secundaria a infecciones virales 7.2. Inmunodeficiencia secundaria a infecciones bacterianas y fngicas 7.3. Inmunodeficiencia secundaria a infecciones parasitarias 8. Inmunodeficiencia secundaria a enfermedades infiltrativas y tumores 8.1. Evasin de la respuesta inmune por tumores 8.2. Defectos inmunolgicos en tumores 9. Inmunodeficiencia secundaria a terapia inmunosupresora 9.1. Mecanismos de accin 9.2. Impacto de la inmunodeficiencia asociada a inmunosupresores

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RESUMEN En este captulo se incluyen las inmunodeficiencias secundarias ms frecuentes, tanto en el nio como en el adulto. Se hace nfasis especial en la infeccin por Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) y Sndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), debido a su relevancia como problema de salud pblica en todo el mundo. Adems, aun cuando no constituyen inmunodeficiencias secundarias propiamente tales, se han incorporado algunos aspectos relevantes del sistema inmune neonatal y del sistema inmune del senescente, edades extremas de la vida en las cuales el sistema inmune presenta algunas caractersticas especiales que pueden semejar una inmunodeficiencia.

1.

INTRODUCCIN

Las inmunodeficiencias secundarias son aquellas que, a diferencia de las inmunodeficiencias primarias, no son causadas por alteraciones intrnsecas en el desarrollo y funcin de los componentes del sistema inmune. Estas inmunodeficiencias pueden afectar a uno o a varios de sus componentes y pueden ser transitorias o definitivas de acuerdo a la naturaleza y posibilidades de tratamiento o eliminacin de la causa que las produce. La ms conocida es la infeccin por VIH y el SIDA, otros ejemplos son las inmunodeficiencias secundarias a malnutricin, enteropatas perdedoras de protenas, tumores malignos linforreticulares, las inducidas por ciruga y trauma, tratamientos inmunosupresores y quimioterapia. Como grupo, las inmunodeficiencias secundarias son las ms comunes, especialmente las asociadas al VIH y a la malnutricin, pudiendo presentarse a cualquier edad. 2. INFECCIN POR VIH Y SIDA El Sndrome de Inmunodeficiencia Adquirida SIDA fue reconocido como una nueva enfermedad en el mundo, en el ao 1981. Los primeros casos en ser identificados, que pusieron en alerta a la comunidad mdica y cientfica, se diagnosticaron en hombres homosexuales jvenes, previamente sanos, los cuales desarrollaron raras enfermedades tales como sarcoma de Kaposi y neumonia por Pneumocystis carinii. Aunque estas enfermedades se haban observado ocasional-

mente en algunos subgrupos de la poblacin, por ejemplo en hombres ancianos de origen mediterrneo en el caso del sarcoma de Kaposi y la neumonia por Pneumocystis carinii en individuos inmunodeprimidos por terapias inmunosupresoras, la ocurrencia de este tipo de enfermedades en personas jvenes previamente sanas no tena precedentes. Una caracterstica comn en esta nueva enfermedad, era la presencia de una progresiva y severa inmunodeficiencia; de ah su nombre, sndrome, porque se presenta como un conjunto de signos y sntomas relacionados, de inmunodeficiencia adquirida, para distinguirlo de formas congnitas de inmunodeficiencia. Pronto se reportaron casos de SIDA en otros grupos de la poblacin, tales como consumidores de drogas intravenosas (CDI), personas que haban recibido transfusiones y productos de la sangre como los hemoflicos y, por ltimo, hijos de madres con SIDA. Todo indicaba que un agente infeccioso transmisible por contacto sexual ntimo y por la sangre era el responsable de este sndrome, y en 1983 se identific y reconoci como agente causal del SIDA, el virus de inmunodeficiencia humano (VIH). Este virus tiene la particularidad de daar al sistema de defensas del organismo, como queda de manifiesto por la severa disminucin e incluso eliminacin de los linfocitos T CD4+ ("helper") que lo caracteriza, en consecuencia, el individuo queda inerme frente a la agresin de mltiples agentes infecciosos y la muerte se produce, de no mediar ningn tratamiento, principalmente debido a estas complicaciones.

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2.1. Magnitud del problema La infeccin por VIH y el SIDA constituyen una epidemia mundial de gran magnitud, el VIH se ha propagado y sigue propagndose por todo el orbe, apareciendo incluso en comunidades inicialmente poco afectadas por la epidemia. Hasta fines de 2000, segn las estimaciones del Programa Conjunto de las Naciones Unidas sobre el VIH/ SIDA (ONUSIDA) y la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), copatrocinadora del ONUSIDA, haba en el mundo un total de 36,4 millones de personas viviendo con el VIH/SIDA, de los cuales ms de 14 millones corresponden a mujeres. El nmero total de nios menores de 15 aos con VIH, infectados en su mayora a travs de su madre antes de nacer, durante el parto o por la lactancia natural, se calcula en aproximadamente 5 millones desde los inicios de la epidemia, de los cuales alrededor de 3 millones ya han fallecido. Se calcula en alrededor de 16.000 las nuevas infecciones por el VIH que ocurren diariamente, de las cuales al menos un 60% ocurre en adolescentes y nios. En Amrica latina y el Caribe hay aproximadamente 1,8 millones de personas que viven con el VIH, calculndose la prevalencia del VIH en alrededor de 1 de cada 100 adultos en casi todos los 44 pases y territorios de la regin. Las tasas ms altas se observan en pases como Brasil y Argentina, y las ms bajas en Ecuador y Bolivia. En Chile, el primer caso de SIDA se notific en 1984 y hasta el 30 de junio de 2000 se haban notificado 3.741 enfermos y 3.492 portadores asintomticos en las trece regiones del pas. La cifra real de portadores del VIH en el pas podra ascender a alrededor de 30.000-40.000 personas. El 89,7 % de los casos de SIDA son hombres y el 10,3% mujeres, con un crecimiento mayor de casos de SIDA en mujeres en relacin a los hombres, incluyendo todos los mecanismos de transmisin. La proporcin de casos de SIDA entre hombres y mujeres ha disminuido con el tiempo, desde 31,5:1 en 1990 a 8,5:1 en 1997. Los principales grupos de edad afectados estn entre los 20 y 49 aos y concentran el 85,2% de los casos. Los menores de 20 aos representan el 2,7% y los mayores de 50 el 12,1%. En cuanto a las categoras de exposicin, la principal es la exposicin sexual con el 92% de los casos. La va sangunea alcanza al 6% desde el inicio de la epi-

demia. La deteccin de anticuerpos anti-VIH se implement en los bancos de sangre del pas a partir del segundo semestre de 1987, frenando la exposicin por transfusiones de sangre y otros productos hemoderivados. Sin embargo, se observa un aumento de casos asociados a la drogadiccin intravenosa, va que es hoy la fundamental dentro de la transmisin sangunea. Los casos asociados a transmisin vertical constituyen el 2% del total, con una tasa de transmisin del VIH de la madre infectada a su hijo que alcanza al 27%, cifra acumulada desde el inicio de la epidemia. 2. 2. Caractersticas del virus El VIH est clasificado en la familia Retroviridae y pertenece a la subfamilia de los lentivirus. Se distinguen dos tipos de VIH: VIH-1 y VIH-2, siendo el VIH-1 ms importante debido a su potencial patognico mayor, reflejado en su rpida diseminacin por todo el mundo. El VIH-1 infecta las clulas CD4+ del sistema inmune, conduciendo a una profunda depresin de la inmunidad. Sin embargo, este virus tambin puede infectar otras clulas, como se ver ms adelante. Estructura del VIH Al microscopio electrnico, el VIH tiene las caractersticas de un lentivirus, con un core con forma de cono compuesto por protenas. Dentro de esta cpside o nucleoide se encuentran dos hebras idnticas de cido ribonucleico (RNA), el material gentico del virus, estrechamente asociadas con la enzima transcriptasa reversa que transcribe el RNA viral en DNA en la clula hospedera, otras enzimas y protenas. La superficie del virus se caracteriza por la presencia de 72 trmeros o tetrmeros formados por las glicoprotenas de envoltura. stas se originan a partir de un precursor de 160 kDa, la glicoprotena (gp) 160, la cual es clivada dentro de la clula hospedera en una gp 120 externa y una gp 41 de transmembrana. Parte de la porcin central y terminal de la gp41 tambin se expresa hacia el exterior del virin, donde se une a la gp120 de manera no covalente. La gp120 del virin, localizada externamente, contiene el sitio de unin para el receptor celular y los dominios neutralizantes mayores. Se ha reportado que la porcin externa de la gp41 y parte de la p17, contienen eptopos de reconocimiento para anticuerpos neutralizantes.

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Organizacin genmica del VIH-1 El tamao genmico del VIH-1 es de alrededor de 9,8 kb. Contiene genes estructurales: gag, pol y env, y al menos 8 genes reguladores. El transcripto primario del VIH es un RNA mensajero (mRNA) largo, el cual es traducido en las protenas Gag y Pol. Por clivaje proteoltico, se originan las protenas y enzimas maduras. Los productos de los genes no estructurales del VIH constituyen una variedad de protenas virales reguladoras y accesorias que pueden afectar la replicacin del virus en varios tipos celulares. Algunos estudios sugieren que los genes accesorios pueden ser ms importantes para la replicacin del VIH-1 en los macrfagos que en los linfocitos CD4+. Variacin gentica del VIH-1 El VIH-1 se encuentra en los individuos infectados como mezcla de variantes virales genticamente relacionadas, llamadas cuasiespecies, que son el resultado de una alta tasa de error en la actividad de la transcriptasa reversa. La variacin gentica observada no est distribuida uniformemente en el genoma viral, siendo env el gen viral ms variable y gag y pol ms conservados. Sin embargo, no todas las regiones de env varan en la misma forma, distinguindose 5 regiones variables (V1 a V5) y 4 regiones constantes. La tercera regin hipervariable de la gp120, que tiene una estructura en asa central o loop V3, contiene el sitio ms importante para la neutralizacin por anticuerpos. El asa V3 tambin est involucrada en el tropismo celular y formacin de sincicios. Esta gran variacin gentica en un mismo individuo, da cuenta de la rpida emergencia de variantes resistentes a anticuerpos neutralizantes, a clulas T citolticas y drogas antirretrovirales. Adems, la naturaleza diploide del genoma del VIH contribuye a aumentar la variacin viral mediante la recombinacin gentica. Ciclo de replicacin viral La transmisin del VIH requiere de una adecuada interaccin del virus con receptores de la superficie de la clula hospedera. Luego de sta, se producen diversos eventos que facilitan la penetracin de la cpside viral a travs de la membrana celular. El principal receptor celular del VIH es la

molcula CD4, presente en la membrana de las clulas CD4+, en particular linfocitos T helper (LTh). El sitio de unin de CD4 a la gp120 del virus se ha localizado en D1, la misma regin de CD4 de unin a las molculas del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) clase II. En el virus, la regin principal de unin a CD4 est en la regin conservada C4, cerca del extremo carboxiterminal de la gp120. En esta interaccin, de gran afinidad, son importantes la conformacin tanto de CD4 como de la gp120. Enseguida de la unin de la gp120 a la molcula CD4, la gp120 se desplaza, permitiendo la exposicin del dominio de fusin de la gp41, necesario para la continuacin del proceso. Este dominio se unira a un receptor de fusin celular, permitiendo la fusin del VIH con la clula. Varios estudios sobre la interaccin inicial virus-clula hospedera indicaron que el receptor CD4 solo no era suficiente ni tampoco el nico medio para permitir la entrada viral a la clulas. De este modo, se lleg a identificar que ciertos receptores de quimioquinas actan como correceptores del virus. As, la molcula CXCR-4 acta como correceptor para cepas virales linfocitotrpicas, usualmente con fenotipo inductor de sincicios, en cambio CCR-5, ayuda a las cepas macrofagotrpicas no inductoras de sincicios a entrar a la clula. Una variante gentica de CCR-5, con una delecin de 12 bp se ha relacionado con resistencia a la infeccin por VIH-1 e in vitro, las clulas mononucleares de sujetos que han estado expuestos al VIH, pero que son homocigotos para esta mutacin habitualmente son resistentes a la infeccin. Tambin se ha sugerido un retardo en la progresin de la enfermedad en individuos que son heterocigotos para el alelo mutante. Los receptores de quimioquinas toman contacto estrecho con el asa V3, facilitando una unin ms estrecha del virus con la membrana de la clula hospedera, facilitando as la fusin. El mecanismo de entrada de la cpside, sin embargo, es desconocido. Muchas clulas CD4- son susceptibles de ser infectadas por VIH, incluyendo fibroblastos de la piel y de la pulpa dental, clulas foliculares dendrticas, clulas de la glia, clulas endoteliales de capilares cerebrales, clulas epiteliales cervicales, clulas del trofoblasto, clulas de epitelio intestinal, clulas del epitelio renal. Se postula que esta infeccin es posible por la interaccin con receptores secundarios como los de

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quimioquinas o por un receptor de fusin desconocido. Tambin se ha demostrado que en neuronas actan como receptores virales los glicolpidos de membrana galacilceramida y galacilsulfuro. Estos receptores se han relacionado tambin con la infeccin de clulas intestinales y del epitelio vaginal. El VIH establece adems uniones con otras molculas presentes en la membrana de la clula hospedera y que pueden aumentar su infectividad, como por ejemplo molculas MHC y molculas de adhesin celular (LFA-1, ICAM-1, CD44), protenas que unen la manosa presente en la envoltura viral. Un concepto clave en los eventos iniciales de la interaccin del VIH con la clula es que probablemente la unin a CD4 provoca cambios conformacionales tanto en la gp120 como en CD4. Esta alteracin causa los cambios necesarios para la unin con CXCR-4, CCR-5, u otros co-receptores. Luego ocurre la fusin entre gp41 y el receptor de fusin y se produce la fusin virus-clulas, que es pH independiente. Enseguida se produce la entrada del core completo en la clula. Posteriormente se inician eventos intracelulares como la transcripcin reversa, produccin del DNA viral y su duplicacin en un DNA de doble cadena que llega al ncleo en donde se integra en el DNA cromosomal. La produccin del mRNA y del RNA genmico viral conduce posteriormente a la produccin de las poliprotenas virales. Enseguida se incorpora el RNA genmico en la cpside formada en la membrana celular y en compartimientos intracelulares, ocurriendo el procesamiento de las poliprotenas Gag y GagPol en la membrana celular y en los viriones en gemacin. Estas protenas procesadas se incorporan en la envoltura viral constituyendo los nuevos viriones maduros. En la tabla 31-1 se presentan las etapas del ciclo celular del VIH-1. Mecanismos adicionales de entrada del virus a la clula hospedera pueden estar mediados por receptores Fc y del complemento. De hecho, en estudios sobre la respuesta humoral en la infeccin por VIH, se ha demostrado la facilitacin de la infeccin viral mediada por anticuerpos. Control de la replicacin del virus El estado de activacin de las clulas T es importante para la replicacin viral e involucra la

interaccin de factores intracelulares con las regiones LTR (long terminal repeat) presentes en los extremos del genoma viral. Durante este proceso, se activan factores transcripcionales, por ejemplo NF-B cuya interaccin con regiones de los LTR puede aumentar o suprimir la replicacin viral. Ciertas citoquinas y hormonas, as como protenas transactivadoras de otros virus, pueden tambin aumentar la produccin del VIH va estos eventos intracelulares.

Tabla 31-1. Ciclo celular del VIH

Unin de la gp120 de la envoltura viral al receptor de superficie celular: CD4 u alternativo. Cambio conformacional de la gp120 y quizs de la molculas CD4. Unin de otra regin de la gp120 a un coreceptor. Desplazamiento de gp120. Clivaje proteoltico del asa V3. Interaccin del domino de fusin del VIH (por ej. gp41) con un receptor de fusin de la superficie celular (posiblemente un glicolpido). Fusin virus:clula. Entrada del RNA viral asociado con el core al citoplasma celular. Inicio de la transcripcin reversa. Produccin del DNA viral a partir del RNA viral y su duplicacin en hebras de doble cadena, generacin forma circulares unidas covalentemente y no covalentemente. Transporte del DNA copiado al ncleo, integracin de las formas circulares unidas no covalentemente al DNA cromosomal. Produccin del mRNA viral y del RNA genmico viral a partir del DNA proviral integrado. Produccin de protenas virales. Incorporacin del RNA genmico en la cpside formada en la membrana celular. Procesamiento de las poliprotenas Gag y Gag-Pol en la superficie celular y en los viriones en formacin. Gemacin de la cpside viral a travs de la membrana celular con incorporacin de las glicoprotenas de envoltura procesadas presentes en la superficie celular.

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Mecanismos citopticos Muy importante en la comprensin de la patognesis del VIH en el individuo infectado es el conocimiento de los mecanismos citopticos por los que actan el virus o sus protenas sobre las clulas infectadas y no infectadas. Ciertos VIH-1 aislados de individuos con enfermedad avanzada, tienen una mayor capacidad para matar clulas infectadas en cultivo que los aislados de individuos asintomticos. La muerte celular parece ser el resultado de la formacin de clulas multinucleadas, necrosis y apoptosis. La formacin de clulas multinucleadas o sincicios que ocurre en cultivo, y quizs en el individuo, es el resultado de la fusin de clulas infectadas con clulas CD4+ no infectadas; parece involucrar carbohidratos y glicolpidos de la superficie celular y muy probablemente mltiples interacciones gp120:CD4. VIH inductores de sincicios (IS) se encuentran ms frecuentemente en individuos con enfermedad avanzada. Sin embargo, exceptuando el cerebro, no hay evidencias de la existencia de clulas multinucleadas in vivo. Varias observaciones han relacionado la muerte celular con toxicidad directa del virus o de la envoltura viral. El mecanismo no es claro, pero podra involucrar un cambio de la integridad de la membrana celular y/o apoptosis. Se ha descrito actividad citotxica a varias protenas virales. La apoptosis acelerada de clulas T que se observa en la infeccin por VIH-1 puede estar relacionada con varios mecanismos: protenas virales especficas que actan como inductoras, interaccin de las protenas del virus con la molcula CD4, interaccin de citoquinas con sus receptores (particularmente el sistema Fas/Fas-ligando). A todos estos mecanismos, pueden sumarse defectos de las clulas presentadoras de antgeno que llevan a una actividad defectuosa de las clulas T y, por ltimo, una actividad tipo superantgeno del VIH. 2.3. Progresin de la infeccin por VIH-1 La evolucin en el tiempo de un paciente con infeccin por VIH es muy variable, sin embargo, se han evidenciado mltiples factores, que intervienen en una mayor o menor progresin a SIDA. En general, se describen tres grupos de pacientes de acuerdo a su evolucin: los progresores tpicos, que corresponden al 80-90% de los casos, y cuya sobrevida es aproximadamente

10 aos; los progresores rpidos, evolucionan a SIDA en 3 a 4 aos, y corresponden al 5-10% de los casos; y finalmente, los no progresores, o progresores lentos, que corresponden a no ms del 5% de los pacientes con infeccin por VIH, y que permanecen asintomticos por perodos de ms de 10 a 15 aos, manteniendo recuentos de clulas CD4+ superiores a 400/L, y cargas virales muy bajas o indetectables. Existen varios cofactores involucrados en la evolucin a la enfermedad, como la va de transmisin, edad al momento de la infeccin, estado previo del sistema inmune del husped, primoinfeccin sintomtica, coinfecciones con otros patgenos, etc. Se han descrito importantes asociaciones del sistema HLA ("Human Leukocyte Antigen", MHC en humanos) y progresin de la infeccin por VIH, en este sentido, se han identificado haplotipos HLA-A1/B8/DR3/B35, asociados con una rpida progresin a SIDA, y con una mayor susceptibilidad a la infeccin, en tanto haplotipos HLA-A9/ A25/ A32/ B5/ B18/ B27/ DR5/ DR6/ DR13, se asocian a individuos que presentan una lenta progresin a SIDA, y haplotipos HLA-A2/ A28/ DR13, a personas seronegativas, frecuentemente expuestas al VIH, por lo que se asocian con cierta resistencia a la infeccin. Otro factor importante a considerar en el curso de la infeccin por VIH, es la respuesta de clulas Th1 y Th2. Aparentemente se producira un "switch" en el curso de la infeccin por VIH, predominando la respuesta Th2 sobre Th1, lo que se ha relacionado con una rpida progresin a SIDA. 2.4. Ingreso al organismo El VIH ingresa al organismo, directamente a travs del torrente sanguneo, o a travs de mucosas, pudiendo ingresar como virus libre o clulas infectadas, lo habitual es la transmisin sexual a nivel de la mucosa genital. Las primeras clulas infectadas son las clulas dendrticas de la lmina propia, stas se fusionan con clulas CD4+, y se produce diseminacin a otros tejidos. El VIH puede ser detectado en los ganglios linfticos regionales, a los pocos das despus de producida la infeccin. Posteriormente ocurre diseminacin sistmica. Lesiones en la mucosa e inflamacin, debido a lceras genitales, uretritis o cervicitis, favorecen que se establezca la infeccin por VIH. En los ganglios linfticos se produce infeccin de clulas CD4+ activadas, y

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diseminacin a otros tejidos linfoides y rganos a distancia. Es importante comprender que desde el punto de vista virolgico, no existe perodo de latencia, ya que estos rganos linfoides, constituyen un reservorio del virus, y un sitio de constante replicacin. Existe un verdadero secuestro del VIH a nivel de las clulas dendrtico foliculares, presentes en los ganglios linfticos. 2.5. Respuesta inmune anti-VIH En la infeccin por VIH, la evolucin a SIDA est relacionada con el xito de la respuesta inmune en controlar la replicacin y diseminacin del virus. La respuesta inmune especfica, tanto humoral como mediada por clulass se ha demostrado en pacientes con infeccin por VIH, sin embargo, est claro que esta inmunidad especfica al virus, no confiere adecuada proteccin. Esto se explica, en cierta medida, por el hecho de que las clulas CD4+, necesarias para iniciar una repuesta inmune especfica y protectora, son destruidas o alteradas funcionalmente; adems el virus presenta un alto grado de variabilidad gentica, lo que lleva a variaciones antignicas, que le sirven al VIH para evadir al sistema inmune del husped. 2.6. Diagnstico de laboratorio La pesquisa de anticuerpos anti-VIH en muestras de suero es el mtodo ms comnmente empleado para el diagnstico de laboratorio de la infeccin por VIH. Los antgenos usados en los ELISAs y otras pruebas de tamizaje para pesquisar anticuerpos anti-VIH incluyen pptidos recombinantes/sintticos de VIH-1 y VIH-2. Debido a que estas pruebas son muy sensibles pero no tan especficas, y dado la trascendencia del diagnstico de infeccin por el VIH es necesaria la confirmacin de los resultados positivos. Entre las pruebas de confirmacin se pueden citar las basadas en la inmunoelectrotransferencia o western blot (la ms usada), inmunofluorescencia indirecta, radioinmunoprecipitacin e immunoblot con antgenos recombinantes. 2.7. Tratamiento El tratamiento en los pacientes VIH positivos depender de la etapa en que se encuentra la enfermedad. Se han establecido parmetros clnicos y de laboratorio para decidir el momento ms adecuado para iniciar este tratamiento, que no es

curativo sino que est orientado a suprimir la replicacin viral, permitiendo la recuperacin inmunolgica del individuo, mejorando su estado de salud y calidad de vida. a) Tratamiento antirretroviral Los objetivos teraputicos frente a la infeccin por VIH han ido evolucionando en funcin de la eficacia y seguridad de los antirretrovirales, y de una forma esquemtica se han ido planteado las siguientes alternativas posibles: (i) Reduccin sustancial de la carga viral, sin que necesariamente se pretenda que la viremia sea indetectable, (ii) carga viral plasmtica indetectable y (iii) erradicacin de la infeccin. Los principios generales del tratamiento frente a la infeccin por VIH son los siguientes: (i) tratamiento intenso, con el propsito de suprimir al mximo la replicacin viral, (ii) anlisis de beneficios y riesgos del inicio del tratamiento antirretroviral, (iii) desarrollo de resistencia a los antirretrovirales, (iv) base de la teraputica actual son las combinaciones de antirretrovirales, (v) el recuento de LT CD4+ y la carga viral son imprescindibles, (vi) la adherencia al tratamiento es un pilar esencial frente a la infeccin por VIH. Los antirretrovirales disponibles comercialmente pertenecen a 3 familias: (i) los inhibidores de la transcriptasa reversa anlogos de nuclesidos: zidovudina (ZDV), didanosina (ddI), zalcitabina (ddC), estavudina (d4T), lamivudina (3TC), (ii) los inhibidores de la transcriptasa reversa no anlogos de nuclesidos: delavirdina, y (iii) los inhibidores de proteasa: ritonavir (RIT), saquinavir (SAQ), indinavir (IND) y lopinavir. Cada uno de estos medicamentos tiene un perfil de efectos adversos que es necesario considerar, e interacciones con otros frmacos. b) Otros tratamientos En el paciente con infeccin por VIH es esencial la atencin integral. No slo considerar la terapia farmacolgica, sino el apoyo psicolgico para l y su entorno, apoyo nutricional, prevencin de complicaciones oportunistas, uso adecuado de ciertas vacunas, prevencin de reinfecciones con el VIH (sexo ms seguro), entre otras medidas. En este marco tambin puede tener un lugar, en casos seleccionados, la terapia inmunolgica con citoquinas como la IL-2 para estimular la reconstitucin inmunolgica.

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Respuesta humoral La produccin de anticuerpos con especificidad para varios de los componentes virales, se produce precozmente en el curso de la infeccin por VIH, constituyendo la base para el diagnstico. Hay evidencias que demuestran que una disminucin de los anticuerpos anti-gag o anti-pol, precede la progresin a SIDA en 1 a 4 aos. Existen anticuerpos que pueden neutralizar la infectividad de virus libres, o unidos a membrana, antes de su entrada a las clulas, tambin se han reportado anticuerpos neutralizantes de protenas estructurales internas. El principal eptopo neutralizante, est localizado en la regin hipervariable de la gp120 de la envoltura, la regin V3, los anticuerpos con especificidad para esta regin son tipo-especfico. En el genoma viral, que codifica para las gp 120 y gp 41, se han identificado los sitios especficos de reconocimiento antgnico, de anticuerpos neutralizantes, con propiedad ADCC (Citotoxicidad dependiente de anticuerpos) y reconocimiento de clulas T especficas. Los anticuerpos neutralizantes contra la regin hipervariable V3 de la gp 120, al parecer inhiben la infeccin al bloquear cambios conformacionales de la gp120, necesarios para el proceso de fusin y entrada del VIH a la clula. Tambin se han descrito anticuerpos neutralizantes contra la regin de unin a CD4 de la gp120, su rol protector es menos eficaz que los anteriores. Los niveles sricos de anticuerpos neutralizantes, aparecen 2 a 4 semanas despus de la primoinfeccin, alcanzando su "peak" durante la fase asintomtica. En etapas avanzadas de la infeccin, estos anticuerpos se encuentran a muy bajos niveles. En cuanto a los anticuerpos con propiedad ADCC, o fijacin del complemento, existe an bastante controversia de su rol benfico o deletreo in vivo. Se ha observado que anticuerpos anti-VIH, que median ADCC de clulas que expresan gp120 o gp41, se elevan precozmente en el curso de la infeccin, y son detectados a travs de toda la evolucin, disminuyendo sus niveles con el desarrollo de la enfermedad. Tambin se han descrito los anticuerpos facilitantes de la infeccin por VIH, va receptores del complemento o fraccin Fc de las inmunoglobulinas. El significado "in vivo" de estos anticuerpos facilitantes es an controvertido, aunque se ha observado que su presencia se correlaciona con progresin a SIDA.

Respuesta celular Existen evidencias de la importancia de la inmunidad celular especfica anti-VIH, y de su rol en la progresin a SIDA. Se han identificado respuestas de clulas Th anti-VIH, clulas CD8+ que median citotoxicidad directa de clulas infectadas, va restriccin MHC clase I, y tambin clulas CD8+ que suprimen la replicacin del VIH por mecanismos MHC independientes. Se han identificado los eptopos de la envoltura viral, que son el blanco de los LTh y LT citotxicos, sin embargo, se ha evidenciado respuesta a la mayora de las protenas estructurales y reguladoras del virus. Diferentes ensayos de inmunizacin activa, en modelos animales, han demostrado que la respuesta inmune mediada por LT CD8+, es la que mejor se correlaciona con proteccin de la infeccin por VIH. Para desarrollar una vacuna anti-VIH eficaz, es necesario comprender ampliamente los aspectos de la inmunidad protectora anti-VIH.

3. SISTEMA INMUNE FETAL Y NEONATAL El recin nacido est expuesto a infecciones neonatales por bacterias pigenas, virus y ciertos patgenos intracelulares como Toxoplasma Gondii y Listeria Monocytogenes, dada la inmadurez de su sistema inmunitario, tanto humoral como celular. 3.1. Inmunidad celular Tanto los linfocitos T CD4+ como los T CD8+ aparecen en el hgado y bazo a las 14 semanas de gestacin, luego se produce un aumento progresivo hasta los 6 meses de vida extrauterina que declina gradualmente hasta llegar a los niveles del adulto durante la infancia. La relacin CD4/ CD8 es mayor durante la vida fetal (3,5) vs 2,5 al trmino del embarazo. La relacin en un adulto se estima entre 1,2 y 2,1. As, los linfocitos T en nios de trmino estn aumentados en nmero y presentan una mayor expresin de CD38 (marcador timocitario) o de CD45RA (marcador de linfocitos T nave, presentes en el 90% de estos linfocitos a esta edad vs un 60% de representacin en la misma poblacin T en un adulto). Tambin existe una respuesta normal a mitgenos pero una menor respuesta proliferativa

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a anticuerpos anti-CD2 y anti-CD3, lo que correspondera a una propiedad general de los linfocitos T nave ms que a una caracterstica nica de los linfocitos T del recin nacido. Existe adems un dficit de la produccin de linfoquinas, IL-3, IL-4, IL-5 e IFN-, comparado con la produccin de los linfocitos T del adulto. Por los factores ya mencionados y por la menor expresin de molculas coestimuladoras, como por ejemplo el ligando CD40 de superficie, existe una menor colaboracin para la funcin de los linfocitos B, que tienen una menor produccin de anticuerpos. En general, las respuestas T citotxicas estn disminuidas en recin nacidos, promediando el 30 a 60% de aquella generada por las clulas adultas. 3.2. Inmunidad humoral Aunque existe sntesis de anticuerpos especficos desde las 20 a 24 semanas de vida intrauterina, la concentracin de IgM e IgA es baja al momento de nacer, por la falta de exposicin antignica. Respecto a la inmunoglobulina G, el neonato depende del paso transplacentario de este anticuerpo para protegerse contra ciertos patgenos, lo que ocurre principalmente en las ltimas 8 a 10 semanas de la gestacin, por lo cual un nio prematuro es ms susceptible a desarrollar estas infecciones. Este paso transplacentario comienza a niveles bajos desde la octava semana de gestacin, aumenta progresivamente durante el embarazo y en el recin nacido de trmino incluso excede en 5 a 10% el nivel de inmunoglobulina G materna. Los linfocitos B del feto y neonato humano son funcionalmente inmaduros y sus respuestas de anticuerpos especficas son esencialmente IgM y la respuesta a antgenos polisacridos est severamente alterada. Los linfocitos B neonatales no se diferencian a clulas plasmticas productoras de IgG o IgA por falta de colaboracin de los LTh cuya actividad tambin est disminuida, como veremos posteriormente. Tambin puede producirse una tolerancia neonatal a antgenos encontrados durante la vida intrauterina y desarrollarse una anergia clonal de estos linfocitos especficos, y ello puede explicar el dficit de produccin de anticuerpos que puede observarse en infecciones congnitas adquiridas tempranamente in tero, como la Rubola. Existe un problema adicional con ciertos patgenos, ante los cuales la respuesta materna es

principalmente de IgM, como por ej. Salmonellas y Escherichia Coli y donde los niveles de IgG protectores son suficientes para la madre, pero no para el feto o recin nacido, ya que la madre puede montar una respuesta inmune secundaria con rapidez y tambin una respuesta de IgM ms rpida a estos antgenos de evocacin, cuando su sistema inmune se encuentra nuevamente con el patgeno. Respecto a los niveles de inmunoglobulinas, es importante destacar que la IgM alcanza el nivel de un adulto al ao de vida, la IgA en la adolescencia y la IgG alrededor de los 5 a 6 aos. En un nio prematuro, se observarn menores concentraciones de inmunoglobulinas que en un nio de trmino. 3.3. Inmunidad innata Respecto a las concentraciones de los factores del Complemento, y su actividad funcional estn disminuidas incluso en recin nacidos de trmino, y estas deficiencias son an ms evidentes en prematuros. La va alterna ms es la afectada. La sntesis de los factores del complemento se inicia a las 6 a 14 semanas de vida intrauterina, pero no es significativa hasta el tercer trimestre de la gestacin. Al trmino del embarazo, los niveles de las protenas del complemento representan el 50 a 75% de los niveles maternos. Tambin se ha observado que la concentracin de fibronectina, una glicoprotena de alto peso molecular, que acta como opsonina, est reducida en el recin nacido, en especial en aquellos que presentan distress respiratorio, asfixia y cuadros spticos. Respecto a las caractersticas del sistema fagoctico a esta edad, podemos sealar que el nmero de neutrfilos circulantes se eleva poco despus del nacimiento, pero la capacidad de respuesta medular y produccin de nuevas clulas en la presencia de cuadros infecciosos es limitada, especialmente en prematuros. Estas clulas alcanzan un peak a las 12 a 14 horas del nacimiento, y posteriormente disminuyen, alcanzando a las 72 horas los niveles sanguneos de un adulto El nmero de monocitos circulantes, est normal o aumentado en recin nacidos, con una capacidad de respuesta medular conservada. La produccin de macrfagos comienza desde la cuarta semana de gestacin, pero se desconoce el nmero de macrfagos tisulares en recin nacidos. Estas clulas tienen una permanencia de 2 a 3 meses en los tejidos, luego de un paso sanguneo de 2 a 3 das como monocitos.

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La quimiotaxis de neutrfilos y monocitos est disminuida, probablemente debido a una menor expresin de molculas de adhesin, defecto que se hace ms evidente en prematuros. Por este motivo, la liberacin de monocitos a tejidos inflamados o infectados, est retardada. Las funciones fagoctica y microbicida de neutrfilos y monocitos provenientes de recin nacidos sanos, estn conservadas in vitro pero alteradas en nios enfermos, especialmente si son prematuros. La produccin de citoquinas monocitarias est relativamente conservada en recin nacidos de trmino, y son capaces de secretar IL-1, IL-6, TNF- e IL-8, en forma similar a las clulas de un adulto, ante un estmulo endotxico. Tambin est conservada la capacidad de producir GM-CSF y G-CSF (Factor estimulador de colonias granulocito-monocito y granulocito, respectivamente). Las clulas natural killer (NK) representan un 10 a 15% de los linfocitos circulantes en el adulto y en el recin nacido. Se observan en el hgado fetal a partir de la sexta semana de gestacin. Su nmero alcanza un peak en el primer ao de vida y a los 4 a 5 aos alcanza los niveles de un adulto. Respecto a su funcionalidad, es importante destacar que sta aumenta progresivamente en la vida fetal y postnatal, y que slo el 50% de ellos expresa el marcador CD56 al momento del nacimiento. A esta edad estas clulas tienen una menor actividad citoltica.

cambios en la regulacin de la funcin de los monocitos/macrfagos. Por estas razones, la senescencia inmunolgica ms bien hay que entenderla como una disrregulacin del sistema inmune, que como una deficiencia. 4.1. Inmunidad celular Si bien no hay cambios de los linfocitos T totales con la edad, se produce un aumento significativo del cuociente entre las dos principales subpoblaciones de linfocitos T, (LT CD4+ y LT CD8+), debido a un aumento significativo de los linfocitos T CD4+. A diferencia de lo que se encuentra en el individuo joven, en el que predominan las clulas T CD4+ vrgenes (no han tenido contacto con antgeno), que se caracterizan por el marcador de membrana CD45RA+, en el senescente estas clulas T CD4+ son predominantemente linfocitos T de memoria, que llevan el marcador CD45RO+ . En los jvenes, el porcentaje de clulas T virgen excede al de clulas T de memoria. A lo largo de la vida, la activacin de las clulas T vrgenes estimula su transicin a clulas T de memoria, y por esta razn el tamao de estos dos compartimientos celulares, cambia recprocamente con la edad. Ya en las edades medias de la vida, las clulas T de memoria son ms numerosas que los LT vrgenes. Ambas subpoblaciones difieren no solamente en las molculas que ellas activan sino tambin en las citoquinas que producen. Por estas razones, el cuociente alterado entre estas subpoblaciones contribuye en forma importante al efecto de la edad sobre la respuesta inmune. Debido a que la expansin clonal de las clulas T es una etapa importante en la respuesta inmune, se ha estudiado extensamente la capacidad de respuesta proliferativa de los linfocitos T en individuos jvenes y en senescentes. En los ancianos se ha encontrado que la capacidad de respuesta proliferativa de las clulas T a mitgenos como "phytohemagglutin" (PHA), "concanavalin A" (Con A) y al anticuerpo monoclonal anti-CD3, est disminuida. Estos cambios parecen explicarse por alteraciones de la expresin de diversos proto-oncogenes que regulan la proliferacin de los linfocitos T, constatadas en estos grupos de la poblacin. Esta menor capacidad de respuesta proliferativa de las clulas T en los ancianos, se asocia con una disminucin de la produccin y de la respuesta a la IL-2, interleuquina que es esen-

4. E N V E J E C I M I E N T O Y S I S T E M A INMUNE En el anciano hay una mayor incidencia de enfermedades en general, y de enfermedades infecciosas en particular. Si bien parece lgico plantear que en el anciano, existe una inmunodeficiencia asociada con la edad, que podra explicar esta mayor incidencia, los marcadores ms comunes de inmunodeficiencia no se constatan en el senescente saludable. Por ejemplo, no se produce una disminucin del recuento de linfocitos totales circulantes ni de la concentracin de inmunoglobulinas sricas con la edad. Ms bien, la senescencia inmunolgica se caracteriza por un cambio en el nmero y competencia de las subpoblaciones linfocitarias y de las citoquinas que ellas producen, como asimismo por un cambio en el repertorio de los linfocitos (menos clones) y

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cial en esta etapa. Parece ser que esto se debe a una disminucin de la expresin de los receptores de alta afinidad para la IL-2, que se ha constatado en estos individuos. La produccin de otras citoquinas inmunorreguladoras no est disminuida en el anciano. Con la edad la produccin de IFN- no cambia y la produccin de IL-4 y de IL-6 aumenta. Estas citoquinas actan como factores de crecimiento de las clulas B, pueden contribuir al aumento de la produccin de autoanticuerpos y de Igs monoclonales, que se observan en el senescente. Estos cambios en la produccin de citoquinas en el anciano pueden deberse, al menos en parte, al cambio que ocurre en la proporcin de clulas T vrgenes y de memoria, ya que la secrecin de citoquinas producidas por estas dos subpoblaciones celulares, es diferente. Ambas producen IL2, pero las clulas T de memoria son las principales productoras de IFN, IL-4 e IL-6. La expresin dominante de esta subpoblacin particular de linfocitos y la resultante produccin de citoquinas puede contribuir a la mayor susceptibilidad a ciertas infecciones, que se produce con la edad. La declinacin de las respuestas cutneas de hipersensibilidad retardada, asociada con la edad, fue el primer indicador que demostr que la funcin de las clulas T se altera con el envejecimiento. Muchas personas de edad avanzada, a pesar de infeccin previa con el Mycobacterium tuberculosis, tienen respuestas dbiles o no tienen respuestas cutneas frente al PPD y otros antgenos de evocacin. 4.2. Inmunidad humoral La inmunidad humoral se afecta poco. En general, el nmero y funcin de los linfocitos B permanece intacto, as como las inmunoglobulinas, que pueden estar normales o levemente aumentadas. Hace excepcin la IgE, que puede estar muy alta, independientemente de la contribucin de otros factores, tales como parasitosis o alergia, reflejando una regulacin defectuosa de su produccin por las clulas T. Otros componentes del sistema de defensas inespecfico, tales como el sistema fagoctico, tambien est disminuido en la malnutricin, tan frecuente en el anciano. La fagocitosis generalmente se mantiene intacta, pero algunos estudios han mostrado una migracin y una capacidad bactericida deficiente. En general, estos defectos

no son severos, pero ellos pueden contribuir, a hacer ms profundas las alteraciones de la inmunidad celular que se describen antes.

5. INMUNIDAD Y NUTRICIN La nutricin inadecuada, influencia adversamente la mayora de las funciones inmunes normales. La primera lnea de defensa en la inmunidad normal es la integridad fsica de piel y mucosas. Deficiencias de nutrientes especficos se han correlacionado con alteraciones de estas importantes barreras, entre otras, la deficiencia de vitamina A, riboflavina y piridoxina. La deficiencia proteica se asocia con atrofia generalizada de la piel y, a nivel celular, puede llevar a una deplecin del nmero de linfocitos y de clulas plasmticas en el espacio intersticial de las membranas mucosas. Estas clulas juegan un rol importante en la produccin de IgA secretora, la principal inmunoglobulina de las mucosas. 5.1. Inmunidad celular La disminucin de la funcin de las clulas T y de la inmunidad celular es el hallazgo ms consistente en la evaluacin inmunolgica de los individuos malnutridos. Hay deplecin tanto de los linfocitos circulantes como tisulares y las respuestas cutneas de hipersensibilidad retardada estn disminuidas, en forma proporcional a la severidad de la malnutricin. Las respuestas proliferativas de los linfocitos T estn alteradas en forma variable. Los mecanismos responsables de esta disminucin de la inmunidad celular se conocen slo parcialmente, postulndose la participacin de numerosos factores. En nios, estas alteraciones se recuperan luego de una suplementacin diettica adecuada. 5.2. Dficit de nutrientes especficos Se ha demostrado que las deficiencias de nutrientes especficos, incluyendo vitaminas esenciales y minerales, tienen un efecto adverso sobre varios parmetros de la inmunidad. El problema de las interacciones de los micronutrientes con el sistema inmune es complejo, debido a la asociacin frecuente con otras deficiencias nutricionales, la presencia de infecciones clnicas o subclnicas, las cuales por s mismas tienen un efecto sobre el sistema inmune. Las deficiencias aisladas de

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micronutrientes son raras, exceptuando las de fierro, la vitamina A y zinc. El rol de la deficiencia de vitamina A en la disminucin de las respuestas inmunes parece ser muy importante, como queda demostrado por la significativa disminucin de la morbimortalidad que se ha observado en poblaciones deprivadas, sometidas a suplementacin diettica con esta vitamina. La vitamina A parece jugar un papel importante en las funciones inmunes, como se mencion, en la mantencin de la integridad de las barreras anatmicas, pero adems, se han documentado otros defectos inmunolgicos en el dficit de vitamina A: leve reduccin del peso del timo, disminucin de la respuesta de los linfocitos T a los mitgenos, disminucin de la produccin de anticuerpos especficos, disminucin de la proliferacin de los linfocitos T in vitro y aumento de la adherencia bacteriana a las clulas epiteliales respiratorias. La deficiencia de zinc se ha estudiado ms extensamente que otras deficiencias. Estos estudios han demostrado que el zinc tiene los siguientes efectos profundos sobre la funcin inmune: atrofia de tejidos linfticos en animales de experimentacin, deplecin linfocitaria, disminucin de las respuestas de hipersensibilidad cutnea retardadas, disminucin de la respuesta proliferativa de los linfocitos a mitgenos, menor quimiotaxis de los neutrfilos, entre otras. La deficiencia de vitamina E se asocia con una disminucin de la inmunidad celular, disminucin del recuento de linfocitos T y de las respuestas de las clulas NK. Tambin se han observado sntesis de anticuerpos disminuidas. Estos efectos son mayores cuando existe concomitantemente un dficit de selenio. No existe mucha informacin acerca de los efectos de la malnutricin y, en particular, de dficit especficos de micronutrientes, en poblacin anciana. La mayor parte de los trabajos, a este respecto, se han efectuado en nios.

saria para la reparacin de la herida y para la defensa local contra los microorganismos. Esta reaccin tambin evoca una respuesta sistmica que, en general, es depresora de la inmunidad, cuya finalidad sera proteger al organismo de un sndrome de inflamacin sistmico que podra llegar a ser deletreo. El grado de inmunodeficiencia se correlaciona con el grado de injuria y estrs y es causa de mayor morbilidad y mortalidad en pacientes quirrgicos y traumatizados, entre otras, sepsis y falla orgnica mltiple. Los individuos con mayor riesgo son los recin nacidos, senescentes, pacientes con enfermedades severas subyacentes, especialmente las que afectan al sistema inmune, malnutridos y alcohlicos. La identificacin de estos pacientes es importante y en pacientes con ciruga electiva es til la evaluacin previa de la inmunocompetencia, ya que pacientes anrgicos o que se hacen anrgicos con la ciruga tienen mayor riesgo de sepsis y tambin mayor mortalidad.

7. INMUNODEFICIENCIA SECUNDARIA A ENFERMEDADES INFECCIOSAS Existen diversos mecanismos por los cuales un agente infeccioso puede producir una alteracin de la respuesta inmune. Es un hecho conocido que despus de algunas infecciones, como por ejemplo el sarampin, el paciente que la ha experimentado queda propenso a tener otras infecciones, lo que da cuenta de un deterioro de la respuesta inmune. Este dficit suele ser transitorio en la mayor parte de las patologas infecciosas que lo producen, pero existen otras, como la infeccin por VIH (ver punto 2) que conducen a un deterioro progresivo del sistema inmune. Entre estos mecanismos de depresin inmunitaria estn la infeccin directa de las clulas del sistema inmune, la alteracin de subpoblaciones linfocitarias con linfopenia generalizada, supresin de la respuesta de LTh, activacin de linfocitos T supresores, y la generacin de mediadores solubles que afectan la accin de clulas o mediadores inmunolgicos (interferones y citoquinas derivadas del husped y factores supresores y superantgenos derivados del patgeno). Existen diversos estudios epidemiolgicos que muestran la mayor incidencia de infecciones respiratorias altas y bajas durante epidemias de

6. INMUNODEFICIENCIA INDUCIDA POR CIRUGA Y TRAUMA El trauma quirrgico, ya sea accidental o en el pabelln gatilla una respuesta inflamatoria y metablica, destinada a controlar sus efectos y a la reparacin. En general, el estrs quirrgico evoca una respuesta pequea y controlable. La inflamacin local producida por este proceso es nece-

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influenza, e infecciones por virus sincicial respiratorio y adenovirus, en estos pacientes. Tambin se ha observado la asociacin de infecciones simultneas, como por ejemplo, neumopatas por Citomegalovirus y Herpes simplex, e infeccin por virus de Epstein-Barr con Candidiasis diseminada, entre otros ejemplos. A continuacin se analizan algunos de los principales patgenos asociados con inmunodepresin: 7.1. Inmunodeficiencia secundaria a infecciones virales Sarampin. Este virus infecta directamente a las clulas linfoides, incluyendo monocitos, linfocitos T y B, tambin es capaz de alterar la actividad de clulas NK y la sntesis de inmunoglobulinas. Este perodo de inmunodepresin habitualmente se manifiesta por unas pocas semanas, pudiendo conducir al desarrollo de otras infecciones en ese momento. Este virus, se une a CD46, una protena regulatoria del complemento, que acta como receptor viral, y esta unin impide la produccin de interleuquina 12 por monocitos y macrfagos, in vitro. La IL-12 es crtica en el desarrollo de la inmunidad celular, ya que es un potente inductor de IFN- en linfocitos T y clulas NK y es importante en el desarrollo de respuestas de tipo Th1 y respuestas de hipersensibilidad retardada. Si se mide la produccin de IL-12 por monocitos de sangre perifrica de pacientes con sarampin, se observa una marcada supresin de la produccin de esta citoquina. Este fenmeno es objetivable hasta varios meses despus de la infeccin aguda. En esta patologa, como existe un dficit inmunitario global, comandado por la supresin de la proliferacin T ante el estmulo antignico, tambin es posible encontrar anergia cutnea en las pruebas de hipersensibilidad retardada, que es una caracterstica comn de infecciones donde el compromiso de la inmunidad celular es preponderante. Virus de Epstein-Barr. Este es un virus de la familia de los Herpes virus, causante de la Mononucleosis Infecciosa (MNI), capaz de infectar directamente a los linfocitos B unindose al receptor CD21 de la superficie linfocitaria, y transformarlos produciendo una expansin policlonal de linfocitos B, con aumento de la produccin de anticuerpos, y por otra parte, existe una intensa proliferacin de linfocitos T CD8+, citotxicos y su-

presores. Los primeros estaran encargados de eliminar los linfocitos B infectados y los linfocitos supresores ms bien inhibiran la proliferacin B y mantendran al virus en estado latente. En esta enfermedad, existira un estmulo de la IL-10, proveniente de linfocitos Th2, y tambin por un homlogo viral de esta IL-10, que actan en forma inhibitoria, de la actividad Th1, de la liberacin de citoquinas y de la sntesis de IL-12, actuando sobre los macrfagos para inhibir la activacin Th1. Tambin se ha observado un aumento temporal del nmero de clulas NK, que presentan, sin embargo, una funcin disminuida, que dura aproximadamente 4 semanas, durante el curso de una MNI. La infeccin por virus de Epstein-Barr tambin se ha asociado con defectos inmunitarios ms severos y permanentes. Citomegalovirus. La infeccin por este virus de la familia de los Herpes virus puede manifestarse por un sndrome mononuclesico o por patologas habitualmente ms graves, cuando ocurre una reactivacin de la infeccin en condiciones de depresin inmunitaria (Infeccin VIH, uso de inmunosupresores, etc), con diseminacin de la infeccin y compromiso orgnico generalizado. Una vez que este agente infecta los monocitos, se replica en ellos e induce la produccin de una molcula inhibitoria de la actividad de la IL-1. Una vez que las personas superan la primoinfeccin por Citomegalovirus, la mayor parte queda como portadora de la infeccin en estado latente, y esta infeccin puede reactivarse con gran agresividad en casos de inmunodeficiencias posteriores. Otros Herpes virus. La infeccin por virus herpes simplex se asocia con una expansin de la poblacin T supresora, lo que se manifiesta con una linfoproliferacin disminuida y una menor produccin de anticuerpos. Las glicoprotenas virales pueden inhibir directamente la citolisis mediada por complemento, y, a travs de la unin al fragmento Fc de la IgG, impedir una adecuada fagocitosis. A nivel de recuentos hematolgicos, puede existir una linfopenia transitoria. El virus herpes 6, causante de la Roseola infantil, puede infectar directamente las clulas NK. Tambin se han reportado alteraciones en distintas funciones inmunitarias en la fase temprana de reactivacin de infecciones por virus varicella zoster.

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Virus Influenza. La infeccin aguda produce una linfopenia global transitoria, con disminucin de la proliferacin linfocitaria, incremento de la actividad NK debido a produccin de IFN y generacin de linfocitos supresores que inhiben la produccin de IL-2. Rinovirus. Es el agente del resfro comn, con una gran variedad de serotipos, lo cual representa un ejemplo de estrategia de evasin viral a la respuesta inmunitaria, que es especfica de cada serotipo. Existe un receptor natural del virus, la molcula de adhesin intercelular ICAM-1 (CD54). La infeccin por este virus lleva a un aumento de la produccin de IFN- y de la actividad de las clulas NK. Adenovirus. La infeccin por este virus se caracteriza por un dficit en la produccin de IL-2 y de la capacidad de respuesta inmunitaria a esta citoquina. Este virus produce una protena capaz de antagonizar los efectos de los interferones y otra protena que se une a las molculas del MHC clase I, dificultando as la respuesta citotxica de los linfocitos T CD 8+. Virus Sincicial Respiratorio. Existen diversos estudios sugerentes de una modulacin del sistema inmune por parte de este agente, sin que podamos claramente hablar de una inmunodepresin secundaria. Lo que se ha observado es una inmunomodulacin viral especfica a nivel de los linfocitos T helper 2 de memoria, que participaran en la expresin de manifestaciones obstructivas respiratorias, inclusive asma que presentan algunos sujetos, pero existe an bastante controversia sobre este tema. Virus Rubola. Este virus es capaz de infectar directamente diversas clulas del sistema inmune, lo que se ha evidenciado en diversos estudios que han utilizado citometra flujo. Papilomavirus. Este agente es el causante de patologas cutneas como verrugas y condilomas acuminados, que en general, son difciles de erradicar, pese a respuestas celulares y humorales medibles contra este agente, lo que sugiere una inmunosupresin funcional. Se ha identificado la presencia de un factor soluble, derivado de linfocitos de sangre perifrica, en estos pacientes, inhibitorio de la produccin y actividad de IL-2. Tambin se han reportado, en algunos pacientes,

la presencia de un mayor nmero de linfocitos T CD 8 supresores y defectos en las clulas T CD4+. Virus de la Rabia. Este virus expresa un superantgeno viral, que puede producir notorios trastornos inmunitarios, ya sea por delecin clonal o poderosas respuestas proliferativas de linfocitos T. 7.2. Inmunodeficiencia secundaria a infecciones bacterianas y fngicas Existen distintas alteraciones inmunolgicas, comunicadas en humanos, que se han observado en infecciones bacterianas graves, que incluyen alteracin de la quimiotaxis leucocitaria, disminucin de la eliminacin de partculas por el sistema fagoctico-mononuclear, fagocitosis disminuida y alteracin transitoria de la funcin bactericida. Estas alteraciones no son consistentes en todos los estudios publicados y se refieren a la presencia de linfopenia y cambios de las subpoblaciones de linfocitos T CD3+, CD4+ y CD8+. Componentes aislados de algunos microorganismos tienen efectos supresores de la inmunidad, como por ejemplo, el Lipoarabinomannan, de origen micobacteriano o componentes de Candida Albicans, que afectaran especialmente la funcin linfocitaria T. Distintos productos bacterianos ejercen un efecto de superantgeno sobre los linfocitos T, lo que puede conducir a estas clulas a su delecin clonal o a su inactivacin funcional. Entre ellos podemos mencionar toxinas estafiloccicas y estreptoccicas. Otros agentes no bacterianos asociados a un efecto de superantgeno son el virus de la rabia y el virus de la inmunodeficiencia humana. 7.3. Inmunodeficiencia secundaria a infecciones parasitarias Algunas infecciones parasitarias severas se asocian con algunos dficit inmunitarios, entre ellas podemos mencionar la Malaria (asociada con alteracin de la respuesta de anticuerpos a antgenos proteicos y polisacridos), la Esquistosomiasis (asociada con disminucin de respuestas linfocitarias a mitgenos in vitro y con escasa respuesta inflamatoria alrededor de los parsitos tisulares in vivo), la Enfermedad de Chagas (asociada con produccin de molculas capaces de bloquear la activacin del complemento) y otras

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Tripanosomiasis (asociadas con depresin de respuestas celulares y humorales) y algunas infecciones por Nemtodos (asociadas con disminucin de respuestas proliferativas in vitro hacia antgenos parasitarios e incapacidad de produccin de ciertas citoquinas como IL-1, IL-2 e IFN-.

8. INMUNODEFICIENCIA SECUNDARIA A ENFERMEDADES INFILTRATIVAS Y TUMORES Se han observado diferentes alteraciones en las respuestas inmunolgicas de pacientes con cncer, tanto in vivo como in vitro, dadas por su enfermedad de base, a las cuales se pueden agregar las propias de las terapias antitumorales correspondientes. Estos pacientes presentan una mayor susceptibilidad a infecciones, una menor respuesta en pruebas cutneas de hipersensibilidad retardada y una menor respuesta de inmunoglobulinas especficas ante vacunaciones, entre otros defectos. 8.1. Evasin de la respuesta inmune por tumores Ante el hecho de que ocurra la expansin de un tumor, al menos en su etapa inicial, podra pensarse en una falla inmunolgica que permita el desarrollo y diseminacin posterior de ste. Lo que ocurre es que estas clulas tumorales pueden evadir los mecanismos de control del sistema inmune de varias formas, entre ellas: (a) Disminuir la expresin de las molculas MHC clase I en su superficie, dificultando el procesamiento y presentacin antignica a linfocitos citotxicos. (b) Disminuir la expresin de molculas de adhesin y de -2 microglobulina de superficie, dificultando el reconocimiento antignico y causando la prdida de la inhibicin del crecimiento por contacto entre las clulas, fenmeno que ocurre en tejidos sanos normalmente. (c) Falta de expresin de molculas coestimuladoras en tejidos tumorales, como por ejemplo la molcula B7 (CD80), lo que dificulta su reconocimiento por distintos subgrupos de linfocitos T. (d) Las clulas tumorales pueden ser pobremente inmunognicas, dependiendo de los antgenos que expresen, lo cual puede evolu-

cionar segn la etapa de desarrollo en que este tumor se encuentre. Respecto a la expresin de antgenos por las clulas tumorales, es importante destacar que existen los llamados antgenos de diferenciacin, asociados a tumores, que requieren de otras seales antignicas para su reconocimiento, ya que representan eptopos celulares normales y que tambin existe expresin de neoantgenos, que contienen eptopos diferentes a los de antgenos normales, que se han utilizado en ciertas estrategias de tratamiento antitumoral. (e) Los tumores pueden antagonizar funciones inmunolgicas a travs de la produccin de factores solubles, la baja expresin de citoquinas en el microambiente tumoral o la induccin de defectos molculares en el receptor del linfocito T. Estas acciones no son comunes a todos los tipos de cncer existentes, y se observan distintas alteraciones asociadas a distintas patologas neoplsicas. As por ejemplo, se sabe que en el linfoma de Hodgkin y en algunos Gliomas malignos, existe secrecin de prostaglandinas por las clulas tumorales, como prostaglandina E2 que es capaz de aumentar la actividad de clulas supresoras de la actividad monocitaria. Las clulas tumorales (y tambin los linfocitos T humanos), son capaces de producir TGF- (factor de crecimiento transformante-), que dependiendo de la concentracin, tiene efectos supresores la respuesta inmune, afectando la funcin de linfocitos T, B y clulas NK, la produccin de IL-1, adems de la funcin macrofgica y la produccin de clulas inmunocompetentes en la mdula sea. Las clulas tumorales normalmente son destruidas por diversos mecanismos inmunolgicos, como la citotoxicidad mediada por linfocitos T CD8+ y clulas NK, y la lisis celular mediada por complemento, activada por las vas clsica y alterna. Las clulas normales expresan inhibidores del complemento que las protegen de esta cascada ltica en condiciones fisiolgicas. Se ha observado que varios tumores pueden expresar estas molculas en alta concentracin, como por ejemplo carcinomas, sarcomas, glioblastomas, melanomas y papilomas. Estos factores inhibidores son CD59, DAF (factor activador de la degradacin del complemento) y CLI (inhibidor de la citolisis por complemento). Estudios in vitro muestran que la expresin de los mRNA de estas

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molculas se correlaciona con la resistencia a la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. En investigaciones basadas en modelos de carcinoma de colon humano, se han observado diversos defectos moleculares del receptor del linfocito T, que se presentan progresivamente a medida que se desarrolla el tumor, y que comprometen su estructura interna y su funcin. 8.2. Defectos inmunolgicos en tumores Todos estos complejos mecanismos desarrollados por las clulas tumorales y su interaccin con las clulas normales, finalmente conducen a la expresin de una serie de defectos inmunolgicos, entre los que podemos mencionar la disminucin de las respuestas de hipersensibilidad retardada, de respuestas proliferativas a mitgenos, de sntesis de inmunoglobulinas, de respuestas monocitarias oxidativas, de produccin de citoquinas y el aumento de la actividad supresora a nivel monocitario. En algunos tumores, como linfomas y leucemias, se puede observar adems la presencia de linfopenia. En resumen, podemos concluir que existen diversas estrategias desarrolladas, a veces en forma evolutiva por las clulas tumorales, que les permiten por un lado escapar del control inmunolgico y por otra, alterar esta respuesta inmune afectando el nmero y la funcin de distintos grupos de clulas inmunocompetentes.

9. INMUNODEFICIENCIA SECUNDARIA A TERAPIA INMUNOSUPRESORA Existen numerosas enfermedades autoinmunes e inflamatorias cuyo tratamiento farmacolgico necesariamente induce un dficit inmunitario iatrognico. Algunos de estos frmacos tambin se utilizan en la prevencin del rechazo de trasplantes. Dichos frmacos inmunosupresores se presentan en la tabla 31-2. 9.1. Mecanismos de accin Estas terapias tienen distintas especificidades sobre el sistema inmune, y as, algunos frmacos actan ms selectivamente o ms generalizadamente, como analizaremos a continuacin. Las sustancias que actan sobre las clulas en divisin (Agentes alquilantes, antiproliferativos, inhibidores del metabolismo de las purinas) y las radiaciones ionizantes disminuyen la produccin de linfocitos B y T maduros en el timo y mdula sea. Cuando son administrados junto a un antgeno, actan selectivamente sobre linfocitos T y B activados, sin afectar los linfocitos de memoria en fase G0 del ciclo celular. Los linfocitos T de memoria que circulan entre la sangre y la linfa son relativamente insensibles a los tratamientos inmunosupresores, pero pueden destruirse por irradiacin linfoide total, drenaje prolongado del conducto torcico, proce-

Tabla 31-2. Categoras de Frmacos Inmunosupresores Antiproliferativos Metotrexato, Ciclofosfamida, Azatioprina, Mizobirina/Micofenolato, Brequinar, Deoxispergualina Antagonistas de las Inmunofilinas, Sirolimus, Ciclosporina A, Tacrolimus (FK506), Rapamicina Glucocorticoides Antinflamatorios no esteroidales Agentes biolgicos Globulinas antilinfocito y antitimocito, Gammaglobulina endovenosa, Anticuerpos monoclonales. Citoquinas y antagonistas de sus receptores Otros:Talidomida, Dapsona. Radiaciones ionizantes

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dimientos de afresis repetidos e inyecciones de anticuerpos antilinfocitarios, que retiran una parte de los linfocitos T de larga vida. La renovacin celular por parte del timo es ms efectiva en individuos jvenes que en ancianos. Algunos inmunosupresores actan sobre la presentacin de antgenos a los linfocitos T (IL-10, Deoxispergualina) o sobre las interacciones celulares generadoras de seales coestimuladoras (Anticuerpos anti-CD4, anti-LFA-1). Otros inhiben la transcripcin de los genes de citoquinas por las clulas T activadas (Ciclosporina A, FK506, Glucocorticoides) o bloquean las seales de progresin de la fase G1 a la fase S del ciclo celular (Rapamicina, Anticuerpos anti-CD25). Las molculas que interfieren con el metabolismo de las purinas inhiben la expansin clonal de los linfocitos T activados (Azatioprina, Mizobirina, Brequinar, Mofetil micofenolato metabolizado al producto activo, el cido micofenlico en el organismo. Los agentes alquilantes (Mostaza nitrogenada, Ciclofosfamida, Clorambucil) y el Metotrexato tambin actan en este estado, pero sin ninguna especificidad frente a los linfocitos T. Adems, algunos frmacos actan sobre la diferenciacin de los linfocitos T y B activados por antgenos (Deoxispergualina y Citoquinas que controlan el desarrollo celular Th1 y Th2 (IFN-, IL-4). Se profundizar brevemente los mecanismos de accin y efectos colaterales de algunos de estos frmacos. Agentes Alquilantes Estos agentes forman uniones covalentes con el DNA, y cuando se administran a altas dosis, conducen a la muerte celular. Actan, principalmente, en clulas en divisin y su uso implica riesgos como el desarrollo de aplasia medular, alopeca, esterilidad, cistitis hemorrgica, y a largo plazo, el desarrollo de tumores, como cncer vesical y leucemia mieloide. Por tener efectos mutagnicos y teratognicos, es indispensable el uso de un tratamiento anticonceptivo paralelo. Su accin se ejerce principalmente sobre los linfocitos B (Supresin de la produccin de anticuerpos e hipogammaglobulinemia), los linfocitos T CD8+ a bajas dosis y los linfocitos T CD4+ a altas dosis. Inhibidores del metabolismo de las purinas y pirimidinas Uno de ellos es el Metotrexato; al inhibir la tetrahidrofolato reductasa, bloquea la sntesis de

timidilato, la sntesis de novo de purinas y la divisin celular. En dosis altas, produce una fuerte toxicidad hematolgica y digestiva, aunque este efecto puede neutralizarse con la administracin preventiva de cido flico. A dosis bajas, no se asocia con mayor riesgo de mutagenicidad ni teratogenicidad, pero posee toxicidad heptica y puede producir fibrosis pulmonares. La Azatioprina, derivado de la 6-Mercaptopurina, no es activa por s misma, sino por sus derivados. Bloquea la transformacin del cido inosnico en cido adenlico, precursor de bases purnicas (guanina, hipoxantina). Su accin se ejerce, principalmente, sobre los linfocitos T CD4+ y CD8+ y sobre las clulas NK, pero tambin sobre el conjunto de clulas hematopoyticas, por lo cual se requiere un ajuste muy preciso de sus dosis. La administracin concomitante de inhibidores de la sntesis de cido rico (alopurinol) debe evitarse debido al riesgo de aplasia medular. La sobredosis puede producir pancitopenia, macrocitosis aislada y lesiones hepticas. Este frmaco es utilizado principalmente en trasplantes de rganos, con frecuencia asociado a corticoides. En enfermedades autoinmunes, la Azatioprina se utiliza, principalmente, en las formas corticorresistentes o corticodependientes con el fin de reducir la dosis de stos y sus efectos indeseables. Nuevos inhibidores de la biosntesis de nucletidos Son tres frmacos que inhiben en forma similar las respuestas linfocitarias T y B, pero con una menor incidencia de mielosupresin que los agentes anteriormente analizados. La Mizobirina y el cido Micofenlico inhiben la accin de la inosinmonofosfatodehidrogenasa, suprimiendo la sntesis de nucletidos guannicos. Brequinar inhibe una enzima requerida para la sntesis de novo de pirimidinas (Dihidroorotato dehidrogenasa). Antagonistas de Inmunofilinas La Ciclosporina A es un derivado de origen fngico, descubierta en 1976, que acta selectivamente frente a linfocitos T activados. Se une a receptores intracitoplasmticos, las ciclofilinas A, B, C y D de la familia de las inmunofilinas y este complejo inhibe la accin de la fosfatasa 2B o Calcineurina. Este efecto condu-

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ce a un bloqueo de la transcripcin, calcio dependiente, del gen de IL-2 y de otras citoquinas como IL-3, IL-4 e IFN-. Al contrario de los frmacos ya analizados, que actan sobre todas las clulas que sintetizan activamente DNA, este frmaco acta exclusivamente sobre los linfocitos activados, principalmente sobre los linfocitos T CD4+. No tiene efectos adversos sobre la hematopoyesis y no modifica la poblacin de linfocitos T de memoria. Su accin inmunosupresora es rpidamente reversible despus de suspender la terapia. Entre sus efectos secundarios podemos mencionar: nefrotoxicidad, con hipertensin arterial secundaria. El FK506 es un macrlido de origen fngico, que acta a menores dosis que la Ciclosporina A. Este frmaco se liga a una inmunofilina citoplasmtica, y este complejo tambin inhibe, a nivel transcripcional, la sntesis de IL-2 y otras citoquinas. La Rapamicina es otro macrlido que se une al mismo receptor citoplasmtico que FK506 pero sus efectos son distintos. Este frmaco bloquea la actividad de una serintreoninquinasa y su asociacin con la ciclina D1, que controla la entrada de las clulas a la fase S del ciclo celular. Por ello, la Rapamicina no disminuye la sntesis de citoquinas pero impide la expansin clonal de linfocitos T estimulados por antgenos. Glucocorticoides Se unen a receptores intracitoplasmticos y son traslocados al ncleo celular, donde el complejo se fija a secuencias reguladoras especficas, los elementos de respuesta a glucocorticoides, modulando positiva o negativamente la transcripcin de ciertos genes, en particular, genes que codifican para citoquinas. Tambin tienen efectos sobre la traduccin del RNA, la sntesis y la secrecin de citoquinas ( IL-2 e IFN-). In vivo, los glucocorticoides inhiben el acceso de los leucocitos a focos inflamatorios. A dosis altas, inducen una neutrofilia por movilizacin del pool marginal y una linfopenia que afecta principalmente a linfocitos T CD4+, por redistribucin de stos. Tienen, por lo tanto, su mayor efecto sobre la inmunidad celular. Su accin antinflamatoria se explica, principalmente, por los efectos que poseen sobre macrfagos y neutrfilos. Ellos inhiben la sntesis de IL-1, IL-6 y en menor grado de TNF. Tambin disminuyen la sntesis de prostaglandinas y

leucotrienos, y la actividad de la fosfolipasa A2, adems de inhibir la ciclooxigenasa de los macrfagos. Los corticoides tambin son inhibidores de distintas proteasas: colagenasa, elastasa y activador del plasmingeno y de la produccin de derivados del xido ntrico. Por otra parte, actan sobre las clulas endoteliales e inhiben la permeabilidad vascular inhibiendo la expresin de los genes MHC clase II y de las molculas de adhesin ELAM-1 e ICAM-1. En el hombre, slo los timocitos y los linfocitos T activados son susceptibles a la lisis por apoptosis. Los corticoides ms utilizados como inmunosupresores son la Prednisona y la Metilprednisolona. Los efectos secundarios son mltiples: sndrome Cushingoide, hipertensin arterial, osteoporosis, cataratas, diabetes, alteracin del crecimiento, acn, defectos de cicatrizacin, entre otros. Globulinas antitimocitos y Anticuerpos monoclonales Las globulinas antitimocitos o antilinfocitos se obtienen inmunizando conejos o caballos con estas clulas de origen humano y se utilizan, primordialmente, en la prevencin y tratamiento de los rechazos de trasplante. Tienen el severo riesgo de inducir una Enfermedad del suero, debido a la produccin de anticuerpos contra estos anticuerpos heterlogos (de otra especie), que se manifiesta clnicamente en 10 a 30% de los pacientes, alrededor del dcimo da de tratamiento, con la aparicin de fiebre, artritis, adenopatas dolorosas, y leucocitosis con trombopenia y cada del nivel plasmtico del frmaco administrado. Esta patologa implica la detencin de la terapia o el cambio por un anticuerpo de otro origen. Los anticuerpos monoclonales anti-CD3 u OKT3, tienen un poderoso efecto inmunosupresor. El sitio probable de accin de este frmaco es la interferencia con transduccin de seales que siguen al reconocimiento del receptor T (TCR) al antgeno presentado por clulas presentadoras de antgeno. Adems existira un efecto de lisis directa de los linfocitos T CD3 debido a que se produce una rpida cada de los recuentos linfocitarios. Se utiliza ampliamente en la prevencin y tratamiento del rechazo de alotrasplantes. Como estos frmacos son de origen murino, tienen el potencial de inducir anticuerpos humanos y desencadenar una Enfermedad del suero. La

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modificacin de este tipo de frmacos sustituyendo la regin Fc por la secuencia aminocida de IgG humana, puede colaborar en producir anticuerpos monoclonales menos sensibilizantes y con mejor cintica in vivo. 9.2. Impacto de la inmunodeficiencia asociada a inmunosupresores Los tratamientos inmunosupresores producen un dficit inmunitario que puede traducirse en patologas infecciosas o tumorales, por lo cual estas terapias deben ser cuidadosamente vigiladas del punto de vista clnico y de laboratorio. La inmunosupresin intensa acarrea el riesgo de infecciones oportunistas, particularmente por hongos, virus y protozoos, as como a la emergencia de tumores asociados a infecciones virales crnicas.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 32
INMUNIDAD FRENTE A BACTERIAS
Eva Burger, Edilia Andrews G. y Heriberto Fernndez J.

1. Introduccin 2. Inmunidad frente a bacterias extracelulares 2.1. Caractersticas generales de las bacterias extracelulares 2.2. Mecanismos de inmunidad natural 2.2.1. Mecanismos comunes a bacterias extra e intracelulares 2.2.2. Inmunidad natural a bacterias extracelulares 2.3. Inmunidad adquirida a bacterias extracelulares 2.3.1. Neutralizacin de toxinas o enzimas bacterianas por anticuerpos 2.3.2. Efectos directos del sistema del complemento 2.3.3. Efecto conjunto de anticuerpo, complemento y lisozima 2.3.4. Opsonizacin y facilitacin de la fagocitosis 3. Inmunidad frente a bacterias intracelulares 3.1. Caractersticas generales de las bacterias intracelulares 3.2. Inmunidad natural a bacterias intracelulares 3.2.1. Clulas NK

3.2.2. Leucocitos polimorfonucleares neutrfilos 3.3. Inmunidad adquirida a bacterias intracelulares 3.3.1. Macrfagos activados 3.3.2. Linfocitos T 3.3.3. Efecto conjunto de linfocitos T CD4+ y CD8+ 3.3.4. Linfocitos T 3.3.5. Citoquinas 3.3.6. Granulomas 4. Anlisis comparativo del desarrollo de inmunidad en infecciones por bacterias extracelulares e intracelulares. 5. Estrategias de intervencin inmune en relacin a bacterias intracelulares 5.1. Tipos de vacunas para bacterias intracelulares en uso 5.2. Desarrollo de nuevas vacunas 5.2.1. Identificacin de antgenos protectores 5.2.2. Cepas vaccinales atenuadas y recombinantes 5.2.3. Vacunas de subunidades y empleo de adyuvantes 5.2.4. Vacunas DNA

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RESUMEN En este captulo se presenta algunas caractersticas de las bacterias extracelulares e intracelulares, incluyendo principios de su patogenicidad y virulencia. Algunos aspectos de la inmunidad frente a bacterias son abordados separadamente, cuando los mecanismos inmunolgicos activos son diferentes en estos dos grupos de microorganismos. Se describen los componentes de la respuesta inmune innata o natural comunes a ambos grupos bacterianos, tales como la influencia de la especie, el papel de la piel, de la concentracin de hierro y de substancias inhibitorias no inmunolgicas como por ejemplo la lisozima. Se discute la participacin de las citoquinas inflamatorias en la inmunidad natural a bacterias extracelulares y de las clulas NK y de los leucocitos polimorfonucleares neutrfilos en la inmunidad natural a bacterias intracelulares. Consecuentemente, se analiza la participacin de la respuesta inmune adquirida en la proteccin contra infecciones bacterianas. Los mecanismos efectivos relevantes son el brazo humoral de la respuesta inmune en el caso de las bacterias extracelulares y el brazo celular de la respuesta inmune en el caso de las bacterias intracelulares. Tratndose de mecanismos completamente diferentes, stos fueron abordados separadamente. As, en el tpico inmunidad adquirida a bacterias extracelulares, se presenta la neutralizacin de toxinas o de enzimas bacterianas por anticuerpos, los efectos del sistema complemento, ya sean directos o en conjunto con anticuerpos y lisozima, adems de la opsonizacin y facilitacin de la fagocitosis por el fragmento Fc de IgG y/o el componente C3b del complemento. En lo tocante a inmunidad adquirida a bacterias intracelulares se analiza la participacin de varias poblaciones celulares, tales como macrfagos activados, linfocitos T, linfocitos T CD4+ y sus subpoblaciones, linfocitos T CD8+, linfocitos T, estudindose tambin la participacin de citoquinas y granulomas. Finalmente, se presentan estrategias de inmunointervencin en la prevencin de infecciones causadas por bacterias intracelulares, destacndose las vacunas ya en uso y las nuevas vacunas en desarrollo, comprendiendo la identificacin de antgenos protectores, cepas atenuadas y recombinantes, vacunas de subunidades y de DNA y el efecto de adyuvantes.

1. INTRODUCCIN En el contexto de un libro de Inmunologa, interesa estudiar los microorganismos de acuerdo con la respuesta inmune que inducen y no segn su clasificacin taxonmica. Considerando que entre la respuesta inmune frente a bacterias extracelulares e intracelulares existen diferencias fundamentales, en este captulo, su estudio ser presentando dividido bajo ese aspecto, con excepcin de aquellos mecanismos de inmunidad natural comunes a ambos tipos de bacterias.

2.

INMUNIDAD FRENTE A BACTERIAS EXTRACELULARES

2.1. Caractersticas generales de las bacterias extracelulares Las bacterias extracelulares son capaces de replicarse fuera de las clulas del hospedero, como por ejemplo en la circulacin, en el tejido conectivo y en espacios tisulares como las vas areas y el lumen intestinal. Entre las bacterias extracelulares se cuentan las cocceas Gram (+) piognicas (Staphylococcus, Streptococcus) y los bacilos, principalmente anaerobios (Clostridium). Dentro de las Gram (-) se encuentran cocos (Neissera meningitidis, N. gonorrhoeae y otras Neisseria) y

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una gran gama de bacilos, incluyendo los microorganismos entricos (Escherichia coli). Las bacterias extracelulares causan enfermedad por varios mecanismos: Produccin de exotoxinas. La patogenicidad bacteriana puede ser producida por la secrecin de protenas, las cuales son las toxinas ms potentes conocidas y que tienen varios efectos patolgicos. Estas toxinas pueden ser exotoxinas, activamente secretadas por las bacterias y tambin, endotoxinas, las que forman parte de la pared bacteriana. Las exotoxinas son citotxicas y tienen la capacidad de translocarse a clulas de mamferos. El mecanismo general por el cual ello ocurre es por la unin especfica de una porcin de la molcula a la superficie de la clula, mientras que otra parte de la molcula es el dominio txico. Estas dos porciones pueden ser producto de un gen nico o de dos genes. Los lugares blancos intracelulares son diferentes, as como tambin su modo de accin. Como ejemplos de exotoxinas se pueden citar las toxinas diftrica, colrica, tetnica y clostrdica. La respuesta inmune contra bacterias extracelulares tiende a destruir las bacterias y a neutralizar los efectos de sus toxinas. Induccin de la respuesta inflamatoria excesiva. Las bacterias piognicas inducen una respuesta inflamatoria muy acentuada la cual puede llevar a lesin tisular. Secrecin de superantgenos. Los Staphylococcus y los Streptococcus del grupo A producen toxinas que tienen la capacidad de activar un porcentaje muy alto de linfocitos T. Los sntomas clnicos varan pero en general incluyen choque sistmico. La respuesta inmune a estas substancias y a protenas relacionadas con ellas las torna nicas en trminos de efectos biolgicos y patolgicos. Los efectos patolgicos de las enterotoxinas estafiloccicas son mediadas por citoquinas, como el TNF-. Las enterotoxinas estafiloccicas son algunos de los mitgenos naturales ms potentes para linfocitos T, actuando en concentraciones de 10-9 M o menos, uno de cada cinco linfocitos T responde a ella. La respuesta a enterotoxinas estafiloccicas requiere de clulas presentadoras de antgeno expresando molculas del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) clase II. Estas enterotoxinas se unen directamente a la porcin constante de las molculas clase II (por fuera del sitio de unin para los antgenos) y no preci-

san ser procesadas. Este complejo es, entonces, reconocido por linfocitos T CD4+ expresando receptores de antgeno de cierto V. En resumen, estos superantgenos se ligan a molculas del MHC clase II y simultneamente al TCR de un alto porcentaje de los linfocitos T, independientemente del pptido que est siendo presentado. Las respuestas txicas se deben a la estimulacin de linfocitos T y a la consiguiente excesiva produccin de citoquinas. Secrecin de lipopolisacridos (LPS). El LPS es otra clase de molcula que acta indirectamente, causando autointoxicacin del hospedero. El LPS liberado por las bacterias se une con gran afinidad por la porcin altamente conservada en todas las enterobacterias (lpido A) a la protena de fase aguda LPS-ligante. El complejo se une a macrfagos, induciendo la formacin de TNF- e IL-1, las cuales desencadenan una cascada de citoquinas por parte de varias clulas del sistema inmune, desencadenando la sintomatologa caracterizada por leucocitosis, choque y coagulacin intravascular diseminada. Invasin bacteriana. Algunas bacterias secretan substancias nocivas como hialuronidasa (lisa el cido hialurnico del tejido conectivo y permite la diseminacin bacteriana), estreptoquinas (enzima fibrinoltica capaz de disolver cogulos), colagenasas y elastasas que destruyen la estructura del tejido conjuntivo. 2.2. Mecanismos de inmunidad natural 2.2.1. Mecanismos comunes a bacterias extra e intracelulares influencia de la especie. Existe la resistencia de determinadas especies a ciertas infecciones. La resistencia de las gallinas a Brucella abortus es un ejemplo de esta condicin, la cual es una manifestacin de factores genticos. Integridad de la piel. La piel ntegra sustenta una alta densidad de bacterias comensales y potencialmente patognicas pero, luego, por debajo de la superficie ella es estril. En la piel ntegra, es imposible la penetracin de bacterias o de otros microorganismos excepto la de cercarias de Schistosoma. Heridas pequeas permiten la entrada de staphylococcus y/o streptococcus mientras que heridas ms profundas y la destruccin

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de los tejidos generan un medio anaerobio y permiten el acceso de clostridium. Substancias inhibitorias no inmunolgicas. La relativa poca frecuencia de infecciones bacterianas debido a pequeas heridas, indica la capacidad de los tejidos animales para contener la invasin bacteriana. Parte de esta resistencia se debe a la presencia de potentes substancias con propiedades antibacterianas en los tejidos: Lisozima. La ms importante de estas substancias inhibitorias es la lisozima, encontrada en tejidos y en todos los fluidos corporales con excepcin del lquido cefalorraqudeo (LCR), sudor y orina. Se encuentra en altas concentraciones en las lgrimas y en la clara de huevo. Tiene la capacidad de lisar la capa de peptidoglicano de la pared y los acilaminopolisacridos de las cpsulas de algunas bacterias Gram (+), induciendo su muerte. En accin sinrgica con la lactoferrina, en condiciones de baja osmolaridad, mata varias bacterias Gram (-). Actuando conjuntamente con el complemento, lisa bacterias Gram (-). La lisozima es ms eficaz contra las bacterias Gram (+) porque en las Gram (-) la pared de peptidoglicano est protegida por la membrana externa. A pesar que las bacterias as lisadas no sean patognicas, esta ausencia de patogenicidad podra deberse, justamente, a su susceptibilidad a la accin de la lisozima. Esta enzima se encuentra en alta concentracin dentro de los leucocitos polimorfonucleares neutrfilos (PMN) y, por tanto, se acumula en los lugares donde existe inflamacin aguda, incluso sitios de invasin bacteriana. El pH ideal para ejercer su accin (pH 3-6) se alcanza en situaciones fisiolgicas, tanto en los lugares de invasin bacteriana como dentro de fagosomas. Otras substancias inhibitorias. Incluyen la espermina y la espermidina, que son tetraaminas presentes en rin, pncreas y prstata las que, en conjunto con una alfa-globulina srica, forman un complejo antibacteriano activo contra bacterias cido-alcohol resistentes y Bacillus anthracis. Otras substancias inhibitorias, son los pptidos y protenas bsicas beta-lisina y fagocitina, ricas en lisina y arginina, originadas de la digestin de protenas por enzimas proteolticas liberadas de PMN o de plaquetas y que presentan un potente efecto antibacteriano. Los cidos grasos libres inhiben el crecimiento bacteriano, mientras que los insaturados

son bactericidas para bacterias Gram (+). Contenido de hierro. Un factor determinante del xito o no de una invasin bacteriana es el contenido de hierro en los fluidos orgnicos. Muchas bacterias, como Staphylococcus aureus, pasteurella multocida, Mycobacterium tuberculosis y Escherichia coli necesitan de hierro para su crecimiento. En el cuerpo, sin embargo, el hierro en su mayor parte se encuentra secuestrado, asociado a protenas (transferrina, lactoferrina, haptoglobina y ferritina). Despus de una invasin bacteriana, cesa la absorcin intestinal de hierro. La IL-1 liberada de macrfagos causa un aumento en la produccin de transferrina y haptoglobina por los hepatocitos y aumento de incorporacin de hierro en el hgado. El resultado final es la falta de disponibilidad (escasez) de fierro para la bacteria invasora. De modo anlogo, la invasin bacteriana a la glndula mamaria determina la liberacin del contenido de lactoferrina de los PMN aumentando, as, el poder bactericida de la leche. Las bacterias han desarrollado mecanismos para la adquisicin de hierro para su sobrevivencia y su crecimiento. Las enterobacterias secretan quelantes de fierro denominados siderforos, los que compiten exitosamente por el hierro libre. Luego, por receptores proteicos especficos ubicados en la membrana, absorben el siderforo repleto de hierro y lo transportan a receptores de hierro intracelulares. En seguida, el complejo siderforo/hierro internalizado es clivado para originar hierro libre para la bacteria. Algunas bacterias, como Neisseria y Haemophilus influenzae no producen siderforos pero, adquieren el hierro directamente de la lactoferrina o de la transferrina. Otras bacterias, como Mycobacterium tuberculosis o Escherichia coli, producen compuestos con una poderosa capacidad quelante (micobactina y enteroquelina), que retiran el hierro de las protenas sricas, dejndolas disponibles para las bacterias, las que entonces podrn invadir el organismo. 2.2.2. Inmunidad natural a bacterias extracelulares Citoquinas inflamatorias. Debido al hecho de que las bacterias extracelulares son muertas eficientemente por los mecanismos microbicidas de los fagocitos, el principal mecanismo de inmu-

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nidad natural a estos microrganismos es la fagocitosis por PMN, monocitos y macrfagos tisulares. La resistencia de las bacterias a la fagocitosis y a la digestin intracelular es, por tanto, una importante determinante de su virulencia. Las endotoxinas, como el LPS estimulan la produccin de citoquinas por macrfagos y por otras clulas, como por ejemplo el endotelio vascular. Estas citoquinas incluyen TNF-, IL-1, IL-6 y quimioquinas (ver captulo 11). La funcin fisiolgica principal de las citoquinas derivadas de macrfagos es la de estimular la inflamacin. Estas citoquinas inducen la adherencia de neutrfilos y monocitos al endotelio vascular en los sitios de infeccin, fenmeno que es seguido por la migracin, acmulo en el lugar afectado y activacin de clulas inflamatorias. Las clulas inflamatorias tienen la funcin de eliminar las bacterias. 2.3. Inmunidad adquirida a bacterias extracelulares El principal mecanismo capaz de conferir inmunidad especfica contra bacterias extracelulares es la inmunidad humoral. Algunos de los componentes ms inmunognicos de paredes y cpsulas bacterianas son polisacardicos y constituyen ejemplos tpicos de antgenos timo independientes, estimulando directamente linfocitos B y originando fuertes respuestas especficas de anticuerpos IgM. Otros isotipos pueden ser originados debido a la produccin de citoquinas que inducen cambio de clase (switch isotpico), como por ejemplo la produccin de IgG2 en humanos en respuesta a la cpsula polisacrida de Streptococcus pneumoniae, antgeno tpicamente T-independente. 2.3.1. Neutralizacin de toxinas o enzimas bacterianas por anticuerpos Muchos productos agresivos necesitan ligarse a receptores celulares. Esto es evitado por la molcula de anticuerpo que se liga a eptopes importantes de la toxina, causando impedimento espacial. Este fenmeno puede ser a travs de la molcula completa o solamente por la regin Fab o F(ab)2. Tanto anticuerpos IgG como IgM neutralizan toxinas bacterianas y evitan su unin a las clulas blanco. La neutralizacin involucra la competencia entre el anticuerpo y el receptor en la clula blanco por la molcula de toxina. La IgA presente en las secreciones neutraliza las toxinas

bacterianas en los tractos respiratorio y gastrointestinal y evita la colonizacin de los tejidos extraluminales. 2.3.2. Efectos directos del sistema del complemento Varios componentes del sistema del complemento pueden atacar directamente y destruir bacterias. Como los productos intermediarios resultantes de la activacin del sistema tienen accin quimiotctica, pueden reclutar fagocitos hacia el sitio de la infeccin. 2.3.3. Efecto conjunto de anticuerpo, complemento y lisozima Tanto la IgM como la IgG activan el sistema del complemento, llevando a la produccin del complejo de ataque a membranas bacterianas de efecto microbicida y a la liberacin de mediadores de la inflamacin aguda. La funcin del complejo de ataque a membranas bacterianas es ejercida slo en algunas infecciones, pues la deficiencia en los componentes tardos C5 a C8 est asociada al aumento de la susceptibilidad a la infeccin por Neisseria, pero no a la de otras bacterias. El complejo de ataque a membranas no consigue lisar bacterias Gram (-) pero, al insertarse a la pared bacteriana, provee un substrato a la lisozima, la cual, actuando en secuencia al complemento, produce la lisis de la bacteria. Individuos no inmunes pueden lisar bacterias a travs de la activacin de la va alterna del complemento, pues las clulas bacterianas permiten la produccin de la convertasa de C3 de la va alterna (C3bBbP) (ver captulo 18). 2.3.4. Opsonizacin y facilitacin de la fagocitosis Opsonizacin por Fc de IgG. La eficiencia de la fagocitosis aumenta cuando la membrana del fagocito se liga al objeto a ser fagocitado. Los anticuerpos IgG opsonizan las bacterias y favorecen la unin de macrfagos, monocitos y neutrfilos a travs de sus receptores para Fc gamma (FcR). Opsonizacin por C3b. Los fagocitos tambin tienen receptores para C3b. Las personas deficientes en C3 son muy susceptibles a infecciones bacterianas piognicas.

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Opsonizacin por Fc de IgG y por C3b. Las consecuencias de la opsonizacin con C3b o Fc de IgG y ms an, su efecto conjunto, son el aumento de la unin de la partcula a ser fagocitada y la activacin metablica de los fagocitos. Los anticuerpos IgG e IgM activan el sistema del complemento, generan C3b e iC3b que se ligan a los receptores CR1 y CR3, respectivamente, y promueven la fagocitosis.

hasta la forma lepromatosa con inmunidad celular deficiente y muchos bacilos. Parasita una gran variedad de clulas. Listeria monocytogenes y listeriosis: Es una enfermedad de ovinos y bovinos pero puede afectar al hombre. La enfermedad experimental en ratones es aguda. Parasita preferentemente clulas presentadoras no profesionales (endoteliales, hepatocitos), adems de macrfagos. Brucella abortus. Cuando penetra al organismo, es captada y transportada por clulas fagocticas hacia los rganos del sistema fagoctico mononuclear estableciendo una infeccin crnica. En bovinos se ubica en rganos del aparato gnitourinario, posiblemente debido a la presencia de eritritol en la superficie de las clulas epiteliales. Respecto a la patogenicidad y virulencia de bacterias intracelulares, stas entran al hospedero a travs de las mucosas, principalmente por el intestino o por el pulmn. Luego, atraviesan las capas epiteliales. Enseguida, sufren los efectos de los mecanismos inespecficos de defensa, desde los fsicos y fsicoqumicos hasta aquellos que involucran la inmunidad natural. Si son capaces de sobrevivir, colonizarn los tejidos situados ms profundamente y van a provocar el establecimiento de una respuesta inmune especfica. En situaciones ideales, se consigue la erradicacin de las bacterias, o si no, ellas permanecen en nichos poco accesibles al sistema inmune. 3.2. Inmunidad natural intracelulares a bacterias

3.

INTRODUCCIN A BACTERIAS INTRACELULARES

3.1. Caractersticas generales de las bacterias intracelulares Las bacterias intracelulares causan enfermedades conocidas desde antiguo (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Salmonella typhi) que afectan a ms de medio billn de personas, y otras enfermedades, conocidas como emergentes, que afectan a pacientes con SIDA (Mycobacterium intracellulare). Estas bacterias viven dentro de las clulas del hospedero vertebrado durante gran parte de su vida y deben, por tanto, tener baja toxicidad, lo que tiene consecuencias sobre la respuesta inmune que ellas desencadenan. En relacin a su hbitat, las bacterias intracelulares pueden ser: (a) intracelulares facultativas, que prefieren fagocitos mononucleares, (Mycobacterias, Salmonella, Brucella, Legionella y Listeria) pero pueden infectar otras clulas, y (b) intracelulares estrictas, que no sobreviven fuera de las clulas y que prefieren clulas presentadoras no profesionales (endoteliales y epiteliales), a pesar de poder infectar monocitos mononucleares (Rickettsia y Chlamydia). Algunos ejemplos de bacterias intracelulares son los siguientes: Mycobacterium tuberculosis y tuberculosis: M. tuberculosis es una bacteria aerobia estricta. Por tener muchos lpidos, glicolpidos y elementos grasos, es hidrofbico y resistente a la lisis por complemento, a cidos y lcalis. Es el patgeno responsable del mayor nmero de muertes e infecta entre 1/3 y 1/2 de la humanidad. Parasita prcticamente slo a macrfagos. Mycobacterium leprae y lepra: Es una enfermedad muy crnica, espectral, yendo desde la forma tuberculoide, con fuertes reacciones inmunes celulares y lesiones con pocos microorganismos,

El principal mecanismo de inmunidad natural contra microorganismos intracelulares es la fagocitosis, aunque las bacterias intracelulares patognicas son relativamente resistentes a la lisis dentro de los fagocitos mononucleares. Por tanto, no es sorprendente que la inmunidad natural sea, generalmente, bastante ineficiente en controlar la colonizacin por estos microorganismos y su consecuente diseminacin. La resistencia a la fagocitosis es tambin una razn por la cual estas bacterias tienden a causar infecciones crnicas que pueden durar aos, frecuentemente de difcil erradicacin y recrudeciendo despus de curas aparentes. 3.2.1. Clulas NK Las bacterias intracelulares activan clulas

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NK, ya sea directamente o estimulando la produccin de IL-12 por los macrfagos y PMN. Las clulas NK producen IFN- que, a su vez, activa macrfagos y promueve la lisis de las bacterias fagocitadas. As, las clulas NK constituyen una lnea de defensa en una fase inicial de la infeccin por este tipo de bacterias, antes del desenvolvimiento de la respuesta inmune especfica. De hecho, ratones con SCID (Inmunodeficiencia combinada severa) que son, deficientes en linfocitos T y B son capaces de controlar, por lo menos temporalmente, infecciones producidas por Listeria monocytogenes a travs de la produccin de IFN por clulas NK. 3.2.2. Leucocitos polimorfonucleares neutrfilos Como estas clulas tienen alto potencial bactericida, pueden matar muchas bacterias intracelulares. Sin embargo, son de corta vida y las bacterias intracelulares estn secuestradas en nichos. En la fase inicial de la infeccin disminuyen la carga infectante como por ejemplo en la listeriosis, en la que se observa una gran afluencia de PMN. La muerte de bacterias intracelulares por macrfagos o por PMN es realizada por molculas txicas, particularmente metabolitos reactivos del oxgeno e intermediarios reactivos del nitrgeno (ver captulo 3). Alguna deficiencia en el anin superxido favorece la susceptibilidad a muchas infecciones bacterianas (enfermedad granulomatosa crnica). 3.3. Inmunidad adquirida a bacterias intracelulares La inmunidad mediada por clulas es la principal respuesta inmune protectora a infecciones por bacterias intracelulares. Individuos que presentan deficiencias en la inmunidad celular son extremadamente susceptibles a estas infecciones, como lo son, por ejemplo, los pacientes con SIDA. Las principales respuestas inmunes protectoras son de dos tipos. Uno es la lisis de las bacterias intracelulares fagocitadas como resultado de la activacin de macrfagos por citoquinas derivadas de linfocitos T, principalmente IFN- y, el otro, es la lisis de las clulas infectadas, por linfocitos T CD8+ citolticos. 3.3.1. Macrfagos activados La activacin de las funciones antibacterianas

de los macrfagos constituye uno de los pasos fundamentales en la resistencia a bacterias intracelulares. Muchas de las actividades descritas para estas clulas no son expresadas constitutivamente en ellas. La expresin plena de las actividades antibacterianas de estas clulas depende del estmulo adecuado por citoquinas, de las cuales la ms importante es el IFN-. Su efecto transforma los macrfagos de clulas que permiten la replicacin microbiana en clulas efectoras que restringen o eliminan su capacidad de sobrevivencia. En macrfagos murinos, el IFN es el principal activador de macrfagos, los que se tornan capaces de lisar L. monocytogenes o Brucella y de inhibir el crecimiento de M. tuberculosis y de M. bovis. Los principales efectores de la actividad antibacteriana de los macrfagos son los intermediarios del metabolismo del nitrgeno. Estos mecanismos aun no estn bien entendidos en los seres humanos, pues todava no ha sido demostrada la produccin de reactivos del nitrgeno en macrfagos humanos y el IFN- casi no induce inhibicin del crecimiento de M. tuberculosis. Sin embargo, TNF- causa inhibicin del crecimiento de M. intracellulare e IFN-, en conjunto con TNF-, producen inhibicin del crecimiento de M. tuberculosis. 3.3.2. Linfocitos T La resistencia adquirida a infecciones por bacterias intracelulares depende crucialmente de linfocitos T, que promueven la erradicacin estril de las bacterias susceptibles (L. monocytogenes) y clearence parcial y contencin, a travs de lesiones granulomatosas de las bacterias resistentes (M. tuberculosis). La formacin y la mantencin de los granulomas es gobernada por los linfocitos T y la coordinacin entre linfocitos T, macrfagos y otras clulas es promovida por las citoquinas. La necesidad de linfocitos T se ilustra y queda en evidencia en pacientes deficientes en linfocitos T (enfermos de SIDA) y en animales atmicos. a) Linfocitos T CD4+. Las bacterias intracelulares residen dentro de endosomas de macrfagos, pudiendo ser procesada como antgeno endgeno y ser presentada en el contexto de molculas clase II. Los linfocitos CD4+ pueden responder tambin a antgenos de las bacterias, los que son internalizados y presentados en molculas clase II, como por ejemplo el ppd de M. tuberculosis.

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Las infecciones por bacterias intracelulares, incluyendo la tuberculosis, la listeriosis y la brucelosis experimentales, se caracterizan por una preponderancia de efectos de linfocitos Th1. Aparentemente las bacterias intracelulares estimulan la produccin de IL-12 y de IFN- por clulas de la respuesta inmune natural. Solamente en la fase lepromatosa de la lepra ocurren fenmenos Th2, los que parecen contribuir a la inmunosupresin. b) Linfocitos T CD8+. Adems de linfocitos T CD4+ restringidos por MHC clase II, tambin los linfocitos T CD8+ restringidos por MHC clase I participan en la resistencia adquirida a infecciones por bacterias intracelulares. Listeria, al ser capaz de dejar el endosoma y entrar al citoplasma puede ser procesada a travs de la va de presentacin de antgeno endgeno, interactuar con MHC clase I y promover la activacin de linfocitos T CD8+. Deben existir otros mecanismos de presentacin en el contexto de clase I, ya que otras bacterias, que no van al citoplasma (M. bovis, S. typhimurium) tambin producen respuesta de linfocitos T CD8+, tal vez por translocacin al citoplasma de algunos pptidos bacterianos durante la replicacin bacteriana. La importancia de la poblacin de linfocitos T CD8 + en el control de la brucelosis se ha demostrado en experimentos realizados con ratones "knock out" en molculas clase I, en los que observ una aumentada susceptibilidad a la brucelosis. Estas clulas tienen potencialmente dos funciones: pueden lisar clulas infectadas y pueden tambin producir INF-. 3.3.3. Efecto conjunto de linfocitos T CD4+ y CD8+ Estas dos poblaciones de clulas efectoras actan complementariamente. En la listeriosis, los linfocitos T CD4+ producen IFN- que activa los macrfagos para destruir las bacterias fagocitadas. Sin embargo, L. monocytogenes escapa al citoplasma, protegindose de los productos del metabolismo del oxgeno que actan en los fagolisosomas. Los linfocitos CD8+, entonces, lisarn esta clula que contiene bacterias en su citoplasma. En la tuberculosis existe consenso que los linfocitos T CD8+ son cruciales para la proteccin, ya que animales carentes de beta-2 microglobina o de T CD8+ mueren de tuberculosis experimental. Este importante papel protector est en aparente conflicto con el hbitat

intrafagosomal de M. tuberculosis, lo que resultara en la presentacin del antgeno restringida por molculas MHC clase II. La explicacin para la presentacin en el contexto de molculas MHC clase I sera por drenaje de protenas secretadas por las bacterias viables al citoplasma a partir del fagosoma, o por la presencia de M. tuberculosis libre en el citoplasma, de acuerdo a lo establecido en recientes estudios realizados con microscopa electrnica. En la tuberculosis, la enfermedad se exacerba en ratones depletados de una de las dos poblaciones de linfocitos T y la enfermedad se torna fatal (M. tuberculosis) o ms grave (M. bovis) en animales que no expresan molculas clase I. En la lepra y la tuberculosis, los granulomas estn constituidos por linfocitos T CD4+ rodeados por linfocitos T CD8+. 3.3.4. Linfocitos T- Existen evidencias circunstanciales del papel de la LT en la inmunidad a bacterias intracelulares. Este tipo de linfocitos de individuos sanos o inmunes son muy estimulados por los componentes de las mycobacterias. Han sido identificados muchos linfocitos T en los sitios donde existen lesiones en las cuales ocurre una rpida replicacin de L. monocytogenes y M. bovis, en estadios reactivos de lepra y en lugares de hipersensibilidad de tipo tarda (HTT) contra lepromina y en los centros necrticos de las lesiones de la tuberculosis y muy pocos en lesiones crnicas de la tuberculosis o de lepra tuberculoide. 3.3.5. Citoquinas El estudio del papel de varias citoquinas en la inmunidad a bacterias intracelulares experiment un enorme impulso con el uso de citoquinas recombinantes, de anticuerpos monoclonales para su neutralizacin y de ratones knock-out para establecer su expresin gnica. Por ejemplo, el tratamiento con anticuerpos anti-IFN- o anti-TNF- produce un agravamiento en la listeriosis hacindola fatal as como tambin con anti-receptor de IL-1. Por otro lado, la administracin de IFN-, TNF-, IL-1 o IL-6 recombinantes, aumenta la resistencia a la listeriosis. El tratamiento con anti-IFN- o anti-TNF- empeora un poco la tuberculosis y, en cambio, el tratamiento con anti-IL-4 tiende a mejorarla. Ratones sin receptores para IFN- son mucho ms suscepti-

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bles a la infeccin por Listeria que sus controles. En infecciones experimentales por B. abortus se ha observado que IL-12 se produce in vivo slo durante la infeccin con bacterias vivas, tambin se ha observado que ratones "knock-out" en receptor para TNF son severamente deficientes en la produccin de IL-12, la cual regula positivamente la produccin de INF- de linfocitos T. La cantidad de informacin acumulada en los ltimos aos hace imposible enumerar, en este captulo, los efectos producidos por la gran cantidad de citoquinas existentes (ver captulo 11). Sin embargo, es indiscutible el importante papel del IFN- en la defensa contra infecciones causadas por bacterias intracelulares, as como el de otras citoquinas que favorecen la respuesta Th1. En general, el papel de las citoquinas Th2 es actuar ante el agravamiento de la enfermedad. Sin embargo, en algunas situaciones, es necesaria la presencia de IL-10 para controlar una respuesta inmune excesiva. 3.3.6. Granulomas El encuentro entre las bacterias intracelulares y los mecanismos de defensa del hospedero es un evento local, que se verifica en la lesin granulomatosa, la cual constituye el ncleo de la proteccin antibacteriana. La ausencia de desarrollo de un granuloma o la destruccin de un granuloma organizado, lleva a la exacerbacin de la enfermedad, pudiendo ser, entonces, fatal. Por otro lado, los granulomas expansivos impiden las funciones fisiolgicas de los tejidos, lo que es crucial para la patognesis. De hecho, los granulomas tienen efecto protector contra M. tuberculosis y M. bovis pero no contra L. monocytogenes, donde las lesiones excesivas son perjudiciales. Los mecanismos por los cuales los granulomas restringen el crecimiento bacteriano y confinan la infeccin, confiriendo proteccin, se deben a diversos factores como macrfagos activados que inhiben el crecimiento bacteriano, la encapsulacin promovida por la fibrosis asla las bacterias y la necrosis reduce la oferta de nutrientes y de oxgeno. Existen varias citoquinas involucradas en la formacin y/o mantencin de los granulomas, entre ellas, TNF-, IFN- e IL-4.

4. ANLISIS COMPARATIVO DEL DESARROLLO DE INMUNIDAD EN INFECCIONES POR BACTERIAS EXTRACELULARES E INTRACELULARES Tanto las bacterias extracelulares como las intracelulares infectan, transitoriamente, las clulas epiteliales como parte de sus mecanismos invasivos. Los mediadores de la respuesta inmune a bacterias intracelulares son los linfocitos T que no interactan directamente con ellas pero s con la clula infectada del hospedero. Los principales mediadores de la respuesta inmune contra las bacterias extracelulares son los anticuerpos. Las bacterias intracelulares son de baja o de ninguna toxicidad, siendo la patologa la resultante de las reacciones inmunes. Las bacterias extracelulares producen varias toxinas responsables directamente de la lesin tisular. Las bacterias intracelulares coexisten con su hbitat intracelular por mucho tiempo, dando como resultado perodos de incubacin prolongados y enfermedad crnica. Las bacterias extracelulares causan enfermedad aguda que desaparece cuando se establece la respuesta inmune. Las reacciones tisulares contra bacterias intracelulares son granulomatosas y tanto la respuesta inmune protectora como la patologa se centran en esta caracterstica. La ruptura del granuloma promueve la diseminacin bacteriana y nuevas lesiones en otras zonas. Las reacciones tisulares contra las bacterias extracelulares son purulentas y llevan a la formacin de abscesos o reacciones sistmicas. Las infecciones por bacterias intracelulares se acompaan de reacciones de hipersensibilidad de tipo tardo que pueden expresarse despus de la administracin local de antgeno soluble como una reaccin tisular tarda mediada por linfocitos T y llevada a cabo por macrfagos.

5. ESTRATEGIAS DE INTERVENCIN INMUNE EN RELACIN A BACTERIAS INTRACELULARES Un conocimiento detallado acerca de la biologa de las infecciones por bacterias intracelulares y de la respuesta inmune inducida por ellas, nos permite entender no slo la compleja relacin entre patgeno y el husped, sino que tambin desarrollar medidas preventivas y estrategias de intervencin teraputicas.

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Aunque en general, la vacunacin es la medida profilctica ms exitosa contra las enfermedades infecciosas, la mayora de las vacunas (ver captulo 36) en uso estn dirigidas contra microorganismos extracelulares. El xito de estas vacunas est basado principalmente en la formacin de anticuerpos que actan impidiendo la invasin del patgeno o neutralizando toxinas o factores de virulencia. 5.1. Tipos de vacunas para bacterias intracelulares en uso Actualmente existen slo dos vacunas contra bacterias intracelulares y en ambos casos con limitado xito. El BCG, es una cepa atenuada derivada de la cepa virulenta M. bovis. Desde su primer uso en 1921, ha sido administrado con pocos efectos colaterales pero, su eficacia protectora contra la tuberculosis pulmonar es muy variable (0 a 80%). La otra vacuna contra bacterias intracelulares corresponde a la cepa atenuada de Salmonella typhi Ty21. Por su baja proteccin y poca duracin, se administra slo a viajeros que visitan reas donde existe alto riesgo de contraer fiebre tifoidea. 5.2. Desarrollo de nuevas vacunas Existe la necesidad de disponer de formas de vacunas ms efectivas, baratas y fciles de aplicar, no slo contra TBC y fiebre tifoidea, sino que tambin contra otras bacterias intracelulares de importancia en salud pblica. El desarrollo racional de una nueva generacin de vacunas debe considerar el carcter particular que tiene la respuesta inmune efectiva contra el respectivo patgeno. Los requerimientos para tal vacuna incluyen: Induccin de la poblacin de clulas T adecuada y secrecin rpida de las citoquinas apropiadas que medien inmunidad protectora y al mismo tiempo dejen memoria inmunolgica. Activacin de los mecanismos efectores ms apropiados que impidan que la infeccin se establezca o permitan eliminar el agente infeccioso. Especificidad frente al patgeno responsable para evitar el riesgo de una enfermedad autoimune a travs de antgenos de reaccin cruzada.

Que incluya antgenos expresados por la bacteria en el husped y por varias otras cepas similares prevalentes. Inmunogenicidad para todos los haplotipos del Complejo Principal de Histocompatibilidad (HLA en humanos) dentro de la poblacin.

5.2.1. Identificacin de antgenos protectores Es importante primero definir los antgenos que son protectores. Una vacuna contra una bacteria intracelular debera contener aquellos antgenos capaces de inducir la combinacin apropiada de clulas T CD4+ y CD8+ que produzcan IFN- para, subsecuentemente, activar macrfagos para eliminar la bacteria. 5.2.2. Cepas vaccinales atenuadas y recombinantes El uso de bacterias vivas atenuadas como vacunas tiene la ventaja de que los microorganismos se replican en el husped, al menos por un tiempo, con lo cual generalmente inducen inmunidad especfica duradera. Adems, por su gran homologa con el patgeno virulento pueden inducir una respuesta inmune similar. Tal es el caso para las vacunas en humanos contra la tuberculosis (M. bovis BCG) y fiebre tifodea (S. typhi Ty21) y para las vacunas utilizadas en el ganado (B. abortus RB51 B. melitensis Rev-1). La identificacin de factores de virulencia ha permitido la generacin de cepas mutantes por delecin gentica creando cepas atenuadas que no producen dao en el hospedero y retienen su potencial inmunognico. La cepa de S. typhimurium Aro A- fue creada por mutagnesis, es una mutante auxotrfica que tiene un defecto en la biosntesis aromtica. Puede conferir proteccin en ratones. Otra aproximacin, es el uso de bacterias vivas atenuadas como transportadoras de antgenos recombinantes, los cuales pueden ser expresados solos o junto con las citoquinas que son importantes en el control de los microorganismos intracelulares (IL-12, GM-CSF e IFN-). 5.2.3. Vacunas de subunidades y empleo de adyuvantes El uso de protenas nativas o recombinantes como antgenos vacunales tiene ventajas y des-

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ventajas: Son vacunas altamente especficas y tienen bajo riesgo de efectos colaterales. Sin embargo, cuando se administran solas, su eficacia inmunoestimulatoria y protectora es generalmente dbil y de corta vida. La administracin de subunidades bacterianas como vacunas depende, fuertemente, de adyuvantes inmunoestimulatorios que simultneamente generen el medio requerido para la estimulacin de clulas T protectoras y adems un reservorio para la liberacin lenta de antgeno en el lugar de la administracin para facilitar proteccin duradera. El nico adyuvante aprobado para uso en humanos es el aluminio, que favorece respuestas de tipo Th2. El uso de adyuvantes capaces de estimular una respuesta Th1, que es lo que se requiere para vacunar contra bacterias intracelulares, presenta dificultades por la severa inflamacin que acompaa su administracin. Algunos glicolpidos y oligonucletidos, por sus propiedades proinflamatorias, pueden ser considerados adyuvantes naturales para microorganismos intracelulares Las vacunas basadas en pptidos, escogidos entre eptopes protectores pueden disminuir el riesgo de reactividad cruzada por su especificidad nica pero, tienen la desventaja de ser menos inmunognicos. Debido a la existencia de distintos haplotipos de HLA, una vacuna basada en pptidos antignicos tendra que cubrir la mayora de las posibilidades del repertorio de eptopes de clulas T presentes en una poblacin susceptible. 5.2.4. Vacunas DNA En los ltimos aos, han aparecido mtodos de vacunacin con cidos nucleicos (ver captulo 36), los cuales constituyen un nuevo medio de expresin in situ de un antgeno seleccionado para la generacin de una respuesta inmune humoral y celular que, eventualmente, puede inducir una respuesta inmune protectora. La inmunizacin con DNA ha sido usada para virus, bacterias y parsitos. La vacunacin con un plsmido bacteriano que tiene un gen que codifica para un antgeno seleccionado, se basa en la expresin del gen bajo control de un promotor viral fuerte como por ejemplo, el promotor de citomegalovirus (CMV), lo cual permite la expresin de genes codificados por las clulas eucariontes transfectadas. El plsmido se replica en una bacteria (E. coli), se purifica y luego se inyecta va intramuscular en el husped. Las clulas del husped son capaces de sintetizar, procesar y presentar el antgeno a los linfocitos.

El plsmido es fabricado sin su origen de replicacin funcional en clulas eucariontes, por lo tanto no se replica ni se integra al DNA cromosomal de la clula husped transfectada. La integracin de una secuencia lder en el plsmido permite la exportacin del antgeno por la clula. El gen codificado por el plsmido se expresa hasta que ste es expulsado a travs de la divisin celular. El plsmido puede ser administrado en la piel dentro de partculas, o a travs de transportadores bacterianos. Posteriormente el antgeno puede ser fagocitado por monocitos y clulas dendrticas las cuales estimularn clulas T "helper". La vacunacin por cidos nucleicos induce tanto la inmunidad humoral como la inmunidad mediada por clulas. Se observa una reaccin inflamatoria inducida por secuencias DNA bacteriano tales como los motivos CpG, que promueve la infiltracin de monocitos, estimulacin de clulas B para producir anticuerpos especficos contra el antgeno soluble, estimulacin de clulas T CD8+ para diferenciarse a linfocitos T citotxicos y tambin de clulas T CD4+ para diferenciarse a clulas Th1 y secretar citoquinas como IL-2 e INF-. En distinta medida todas estas vas de activacin son importantes en la proteccin contra microorganismos de vida intracelular, adems la inclusin de genes codificando citoquinas y molculas coestimulatorias en el mismo plsmido puede promover una respuesta inmune ms apropiada. Este tipo de vacuna es seguro y fcil de producir, mantener y administrar. La facilidad de construir y manipular los insertos de los genes, el bajo costo, la estabilidad del DNA, representan caractersticas deseables para una vacuna. Adems la inmunizacin con cidos nucleicos presenta como ventaja la capacidad de inducir mayores respuestas inmunolgicas celulares que las vacunas de cepas vivas atenuadas, asociado a inmunidad a largo plazo. La inmunizacin con inyeccin directa de plasmidios DNA codificando genes para antgenos proteicos especficos, se ha evaluado experimentalmente en varios modelos de infeccin, tales como virus de influenza, virus de la inmunodeficiecia adquirida (HIV), Mycoplasma pulmoniae, L. mayor, B. burgdorferi, as como con varios antgenos de M. tuberculosis. La vacunacin con DNA representa un avance promisorio e importante en el control de las infecciones por bacterias intracelulares.

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LECTURAS SUGERIDAS Schaible, E., Collins, H. y Kaufmann, S., Confrontation between Intracellular Bacteria and the Immune System, Adv. Immunol. 71:267-377, 1999. Splitter, G.; Oliveira, S.; Carey, M.; Miller, C.; Ko, J. and Covert, J., T lymphocyte mediated protection against facultative intracellular bacteria, Vet. Immun. Immunopath. 54:309-319, 1996. Ulmer, J., Donnelly, J.; Parker, S.; Rhodes, G.; Felgner, P.; Dwarki, V.; Gromkowski, S.; Deck, R.; Dewitt, C.; Fridman, A. y cols, Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein, Science, 259: 17451749, 1993. Young, E.J., An Overview of Human Brucellosis, Clin. Infect. Dis. 21:283-290, 1995. Zhan, Y.F. y Cheers, C., Endogenous interferong mediates the resistance to Brucella abortus infection, Infect. Immun. 61:4899-4901, 1993. Zhan, Y.F. y Cheers, C., Endogenous interleukin12 is involved in resistance to Brucella abortus infection. Infect. Immun. 63:1387-1390, 1995.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 33
INMUNIDAD FRENTE A HONGOS
Eva Burger, Luiz Zaror C., y Heriberto Fernndez J.

1. Introduccin 1.1. Consideraciones histricas 1.2. Caractersticas generales de algunos hongos oportunistas 1.3. Caractersticas generales de algunos hongos patognicos 1.4. Caractersticas generales de los dermatofitos 1.5. Conceptos sobre inmunidad a hongos patognicos 2. Inmunidad natural 2.1. Factores hormonales 2.2. Concentracin de hierro 2.3. Sistema del complemento 2.4. Clulas natural killer (NK) 2.5. Leucocitos polimorfonucleares neutrfilos (PMN)

2.6. Macrfagos 3. Inmunidad humoral a hongos 3.1. Papel de la inmunidad humoral 3.2. Mecanismos protectores de la inmunidad humoral 4. Inmunidad celular a hongos 4.1. Macrfagos 4.2. Linfocitos T 4.3. Citoquinas 4.4. Granulomas 5. Mecanismos de inmunidad protectora 5.1. Mecanismo principal 5.2. Otros mecanismos

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RESUMEN En este captulo se presentan algunas caractersticas de los hongos oportunistas, de los hongos patgenos primarios agentes de micosis sistmicas y de los dermatofitos. Se introduce y analiza el concepto de que no existe un mecanismo protector especfico capaz de conferir inmunidad protectora contra las micosis, haciendo nfasis en la participacin y accin conjunta de varios mecanismos inmunolgicos, los que tambin son efectivos en diferentes infecciones determinadas por otros agentes infecciosos. Tambin se describen los diferentes componentes de la respuesta inmune innata o natural, tales como factores inespecficos (hormonios, concentracin de hierro), factores solubles (componentes del sistema del complemento) y clulas efectoras (clulas killer (NK), leucocitos polimorfonucleares neutrfilos (PMN) y macrfagos alveolares y residentes). Igualmente, se discute la participacin de la respuesta inmune adquirida. Se analiza el papel protector o no protector de la inmunidad humoral como tambin los mecanismos efectores activos, tales como la opsonizacin de hongos por anticuerpos, citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC) y la opsonizacin y/o lisis de hongos por complemento. Se estudia la participacin preponderante de la inmunidad celular en la proteccin a infecciones fngicas y el rol de las poblaciones celulares responsables de ella, como los macrfagos y sus productos antifngicos, los linfocitos T CD4+ y T CD8+ y las subpoblaciones de linfocitos T CD4+ y sus productos de secrecin (citoquinas). Finalmente, se discute tambin el papel de los granulomas en la infeccin por hongos.

1. INTRODUCCIN 1.1. Consideraciones histricas En la mayora de los textos de Inmunologa, cuando se trata el tema Inmunidad a Infecciones, el asunto Inmunidad frente a Hongos o est ausente o es de escasa extensin. Esto se debe a que, hasta hace poco, exista considerablemente menos informacin sobre la respuesta inmune frente a hongos que frente a las bacterias, virus e, incluso, protozoos y helmintos. Esto se deba a que las infecciones por hongos representaban un flagelo de mucho menor importancia para la humanidad que las infecciones de origen bacteriano. Actualmente, con el infortunado advenimiento del Sndrome de la Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), este cuadro ha sido completamente modificado. Con la introduccin de tratamientos inmunosupresivos en oncologa y en trasplantes, el perfil inmunolgico de la humanidad viene siendo drsticamente alterado, propiciando la aparicin de un contingente cada vez mayor de pacien-

tes con deficiencias en la respuesta inmune y con tiempos de sobrevida ms prolongados. Estos individuos constituyen una poblacin extremadamente susceptible a las infecciones fngicas. En la historia natural de los hongos y en su relacin con el hombre y los animales, su estado de parasitismo es un accidente o una necesidad poco apremiante y, por este motivo, hasta hace poco tiempo, eran considerados por muchos investigadores como organismos con poca capacidad invasiva y poca adaptacin para el parasitismo. A la luz de lo expuesto precedentemente, estos conceptos deben ser necesariamente revisados. 1.2. Caractersticas generales de algunos hongos oportunistas Los hongos oportunistas expresan capacidades patognicas slo en hospederos inmunocomprometidos. Algunos ejemplos de estos hongos se muestra en la tabla 33-1.

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Tabla 33-1. Hongos oportunistas Hongo Candida albicans Caractersticas Forma parte de la flora normal (organismo endgeno). Infeccin mucocutnea por prdida de la resistencia; en los tejidos infectados aparece formando pseudohifas. Hongo capsulado, el tamao de la cpsula vara de acuerdo con la virulencia de cada cepa. Diseminacin hematgena al cerebro y a las meninges; en casos graves compromete el sistema nervioso central. Grupo de riesgo: portadores de neoplasias malignas, pacientes con SIDA y trasplantados renales.

Cryptococcus neoformans

1.3. Caractersticas generales de algunos hongos patognicos Los hongos patognicos, hongos considerados patgenos primarios, o sea, capaces de inducir infeccin y enfermedad en hospederos inmunocompetentes. Son todos hongos dimrficos, lo que ha inducido a algunos autores a considerar esta caracterstica como una adaptacin al

parasitismo. En la tabla 33-2, se muestra algunos ejemplos. 1.4. Caractersticas generales de los dermatofitos En la tabla 33-3 se muestra algunos ejemplos de dermatofitos

Tabla 33-2. Hongos patognicos Hongo Coccidioides immitis Caractersticas Presente en suelo de regiones ridas. La infeccin se produce por inhalacin de esporas (artroconidias). En los tejidos ocurre crecimiento (esfrulas) y fragmentacin (endosporo). La enfermedad vara desde asintomtica a diseminada (articulaciones, huesos, meninges y tracto gnitourinario). Infeccin por inhalacin de conidias. Infeccin subclnica o leve; a veces produce epidemias. Enfermedad pulmonar progresiva; diseminacin hematgena fatal en individuos inmunosuprimidos. Parsito intracelular facultativo de macrfagos. La infeccin se inicia en los pulmones. Forma progresiva: diseminacin hematgena hacia el tracto gnitourinario, huesos. Enfermedad granulomatosa progresiva crnica. Infeccin primaria del pulmn, diseminacin hacia las mucosas oral, nasal, tracto gastrointestinal, rganos viscerales, linfonodos.

Histoplasma capsulatum

Blastomyces dermatitidis

Paracoccidioides brasiliensis

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Tabla 33-3. Dermatofitos Hongo Epidermophyton Microsporun Trichophyton Caractersticas Representan las micosis superficiales ms frecuentes en Chile. Atacan las reas queratinizadas (piel, pelos y uas). No forman parte de la biota de estas estructuras. Adaptados para utilizar la queratina como nutriente. El grado de inflamacin producido depende del tipo de dermatofito (geoflico, zooflico o antropoflico) y tambin del estado inmunolgico del paciente.

1.5. Conceptos sobre inmunidad a hongos patognicos El reino Fungi comprende una gran variedad de especies que causan un amplio espectro de enfermedades de diferentes tipos. Los hongos patognicos no causan un nmero elevado de muertes, considerando que muchos de ellos son controlados eficientemente mientras el sistema inmune mantenga su integridad. La produccin de enfermedad, y particularmente de enfermedad grave, ocurre en determinadas circunstancias, las que sern descritas a continuacin. El sistema inmune, como un todo, es necesario para dar combate efectivo a las infecciones micticas. La inmunidad protectora frente a infecciones producidas por hongos exige la participacin eficiente de diversos mecanismos, los que incluyen diferentes clulas y molculas. A continuacin se describen aspectos de la inmunidad natural o innata e inmunidad especfica o adquirida (humoral y celular) asociada a infecciones micticas.

bres que en mujeres. La transicin de la fase miceliar a la fase levaduriforme es inhibida por el 17-beta estradiol, a travs de la interaccin con un receptor presente en el hongo. Candida albicans. La candidiasis vaginal aumenta en mujeres hacia el final de la gestacin y al final de la fase ltea del ciclo menstrual. Los estrgenos y los receptores de esta hormona influencian la conversin levadura/hifa. Al final del ciclo menstrual, cuando existen altos niveles de progesterona y bajos niveles de estradiol, se produce una disminucin de la proliferacin de linfocitos T frente a antgenos de C. albicans, lo que estimula el crecimiento de esta levadura. Dermatofitos. Los dermatofitos presentan una distribucin por edad, observndose Microsporun principalmente en nios. En cambio, los Trichophyton se observan preferentemente en adultos, lo que tiene que ver con la presencia de distintos cidos grasos en la infancia y la pubertad, los que presentan diferentes espectros de accin sobre estos hongos. En las inmunodeficiencias como el SIDA, hay un notorio aumento de las dermatofitosis. En cambio, en la diabetes, el aumento de las dermatofitosis es levemente mayor, sin que ste sea estadsticamente significativo . 2.2. Concentracin de hierro Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis necesitan de hierro para su crecimiento. En el organismo, el hierro est asociado a transferrina (protenas transportadora) y ferritina (protena de almacenamiento). Los hongos tienen, tambin, capacidad para secuestrar hierro para su crecimiento. Por tanto, existe una competencia

2. INMUNIDAD NATURAL 2.1. Factores hormonales Coccidioides immitis. Existe una mayor predisposicin para la coccidioidomicosis durante el embarazo. La maduracin de la fase tisular de C. immitis (esfrulas/endosporos) se ve acelerada por efecto de esteroides, como por ejemplo del 17beta estradiol presente en el suero durante el embarazo. Paracoccidioides brasiliensis. La paracoccidioidomicosis es 20/90 veces ms frecuente en hom-

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entre el hospedero y el hongo por este elemento, especialmente en su forma libre. As, el aumento de hierro srico aumenta la susceptibilidad las infecciones fngicas. En los dermatofitos, la transferrina no saturada puede prevenir el desarrollo de stos en las capas profundas de la piel, por competencia por el hierro. 2.3. Sistema del complemento El sistema del complemento puede ser activado por la va clsica y alterna. Activacin por la va alterna. Esta va es activada por las paredes de P. brasiliensis, B. dermatitidis, C. albicans, F. pedrosoi, C. immitis, y H. capsulatun y por la cpsula de C. neoformans. Como resultado, se genera C3b, que opsoniza los hongos y favorece su fagocitosis. Tambin aparecen diversos productos quimiotcticos que reclutan y activan leucocitos y, finalmente, aparece el complejo de ataque a membranas (MAC) con actividad ltica sobre los hongos. En el caso de los dermatofitos, al gatillar el sistema del complemento, se produce la atraccin quimiotctica de los neutrfilos. Activacin por la va clsica. Los hongos patognicos son inmunognicos e inducen la sntesis de anticuerpos especficos, favoreciendo la activacin tambin por esta va. An sin la participacin de anticuerpos, esta va puede ser activada pues, en la composicin de su pared, muchos hongos presentan manosa, la cual se une a un receptor especfico semejante al primer componente de la va clsica (C1q). 2.4. Clulas natural killer (NK) Mecanismos. El mecanismo de accin de las clulas NK se puede expresar tanto por un efecto fungicida directo o un efecto indirecto, a travs de la produccin de citoquinas, principalmente IFN-gama pero, tambin, de TNF- y de GM-CSF. Efectos de las clulas NK sobre algunos hongos. Los efectos antifngicos de las clulas NK dependen de la especie de hongo de que se trate. As, estas clulas presentan actividad anti H. capsulatun y juegan un papel en su clearence. Tambin ha sido verificado que las clulas NK inhiben C. immitis y C. albicans y son fungistticas para C. neoformans y P. brasiliensis. En otros estudios se ha observado que los pa-

cientes con paracoccidioidomicosis tienen un mayor nmero de clulas NK que los individuos normales pero, stas, son de menor actividad. 2.5. Leucocitos polimorfonucleares neutrfilos (PMN) Los PMN destruyen eficientemente los hongos siendo, incluso, ms eficaces que otras clulas de la inmunidad natural pero, como tienen corta vida y las infecciones fngicas son crnicas, su efecto es limitado. As, en la fase inicial de las infecciones fngicas los pmn diminuyen la carga infectante. Por otro lado, el papel de los pmn y su influencia en el tipo y la magnitud de la respuesta inmune adquirida debe ser estudiado con mayor profundidad. PMN frente a hongos oportunistas. Los PMN son esenciales en la resistencia a la aspergilosis y a la candidiasis sistmica. De hecho, la susceptibilidad a la Candida sp. y a Aspergillus sp. aumenta en casos de neutropenia grave, enfermedad granulomatosa crnica en la cual existe una deficiencia de anin superxido, la que lleva a una alteracin en los niveles de mieloperoxidasa. Estas clulas son competentes para lisar extracelularmente hifas grandes de C. albicans y de A. fumigatus y tienen una significativa presencia en las fases iniciales de la candidiasis y de la criptococosis. PMN frente a hongos patognicos. Los efectos antifngicos de los PMN dependen de la especie de hongo patognico. En la tabla 33-4 se menciona algunos casos especficos. 2.6. Macrfagos Macrfagos alveolares. Estas clulas fagocitan partculas infectantes de H. capsulatun, C. immitis, C. neoformans, A. funigatus, C. albicans y B. dermatitidis. Fagocitan y matan hongos oportunistas y fagocitan, pero no matan, hongos patognicos primarios. Macrfagos residentes. Cuando no son estimulados por citoquinas presentes durante la respuesta inmune adquirida, permiten la proliferacin de H. capsulatun, P. brasiliensis y C. immitis. Producen xido nitroso que inhibe el crecimiento de hongos patgenos fagocitados y seran activos contra hongos superficiales, como los dermatofitos.

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Tabla 33-4. PMN y hongos patognicos Hongo C. immitis H. capsulatun B. dermatitidis P. brasiliensis Papel de los PMN Lisan alrededor del 20% de las artroconidias fagocitadas, digieren la pared de esfrulas y no lisan endosporos. Son poco eficaces en humanos y tienen importancia relativa en la respuesta primaria de animales. Pueden lisar clulas levaduriformes cuando son estimulados por IFN-. En pacientes, su capacidad fagoctica es normal pero su efecto fungicida es deficiente. In vitro son fungistticos y cuando son estimulados por IFN- se tornan fungicidas. Los neutrfilos y los monocitos/macrfagos aparecen como un importante mecanismo de defensa contra los dermatofitos a travs de procesos microbicidas: oxidantes microbicidas (superxidos, agua oxigenada, cido hipocloroso) y monocloramina. Por muerte de los neutrfilos se producen substancias microbicidas no oxidativas: catepsinas, defensinas, lactoferrina, lisozima, azuricidina, protenas microbicidas que incrementan la permeabilidad. Los PMN tienen grnulos de Ca y Zn ligados a calprotectina.

Dermatofitos

Otras Clulas. Las clulas de la capa basal de la piel producen el crecimiento continuo de la epidermis hacia su derivacin en queratinocitos. stos, representan una barrera estructural contra antgenos externos y son importantes por mediar la respuesta inmune cutnea, secretando factores solubles capaces de estimular o disminuir la respuesta inmune. Producen marcadores de superficie, molculas de adhesin, citoquinas quimiotcticas que seran responsables de la inflamacin en las lesiones cutneas, eicosanoides (PGE2), factores de crecimiento e interleuquinas. 3. INMUNIDAD HUMORAL A HONGOS 3.1. Papel de la inmunidad humoral Papel protector. Las infecciones fngicas determinan la formacin de anticuerpos especficos. Estos tienen efecto protector, pero su funcin es auxiliar. Sin embargo, la respuesta inmune humoral es importante en la fase inicial de la infeccin por S. schenkii y para evitar la candidiasis diseminada.

Papel no protector. Altos ttulos de anticuerpos especficos se presentan en las formas clnicas graves de coccidioidomicosis y paracoccidioidomicosis. La activacin policlonal de linfocitos B ocurre en formas clnicas graves de coccidioidomicosis y paracoccidioidomicosis. En estas micosis, una respuesta inmune humoral exacerbada representa un mal pronstico. En las dermatofitosis las precipitinas son producidas infrecuentemente encontrndose bajos niveles de anticuerpos contra T. rubrum, los que podran determinar reacciones cruzadas con otros organismos. 3.2. Mecanismos protectores de la inmunidad humoral Opsonizacin de hongos por anticuerpos. El papel de las clulas fagocticas que presentan receptores para la regin Fc IgG (FcR), se ve facilitado por la opsonizacin producida por los mismos anticuerpos. As, PMN y monocitos humanos lisan C. neoformans opsonizados por anticuerpos, macrfagos de roedores o monocitos humanos ingieren C. neoformans encapsulados opsonizados por anticuerpos y los PMN se adhieren ms a H.

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capsulatum opsonizado por anticuerpos que a aquellos no opsonizados. Citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC). Este mecanismo fue descrito contra C. neoformans, promoviendo un efecto fungisttico. Opsonizacin de hongos por complemento. Los PMN y monocitos humanos lisan C. neoformans, H. capsulatun, S. schenkii opsonizados por complemento. Los macrfagos no activados no fagocitan C. neoformans opsonizado por complemento. Lisis de hongos por complemento. El complejo de ataque a las membranas tienen efecto fungicida sobre C. neoformans. Un fenmeno interesante es que una deficiencia en el componente C5 de la va efectora del sistema del complemento no implica en aumento de susceptibilidad a varias micosis profundas.

dimrficos patognicos. Formas clnicas graves de algunas micosis estn asociadas a la anergia de las respuestas mediadas por linfocitos T. Ciertas deficiencias en los linfocitos T, como aquella observada en pacientes con SIDA o en ratones atmicos, determinan formas infecciosas graves. De hecho, a travs de modelos experimentales fue posible comprobar un aumento en la gravedad de la infeccin por H. capsulatun en animales atmicos o depletados de linfocitos T, as como su incapacidad para eliminar C. neoformans y controlar su diseminacin al sistema nervioso central. Sin embargo, no fue posible demostrar aumento de carga fngica o exacerbacin de la enfermedad causada por C. albicans. Linfocitos T CD4+ Todos los hongos patognicos causan reacciones de hipersensibilidad de tipo tardo (HTT). El desarrollo de fuertes reacciones de HTT est asociado a formas clnicas benignas en pacientes con paracoccidioidomicosis y coccidioidomicosis. En modelos experimentales de varias micosis profundas se observ un paralelismo entre HTT y la cura o una buena evolucin de la enfermedad, muchas veces precediendo al clearence de los hongos. Muchos pacientes con dermatofitosis presentan HTT a antgenos de dermatofitos y tambin una vigorosa transformacin de linfocitos como respuesta al antgeno pudiendo, stos, acceder a la epidermis junto con neutrfilos. Las respuestas de HTT participan en la lisis de los hongos de menor patogenicidad y del clearence parcial y la contencin de hongos de mayor patogenicidad, incluyendo la formacin de granulomas, se muestra en la tabla 33-5. A continuacin se describe el papel de subpoblaciones de clulas T CD4+ (LTh1 y LTh2) en la inmunidad clulas frente a algunos hongos. C. albicans y C. neoformans. En la respuesta inmune que se establece frente a estos hongos existe una asociacin entre patrn de curacin de la infeccin sistmica y respuesta predominantemente Th1 y entre patrn de no curacin y el establecimiento de una respuesta predominantemente Th2, constituyendo, as, un perfil claramente dicotmico de produccin de citoquinas Th1 y Th2.

4. INMUNIDAD CELULAR A HONGOS La inmunidad celular tiene importancia decisiva en la proteccin contra micosis profundas y en la candidiasis mucocutnea. Repetidamente ha sido verificado que los hongos patognicos tienen un efecto supresor sobre su induccin y/o sobre su expresin. 4.1. Macrfagos Como ya fue visto, al contrario de los macrfagos residentes, que no lisan hongos patognicos, los macrfagos activados por IFN- son competentes fungicidas. Los efectos antifngicos de estos macrfagos dependen tanto del hongo (especie, virulencia de la cepa) como de las caractersticas del macrfago (tipo, lugar de origen, especie del hospedero). Substancias fngicas relevantes. Los fagocitos lisan hongos a travs de metabolitos txicos dependientes de NO (P. brasiliensis, H. capsulatun, B. dermatitidis, C. neoformans), dependientes de O2 (H. capsulatun, C. immitis, C. albicans) y tambin por medio de protenas catinicas (C. immitis). 4.2. Linfocitos T Esta poblacin celular es esencial para la resistencia a las infecciones causadas por hongos

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Tabla 33-5. Papel de linfocitos T CD4(+) en la inmunidad celular a algunos hongos Hongo C. immitis H. capsulatun C. neoformans Papel de los linfocitos T CD4 (+) Son necesarios para la inmunidad protectora en los pulmones, lo que fue confirmado por experimentos de transferencia de clulas. Su ausencia determina un notorio aumento de la susceptibilidad y muerte por dosis menor del hongo que las usualmente conocidas. Son necesarios para el clearence de los hongos del pulmn.

P. brasiliensis, B. dermatitidis, C. immitis. En las infecciones por estos hongos existe una respuesta Th1 inicial seguida de una respuesta Th2, lo que se correlaciona con el agravamiento de la enfermedad. El patrn de produccin de citoquinas Th1 y Th2 difiere entre los diferentes hongos, tanto en cuanto a su cintica como a los niveles producidos. Linfocitos T CD8+. Los LT citotxicos (LT CD8+) participan, en conjunto con linfocitos t CD4+, en la inmunidad protectora contra varios hongos patognicos, como H. capsulatun y C. neoformans. Los mecanismos por los cuales esta proteccin se produce pueden ser varios: lisis de macrfagos infectados (H. capsulatun), efecto fungicida directo (C. neoformans) o secuestro en granulomas (C. neoformans). En la tabla 33-6 se describe la participacin de las clulas T CD8+ en algunas infecciones micticas. 4.3. Citoquinas. Las citoquinas Th1 (IFN-, IL2) tienen un papel importante en la proteccin contra infecciones fngicas, en el desarrollo de reacciones de HTT y en la activacin de macrfagos. Las citoquinas Th2 (IL-4, IL-10) estn

involucradas en la exacerbacin de infecciones fngicas, en la anergia de reacciones de HTT y en la desactivacin de macrfagos. TNF- y GM-CSF estimulan la actividad antifngica de PMN, monocitos y macrfagos. En la tabla 33-7 se muestra la participacin de algunas citoquinas en la inmunidad celular de algunos hongos. 4.4. Granulomas La formacin de granulomas tiene el propsito de restringir el crecimiento fngico y confinar la infeccin. Los macrfagos activados inhiben el crecimiento fngico. Cuando esto no es posible, ocurre la fusin de macrfagos formndose clulas gigantes multinucleadas para contener el desarrollo fngico. La encapsulacin promovida por la fibrosis tambin tiene efecto de contencin sobre los hongos. Como ocurre necrosis, se reduce la oferta de nutrientes y de oxgeno necesarios para la proliferacin de los hongos. Los principales tipos celulares encontradas en varias micosis, como las causadas por B. dermatitidis, C. immitis, S. schenkii, H.

Tabla 33-6. Linfocitos T CD8+ y algunos hongos Hongo C. immitis H. capsulatun C. neoformans Papel de los linfocitos T CD8 (+) Son necesarios para la inmunidad protectora en el pulmn. Su ausencia determina un relativo aumento de la susceptibilidad pero no causa la muerte. Son necesarios para el clearence de estos hongos de los pulmones.

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Tabla 33-7. Citoquinas e infecciones micticas Hongo C. albicans Papel de las citoquinas IFN est asociada con el patrn de curacin de la infeccin y, en contrapartida, IL-4 e IL-10 con el desarrollo de enfermedad crnica. IL-12 presenta efecto protector contra la diseminacin del hongo, adems de ser un poderoso inductor de la respuesta Th1 IFN-, GM-CSF y TNF- son mediadores de la lisis intracelular. TNF-, IL-1 y IL-6 estn involucrados en el sndrome respiratorio agudo y choque sptico, importantes en la patognesis. IFN- y IL-12 son mediadores de la lisi intracelular de artroconidias. IL-12 tienen efecto protector tambin por induccin de la expresin de citoquinas Th1. IL-12 tienen efecto protector indirecto, por la produccin de IFN y relevancia en la respuesta inmune primaria. TNF en conjunto con IL-12 aumentan la produccin de IFN es el principal mediador de la lisis intracelular. TNF en conjunto con IFN determinan la exacerbacin del efecto protector. IL-4 modula la inmunidad protectora mediada por IFN TNF, IL-12, IL-1, IFN son producidos al inicio de la infeccin, con un importante papel en la induccin de inmunidad celular protectora. IL-12 presenta efecto protector contra la diseminacin. IFN, GM-CSF y TNF son mediadores de la lisis intracelular. El IFN est involucrado en gatillar la HTT y es responsable de las manifestaciones cutneas y en la defensa del husped contra la infeccin. Es producido por linfocitos perifricos en la dermatofitosis inflamatoria aguda, siendo baja su concentracin en las formas crnicas. Liberan IL-8 por efecto de antgenos de dermatofitos iniciando la inflamacin como defensa. Los niveles de IL-1 inducidos por T. mentagrophytes son ms altos que los producidos por el hongo antropoflico T. rubrum, lo que se relaciona con una respuesta inflamatoria ms severa en el caso del hongo geoflico. Las clulas de Langerhans (2-5% de las clulas de la epidermis) producen marcadores de superficie y molculas de adhesin (LFA-3, ICAM-1, B7) y citoquinas (IL-1B, IL-6, TNF-), actan como procesadoras y presentadoras del antgeno para activar los linfocitos T, adems de fagocitosis de antgenos.

C. immitis

H. capsulatun

C. neoformans

Dermatofitos

capsulatun y C. neoformans, son PMN, linfocitos, clulas epiteliales y clulas gigantes multinucleadas. Los granulomas se presentan circunscritos en la enfermedad controlada y diseminados en las enfermedades graves.

5. MECANISMOS DE INMUNIDAD PROTECTORA 5.1. Mecanismo principal El principal mecanismo protector que acta en las micosis profundas es la produccin de

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citoquinas como el IFN por linfocitos T, llevando a la activacin de macrfagos, con el consiguiente aumento de su capacidad fungicida. 5.2. Otros mecanismos Adems de ste, existen otros mecanismos capaces de conferir inmunidad protectora en infecciones fngicas. De estos otros es necesario citar el desarrollo primordial o preferencial de una fuerte respuesta del tipo Th1, el efecto conjunto de linfocitos T CD4+ y T CD8+ adems del efecto de otras poblaciones celulares y del efecto individual o sinrgico de varias citoquinas.

LECTURAS SUGERIDAS Kwon-Chong, K.J. & Bennet, J.E., Medical Mycology, Lea & Febiger Ed., Philadelphia, 1992. Journal of Medical and Veterinary Mycology, Volume 30, Supplement 1, 1992 (Proceeding of the XI Congress of ISHAM). Medical Mycology, Volume 36, Supplement 1, 1998 (Proceedings of the XIII Congress of ISHAM). Medical Mycology, Volume 38, Supplement 1, 2000 (Proceedings of the XIV Congress of ISHAM). Sarosi, G.A & Davies, S.F., Doenas Fngicas do pulmo. Revinter Ed., 2001.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 34
RESPUESTA INMUNE FRENTE A VIRUS
Jos M. Ojeda F. y Jorge A. Fernndez V.

1. Introduccin 2. Infeccin viral 2.1. Interaccin virus-husped 3. Respuesta inmune en infecciones virales 3.1. Inmunidad antiviral natural 3.1.1. Produccin de IFN tipo I y otras citoquinas 3.1.2. Clulas NK 3.1.3. Activacin del complemento y fagocitosis 3.2. Inmunidad antiviral especfica 3.2.1. Inmunidad humoral 3.2.2. Inmunidad celular

3.3. Evasin de la respuesta inmune por virus 3.3.1. Persistencia intracelular 3.3.2. Variacin antignica 3.3.3. Interaccin con componentes del sistema inmune 3.3.4. Interferencia con la presentacin antignica 3.3.5. Simulacin molecular 3.3.6. Inmunosupresin

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RESUMEN An cuando en su mayora las infecciones virales son de tipo subclnico o asintomticas, en general inducen respuesta inmune. En este captulo se revisa, brevemente, cmo ocurren las infecciones virales, indicando el tipo de interacciones ligando-receptor que se requieren para que estos parsitos intracelulares infecten las clulas blanco. La mayor parte del captulo se refiere a la respuesta inmune que se puede generar en las infecciones virales. En lo que se refiere a la inmunidad antiviral natural o innata, participan el interfern (IFN) tipo I, clulas NK y el sistema del complemento. Respecto a la inmunidad antiviral especfica o adquirida, se describe la participacin de los anticuerpos (inmunidad humoral) y de linfocitos T citotxicos (inmunidad celular). Finalmente, en el captulo se explican las diferentes estrategias que utilizan los virus para evadir la respuesta inmune: persistencia intracelular, variacin antignica, interaccin con componentes del sistema inmune, interferencia con la presentacin antignica, simulacin molecular e inmunosupresin.

1. INTRODUCCIN Los virus, son agentes infecciosos capaces de ejercer diversas interacciones con los hospederos que infectan, algunas de las cuales afectan a clulas, tejidos y rganos manifestando su poder patgeno. En estas interacciones, que conducen al desarrollo de enfermedad, participan factores propios del agente infeccioso, del hospedero y del ambiente. La patogenia de las enfermedades infecciosas involucra etapas que son determinadas por la accin de estos factores. Los factores dependientes del hospedero ejercen su accin a travs de mecanismos de inmunidad natural o inespecfica y de los mecanismos especficos o de inmunidad adquirida (ver captulo 3). Entre los mecanismos de inmunidad natural, que tienen importancia en el control de las infecciones, estn: la fagocitosis, la accin del sistema complemento, clulas NK, las barreras cutneas y de las superficies epiteliales, el pH gstrico, los movimientos ciliares, las secreciones en las mucosas, la flora gastrointestinal normal y otros. Los mecanismos de inmunidad especfica (Linfocitos B, T, anticuerpos), seran de escasa o nula utilidad si no contaran con los mecanismos de inmunidad natural. La evolucin de las infecciones virales y de

sus enfermedades comprende una secuencia de interacciones entre los virus y sus hospederos. stas incluyen la entrada de los virus al organismo, su diseminacin y localizacin en los tejidos u rganos blancos, evadiendo al mismo tiempo los mecanismos inmunes del hospedero. La respuesta inmune frente a virus se caracteriza por: a) Estar mediada por ambos tipos de inmunidad, tanto innata, como adquirida, aunque en una primoinfeccin predominan los mecanismos innatos, cuya respuesta aislada se caracteriza por ser siempre de igual magnitud frente al mismo estmulo antignico y carecer de memoria. b) Diferentes tipos de virus estimulan distintas respuestas y mecanismos efectores inmunes, ya que los virus difieren en sus patrones de infeccin, inmunogenicidad y por tanto su eliminacin implica diversos sistemas efectores. c) La sobrevivencia y patogenicidad de los virus en el hospedero dependen de su habilidad para evadir o resistir los mecanismos inmunes. Los virus en su evolucin han desarrollado una variedad de estrategias y eficientes mecanismos para su sobrevivencia, evadiendo la respuesta inmune.

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d) El dao tisular y enfermedades derivadas de las infecciones por virus patgenos pueden ser causadas por la respuesta del hospedero contra el agente infeccioso, ms que por la accin directa de l. La inmunidad, al igual que muchos otros mecanismos homeostticos, es fundamental en la proteccin del hospedero ante las agresiones externas, pero tambin tiene la capacidad de provocarle dao. 2. INFECCIN VIRAL Los virus pueden infectar a los individuos y causar enfermedad, si poseen capacidad o poder patgeno en dicho husped. Sin embargo, las infecciones virales son en su mayora de tipo subclnico o asintomticas, sin generar procesos patolgicos, pero s una respuesta inmune.

plique y exprese, generando nuevas copias de cido nucleico y protenas o antgenos virales. La replicacin viral produce inhibicin de la sntesis de cidos nucleicos y protenas celulares, lo que conduce a alteraciones celulares que se manifiestan de diversas formas denominadas efectos citopticos y que suelen concluir con la lisis o muerte celular. Algunos virus producen infecciones sin generar efectos citopatolgicos evidentes, estableciendo infecciones a nivel celular de carcter latente o persistente. En algunos casos las clulas, as infectadas expresan protenas o antgenos virales que pueden estimular la inmunidad especfica, la que acta a travs de reacciones de hipersensibilidad produciendo el dao celular. Este tipo de reacciones suele observarse en infecciones por el virus de la Coriomeningitis linfocitaria en ratones y por virus de la Hepatitis B en los seres humanos. 3. RESPUESTA INMUNE FRENTE A VIRUS La inmunidad contra los virus opera en dos etapas: En la fase inicial de infeccin, antes de que un virus haya entrado en las clulas (virus extracelular) y despus de su penetracin, cuando el virus se encuentra en el interior de las clulas infectadas y es inaccesible para los mecanismos de inmunidad humoral (anticuerpos y complemento) y los fagocitos. La estimulacin misma del sistema inmune en una infeccin viral puede tener tres consecuencias generales: Activacin de componentes del sistema inmune no especficos para antgenos virales, lo que puede significar la induccin de un proceso inflamatorio que favorece la eliminacin del virus, pero que tambin pude causar dao en las clulas y tejidos del husped. Tambin la activacin puede conducir al desarrollo de un estado patolgico que tienda a persistir en el tiempo, independiente de la presencia del virus. Activacin de componentes del sistema inmune que exhiban especificidad para interactuar con estructuras virales. La interaccin de mecanismos efectores especficos del sistema inmune con antgenos virales promueve la eliminacin progresiva de virus. Modificaciones en componentes del sistema inmune, algunas de ellas irreversibles, que perduran despus de la eliminacin del virus, que pueden conducir a variaciones en el repertorio de receptores de clulas T (TCR) (ver captulo 7), ge-

2.1. Interaccin virus-husped Los virus son organizaciones macromoleculares constituidas por cido nucleico y protenas. Slo algunos virus poseen adems una envoltura o membrana lipdica con glicoprotenas insertas. Las partculas virales poseen capacidad infectiva y por carecer de maquinaria de biosntesis de sus macromolculas, aprovechan la maquinaria metablica de la clula hospedera, ejerciendo el carcter de parsitos estrictamente intracelulares. La utilizacin de los sistemas de biosntesis celulares le permiten a los virus replicarse en el interior de las clulas infectadas. Los virus animales entran a las clulas unindose a receptores moleculares presentes en la superficie celular y que corresponden a entidades que son fisiolgicamente activas. Algunos ejemplos son: (i) Virus de la inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1), el cual se une a la molcula CD4 presentes en las clulas T "helper" humanas, (ii) Virus Epstein-Barr (VEB), que se une al receptor tipo 2 del complemento en los linfocitos B humanos, y (iii) Los Rinovirus, agentes causantes del resfro comn, que se unen a la molcula de adhesin intercelular (ICAM-1), expresada en el epitelio de la va erea. Despus del proceso de unin a los receptores los virus son internalizados a la clula por fagocitosis (viropexia) o por fusin de las membranas viral y celular. En el interior de las clulas infectadas los virus se liberan de su cubierta proteica, permitiendo que el genoma viral se re-

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neracin de poblaciones celulares de memoria inmunolgica y tolerancia. 3.1. Inmunidad antiviral natural Hay dos mecanismos principales de inmunidad antiviral natural: (i) produccin de Interfern (IFN) tipo I ( y ) y otras citoquinas, que generan un estado antiviral, y (ii) participacin de clulas NK ("Natural Killer") en la destruccin de las clulas infectadas. El (IFN) I puede aumentar la actividad citoltica de las clulas NK. Ambos mecanismos operan en la fase temprana de las infecciones virales, antes de que acten los mecanismos de inmunidad especfica. Por otra parte, la activacin del sistema del Complemento y la fagocitosis participan en la eliminacin de virus extracelular presente en los fluidos corporales y constituyen tambin formas de inmunidad antiviral natural. 3.1.1. Produccin de IFN tipo I y otras citoquinas La infeccin viral estimula la produccin de IFN tipo I y citoquinas en ciertos tipos de clulas (ver captulo 10). Los interferones son protenas que ejercen sus efectos antivirales a travs de diversos efectos como: (i) mayor expresin de las molculas MHC clase I y II, lo que facilita el reconocimiento de los antgenos virales por parte del sistema inmune, (ii) activacin de las clulas NK y macrfagos con capacidad de destruir las clulas infectadas por los virus. El IFN- estimula tambin a los linfocitos B, (iii) inhibicin directa de la replicacin viral. Diversos mecanismos contribuyen a producir este efecto. Los IFN- corresponden a una familia de 20 polipptidos (18 kDa) relacionados estructuralmente entre s y codificados por genes separados, en cambio el IFN- es un polipptido (20 kDa) codificado por un solo gen. Las principales clulas productoras de IFN- son los fagocitos mononucleares y en el caso de IFN- son los fibroblastos y las clulas infectadas por virus. La seal natural ms potente para la sntesis de IFNs tipo I es la infeccin viral. Ambos tipos de IFNs son secretados tambin durante la respuesta inmune a antgenos, al ser estimulados los fagocitos mononucleares por los linfocitos T. Aunque los IFNs y muestran poca similitud estructural, se unen al mismo receptor celular e induciran res-

puestas celulares similares. El IFN producido por las clulas infectadas es secretado al exterior, donde se une a receptores presentes en la superficie de las clulas vecinas. Esta interaccin IFN-receptor provoca una cascada de eventos moleculares similar a otra transduccin de seales, que culmina con la activacin de genes e induccin de protenas antivirales como son: una protena quinasa y una 2',5'-oligoadenilato sintetasa. La protena quinasa inactiva por fosforilacin al factor proteico de iniciacin (eIF-2) necesario para la sntesis de protenas virales. La sintetasa genera oligoadenilatos que activan una endorribonucleasa que degrada los cidos ribonucleicos virales. El efecto antiviral de estos IFNs es por tanto paracrino, dado que la clula infectada secreta IFNs para proteger a las clulas vecinas an no infectadas, produciendo el estado antiviral. 3.1.2. Clulas NK Las clulas NK (ver captulo 19) destruyen una gran variedad de clulas infectadas por virus. La actividad ltica de las clulas NK pueden ser uno de los principales mecanismos de inmunidad en contra de los virus, tempranamente o durante el curso de la infeccin, antes de que las respuestas inmunes especficas se hayan desarrollado. Los IFNs tipo I ejercen un efecto sinrgico aumentando la capacidad de las clulas NK para lisar las clulas infectadas. Las clulas NK destruyen o lisan estas clulas liberando el contenido de sus grnulos que consiste en perforinas o protenas que generan canales en las membranas celulares, produciendo lisis osmtica y granzimas, que son endonucleasas que degradan DNA. Tambin las clulas NK inducen Apoptosis (muerte celular programada) de la clula infectada. 3.1.3. Activacin del Complemento y Fagocitosis El Complemento y la Fagocitosis pueden eliminar virus desde sitios extracelulares y desde la circulacin y fluidos corporales. La activacin del complemento, como mecanismo de inmunidad natural, sera a travs de la va alterna. Constantemente se est formando en el plasma C3b a partir de C3. Si este C3b se deposita covalentemente sobre una membrana biolgica (como puede ser la de los virus con envoltura), o sobre una superficie proteica (virus desnudos), y si es que estas

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superficies, a diferencia de las membranas celulares, no poseen protenas regulatorias como: H, CR1, MCP o CD59 puede producirse, en el caso de los virus envueltos, virolisis por ruptura de su envoltura lipdica al formarse MAC, o bien por opsonizacin y fagocitosis por las clulas del sistema fagoctico mononuclear que poseen receptores para C3b (CR1, CR3 y CR4). 3.2. Inmunidad antiviral especfica La inmunidad especfica contra las infecciones virales es mediada por una combinacin de mecanismos celulares y humorales. Ambos mecanismos participan en el control de la infeccin, ya sea actuando directamente sobre las partculas virales o bien sobre las clulas infectadas. 3.2.1. Inmunidad humoral Durante la infeccin viral se estimulan los linfocitos B, haciendo que stos proliferen y se diferencien en clulas plasmticas capaces de sintetizar anticuerpos especficos que reconocen y reaccionan contra diferentes antgenos virales, ya sea estructurales (que forman parte de la partcula viral) o no estructurales (protenas virales que se generan durante la infeccin viral, pero que no forman parte de la partcula viral). Anticuerpos neutralizantes. Estos anticuerpos especficos son importantes por su accin protectora, ya que su funcin es la neutralizacin de la capacidad infectiva. Se unen a las protenas de infectividad, que son aquellas que permiten la unin del virus a sus receptores celulares, impidiendo as su entrada y replicacin. Anticuerpos opsonizantes. Los anticuerpos subclase IgG1 e IgG3 tienen propiedades opsonizantes, se unen a los antgenos virales aumentando la fagocitosis de las partculas virales por clulas fagocticas que poseen receptores Fc. Sin embargo, estos anticuerpos pueden en algunos casos facilitar la entrada de las partculas virales a estas clulas donde ciertos virus inician procesos infectivos y replicativos, como es el caso de la infeccin de fagocitos mononucleares por VIH. Anticuerpos activadores del complemento. Otros anticuerpos son aptos para unirse a las particulas virales formando complejos antgeno-

anticuerpo capaces de activar el sistema complemento, generando destruccin de la partcula viral (virolisis) o promoviendo la fagocitosis. Los anticuerpos que no son opsonizantes ni activan complemento, como IgA, IgE e IgG4 desempean funciones neutralizantes importantes a nivel de inmunidad local, especialmente en infecciones del tracto respiratorio e intestinal. La manipulacin de la inmunidad humoral ha sido fundamental en el establecimiento de la vacunas antivirales a virus atenuado o inactivado, ya que el xito de la funcin protectora de una vacuna est relacionada con la capacidad de inducir una respuesta inmune de anticuerpos especficos contra determinados antgenos virales que son determinantes de la infeccin y poder patgeno. La inmunidad humoral desempea su funcin protectora, en gran parte por la funcin neutralizante de los anticuerpos. Sin embargo es importante considerar que esta proteccin es efectiva slo en la fase temprana de la infeccin, es decir antes que el virus entre a la clula. Por otro lado, es difcil transferir inmunidad antiviral mediante anticuerpos purificados y la capacidad neutralizadora de un anticuerpo in vitro, generalmente muestra poca o ninguna correlacin con su capacidad protectora in vivo. Estas consideraciones muestran que los anticuerpos son un componente importante de la inmunidad antiviral, pero que no son suficientes para eliminar muchas infecciones virales. Estos hechos se evidencian tambin en que determinadas deficiencias de la inmunidad humoral aumenta la susceptibilidad de determinadas infecciones virales. 3.2.2. Inmunidad celular La respuesta inmune celular especfica est dada por complejas interacciones entre la clula infectada y clulas del sistema inmune. La interaccin ms importante, referente al control de la infeccin es la que se establece entre los linfocitos T citotxicos (LTc) y la clula infectada. En esta interaccin se produce un reconocimiento por parte de ambas clulas, en la que es crucial la expresin de ciertos polipptidos virales, que dan la especificidad de la respuesta y la accin citotxica en s, que es respuesta a este reconocimiento. La principal poblacin celular que ejerce esta accin citotxica son las clulas CD8+, las que reconocen pptidos o antgenos virales sintetizados en la clula infectada, en asociacin con mo-

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lculas MHC de clase I. Una proporcin menor, pero detectable de linfocitos citotxicos de humanos y de ratones, corresponde a linfocitos CD4+ que reconocen pptidos virales en asociacin con molculas MHC de clase II. Esta accin citotxica de las clulas CD4+ se ejerce sobre clulas infectadas que expresan tanto MHC-II, como pptidos virales. La diferenciacin de los LTC de tipo CD8+ requiere de citoquinas producidas por clulas las clulas CD4+. El efecto antiviral de los LTc conduce a la lisis de la clula infectada, la que se debe a diversas acciones como: produccin de perforinas, estimulacin de enzimas intracelulares que degradan genomas y protenas virales, secrecin de citoquinas como IFN, induccin de apoptosis y otros (ver captulo 19). La importancia de los LTc en el control de las infecciones virales ha sido demostrada en sistemas experimentales. Los ratones pueden ser protegidos contra el virus de influenza, a travs de la transferencia de LTc especficos para el virus y del mismo tipo de MHC del animal. Sin embargo, una gran proporcin de LTc especficos para virus influenza, no son serotipos especficos, porque ellos reconocen pptidos derivados de las protenas virales como son las protenas internas de la partcula viral, y que no se relacionan antignicamente con las glicoprotenas de la envoltura proteicas (hemaglutinina y neuroaminidasa) que son las que determinan el serotipo. Por otra parte, la inmunidad adquirida activamente en el caso de infecciones por virus influenza es serotipo especfica, lo indica que tanto los anticuerpos como los LTc participan en la respuesta inmune para proteger la clula hospedera, bloqueando la entrada del virus a la clula o inhibiendo la replicacin viral. Respuesta inmune antiviral y dao celular En la mayora de las infecciones virales agudas se produce destruccin celular y tisular por accin directa del virus sobre las clulas (citolisis) como consecuencia de sus efectos citopticos. La respuesta inmune de los LTc puede ser el factor ms importante en producir dao celular en los tejidos infectados por virus no citopticos. El mejor ejemplo son las infecciones por virus de la coriomeningitis linfocitaria (VCML), el cual induce inflamacin de las meninges en ratones. El VCML infecta las clu-

las de la meninge, expresando pptidos y antgenos virales, pero sin destruirlas. Adems el VCML estimula el desarrollo de LTc especficos que son los que reconocen las clulas infectadas y las destruyen. Los ratones infectados con VCML, pero deficientes en clulas T, son portadores crnicos del virus, pero no desarrollan meningitis, mientras que s se desarrolla en los ratones normales infectados. La infeccin del virus de la hepatitis B en humanos muestra algunas similitudes con la infeccin por VCML en ratones. Las personas inmunodeficientes que llegan a infectarse no desarrollan la enfermedad, pero pueden ser portadores del virus y transmitir la infeccin a personas sanas. Por otra parte, el hgado de pacientes con hepatitis aguda contiene gran cantidad de clulas T CD8+. La respuesta inmune a infecciones virales, puede estar tambin relacionada a procesos de desarrollo de enfermedad, ya que como consecuencia de infecciones persistentes por algunos virus se forman complejos inmunes circulantes de antgenos virales con anticuerpos especficos. Estos complejos antgeno-anticuerpo se depositan en los vasos sanguneos y suelen conducir a procesos inflamatorios de vasculitis y destruccin vascular. Algunos virus contienen protenas antignicas, cuyas secuencias de aminocidos poseen cierta homologa con protenas celulares. Algunas de estas protenas virales, se expresan en la superficie celular de ciertos tejidos. Se ha postulado que debido a esta similitud molecular, la inmunidad antiviral puede conducir a respuestas de dao tisular. La tabla 34-1 muestra algunas protenas virales homlogas a protenas celulares y que poseen funciones biolgicas determinantes en las propiedades patognicas de ciertos virus. Algunas de estas protenas pueden interactuar directamente con componentes del sistema inmune, como son las protenas gVC-1 y gE de los virus HSV, que se unen a C3b del complemento y Fc de las inmunoglobulinas respectivamente. Otras de protenas virales son homlogas a interleuquinas, como la protena codificada por el gen K2 del virus HHV-8 que es similar estructural y funcionalmente con IL-6. Tambin existen protenas virales que actan en forma similar a protenas celulares, como es el caso de la protena VGF de los virus Vaccinia que acta igual que EGF, estimulando el crecimiento de clulas epiteliales.

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Tabla 34-1. Protenas virales homlogas a protenas celulares Virus Adenovirus Protena viral E3 E1b Herpes simplex 1 y 2 (HSV) g C-1 gE UL 18 BHRF 1 BCRF 1 K2 ORF 4 ORF 16 ORF 72 VGF VCP Funcin Impide translocacin de MHC-I Interfiere con seal de transduccin de TNF Se une a C3b Se une a Fc de Ig Se une a 2 MG Homlogo a Bcl 2 Homlogo a IL 10 Homlogo IL-6 Se une a Complemento Homlogo Bcl 2 Homlogo Ciclina D Homlogo a EGF/TGF Se une a C4b

Citomegalovirus (CMV) Epstein Barr (EBV)

Herpes Humano 8 (HHV-8)

Vaccinia

El establecimiento de la secuencia gnica de varios virus ha permitido establecer y comprobar la homologa de genes y protenas virales con sus contrapartes celulares. Se postula que estos genes virales han sido secuestrados o capturados de los genomas celulares durante los procesos evolutivos y que han sido parcialmente modificados, con el fin de permitir obtener ventajas selectivas a los virus para su existencia, replicacin y transmisin. 3.3. Evasin de la respuesta inmune en las infecciones virales Los virus han desarrollado diversos mecanismos para evadir los mecanismos de defensa antiviral del sistema inmune, los que han permitido su supervivencia. Se han identificado varios genes virales y sus protenas que modulan la respuesta inmune y posiblemente existan muchos otros genes y protenas virales con estas propiedades. Varios virus son capaces de inhibir la presentacin de sus propios antgenos a los linfocitos T citotxicos. Estos linfocitos CD8+ con actividad citoltica restringida a MHC clase I, constituyen el principal mecanismo de defensa contra las

infecciones virales a nivel celular. Si un virus es capaz de expresar funciones inhibitorias para los MHC clase I o su presentacin antignica, se har indetectable para los linfocitos T y podr permanecer y replicarse en las clulas infectadas. Existen diversos mecanismos por los cuales las infecciones virales escapan al control de la respuesta inmune, estableciendo infecciones de carcter crnico, ya sea con persistencia de partculas virales infectivas o por estados de latencia y transformacin viral. 3.3.1. Persistencia intracelular La permanencia intracelular de los virus, sin expresin de antgenos de reconocimiento y reactividad inmunolgica, es el mecanismo ms obvio por el cual ellos pueden escapar de las clulas y molculas de la respuesta inmune, como es el caso de las infecciones de ciertas neuronas por los virus Herpes simplex, donde se encuentran latentes. 3.3.2. Variacin antignica Existen virus capaces de presentar gran variacin antignica, especialmente en sus prote-

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nas de infectividad, como es el caso de los virus influenza (Hemaglutinina y Neuroaminidasa). Estas variaciones ocurren por mutaciones puntuales, recombinaciones y reordenamientos genticos entre cepas virales diferentes. Como resultado, los nuevos virus no son susceptibles a la inmunidad generada en la poblacin por infecciones previas. Existen muchos tipos antignicos de rinovirus (ms de un centenar) por lo que la inmunidad especfica contra un tipo antignico no protege de la infeccin por otro tipo. Ciertos virus RNA como VIH acumulan mutaciones durante su replicacin por carecer de maquinaria de reparacin de sntesis de cidos nucleicos, de aqu que a su alta variacin gentica se asocia la variacin antignica. 3.3.3. Interaccin con componentes del sistema inmune Ciertos virus como Epstein Barr infectan a clulas del sistema inmune como son los LB. Por otra parte, VIH infecta LT CD4+ y otros virus infectan secundariamente a otras clulas del sistema inmune incluyendo macrfagos. La infeccin de las clulas del sistema inmune por estos virus provoca un desbalance que conduce a formas de evasin de la respuesta inmune antiviral. 3.3.4. Interferencia con la presentacin antignica Existen ciertos virus que durante la infeccin viral expresan protenas que interfieren con la presentacin antignica, especialmente la relacionada con los MHC, que es fundamental en el reconocimiento y destruccin de la clula infectada por los LT. Varios virus son capaces de inhibir la presentacin de sus propios antgenos a los linfocitos T citotxicos. Estos linfocitos CD8+ con actividad citoltica restringida a MHC clase I, constituyen el principal mecanismo de defensa contra las infecciones virales a nivel celular. Si un virus es capaz de expresar funciones inhibitorias para los MHC clase I o su presentacin antignica, se har indetectable para los linfocitos T y podr permanecer y replicarse en las clulas infectadas. Cada una de las etapas de la presentacin antignica puede ser inhibida por productos virales: a) La transcripcin de los genes de MHC clase I es inhibida por la protena E1A de cepas patognicas de ciertos Adenovirus.

b) Los virus Herpes simplex, ya sea tipo 1 2, expresan una protena viral no estructural ICP-47, en las clulas infectadas, que se une al sitio de unin del pptido del transportador asociado con la presentacin antignica TAP e impide que los pptidos virales citoslicos se unan al TAP y sean transportados al retculo endoplsmico para unirse al MHC clase I (ver captulo 9). c) La protena E3 de algunos Adenovirus (19 kDa) se une y retiene a los MHC clase I en el retculo endoplsmico. d) La protena US3 (codificada por un gen localizado en la secuencia nica 3) del Citomegalovirus (CMV) humano es capaz de secuestrar molculas de MHC clase I en el retculo endoplsmico y una protena del CMV murino retiene MHC clase I en el cis Golgi. e) Las protenas US2 y US11 del CMV se unen a molculas de MHC clase I en el retculo endoplsmico y las llevan o descargan en el citosol, donde no pueden unirse a los pptidos de presentacin y son degradadas. f) Las protenas Vpu y Nef del virus de la inmunodeficiencia humana tambin inhiben la expresin de molculas MHC clase I en las clulas infectadas. La consecuencia del bloqueo de MHC clase I y su asociacin con los pptidos de presentacin en todos estos casos es que las clulas infectadas muestran una reducida expresin de molculas estables de MHC clase I en la superficie celular y no presentan los pptidos virales para el reconocimiento y accin citoltica de los linfocitos T CD8+. Sin embargo, es difcil de demostrar que estos genes virales que codifican para las protenas que inhiben la presentacin de MHC clase I son genes de virulencia o patogenicidad de dichos virus. Un ejemplo de esta compleja interaccin es la adaptacin del sistema inmune de los mamferos para reconocer clulas deficientes en MHC clase I, de esta manera los virus tratan de evadir la respuesta inmune de los LTc inhibiendo MHC clase I, pero los linfocitos NK han desarrollado la capacidad para responder ante la ausencia de MHC clase I en las clulas infectadas por virus. El resultado de este continuo evolutivo determina si los virus o sus huspedes logran el control celular.

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3.3.5. Simulacin molecular Debido a la homologa que poseen ciertos genes y protenas virales con genes y protenas celulares, estas protenas virales pueden interactuar con elementos de la respuesta inmune bloqueando su efectividad y permitiendo la evasin y muchas veces provocando enfermedad. Ejemplos son la modulacin de la presentacin y reconocimiento en el caso de la protena viral CMV que se une a la beta 2 microglobulina por poseer un dominio homlogo al MHC. 3.3.6. Inmunosupresin e infeccin viral Algunos virus infectan clulas del sistema inmune, impidiendo su funcin y dando como resultado la inhibicin de la respuesta inmune especfica. El ejemplo ms representativo son las infecciones por VIH, en las que se produce severa inmunodeficiencia por destruccin de las clulas CD4+ infectadas, lo que se manifiesta clnicamente en el sndrome de la inmunodeficiencia humana (SIDA). Tambin se ha descrito inmunosupresin en infecciones virus EpsteinBarr, en las que la expresin de un gen viral homlogo al gen celular que codifica para la IL-10, sera responsable de los efectos inhibitorios de la respuesta inmune, los que son similares a los de esta citoquina.

LECTURAS SUGERIDAS Abbas, A. K.; Liehtman, A.H.; Pober, J. S., Cellular and molecular Immunology, Chapter 15, Editorial W.B. SAUNDERS, 2001. Dietz, M., Viral Cytokines, The Oncologist 5: 77-80, 2000. Gianani, R., Savetnik, N., Viruses, Cytokines, Antigens and autoimmunity, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A.; 93:2257-2259, 1996. Roitt, I.; Brostoff, J.; Male, D., Inmunologa, Captulo 16: Inmunidad frente a virus, bacterias y hongos, Tercera edicin, 1991. Stites, D.P., Abba, L.T., Basic and Clinical Immunology, Chapter 50, Sptima edicin, 1991.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 35
INMUNIDAD FRENTE A PARSITOS
Ulises Vergara C. y Jorge Gonzlez C.

1. Introduccin 2. Respuesta inmune frente a protozoos 2.1. Desarrollo de inmunidad protectora 2.2. Activacin de macrfagos infectados 2.3. Activacin de linfocitos T CD8+ 2.4. Rol de los anticuerpos en el control de protozoos 3. Respuesta inmune frente a nemtodos intestinales 3.1. Aspectos generales de la respuesta inmune 3.1.1. Enterocitos 3.1.2. Inmunoglobulinas 3.1.3. Linfocitos 3.1.4. Clulas mieloides

3.2. Respuesta Th2 y proteccin inmunolgica 3.2.1. Mecanismos efectores y resistencia a la infeccin 3.3. Respuesta Th1 y susceptibilidad a la infeccin 4. Respuesta inmune frente a tremtodos intestinales 4.1. Inmunidad protectora frente a Schistosoma 4.1.1. Eosinfilos 4.1.2. Macrfagos 4.2. Inmunidad en la rata 4.3. Inmunidad en el ratn 4.4. Interferencia con la inmunidad

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RESUMEN En este captulo se describe los mecanismos efectores asociados con resistencia a un grupo selecto de parsitos y se ha enfocado particularmente en parsitos que ilustran la diversidad de los mecanismos efectores que contribuyen a inmunidad protectora. La respuesta inmune requerida para eliminar protozoos intracelulares es bastante distinta de aqulla requerida para controlar nemtodos intestinales y pueden dividirse en respuestas tipo Th1 y Th2. Sin embargo, mientras la respuesta de tipo Th1 controla las infecciones por protozoos intracelulares, la respuesta Th2 controla infecciones por nemtodos intestinales.

1. INTRODUCCIN Los organismos cuya forma de vida depende de la colonizacin de otro individuo, deben vencer diversos obstculos para lograr su objetivo de instalacin en un rgano o tejido que le proporcione las condiciones necesarias para reproducirse y completar su ciclo biolgico. De esta manera, la evolucin del parasitismo como forma de vida, ha requerido el desarrollo de una gran variedad de adaptaciones biolgicas que permiten que la fisiologa del parsito coincida, al menos en parte, con la fisiologa del hospedero del cual obtendr los metabolitos que le son indispensables para completar su ciclo biolgico. As, los parsitos han desarrollado nuevas y complejas vas metablicas pero al mismo tiempo han perdido otras y, aunque en muchos casos se desconocen las ventajas o desventajas de estos cambios, su conocimiento es fundamental para el desarrollo de nuevas estrategias quimioteraputicas que permitan bloquear el desarrollo del parsito. La sobrevida de un parsito depende de un delicado equilibrio entre sus propiedades inmunognicas y los mecanismos efectores de respuesta inmune del hospedero. Un parsito exitoso debe ser inmunognico y, por lo tanto, capaz de inducir una respuesta inmune que mantenga el nmero de parsitos en niveles compatibles con la sobrevida del hospedero Al mismo tiempo, el parsito debe ser capaz de evadir los mecanismos de defensa del individuo colonizado y, durante los millones de aos de coevolucin con el sistema inmune, los parsitos han desarrollado diversas estrategias para evadir, desviar, suprimir o mani-

pular en su propio beneficio, la respuesta inmune del hospedero. Un individuo infectado, debe a su vez poner en marcha mecanismos de regulacin de la respuesta inmune que le permitan controlar el curso de la infeccin y /o de la enfermedad y limitar el eventual dao de una respuesta incontrolada. Como consecuencia de las complejas interacciones hospedero-parsito, las infecciones parasitarias pueden convertirse en cuadros crnicos y progresivos que debilitan de manera severa la salud del hospedero, o en infecciones latentes que, luego de la resolucin de la fase aguda, persisten durante la vida del individuo sin causar sntomas o signos clnicos de enfermedad (a menos que el hospedero haga un cuadro de inmunodeficiencia o inmunodepresin). El conocimiento, tanto de las caractersticas del ciclo de vida y la variabilidad biolgica del parsito, como de sus distintas formas de interaccin con el organismo hospedador, son esenciales para establecer mtodos de control y eventual erradicacin de las enfermedades parasitarias. Sin embargo cualquier intento de control y eventual erradicacin de las infecciones de origen parasitario, deber siempre considerar la utilizacin de estrategias mltiples y complementarias como: 1. Reduccin o eliminacin del agente parasitario por farmacoterapia 2. Reduccin de la contaminacin ambiental mediante educacin sanitaria y mejoramiento de la vivienda y de las condiciones nutricionales y sanitarias de la poblacin

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3. Reduccin de los hospederos intermediarios y modificacin de su hbitat 4. Reduccin de la exposicin al riesgo de contaminacin o infeccin 5. Desarrollo de estrategias inmunolgicas que permitan controlar el curso de la infeccin y/o de la enfermedad. Los mecanismos efectores innatos y adquiridos, necesarios para la proteccin inmunolgica contra cualquier infeccin parasitaria, son bastante variados y dependen de las caractersticas especficas de cada parsito, como son su forma de entrada y localizacin en el hospedero, su ciclo biolgico, los estadios infectantes y las diferentes estrategias de evasin de la respuesta inmune. La respuesta inmune innata, que reconoce patrones moleculares parsito-especficos, rara vez proporciona proteccin contra la infeccin pero desempea un importante papel, tanto en la puesta en marcha de seales tempranas de alarma que alertan al hospedero respecto de la presencia de un organismo invasor, como en el subsecuente desarrollo y regulacin de una respuesta inmune especfica. La regulacin de los distintos mecanismos efectores especficos permitir que ellos puedan luego operar simultneamente en el curso de la infeccin o de manera restringida en funcin de las diferentes fases del ciclo de vida del parsito, de sus distintas formas infectantes o de sus diferentes localizaciones tisulares. Entender la complejidad de los mecanismos efectores que se ponen en marcha durante una infeccin parasitaria y determinar cul de ellos resulta crucial para el control de la infeccin, es fundamental para el desarrollo de terapias eficaces que conduzcan al control de las enfermedades parasitarias. En el presente captulo, se describen los aspectos ms relevantes de la respuesta inmune frente a protozoos y helmintos parsitos. Se analiza primero la respuesta inmune frente a protozoos intracelulares como Leishmania, Toxoplasma, y Trypanosoma cruzi, que aunque pueden encontrarse fuera de las clulas, desarrollan una parte sustancial de su vida dentro de las clulas del hospedero mamfero, y gatillan una respuesta inmune polarizada de tipo Th1, que resulta crucial para el control de la infeccin. Se discute luego la respuesta inmune frente a la infeccin por helmintos y el repertorio de mecanismos efectores necesarios para la eliminacin de estos parsitos multicelulares.

2. RESPUESTA PROTOZOOS

INMUNE FRENTE A

Aunque Leishmania, Trypanosoma cruzi, Toxoplasma gondii y Cryptosporidium, son todos protozoos intracelulares, ellos difieren substancialmente en sus ciclos de vida. Leishmania existe en dos estadios distintos, los promastigotes metacclicos y los amastigotes. Los promastigotes son formas alargadas, flageladas y extracelulares que se multiplican en el intestino de las hembras del insecto vector (de los gneros Phlebotomus y Lutzomya) para migrar luego a la parte anterior del insecto, donde permanecern hasta ser inoculados en un nuevo hospedero vertebrado. Una vez inoculados en un hospedero mamfero, los promastigotes invaden rpidamente macrfagos y otras clulas del linaje monocito-macrofgico, transformndose en amastigotes ovalados e inmviles, que se multiplican en el citoplasma de la clula infectada (figura 35-1)

Figura 35-1. Ciclo biolgico de Leishmania. Leishmania es un protozoo parsito, que tiene un ciclo de vida dimrfico que incluye promastigotes flagelados y extracelulares , que se multiplican en el intestino del insecto vector (de los gneros Phlebotomus y Lutzomya) y amastigotes inmviles eintracelulares que residen y se multiplican en macrfagos y otras clulas del hospedero mamfero.

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En Trypanosoma cruzi, las formas infectantes (tripomastigotes metacclicos) son transmitidas por las deyecciones de insectos vectores reduviideos (Triatoma, Rhodnius y Panstrongylus y pueden introducirse al organismo a travs del orificio de la picadura, heridas o escoriaciones de la piel o atravesando directamente la mucosa ocular, nasal o bucal y de manera anloga a Leishmania, los parsitos invaden macrfagos transformndose en amastigotes intracelulares que se multiplican activamente por fisin binaria. Sin embargo, a diferencia de Leishmania, T. cruzi pueden invadir todas las clulas nucleadas y despus de varios ciclos de divisin intracelular, los organismos se transforman en tripomastigotes flagelados, que abandonan las clulas infectadas y circulan libres en la sangre. Los tripomastigotes pueden reinvadir otras clulas, repitiendo as varias veces el ciclo de divisin intracelular (figura 35-2). Toxoplasma gondii, tiene por su parte un ciclo de vida ms complejo que Leishmania o T. cruzi. En el citoplasma de clulas del epitelio intestinal del gato, los parsitos desarrollan procesos de reproduccin sexual que culminan con la produccin de ooquistes, que se vuelven infectivos despus ser expulsados al medio con las deposiciones del hospedero. Toxoplasma puede multiplicarse sexualmente slo en el intestino del gato y otros felinos, pero sus ooquistes pueden infectar una gran variedad de especies vertebradas en las cuales los parsitos invaden el epitelio intestinal y se transforman en taquizoitos, que entran en rpida multiplicacin. Los parsitos pueden entonces diseminarse siendo capaces de invadir cualquier clula nucleada del organismo. Una vez que una respuesta inmune eficaz se ha establecido, un estadio parasitario de lenta divisin, el bradizoto, puede sobrevivir dentro de los quistes. As, la infeccin por Toxoplasma presenta a menudo una fase aguda, asociada con rpida multiplicacin de taquizotos, y una fase crnica, donde quistes que contienen bradizotos persisten en el husped, generalmente de por vida (figura 35-3). Cryptosporidium sp., infecta a diferentes especies de animales incluyendo el hombre, que adquiere la infeccin al ingerir alimentos o aguas contaminadas con ooquistes del parsito. A nivel del epitelio intestinal los parsitos desarrollan procesos de reproduccin asexual y luego de reproduccin sexual que culminan con la produccin y liberacin de ooquistes maduros que se

Figura 35-2. Ciclo de vida de Trypanosoma cruzi. En el intestino de insectos reduviideos (Triatoma, Rhodnius y Panstrongylus), el parsito se multiplica en forma de epimastigotes que dan luego origen a numerosos tripomastigotes metacclicos que constituyen las formas infectantes para el hospedero vertebrado. Los tripomastigotes son transmitidos por las deyecciones del insecto vector y pueden introducirse en el hospedero a travs del orificio de la picadura, a travs de heridas y escoriaciones en la piel o directamente a travs de la mucosa ocular, nasal o bucal. Los parsitos invaden macrfagos y clulas de diversos tejidos, transformndose en amastigotes intracelulares que se multiplican activamente para dar luego origen a tripomastigotes flagelados que abandonan la clula infectada y pueden circular libres en la sangre para invadir nuevas clulas.

eliminan con las deposiciones del hospedero infectado. Adems de las obvias diferencias en sus ciclos de vida, estos parsitos utilizan diferentes estrategias para sobrevivir dentro de las clulas del hospedero. Por ejemplo, T. cruzi secreta una hemolisina, que asociada a la accin de una transialidasa, facilita el escape del parsito desde el fagolisosoma al citoplasma, evitando as el ambiente txico producto de la fusin de lisosomas

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Figura 35-3. Ciclo biolgico de Toxoplasma gondii. En las clulas epiteliales del intestino del hospedero definitivo, las formas infectantes (quistes, ooquistes y taquizoitos) se multiplican primero asexualmente por esquizogonia y luego sexualmente por esporogonia, para generar ooquistes que son eliminados con las heces del gato. El hombre y diversos mamferos ingieren el parsito por va oral y a partir de ooqistes se generan taquizoitos que invaden las clulas del hospedero para reproducirse y generar numerosos taquizoitos o quistes con bradizoitos.

al fagosoma. Toxoplasma crea su propia vacuola parasitfora, que impide la fusin con lisosomas. En contraste, Leishmania ha desarrollado mecanismos de resistencia que le permiten sobrevivir incluso despus que el fagosoma se ha fusionado con los lisosomas. Por su parte, Cryptosporidium, a diferencia de otros patgenos intracelulares no se localiza en el citoplasma, puesto que invade las clulas localizndose justo entre la membrana celular y el citoplasma. Las consecuencias inmunolgicas de estas diferencias se traducen en que protenas de T. cruzi y Toxoplasma parecen entrar ms rpidamente en la va de presentacin antignica por molculas MHC de clase I, generando as una respuesta inmune protectora que involucra la participacin de linfocitos T citotxicos. En la leishmaniasis, tambin opera la va de presentacin MHC de clase I, sin embargo, no est claramente definido el rol

que clulas T CD8+ parsito-especficas, juegan en la proteccin contra la infeccin por Leishmania. En el caso de Cryptosporidium, la respuesta inmune del hospedero no es del todo conocida, pero parece involucrar mecanismos de presentacin antignica tanto en el contexto de molculas MHC de clase I como de clase II. Por ltimo es necesario sealar que la resistencia contra todas estas infecciones parasitarias, requiere la participacin de clulas T CD4+. 2.1. Desarrollo de inmunidad protectora La IL-12 juega un papel central en el desarrollo de inmunidad protectora contra estos protozoos intracelulares, promoviendo la polarizacin hacia una respuesta Th1 y la produccin de IL-2 e IFN-. Los macrfagos y las clulas dendrticas (CDs) son las principales fuentes de

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IL-12, y se piensa que la infeccin o la exposicin a productos moleculares de los parsitos inducen la produccin de estas citoquinas. Sin embargo, la infeccin in vitro de macrfagos con promastigotes metacclicos o con amastigotes de Leishmania no induce la produccin de IL-12, aunque DCs s puede producir IL-12 despus de la infeccin con el parsito. Es ms, la infeccin de macrfagos puede suprimir la produccin de IL-12 estimulada por algunos productos moleculares de Leishmania. La bsqueda de una explicacin para este fenmeno permiti establecer que la unin de CD40 con linfocitos T que expresan el ligando CD40L, constituye una seal crtica de coestimulacin que conduce a la produccin de IL-12, como lo sugiere el hallazgo que ratones deficientes en CD40 o CD40L son susceptibles a infeccin y que esta susceptibilidad puede ser revertida mediante el tratamiento con IL-12. Ms recientemente, otra va crtica que lleva a la produccin IL-12, parece involucrar la participacin de quimioquinas. As, se ha observado que lisados de Toxoplasma son capaces de estimular la produccin de MIPla y MIP1b que constituyen ligandos para el receptor de quimioquinas CCR5 y que la unin de CCR5 a clulas dendrticas, conduce a la produccin de IL-12. La importancia de esta va de activacin en iniciar el desarrollo de una respuesta inmune protectora fue demostrada por la observacin que ratones deficientes en CCR5 son ms susceptibles a infeccin por Toxoplasma gondii. Cryptosporidium parvum, causa inflamacin de la mucosa intestinal con numerosos neutrfilos intraepiteliales e importantes infiltrados de neutrfilos y clulas mononucleares en la lmina propia. Las clulas epiteliales humanas son capaces de secretar y expresar IL-8 y la quimioquina del tipo CXC denominada GRO- (Growthrelated oncogene ) y se ha observado que en la infeccin por C. parvum la respuesta de quimioquina CXC es ms tarda que la observada en la infeccin con otros protozoos intestinales y no parece participar como un mecanismo efector sino ms bien en el reclutamiento y activacin de diversas poblaciones celulares. De igual manera, la actividad de quimioquinas del tipo CC parece ser importante para el hospedero, en las infecciones por T. cruzi. As, estudios in vitro han mostrado que quimioquinas como RANTES, MIP-1 y MIP-1 aumentan la captura y destruccin intracelular de tripomasti-

gotes por macrfagos humanos. Resultados similares se han obtenido, tanto in vivo como in vitro utilizando el modelo murino. Las quimioquinas parecen inducir actividad tripanocida mediante la produccin de xido ntrico (NO). Considerando que todos estos parsitos intracelulares pueden infectar clulas presentadoras de antgeno, la activacin de clulas de T CD4 + pueden explicarse por interaccin con macrfagos o CDs que han sido infectadas o que han tomado contacto con parsitos muertos. Las quimioquinas parecen jugar un papel importante en la migracin de CDs que han capturado parsitos o antgenos parasitarios en los sitios perifricos de infeccin y los llevan a los ganglios linfticos para su presentacin a linfocitos T CD4+. As, la protena quimiotctica MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein-1) se produce tempranamente en la infeccin por Leishmania y parece contribuir a la migracin de CDs, puesto que en ratones deficientes en CCR2, la migracin de CDs se encuentra afectada y este deterioro contribuye a aumentar la susceptibilidad de los ratones a la infeccin por Leishmania major. Por otro lado, luego de una inyeccin intravenosa con antgeno de Toxoplasma, las CDs se movilizan desde la pulpa roja y las zonas marginales del bazo a las regiones de clulas T de los linfondulos periarteriales, y esta migracin depende de la expresin del receptor de quimioquinas CCR5. Existe consenso que en las infecciones por Cryptosporidium, los mecanismos responsables de la eliminacin del parsito del tracto intestinal requieren la participacin IFN- puesto que ratones knockout para IFN- desarrollan un parasitismo masivo de todo el intestino y mueren en dos a tres semanas luego de una infeccin experimental con C. parvum mientras los controles se muestran libres de la infeccin hasta por treinta das. Adems, distintas cepas de ratones presentan diferencias significativas en la sobrevida a la infeccin con el parsito y estas diferencias se asocian a su habilidad en producir IFN-. Estudios utilizando ratones con insuficiencia severa combinada (ratones SCID), mostraron que estos ratones permanecen infectados por largo tiempo sin muestras de enfermedad, mientras los ejemplares incapaces de producir IFN- mueren rpidamente. De igual manera, clulas T CD4+ participan en la resolucin tanto de las formas agudas como crnicas de la infeccin en ratones, puesto que la inmunidad es dependiente del aumento en el nmero de clulas T CD4+ en la poblacin de linfocitos

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intraepiteliales del intestino y la subsecuente generacin de IFN-. 2.2. Activacin de macrfagos infectados La actividad microbicida de macrfagos es un mecanismo efector primario que lleva al control de patgenos intracelulares. Los macrfagos activados muestran cambios importantes que incluyen el aumento en la expresin de molculas MHC de clase II, aumento en la actividad fagoctica y generacin de radicales libres altamente txicos. Mientras los reactivos intermediarios de oxgenos (ROls) y los reactivos intermediarios de nitrgeno (RNIs), son efectivos agentes microbicidas, el xido ntrico parece particularmente importante en el control de parsitos intracelulares. El xido ntrico se genera a partir L-arginina en una reaccin catalizada por la forma inducible de la enzima xido ntrico sintetasa (iNOS). Ratones deficientes en la enzima (iNOS - /-) son altamente susceptibles a la infeccin con L. mayor o T. cruzi. Ms an, una comparacin directa de la importancia relativa de ROIs y RNIs en el control de la infeccin por L. donovani, mostr que aunque ROIs puede contribuir al control del parsito en etapas tempranas de la infeccin, xido ntrico es la molcula efectora de central importancia en el control de L. donovani. En contraste, la infeccin de ratones iNOS / - por Toxoplasma, muestra un cuadro ms complejo, dado que la resistencia a estas infecciones se asocia tanto con mecanismos iNOS dependientes como con mecanismos iNOS independientes. As, los ratones knockout para iNOS son capaces de controlar Toxoplasma durante la fase aguda de la infeccin, pero mueren durante la fase crnica. Sin embargo, luego de la vacunacin con cepas avirulentas de Toxoplasma, los ratones knockout para iNOS resultan tan resistentes como los ratones normales en el control de la infeccin con formas virulentas del parsito. La importancia de xido ntrico en la resistencia a la infeccin con protozoos intracelulares es, por lo tanto, relativa y depende del parsito intracelular que se examina y de la fase de la infeccin que se analiza. El modelo actualmente aceptado para explicar la activacin de macrfagos, sugiere que IFN es una citoquina fundamental en la activacin de estas clulas, an cuando otras citoquinas como TNF pueden facilitar este proceso. Ratones

depletados de IFN- por administracin de anticuerpo monoclonal anti-IFN- o lratones knockout para IFN- son altamente susceptibles a la infeccin con Leishmania, Toxoplasma, y T. cruzi. La importancia de TNF en el control de la infeccin por parsitos intracelulares, se estableci al observar que ratones deficientes en el receptor de TNF (ratones TNFR), son altamente susceptibles a la infeccin con Leishmania o Toxoplasma. Sin embargo, ratones knockout TNFRp55 y TNFRp55p75 infectados con L. major son capaces de controlar y eliminar la mayora de los parsitos, sugiriendo que seales accesorias como la interaccin CD40/CD40L, podran compensar la ausencia de TNF. Un papel crtico para TNF en el control de parsitos intracelulares se observ luego de la infeccin con L donovani de ratones deficientes en IFN-, los cuales resultaron inicialmente mucho ms susceptibles a la infeccin con el parsito. Sin embargo, despus de 8 semanas de infeccin, la replicacin del parsito fue parcialmente controlada. En estos ratones knockout para IFN-, el control temprano de la infeccin, puede ser inducido mediante la administracin de IL-12, pero no mediante la administracin de IL-12 ms anticuerpos anti-TNF. Mientras la mayora de los estudios de parsitos intracelulares se han centrado en los macrfagos, es evidente que Toxoplasma y T. cruzi infectan adems otras clulas distintas de los fagocitos, pero que igualmente requieren eliminar los parsitos para controlar la infeccin. Se ha sugerido que xido ntrico proveniente de macrfagos activados situados en la vecindad de las clulas infectadas, puede matar parsitos en clulas no hematopoyticas. La creacin de quimeras de mdula sea entre ratones normales y ratones deficientes en el receptor para IFN- (IFNR), permiti establecer que la resistencia a la infeccin con Toxoplasma, es dependiente de la expresin del receptor para IFN-, tanto en clulas hematopoyticas como en clulas no hematopoyticas. Sin embargo, el mecanismo mediante el cual IFN- ejerce sus efectos en clulas no hematopoyticas no est claro. Se ha mostrado que IFN- puede aumentar la actividad de la dioxigenasa de indoleamina en fibroblastos infectados con Toxoplasma, lo que conduce a la degradacin de triptofano necesario para la replicacin de los parsitos. No obstante, esta va no opera en macrfagos humanos ni tampoco en la infeccin

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por T. cruzi. As, los mecanismos independientes de iNOS que operan en el control de Toxoplasma o T. cruzi, permanecen sin definir. Sin embargo, algunas respuestas a este problema podran provenir de los estudios con ratones carentes de protenas ligadoras de GTP (IGTP) que es regulada por IFN-. En efecto, ratones que no poseen esta molcula pueden controlar infecciones por patgenos intracelulares como Listeria monocytogenes y Citomegalovirus, pero son incapaces de controlar infecciones por Toxoplasma. 2.3. Activacin de linfocitos T CD8+ La importancia de las clulas T CD8+ en la resistencia a T. cruzi y Toxoplasma ha sido bien establecida, observndose un aumento en la susceptibilidad a la infeccin en ratones deficientes en clulas T CD8+. Las clulas de T CD8+ reconocen antgenos presentados en el contexto de molculas MHC de clase I, lo que facilita la deteccin de infecciones por patgenos intracelulares en cualquier clula del organismo, aspecto que resulta particularmente importante en el control de infecciones por T. cruzi y Toxoplasma. Los linfocitos T CD8+ secretan citoquinas como IFN- que activa macrfagos, pero son tambin capaces de lisar clulas infectadas, mediante la liberacin de perforina. Ratones knockout para perforina, muestran una significativa mayor susceptibilidad a la infeccin por Toxoplasma durante la fase crnica de infeccin. Sin embargo, los ratones deficientes en perforina, pero vacunados con una cepa avirulenta de Toxoplasma son tan resistentes como ratones controles, a la infeccin con cepas virulentas del parsito. Lo anterior hace pensar que las clulas T citolticas pueden ser importantes para el control de la fase crnica de toxoplasmosis (cuando los quistes estn presentes en el cerebro), pero menos importante durante la fase aguda, cuando los taquizotos se multiplican rpidamente. Un resultado diferente se observa en la infeccin con T. cruzi, donde se encontr que an en las infecciones con cepas avirulentas, se requieren linfocitos T CD8+ para la proteccin contra el parsito. Sin embargo, ratones knockout para perforina y granzima B, son tan resistentes a la infeccin por T. cruzi, como los ratones controles, indicando que las clulas T CD8+ que protegen contra T. cruzi, no requieren de mecanismos de citotoxicidad que involucren perforina o granzima B.

El papel que las clulas de T CD8+ juegan en leishmaniasis es menos claro, puesto que ratones deficientes en clulas T CD8+ pueden resistir la infeccin primaria con L. mayor. Como Leishmania reside dentro del fagolisosoma, podra predecirse que clulas de T CD8+ no se activan durante infeccin. Sin embargo, tanto en infecciones humanas como en infecciones experimentales, por Leishmania las clulas T CD8+ antgeno-especficas se encuentran aumentadas y estudios in vitro muestran que clulas infectadas pueden presentar antgenos a clulas de T CD8+. La importancia de las clulas de T CD8+ en leishmaniasis ha sido demostrada mediante estudios que indican que ellas contribuyen a la resistencia a la infeccin o el desafo secundario y a la resistencia inducida por vacunacin. La manera cmo las clulas de T CD8+ influencian la infeccin por Leishmania no est bien establecida. Sin embargo, estudios in vitro indican que macrfagos infectados no actan como blancos para el citolisis por las clulas T CD8+, sugiriendo que su funcin protectora se asocia ms a la produccin IFN, en lugar de actuar como clulas citotxicas. En Cryptosporidium spp el papel de las clulas T CD8+ no est claro, no obstante parecen jugar algn papel en el control de la infeccin en ratones. 2.4. Rol de los anticuerpos en el control de protozoos La infeccin con T. cruzi, Toxoplasma, o Leishmania se asocia a la produccin de anticuerpos especficos que parecen tener una variedad de funciones, eventualmente involucradas en el control de estos parsitos. Los anticuerpos pueden, por ejemplo, unirse a las formas infectantes que se movilizan de una clula a otra o que circulan libremente circulan en la sangre. Adems pueden neutralizar o modular la invasin de nuevas clulas, de promover la fagocitosis de estas formas parasitarias (opsonizacin), o bien producir su lisis por activacin del sistema del complemento y/o mediante mecanismos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Mientras muchos estudios in vitro han sugerido algn rol de los mecanismos efectores que involucran la participacin de anticuerpos, su importancia en el control de la infeccin, ha sido ms difcil de establecer in vivo. El uso de animales deficientes en clulas B o en receptores Fc (ratones FcR), ha permitido

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mostrar inequvocamente que clulas B y anticuerpos son requeridos para la proteccin contra T. cruzi y Toxoplasma. As, ratones deficientes en clulas B infectados con Toxoplasma, mueren durante la fase crnica de infeccin, mostrando un elevado nmero tanto de taquizoitos, como de quistes en cerebro y pulmones. Los anticuerpos no son, por lo tanto, necesarios para la proteccin durante la fase aguda de la infeccin. Ratones deficientes en linfocitos B, inoculados con Toxoplasma son mucho ms susceptibles a la infeccin que los controles normales. No obstante, el uso de ratones deficientes en FcR y C5 ha permitido establecer que aunque clulas B son esenciales para la resistencia a la infeccin por Toxoplasma, ni la activacin de mecanismos efectores Fc-dependientes o de lisis mediada por complemento, son requeridos para el efecto protector de los anticuerpos. En la infeccin por T. cruzi, los ratones deficientes en linfocitos B sobreviven ms tiempo que los ratones deficientes en clulas T CD4+ o que los deficientes en clulas T CD8+. Sin embargo, los anticuerpos y particularmente aqullos denominados anticuerpos lticos, parecen importantes en el control de la infeccin. Estos anticuerpos, que estn presentes en el suero de pacientes humanos, y en ratones crnicamente infectados, corresponden a IgG de las subclases IgG2a e IgG2b y son generalmente inducidos por parsitos vivos pero no por aqullos que han sido fijados o lisados. De esta forma, cuando tripomastigotes que son habitualmente resistentes a la accin del complemento, se incuban con suero de infectados crnicos que contiene anticuerpos lticos, la IgG se une especficamente a los parsitos hacindolos sensibles a la lisis por complemento. Estudios recientes utilizando ratones deficientes en linfocitos B, indican que estas clulas no participan en la susceptibilidad o resistencia a la infeccin con L. mayor. Sin embargo, estudios con L. amazonensis indican que en ausencia de clulas de B o de FcR, la infeccin por L. amazonensis es menos severa. Estos resultados sugieren que la unin de anticuerpos a los FcR aumenta la captura y sobrevida de los parsitos o que los FcR activan seales de alarma que modulan la respuesta del hospedero frente a la infeccin. Por otro lado, se ha observado que la activacin va FcR conduce a un aumento en la produccin de IL-10, la cual podra regular negativamente el desarrollo de una respuesta inmune protectora.

En infecciones por Cryptosporidium spp., no se han observado diferencias entre ratones normales y aquellos depletados de clulas B, sugiriendo que la sntesis de anticuerpos no cumple un rol en el control de la infeccin.

3. RESPUESTA INMUNE FRENTE A NEMTODOS INTESTINALES El intestino de vertebrados es, para los parsitos nemtodos, uno de los principales sitios ancestrales de invasin, dado que en el curso de la evolucin, la ingestin accidental de vermes o de sus formas infectantes, result un mecanismo simple de acceso a los hospederos vertebrados. La sobrevida de los parsitos en el intestino fue favorecida por la existencia de una oferta nutritiva ilimitada, mientras el desarrollo de su ciclo evolutivo result facilitado por la posibilidad de salida y escape fcil desde el hospedero. De esta manera, an cuando diversos helmintos pueden invadir distintos rganos y tejidos, la mayor parte de ellos residen en el intestino. El intestino se ha mantenido como el sitio ideal para el desarrollo de los parsitos adultos, an cuando el ingreso al hospedero se produzca a travs de la piel y complejos mecanismos de migracin deban ponerse en marcha antes de llegar al intestino. Muchos estudios han demostrado que el intestino no es un simple hbitat para los helmintos. Nemtodos grandes como Ascaris lumbricoides viven en el lumen, mientras especies de menor tamao como las uncinarias y Trichostrogylus, entran en estrecha relacin con la mucosa y por ello se encuentran en condiciones microambientales muy diferentes. Mientras algunas especies viven en la mucosa durante la mayor parte de su desarrollo y slo emergen al lumen como formas maduras, otras permanecen en la mucosa durante todo su ciclo de vida intestinal. Los nemtodos presentan problemas particulares para el desarrollo de una respuesta inmune en el hospedero. Su cutcula es relativamente gruesa y sus movimientos son muy activos y, aunque no son inertes desde el punto de vista inmunolgico ni metablico, su cutcula los protege de la respuesta inmune y slo pueden ser atacados por los orificios naturales. La cutcula es altamente inmunognica y puede ser daada por mecanismos efectores de la respuesta inmune, sin embargo no est claro si esta respuesta desempea algn papel importante en la inmunidad contra pa-

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rsitos intestinales. Adems, es muy probable el desarrollo de una respuesta efectora contra antgenos secretados o excretados por los helmintos. En humanos, se conoce poco respecto a la respuesta frente a helmintos. Datos epidemiolgicos sugieren la existencia de inmunidad adquirida frente a la infeccin; no obstante algunos nemtodos como Trichuris persisten por largo tiempo y la reinfeccin es muy frecuente. Sin embargo, los nemtodos gastrointestinales constituyen uno de los grupos parasitarios ms exitosos, estimndose que en la poblacin humana actual una de cada cinco personas alberga, a lo menos, una de estas especies. La infeccin por estos patgenos generalmente no es fatal, pero constituyen cuadros insidiosos, a menudo con un grado alto de morbilidad, particularmente en nios. Un rasgo particularmente importante de este tipo de infecciones parasitarias (y que la distingue de otras infecciones) es que el grado de infeccin o la carga parasitaria del hospedero, es un reflejo del nmero de eventos de invasin. Los nemtodos intestinales, generalmente no se multiplican dentro del hospedero y la carga parasitaria se adquiere por eventos de infeccin mltiples, y no a travs de un nico contacto con las formas infectantes. La respuesta inmune frente a helmintos difiere claramente de aqulla inducida por protozoos. Los helmintos son organismos pluricelulares de mayor tamao, que no se replican dentro del hospedero. La diferencia en tamao limita los mecanismos efectores de respuesta inmune y la carencia de replicacin tiene repercusiones importantes en las estrategias de sobrevida desarrolladas tanto por el hospedero como por el parsito. Debido a la dificultad para estudiar la infeccin en condiciones naturales, la mayor parte de nuestro conocimiento actual sobre la infeccin por nemtodos intestinales proviene de las investigaciones realizadas en roedores de laboratorio infectados experimentalmente con parsitos tan diversos como Nippostrongy1us brasiliensis, Trichinella spiralis, Trichuris muris, Heligmosomoides, y Polygyrus Strongyloides spp. La mayor parte del trabajo se ha concentrado en modelos en los que luego de la infeccin primaria, ocurre expulsin natural de los parsitos del tracto gastrointestinal (N. brasiliensis de T. spiralis y Strongyloides), aunque interesantes resultados se estn generando en sistemas en los cuales puede ocurrir una infeccin crnica natural (T. muris y de H. polygyrus).

3.1. Aspectos generales de la respuesta inmune La respuesta inmune frente a nemtodos intestinales, tiene relacin inevitable con las condiciones y arquitectura particular del sistema digestivo. De esta manera en la generacin de esta respuesta participan distintas clulas y mecanismos efectores. 3.1.1. Enterocitos El intestino es la principal va de entrada de antgenos al organismo, no slo de aquellos derivados de eventuales parsitos, sino tambin los que son aportados por los alimentos, los contaminantes ambientales y la flora bacteriana. Los enterocitos que forman el epitelio de la mucosa intestinal, constituyen una barrera fsica que adems puede capturar antgenos desde el lumen. Este proceso es an ms activo y eficiente cuando como producto de una inflamacin aumenta la permeabilidad de la capa epitelial. Citoquinas liberadas durante la inflamacin inducen un aumento en la expresin de molculas MHC en los enterocitos, permitiendo que puedan de esta manera participar como clulas presentadoras de antgeno. La captura y transcitosis de antgenos es adems claramente facilitada por la existencia de clulas M, asociadas al epitelio que tapiza las placas de Payer. Los antgenos tambin pueden ser capturados mediante mecanismos que involucran la participacin de anticuerpos presentes en la superficie de la mucosa. 3.1.2. Inmunoglobulinas El principal isotipo de anticuerpos que se encuentran en la mucosa intestinal corresponde a IgA dimrica, la cual puede ser secretada a travs de los enterocitos o junto a la bilis luego de pasar por el epitelio del ducto biliar como ocurre en roedores. Las molculas de IgA permanecen intactas y actan a nivel del lumen intestinal debido a la presencia de la porcin secretora que la protege de la degradacin por proteasas intestinales. La IgM es tambin transportada a travs del epitelio y permanece activa en el lumen intestinal. Por otra parte, IgG es producida localmente por clulas plasmticas localizadas en la lmina propia. A diferencia de IgA, los anticuerpos IgM e IgG son rpidamente degradados por proteasas, no obstante sus fragmentos Fab pueden permanecer funcionales por algn tiempo.

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3.1.3. Linfocitos Una cantidad apreciable de linfocitos T y B estn presentes en la lmina propia del intestino. Las clulas B contribuyen fundamentalmente a la generacin de clulas plasmticas secretoras de las inmunoglobulinas que estarn presentes en el epitelio y el lumen intestinal. Subpoblaciones linfocitarias T CD4+ y T CD8+ se encuentran en la lmina propia, no obstante las clulas T CD4+ parecen ms importantes en trminos de una respuesta antiparasitaria. 3.1.4. Clulas mieloides En la mucosa normal existen diversas clulas efectoras linfoides y no linfoides, que aumentan durante las infecciones parasitarias. Entre ellas se encuentran clulas natural killer, macrfagos, eosinfilos, neutrofilos y adems basfilos y mastocitos. Estas ltimas poseen aminas y otros mediadores as como tambin receptores de alta afinidad para IgE (FcRI). La infiltracin de la mucosa por mastocitos, basfilos y eosinfilos, durante la infeccin es dependiente de la liberacin de citoquinas por parte de linfocitos T especficos. Estas citoquinas y otros mediadores solubles son responsables de la inflamacin intestinal, que tiene obvias consecuencias en la estructura y funcin intestinal, alterando la cantidad y propiedades del mucus intestinal. 3.2. Respuesta Th2 y proteccin inmunolgica Distintos estudios han sugerido que la expulsin de nemtodos intestinales, es principalmente consecuencia de una respuesta asociada a la secrecin de citoquinas TCD4 del tipo Th2. As, en el modelo murino la IL-4 parece desempear un rol importante en la respuesta inmune que permite la expulsin de H. polygyrus y T. muris del intestino delgado de los ratones experimentalmente infectados. Linfocitos T activados en los ndulos linfticos mesentricos durante el curso de la infeccin, resultan fundamentales en la inmunidad protectora contra muchos nemtodos intestinales, incluyendo Trichinella spiralis. Este parsito infecta el intestino y los gusanos adultos liberan larvas que penetran la pared intestinal y se enquistan luego en los msculos esquelticos (figura 35-4). El mecanismo de expulsin del parsito adulto del intestino es un proceso complejo que involucra la

activacin de linfocitos Th2, y mastocitos y la produccin de citoquinas como IL-4, IL-9, IL-10, IL13 e IL-18. Ratones knockout para IL-18 son altamente resistentes a la infeccin con T. spiralis, expulsan ms rpidamente los gusanos adultos y desarrollan niveles ms bajos de enquistamiento larval en el msculo esqueltico. La expulsin de los gusanos se asocia a un alto nmero de mastocitos en la mucosa intestinal y secrecin aumentada de IL-10 e IL-13 Ratones knockout para IL-4 muestran slo pequeas alteraciones en la cintica de expulsin de T. spiralis, en comparacin con los ratones normales no deficientes, sugiriendo que la expresin de IL-4 no es esencial para la expulsin de los gusanos. No obstante, se ha demostrado que la IL-13

Figura 35-4. Ciclo de vida de Trichinella spiralis. El parsito desarrolla su ciclo biolgico en un nico hospedero que puede ser omnvoro o carnvoro. El hombre se infecta al ingerir carne mal cocida, que contiene larvas enquistadas en los msculos esquelticos. La larvas liberadas en el intestino, maduran rpidamente y las hembras fecundadas darn origen a larvas jvenes que va sangunea o linftica migran a los tejidos para enquistarse en los msculos estriados.

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(una citoquina estrechamente relacionada con IL4), parece desempear un rol importante en la expulsin de muchos nemtodos intestinales. Ratones knockout para IL-13, por ejemplo, tardan bastante ms tiempo en expulsar los gusanos del intestino, cuando se les infecta experimentalmente con N. brasiliensis. De la misma manera, ratones doble knockout para IL-4/IL-13 tardan mucho ms en la expulsin de los parsitos, que los ratones con knockout nico. Una situacin similar ocurre en las infecciones experimentales con T. spiralis, puesto que ratones doble deficientes en IL-4/IL-13, muestran un marcado retraso en la expulsin del parsito, lo que no ocurre en ratones normales o en ratones deficientes slo en IL-13. La importancia relativa de IL-4 e IL-13 en la resistencia a nemtodos intestinales es tambin influenciada por el repertorio gentico del hospedero. As, ratones C57BL/6 deficientes en IL-4, son uniformemente susceptibles y desarrollan infecciones crnicas a T. muris, mientras los ratones de tipo silvestre expelen su carga de gusanos. Por otro lado, ratones BALB/c deficientes en Il4, muestran una sensibilidad sexo-dependiente puesto que, mientras los machos desarrollan infeccin crnica, las hembras expulsan sus parsitos. La expulsin de parsitos en estas hembras es mediada por IL-13, como lo muestran experimentos en que se administra la protena de fusin IL13Ra2. La importancia de IL-4/IL-13 y de IL-4Ra en la respuesta a nemtodos intestinales, sugiere una importante funcin para la molcula STAT6 en la generacin de una respuesta protectora. Ratones deficientes en STAT6 son ms susceptibles a T. spiralis que los ratones normales y muestran una deprimida respuesta de mastocitos intestinales y de citoquinas del tipo Th2 y supresin de la sntesis de IgG parsito-especficas. Estos mismos ratones knockout para STAT6 muestran una expulsin retardada de N. brasiliensis, pero en este caso la respuesta de citoquinas y mastocitos no estn deprimida. Adems de IL-4 e IL-13, otras citoquinas (como IL-3 e IL-9) parecen estar tambin involucradas en la proteccin a helmintos intestinales. IL-3 parece importante en la proteccin contra infecciones por Strongyloides y T. spiralis y la utilizacin de ratones transgnicos ha permitido demostrar que IL-9 induce un aumento en la expulsin de parsitos tales como T. spiralis, T. muris, N. brasiliensis y H. polygyrus. En infec-

ciones experimentales con T. spiralis, la resistencia inducida por IL-9 se expresa fundamentalmente mediante la induccin de mastocitosis intestinal, y en modelos de infeccin T. muris, la neutralizacin de IL-9 mediante anticuerpos especficos, induce infeccin crnica en ratones normalmente resistentes. 3.2.1. Mecanismos efectores y resistencia a la infeccin. El rol de las citoquinas producidas por linfocitos Th2 en la expulsin de nemtodos intestinales est bien establecida; sin embargo, permanecen todava sin definir, los mecanismos efectores que conducen a la expulsin de los parsitos. Muchas infecciones parasitarias inducen aumento en el nmero de eosinfilos de los individuos afectados, pero no existe evidencia que sugiera que estas clulas estn de alguna manera involucradas en la proteccin del hospedero. Por otro lado la participacin de mastocitos en la resistencia a los helmintos intestinales, ha sido tambin controversial. La evidencia ms convincente ha surgido de modelos murinos de infeccin experimental con T. spiralis, que demuestran que la supresin de mastocitos, produce un retraso significativo en la expulsin de los parsitos desde el intestino. Por otro lado, ratones deficientes en una proteasa especfica de mastocitos, denominada MMCP1, muestran un retardo significativo en la expulsin de T. spiralis del intestino. Aunque la funcin de MMCP1 permanece sin definir, se ha sugerido que proteasas de mastocitos, podran tener como blanco las uniones firmes existentes entre las clulas del epitelio intestinal. Cambios en la contractibilidad de la musculatura lisa intestinal y cambios asociados al aumento de la permeabilidad intestinal y la disminucin de la absorcin de fluidos, se producen a menudo durante la expulsin de H. polygyrus y T. spiralis. 3.3. Respuesta Th1 y susceptibilidad a la infeccin Las infecciones naturales por nemtodos intestinales tienden a ser cuadros de tipo crnico y muy pocos estudios han investigado los mecanismos responsables de la cronicidad y susceptibilidad a estas infecciones, aunque es cierto que cuando la respuesta de tipo 2 est deprimida, la expulsin de los gusanos est claramente retardada. En condiciones naturales, hay factores como

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la coinfeccin y el estado nutricional del hospedero, que pueden estar involucrados en el desarrollo de resistencia. As por ejemplo, un estudio reciente de infeccin experimental por H. polygyrus, sugiere la importancia de la dieta proteica en la resistencia a la infeccin, puesto que hospederos expuestos a dietas pobres en protena muestran una depresin en la respuesta Th2 y un marcado retardo en la expulsin de los gusanos en comparacin con aquellos animales que recibieron dietas ricas en protenas. Algunos modelos de infeccin experimental inducen de manera natural un cuadro crnico, lo que ha permitido identificar importantes factores asociados a la susceptibilidad a la infeccin. En el modelo T. muris, mientras la mayor parte de las cepas de puras o inbred de ratones expulsan una moderada o alta carga parasitaria, unas pocas cepas fallan en expulsar los gusanos y muestran altos niveles de parasitismo que evoluciona hacia una infeccin crnica. Est ahora claro, que en estos animales, se desarrolla una respuesta dominante de tipo Th1, mediada por IFN-. La neutralizacin de IFN- o IL-12 en cepas susceptibles de ratones induce la expulsin de los gusanos, con un coincidente aumento en la respuesta de tipo Th2. Sin embargo, la administracin de IL-12 a los animales resistentes induce susceptibilidad, la cual es dependiente de IFN-. Ratones knockout para IL-12 son altamente resistentes a la infeccin, como lo son tambin los ratones deficientes en el receptor de IFN-. RKO. Trabajos ms recientes han identificado a IL-18 como el principal factor involucrado en la induccin de susceptibilidad. Las cepas de ratones susceptibles muestran una fuerte y temprana regulacin positiva de los mRNA para IL-18 en el intestino infectado y esto es seguido por una regulacin positiva de IL-12 y IFN-. Ratones deficientes en IL-18 son altamente resistentes a la infeccin, y la administracin de IL-18 induce cronicidad. En este caso, pareciera ser que ms que inducir altos niveles de IFN- la IL-18 podra regular la produccin de IL-13 . La accin de IL-18 podra ser muy sensible a la influencia del medio, ya que datos recientes muestran que IL-18 tambin pueden promover la sntesis de IL-4 y el desarrollo de respuesta Th2. En el modelo H. polygyrus, la mayora de las cepas de ratones desarrollan infecciones primarias crnicas, aunque algunas cepas empiezan a eliminar vermes varias semanas despus de la infeccin. La infeccin primaria crnica est aso-

ciada con una respuesta Th2 y no con un cambio significativo a una respuesta dominante de citoquinas Th1. Sin embargo, es importante notar que la infeccin crnica puede asociarse con una regulacin negativa de ciertas citoquinas Th2, como IL-9 e IL-10 y una regulacin negativa de la mastocitosis intestinal. La base para la regulacin negativa de la respuesta de citoquinas tanto para T. muris como H polygyrus permanece sin definir, pero se piensa que involucra la participacin de factores inmunomoduladores producidos por el parsito. En el modelo de T. muris, hay evidencias que sugieren que el parsito puede producir una citoquina semejante a IFN-. El concepto que los nemtodos del intestino producen y secretan molculas inmunomoduladoras se refuerza mediante la observacin que extractos de N. brasiliensis pueden inducir una fuerte respuesta Th2 en ausencia de infeccin. El modelo de T. muris agrega otra faceta interesante a la induccin de infeccin crnica luego de la exposicin a diferentes niveles de infeccin. En cepas de ratones resistentes, que normalmente expelen una moderada o alta cantidad de gusanos, ello no ocurre en infecciones producidas por bajas cargas parasitarias (10 a 20 gusanos) y tienden a desarrollar cuadros crnicos. El hospedero genera en estos casos una respuesta dominante de tipo Th1, mientras las infecciones con alta carga parasitaria se genera una fuerte respuesta Th2 y resistencia al desafo parasitario. Esta respuesta es adems difcil de alterar an despus del tratamiento con IL-12, que normalmente induce una fuerte respuesta Th1 y por lo tanto susceptibilidad. Tomando estos datos en su conjunto, especialmente aquellos derivados de experimentos con bajos niveles de infeccin y que ms estrechamente reflejan lo que ocurre en infecciones naturales, es posible sugerir que bajos niveles de infeccin llevan a susceptibilidad mientras que repetidos desafos con bajos inculos pueden llevar a resistencia. Esta condicin de resistencia es difcil de alterar una vez que es adquirida. 4. Respuesta inmune frente a tremtodos intestinales Un paradigma en el estudio de la respuesta inmune a tremtodos es el modelo de infeccin por ejemplares del gnero Schistosoma. Los esquistosomas son platelmintos tremtodos que viven en los vasos sanguneos tanto en hospederos mamferos como en aves. La mayora de los

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tremtodos son hermafroditas, pero los esquistosomas presentan dimorfismo sexual. Su ciclo evolutivo es indirecto e involucra la participacin de caracoles como hospederos intermediarios (figura 35-5). Los huevos son liberados por las hembras hacia las deposiciones o la orina, dependiendo de la especie de esquistosoma. En contacto con el agua, se libera el miracidio mvil que debe entrar en contacto con un caracol para continuar su ciclo biolgico. En el caracol se desarrolla el esporocisto, que genera una segunda generacin de esporocistos y luego las cercarias. Durante este proceso de reproduccin asexuada, el parsito aumenta en nmero y en potencial reproductivo. Por ejemplo, en Schistosoma mansoni, un esporocisto es capaz de generar 200.000 cercarias. Las cercarias abandonan el caracol y constituyen las formas infectantes que penetran activamente la piel de su hospedero definitivo. Esta fase del ciclo de vida va acompaada de profundos cambios en la estructura y fisiologa de la cercaria, que se transforma en un estadio denominado esquistosmula. La esquistosmula migra va vasos sanguneos hacia los pulmones y desde all al hgado, donde alcanza el estado adulto. Los vermes adultos se aparean y migran a las venas mesentricas o hacia aquellas localizadas en las cercanas de la vejiga. Los adultos viven 5 a 6 aos liberando entre 300 (S. mansoni) y 3000 (S. japonicum) huevos por da. Los huevos son depositados en vasos de pequeo dimetro donde quedan atrapados. El miracidio se desarrolla precozmente dentro del huevo, de manera que enzimas secretadas por este estadio facilitan el pasaje del huevo a travs de los tejidos hasta el intestino o la vejiga. Los hospederos son infectados por un elevado nmero de vermes y por un largo perodo de tiempo, de esta forma la infeccin est asociada a una respuesta inmune amplia y variada. La penetracin inicial de las cercarias produce escasa respuesta, no obstante en infecciones masivas puede existir respuestas de hipersensibilidad local. Entonces, aunque el desarrollo inicial puede estar asociado a reacciones alrgicas, generalmente la primera respuesta evidente es aquella derivada de la produccin y liberacin de los huevos. La liberacin constante de estos, induce una fuerte respuesta de tipo celular y lleva tambin a procesos inmunopatolgicos. Los gusanos adultos no son directamente patognicos pero son fuertemente inmunognicos, al liberar antgenos de su tegumento, de su intestino y aquellos derivados de su metabolismo.

Figura 35-5. Ciclo biolgico de Schistosoma. Las formas larvales o cercarias que nadan libremente en aguas infectadas, pueden penetrar a travs de la piel humana, convirtindose en equistosmulas que va circulatoria viajan a los pulmones y luego al hgado, donde se convertirn en gusanos adultos y maduros. Desde el hgado los parsitos migran hasta los vasos sanguneos del intestino, donde luego de reproducirse sexualmente, darn origen a numerosos huevos que son expulsados a travs de las deposiciones u orina del hospedero. En el agua, los huevos dan origen a larvas ciliadas o miracidios que al entrar en un caracol, que acta como hospedero intermediario, se reproducen asexualmente generando esporoquistes a partir de los cuales se originan finalmente las cercarias infectantes para diversos hospederos mamferos.

4.1. Inmunidad protectora frente a Schistosoma En el hombre, existen claras evidencias acerca de la existencia de inmunidad adquirida y resistencia a la infeccin. El hecho que los individuos sobreviven en reas endmicas con elevada transmisin y la observacin de que los niveles de infeccin llegan a un equilibrio despus de la segunda dcada de vida, se consideran evidencias de tal inmunidad. De igual manera se acepta que la habilidad para expresar esa resistencia se desarrolla de manera paulatina y que los niveles de

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resistencia varan de un individuo a otro. Estudios en diferentes poblaciones humanas han mostrado que la resistencia a la infeccin aumenta con la edad y que la respuesta inmune especfica incluye la participacin de IgE, eosinfilos, IL-4 e IL-5, lo que se asocia adems a bajos niveles de reinfeccin luego de la quimioterapia. En modelos animales existe clara evidencia que la inmunidad depende del tipo de hospedero utilizado. Frente a la infeccin experimental por S. mansoni, monos y ratones desarrollan una fuerte respuesta inmune y aunque la infeccin primaria persiste por varios meses, los individuos se hacen resistentes a las reinfecciones. En ratas se desarrolla una respuesta inmune capaz de erradicar la infeccin primaria y de inducir una fuerte resistencia a la reinfeccin. Los monos Rhesus son capaces de destruir la mayora de los vermes de S. mansoni producidos en la reinfeccin, pero son incapaces de eliminar aquellos establecidos en la infeccin inicial. De igual manera, la inmunidad a la infeccin puede estimularse por exposicin de los monos a cercarias irradiadas o por trasplante de vermes adultos al sistema vascular. As la inmunidad a la reinfeccin puede ser estimulada por los gusanos adultos para actuar contra los estadios larvales, sin afectar a los adultos (fenmeno de inmunidad concomitante). Hoy se acepta que la inmunidad concomitante frente a esquistosomas se manifiesta en diferentes hospederos y resulta por lo tanto particularmente interesante establecer los mecanismos que permiten a los vermes adultos evadir la respuesta inmune y los mecanismos efectores que conducen a la destruccin de las cercarias. Estudios in vitro han mostrado que una variedad de mecanismos efectores que involucran clulas y anticuerpos, pueden actuar contra las larvas de equistosomas. As, las esquistosmulas pueden ser destruidas por lisis mediada por complemento. La interaccin de las clulas efectoras con las larvas opsonizadas ocurre por medio de receptores para Fc y/o C3b. Aunque varias clulas actan contra las esquistosmulas in vitro, los tipos celulares ms importantes son macrfagos y eosinfilos 4.1.1. Eosinfilos Cuando las larvas se exponen a anticuerpos especficos y se activa el sistema del complemento, la adherencia de eosinfilos a la larva puede ocurrir por medio de receptores para Fc o C3b.

Los eosinfilos unen molculas de IgE mediante receptores de baja afinidad FcII, lo que les permite adherirse a la larva reconociendo la porcin Fc de las IgE que se han unido a antgenos larvales especficos. En la rata, se han descrito reacciones ADCC con participacin de eosinfilos e IgG2a que se producen durante las primeras 6 semanas de la infeccin, puesto que ms tarde IgE ser el anticuerpo predominante. Las IgG reconocen antgenos presentes en el tegumento tanto en larvas como en parsitos adultos, y esto explica por qu los gusanos adultos generan inmunidad contra las larvas. Los anticuerpos IgG2a pueden tambin unirse a mastocitos y la destruccin de esquistosmulas por eosinfilos y anticuerpos es estimulada en presencia de mastocitos Este fenmeno que se asocia a la liberacin de tetrapptidos como el factor eosinoflico quimiotctico de anafilaxis (ECF-A). La participacin de IgA en reacciones de ADCC con participacin de eosinfilos tambin ha sido descrita y luego de adherirse a la larva, estas clulas quedan en estrecho contacto con el tegumento del parsito, y sus grnulos de secrecin de la clula se localizan adyacentes a la zona de contacto, se fusionan con la membrana celular y su contenido se vierte sobre el verme. Estos grnulos contienen una variedad de mediadores incluyendo enzimas como peroxidasa y fosfolipasa B y la llamada protena bsica principal, todas las cuales tienen efecto deletreo para el tegumento. As la permeabilidad del tegumento parasitario es seriamente alterada y los eosinfilos pueden tambin invadir activamente el tegumento. Se ha demostrado adems que los eosinfilos pueden expresar molculas coestimulatorias como CD28 y CD86 y participan en la secrecin selectiva de citoquinas Th1 como IL-2 y IFN-. Estudios inmunoepidemiolgicos han mostrado, que en el hombre existe correlacin entre niveles de anticuerpos IgE y resistencia a la reinfeccin. Se ha mostrado que eosinfilos, macrfagos y plaquetas son capaces de matar esquistosmulas en presencia de IgE. Existe una fuerte evidencia de que reacciones de ADCC mediadas por IgE pueden ser un componente importante de la inmunidad protectora aunque otros mecanismos tambin podran participar y la mayor o menor participacin de un determinado mecanismo puede depender del modelo utilizado. 4.1.2. Macrfagos La muerte de esquistosmulas por macr-

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fagos parece operar de dos maneras distintas. Por un lado, linfocitos T activados liberan IFN- que va a estimular macrfagos con la consiguiente produccin de metabolitos txicos y xido ntrico. El segundo mecanismo es especfico y requiere la participacin de anticuerpos IgE, los cuales no son opsonisantes pero permiten la adhesin del macrfago y la liberacin de enzimas sobre el tegumento del parsito. Entre los mecanismos efectores contra esquistosmulas se encuentra la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (DAC) que resulta muy eficiente contra larvas jvenes. Esta susceptibilidad de las larvas decrece con el tiempo, puesto que el rpido desarrollo de resistencia a la ADCC es fundamental en la sobrevida del parsito, an en infecciones primarias. Aunque anticuerpos no estn presentes en las etapas iniciales de la infeccin, la activacin de la ruta alterna del sistema del complemento resulta en la adherencia de C3b. La prdida de la susceptibilidad se correlaciona con alteraciones en la antigenicidad de la superficie de las esquistosmulas, que conducen a disminuir la unin de anticuerpos y de factores del complemento y el tegumento del parsito muestra una mayor resistencia a los mecanismos efectores de inmunidad. Aunque esquistosmulas son el principal blanco de la respuesta protectora, estadios posteriores (postpulmonares) e incluso adultos pueden ser afectados por la inmunidad. 4.2. Inmunidad en la rata La rata es un hospedero relativamente no permisivo, que desarrolla una fuerte respuesta inmune a la infeccin primaria, de manera que los gusanos adultos no se reproducen y son rpidamente eliminados. De igual modo, la infeccin primaria confiere inmunidad al desafo o a la reinfeccin y los pulmones parecen ser el principal sitio de destruccin de parsitos. Esta inmunidad es dependiente de clulas T, pero se ha mostrado la participacin de anticuerpos y la actividad protectora de sueros inmunes est asociada a los isotipos IgG2a e IgE. Datos obtenidos in vitro muestran que estos anticuerpos participan en reacciones de tipo ADCC en las cuales los eosinfilos juegan un papel central. Estudios de vacunacin utilizando el antgeno recombinante Sm28GST, han confirmado la participacin de IgE en la inmunidad pero han mostrado tambin que IgA pueden participar en la proteccin citotxica dependiente de eosinfilos

4.3. Inmunidad en el ratn El ratn es un hospedero permisivo, en el que se produce la sobrevida y establecimiento de poblaciones reproductivas del verme. La infeccin primaria, lleva al desarrollo de patologa heptica, seguida de la formacin de granulomas alrededor de los huevos que quedan atrapados en los capilares mesentricos. Las infecciones secundarias producen bajo nmero de vermes adultos, pero este fenmeno resulta en parte por la formacin de anastomosis portal y cava que permite una menor poblacin de vermes en el hgado. Los ratones pueden sin embargo ser inmunizados con cercarias y esquistosmulas irradiadas las cuales no maduran a adultos productores de huevos permitiendo el estudio de la inmunidad en ausencia de patologa. En el ratn, la inmunidad inducida por vacunacin es generalmente T-dependiente con participacin de subpoblaciones T CD4+. Las reacciones de ADCC (con participacin de IgG) y la activacin de macrfagos por linfocitos T seran los principales mecanismos efectores, pero es posible que la relevancia de los distintos mecanismos efectores dependa de la localizacin tisular del parsito. Eosinfilos y neutrfilos han sido implicados en la respuesta a nivel de la piel mientras que macrfagos juegan un papel central en el hgado. Estudios de respuesta inmune frente a estadios pulmonares sugieren que la respuesta Th1 es de fundamental importancia. Luego de la estimulacin antignica, estas clulas liberan IFN que activa macrfagos los que interactan con esquistosmulas y otras citoquinas, para iniciar el desarrollo de un foco inflamatorio en el cual la larva es atrapada. El mecanismo de dao mediado por macrfagos involucra intermediarios reactivos de oxgeno, nitrgeno y TNF. La inmunidad es reducida si los ratones infectados se tratan con anticuerpos anti-IFN-. Estudios de inmunoproteccin han mostrado que en el hombre y la rata la proteccin estara dada por mecanismos efectores mediados por subpoblaciones Th2, mientras que en el ratn la inmunidad protectora estara dada por Th1 con la participacin de IFN- e IL-12. Estudios in vitro utilizando tanto clulas humanas como de ratn, sugieren que reacciones ADCC participan en la muerte de las larvas de esquistosoma. Este mecanismo parece mediado por IgE con la participacin de clulas efectoras como eosinfilos y plaquetas. Dado la importante contribucin de IL-

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4 e IL-5 en la induccin de anticuerpos IgE y de eosinofilia, parece claro que una respuesta Th 2 es un respuesta protectora en estas especies. Estudios de proteccin con cercarias irradiadas muestran claramente la importancia de clulas T CD4+ en la resistencia, la cual es claramente dependiente de IFN-. De igual manera, la inmunidad es reducida en ratones deficientes en clulas CD4+, clulas B, IFN- o IL-12, sugiriendo que linfocitos Th1 son particularmente importantes en el desarrollo de una respuesta efectiva contra el parsito. De hecho, ratones vacunados que desarrollan una respuesta Th1 y altos niveles de IL-12 resultan fuertemente protegidos. Aunque los mecanismos que operan en esta proteccin mediada por Th 1, no estn definidos, existe fuerte evidencia que sugiere que podra estar mediada por IFN-, TNF-, macrfagos activados y clulas endoteliales. No obstante, cuando ratones reciben una vacunacin de refuerzo mediante cercarias irradiadas, se desarrolla una mezcla de respuestas Th1/Th 2 con produccin de anticuerpos parsito-especficos y capaces de proteger mediante transferencia pasiva a ratones no inmunizados. Estas observaciones, sugieren que respuestas efectoras Th1 y Th 2 podran contribuir a la inmunidad protectora de ratones vacunados con mltiples dosis. Caractersticas importantes de la respuesta inmune frente a esquistosomas se han conocido mediante el uso de ratones doble knockout que muestran respuestas altamente polarizadas para Th 1 (ratones deficientes en IL10/IL-4) o Th 2 (ratones deficientes en IL-10/IL12). Los hallazgos ms significativos se observaron en animales deficientes en IL-10, los cuales desarrollaron respuesta protectora tanto Th1 como Th 2, con altos ttulos de anticuerpos especficos, alta proliferacin de linfocitos, elevada respuesta inflamatoria pulmonar y aumento en el nmero de clulas productoras de IFN- e IL-4. Estos resultados sugieren que, en esquistosoma, una ptima respuesta inmune no se basa en una respuesta polarizada Th1 o Th2, sino ms bien en la induccin de ambas. Estos hallazgos son semejantes a los obtenidos en animales tratados con IL-12, los cuales al ser expuestos a cercarias irradiadas, muestran un aumento significativo de las respuestas humoral y celular, aunque a diferencia de lo que ocurre con ratones deficientes en IL-10, la IL-12 induce una respuesta polarizada de tipo Th1.

4.4. Interferencia con la inmunidad En las poblaciones humanas expuestas a la infeccin, el desarrollo de inmunidad es lento y depende de la intensidad de la transmisin. Estudios serolgicos de reinfectacin realizados en escolares tratados en reas endmicas, sugieren que el estado de inmunidad es determinado por el balance entre los anticuerpos IgG4 e IgE. La reinfeccin est significativamente reducida en los nios con altos niveles de IgE contra gusanos adultos y mucho ms reducida en aqullos con altos niveles de IgG4. La explicacin para este fenmeno se asocia al hecho que IgG4 bloquea las reacciones ADCC en que participan los eosinfilos y podra adems interferir con otros mecanismos efectores (degranulacin de mastocitos, por ejemplo). El concepto de anticuerpos bloqueadores est bien documentada en la relacin esquistosomahospedero, y en humanos se ha mostrado que anticuerpos IgM dirigidos contra eptopos particulares de la superficie de esquistosoma, bloquean efectivamente la unin de IgG dirigidas contra el mismo eptopo. En ratas el monoclonal IgG2c bloquea la muerte por eosinfilos dependiente del monoclonal IgG2b mientras que en el ratn monoclonales IgM bloquean la ADCC mediada por IgG. Estos anticuerpos bloqueadores muestran especificidad por eptopos de carbohidratos presentes tanto en la larva como en los huevos. Estos anticuerpos originados en respuesta a la infeccin por adultos productores de huevos, interfieren cruzadamente la inmunidad contra las larvas invasivas. La sntesis de un particular isotipo de anticuerpos es regulada por citoquinas producidas por clulas T. Trabajos de infeccin por esquistosoma en el ratn, han mostrado que el comienzo de la producccin de huevos esta asociada a un cambio desde una respuesta predominantemente Th1 a una de tipo Th2, una regulacin negativa de las citoquinas IFN- e IL-2 y un aumento en la produccin de IL-4, IL-5 e IL10. Muchos de los eventos inflamatorios que ocurren en ese momento se pueden asociar al patrn de citoquinas secretado y el balance de citoquinas tambin determina la produccin de determinados isotipos de anticuerpos. La esquistosomiasis es una de las pocas parasitosis en las que la patologa asociada a la infeccin es causada no por la presencia directa del gusano sino por la respuesta inmune e inflamatoria del hospedero. En el dao

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inmunopatolgico, destacan la dermatitis que sigue a la penetracin de las cercarias, la alergia aguda causada por la migracin a travs del pulmn, la fase alrgica tarda observada en infecciones por S. mansoni y las enfermedades por inmunocomplejos. No obstante la entidad mejor estudiada son las reacciones asociadas a la infeccin crnica con S. mansoni la cual es responsable de los importantes cambios que se observan en el hgado. Aunque algunos huevos son eliminados por las heces del hospedero, otros, aunque no permanecen en las venas y capilares mesentricos son capaces de pasar a la vena porta y llegar al hgado donde quedan atrapados en las vnulas presinusoidales. En huspedes crnicamente infectados, los miracidios secretan potentes inmungenos (Antgenos solubles del huevo, ASH), estimulando hipersensibilidad retardada, por lo que cada huevo es foco de produccin del granuloma. Los ASH son liberados por los poros del huevo y corresponden a estructuras complejas de protenas, lipoprotenas, carbohidratos y glicolpidos. Algunos de estos componentes son reconocidos por linfocitos TCD4 que participan en la iniciacin, desarrollo y modulacin del granuloma. Los linfocitos T helper y sus citoquinas al aumento local de macrfagos, eosinfilos y otras clulas inflamatorias, que se localizan alrededor de cada huevo produciendo un foco de inflamacin. Los ASH parecen promover una selectiva respuesta Th2 con liberacin de IL5 responsable de la acumulacin de eosinfilos. La respuesta inmune lleva entonces a la formacin de granulomas, pero tambin protege del dao por hepatotoxinas liberadas por los miracidios. El ataque inmunolgico consigue destruir los miracidios y ratones deficientes en linfocitos T aunque no forman granulomas sufren severo dao heptico, caracterizado por necrosis en las reas inmediatamente vecinas a los huevos atrapados.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 36
VACUNAS
Ulises Vergara y Rosario Billetta

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Introduccin Vacunas naturales o tradicionales Vacunas recombinantes Vacunas anti-idiotpicas Vacunas sintticas Vacunas de DNA Vacunas Genmicas Adyuvantes, inmunomoduladores e inmunogenicidad

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RESUMEN La vacunacin contra diversas enfermedades infecciosas ha sido uno de los mayores xitos en el campo de la inmunologa desde los tiempos de Jenner. Bacterias y virus vivos atenuados que conservan su capacidad de replicacin y su inmunogenicidad pero no su patogenicidad; bacterias y virus muertos que slo conservan su inmunogenicidad; fraccciones antignicas purificadas; protenas, subunidades proteicas y toxinas bacterianas se han utilizado como vacunas para controlar diversos agentes infecciosos. Sin embargo, an cuando estas vacunas han logrado disminuir la incidencia, morbilidad y mortalidad de un gran nmero de enfermedades infecciosas, existen todava enfermedades que son difciles de prevenir y controlar por medios profilcticos, porque no existe una vacuna disponible, o las que existen son menos seguras o menos efectivas de lo deseado. Carencia de suficiente material a partir de fuentes naturales de material biolgico, efectos colaterales adversos, inestabilidad de la vacuna en su forma atenuada, material biolgico contaminante, baja inmunogenicidad de sus componentes y dificultades en su produccin, almacenamiento transporte y forma de administracin, son algunas de las causas que explican la ausencia o baja efectividad de algunas de nuestras vacunas. Los recientes avances en biotecnologa ofrecen hoy en da nuevas posibilidades para el desarrollo de vacunas efectivas basadas en antgenos recombinantes altamente purificados, bacterias o virus recombinantes vivos, anticuerpos anti-idiotpicos que representan imgenes internas de eptopes protectores, fragmentos peptdicos qumicamente sintetizados y vacunas gnicas y genmicas de DNA, que codifican respectivamente, la expresin de antgenos protectores individuales o del repertorio antignico completo en forma de genes

1. INTRODUCCIN La vacunacin contra diversas enfermedades infecciosas ha sido uno de los mayores logros en el campo de la inmunologa desde 1798 cuando Edward Jenner demostr que la inoculacin de virus vivos provenientes del ganado (poxavirus del gnero vaccinia) proporcionaba inmunidad contra la viruela en la especie humana. Este importante hallazgo se bas en la observacin, durante una epidemia de viruela, de la ausencia de la enfermedad en ordeadoras que haban permanecido en contacto con el ganado bovino. Hoy da estos virus estn siendo genticamente manipulados in vitro y utilizados como vectores para la introduccin de diversos determinantes antignicos de manera que su expresin, en las clulas infectadas con el virus recombinante, conduzca al desarrollo de una respuesta inmune protectora contra el agente infeccioso del cual derivan esos antgenos. La vacunacin para prevenir diversas enfermedades infecciosas ha sido practicada por casi

200 aos y el proceso ha sido bastante conservador desde los tiempos de Jenner, manteniendo el objetivo de inducir una respuesta inmune humoral y/o celular que proporcione proteccin frente a la infeccin natural con el patgeno. El inmungeno de eleccin ha sido siempre el agente infeccioso muerto o atenuado y slo en los ltimos 15 aos se han hecho esfuerzos para reemplazar las vacunas que utilizan el patgeno completo por vacunas basadas en subunidades o porciones no viables o no infecciosas que contengan fraccciones antignicas altamente purificadas y todava capaces de inducir una respuesta inmune protectora. El uso de vacunas de subunidades del agente infeccioso ha resultado atractiva porque evita los problemas asociados a la inactivacin o atenuacin incompleta del patgeno y la posibilidad de contaminacin biolgica durante el cultivo del agente infeccioso a gran escala. Inmungenos especficos pueden ahora producirse a travs de la purificacin de protenas individuales, el uso de anticuerpos anti-idiotpicos que representan imgenes internas de ciertos deter-

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minantes antgenos del agente infeccioso o mediante la utilizacin de la tecnologa del DNA recombinante y la sntesis qumica de pptidos. Una vez aislado e identificado un agente infeccioso, cualquier intento de generacin de una vacuna contra la enfermedad debe considerar una serie de factores que pueden favorecer o complicar el desarrollo de la misma. Estos factores pueden estar relacionados con el agente infeccioso, con la enfermedad y con sus posibilidades de control o erradicacin (tablas 36-1 y 36-2). Adems, la induccin de una respuesta inmune protectora humoral y/o celular en los individuos vacunados, depender en ltimo trmino de la naturaleza y forma fisicoqumica de los antgenos utilizados, de su forma de administracin, del destino metablico de los mismos y del repertorio gentico del individuo y los diversos mecanismos de regulacin de la respuesta inmune. La edad del individuo es tambien un factor a considerar en la induccin de respuesta inmune a una vacuna, puesto que existen diferencias en la capacidad de respuesta en los primeros meses de vida y durante la senescencia. La presencia de altos niveles de anticuerpos maternos adquiridos en forma pasiva en los primeros meses de vida, dificultan o alteran la respuesta inicial a algunas vacunas. En los ancianos existe una disminucin en la capacidad

de respuesta a la estimulacin antignica y se requiere, muchas veces, una mayor cantidad de antgeno para lograr la respuesta inmune deseada. Luego de identificados los inmungenos que pueden servir de base para la generacin de una vacuna contra un agente infeccioso, el desarrollo de la misma debe cumplir 3 rigurosas etapas o fases, que ponen a prueba su eficacia, seguridad y estabilidad, antes de su uso masivo para el control de la enfermedad (tabla 36-3)

2. VACUNAS NATURALES O TRADICIONALES La defensa contra una gran variedad de agentes infecciosos depende de la habilidad del sistema inmune para reconocer, neutralizar y eliminar antgenos del agente patgeno y el objetivo de la vacunacin es inducir una adecuada respuesta inmune protectora contra la infeccin natural. As, bacterias y virus vivos atenuados que conservan su capacidad de replicacin y su inmunogenicidad, pero no su patogenicidad; bacterias y virus muertos que slo conservan su inmunogenicidad; fracciones antignicas purificadas; protenas, subunidades proteicas y toxinas bacterianas, se han utilizado como vacunas para controlar diver-

Tabla 36-1. Factores que favorecen el desarrollo de vacunas efectivas

Del agente infeccioso Slo uno o pocos serotipos, con poca variacin antignica Patgeno moderada o escasamente infeccioso Antgenos con eptopos B y T fcilmente identificables Inmunidad sistmica de fcil induccin.

De la enfermedad Infeccin induce respuesta inmune protectora Existencia de un modelo animal que reproduce la evolucin de la infeccin y/o la enfermedad.

De la erradicacin La infeccin est limitada a humanos y no existen otros reservorios naturales La infeccin induce un cuadro clnico caracterstico y no existen infecciones subclnicas o portadores sanos. Existencia de un marcador simple de vacunacin exitosa

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Tabla 36-2. Factores que complican el desarrollo de vacunas efectivas Del agente infeccioso Existencia de variacin antignica y por lo tanto mltiples serotipos El patgeno es altamente infeccioso Eventual variacin en el tropismo del patgeno Patgeno provisto de mecanismos de evasin de la respuesta inmune

De la infeccin Infeccin puede ser transmitida por clulas infectadas que no expresan antgenos del patgeno Integracin de genes del patgeno en el genoma del hospedero La infeccin no induce una respuesta inmune protectora Induccin de mecanismos de supresin de la respuesta inmune Infeccin y/o destruccin de subpoblaciones linfocitarias Ausencia de un modelo animal que simule la infeccin o la enfermedad en humanos

De la erradicacin Existencia de reservorios naturales Distintas manifestaciones clnicas de la infeccin o enfermedad y existencia de formas subclnicas y de portadores sanos.

Tabla 36-3. Fases en el desarrollo de una vacuna

Fase I : Fase II:

Corresponde a la fase de seguridad que determina la ausencia de reacciones adversas en voluntarios inoculados Corresponde al desafo, de los voluntarios inmunizados, con el agente infeccioso en condiciones restringidas. Esta fase requiere la disponibilidad de drogas para control del patgeno y eventual tratamiento de los voluntarios.

Fase III: Exposicin de los voluntarios inmunizados, a la infeccin natural con el patgeno en una regin en la que la infeccin o la enfermedad es endmica. Requiere tambien drogas para el control del patgeno y eventual tratamiento de los voluntarios

sos agentes infecciosos. Sin embargo, an cuando estas vacunas convencionales han ciertamente disminuido la incidencia, morbilidad y mortalidad de un gran nmero de enfermedades infecciosas, existen todava enfermedades que son difciles de controlar y prevenir por medios profilcticos, ya que no existe una vacuna disponible o las que existen son menos seguras o menos efectivas que lo deseado. Las razones que explican la ausencia de estas vacunas son desde luego diversas y entre ellas podemos mencionar la caren-

cia de suficiente material biolgico a partir de fuentes naturales, efectos colaterales no deseados, efectos nocivos por insuficiente atenuacin o inestabilidad de la vacuna en su forma atenuada, baja inmunogenicidad de sus componentes, presencia de material biolgico contaminante y dificultades en la produccin, almacenamiento, transporte y forma de administracin de la vacuna. Una vacuna ideal debe desde luego reproducir la respuesta inmune protectora inducida por la infeccin natural, debe ser estable y carecer de efectos colatera-

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les adversos, pero adems debe ser de bajo costo, sin dificultades de produccin, almacenamiento o transporte y debe ser fcil de administrar en los distintos individuos. Muchas de las vacunas convencionales actualmente disponibles no son ideales debido a su alto costo de produccin (hepatitis B, rabia), por sus potenciales efectos txicos o virulentos (pertussis, rubola) o por la inadecuada proteccin inducida (clera, tifus). Ahora bien, la preparacin de una vacuna a partir de fuentes naturales de material biolgico, requiere la obtencin del agente patgeno a partir de fuentes humanas o de animales infectados, su identificacin y caracterizacin, su mantencin en cultivo de tejidos o diversos medios de cultivo in vitro y los variados procesos de atenuacin o inactivacin. Prevenir la replicacin del agente infeccioso (mediante tratamiento con luz ultravioleta, fenol, formaldehido, beta propiolactona, imina) parece la forma ms simple de destruir su caracter patognico, pero el proceso de inactivacin no debe alterar la estructura antignica necesaria para la induccin de una respuesta inmune protectora. La inmunidad conferida por microorganismos muertos (difteria, ttanos, tifoidea, influenza, rabia, virus polio Salk) no induce inmunidad permanente con una nica dosis y requiere dosis repetidas y refuerzos para mantener la respuesta inmune protectora. La inmunidad conferida por las vacunas inactivadas o muertas es en muchos casos menor que la conferida por las vacunas vivas, ya que la replicacin del agente infeccioso permite la exposicin a una dosis mayor y sostenida de antgeno, al tiempo que favorece el procesamiento y la presentacin de los mismos. Este fenmeno es particularmente importante en las enfermedades virales, que requieren de la infeccin celular para la expresin de ciertos antgenos y una adecuada induccin de respuesta inmune celular. Las vacunas naturales inactivadas o no infecciosas entonces, son en general bastante estables y seguras pero requieren habitualmente de altas dosis de inoculacin por va parenteral, lo que puede provocar reacciones de hipersensibilidad. El proceso de atenuacin de un patgeno pretende producir un agente infeccioso modificado que mantenga o imite la conducta natural del microorganismo original, pero sin causar enfermedad. As ha ocurrido con las vacunas contra sarampin, rubola, fiebre amarilla, poliomielitis (Sabin) y parotiditis que confieren inmunidad de por vida o permanente con una sola dosis, puesto

que no slo simulan la infeccin natural, sino que adems se multiplican en el receptor produciendo gran cantidad de antgenos. La atenuacin del agente infecioso puede obtenerse por modificacin de las condiciones de crecimiento o de cultivo del patgeno (como por ejemplo bacilo de Calmette y Gurin de Mycobacterium tuberculosis), pero una vacuna atenuada puede tambien generarse mediante la utilizacin de especies o variantes distintas del patgeno y que son virulentas para hospederos heterlogos, distintos de aqul que se pretende proteger con la vacuna. El ejemplo ms conocido es el del virus vaccinia (cowpox de bovinos) que protege contra la viruela humana y representa uno de los xitos ms espectaculares en el control de una enfermedad infecciosa, la que se considerada erradicada desde 1980. En este grupo de vacunas atenuadas se encuentran tambin las vacunas contra sarampin, rubola, parotiditis, fiebre amarilla y la vacuna Sabin contra poliomielitis. Algunas bacterias producen enfermedad no por efecto directo sino por la liberacin de toxinas que pueden tener enormes efectos destructivos en rganos o tejidos distintos del sitio de infeccin. As, exotoxinas bacterianas inactivadas por calor o qumicamente modificadas por tratamiento cido, tratamiento con formaldehido o con enzimas proteolticas, han dado origen a vacunas basadas en este producto detoxificado denominado toxoide. Vacunas basadas en toxoides de diphteria y tetanus inducen una respuesta de anticuerpos protectores que neutralizan la toxina y facilitan su fagocitosis. Las vacunas naturales o tradicionales pueden, en general, agruparse en: Aqullas que utilizan microorganismos inactivados o muertos, por ejemplo clera (Vibrio cholerae), fiebre tifoidea (Salmonella tiphi), tos convulsiva (Bordetella pertussis) y antrax. Las que utilizan patgenos atenuados como poliomielitis, parotiditis, fiebre amarilla, influenza, varicela, adenovirus, viruela y tuberculosis Las que utilizan toxinas detoxificadas (toxoide) ya sea solas o unidas a un carrier proteico. En este grupo se encuentran las vacunas contra botulismo (Clostridium botulinum), difteria (Corynebacterium diphteriae) y ttanos (Clostridium tetani)

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Las que utilizan material capsular soluble (como polisacridos de Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Salmonella typhi y Haemophilus influenzae) Las que utilizan fracciones antignicas purificadas, como por ejemplo influenza y antgeno de superficie de hepatitis B.

3. VACUNAS RECOMBINANTES La preparacin de cualquier vacuna contra un agente infeccioso requiere la obtencin del patgeno a partir de fuentes humanas o animales de material biolgico, y su mantencion en cultivo para la produccin de los antgenos implicados en la induccin de una respuesta inmune protectora. Sin embargo, muchos agentes infecciosos son difciles o imposibles de cultivar y otros ofrecen un muy bajo rendimiento, an despues de cultivos masivos a gran escala. Este es el contexto en el que los recientes avances en biotecnologa ofrecen sorprendentes y atractivas posibilidades para la produccin de una nueva generacin de vacunas efectivas contra diversos agentes infecciosos. Una aproximacin para generar grandes cantidades de un inmungeno proteico especfico, es la utilizacin de la tecnologa del DNA recombinante que involucra el aislamiento del DNA que codifica la expresin del antgeno protector, su insercin en un vector de clonamiento autorreplicante (plsmido o virus) y su amplificacin en bacterias (E. coli), levaduras o clulas de mamfero (figura 36-1). Si el DNA no est disponible, se purifica el RNA mensajero del agente infeccioso y se le utiliza como molde para generar por transcripcin inversa un DNA complementario (cDNA) que se insertar en el vector de clonamiento. En general, las estrategias utilizadas para la introduccin de DNA extrao en un vector de clonamiento autorreplicante pueden conducir a la la construccin de una biblioteca genmica (genoteca) a partir del DNA del agente infeccioso (figura 36-1), o la generacin de una genoteca de cDNA a partir del RNA mensajero del mismo patgeno. La construccin de una genoteca implica: a) Eleccin y purificacin del vector de clonamiento, plsmido o virus, ms adecuado. b) Purificacin de DNA total, del agente infeccioso c) Tratamiento, bajo condiciones apropiadas, del vector de clonamiento y del DNA del agente infeccioso (DNA forneo o extrao) con la misma enzima o nucleasa de restriccin. De esta manera el DNA circular del vector de clonamiento se convierte en una estructura lineal, mientras el DNA del agente infeccioso

Ahora bien, cuando se inocula un agente infeccioso, ya sea vivo o muerto o partes substanciales de l, se est introduciendo en los individuos material biolgico que es, en gran parte, desconocido y altamente mutable. Si el agente infeccioso ha crecido en cultivo de tejidos, es imposible garantizar la ausencia de contaminacin biolgica y mientras ms aprendemos sobre mutabilidad y latencia viral, mayor debe ser la preocupacin por los efectos a largo plazo de nuestras vacunas. El hecho es que junto a los determinantes antignicos indispensables para la induccin de una respuesta inmune protectora, estamos tambien introduciendo al vacunar, molculas innecesarias e irrelevantes que pueden ser inmunognicas y por lo tanto capaces de activar linfocitos T supresores o de inducir la sntesis de anticuerpos que participan en la formacin de complejos inmunes que pueden tener algn efecto patognico al fijarse en diversos rganos o tejidos. Partiendo del supuesto que la respuesta inmune contra un agente infeccioso est en su mayor parte dirigida contra molculas de la superficie del agente patgeno, los esfuerzos de los investigadores se han concentrado en la identificacin y caracterizacin de estos antgenos con el objeto de reemplazar las vacunas que utilizan agentes infecciosos vivos o muertos, por fracciones antignicas altamente purificadas, por antgenos recombinantes, por fragmentos peptdicos qumicamente sintetizados o por la inoculacin directa del DNA o RNA que codifica la expresin de un antgeno protector. Adems algunos virus estn siendo genticamente manipulados para eliminar del genoma aquellas regiones que codifican la expresin de los factores responsables de su virulencia, y de esta manera desarrollar vacunas efectivas, de virus vivos que conserven intacta su capacidad de replicacin y su capacidad para inducir una respuesta inmune protectora, al tiempo que carecen de la posibilidad de revertir a una forma patognica.

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Figura 36.1. Estrategia general utilizada en la tecnologa del DNA recombinante. El vector de clonamiento elegido es el plsmido pBR322 que confiere resistencia a los antibiticos ampicilina y tratraciclina, a las bacterias que lo poseen o lo incorporan. Tanto el plsmido como el DNA del agente infeccioso se tratan con la misma enzima de restriccin para convertir el DNA circular del plsmido en una estructura abierta y lineal, mientras en el DNA del agente infeccioso se generan diversos fragmentos de restriccin. El vector de clonamiento y los fragmentos de DNA se mezclan y unen luego en presencia de la enzima DNA ligasa, para generar vectores recombinantes que incorporan algn fragmento de DNA (gen) extrao del agente infeccioso (la insercin del DNA extrao, en el gen de resistencia a ampicilina, determina la inactivacin del mismo). La amplificacin de los plsmidos en cultivos de E. coli, permitir seleccionar bacterias tetracilina resistentes por incorporacin de un plsmido recombinante.

se convierte en pequeos "fragmentos de restriccin", algunos de los cuales contendrn el gen de inters. Como alternativa, la fragmentacin del DNA del agente infeccioso se puede obtener por metodos fsicos como ruptura de las molculas de DNA por pasaje a travs de una jeringa o por sonicacin, entre otros. Finalmente se puede tratar enzimticamente el DNA total mediante digestin parcial con DNAsa, esto evita el uso de enzimas de restriccin que pueden cortar en medio de la secuencia codificante de los genes.

d) Mezcla y unin de la forma lineal del vector de clonamiento y con los fragmentos de DNA extrao, y tratamiento con la enzima DNA ligasa para generar vectores recombinantes (clonamiento del DNA). e) Introduccin y amplificacin de cada vector de clonamiento en bacterias, levaduras o clulas de mamfero en cultivo, en condiciones que slo permiten el crecimiento de los vectores recombinantes que han incorporado algn gen o fragmento gnico del DNA extrao (selec-

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cin positiva). De esta manera se genera una genoteca, que contiene fragmentos de todo el genoma del agente infeccioso y est por lo tanto constituida por la coleccin completa de vectores recombinantes generados durante el proceso de clonamiento. La estrategia alternativa de clonamiento a partir de RNA mensajero del agente infeccioso y la consiguiente construccin de una genoteca de cDNA implica: a) Purificacin del RNA mensajero total o de una fraccin del RNA mensajero del patgeno. b) Transcripcin inversa del RNA mensajero, para generar una copia de DNA complementario (cDNA). La reaccin es catalizada por la enzima transcriptasa inversa, que utiliza la molcula de mRNA como molde para la sntesis de una molcula de cDNA. c) La hebra simple de cDNA es convertida en una doble hlice de DNA en una reaccin catalizada por la enzima DNA polimerasa. d) Corte del vector de clonamiento con enzima de restriccin y agregado de pequeas secuencias nucleotdicas homopolimricas en los extremos abiertos del vector y de secuencias homopolimricas complementarias en los extremos del cDNA. e) Insercin de las molculas de cDNA en el vector de clonamiento, en presencia de la enzima DNA-ligasa. Se generan as vectores recombinantes de cDNA f) Introduccin y amplificacin de cada vector de clonamiento en bacterias, levaduras o clulas de mamfero en cultivo, en condiciones que slo permitan el crecimiento de vectores recombinantes. Se genera as una genoteca de cDNA que contiene slo las regiones que se transcriben del genoma del patgeno y est constituida por la coleccin completa de vectores recombinantes generados a partir del mRNA del agente infeccioso. Una vez construida una biblioteca genmica o una biblioteca de cDNA, debe realizarse la identificacin de los clones recombinantes que contienen el gen que codifica la expresin del antgeno de inters. Esta identificacin y seleccin de clones recombinantes especficos puede hacerse por hibridizacin in situ con una sonda radiactiva de

DNA o RNA, mediante una sonda marcada (por ejemplo un anticuerpo o un ligando especfico radiactivamente marcado), que permitan detectar la expresin del antgeno mismo en cultivos de bacterias, levaduras o clulas de mamfero transfectadas con los clones o vectores recombinantes (ver captulo 30). La produccin de antgenos mediante tcnicas de biologa molecular ofrece un alto rendimiento del inmungeno en cuestin, el que ser similar, si no idntico a la protena original expresada por el agente infeccioso. Regiones seleccionadas del genoma del agente infeccioso (que codifican la expresin de protenas involucradas en la induccin de una respuesta inmune protectora) pueden, luego de su insercin en el vector de clonamiento, ser amplificadas y expresadas en cultivos de bacterias, levaduras o clulas de mamfero, a partir de los cuales se purificar el "antgeno recombinante". El crecimiento de plsmidos o virus recombinantes en estos cultivos a gran escala, ofrece un gran potencial, tanto para el desarrollo de vacunas recombinantes no infecciosas que reemplacen las vacunas tradicionales ya existentes, (B. pertussis, H. influenzae, pneumococcus, meningococcus, hepatitis B, sarampin, polio), como para la generacin de vacunas contra agentes infecciosos que son difciles o imposibles de cultivar en el laboratorio. Una alternativa adicional en la generacin de vacunas recombinantes es la utilizacin de bacterias o virus recombinantes vivos como inmungeno. La estrategia de preparacin de estas vacunas consiste en escoger el DNA del agente patgeno que codifica la expresin de una protena capaz de inducir una respuesta inmune protectora, e insertarlo en el genoma de un virus o bacteria de reconocida seguridad y eficacia como vacuna viva. Virus como vaccinia, herpes, varicela, adenovirus, papiloma, SV40 y polio y bacterias como Salmonella, BCG y Escherichia coli estn siendo utilizados como vectores de clonamiento para el desarrollo de estas vacunas recombinantes vivas. El segmento gnico protector es insertado en el genoma viral o bacteriano de manera tal que la replicacin del vector recombinante desencadene en los individuos inoculados, una respuesta mixta contra el vector y contra el producto gnico del DNA extrao del agente infeccioso. Este DNA extrao del patgeno debe ser insertado en un lugar tal del genoma del vector recombinante, que no se alteren los mecanismos de replicacin ni la sobrevida del vector en el hospedero. Al incorpo-

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rarse en la clula del individuo vacunado, el vector recombinante dirigir la sntesis de sus propias molculas incluyendo la protena codificada por el gen extrao del patgeno. Esta protena ser luego adecuadamente procesada, glicosilada e insertada en la membrana de la clula infectada o bien procesada y presentada al sistema inmune del hospedero, en asociacin con una molcula MHC en la superficie de la misma clula. La estrategia de virus o bacterias recombinantes ha sido utilizada con xito para el antgeno de superficie de la hepatitis B, glicoprotena D del virus Herpes simplex, hemoaglutinina del virus influenza, glicoprotena del virus rabia, glicoprotena gp 160 y otra protenas de HIV, virus Epstein-Barr, cytomegalovirus, parainfluenza, sarampin y virus respiratorio sincicial. Finalmente es importante sealar que una limitacin de la tecnologa del DNA recombinante es que ella no es aplicable a la sntesis de antgenos hidrocarbonados o lipidicos o pptidos glicosilados en los que epitopo inductor de la respuesta inmune protectora reside en la porcin hidrocarbonada de la molcula. Pero anticuerpos antiidiotpicas que imiten o representen imgenes internas de estas estructuras epitpicas, pueden constituir una alternativa para el desarrollo de vacunas protectoras.

desarrollar una respuesta inmune contra un antgeno al cual nunca ha estado expuesto. Los antgenos de muchos agentes infecciosos son de naturaleza hidrocarbonada o lipdica y no pueden prepararse por DNA recombinante o sntesis qumica, pero anticuerpos anti-idiotpicos que representen imgenes internas de tales antgenos pueden constituir excelentes vacunas, las que pueden adems prepararse a travs de la produccin de anticuerpos monoclonales antiidiotpicos. Existen numerosos ejemplos de infecciones experimentales en las que se ha demostrado induccin de una efectiva repuesta inmune protectora mediante la inmunizacin anti-idiotpica. Entre ellas podemos mencionar infecciones virales por virus Sendai, virus rabia, herpes simplex, polio hepatitis B y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) para el cual se ha preparado un anticuerpo anti-idiotpico que representa la imagen interna de CD4 y por lo tanto compite en la unin con el virus; bacterias como Streptococcus pneumoniae, Lysteria monocytogenes, E. coli; infecciones parasitarias como malaria, schistosomiasis, trypanosomiasis africana y leishmaniasis.

5. VACUNAS SINTTICAS Un tercer camino para la preparacin de vacunas distintas de las vacunas tradicionales lo constituye la utilizacin de pptidos sintticos que contienen o representan la secuencia aminoacdica de eptopos protectores derivados de antgenos proteicos. Aunque la respuesta inmune contra una protena extraa es bastante compleja, se ha demostrado que pequeos pptidos derivados de la protena original reaccionan con anticuerpos producidos contra la protena completa. Adems la frecuencia con la cual anticuerpos contra pequeos pptidos de menos de 20 aminocidos reaccionan o reconocen la protena de la cual derivan, es bastante ms elevada de lo que se esperaba y algunos pptidos han sido tan efectivos como inmungenos que muchos investigadores han centrado su inters en la sntesis de pptidos que, presentados y administrados de manera apropiada, puedan estimular una respuesta inmune protectora efectiva contra antgenos de agentes infecciosos. En la bsqueda de eptopos individuales, la atencin se ha centrado en los eptopos estructurales o continuos, que estn confinados a una corta secuencia

4. VACUNAS ANTI-IDIOTPICAS Un camino alternativo para la produccin de vacunas efectivas es la utilizacin de anticuerpos anti-idiotpicos que reconocen el sitio de combinacin o paratopo, de un anticuerpo especfico para un agente infeccioso. Por definicin un suero anti-idiotpico producido contra inmunoglobulinas especficas para un eptopo determinado, contendr anticuerpos que reconocen determinantes antignicos idiotpicos presentes en la porcin variable del anticuerpo que reconoce al eptopo original (ver captulo 13). Algunos de estos anticuerpos antiidiotpicos poseen un sitio de combinacin que se asemeja o representa al determinante antignico original contra el cual est dirigido el idiotipo. La inoculacin de anticuerpos anti-idiotpicos que poseen tal imagen interna de un eptopo, puede inducir una respuesta inmune contra ese determiante antignico o ms ampliamente contra el antgeno o el agente infeccioso que posea tal eptopo. De esta manera un individuo puede

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aminoacdica de la protena y que pueden ser fcilmente sintetizados. El atractivo de los pptidos sintticos como vacunas parece bastante claro: ellos evitaran la necesidad de vacunas compuestas de preparados inactivos o de cepas no patgenas del agente infeccioso. Evitaran adems la necesidad de una fuente de material biolgico o la sangre de individuos afectados a partir de los cuales se preparan las fracciones antignicas que sirven de base para las vacunas tradicionales. No requieren del cultivo y manipulacin de organismos patgenos y evitan el complejo proceso biotecnolgico implicado en la manipulacin gentica de virus, bacterias, levaduras o clulas eucariontes para la produccin masiva de protenas antignicas recombinantes. Todo esto es reemplazado por un proceso de sintesis qumica de pptidos, de bastante menor costo que el de las vacunas tradicionales o de las vacunas recombinantes. Las vacunas basadas en pptidos sintticos son uniformes, especficas y su contenido perfectamente conocido y libre de los innecesarios e indeseables componentes del husped o del agente infeccioso. Para sintetizar un pptido antignico es necesario determinar la secuencia aminoacdica del eptopo reconocido por el sistema inmune del individuo. Luego debe ser administrado en la forma, dosis y ruta ms apropiada para la induccin de una respuesta inmune protectora. La identificacin y aislamiento de antgenos protectores mediante las tcnicas de biologa molecular, permite determinar la secuencia nucleotdica de los respectivos genes y deducir la secuencia aminoacdica de las protenas que codifican. Analizando luego la secuencia aminoacdica de una protena, es posible predecir qu regiones o segmentos de la molcula estarn expuestos en la superficie de la protena en solucin y, por lo tanto, disponibles para interactuar o ser reconocidos por el sistema inmune del individuo. La tcnica de difraccin de rayos X de protenas, purificadas y cristalizadas, puede detectar las regiones que protruyen o sobresalen en la superficie de la molcula permitiendo predecir eptopos que estimulen linfocitos B o linfocitos T. Existen adems programas computacionales que partiendo de la secuencia aminoacdica de una protena pueden combinar la deteccin de estructuras beta con la hidropaticidad o anfipaticidad de las distintas regiones de la molcula (existencia de dominios hidroflicos o hidrofbicos) para predecir qu dominios estarn expuestos en la super-

ficie de la molcula en solucin. Pptidos sintticos pueden entonces sintetizarse para identificar eptopos protectores los que sern acoplados ms tarde a un carrier adecuado para generar un preparado antignico eventualmente seguro y eficaz como vacuna sinttica. Por otro lado, conociendo la secuencia aminoacdica de una protena es posible establecer o confeccionar una biblioteca peptdica constituida por todos los pequeos pptidos de secuencia aminoacdica superpuesta que puedan sintetizarse cubriendo toda la secuencia desde el extremo amino al extremo carboxilo de la molcula. As, si la biblioteca se construye en base a pptidos de 10 aminocidos, el primer pptido incluir desde el aminocido 1 al 10, el segundo incluir los aminocidos 2 al 11, el tercero ir del aminocido 3 al aminocido 12 y as sucesivamente hasta el ltimo residuo en el extremo carboxilo de la protena. Los distintos pptidos se prueban luego para determinar su habilidad para ser reconocidos por la respuesta inmune protectora contra la protena original y para inducirla bajo condiciones adecuadas. De esta manera se logra identificar los pptidos sintticos que contienen o imitan (mimotopos) la estructura de eptopos antignicos y que pueden por lo tanto utilizarse como base para el desarrollo de una vacuna sinttica. Diferentes modelos experimentales han mostrado que pptidos sintticos pueden inducir inmunidad protectora contra diversos agentes infecciosos: tetradecapptido 188-201 de toxina diftrica, pptido 135-155 de antgeno de superficie de hepatitis B; pptido 91-108 de hemaglutinina del virus influenza, pptido 134160 de protena VP1 del virus aftosa y diversos pptidos de txina del clera, glicoprotena D del virus herpes, protena M de Streptococcus pyogenes, Mycobacterium tuberculosis, pilina de E. coli, pilina de Neisseria gonorrohoeae, protena circumsporozotica de Plasmodium falciparum y otros plasmodios de la malaria, etc. En la mayora de los casos los pptidos han sido administrados con un adyuvante y covalentemente acoplados a un carrier proteico para hacerlos inmunognicos. La eleccin de un adyuvante y de un carrier apropiado es por lo tanto de primera importancia para el desarrollo de vacunas sintticas de uso humano. Finalmente debe sealarse que un aspecto importante a considerar en el desarrollo de vacunas sintticas es la calidad e intensidad de la respuesta inmune protectora y la induccin o no de me-

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moria inmunolgica por un tiempo prolongado, en comparacin con la respuesta inmune inducida por la protena original o por el agente infeccioso completo. La induccin de una respuesta inmune requiere de un cierto grado de complejidad antignica para estimular las necesarias interacciones celulares entre macrfagos, clulas presentadoras de antgeno, linfocitos T y linfocitos B que conducen al desarrollo de una efectiva respuesta protectora. La omisin de cualquiera de estos eptopos funcionales limitar la eficacia de una vacuna sinttica. Como es difcil estabilizar una estructura peptdica en el caso de un pptido que representa un eptopo B de tipo conformacional, se han empleado estrategias alternativas para preservar la estructura antignica de una secuencia peptdica. En general, se han usado regiones beta-loops de varias protenas andamio donde se ha expresado el pptido de inters. As, se han utilizado entre otras, las regiones hipervariables de inmunoglobulinas, regiones beta-loops de protena de superficie de virus filamentosos de E. coli, de la protena gp120 del virus VIH y la protena srica humana transferrina. El desarrollo de una eventual vacuna sinttica contra un agente infeccioso no es entonces una tarea fcil. Requiere un conocimiento de la secuencia aminoacdica de la protena protectora, requiere la identificacin de eptopos T y eptopos B y muchas veces los eptopos B son eptopos conformacionales que no son fcilmente imitados por pptidos sintticos. Los pptidos, por lo general, no inducen sntesis de anticuerpos y deben conjugarse a un carrier que contenga eptopos T y administrarse junto a un adyuvante para hacerlos inmunognicos. Surge entonces el problema de seleccionar carriers y adyuvantes apropiados para uso humano. La toxina tetnica por ejemplo, ha sido usada para vacunacin humana por muchos aos sin efectos colaterales adversos y ha funcionado muy bien como adyuvante en modelos experimentales con diversos animales, pero su utilizacin como adyuvante en humanos induce la activacin de linfocitos T supresores que inhiben la respuesta inmune contra el pptido (supresin epitpica). Este fenmeno de "supresin epitpica" es similar pero opuesto, al "efecto carrier" descrito para los conjugados carrier hapteno. En el efecto carrier, la respuesta secundaria de anticuerpos contra un hapteno especfico requiere la inoculacin de un complejo carrier-hapteno formado con el mismo carrier utilizado en la inmunizacin pri-

maria; la respuesta requiere entonces sensibilizacin previa con el carrier, para la activacin de linfocitos T helper carrier especficos. En el fenmeno de supresin epitpica, en cambio, la sensibilizacin previa con el carrier, estimula la activacin de linfocitos T supresores carrier especficos que inhiben la respuesta contra el pptido (hapteno) en el encuentro secundario con el mismo carrier.

6. VACUNAS DE DNA Al inicio de la dcada de los 90, evidencias experimentales demostraron que inoculaciones directas in vivo de genes incluidos en vectores de expresin eucariticos en animales de laboratorio pueden facilitar una fuerte respuesta inmune contra los antgeno expresados. Este mtodo se ha denominado Inmunizacin Gentica o Vacunas de DNA y ha sido utilizado para promover una efectiva respuesta inmunoprotectora de tipo humoral y celular en una amplia variedad de modelos animales pre-clnicos para enfermedades infecciosas, alergia, cncer y cuadros autoinmunes. La vacunacin de DNA es particularmente efectiva para la induccin de clulas T citotxicas. Recientemente, se ha reportado la primera vacuna en una ensayo clnico contra linfoma y malaria y existen resultados preliminares en ensayos clnicos humanos en infeccin por VIH, lo que ha confirmado el valor e inters por esta estrategia de inmunizacin en el modelo humano. Efectivamente, la vacuna de DNA es el mtodo ms cercano para imitar la inmunidad natural y puede ser utilizado como una estrategia para programar el sistema inmune a responder contra una gran variedad de antgenos, e inducir de esta manera proteccin contra diversas enfermedades. Las vacunas de DNA consisten en un plasmidio bacterial que contiene un promotor viral fuerte como Cytomegalovirus (CMV), Rous Sarcoma Virus (RSV), Simian Virus 40 (SV40), el gen de inters, una secuencia de terminacin transcripcional y de polyadenylation, y finalmente un Intron. El plasmidio es cultivado en E. coli, purificado y posteriormente inyectado en el husped usando una solucin salina o con la ayuda de un adyuvante. El plasmidio inyectado es adsorbido por las clulas del hospedero y producirn luego la protena codificada por el DNA incluido en el vector. La expresin de plasmidios usados para

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la Inmunizacin Gentica no es replicada en el husped mamfero y no se integra al DNA cromosomal del individuo, aunque recientemente se han reportado dos casos de integracin cromosomal del gen inyectado. El xito logrado en la inmunizacin intramuscular de animales de experimentacin con vacunas que contienen DNA, ha proporcionado un sorprendente y revolucionario mtodo para la generacin de anticuerpos y la activacin de linfocitos T citotxicos especficos contra la protena codificada por ese DNA. La eficacia de estas vacunas gnicas parece depender de la eficiencia de la transfeccin (o incorporacin y expresin del DNA) y la eficiencia con que las clulas transfectadas presentan al sistema inmune las protenas codificadas por el DNA. La eficacia de la inmunizacin con DNA, fue inicialmente demostrada usando la inoculacin intramuscular de ratones con un plasmidio de DNA que codifica la hemoaglutinina (HA), una glicoprotna de superficie del virus influenza A. El experimento demostr la posibilidad de generar altos niveles de anticuerpos anti-HA que protegen a los ratones inmunizados, en experimentos de desafio con cepas homlogas del virus de la influenza. Este modelo de vacunacin en animales, ha sido usado tambin ocupando el gen que codifica una protena interna conservada (la nucleoprotena) del virus influenza A. Los animales as inmunizados desarrollaron tanto anticuerpos nucleoprotena-especficos, como una respuesta celular de tipo citotxico. La inyeccin intramuscular de 100 microgramos de plsmido, que contiene el DNA codificante de la nucleoprotena del virus influenza, induce en ratones la expresin citoslica de la protena y un adecuado procesamiento y presentacin al sistema inmune, de fragmentos peptdicos asociacidos con molculas del Complejo Principal de Histocompatibilidad. Se genera as una buena respuesta inmune contra la protena, pero sta es an mayor si la vacuna gnica se co-inyecta con, o contiene plsmidos que codifican citoquinas como GM-CSF (factor estimulador de colonias de granulocitos y macrfagos). El mtodo ha sido utilizado tambien con xito para la generacin de una eficiente respuesta inmune contra la glicoprotena del virus rabia y contra Mycobacterium tuberculosis. Las ventajas de las vacunas gnicas sobre otros tipos de vacunas son mltiples: pueden ge-

nerar una respuesta inmune sin necesidad de un vector vivo autorreplicante. La expresin del gen extrao, por las clulas del hospedero, puede conducir a la sntesis de una protena mucho ms cercana a la protena original del agente infeccioso y puede ser ms adecuadamente procesada y presentada al sistema inmune. Las vacunas de DNA tendran adems, un menor costo de produccin que cualquier otro tipo de vacunas y podran se convertidas en un "pellet" seco, estable a temperatura ambiente, de fcil almacenamiento y transporte y, de fcil reconstitucin ya que slo requerira de agua antes de su administracin. Sin embargo, es importante sealar que el uso de vacunas de DNA conlleva tambin una serie de riesgos como las eventuales consecuencias a largo plazo, de la de existencia de un plsmido u otro vector de clonamiento en las clulas del hospedero y la expresin constitutiva de un gen extrao en las clulas de los individuos inmunizados. El DNA del vector puede adems incorporarse en el genoma del hospedero con el consiguiente riesgo de transformacin celular por integracin de un oncogen, activacin de un proto-oncogen o inactivacin de un gen supresor de oncogenes. En respuesta a esta preocupacin, se han establecido desde la mitad de los aos 90, una serie de normas y reglamentacines que regulan el uso de las vacunas de DNA Diversas normas han sido establecidas por agencias Norteamericanas y Europeas basadas en las experiencias obtenidas a partir de estudios preclnicos y clnicos. Entre los varios requerimientos de seguridad se incluyen conocimiento sobre la distribucin en tejidos, la persistencia en el organismo y la eventual integracin en el genoma del hospedero, del DNA inoculado. En conclusin, la Inmunizacin Gentica, ciertamente, ofrece potenciales soluciones a algunos de los desafos asociados al desarrollo de vacunas: brinda una amplia proteccin contra diferentes cepas virales debido a la respuesta T citotxica mediada por linfocitos T que reconocen eptopos de protenas conservadas e inducen una respuesta inmune duradera. La respuesta de clulas T helper facilita la combinacin de diferentes inmungenos y adyuvantes moleculares en una preparacin nica, induciendo una fuerte e inmunomodulada respuesta inmune con la opcin de inmunizacin simultnea para varias enfermedades.

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7. VACUNAS GENMICAS Un nuevo mtodo para el desarrollo de vacunas, llamado Inmunizacin Genmica o Expresion Library Immunization (ELI), hace uso de tcnicas de Inmunizacin con DNA partiendo de la suposicn o del conocimiento que la coleccin completa de antgenos de un patgeno, debe estar necesariamente codificada en su genoma. Utilizando entonces como inmungeno gentico, toda la Genoteca de Expresin del DNA de un agente patgeno (o toda la coleccin gnica o genmica de cualquier patgeno) pueden obtenerse resultados efectivos de presentacin antignica y de proteccin inmunolgica en forma de una vacuna viva sin riesgo. La evidencia experimental en modelo murino ha demostrado que an una Genoteca de Espresin parcial hecha a partir del DNA de Mycoplasma pulmonis, Leishmania major, Trypanosoma cruzi y Plasmodium chabaudi son capaces de proporcionar proteccin contra la agresin por el agente patgeno. El reciente desarrollo de la Inmunizacin Genmica se ha perfeccionado en base a la disponibilidad de la informacin de las secuencias genmicas de varios patgenos. Esta tecnologa est basada en las sorprendentes evidencias recin encontradas que fragmentos amplificado por PCR, pueden ser hechos transcripcionalmente activos simplemente cruzndolos con secuencias activas de tipo promotor y terminador. Cuando se mezclan secuencias codificante, promotora y terminadora se cruzaron por hibridacin espontneamente para formar "Elementos de Expresin Linear" (LEE). Ademas, cuando estas LEE fueron transfectadas en cultivo celular o inyectadas en animales se obtuvo un considerable nivel de expresin de la secuencia codificada. Significativamente, cuando genes/antgenos del genoma del patgeno humano, Mycobacterium tuberculosis, fueron utilizados como secuencias codificadas y las secuencias LEE transcripcionalmente activas fueron administradas por Inmunizacin del DNA intradrmica por gene gun o inyectadas intramuscularmente, los animales inyectados desarrollaron anticuerpos contra el antgeno de la tuberculosis. Estas dos nuevas tecnologas, cuando propiamente asociadas a un mtodo de screening, pueden proporcionar una solucin al dificil problema de descubrir qu gen del patgeno incluir en el vector gentico de inmunizacin especialmente

con patgenos con genomas mayores tales como las bacterias y parsitos. Expression Library Immunization usado con genotecas de espresin de cDNA e Inmunizacin Gentica pueden bsicamente identificar los genes protectores dentro de un genoma ofreciendo un sistema imparcial para descubrir candidatas para vacunas en varios modelos de enfermedad.

8. ADYUVANTES, INMUNOMODULADORES E INMUNOGENICIDAD Los adyuvantes, a diferencia de los carriers proteicos son substancias que no forman enlaces covalentes con los antgenos con que administran y estn destinados a aumentar la inmunogenicidad de molculas como protenas, pptidos e hidratos de carbono, que son muy poco inmunognicas. La asociacin de protenas con adyuvantes tradicionales como hidrxido de aluminio (almina) o su emulsin con adyuvantes que contienen aceites minerales y productos bacterianos (tabla 36-4), permiten convertir molculas solubles en un complejo particulado que ser ms fcilmente ingerido por fagocitos profesionales y adecuadamente procesado y presentado para la induccin de una respuesta efectiva. En general los diversos adyuvantes retardan la liberacin de los antgenos en el sitio de inculacin, facilitan su ingestin por macrfagos y otros fagocitos profesionales e inducen la activacin de los mismos, lo que favorece el procesamiento y presentacin de antgenos en asociacin con molculas del complejo principal de histocompatibilidad. Los complejos inmunoestimuladores (ISCOM= immune stimulating complex) son glicsidos que pueden formar complejos multimricos con diversos antgenos y pueden atravesar las membranas celulares, como hacen los liposomas. Esto permite el ingreso de antgenos al citoplasma celular facilitando su adecuado procesamiento y presentacin. Por ltimo es importante sealar que citoquinas como interleuquina- 12 (IL-12), que estimula la induccin de una respuesta celular Th1 dependiente e inhibe el desarrollo de una respuesta Th2, pueden constituirse en coadyuvantes o inmunomoduladores importantes para el desarrollo de vacunas efectivas contra una enfermedad infecciosa. El rol adyuvante de ciertas secuencias

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inmunoestimuladoras (ISSs)de DNA bacterianos, ha sido recientemente propuesto en funcin de sus habilidades estimulatodoras de respuesta T helper-1 (Th1) en animales vacunados con genes o protenas. Se trata de motivos de secuencia que contienen dinucletidos demetilado CpG y que comnmente se encuentran en DNA bacteriano. Regiones no codificantes de plsmido de DNA enriquecido en ISS o ISS oligonucletidos (ISSODNs), estimulan una potente respuesta inmune al ser coadministrado con antgenos. Estas secuencias ISS activan directamente macrfagos, clulas NK y linfocitos, induciendo sntesis y secrecin de citoquinas, quimioquinas e inmunoglobulinas como parte de la respuesta inmune innata inducida por interacin de las secuencias CpG con receptores especficos de la familia de receptores Toll-like, en la superficie de estas clulas. Se ha demostrado que ISS-DNAs juegan un papel

supresor en la sntesis de IgE, pero promueven la sntesis de IgG2a y la produccin de IFN-. Adicionalmente, la secuencia ISS promueve la secrecin de un particular patrn de citoquinas, como IFN-, IFN-, IFN-, IL-12 e IL-18, que favorecen la respuesta humoral TH1 y la inmunidad celular. La adicin de la secuencia ISS como adyuvante molecular o como subunidad en vacunas con virus inactivados, pouede conducir a la generacin de una respuesta inmune efectiva a las infecciones virales, tanto en la inmunizacin con DNA como en la inmunizacin con antgeno proteico tradicional. El desarrollo entonces de adyuvantes e inmunoduladores apropiados es una necesidad evidente para la administracin de vacunas en una forma inmunognicamente adecuada para la induccin de una respuesta inmune protectora efectiva un agente infeccioso.

Tabla 36-4. Adyuvantes que aumentan la inmunogenicidad de diversos antgenos e inducen una respuesta inmune efectiva Adyuvante Adyuvante Incompleto de Freund Adyuvante Completo de Freund`s Adyuvante de Freund`s con pptidoglicano muramil dipptido (MDP= N-acetyl-muramyl L-alanil.D isoglutamine) Almina o Hidrxido de Aluminio Polinucletidos de doble hlice Composicin Emulsin de aceite mineral y agua Emulsin de aceite mineral , agua y mycobacterias muertas Emulsin de aceite mineral, agua y MDP de mycobacterias Mecanismo de accin Retarda la liberacin de antgenos y facilita su ingestin por fagocitos Retarda liberacin de Ag. facilita su ingestin y activa macrfagos Retarda liberacin de Ag. facilita su ingestin activa macrfagos

Gel de hidrxido de aluminio Poli-inosina y cido policitidlico (poli-IC) o cido poliadenlicopoliuridlico (poli-AU) Matriz de Quail A, componente activo de la saponina

Retarda liberacin de Ag. facilita su ingestin y activa macrfagos Activacin de linfocitos T antgeno especficos y activacin de macrfagos Entrega antgenos en el citosol y activa linfocitos T citotxicos

Complejos Inmunoestimulantes (ISCOMs)

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LECTURAS SUGERIDAS Ada, Gordon L. Vaccines in Fundamental Immunology, Edited by William Paul, Third Edition, Raven Press Limited, New York, 1993, pp. 1309-1352,. Aggarwal, A. et al., Oral salmonella: Malaria circumsporozoite recombinants induce specific CD8+ cytotoxic T cells. J. Exptl. Med., 172: 1083.1090, 1990. Audibert, F.M.. and Lise, L.D., Adjuvants: current status, clinical perspectives and future prospects, Immunol. Today, 14: 281-284, 1993. Barry, M.A., Lai, W.C. and Johnston, S.A., Protection against mycoplasma infection using expression-library immunization, Nature 377:632, 1995. Brown, F., The potential of peptides as vaccines, Semin. Virol. 1: 67-74, 1990. Brown, F., Schild, G.C. and Ada, G.L., Recombinant vaccinia viruses as vaccines, Nature 319: 549-552, 1986. Cease, K.B. and Berzofsky, J.A.. Toward a vaccine for AIDS: The emergence of Immunobiology-Based vaccine development, Annu. Rev. Immunol. 12: 923-989, 1994. Darji, A.; Guzman, C.A.; Gerstel, B.; Wachholz, P.; Timmis, K.N.; Wehland, J.; Chakraborty, T.; and Weiss, S., Oral somatic transgene vaccination using attenuated typhimurium, Cell 91:765, 1997. Dietrich, G.; Bubert, A.; Gentschev, I.; Sokolovic, Z.; Simm, A.; Catic, A.; Kaufmann, S.H.; Hess, J.; Szalay, A.A.; and Goebel, W., Delivery of antigen- encoding plasmid DNA into the cytosol of macrophages by attenuated suicide Listeria monocytogenes [see comments], Nat Biotechnol 16:181, 1998. Fynan, E.F. et al., DNA vaccines: Protective immunizatios by parenteral, mucosal, and genegun inoculations, Proc. Nat. Acad.Sci. USA. 90: 11478-11482, 1993.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 37
MECANISMOS DE INMUNIDAD ANTITUMORAL
Flavio Salazar O. y Javier Puente P.

1. Introduccin 2. Defensa inmunolgica contra el cncer 2.1. La hiptesis de vigilancia inmunolgica antitumoral 2.2. Componentes de la respuesta inmune antitumoral 2.2.1. Respuesta inmunolgica humoral 2.2.2. Respuesta inmunolgica celular 3. Antgenos asociados a tumores 3.1. Clasificacin de AAT reconocidos por LT

4. Estrategias tumorales de evasin inmunolgica 4.1. Disminucin de la expansin de las molculas MHC 4.2. Factores inmunosupresores producidos por los tumores 5. Terapia inmunolgica contra el cncer 5.1. Anticuerpos monoclonales 5.2. Terapia biolgica contra el cncer 5.2.1. Utilizacin de citoquinas 5.2.2. Terapia celular adoptiva 5.3. Inmunizacin activa contra tumores

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RESUMEN Una de las funciones asignadas al sistema inmune es la inmuno-vigilancia, propiedad que le permitira controlar el desarrollo de clulas tumorales. Sin embargo, la gran mayora de las clulas tumorales son dbilmente inmunognicas, hecho sumado a que individuos inmunosuprimidos, ya sea por tratamiento farmacolgico o por inmunodeficiencias genticas no presentan una mayor incidencia de tumores. Las clulas tumorales presentan adems diversas estrategias de evasin de la respuesta inmunolgica; disminucin de la expresin de las MHC y la produccin de molculas inmunosupresoras. La especificidad de los LT, especialmente los LT CD8+, ha permitido ir conociendo un gran conjunto de antgenos asociados a tumores (AAT), muchos de los cuales corresponden a protenas normalmente expresadas y una muy pequea fraccin a antgenos tumorales propiamente tales. Adems, en algunos casos, han podido utilizarse anticuerpos monoclonales que reconozcan a antgenos tumorales en diagnstico y terapia. La inmunoterapia antitumoral (terapia celular adoptiva) ha emergido de forma tal de estimular los mecanismos defensivos del individuo y se basan en la estimulacin in vitro de LT especficos (clulas TIL) o de clulas NK (clulas LAK) del paciente las que una vez activadas son readministradas al paciente. En este mismo sentido se han utilizado citoquinas estimuladoras de la respuesta inmunolgica como tratamiento en forma individual y en conjunto con la terapia celular adoptiva. Entre las estrategias ms recientes se encuentra la utilizacin de clulas tumorales modificadas genticamente, pptidos antignicos tumorales y DNA que exprese a los pptidos antignicos y a molculas co-activadoras. Todos estos casos son representativos de la denominada vacuna contra el cncer, vacuna de caractersticas teraputicas diseada para estimular la respuesta inmunolgica del paciente. Este conocimiento tambin ha permitido utilizar clulas dendrticas a las que se les incorpora in vitro el pptido antignico, y se le inserta el gen de molculas co-activadoras transformndolas en clulas presentadoras de antgenos tumorales y de las seales coactivadoras necesarias para una interaccin eficiente con los LT especficos.

1. INTRODUCCIN Las neoplasias son tejidos formados por clulas que debido a mutaciones en su material gentico, ven alterada la regulacin de su ciclo celular y comienzan a proliferar descontroladamente. La acumulacin de clulas neoplsicas asociadas a clulas infiltradas del sistema inmune forman los tumores. Las clulas tumorales a su vez, adquieren mediante un proceso de acumulacin de mutaciones, la capacidad de invadir otros tejidos distantes formando las denominadas metstasis. Las neoplasias con capacidad de producir metstasis constituyen los tumores malignos y producen un grupo de enfermedades llamadas cncer. Existen ciertos factores que permiten a algunas clulas liberarse paulatinamente de las condiciones que regulan la divisin celular. Sustancias

qumicas, como las producidas por el humo del tabaco, la irradiacin de rayos ultravioleta, algunas infecciones virales y mutaciones genticas heredadas son algunos de estos factores. Junto con la proliferacin celular descontrolada, estos cambios genticos dan origen a cambios en la expresin de protenas en la clula maligna, lo que se manifiesta en la sobre-expresin de algunos genes o en la activacin de genes que generalmente no se expresan en ciertos tejidos normales. Estos genes dan lugar a protenas que pueden ser reconocidas como aberrantes por el sistema inmune y propiciar una respuesta antitumoral. Aunque esta respuesta inmunolgica puede ser humoral, a travs de anticuerpos que reconocen protenas expresadas en la membrana de las clulas tumorales, experimentos realizados en animales y estudios recientes en humanos demuestran que el papel principal en la reaccin inmune

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antitumoral est dado por la respuesta celular, principalmente los linfocitos T (LT), los que reconocen antgenos procesados y presentados en asociacin con las molculas del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC). La paradoja existente entre la existencia de clulas antitumorales en los pacientes con cncer y la progresin sistemtica de la enfermedad, sugieren la existencia de mecanismos mediados por el tumor para evadir la respuesta del sistema inmune. Una de las mayores preocupaciones de la medicina a lo largo del tiempo, lo representa el conocimiento del cncer, hecho que se ha transformado en una verdadera lucha contra esta enfermedad. Entre las numerosas alternativas de tratamiento del cncer, estn obviamente las ms convencionales: la erradicacin del tumor mediante ciruga, procedimiento que sigue siendo una de las mejores alternativas; la quimioterapia y radioterapia, las que en su conjunto apuntan hacia la destruccin de las clulas tumorales, aprovechando especialmente la propiedad de activa divisin de estas clulas. Considerando el papel propuesto para el sistema inmune, de reconocimiento de los antgenos tumorales y la eliminacin de las clulas que los presentan, ha emergido la inmunoterapia del cncer. Esta se basa en la posibilidad de uso de anticuerpos monoclonales contra antgenos tumorales especficos, los que tambin van con el objetivo de la destruccin del tumor, y en la denominada terapia biolgica contra el cncer, que utiliza principios diferentes a los anteriormente mencionados en la accin antitumoral. La terapia biolgica contra el cncer, no va dirigida a destruir por s misma al tumor, sino que a provocar la activacin de los propios mecanismos inmunolgicos del paciente para que puedan actuar efectivamente contra el tumor. En este captulo se revisarn los mecanismos efectores de inmunidad antitumoral, las caractersticas de los antgenos tumorales, las estrategias de evasin utilizada por los tumores y los mtodos inmunoteraputicos para tratar el cncer.

pueden ser reconocidos por el sistema inmune y pueden generar una respuesta contra las clulas neoplsicas. Experimentos realizados en ratones singnicos, en la dcada del 40, demostraron que tumores inducidos qumicamente y luego extirpados conferan resistencia contra un desafo con el mismo tumor en otro ratn de la misma cepa. Esta resistencia estaba principalmente mediada por los linfocitos, ya que al ser estos trasplantados desde un animal resistente a uno no resistente transmitan la inmunidad. Estas y otras observaciones posteriores llevaron al cientfico australiano Sir Frank Macfarlane Burnet (1899-1985) a elaborar, en 1970, la hiptesis de vigilancia inmunolgica antitumoral. En ella se postula que una de las principales funciones del sistema inmune sera la de reconocer a las clulas neoplsicas y eliminarlas antes de que formen tumores. Esta afirmacin implica que, en ausencia del sistema inmune, la incidencia de tumores sera enormemente mayor. Sin embargo, observaciones realizadas en ratones inmunosuprimidos por alteraciones genticas o por manipulacin experimental, no concuerdan plenamente con esta hiptesis ya que la incidencia de tumores en stos no se ve, significativamente, alterada. En humanos, excepto por algunos tumores del sistema linforreticular, como el linfoma asociado a Epstein Barr virus, con una incidencia aumentada en pacientes postrasplantados y por lo tanto inmunosuprimidos, o el Sarcoma de Kaposi frecuente en pacientes con Sndrome de Inmunodeficiencia Adquirida, no existen evidencias de un aumento significativo de la incidencia de tumores por inmunosupresin que avalen la hiptesis. De todas formas, los avances en la comprensin celular y molecular de los procesos de presentacin y reconocimiento de antgenos asociados a las molculas MHC y la manipulacin teraputica del sistema inmune en la lucha contra el cncer, le ha conferido nuevamente validez al concepto de escape de la inmunovigilancia antitumoral pero ahora con relacin a la inmunoterapia. 2.2. Componentes de la respuesta inmune antitumoral El sistema inmune consiste en una serie de estrategias complejas desarrolladas durante la evolucin para combatir la invasin de microorganismos y para detectar, eliminando, clulas anmalas propias que puedan poner en peligro la supervivencia del organismo. Ambos bra-

2. DEFENSA INMUNOLGICA CONTRA EL CNCER 2.1. La hiptesis de vigilancia inmunolgica antitumoral La inmunologa antitumoral est basada en la premisa de que existen antgenos tumorales que

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zos del sistema inmune, el de la inmunidad innata y el del sistema inmune adquirido participan en la defensa inmunolgica antitumoral. El primero tiene uno de sus principales exponentes en las clulas NK (ver captulos 10 y 19). Las clulas NK han sido identificadas por su capacidad de reconocer espontneamente ciertas lneas celulares tumorales in vitro, clulas infectadas por virus y clulas alognicas. Estudios realizados, in vivo e in vitro, han establecido la capacidad de las clulas NK de reconocer clulas tumorales deficientes en la expresin de molculas MHC clase I. Tumores deficientes en molculas MHC clase I son ms eficientemente eliminados por ratones no inmunizados, efecto que desaparece totalmente con la neutralizacin de las clulas NK. Sin embargo, el papel fisiolgico de las clulas NK en la respuesta inmunolgica antitumoral no est lo suficiente bien clarificado, aunque existen indicios que permiten deducir una funcin relacionada con el control de las metstasis. 2.2.1. Respuesta inmunolgica humoral Durante varios aos la atencin de los inmunlogos del cncer estuvo enfocada al brazo humoral de la respuesta antitumoral. Se parta de la hiptesis de que existiran protenas de membrana especficas de los tumores o sobreexpresadas en stos, que permitiran una discriminacin entre la neoplasia y el tejido normal. Si bien varias protenas han sido identificadas como antgenos asociados al tumor (AAT), con presencia de anticuerpos especficos en el suero de los pacientes con cncer, estos anticuerpos tienen una importancia menor en los mecanismos de rechazo de los tumores y ms bien adquieren relevancia con relacin al diagnstico y a terapias inmunolgicas. Debido a que muchos antgenos tumorales no son necesariamente inmunognicos en el hospedero del tumor, su identificacin se ha realizado con anticuerpos xenogenicos, o sea a travs de la inmunizacin de otras especies con el tumor. Desde el punto de vista prctico, son ms bien marcadores tumorales aunque, a veces, se encuentran en pequeas cantidades en clulas normales o en tumores benignos. Ejemplos de estos antgenos son la -fetoprotena (-FP), el Antgeno Carcinoembrionario (CEA) y el Antgeno asociado a la Prstata (PSA).

2.2.2. Respuesta inmunolgica celular Sin duda, la actividad inmunolgica antitumoral ms importante est dada por la respuesta celular. Durante las ltimas tres dcadas se ha experimentado un enorme avance en la comprensin del funcionamiento del sistema inmune especialmente con relacin al reconocimiento antignico. Esta acumulacin de conocimientos, sumados al gran impulso de tcnicas de biologa molecular que facilitan el clonamiento de genes y la produccin de protenas recombinantes, han permitido la identificacin de antgenos asociados a tumores y su posterior caracterizacin. Experimentos pioneros demostraron que el crecimiento de tumores singnicos poda ser prevenido en ratones inmunizados con el mismo tumor irradiado para evitar su proliferacin. Guiados por estudios en modelos animales, los linfocitos T humanos han mostrado ser capaces de lisar especficamente tumores autlogos in vitro. Las clulas T son tambin capaces de secretar citoquinas como IL-2, IFN-, GM-CSF y TNF, y proliferar en respuesta a la estimulacin con clulas tumorales autlogas. Las clulas T antitumorales pueden ser expandidas in vitro y transferidas adoptivamente para tratar incluso grandes cargas tumorales en ratones y humanos. En conjunto, estos resultados proveen evidencias innegables de que una respuesta mediada por linfocitos T puede ocurrir contra los tumores autlogos. Las clulas presentadoras de antgenos (CPA) juegan un papel fundamental en la generacin de una respuesta antitumoral mediada por linfocitos T. Estas clulas especializadas, entre las que se incluyen los macrfagos, los linfocitos B y las clulas dendrticas (DC), poseen la capacidad de capturar antgenos tumorales y presentarlos asociados a las molculas MHC. Adems expresan gran cantidad de molculas coestimuladoras, las que proveen seales cruciales que garantizan la efectividad de la respuesta mediada por linfocitos T. Destacan en este aspecto las DC, tambin llamadas CPA profesionales, ya que se encuentran estratgicamente localizadas en los sitios de concentracin antignica, internalizan, procesan y presentan eficientemente antgenos solubles en el contexto de MHC clase I y II, siendo las ms eficientes en la induccin de una respuesta primaria de LT.

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3. ANTGENOS ASOCIADOS A TUMORES Los linfocitos T citotxicos (LTc) CD8+ tienen la capacidad de reconocer tumores a travs de fragmentos peptdicos de 8-10 aminocidos derivados de protenas citoplasmticas o nucleares que estn asociados al MHC clase I. Los LTc melanoma-especficos, transferidos adoptivamente o activados in vivo por eptopos de antgenos asociados a melanoma, poseen capacidad teraputica, pudiendo inducir la regresin de tumores y sus micrometstasis. Durante los ltimos aos varios antgenos melanoma-asociados reconocidos por LTc han sido identificados y sus eptopos peptdicos caracterizados utilizando mtodos genticos y bioqumicos. 3.1. Clasificacin de AAT reconocidos por LT Los AAT reconocidos por linfocitos T pueden ser agrupados de acuerdo al origen de las protenas de las cuales derivan, de los niveles de su expresin y de su distribucin en distintos tejidos. El primer grupo est conformado por los llamados Antgenos tumor-especficos. Los genes de estos antgenos codifican protenas de origen embrionario, silentes en clulas adultas y solamente expresados en el tejido tumoral. El cientfico belga Thierry Boon y colaboradores han definido varios antgenos de este tipo tales como MAGE1, MAGE-3, BAGE y GAGE entre otros. Clulas tumorales que expresan estos antgenos han sido encontradas en tumores de distinto origen (tabla 37-1). Entre los llamados Antgenos de diferenciacin tisular o tejido-especficos se agrupan la mayora de los antgenos reconocidos por los linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) de pacientes con cncer. Estas protenas se expresan no slo en el tumor sino que tambin en los tejidos normales de los cuales stos derivan. Tambin pueden ser encontrados en otros tejidos normales aunque en niveles de expresin mucho menores. En melanoma, uno de los tumores ms caracterizados, existen varias protenas asociadas a la sntesis y control de la melanina como MART-1/MelanA; gp100, tirosinasa y MC1R que son AAT. Un tercer grupo lo conforman los Antgenos derivados de Oncogenes y Proto-Oncogenes. P53, pRas, y HER2/neu son genes que codifican protenas relacionadas directamente con el control del ciclo celular. Ha sido demostrado que muchos tumores poseen mutaciones en estos genes o bien stos se encuentran sobreexpresados en las clu-

las cancergenas. Pptidos derivados de estas protenas, normales o mutadas, pueden ser reconocidos por LT. Existe una clara relacin entre algunos tipos de cncer e infecciones virales. El virus papiloma humano (HPV) ha sido asociado a ciertos tumores cervicales y el virus Epstein Barr (EBV) a algunos linfomas tipo B. Las clulas tumorales infectadas con estos virus presentaran antgenos virales en el contexto de molculas MHC, los que seran reconocidos por las clulas LT. A la luz de las investigaciones llevadas hasta ahora resulta cada vez ms clara la casi inexistencia de antgenos tumorales propiamente tales, excepto los de origen embrionario, que se expresan nica o especialmente en los tumores. El reconocimiento de AAT por parte del sistema inmune se debera principalmente a la sobreexpresin o a la expresin inadecuada de algunas protenas en ciertos tejidos, lo que relaciona a la respuesta inmune antitumoral con fenmenos de autoinmunidad.

4. ESTRATEGIAS TUMORALES DE EVASIN INMUNOLGICA Los tratamientos inmunoteraputicos utilizados hasta hoy para combatir el cncer no han sido del todo exitosos, produciendo una respuesta positiva solamente en una parte de los pacientes. Varias razones incidiran en las dificultades para activar ptimamente al sistema inmune de los pacientes con cncer. Algunos se deberan a la inmunosupresin propia de estos enfermos, aunque la mayora est ms relacionada con alteraciones del sistema inmune inducidas por el propio tumor. Los mecanismos de evasin tumoral han sido resumidos en la tabla 37-2 y algunos de ellos discutidos ms abajo. 4.1. Disminucin de la expresin de las molculas MHC La mayora de los pptidos asociados al MHC clase I derivan de protenas propias intracelulares o de microorganismos infecciosos (ver captulo 9). Estas protenas son cortadas en segmentos polipeptdicos y transportadas por distintas protenas chaperonas hasta asociarse a molculas MHC y ser presentadas en la superficie celular a los linfocitos T. Defectos en el funcionamiento de cualquiera de los componentes del procesamiento

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Tabla 37-1. Antgenos tumorales humanos reconocidos por clulas T MHC clase I restringidas Tipo de antgeno tumoral Neoplasias que presentan el pptido Pptido Molcula MHC-I presentadora

Productos de oncogenes activados Ras Producto p210 del reorDenamiento de bcr/abl

10 % de tumores humanos Leucemia mieloide crnica, leucemia linfoblstica aguda Carcinomas pancretico, mamario, ovrico, gstrico, colorectal y melanoma

HER-2/neu/c-erb/p185

CLLDILDTAGL VVVGAVGVG SSKALQRPV ATGFKQSSK KQSSKALQR ATGFKQSSK GFKQSSKAL KIFGSLAFL IISAVVGIL VMAGVGSPYV ELVSEFSRM QLFEDNYAL RLLQETELV ILHNGAYSL ALCRWGLLL VLRENTSPK

A2 B35 A2 A3 A3 A11 B8 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A3

Productos de genes supresores de tumor p53 mutada 50% de tumores humanos LLPENNVLSPL GLAPPQHLIRV RMPEAAPPV KTCPVQLWV Producto de genes embrionarios reactivados MAGE-1 MAGE-2 MAGE-3 BAGE GAGE RAGE A2 A2 A2 A2

Melanomas, carcinomas, sarcomas y otros

EADPTGHSY SAYGEPRKL KMVELVHFL YLQLVFGIEF EVDPIGHLY FLWGPRALV KVAELVHFL MEVDPIGHLY AARAVFLAL YRPRPRRY SPSSNRIRNT

A1 CW*1601 A2 A2 A1 A2 A2 B44 CW*1606 CW6 B7

Antgenos de diferenciacin tejido-especficos MART-1/Melan-A gp100/Pmel 17

Melanomas y otros

AAGIGILTV ILTVILGVL ITDQVPFSV LLDGTATLRL VLYRYGSFSV

A2 A2 A2 A2 A2

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Tirosinasa

MC1R

Antgeno especfico prosttico

KTWGQYWQV YLEPGPVTA YMDGTMSQV MLLAVLYLL AFLPWHRLF SEIWRDIDF TILLGIFEL FLALIICNA AIIDPLIYA KLQCVDHLV FLTPKKLCQV VISNDVCAQV LLHETDASV ALFDIESKV

A2 A2 A2 A2 A24 B44 A2 A2

Antgeno especfico prosttico Carcinomas prostticos de membrana

Protenas propias ampliamente expresadas Antgeno carcinoembrionario MUC-1

A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A2 A11 A2 A2 A2 A2 A11 A11 A2 A3 A2 A11 A2 B14

Variados carcinomas mamarios, ovricos y carcinomas pancreticos

YLSGANLNL IMIGVLVGV STAPPAHGV

Productos de genes virales Protenas E6 y E7 del virus papiloma humano Protenas del virus EpsteinBarr

Carcinoma cervical

Protenas del virus hepatitis B Protenas del virus-1 de la Leucemia de clulas T Humana Antgenos mutados CDK4-R24C-1 mutada b-catenina

Enfermedad de Hodgkin Linfoma de Burkitt y carcinomas nasofarngeos, Carcinoma hepatocelular Leucemia de clulas T

FAFRDLCIV LLMGTLGIV YMLDLQPETT TLGIVCPI AVFDRKSVAK IVTDFSVIK CGLGLLTMV RLRAEAGVK FLPSDFFPSV YVNVNMGLK LLFGYPVYV VPYKRIEEL

Melanoma

EEKLIVVLF ACDPHSGHFV SYLDSGIHF

B-44 A2 A24

Tabla adaptada de Salazar-Onfray et al. Med Oncol, 1999.

y presentacin antignica incide en una incapacidad de los linfocitos T de reconocer a la clula presentadora, en este caso la clula tumoral. La prdida de uno o varios alelos de HLA ("Human Leukocyte antigen", MHC en humanos) es un evento comn en varios tipos de tumores especialmente en las metstasis. Estos defectos han sido atribuidos a mutaciones puntuales en la 2-

microglobulina o en otros genes del complejo MHC. Recientemente defectos en otras protenas relacionadas con la presentacin antignica como los proteosomas y las TAP han sido tambin descritos en melanomas y otros carcinomas.

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Tabla 37-2. Mecanismos de escape a la vigilancia del sistema inmune utilizada por los tumores Prdida de la expresin de MHC para evitar el reconocimiento por los LT. Disminucin o prdida en el tumor de la expresin de antgenos asociados al tumor. Disminucin o prdida de la expresin de molculas coestimuladoras, en el tumor o en las clulas dendrticas, requeridas para una eficiente interaccin con los LT. Neutralizacin de la respuesta inmune a travs de la induccin de anergia o debido a la eliminacin clonal de los LT especficos. Activacin, mediada por el tumor, de clulas supresoras o clulas del sistema inmune que secretan citoquinas inhibidoras. Cambios, inducidos por el tumor, en las molculas transductoras de seales en los LT. Utilizacin de factores estimulantes, que favorecen el crecimiento tumoral, producidos luego de la activacin del sistema inmune (TGF-). Secrecin de factores inmunosupresores por los tumores (Prostaglandina E2 e IL-10).

alta afinidad inactivando los LT, clulas NK y a las clulas LAK (clulas NK activadas por linfoquinas). En humanos el TGF- ha sido involucrado en el aumentado potencial metastsico de melanomas y otros carcinomas. La IL-10 es una citoquina del tipo Th2, la que favorece una respuesta de tipo humoral ms que celular, siendo esta ltima la ms efectiva contra los tumores. La IL-10 inhibe adems la produccin de citoquinas pro-inflamatorias en monocitos y macrfagos y reduce la expresin de MHC clase I y II en las clulas presentadoras de antgenos. Esto redunda directamente en la inhibicin del crecimiento y activacin de linfocitos T y clulas NK y por lo tanto en el escape de los tumores. La IL-10, que es producida por una gran variedad de tumores, inhibe la expresin de MHC clase I y II en stos a travs de la inhibicin de componentes del procesamiento y presentacin antignica como las TAP y los proteosomas.

5. TERAPIA INMUNOLGICA CONTRA EL CNCER La utilizacin del sistema inmune para combatir el cncer es una antigua idea, extensamente investigada durante varias dcadas. Algunos perodos de la historia de la inmunologa antitumoral han estado marcados por un excepcional entusiasmo y optimismo respecto de los beneficios que estas terapias proporcionaran a los pacientes con cncer, mientras que otros son acompaados por la frustracin y el escepticismo. De todas formas, ciertas terapias inmunolgicas han dado resultados esperanzadores, lo que unido con una comprensin ms profunda del funcionamiento del sistema inmune abre buenas perspectivas para el tratamiento generalizado de cierto tipo de tumores. 5.1 Anticuerpos monoclonales. La capacidad de los anticuerpos de reconocer protenas aberrantes en la membrana celular y el desarrollo de la tcnica de produccin de anticuerpos monoclonales (AcMo), ha permitido la utilizacin de estos ltimos en tratamientos contra algunos tipos de cncer con buenos resultados. Recientemente se ha demostrado un aumento en la sobrevida de pacientes con carcinomas colo-rectales tratados con AcMo contra CEA. Otros AcMo, actualmente en uso clnico o en las ltimas fases de desarrollo son: anti-Her2/Neu en el caso de cncer mamario y antiCD20 en linfoma (tabla 37-3). Existiran varios

Tabla adaptada de Salazar-Onfray et al. Med Oncol, 1999.

4.2. Factores inmunosupresores producidos por los tumores Numerosos factores inmunosupresores producidos por las clulas tumorales han sido identificados y estudiados en relacin al escape tumoral. Un ejemplo clsico es la Prostaglandina E2 (PGE 2 ). La PGE 2 ha sido implicada en la patognesis del cncer actuando a travs de la inmunorregulacin. Evidencias indirectas que indican que el tratamiento profilctico con cido acetil-saliclico, un inhibidor de la sntesis de PGE2, reduce la incidencia de cncer colo-rectal, respalda el rol de la PGE22 en la progresin de los tumores. El Factor de Crecimiento Transformante- (TGF-) y la Interleuquina-10 (IL-10) son las citoquinas con mayor efecto inmunosupresor. Experimentos en animales indican que la mayor actividad de la TGF- in vivo es la promocin de la invasin y la metstasis. In vitro el TGF inhibe la expansin de las LTc y de los linfocitos B, inhibe la expresin de receptores de IL-2 de

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mecanismos por los cuales los AcMo pueden destruir a los tumores. Uno, es la activacin del sistema de complemento, esto determinado por el isotipo del AcMo. Los AcMo pueden tambin inducir citotoxicidad celular dependiente de Ac (ADCC) contra los tumores. La ADCC es eficientemente mediada por las clulas NK, pero adems puede ser mediada por monocitos, macrfagos y granulocitos. Estas clulas contienen receptores para los Fc que activan la citotoxicidad. Finalmente los AcMo podran ser directamente letales para las clulas tumorales por la induccin de apoptosis, a travs del bloqueo de receptores de membrana esenciales para algn factor de crecimiento o la inhibicin del contacto intercelular. Otra estrategia basada en los AcMO pero tambin con pocos exponentes en uso clnico son los anticuerpos unidos a compuestos txi-

cos para la clula como radionuclidos o toxinas, estos conjugados se denominan inmunotoxinas. El mecanismo general de estos agentes se basa en la interaccin especfica con la clula tumoral y en su posterior internacin. La toxina una vez en el interior celular puede ejercer su accin txica. 5.2 Terapia biolgica contra el cncer. Esta inmunoterapia conceptualmente corresponde a la activacin de los mecanismos defensivos del paciente, en este caso dirigidos contra el tumor. El creciente conocimiento acerca de las diversas citoquinas, historia que comenz a fines de la dcada del 50 con la descripcin de la molcula de interfern, cre grandes expectativas de inmunoterapia contra el cncer y otras enfermedades, especialmente infecciosas. Entre muchos intentos fallidos, al inicio de la dcada de los 80

Tabla 37-3. Inmunoterapia del Cncer1 Clulas activadas o modificadas genticamente2 a) Clulas LAK b) Clulas TIL Clulas TIL CD4+ o CD8+ Clulas TIL modificadas genticamente. Introduccin de genes de citoquinas o de factores de crecimiento. c) Clulas tumorales modificadas genticamente Introduccin de genes de citoquinas, factores de crecimiento y otros MHC, B7. d) Clulas dendrticas modificadas. Presentacin de antgenos tumorales (incorporados in vitro) Introduccin de genes de molculas co-activadoras. Anticuerpos y citoquinas2 Citoquinas: IL-2, IFN-, IFN-. Anticuerpos monoclonales contra los antgenos CEA (cncer colo-rectal), Her-2Neu (cncer mamario), CD20 (linfoma). Antgenos tumorales2 Pptidos antignicos DNA: con informacin para la expresin del antgeno tumoral y para la expresin de molculas co-activadoras.
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Estos tratamientos se aplican, en general, de forma mixta y tambin en conjunto con los tratamientos convencionales: quimioterapia, radioterapia, hormonoterapia. 2 Muchos de estos tratamientos se encuentran an en fases clnicas de desarrollo. LAK, clulas NK activadas por linfoquinas; TIL, linfocitos infiltrantes de tumor

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comenz la visin de una terapia basada en el uso de clulas citotxicas del propio paciente: inmunoterapia adoptiva primero inespecfica, clulas LAK, y posteriormente especfica, clulas TIL, pptidos antignicos y clulas dendrticas (figura 37-1).

inducir la presentacin antignica en las CPA incluyendo las clulas tumorales. Hasta ahora, el principio utilizado ha sido el uso de una citoquina estimuladora en altas concentraciones. Tomando en cuenta la amplia variedad de estos compuestos y de otros mediadores endgenos que modulan la

Figura. 37-1. Esquema general de obtencin de linfocitos activados o de clulas tumorales modificadas genticamente utilizados en la terapia biolgica contra el cncer.

5.2.1 Utilizacin de citoquinas. En el caso de citoquinas nicamente como inmunoterapia, se han utilizado IFN-, IFN-, IL-2 y GM-CSF, entre muchas otras. Tambin se ha intentado mezclas de citoquinas y citoquinas ms tratamientos convencionales (tabla 37-3). La base del uso de las citoquinas es la accin estimuladora de la respuesta inmune del hospedero y no necesariamente una accin directa sobre las clulas tumorales. La citoquina IL-2 ha sido una de las ms estudiadas; de 15,5 kDa, es producida por los linfocitos T activados, presenta un t1/2 de 8 horas en la circulacin y se la ha utilizado en protocolos de altas y bajas dosis. El efecto antitumoral de esta citoquina parece derivar de al menos dos acciones diferentes: La IL-2 puede mediar la generacin de clulas citotxicas inespecficas, a partir de linfocitos precursores en reposo, que pueden destruir las clulas tumorales. Adems de esta accin antitumoral, esta citoquina puede expandir a las clulas T que reconocen especficamente antgenos tumorales, provocando una respuesta especfica. Este tipo de tratamientos ha tenido una respuesta objetiva (remisin completa y/o parcial) del orden del 20%. Otra citoquina muy utilizada, especialmente en melanomas, es el IFN- cuyo efecto principal es

respuesta inmune en un delicado balance, no parece ser la mejor de las opciones. Este punto se ha visto reforzado por una observacin que cada vez se hace ms general en la respuesta inmune: los mecanismos de activacin celular pueden culminar en la destruccin de la clula activada por mecanismos de muerte celular programada o apotosis. En el caso de las clulas NK este tipo de mecanismo ya est claramente establecido, la estimulacin simultnea por ejemplo por IL-2 e IL-12 o IL-12 e IL-15, provoca inicialmente estimulacin celular y posteriormente apoptosis. Por lo tanto, es posible que la toxicidad de los tratamientos en base a citoquinas podra deberse, en parte a este fenmeno. Estos tratamientos tienen un efecto parcial y varios efectos colaterales si se utilizan dosis altas, tales como nuseas, fiebre y dolores musculares intensos. Su efecto en todo caso, es lo suficientemente importante como para ser un tratamiento alternativo en algunos tipos de cncer. 5.2.2. Terapia celular adoptiva a) Precursores clulas NK. Se basa en la activacin general in vitro de linfocitos sanguneos perifricos, con altas dosis de las citoquinas IL-2,

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IL-7 o IL-12. Bajo estas condiciones de cultivo, se genera una nueva estirpe celular inespecfica (clulas LAK) cuyos precursores son las clulas NK circulantes, y que se caracteriza por adquirir una mayor agresividad y una accin ltica ms amplia. La clave de su utilizacin como inmunoterapia la dio la observacin que estas clulas eran capaces de lisar muy eficientemente in vitro las clulas del tumor autlogo; accin de la que las clulas NK precursoras carecan. Una vez obtenidos los linfocitos a travs de un procedimiento denominado leucofresis, que permite obtenerlos en grandes cantidades, se tratan in vitro con la citoquina, principalmente IL-2 y posteriormente se readministran al paciente, generalmente en protocolos mixtos: clulas activadas ms la citoquina activadora. En los seres humanos normales, la mayora de las clulas NK circulantes se encuentra en reposo, por lo tanto, la generacin de las clulas LAK, se puede seguir, adems de su citotoxicidad, por el aumento de las proporciones de clulas CD56+, CD25+ (IL-2R; indicador de activacin de los linfocitos). Han sido ampliamente utilizados en cncer renal metastsico y melanomas malignos, con un mximo de respuesta objetiva (remisiones completas y parciales) de un 30-40 %. La distribucin de las clulas LAK in vivo en modelos animales y en algunos pocos casos de tratamiento en la patologa humana, ha demostrado que se distribuyen primeramente en los pulmones y posteriormente en hgado y bazo y no necesariamente en el sitio del tumor. Por ello tambin se han administrado localmente en el sitio del tumor o sitios adyacentes. Si bien constituyen una alternativa real, existen riesgos como la toxicidad del tratamiento, lo que implica un riguroso control del paciente en todas las etapas del tratamiento. Las clulas LAK se utilizan tambin en conjunto con tratamientos convencionales, quimio y radioterapia en donde se ha observado una potenciacin de su accin. Tambin se han utilizado clulas A-NK, una subpoblacin de clulas NK activadas por IL-2 y adherentes, ambas caractersticas necesarias para su aislamiento desde la sangre perifrica o del bazo. Las clulas A-NK, expresan CD11a/CD18, son muy eficientes en la produccin de citoquinas, migracin e ingreso a rganos slidos y muy eficientes tambin en la eliminacin de las metstasis. La utilizacin de anticuerpos monoclonales (ver captulo 43) unidos a soportes magnticos y la citometra de flujo (ver captulo 42) han sido contribuciones fundamentales para la obtencin

de fracciones celulares altamente purificadas para su uso potencial en terapia. b) Precursores clulas T. Se basa en la activacin de los linfocitos que han infiltrado el tumor, es decir que ya han reconocido antgenos tumorales, pero que obviamente, en su totalidad, la respuesta no ha sido suficiente para erradicar el tumor. El proceso por lo tanto requiere la extirpacin quirrgica del tumor o bien el manejo de una biopsia, la que debe ser disgregada por tratamientos enzimticos convencionales para la obtencin de clulas a partir de un tejido, separacin de los linfocitos infiltrantes del tumor (TIL) y cultivo de stos en el laboratorio en presencia de IL-2 para lograr una densidad celular que permita readministrarlos al paciente, generalmente tambin en forma mixta: clulas infiltrantes ms la citoquina utilizada. Este tipo de linfocitos es CD4+, CD8+; principalmente CD8, que ha demostrado actividad citoltica especfica in vitro contra las clulas del tumor autlogo y adems una efectividad, en modelos animales, de uno a dos rdenes de magnitud mayor a las clulas LAK en lo que se refiere a reduccin de las metstasis. La mayora de las clulas TIL expresan los marcadores de activacin CD25 y CD28 (el ligando de B7). Han sido utilizadas tambin preferentemente como tratamiento de cncer renal metastsico y melanoma maligno y con resultados porcentuales no mayores a los obtenidos con las clulas LAK. Un hecho de gran relevancia de estas clulas fue que se demostr que debido a su especificidad, una vez administradas podan ser detectadas en el sitio del tumor, es decir pueden volver al tumor original. La figura. 37-1 esquematiza la obtencin de estos tipos celulares para la utilizacin clnica. Si bien no son del todo conocidos los mecanismos por los cuales estas clulas citotxicas (LAK y TIL) median sus efectos teraputicos, obviamente la destruccin del tumor mismo o de sus metstasis y la eliminacin de las clulas tumorales debera ser uno de los ms importantes. Las clulas TIL son principalmente LTc CD8+ y por lo tanto capaces de reconocer y lisar a clulas que presenten antgenos tumorales. De hecho las clulas TIL se han utilizado como precursores para identificar nuevos antgenos principalmente de melanoma. Tanto las clulas LAK y TIL median sus efectos citotxicos a travs del mecanismo membranoltico y dependiente de FasL-Fas. Sin embargo, adems de la citotoxicidad el contacto

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de las clulas LAK y TIL con las clulas tumorales provoca la liberacin de diversas citoquinas y factores de crecimiento. Este ltimo mecanismo, es de especial importancia, pues la liberacin en el sitio del tumor, de citoquinas como TNF-, GMCSF, IFN-, que poseen propiedades citotxicas y de reclutamiento y activacin de otras clulas inmunocompetentes, se encamina justamente al objetivo de destruccin del tumor por los propios mecanismos inmunolgicos del paciente. Adems, se ha intentado purificar la poblacin celular efectora; es necesario enfatizar que estas poblaciones celulares son altamente heterogneas y que adems su rendimiento va a depender del estado del paciente del cual se obtienen, lo que por s mismo constituye un proceso altamente complejo. Una alternativa que resume varias caractersticas teraputicas importantes la constituye el uso de clulas TIL modificadas genticamente. Considerando las propiedades de estas clulas, especialmente su localizacin en el sitio del tumor, la posibilidad de insercin de un gen, especficamente de alguna citoquina, que permita su secrecin en el mismo sitio del tumor apareca como una posibilidad muy interesante. En modelos animales el esquema de tratamiento con clulas TIL modificadas genticamente ha funcionado muy bien; en el caso de inmunoterapia para el cncer humano, se han insertado a clulas TIL los genes de IL-2, TNF-, IFN-, alternativas que se encuentran en estudio. Actualmente, se utilizan adems tratamientos de terapia biolgica en conjunto con tratamientos convencionales de quimioterapia o radioterapia. La tabla 37-3, resume algunas de las alternativas ms utilizadas hasta ahora en esta rea de la biomedicina. 5. 3. Inmunizacin activa contra tumores El comienzo de la historia basada en la idea que el sistema inmune puede detener el desarrollo de un tumor, comienza a fines del siglo pasado, cuando se observ la regresin de esta enfermedad en algunos pacientes que contraan enfermedades infecciosas bacterianas. Uno de los hitos importantes fue el logrado por el mdico William B. Coley, quien lleg a utilizar bacterias atenuadas como tratamiento de pacientes con cncer. Desde luego, este tipo de enfoque inespecfico, corresponde a lo que actualmente conocemos como inmunoterapia, y ms an a un intento de vacuna contra el cncer, que justamente representa en la

actualidad uno de los ltimos y ms esperanzadores enfoques teraputicos. Actualmente el enfoque de terapia del cncer de Coley, se puede considerar como de activacin no especfica del sistema inmune. Ese enfoque se sigue aplicando, siendo uno de los ejemplos ms representativos el tratamiento del cncer a la vejiga por tratamiento a nivel local con el bacilo Calmette-Gurin o BCG, el cual genera una respuesta inflamatoria. Por lo tanto, son los mediadores de la inflamacin los activadores de la respuesta que ataca al tumor. En contraste con las vacunas contra agentes infecciosos extracelulares, en las cuales la estrategia ms importante es la activacin del sistema inmune humoral y la generacin de anticuerpos neutralizantes, el foco de las vacunas contra el cncer est dirigido a la generacin de la respuesta celular especfica mediada por linfocitos T. Hasta ahora, las vacunas contra el cncer no son preventivas, sino ms bien teraputicas. stas intentan la activacin del sistema inmune contra molculas sobreexpresadas o mutadas, presentes en las clulas tumorales, con el fin de eliminar tumores preexistentes en el hospedero. Las clulas tumorales por lo general son poco inmunognicas y adems capaces de inducir tolerancia activamente. Esto principalmente debido a la carencia de molculas co-estimuladoras y a la secrecin de factores inmunosupresores. La estrategia de las vacunas antitumorales es quebrar este estado de tolerancia aumentando la densidad de los antgenos expresados en las molculas MHC acompaada de un incremento de las molculas co-estimuladoras. La forma ms simple de intentar inmunizar pacientes con cncer, consiste en utilizar clulas tumorales autlogas irradiadas o tratadas qumicamente para evitar su proliferacin una vez reinyectadas en el paciente. Estas clulas tumorales pueden ser genticamente modificadas con el fn de que expresen molculas co-estimuladoras y/o citoquinas proinflamatorias como IL-2, IL-4, IFN o GM-CSF, (ver figura. 37-1) lo que eleva la inmunogenicidad de los tumores generando una respuesta ms eficiente contra las metstasis. Nuevamente en base a modelos animales se ha podido formar el siguiente escenario que permite explicar esta accin: las clulas tumorales genticamente modificadas, deben secretar in vivo la citoquina que expresan, lo que a su vez debe traer como consecuencia la activacin y/o reclutamiento de linfocitos CD4, CD8, clulas NK y de CPA. Como resultado de esta accin deberan

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destruirse las clulas tumorales, favorecindose adems la presentacin de los antgenos tumorales por las clulas presentadoras. Finalmente entonces, el tumor debera ser rechazado mediante la accin de clulas efectoras especficas. Una de las posibilidades ms interesantes de este tipo de tratamientos ha sido la utilizacin de clulas tumorales (melanoma, cncer prosttico, cncer renal) modificadas genticamente por la insercin del gen de GM-CSF. Esta citoquina es un factor de crecimiento muy importante para las DC, de modo que estas clulas pueden activarse en estas condiciones y por lo tanto capturar y procesar antgenos tumorales. Bajo estas condiciones, las DC tambin pueden expresar la molcula coestimuladora B7, necesaria para la respuesta mediada por los LT. La identificacin de eptopos de AAT ha permitido explorar la inmunizacin con pptidos recombinantes derivados de los antgenos gp100 y MART-1 en melanoma y Her2/Neu en cncer ovrico. Estos intentos no han sido del todo exitosos, pero han permitido mejorar los protocolos de inmunizacin. Durante los ltimos dos aos, ha adquirido mayor relevancia el papel de las clulas presentadoras de antgeno profesionales como las clulas dendrticas, en la induccin de la respuesta inmune contra los tumores. Las DC, derivadas de monocitos de sangre perifrica, pueden ser activados in vitro utilizando IL-4 y GMCSF y expandidas en cantidades suficientes para inmunizar. Previo a la inmunizacin, las DC son cargadas exgenamente con pptidos antignicos o transfectadas con genes que codifican estos antgenos. Las respuestas a estos tratamientos son las ms promisorias y pareciera que sera la estrategia a seguir. La combinacin in vitro de DC con clulas tumorales apoptticas, permite la presentacin de mltiples antgenos tumorales en una misma clula presentadora, en un contexto adecuado para la induccin de respuesta. Una de las tcnicas ms modernas de inmunizacin, consiste en la utilizacin de DNA desnudo conteniendo los genes codificadores de antgenos tumorales, generalmente asociado a genes que inducen la inflamacin, citoquinas, protenas bacterianas etc. Las vacunas de ADN, sorprendentemente eficientes, estn siendo exploradas no solamente en el contexto de la inmunologa antitumoral, sino que adems como estrategia antiviral o contra otros patgenos, (ver captulo 35). En resumen, el desarrollo de la inmunologa

antitumoral, si bien no ha sido lo suficientemente exitosa desde el punto de vista teraputico, ha permitido avanzar enormemente en la comprensin del sistema inmune y contina abriendo perspectivas en la utilizacin de las defensas naturales de nuestro organismo en el combate contra el cncer, uno de los enemigos ms enconados de la especie humana.

LECTURAS SUGERIDAS Greten, T.F. y Jaffee, E.M., Cancer vaccines, J Clin Oncol 17:1047-1060, 1999. Rosenberg, S.A., A new era for cancer immunotherapy based on the genes that encode tumor antigens. Immunity 10: 281-287, 1999. Salazar-Onfray, F., Interleukin-10: a strategy used by tumors to escape from the immune system (Review). Med Oncol 16: 86-94, 1999. Van den Eynde, B.J. y van der Bruggen, P., T cell defined tumor antigens, Curr Opin Immunol 9: 684- 693, 1997.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 38
MECANISMOS INMUNOLGICOS DEL RECHAZO DE ALOINJERTOS

Cecilia Seplveda C.

1. Introduccin 2. Rechazo de aloinjertos 2.1. Presentacin directa de aloantgenos 2.2. Presentacin indirecta de aloantgenos 2.3. Clulas que participan en el rechazo 3. Mecanismos efectores del rechazo 3.1. Rechazo hiperagudo 3.2. Rechazo agudo 3.3. Rechazo crnico 4. Prevencin y tratamiento del rechazo 4.1. Inmunosupresin 4.2. Seleccin de donantes 4.3. Induccin de tolerancia

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RESUMEN En la actualidad los trasplantes son cada vez ms frecuentes. Muchas personas requieren ser sometidas a este tipo de tratamiento en el cual se reemplazan clulas, tejidos u rganos enfermos, por otros, provenientes de un donante sano. Una barrera importante al xito de los trasplantes es, sin embargo, la barrera inmunolgica, lo que conocemos como rechazo. En este captulo se presenta y discute los principales mecanismos de rechazo, sus caractersticas y componentes. Asimismo se discute las estrategias ms importantes para lograr un mayor xito en la sobrevida y funcionamiento de los trasplantes, ya sea efectuando trasplantes entre individuos con la mayor semejanza posible o a travs del uso de terapias inmunosupresoras.

1. INTRODUCCIN Trasplante es el proceso de tomar clulas, tejidos u rganos (el trasplante o injerto) de un individuo y colocarlo (generalmente) en otro individuo. El individuo que proporciona el injerto es el donante y el que lo recibe es el receptor. Un injerto trasplantado en el mismo individuo del cual se obtuvo se denomina trasplante autlogo o autotrasplante. Un injerto trasplantado entre individuos genticamente idnticos o singeneicos se denomina trasplante singeneico. Un trasplante efectuado entre individuos genticamente diferentes pero que pertenecen a la misma especie se llama trasplante alogeneico o alotrasplante. Un injerto entre individuos de especies diferentes es un trasplante xenogeneico o xenotrasplante. Las molculas que son reconocidas como extraas por el sistema inmune del receptor en los alotrasplantes son los aloantgenos y las de los xenotrasplantes son los xenoantgenos. Los linfocitos y anticuerpos que reconocen aloantgenos o xenoantgenos se denominan alorreactivos o xenorreactivos, respectivamente. La mayor parte de los trasplantes que se efectan en la actualidad son alotrasplantes. Los ms comunes son los de rin, corazn e hgado, pero es cada vez ms frecuente el injerto de otros rganos como pncreas, intestino y pulmn. La transfusin de sangre, trasplante de clulas sanguneas circulantes y/o plasma de un individuo a otro, es tambin muy frecuente, as como el trasplante de mdula sea.

La respuesta inmune del receptor a los aloantgenos del donante presentes en el injerto es muy intensa y se denomina rechazo. Esta respuesta de rechazo es una de las principales barreras al xito de los trasplantes, por lo que su estudio y comprensin es de la mayor importancia.

2. RECHAZO DE ALOINJERTOS La respuesta inmune a los aloantgenos puede ser tanto humoral como celular, siendo en general, la respuesta inmune celular la de mayor importancia. El reconocimiento del mosaico antignico que significa el injerto, ya sea como propio o extrao, est determinado principalmente por las molculas codificadas por el Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC), presentes en las membranas celulares. Como es conocido, las molculas MHC juegan un rol crtico en la respuesta inmune a antgenos extraos, principalmente en la presentacin de pptidos derivados de antgenos proteicos de una forma que ellos puedan ser reconocidos por las clulas T. Por ello, el rol de las molculas MHC como aloantgenos es incidental. Las molculas MHC alognicas pueden ser presentadas para el reconocimiento de las clulas T del receptor por dos vas fundamentalmente diferentes. La primera es la llamada presentacin directa e involucra el reconocimiento de molculas MHC intactas expresadas en la membrana de clulas presentadoras de antgenos (CPA) del donante en el injerto y es una consecuencia de la

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similitud entre molculas MHC intactas del injerto y las del receptor. La segunda va, llamada presentacin indirecta, involucra el procesamiento de las molculas MHC del donante por CPA del receptor y la presentacin de los pptidos derivados de estas MHC alognicas asociadas con las MHC propias del receptor. En este caso, las molculas MHC del injerto son procesadas y presentadas como cualquier antgeno extrao, siendo los mecanismos de la presentacin indirecta indistinguibles de los que normalmente utiliza el sistema inmune (figura 38-1).

expresadas en las membranas celulares normalmente tienen pptidos unidos. Como durante el proceso de tolerancia central se eliminan o inactivan slo las clulas T que reconocen pptidos propios unidos a MHC propios, las clulas T especficas para reconocer pptidos propios unidas a MHC alognicos persisten a este proceso de seleccin y son capaces de responder a los aloinjertos. Se ha calculado que hasta un 2% de las clulas T son capaces de reconocer y responder directamente a una sola molcula MHC extraa y esta alta frecuencia de clulas T reactivas

Figura 38-1. Vas de presentacin de Ag de trasplante: directa e indirecta.

2.1. Presentacin directa de aloantgenos El reconocimiento directo de molculas MHC extraas se debe a que los receptores de clulas T normales presentes en el receptor, seleccionadas para reconocer molculas MHC propias asociadas a pptidos extraos, reconocen las molculas MHC alognicas del injerto asociadas a pptidos, debido a la similitud estructural entre stas (reaccin cruzada). Las molculas MHC alognicas con un pptido unido pueden imitar el determinante formado por una molcula MHC propia ms un determinado pptido extrao. Las molculas MHC

con molculas MHC alognicas es una de las razones del por qu los aloinjertos generan respuestas inmunes intensas in vivo. 2.2. Presentacin indirecta de aloantgenos Molculas MHC alognicas pueden tambin ser reconocidas como molculas extraas convencionales. Como las molculas MHC extraas difieren estructuralmente de las del receptor, ellas pueden ser procesadas y presentadas de la misma manera que cualquier antgeno extrao, esto es, como pptidos asociados con las molculas MHC propias del receptor. La presentacin indirecta

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usualmente implica el alorreconocimiento por clulas T CD4+ ya que los aloantgenos usualmente son procesados por las CPA del receptor por la va vesicular endosmica y requiere la presentacin por molculas MHC clase II. Es posible, sin embargo, que algunos aloantgenos sean reconocidos por clulas T CD8+ y presentados va molculas MHC clase I. Tambin otros aloantgenos polimrficos pueden causar reacciones de rechazo inmunolgico, habitualmente ms dbiles y lentas, y se los conoce como antgenos menores de histocompatibilidad. 2.3. Clulas que participan en el rechazo Pueden participar tanto clulas T CD4+ como CD8+, que reconocen las molculas MHC del injerto presentadas tanto en forma directa como indirecta. Las CPA del receptor y del donante estn involucradas en el proceso de rechazo, siendo tal vez las ms importantes las clulas dendrticas. Estas CPA presentan los antgenos a las clulas T del receptor presentes en el injerto y tambin CPA del donante podran migrar a los ganglios linfticos donde activaran clulas T naive en forma directa. Por otra parte, CPA del receptor pueden entrar al injerto y transportar los aloantgenos a los ganglios linfticos y presentarlos a los linfocitos por la va indirecta. Estas CPA tambin proveen molculas coestimuladoras que contribuyen a la expansin y diferenciacin de las clulas T alorreactivas. La reaccin mixta linfocitaria (RLM) es un modelo in vitro muy til del reconocimiento directo de las molculas MHC alognicas y se utiliza como predictor del rechazo de aloinjertos. Esta reaccin es inducida cultivando in vitro clulas mononucleares provenientes de dos individuos diferentes, esto determina que se produzca una respuesta proliferativa a los 4-7 das de cultivo, denominada RLM alognica. Puede ser bidireccional o unidireccional, en este ltimo caso se procesa una de las dos poblaciones linfocitarias para que no prolifere. Durante este proceso son estimuladas tanto clulas T CD4+ como CD8+. Las CD8+ se diferencian a clulas citolticas y las clulas CD4+ en clulas productoras de citoquinas, tal cual ocurre en una reaccin inmune contra antgenos proteicos restringida por molculas MHC clase I o II, respectivamente. Menos conocidos son los mecanismos que llevan a la produccin de aloanticuerpos contra

molculas MHC alognicas. Se presume que las clulas B especficas para los aloantgenos son estimuladas por mecanismos similares a los que operan frente a protenas extraas.

3. MECANISMOS EFECTORES DEL RECHAZO Tanto clulas T CD4+ como CD8+ y aloanticuerpos participan en el rechazo del aloinjerto, a travs de diferentes mecanismos efectores. Estos mecanismos se clasifican segn la histopatologa que los caracteriza, y segn el tiempo despus del trasplante en que se manifiestan. De acuerdo a la experiencia de los trasplantes renales, estos son: rechazo hiperagudo, agudo y crnico. 3.1. Rechazo hiperagudo El rechazo hiperagudo se caracteriza por hemorragia y oclusin trombtica de la circulacin del injerto y ocurre en minutos u horas de colocado ste. Est mediado por anticuerpos preexistentes que se encuentran en la circulacin del receptor y que se unen a antgenos del endotelio vascular del injerto. Esta unin activa al sistema del complemento causando dao endotelial y promoviendo la trombosis intravascular del injerto. Este tipo de rechazo puede ser provocado por aloanticuerpos dirigidos contra antgenos de grupo sanguneo ABO u otros, que se expresan tambin en las clulas del endotelio vascular. En la prctica esto no sucede o no debiera suceder, ya que donantes y receptores se seleccionan considerando que deben tener grupo sanguneo compatible. El rechazo hiperagudo puede ocurrir por aloanticuerpos de la clase IgG dirigidos contra molculas MHC o contra otros antgenos que no son de grupo sanguneo presentes en las paredes endoteliales. Estos aloanticuerpos se generan en exposiciones previas a aloantgenos, por ej., por transfusiones, embarazos mltiples, trasplantes anteriores. Si el ttulo de anticuerpos es bajo el rechazo puede producirse en el transcurso de varios das, siendo entonces denominado "acelerado ". En los pacientes que van a recibir un aloinjerto se investiga rutinariamente la posible presencia de aloanticuerpos preexistentes contra el posible donante, con el fin de seleccionar el re-

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ceptor ms adecuado, con mayores probabilidades de xito del injerto, y evitar la prdida de ste por un rechazo hiperagudo. 3.2. Rechazo agudo El rechazo agudo se caracteriza por injuria vascular y parenquimatosa del injerto, mediada por clulas T, macrfagos y anticuerpos, que se presenta usualmente despus de la primera semana de efectuado el trasplante. Las clulas T CD8+ activadas causan lisis directa de las clulas del injerto y las clulas T CD4+ a travs de la produccin de citoquinas que reclutan y activan clulas inflamatorias, las cuales causan necrosis. En injertos vascularizados, un hallazgo frecuente en los episodios de rechazo agudo es una endotelialitis microvascular, indicando que las clulas endoteliales son un blanco importante en el rechazo agudo. Tambin los anticuerpos pueden participar en el rechazo agudo. 3.3. Rechazo crnico El rechazo crnico se caracteriza por fibrosis con prdida de las estructuras normales de los rganos la cual ocurre en un perodo de tiempo prolongado, entre 6 meses a un ao despus del trasplante. En la medida que el tratamiento del rechazo agudo ha ido permitiendo su mejor control, el rechazo crnico ha emergido como la principal causa de la prdida de los aloinjertos. No se conoce bien la patogenia de este tipo de rechazo pero en muchos casos se ha observado una arterioesclerosis acelerada o de injerto, con proliferacin de las clulas musculares lisas de la ntima. sta puede representar una forma especializada de hipersensibilidad retardada en la cual los linfocitos activados inducen a los macrfagos a secretar factores de crecimiento de las clulas musculares. Es frecuente en trasplantes cardacos y de rin. En modelos experimentales se ha demostrado participacin importante de clulas T CD4+ y de clulas B en este tipo de rechazo.

estrategias posibles son: minimizar la intensidad de la respuesta inmune alognica efectuando trasplantes entre individuos con la mayor semejanza posible y, por otro lado, a travs del uso de inmunosupresores. 4.1. Inmunosupresin Existen varios grupos de frmacos inmunosupresores que se utilizan en clnica, entre ellos se encuentran los inmunosupresores tradicionales, como la azatioprina y la ciclofosfamida y aquellos ms selectivos, que no deprimen todas las respuestas inmunes sino que principalmente a las clulas estimuladas por los antgenos alognicos. Entre estas ltimas se encuentran la ciclosporina, el mofetil micofenilato, la rapamicina y la llamada FK-506. Una de las ms usadas es la ciclosporina, cuyo principal mecanismo de accin es inhibir la transcripcin de ciertos genes, especialmente los que codifican IL-2. El resultado es que la ciclosporina bloquea la proliferacin y diferenciacin de las clulas T dependientes de esta citoquina, por la tanto, bloquea las clulas T que estn siendo activadas por los aloantgenos y es por esto que esta droga acta "selectivamente". Adems, la ciclosporina induce la sntesis de una citoquina inmunosupresora, el factor transformante beta (TGF-). Tambin se utilizan anticuerpos dirigidos contra molculas de membrana de las clulas T, especialmente en el tratamiento de los episodios de rechazo agudo. Entre estos estn los anticuerpos monoclonales anti-CD3 (OKT3) y anti-CD25; el primero se une a la molcula CD3 de las clulas T bloqueando su funcionamiento, causando lisis directa por activacin del complemento y aumentando su remocin por fagocitosis, y el anti-CD25 que bloquea la activacin de las clulas T bloqueando la unin de la IL-2 a su receptor y favoreciendo tambin la lisis y remocin de estas clulas. Tambin tiene un rol importante el uso de agentes antiinflamatorios como los corticoides, que bloquean la sntesis y secrecin de diferentes factores solubles por los macrfagos, tales como citoquinas (TNF e IL-1), generacin de prostaglandinas, metabolitos del oxgeno, y xido ntrico. El uso de los inmunosupresores, especialmente de la ciclosporina y ms recientemente del mofetil micofenilato, ha permitido un dramtico aumento de la sobrevida de los aloinjertos, espe-

4. PREVENCIN Y TRATAMIENTO DEL RECHAZO Si el receptor tiene un sistema inmune competente, siempre se producir alguna forma de rechazo. Para lograr un mayor xito en la sobrevida de los trasplantes y el menor rechazo posible, las

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cialmente de aquellos que provienen de donantecadver. Previamente al uso de estas drogas, la sobrevida a un ao de los injertos provenientes de donante-cadver era de un 50-60%, aumentando a un 90% gracias al uso de ellas. En el caso de usar donante vivo relacionado (familiar) la sobrevida es de un 90%. La inmunosupresin mantenida en el tiempo es responsable de un aumento de la susceptibilidad a infecciones y tumores oportunistas en estos pacientes. Esto es particularmente notorio en el trasplante de mdula sea, el cual requiere de una intensa inmunosupresin preparatoria. Adems, en este tipo de trasplante, puede producirse una respuesta de los linfocitos de la mdula sea contra los aloantgenos del receptor, causando la llamada enfermedad de injerto versus husped (Graft Versus Host Disease, GVHD). 4.2. Seleccin de donantes Para evitar el rechazo hiperagudo, deben seleccionarse donantes que compartan antgenos de grupo sanguneo ABO con el receptor. Asimismo, que no posean anticuerpos preformados contra antgenos del donante. Esto ltimo se realiza a travs de la tcnica del "cross matching", que consiste en colocar en contacto suero del receptor (que contiene los posibles anticuerpos) con clulas del donante, en presencia de complemento. En caso de haber anticuerpos preexistentes se va a producir una lisis celular, cuya intensidad va a ser proporcional a la cantidad de anticuerpos presentes en el receptor. Adems, se realiza el estudio de tipificacin HLA utilizando una tcnica de microlinfocitotoxicidad en placa (tcnica de Terasaki), buscando la mayor identidad entre las molculas MHC del donante y las del receptor (ver captulo 42). En el trasplante renal, se ha constatado que, a mayor nmero de alelos MHC compartidos entre donante y receptor, mejor es la sobrevida del aloinjerto, especialmente en el primer ao despus del trasplante. La experiencia clnica demuestra que los de mayor relevancia son los antgenos HLA A, B y DR. Los estudios de tipificacin HLA requieren tiempo y no son posibles de realizar en todos los trasplantes, algunos rganos, como corazn e hgado, no pueden preservarse por muchas horas sin sufrir deterioro y deben ser trasplantados lo ms pronto posible.

4.3. Induccin de tolerancia La tolerancia especfica frente a los aloantgenos del donante sera el mtodo ideal para prevenir el rechazo de los aloinjertos. No sera necesaria la inmunosupresin, no habra riesgo de rechazo ni de complicaciones derivadas de la inmunosupresin crnica. Experimentalmente se ha podido inducir tolerancia, tanto central como perifrica. Un ejemplo de ello es la anergia perifrica que se induce bloqueando la interaccin de seales coestimuladoras necesarias para la activacin de las clulas T.

LECTURAS SUGERIDAS Abbas, A., Litchman, A., Pober, J., Cellular and Molecular Immunology, Edition WB Saunders, chapter 16, 2000. Denton, M.D., Magee, C.C., Sayegh M.H. Immunosuppressive strategies in transplantation. Lancet 353:1083-1991, 1999. Gould, D.S., Auchincloss, A. Jr., Direct and indirect recognition: the role of MHC antigens in graft rejection, Immunology Today 20:77-82, 1999. Kahan, B., Clark, J., Transplantation of sdolid organs in Samter's Immunological Diseases, ed. 5, Boston, Little Brown, 1994. Sherman, L.A., Chattopadhyay, S., The molecular basis of allorecognition, Annual Review of Immunology 11:385-402, 1993.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 39
INMUNOMODULADORES
Cecilia Seplveda C. y Mara Antonieta Guzmn M.

1. Introduccin 2. Principales Inmunomoduladores 2.1. Antiproliferativos 2.2. Antagonistas de las Inmunofilinas 2.3. Glucocorticoides 2.4. Agentes biolgicos 2.5. Citoquinas 2.6. Trasplante de mdula sea 2.7. Clulas autlogas modificadas 2.8. Isoprinosine 3. Efectos Adversos de los Inmunomoduladores

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RESUMEN Existen numerosas enfermedades de base inmunolgica: autoinmunes e inflamatorias, inmunodeficiencias, alrgicas y de hipersensibilidad, cuyo tratamiento se basa en el uso de frmacos y agentes biolgicos inmunomoduladores, ya sea capaces de aumentar (inmunoestimuladores) o de suprimir (inmunosupresores) las respuestas del sistema inmune alterado o deficiente. Algunos de estos frmacos tambin se utilizan en la prevencin y tratamiento del rechazo de trasplantes, situacin en la cual el sistema inmune reacciona frente a la agresin causada por los antgenos extraos del trasplante. En este captulo se har mencin a algunos de los inmunomoduladores de mayor aplicacin clnica actual.

1. INTRODUCCIN Un inmunomodulador puede definirse como una sustancia biolgica o no biolgica que influencia directamente una funcin inmune especfica, o indirectamente al modificar uno o ms de los componentes del sistema inmune. As, por ejemplo, los inmunomoduladores pueden participar en: (a) la reconstitucin de un sistema inmune globalmente deficiente, (b) la reconstitucin selectiva de un defecto inmune especfico, (c) la estimulacin de una funcin normal, por ejemplo de clulas supresoras o citotxicas y (d) la eliminacin o supresin selectiva de un tipo celular o de una funcin inmune especfica, por ejemplo, de clulas tumorales o de clulas supresoras activadas. Pese a los enormes avances en la obtencin de inmunomoduladores selectivos y especficos, la principal limitacin de su uso clnico reside en la complejidad del sistema inmune, que hace prcticamente imposible modular un componente aislado de esta red sin perturbar la homeostasis de todo el sistema. 2. PRINCIPALES INMUNOMODULADORES Aunque la experiencia con inmunomoduladores en estudios clnicos controlados es an limitada, algunos de estos agentes constituyen las modalidades teraputicas de eleccin en ciertas patologas, habiendo sido aprobados para su uso clnico. Algunos de estos agentes, originalmente de

origen biolgico, estn actualmente disponibles en cantidades ilimitadas, y en formas extraordinariamente puras gracias a las tecnologas de DNA recombinante, de hibridomas y de clonacin celular. Los ms conocidos y en uso clnico se sealan en la tabla 39-1. 2.1. Antiproliferativos En este grupo se encuentran los agentes alquilantes y los inhibidores del metabolismo de las purinas y pirimidinas, incluidos varios nuevos inhibidores. a) Agentes Alquilantes Estos agentes forman uniones covalentes con el DNA, y cuando se administran a altas dosis, conducen a la muerte celular. La mayora de las drogas de este grupo fueron originalmente aplicadas en dosis altas en el tratamiento del cncer. Sin embargo, en dosis ms bajas o en forma de "pulsos" intravenosos de aplicacin peridica se han demostrado tiles como agentes inmunosupresores y antinflamatorios. Su accin se ejerce, principalmente, sobre los linfocitos B pudiendo llegar a causar la supresin de la produccin de anticuerpos e hipogammaglobulinemia, los linfocitos T CD8 a bajas dosis y los linfocitos T CD4 a altas dosis. Actan principalmente en clulas en divisin y su uso implica riesgos como el desarrollo de aplasia medular, alopeca, esterilidad, cistitis hemorrgica. Usados a largo plazo puede llegar a

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Tabla 39-1. Inmunomoduladores

Antiproliferativos Alquilantes Inhibidores del metabolismo de las purinas y de las pirimidinas Antagonistas de las Inmunofilinas Glucocorticoides Agentes biolgicos Globulinas antilinfocito y antitimocito Gammaglobulina endovenosa Anticuerpos monoclonales Citoquinas Trasplante de mdula sea Clulas autlogas modificadas Inmunoestimuladores sintticos

desarrollarse tumores, como cncer vesical y leucemia mieloide. Uno de los ms usados es la ciclofosfamida, de gran utilidad en el tratamiento de formas severas de enfermedades reumatolgicas autoinmunes e inflamatorias. b) Inhibidores del metabolismo de las purinas y pirimidinas Metotrexato. Es un inhibidor de la tetrahidrofolato reductasa bloqueando as la sntesis de timidilato, la sntesis de novo de purinas y la divisin celular. En dosis altas, produce una fuerte toxicidad hematolgica y digestiva, aunque este efecto puede neutralizarse con la administracin preventiva de cido flico. A dosis bajas inhibe la funcin de las clulas B, suprime la funcin macrofgica, la quimiotaxis de los neutrfilos, la produccin de ciertos leucotrienos, y la produccin de citoquinas como la IL-1 (IL: Interleuquina). No se asocia con mayor riesgo de mutagenicidad ni teratogenicidad, pero posee toxicidad heptica y puede producir fibrosis pulmonar. Se utiliza en el tratamiento de enfermedades reumatolgicas autoinmunes e inflamatorias. Azatioprina. Es un derivado de la 6-mercaptopurina; no es activo por s mismo, sino por sus derivados. Bloquea la transformacin del cido inosnico en cido adenlico, precursor de bases purnicas (guanina, hipoxantina). Su accin se ejer-

ce, principalmente, sobre los linfocitos T CD4 y CD8 y sobre las clulas NK, pero tambin sobre el conjunto de clulas hematopoyticas, por lo cual se requiere un ajuste muy preciso de sus dosis. La administracin concomitante de inhibidores de la sntesis de cido rico (alopurinol), debe evitarse debido al riesgo de aplasia medular. La sobredosis puede producir pancitopenia, macrocitosis aislada y lesiones hepticas. Este frmaco es utilizado principalmente en la prevencin del rechazo de trasplantes de rganos, con frecuencia asociado a corticoides. Una vez que el esquema teraputico se establece, la dosis se mantiene salvo la ocurrencia de una patologa infecciosa. La azatioprina ha sido utilizada en forma prolongada en trasplantes dada la ausencia de nefrotoxicidad a dosis habituales, y que en todo caso, requiere ajuste de dosis si existe insuficiencia renal. La tioguanosina, uno de sus metabolitos, es capaz de producir rupturas cromosmicas, pero el riesgo oncognico de la azatioprina en monoterapia no est bien establecido. En las enfermedades autoinmunes, la azatioprina se utiliza principalmente en las formas corticorresistentes o corticodependientes con el fin de reducir la dosis de stos y sus efectos indeseables. c) Nuevos inhibidores de la biosntesis de nucletidos

Estos frmacos que inhiben en forma similar las respuestas linfocitarias T y B, pero con una menor incidencia de mielosupresin que los agentes anteriormente analizados. La mizobirina y el cido micofenlico inhiben la accin de la inosinmonofosfatodehidrogenasa, suprimiendo la sntesis de nucletidos guannicos. Su uso es creciente en la prevencin del rechazo de alotrasplantes, con muy buenos resultados. Brequinar inhibe la enzima dihidroorotato dehidrogenasa, requerida para la sntesis de novo de pirimidinas. 2.2. Antagonistas de las Inmunofilinas Ciclosporina A. Es un derivado de origen fngico, descubierto en 1976, que acta selectivamente frente a linfocitos T activados. Se une a receptores intracitoplasmticos, las ciclofilinas A, B, C y D de la familia de las inmunofilinas; el complejo formado inhibe la accin de la fosfatasa 2B o calcineurina. Este efecto conduce a un bloqueo de la transcripcin, calcio dependiente, del gen de IL-2 y de otras citoquinas como IL-3, IL-4 e

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interfern gamma (IFN-). Al contrario de los frmacos ya analizados, que actan sobre todas las clulas que sintetizan activamente DNA, este frmaco acta exclusivamente sobre los linfocitos activados, principalmente sobre los linfocitos T CD4. No tiene efectos adversos sobre la hematopoyesis y no modifica la poblacin de linfocitos T de memoria. Su accin inmunosupresora es rpidamente reversible despus de suspender la terapia. Por su gran potencia inmunosupresora y su relativa mayor selectividad de accin este agente farmacolgico ha revolucionado la era de los trasplantes, mejorando muy significativamente la sobrevida y la calidad de vida de los pacientes. Tambin se utiliza en formas severas de enfermedades autoinmunes e inflamatorias. Entre sus efectos secundarios podemos mencionar: nefrotoxicidad, con hipertensin arterial secundaria, hipertrofia gingival, hipertricosis, parestesias distales, sndromes del tipo hemolticourmico, y raramente, hepatitis con patrn colestsico. FK506. Es un macrlido de origen fngico, que acta a menores dosis que la ciclosporina A. Este frmaco se liga a una inmunofilina citoplasmtica, la FKBP, y este complejo tambin inhibe, a nivel transcripcional, la sntesis de IL-2 y otras citoquinas. Rapamicina. Es otro macrlido que se une al mismo receptor citoplasmtico que FK506 pero sus efectos son distintos. Este frmaco bloquea la actividad de una serintreoninquinasa y su asociacin con la ciclina D1, que controla la entrada de las clulas a la fase S del ciclo celular. Por ello, la rapamicina no disminuye la sntesis de citoquinas pero impide la expansin clonal de linfocitos T estimulados por antgenos. 2.3. Glucocorticoides Los glucocorticoides constituyen uno de los grupos de drogas ms importantes en el tratamiento de enfermedades mediadas inmunolgicamente. Son adems, los ms potentes antinflamatorios conocidos. Estos frmacos son capaces de unirse a receptores intracitoplasmticos y son traslocados al ncleo celular, donde el complejo se fija a secuencias reguladoras especficas, los elementos de respuesta a glucocorticoides, modulando positiva o negativamente la transcripcin de ciertos genes,

en particular, genes que codifican para citoquinas. Tambin tienen efectos sobre la traduccin del RNA, la sntesis y la secrecin de citoquinas ( IL2 e IFN-) In vivo, los glucocorticoides inhiben el acceso de los leucocitos a focos inflamatorios. A dosis altas, inducen una leucocitosis por movilizacin del "pool" marginal y una linfopenia que afecta principalmente a linfocitos T CD4, por redistribucin de stos. Tienen por lo tanto su mayor efecto sobre la inmunidad celular. Su accin antinflamatoria se explica, principalmente, por los efectos que poseen sobre macrfagos y neutrfilos. Ellos inhiben la sntesis de IL-1, IL-6 y en menor grado, de TNF. Tambin disminuyen la sntesis de prostaglandinas y de leucotrienos, y la actividad de la fosfolipasa A2, adems de inhibir la cicloxigenasa de los macrfagos. Inhiben la xido ntrico sintetasa y as la produccin del vasodilatador local, xido ntrico (NO). Tambin son inhibidores de distintas proteasas: colagenasa, elastasa y activador del plasmingeno y de la produccin de derivados del NO. Actan sobre las clulas endoteliales e inhiben la permeabilidad vascular inhibiendo la expresin de los genes MHC de clase II y de las molculas de adhesin ELAM-1 e ICAM-1. En el hombre, slo los timocitos y los linfocitos T activados son susceptibles a la lisis por apoptosis. Los corticoides de sntesis ms utilizados como inmunosupresores son la prednisona y la metilprednisolona. Los efectos secundarios son mltiples: sndrome Cushingoide, hipertensin arterial, osteoporosis, cataratas, diabetes, alteracin del crecimiento, acn, defectos de cicatrizacin, entre otros. 2.4. Agentes biolgicos Globulinas antitimocitos o antilinfocitos. Se obtienen inmunizando conejos o caballos con estas clulas de origen humano y se utilizan, principalmente, en la prevencin y tratamiento de los rechazos de trasplante. Tienen el severo riesgo de inducir el desarrollo de la enfermedad del suero, debido a la produccin de anticuerpos contra estos anticuerpos heterlogos (de otra especie), que se manifiesta clnicamente en 10 a 30% de los pacientes, alrededor del dcimo da de tratamiento, con la aparicin de fiebre, artritis, adenopatas dolorosas, y leucocitosis con trombocitopenia y cada del nivel plasmtico del frmaco administrado. Esta patologa implica la detencin de la

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terapia o el cambio por un anticuerpo de otro origen. Inmunoglobulinas intravenosas: Se utilizan inmunoglobulinas intravenosas como terapia de reemplazo en pacientes con inmunodeficiencias primarias de anticuerpos (ver captulo 30), y tambin en algunas inmunodeficiencias secundarias con dficit de inmunoglobulinas. Existen variadas inmunoglobulinas intravenosas comerciales. Estas deben estar libres de agregados, y provenir de un "pool" de ms de 1.000 donantes en los cuales se ha descartado la presencia de infecciones trasmisibles como la causada por el VIH y otros virus. La terapia de reemplazo con inmunoglobulinas est indicada en pacientes con niveles de IgG significativamente disminuidos y que tienen una deficiencia de anticuerpos documentada, de significado clnico. Su propsito es proveer cantidades suficientes de anticuerpos especficos, para disminuir la frecuencia y severidad de las infecciones que presentan estos pacientes y mejorar su calidad de vida. Anticuerpos monoclonales. Producidos por un solo clon de clulas B, son monoespecficos y homogneos. Los anticuerpos monoclonales se utilizan como agentes teraputicos principalmente en el tratamiento del rechazo agudo de alotrasplantes, in vitro en la eliminacin de clulas de la mdula sea, como agentes anti-tumorales y en el tratamiento de ciertas enfermedades inflamatorias crnicas. Entre los anticuerpos monoclonales ms usados, especialmente en el tratamiento del rechazo agudo de trasplantes se encuentra el anticuerpo monoclonal anti-CD3 (OKT3), con poderoso efecto inmunosupresor. El sitio probable de accin de este frmaco es la interferencia con seales de transduccin que siguen al reconocimiento del receptor T al antgeno presentado por clulas presentadoras de antgeno. Adems existira un efecto de lisis directa de los linfocitos T CD3 debido a que se produce una rpida cada de los recuentos linfocitarios. Existen otros anticuerpos monoclonales aprobados para su uso clnico, utilizados tambin en la prevencin y manejo de rechazos de trasplantes, algunos tumores y en enfermedades inflamatorias como la artritis reumatoidea y la enfermedad de Crohn. Como estos frmacos son de origen murino,

tienen el potencial de inducir anticuerpos en el individuo y desencadenar una enfermedad del suero y otros sndromes de hipersensibilidad, pero esto es raro. La modificacin de este tipo de frmacos sustituyendo la regin Fc de la inmunoglobulina por una secuencia aminoacdica de anticuerpo humano, puede colaborar en producir anticuerpos monoclonales menos sensibilizantes y con mejor cintica in vivo. Actualmente su produccin in vitro en sistema de produccin industrial, est llevando a un requerimiento cada vez menor del uso de animales. A travs de la ingeniera gentica se estn generando anticuerpos monoclonales quimricos, humanizados e incluso humanos. 2.5. Citoquinas Interferones. Comprenden una familia de protenas (glicoprotenas en el estado natural y protenas no glicosiladas producidas por tecnologa de DNA recombinante) clasificadas como alfa, beta y gamma (ver captulo 11). El IFN- es producido por los leucocitos polinucleares, el IFN- por los fibroblastos, y el IFN- por los linfocitos T. Adems de sus conocidas propiedades antivirales, los interferones tienen efectos antiproliferativos contra clulas tumorales, y efectos especficos sobre las funciones inmunolgicas. El IFN- est estructuralmente relacionado al IFN y ambos son producidos en respuesta a la estimulacin con virus y polirribonucletidos. En cambio, el IFN- no est relacionado estructuralmente con ellos, y es producido por los linfocitos T en respuesta a estmulos especficos, mitgenos e IL-2. Adems, tiene importantes propiedades inmunomoduladoras que no poseen los otros interferones. Los IFNs que estn actualmente en uso clnico son IFNs naturales parcial o altamente purificados, e IFNs altamente purificados producidos por ingeniera gentica o recombinantes. Su uso y eficacia han sido difciles de probar, tanto por sus variadas preparaciones, vas de administracin y dosis, como por la heterogeneidad de las situaciones clnicas en las que se han evaluado. Slo recientemente han surgido algunas indicaciones precisas en el uso de estos agentes. Fundamentalmente stas se refieren al uso del IFN- en el tratamiento de las hepatitis virales crnicas por virus B y virus C, IFN- en la esclerosis mltiple e IFN- en la enfermedad granulomatosa cr-

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nica, una inmunodeficiencia primaria que se caracteriza por un defecto del metabolismo oxidativo de los leucocitos (ver captulo 30). En la actualidad se dispone de algunos IFNs "pegilados"; esto es, unidos a polietilenglicol, lo que facilita su utilizacin permitiendo su administracin semanal, con menos efectos adversos. Interleuquina-2. Esta citoquina producida por los linfocitos T activados, facilita y permite la expansin clonal de estas clulas. Adems, estimula la produccin de clulas NK, clulas killer activadas con linfoquinas (clulas LAK) (ver captulo 37), y de linfocitos B. Estimula la actividad NK directamente y quizs tambin indirectamente estimulando la produccin de IFN-. Puede tambin estimular a los linfocitos T a producir otras linfoquinas activadoras de los linfocitos B. La IL-2 se ha estudiado en pacientes con cncer y en la infeccin VIH/SIDA. En la actualidad se utiliza, combinada con IFN-, en el tratamiento del cncer renal metastsico, y asociada con terapia antirretroviral especfica, en ciertos casos de SIDA. Tambin se est evaluando la administracin intratumoral de genes de citoquina para lograr una secrecin paracrina de citoquinas inmunoestimuladoras, por ejemplo, del gen de la IL-2 en cncer renal metastsico. 2.6. Trasplante de mdula sea El objetivo del trasplante de mdula sea es el reemplazo de las clulas defectuosas o ausentes del receptor, con clulas inmunocompetentes normales capaces de autorreplicarse. La mdula sea normal contiene clulas pluripotenciales que pueden dar origen a eritrocitos, granulocitos, clulas de la lnea monocito-macrofgica, megacariocitos, y clulas T y B inmunocompetentes. Constituye actualmente la nica forma de terapia adecuada para pacientes con inmunodeficiencias severas, celulares y combinadas. En trasplantes HLA-idnticos la sobrevida es de un 80%, con evidencias de injerto exitoso de clulas T y clulas pluripotenciales del donante. En trasplantes HLA-haploidnticos, aproximadamente el 54% de los pacientes sobrevive. 2.7. Clulas autlogas modificadas Son linfocitos T y clulas NK activadas por incubacin con IL-2, a las que se denomina clu-

las LAK. Mtodo descrito en 1980, ha sido extensamente estudiado en una variedad de tumores metastsicos y en la actualidad se evalan varias modificaciones del mtodo original: clulas LAK alognicas, infusin arterial directa de clulas LAK y de IL-2 en los rganos afectados, clulas infiltrantes del tumor activadas (clulas TIL), etc. 2.8. Isoprinosine Isoprinosine es un complejo que contiene inosina y paracetaminobenzoato de dimetilamino2-propanol. Gracias a su componente inosina, este frmaco estimula a los linfocitos T lo que puede ser verificado por un aumento de la respuesta de estas clulas a los mitgenos. Adems de este efecto sobre los linfocitos T, parece aumentar su nmero as como el nmero y funcin de las clulas NK. Tambin aumenta la funcin de los linfocitos B activados por el Ag. Isoprinosine estimula la sntesis de RNA en linfocitos activados, a travs de la activacin de la va "salvaje" de las purinas. Muchas infecciones virales frecuentemente disminuyen la inmunidad celular en forma transitoria, en muchos casos esta forma de inmunosupresin puede corregirse con el uso de isoprinosine.

3. EFECTOS ADVERSOS DE LOS INMUNOMODULADORES Los tratamientos inmunosupresores producen un dficit inmunitario que puede traducirse en patologas infecciosas o tumorales, por lo cual estas terapias deben ser cuidadosamente vigiladas del punto de vista clnico y de laboratorio. La inmunosupresin intensa acarrea el riesgo de infecciones oportunistas, particularmente pneumocystosis, toxoplasmosis, listeriosis, legionellosis, aspergillosis y criptosporidiosis. Las infecciones virales son frecuentes en los inmunodeprimidos, especialmente por citomegalovirus, herpes simplex 1 y 2, virus de EpsteinBarr, virus varicella zoster, papilomavirus e incluso, por virus de Hepatitis B y C. La mayor parte de las infecciones virales crnicas pueden conducir al desarrollo de cnceres, especialmente despus de terapias inmunosupresoras prolongadas: epiteliomas espinocelulares, cncer de cuello uterino, linfomas, hepatocarcinomas, entre otros.

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Existen distintos protocolos teraputicos en trasplantes y en enfermedades autoinmunes, y actualmente estn en ensayo diferentes metodologas de manipulacin de la respuesta inmune, que pretenden minimizar las consecuencias negativas de estas terapias.

LECTURAS SUGERIDAS Bounpas, D., "Glucocorticoid Therapy for Immune-mediated Diseases: Basic and Clinical Correlates", Ann Int Med., 119:1198,1993. Buckley, R., "Bone marrow reconstitution in primary immunodeficiency" en Clinical Immunology (Rich R., editor), Mosby-Year Book, Inc St Louis, Nissouri, 1996. Calabresi, P., Chabner B., "Antineoplastic agents" in Goodman and Gillman's, The Pharmacologic Basis of Therapeutics, 8va. Edicin, McGraw Hill, New York, 1993. Hong J.C., Kahan B.D. "Immunosuppressive agents in organ transplantation: past, present, and future", Sem nephrol 20; 108, 2000. International Chronic Granulomatous Disease Cooperative Study Group, "A controlled trial of interferon gamma to prevent infection in chronic granulomatous disease", N Eng J Med, 324:509,1991. Rosenberg, S.; Yannelli, J.; Yang, J. et al., "Treatment of patients with metastasic melanoma using autologous tumor infiltrting lymphocytes and interleukin-2, J Natl Cancer Inst, 86: 1159, 1994. Rovira P.; Mascarell, L.; Truffa-Bachi, P., "The impact of immunosuppressive drugs on the analysis of T cell activation", Curr Medicin Chem 7: 673; 2000.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

SECCIN

MTODOS INMUNOLGICOS Y DE BIOLOGA MOLECULAR

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 40
MTODOS INMUNOQUMICOS
Darwins Castillo A. y Carolina Valenzuela B.

1. Introduccin 2. Inmunoanlisis 2.1.Inmunoanlisis con reactivos no marcados 2.1.1. Reaccin de precipitacin 2.1.1.1. Reaccin de precipitacin en medio lquido a) Precipitacin en tubo b) Floculacin c) Turbidimetra d) Nefelometra e) Precipitacin de complejos inmunes solubles 2.1.1.2. Reaccin de precipitacin en gel a) Inmunodifusin doble b) Inmunodifusin radial c) Inmunoelectroforesis d) Inmunofijacin e) Contrainmunoelectroforesis f) Rocket inmunoelectroforesis g) Inmunoelectroforesis cruzada o bidimensional de Laurell 2.1.2. Reaccin de aglutinacin a) Aglutinacin directa b) Aglutinacin indirecta

c) Aglutinacin pasiva 2.1.3. Reaccin con participacin del complemento a) Fijacin del complemento b) Actividad hemoltica del complemento 2.2. Inmunoanlisis con reactivos marcados 2.2.1. Inmunoanlisis fluorescente a) Microscopa inmunofluorescente b) Inmunoanlisis de fluorescencia polarizada c) Inmunoanlisis de fluorescencia unida a enzima d) Citometra de flujo 2.2.2. Enzimainmunoanlisis (EIA) a) EIA homogneo b) EIA heterogneo c) Electroinmunotransferencia o Western blot o Immunoblotting 2.2.3. Radioinmunoanlisis (RIA) a) RIA en fase soluble b) RIA en fase slida c) Deteccin inmunorradiomtrica para antgeno 2.2.4. Quimiluminiscencia 2.2.5. Bioluminiscencia

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RESUMEN La base de los mtodos inmunoqumicos es la unin del antgeno y/o hapteno con el anticuerpo, es una reaccin especfica, de alta afinidad y reversible. Est definida por una constante de equilibrio o de asociacin intrnseca (K) que es una medida de fuerza de la interaccin de la reaccin para formar complejos estables. Los anticuerpos son protenas relativamente estables, y sus reacciones con haptenos o antgenos pueden ser estudiados en un amplio rango de condiciones. Las modificaciones en la constante de asociacin inciden en las fuerzas que estabilizan los complejos antgeno-anticuerpo (Ag-Ac). La reaccin es dependiente de algunos parmetros como: temperatura, pH y fuerza inica del medio que deben considerarse al llevar a cabo un inmunoanlisis. Los inmunoanlisis pueden ser divididos en mtodos que requieren de sistemas Ag-Ac no marcados y marcados. La mayora de los inmunoanlisis no marcados se basan en reacciones inmunes secundarias (precipitacin). Los inmunoanlisis marcados se basan en reacciones inmunes primarias (inmunoanlisis fluorescentes). En el inmunoanlisis con reactivos no marcados, la interaccin de antgenos solubles macromoleculares y anticuerpos especficos llevan a la formacin de complejos, que en una relacin molar equivalente precipitan en solucin (precipitacin). Existe una reaccin anmala llamada floculacin, en que la precipitacin se observa slo en un rango muy estrecho de la proporcin Ag/Ac. La interaccin de antgenos particulados con sus anticuerpos especficos producen aglutinacin. La turbidimetra y nefelometra determina niveles de antgeno o de anticuerpo en baja concentracin, formando pequeos agregados que producen una turbidez que puede ser medida por disminucin y dispersin de la luz incidente, respectivamente. Los mtodos de precipitacin en gel detectan la presencia y/o concentracin de antgenos y/o anticuerpos por la formacin de bandas, anillos o arcos de precipitado que corresponden a complejos antgeno-anticuerpo en la zona de equivalencia (inmunodifusin doble, inmunodifusin radial, inmunoelectroforesis, inmunofijacin, contrainmunoelectroforesis, rocket inmunoelectroforesis e inmunoelectroforesis cruzada). El inmunoanlisis con reactivos marcados se clasifica en homogneo o heterogneo y puede ser de dos tipos competitivo y no competitivo. El inmunoanlisis fluorescente incluye la microscopa inmunofluorescente que corresponde a la tradicional inmunofluorescencia (IF) que es una tcnica inmunohistoqumica o inmunocitoqumica que permite la localizacin de antgenos en clulas tejidos, y la deteccin y titulacin de anticuerpos especficos; el inmunoanlisis de fluorescencia polarizada (FPIA) que es homogneo y competitivo; el inmunoanlisis de fluorescencia unida a enzima (ELFIA) que es heterogneo y puede ser competitivo o no competitivo; y la citometra de flujo que permite medir la cantidad de anticuerpo monoclonal fluorescente unido en cada clula que atraviesa un lser e identificarla segn su tamao y granularidad de acuerdo a la forma que deflecta o dispersa la luz del lser. El enzimainmunoanlisis (EIA) se basa en dos fenmenos biolgicos: reaccin inmunolgica (unin Ag-Ac) y la amplificacin por reacciones qumicas (enzima que acta sobre el sustrato). Se dispone de EIA homogneo representado por el enzyme-multiplied immunoassay technique (EMIT) que adems es competitivo y de EIA heterogneo, como el "enzyme-linked inmunosorbent assay" (ELISA) y el "microparticle enzyme immunoassay" (MEIA) que adems son no competitivos. La electroinmunotransferencia combina la electroforesis en gel SDS-poliacrilaminada y el enzimainmunoanlisis. El radioinmunoanlisis (RIA) utiliza antgeno o anticuerpo, generalmente marcados con istopos como 125I o, eventualmente, 131I y este inmunoanlisis puede llevarse a cabo en fase soluble o slida. Finalmente existe el inmunoanlisis quimiluminiscente que utiliza la emisin de luz producida en ciertas reacciones qumicas de oxidacin, como por ejemplo, la oxidacin del luminol y el inmunoanlisis bioluminiscente que se basa en un sistema natural la D-luciferina/luciferasa, en que la luciferasa cataliza la oxidacin de la D-luciferina en presencia de ATP y Mg+2 a oxiluciferina, con emisin de luz a 546 nm.

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1. INTRODUCCIN La unin del antgeno (Ag) con el anticuerpo (Ac) es una reaccin fundamental en la metodologa inmunoqumica. En general, la mayora de los antgenos son macromolculas, especialmente protenas con una estructura completamente establecida en que regularmente no conocemos la identidad, ni la conformacin del determinante antgnico que reacciona con el anticuerpo, ni el nmero por molcula de Ag. Para comprender la reaccin Ag-Ac y evitar reacciones complicadas con Ags macromoculares, en adelante se van a considerar reacciones de Acs especficos con molculas de haptenos (Hp) simples. La produccin de Acs contra Hp se obtiene generalmente inmunizando animales con el Hp unido covalentemente a una protena. La formacin de complejos especficos Hp-Ac puede ser examinados en detalle con sistemas relativamente simples y los anticuerpos que reaccionan son fcilmente aislados e identificados. Como se ha sealado, la base de los mtodos inmunoqumicos es la unin del antgeno y/o hapteno con el anticuerpo. Esta reaccin se caracteriza por ser especfica, de alta afinidad y reversible. Est definida por una constante de equilibrio o de asociacin intrnseca (K) que es una medida de la fuerza de interaccin de la reaccin para formar un complejo estable. k Hp + Ac k' [Hp Ac] (1)

como ultracentrifugacin, "quenching" fluorescentes, y otros. Pero, el mtodo que se utiliza corrientemente es el equilibrio de dilisis. En forma prctica, en el laboratorio se calcula la constante de asociacin intrnseca promedio (Ko) obtenida a travs de la ecuacin de Scatchard, que se define por la concentracin de hapteno o ligando libre requerida para ocupar la mitad de los sitios activos o de unin de los anticuerpos. De acuerdo a esta premisa, en la ecuacin 2: [Hp Ac] = [Ac], por lo tanto,

1 Ko= [Hp]

La unidad de Ko es el recproco de la concentracin, es decir, litro/moles. Los anticuerpos son protenas relativamente estables y sus reacciones con haptenos o antgenos pueden ser estudiados en un amplio rango de condiciones. Las modificaciones que se producen en la constante de asociacin inciden en las fuerzas que estabilizan los complejos Ag-Ac. Por lo tanto, las caractersticas de la reaccin es dependiente de varios parmetros como: temperatura, pH y fuerza inica del medio. Por ejemplo, un aumento de la temperatura puede afectar la interaccin del anticuerpo con hapteno o antgeno que puede disminuir o no la constante de asociacin y, por lo tanto, modificar la afinidad. Sin embargo, la prctica general es incubar la mezcla de anticuerpos y antgenos a 37C o a temperatura ambiente (aproximadamente 22 C). La unin del hapteno p-aminobenzoato con el anticuerpo anti-p-aminobenzoato disminuye tanto con la reduccin de pH de 7 a 4, como con el aumento de la concentracin de cloruro de sodio (NaC1) desde 0,1 a 1 M. Sin embargo, idnticos cambios no afectan a la unin del hapteno 2,4dinitroanilina (DNP) a su anticuerpo anti-DNP. La explicacin se debera probablemente a que el grupo COO- del benzoato interacta con un grupo cargado positivamente del sitio de combinacin de los anticuerpos y que en cambio, en el grupo DNP las interacciones inicas no son importantes para la unin con el sitio de su anticuerpo.

k K= k' =

[Hp Ac] (2) [Hp] [Ac]

k : constante de asociacin k': constante de disociacin

K representa la afinidad intrnseca de un sitio activo representativo del anticuerpo por un hapteno o ligando en trmino de concentracin en equilibrio, que puede calcularse midiendo la concentracin de hapteno o ligando libre. Existen varios mtodos para distinguir hapteno libre (Hp) de hapteno unido (Hp-Ac),

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2. INMUNOANLISIS Los inmunoanlisis son actualmente herramientas de amplio uso en los laboratorios para medir diferentes analitos biolgicos, debido a su facilidad de trabajo, como en la obtencin de resultados sensibles y especficos. Los inmunoanlisis pueden ser divididos en mtodos que requieren de sistemas Ag-Ac no marcados y marcados. La mayora de los inmunoanlisis no marcados se basan en reacciones inmunes secundarias, como por ejemplo, precipitacin y aglutinacin. Se miden por mtodos cuya base es la dispersin de la luz o por recuento de partculas o clulas Los inmunoanlisis marcados se basan en reacciones inmunes primarias, como por ejemplo, inmunoanlisis fluorescente y enzimainmunoanlisis. 2.1. Inmunoanlisis con reactivos no marcados La interaccin de antgenos solubles macromoleculares (polivalentes) y anticuerpos especficos llevan a la formacin de complejos

(Ag-Ac) con relacin variable de Ag o de Ac, que frecuentemente llegan a ser insolubles y precipitan en solucin. Esta se conoce como reaccin de precipitacin que es dependiente de la relacin molar Ag y Ac. La formacin de complejos de haptenos o de pequeos antgenos univalente con sus anticuerpos son solubles. La interaccin de antgenos particulados, como microorganismo o clulas con sus anticuerpos especficos producen la reaccin de aglutinacin. En la tabla 40-1 se muestran los mtodos de inmunoanlisis con reactivos no marcados. 2.1.1. Reaccin de precipitacin 2.1.1.1. Reaccin de precipitacin en medio lquido a) Precipitacin en tubo. La precipitacin en tubo es un procedimiento que no se usa corrientemente en el laboratorio, pero que es necesario conocer para apreciar las caractersticas generales de la reaccin de anticuerpo con antgeno de alto peso molecular en medio lquido. En forma prctica se

Tabla 40-1. Inmunoanlisis con reactivos no marcados Reaccin de precipitacin En medio lquido Precipitacin en tubo Floculacin Turbidimetra Nefelometra Precipitacin de complejos inmunes solubles En gel Inmunodifusin doble Inmunodifusin radial Inmunoelectroforesis Inmunofijacin Contrainmunoelectroforesis Rocket inmunoelectroforesis Inmunoelectroforesis cruzada o bidimensional de Laurell Reaccin de aglutinacin Aglutinacin directa Aglutinacin indirecta Aglutinacin pasiva Reaccin con participacin del complemento Fijacin del complemento Actividad hemoltica del complemento

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realiza en una batera de tubos que contienen un volumen fijo de antisuero (concentracin fija de anticuerpo) a los que se les aade diferentes concentraciones de antgeno, midiendo la protena total del precipitado formado y detectando el excedente de Ac o de Ag en el sobrenadante. Como se muestra en la figura 40-1, a una concentracin definida de anticuerpos, la cantidad de complejo Ag-Ac precipitado aumenta con la cantidad de antgeno aadido hasta un valor mximo, que sobrepasndolo lleva a una disminucin progresiva de la precipitacin. Se produce precipitacin de una cantidad mxima de anticuerpos por una cantidad ptima de antgeno.

acuerdo a la teora del enrejado (lattice theory) de Heidelberger, Kendall y Marrack. Ellos sugirieron que la precipitacin puede ser consecuencia del crecimiento del agregado antgeno-anticuerpo de tal manera que la molcula del antgeno se une a ms de una molcula de anticuerpo y cada molcula de anticuerpo se une a ms de una de antgeno en que participan activamente interacciones Fc-Fc, de manera que cuando el agregado excede un volumen crtico, precipita espontneamente. El precipitado formado puede disociarse y volver al equilibrio con adicin de Ag fresco. Cuando se produce un exceso suficiente se forman pequeos

Figura 40-1. Curva de precipitacin para un complejo especfico Ag-Ac.

En la curva de precipitacin se encuentra una zona de exceso de anticuerpos, el sobrenadante contiene anticuerpo libre, una zona de exceso de antgeno, el sobrenadante contiene antgeno libre y una zona de equivalencia o punto de equivalencia, el sobrenadante est libre de anticuerpo y antgeno libre. Es importante tener presente que en las zonas de exceso de anticuerpos y de antgenos se detectan complejos inmunes solubles. En la zona de exceso de antgeno los sobrenadantes contienen complejos solubles de varias composiciones como Ag4 Ac3, Ag3 Ac2 y Ag2 Ac. En el extremo de esta zona los complejos que principalmente se forman son Ag2 Ac que se atribuye a los dos sitios activos o a la divalencia de la molcula de anticuerpo IgG. Este fenmeno es explicado de

complejos solubles y el precipitado se solubiliza. b) Floculacin. La floculacin es una reaccin de precipitacin anmala, donde la precipitacin se observa solamente en un rango muy estrecho de la proporcin Ag/Ac. Los agregados insolubles se forman en una relativa gran cantidad de Ag. Estas reacciones se dan slo con algunos antisueros, como por ejemplo, sueros de caballos antitoxina diftrica, antitoxina tetnica y antitoxinas estreptoccicas y suero humano anti-tiroglobulina. Es posible que los antisueros que floculan contengan algunos anticuerpos no precipitantes de alta afinidad que deben ser previamente saturados con el antgeno. c) Turbidimetra. La turbidimetra cuantifica la nubosidad o turbidez de una solucin en que

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reacciona el antgeno con el anticuerpo en baja concentracin. El fotodetector est en lnea a la luz incidente y la solucin, en ngulo de 0 o 180 y mide una disminucin de la seal o reduccin en la intensidad de la luz que ocurre como resultado de la combinacin de la reflexin, absorcin o dispersin de la luz incidente. d) Nefelometra. La nefelometria es una tcnica que permite determinar niveles de antgeno o de anticuerpo en soluciones a muy baja concentracin. La nubosidad o turbidez que producen los pequeos inmunocomplejos es medida por la luz que se dispersa (scattered light), a travs de un fotodetector que est en un ngulo diferente a la fuente de luz incidente (30 a 90). Se puede obtener una gran sensibilidad usando luz monocromtica de un rayo lser y por adicin de polietilenglicol que aumenta el tamao de los agregados. En el laboratorio clnico se est usando masivamente por sus ventajas en la cuantificacin de protenas, como: rpido, altamente automatizado, simple de operar, usa pequeos volmenes de muestra y reactivo, alta sensibilidad (menor que 1 ng/litro) y excelente precisin. e) Precipitacin de complejos inmunes solubles. Existen algunas situaciones que hacen necesario precipitar complejos inmunes solubles para identificar el antgeno o determinar el contenido de anticuerpos, que se lleva a cabo modificando la solubilidad del complejo con polietilenglicol al 2% o sulfato de amonio al 50% o por adicin de un reactivo anti-inmunoglobulinas (anticuerpos antiinmunoglobulinas o protena A de estafilococo).

2.1.1.2. Reaccin de precipitacin en gel Los mtodos de precipitacin en gel permiten detectar la presencia y/o concentracin de antgenos y/o anticuerpos presente, por la formacin de bandas opacas de precipitado que corresponden a complejos antgenos-anticuerpos en la zona de equivalencia. a) Inmunodifusin doble. La inmunodifusin doble fue desarrollada principalmente por Ouchterlony en Suecia. Se basa en la difusin del Ag y el Ac en un medio semislido (gel de agar), formando bandas de precipitacin donde los reactantes estn en proporciones equivalentes. Estos complejos son insolubles y pueden ser analizados visualmente. La tcnica se basa en preparar un gel uniforme de agar en una placa Petri o portaobjeto. En el agar se practica perforaciones de un dimetro y esquema previamente establecidos. Las soluciones que contiene el antgeno y el anticuerpo se colocan en perforaciones adyacentes y se deja difundir hasta formar lneas o bandas de precipitacin. La intensidad, nitidez y posicin de estas bandas es dependiente de la concentracin del Ag y Ac. La inmunodifusin doble se utiliza para anlisis de antgenos y anticuerpos. Permite determinar la relacin inmunoqumica entre dos antgenos a travs de componentes idnticos o de reactividad cruzada. Se distinguen tres patrones de reactividad: reaccin de identidad, de no identidad y de identidad parcial o cruzada (figura 40-2). Tambin, puede utilizarse para determinar monoespecificidad de un antisuero y para conocer el ttulo de los anticuerpos.

Figura 40-2. Inmunodifusin doble. Reacciones de precipitacin en agar que ilustran reacciones de identidad, identidad parcial y no identidad.

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La figura 40-3 muestra la utilidad de la inmunodifusin doble en la deteccin de antgenos proteicos en orina. b) Inmunodifusion radial. La inmunodifusin radial es una tcnica de precipitacin en gel, en que el agar se ha mezclado con un antisuero monoespecfico sobre un portaobjeto o placa de Petri. Se hacen perforaciones cilndricas que se llenan con volmenes fijos de soluciones de referencia de antgeno para el cual el antisuero es especfico y con soluciones o muestras problemas. La difusin del Ag en el agar permite la formacin de anillos de precipitacin, cuya rea es proporcional a la concentracin inicial del Ag. Al trmino de 16 a 48 horas de difusin en cmara

hmeda y temperatura constante, se leen los dimetros del halo de precipitacin. Se construye un grfico o se obtiene la ecuacin de la recta con las concentraciones de referencias versus rea o dimetro del anillo y se interpola la lectura de la muestra problema. Este procedimientos ha sido ampliamente adaptado para medir muchos antgenos, como por ejemplo, inmunoglobulinas en diversos lquidos biolgicos y su sensibilidad puede llegar a 0,1 mg/ ml y su coeficiente de variacin es menor al 20% (figura 40-4). c) Inmunoelectroforesis. La inmunoelectroforesis (IEF) desarrollada por Grabar y Williams, es una tcnica cualitativa que permite la identificacin

Figura 40-3. Inmunodifusin doble de una muestra de orina. Se observa un elevado nivel de albmina y ausencia de IgG, lo que indica un posible dao inicial del glomrulo.

Figura 40-4. Cuantificacin de IgG humana por Inmunodifusin radial. Curva de referencia IgG (pocillos 1 al 4) y muestras de suero de pacientes (pocillos 5 al 8).

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de diferentes antgenos en mezclas complejas, que pueden tener semejante movilidad electrofortica y peso molecular, pero diferentes determinantes antignicos. Esta tcnica se realiza en geles de agar o agarosa y se distinguen dos etapas: (1) la solucin de protenas se somete a separacin electrofortica y (2) terminada la electroforesis, las protenas son analizadas con antisueros poli o monoespecficos en el agar en un canal paralelo al eje de migracin. Luego de un perodo de difusin en cmara hmeda, se observan arcos de precipitacin cuya forma y posicin dependen de las caractersticas inmunoqumicas y de la concentracin de cada antgeno. La IEF es de gran utilidad para el anlisis e identificacin de componentes monoclonales que caracterizan las enfermedades asociadas con gammapatas monoclonales (figura 40-5). d) Inmunofijacin. La inmunofijacin es un procedimiento que utiliza, en una primera etapa, la electroforesis de protena en gel de agarosa y luego, la inmunoprecipitacin. Sobre la placa de agarosa en que se han separado las protenas por

electroforesis se aplican antisueros monoespecficos y la presencia del antgeno complementario forma complejos antgeno-anticuerpo que precipitan. La formacin de un precipitado estable antgeno-anticuerpo fija la protena en el gel (figura 40-6). Se utiliza esencialmente en la caracterizacin de inmunoglobulinas monoclonales. La inmunofijacin y la inmunoelectroforesis son tcnicas complementarias en la identificacin de una gamapata monoclonal. La inmunofijacin debiera ser utilizada frente a protenas anmalas que son difciles de caracterizar por inmunoelectroforesis. e) Contrainmunoelectroforesis. La contrainmunoelectroforesis se realiza en gel agar, donde el pH del tampn de electroforesis permite que el anticuerpo de cargue positivamente y el antgeno negativamente. La sensibilidad del mtodo es aproximadamente 20 veces mayor que la doble difusin. Actualmente el uso ms importante es en el diagnstico de enfermedades infecciosas cuyos antgenos migran hacia el polo positivo en el agar (figura 40-7).

Figura 40-5. Electroforesis e inmunoelectroforesis del suero de un paciente (p) con gammapata monoclonal IgG, . Suero control (c), suero anti-IgG (), suero anti IgA humana (), suero anti-IgM humana (), suero anti-kappa libre humana () y suero anti-lambda libre humana ().

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Figura 40-6. Electroforesis e inmunofijacin del suero de un paciente (p) con gammapata monoclonal IgG, . Suero antiIgG humana (), suero anti-IgA humana (), suero anti-IgM humana (), suero anti-kappa libre humana () y suero anti-lamdda libre humana ().

Figura 40-7. Contrainmunoelectroforesis para la determinacin de antgeno de superficie del virus de la hepatitis B. Pocillos a: Suero de conejo anti-antgeno de superficie del virus de la hepatitis B. Pocillos b: Sueros humanos positivos y negativos a antgeno de superficie del virus de la hepatitis B.

f) Rocket Inmunoelectroforesis. El rocket inmunoelectroforesis es la combinacin de la electroforesis y la inmunodifusion radial que han proporcionado un mtodo rpido para medir concentracin de antgenos. El Ag migra por electroforesis (aplicado en un pequeo pozo) en un agar que contiene antisuero (anticuerpos en exceso). El tiempo requerido para la precipitacin es de

aproximadamente 2 horas. La altura de la zona de precipitacin que tiene la forma de un rocket es proporcional a la concentracin de antgeno. El antgeno debe migrar hacia el polo positivo en la electroforesis, por tanto, es conveniente para albmina, transferrina y ceruloplasmina, pero para inmunoglobulina es ms conveniente la inmunodifusin radial (figura 40-8).

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Figura 40-8. "Rocket" inmunoelectroforesis para la determinacin de albmina humana. Concentraciones de referencia de albmina (pocillos 1 al 3) y muestras de pacientes (pocillos 4 al 7).

g) Inmunoelectroforesis cruzada o bidimensional de Laurell. La inmunoelectroforesis cruzada requiere inicialmente la separacin electrofortica de una mezcla de antgeno en una direccin perpendicular al fenmeno final de precipitacin o de etapa rocket. Esta es capaz de resolver mezcla de antgenos altamente complejas y cuantificar cada uno de ellos (figura 40-9). Por ejemplo, se ha utilizado para estimar el grado de conversin de tercer componente del complementario (C3) a la forma inactivada C3c.

2.1.2. Reaccin de aglutinacin Los antgenos particulados, como microorganismos y suspensiones celulares son corrientemente aglutinados cuando se mezclan con sus antisueros. Los anticuerpos son dirigidos contra determinantes antignicos de superficie que permiten un adecuado entrecruzamiento con el Ag particulado permitiendo la reaccin de aglutinacin. Los principios de la aglutinacin son los mismos descritos para las reacciones con antgenos solubles. Las reacciones de aglutinacin se utilizan preferentemente para identificar bacteria y tipificar glbulos rojos, es llevada a cabo, generalmente en solucin fisiolgica (NaCl 0,15 M; pH 7,0) y es ampliamente utilizada en determinaciones semicuantitativas. En las reacciones de aglutinacin se debe considerar el fenmeno de prozona que consiste en que algunos sueros dan una efectiva reaccin de aglutinacin solamente cuando estn francamente diluidos. Sueros no diluidos o diluidos levemente no reaccionan visiblemente con el Ag. Actualmente se conoce que en la prozona existen anticuerpos absorbidos en la superficie celular y el fenmeno se explica por el exceso de anticuerpos y a la presencia de anticuerpos conocidos como bloqueadores o incompletos que corresponden a anticuerpos univalentes (Acs con un solo sitio activo). a) Aglutinacin directa. La aglutinacin directa se utiliza cuando el antgeno particulado posee

Figura 40-9. Inmunoelectroforesis cruzada o bidimensional de Laurell. Primera dimensin. El pocillo contiene suero humano. Segunda dimensin: el gel de agar contiene un antisuero oligoespecfico. Los precipitados o "rocket" corresponden a las siguientes protenas: (1) transferrina, (2) alfa 2-macroglobulina, (3) ceruloplasmina, (4) alfa 1antitripsina, (5) alfa 1-glicoprotena cida.

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suficientes determinantes antignicos en su superficie permitiendo que el antisuero (Ac) correspondiente produzca espontneamente el fenmeno de aglutinacin. Se usa regularmente en la serotipificacin bacteriana. b) Aglutinacin indirecta. La aglutinacin indirecta se utiliza para clulas que tienen un nmero reducido de determinantes antignicos o que existe una cantidad insuficiente de anticuerpos que dificultan el procedimientos de aglutinacin, para lo cual es necesario disponer de otro reactivo que es el anticuerpo anti-inmunoglobulinas. Por ejemplo, determinacin del antgeno D (Rh) de los glbulos rojos. c) Aglutinacin pasiva. La aglutinacin pasiva se utiliza para antgenos solubles que se absorben en forma covalente a la superficie de las partculas. Se han usado partculas como glbulos rojos (hemaglutinacion pasiva) o polmeros sintticos tal como el poliestireno o un coloide mineral como la bentonita. La determinacin del factor reumatodeo utiliza partculas de poliestireno de aproximadamente 0.20 a 0.25 m de dimetro recubiertas con gammaglobulina humana. La aglutinacin es considerada ms sensible que la precipitacin para detectar anticuerpos, debido bsicamente a que grandes partculas cubiertas con Ag sirven para amplificar la reaccin. 2.1.3. Reaccin con participacin del complemento a) Fijacin del complemento. La fijacin del complemento permite detectar anticuerpos por la formacin de complejos inmunes que fijan complemento por la va clsica y que por una reaccin secundaria, lisis de un sistema indicador glbulos rojos-anti glbulos rojos permite determinar la cantidad de antgeno o de anticuerpo presente en la reaccin. b) Actividad hemoltica del complemento (CH50). La determinacin de la actividad hemoltica del complemento (CH50) permite conocer la actividad funcional del sistema complemento y se basa en determinar la cantidad mnima de suero (complemento) que lisa el 50% de glbulos rojos indicadores que han sido previamente sensibilizados en forma ptima con su anticuerpo (hemolisina). La hemlisis se produce por la activacin de la va clsica del complemento.

2.2. Inmunoanlisis con reactivos marcados Los inmunoanlisis con reactivos marcados se clasifican en: homogneos y heterogneos y existen dos tipos bsicos: competitivo y no competitivo. El inmunoanlisis homogneo no requiere separacin fsica del antgeno unido, del libre. Considera las diferencias fisicoqumicas (tamao o cambios conformacionales) entre el antgeno libre y el acomplejado al anticuerpo, siendo este hecho el que caracteriza la seal de respuesta. La sensibilidad puede verse afectada debido a que no hay separacin de la muestra del paciente con la seal de deteccin final, facilitando interferencias. A veces se recomienda tratamiento previo de la muestra para eliminar estas interferencias. Su automatizacin es fcil y se utiliza preferentemente en la deteccin de drogas y hormonas. El inmunoanlisis heterogneo contempla la separacin del antgeno unido del libre, considerando las diferencias fsicas, qumicas o inmunolgicas (tamao, carga, adsorcin a superficie slida). Permite eliminar la mayora de las interferencias de la muestra, mejorando la sensibilidad de la determinacin. Su automatizacin es compleja y se aplica en la determinacin de anticuerpos especficos, marcadores tumorales y hormonas. El inmunoanlisis competitivo se basa en la competencia entre el antgeno de inters (analito) y una cantidad constante del antgeno similar marcado por una cantidad fija y limitada de anticuerpo especfico. En este caso esta marcado el analito. El inmunoanlisis no competitivo usa un exceso de anticuerpo especfico marcado contra el antgeno o analito de inters. En este caso est marcado el reactivo. En la tabla 40-2 se muestra los mtodos inmunoqumicos que utilizan reactivos marcados. 2.2.1. Inmunoanlisis fluorescente a) Microscopa inmunofluorescente. La microscopa inmunofluorescente incorpora el concepto tradicional de inmunofluorescencia (IF) que bsicamente es una tcnica inmunohistoqumica o inmunocitoqumica que permite la localizacin de antgenos en clulas y tejidos y la

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Tabla 40-2. Inmunoanlisis con reactivos marcados Inmunoanlisis fluorescente Microscopa inmunofluorescente Inmunofluorescencia directa Inmunofluorescencia indirecta Inmunoanlisis de fluorescencia polarizada (FPIA) Inmunoanlisis de fluorescencia unida a enzima (ELFIA) Citometra de flujo Enzimainmunoanlisis (EIA) EIA homogneo. EMIT EIA heterogneo. ELISA, MEIA Electroinmunotransferencia o Western blot o Immunoblotting Radioinmunoanlisis (RIA) RIA en fase soluble RIA en fase slida Deteccin inmunorradiomtrica para antgeno Quimiluminiscencia Bioluminiscencia

deteccin y titulacin de anticuerpos especficos. La fluorescencia es un fenmeno producido por molculas excitadas que emiten radiacin, energa o luz que cesa inmediatamente despus que se retira la luz excitante. Las molculas que tienen esta caracterstica se llaman fluorocromos. Los fluorocromos o fluorforos son sustancias coloreadas que absorben radiacin y luego son excitadas emitiendo mxima energa a una determinada longitud de onda. Para obtener un mximo rendimiento de la IF es necesario conocer los peak de excitacin y de emisin del fluorocromo en uso que permita seleccionar adecuadamente la fuente de luz y la combinacion de filtros (primarios y barrera) del microscopio de fluorescencia. El peak de excitacin es la longitud de onda a la que el fluorocromo absorbe radiacin con una mxima eficiencia. El peak de emisin es la longitud de onda a la que la energa fluorescente resultante es mxima. Los fluorocromos ms utilizados son el isotiocianato de fluoresceina (FITC), rodamina B y ficoeritrina. Los anticuerpos con uno o dos residuos de fluorocromo por molcula son intensamente fluorescentes y mantienen su actividad especfica. Existen dos procedimientos de inmunofluorescencia que se utilizan

regularmente en el laboratorio: directa e indirecta. a.1) Inmunofluorescencia directa (IFD) . La IFD utiliza un anticuerpo especfico conjugado con el fluorocromo que se aplica directamente sobre el sustrato (tejido, clula, u otro) permitiendo identificar la estructura responsable de la especificidad. Se utiliza preferentemente para identificar microorganismo y tipificar clulas (por ejemplo: linfocitos). a.2) Inmunofluorescencia indirecta (IFI). La IFI es una tcnica de doble capa, en que un anticuerpos no marcado se aplica directamente sobre el sustrato y se visualiza la reactividad con un conjugado antiinmunoglobulinas-fluorocromo. Se utiliza preferentemente para la deteccin de autoanticuerpos (figura 40-10). En la inmunofluorescencia se puede aumentar la sensibilidad con el sistema avidina (estreptavidina)-biotina que tiene una alta afinidad, que utiliza primariamente un conjugado anticuerpo-biotina y luego conjugado avidinafluorocromo. b) Inmunoanlisis de fluorescencia polarizada. El inmunoanlisis de fluorescencia polarizada (fluorescence polarization immunoassay"; FPIA)

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detector (ver captulo 43). La molcula de fluorocromo unida al anticuerpo monoclonal absorbe luz del rayo lser y emite luz en otra longitud de onda, en que su intensidad es captada por otro detector que est en ngulo recto al rayo. Ambos fenmenos facilitan la correcta identificacin de las poblaciones celulares. 2.2.2. Enzimainmunoanlisis El enzimainmunoanlisis (EIA) ha reemplazado a muchas tcnicas tradicionales en el diagnstico clnico e investigacin biolgica desde que se introdujo en 1966 por Avrameas y Uriel. Este mtodo se basa en dos fenmenos biolgicos: alta especificidad del anticuerpo por un antgeno (reaccin inmunolgica) y la amplificacin por reacciones qumicas llevadas a cabo por enzimas que actan sobre sustratos que originan productos coloreados (reaccin indicadora). La tcnica de EIA es utilizada rutinariamente para localizacin de antgeno o anticuerpo sobre tejidos o clulas, para la deteccin de antgeno o anticuerpos inmovilizados en una fase slida, para la titulacin de anticuerpo y para la medicin de antgeno. Los antgenos pueden ser medidos por procedimientos inmunoenzimticos homogneos o heterogneos. Las enzimas que se utilizan corrientemente para marcar anticuerpo o antgeno son: fosfatasa alcalina, cuyo sustrato es el p-nitrofenil-fosfato y la lectura de absorbancia se lleva a cabo a 405 nm; peroxidasa que puede utilizar tres sustratos diferentes: o-fenilendiamina (oPD)/H202; 3,3',5,5'tetrametilbenzidina (TMB)/H202 y 2,2'-di-azino(3etilbenzotiazolina 6-cido sulfnico (ABTS)/H202 con lecturas de densidad ptica a 492, 450 y 415 nm respectivamente y beta-galactosidasa, cuyo sustrato es el o-nitrofenil-beta-D-galactopiransido (oNPG) y la lectura se realiza 420 nm. En los EIA automatizados se usa corrientemente la fosfatasa alcalina como enzima marcadora y como sustrato el 4-metilumbeliferil fosfato (MUP). El MUP es catalizado a un producto fluorescente (metilumbeliferona) que es medido por fluorometra. El EIA, tambin puede ser amplificado utilizando la interaccion avidina (estreptavidina)biotina. Se utiliza los conjugados anticuerposbiotina y avidina-enzima. a) EIA homogneo. El enzyme-multiplied immunoassay technique (EMIT) es un EIA

Figura 40-10. Deteccin de anticuerpos antinucleares por inmunofluorescencia indirecta. Se usa clulas HEp-2. En este caso se observa un patrn homogneo.

es un inmunoanlisis homogneo y competitivo que usa un antgeno marcado con un fluorforo y polarizado, y su sistema de deteccin est basado en la fluorometra. Es fcilmente automatizado y se utiliza para medir pequeas molculas como drogas y hormonas. c) Inmunoanlisis de fluorescencia unida a enzima. El inmunoanlisis de fluorescencia unida a enzima (enzyme-linked fluorescence immunoassays", ELFIA) es un inmunoanlisis heterogneo y puede ser de tipo competitivo o no competitivo, en que el inmunorreactante marcado con enzima est en combinacin con un sustrato fluorognico que permite la deteccin por fluorometra. El ELFIA est automatizado y es uno de los mtodos ms sensibles hoy en da en el laboratorio clnico. Utiliza preferentemente como enzima marcadora fosfatasa alcalina y como sustrato fluorognico el 4 metil umbeliferona (4MUP). d) Citometra de flujo. La citometra de flujo permite medir la cantidad de anticuerpo monoclonal fluorescente unido a cada clula en forma individual, facilitando la identificacin y tipificacin de diferentes subgrupos de poblaciones celulares con una extraordinaria sensibilidad, eficiencia y rapidez. En el citmetro de flujo las clulas atraviesan un rayo lser y son analizadas individualmente. Las clulas deflectan o dispersan la luz de un lser de una forma estrechamente relacionada con su tamao y granularidad que es registrada en un

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homogneo y competitivo que usa una enzima marcadora y el sistema de deteccin es espectrofotomtrico. La enzima marcadora es unida covalentemente al antgeno en una posicin cercana al sitio activo de la enzima. Durante la reaccin inmunolgica, cuando el antgeno marcado con la enzima se une al anticuerpo, el sitio activo de la enzima es bloqueado fsicamente y la enzima es inhibida funcionalmente. En la forma libre del antgeno marcado con la enzima, la enzima permanece activa funcionalmente y actuar sobre el sustrato que se aade generando un producto coloreado. El cambio de color resultante es proporcional a la cantidad de antgeno marcado libre disponible y debido a la naturaleza competitiva del inmunoanlisis, ser proporcional a la cantidad de analito (antgeno) presente en la muestra. El EMIT se ha automatizado fcilmente y es usado principalmente en la deteccin de drogas. b) EIA heterogneo. Los procedimientos EIA heterogneos son en general ms sensibles que los homogneos. El "enzyme-linked inmunosorbent assay" (ELISA) se realiza sobre una fase slida (placas de poliestireno u otro similar) y es un EIA heterogneo, no competitivo y su deteccin preferentemente es por espectrofotometra (figura 40-11). Es ampliamente utilizado en el laboratorio clnico en la deteccin y medicin de autoanticuerpos y varias otras protenas. Existe una variedad que se realiza sobre papel de nitrocelulosa que se ha llamado inmunofijacion en punto o "immuno blot, "dotimmunobinding" o "dot" (figura 40-12). El "microparticle enzyme immunoassay" (MEIA) es un mtodo heterogneo, no competitivo y de tipo sandwich. Utiliza una enzima marcadora y el sistema de deteccin es por fluorometra o espectrofotometra. Incorpora micropartculas que permiten aumentar el rea en la cual ocurre la reaccin antgeno-anticuerpo facilitando la cintica de la reaccin y disminuyendo el tiempo de incubacin. Ha sido automatizado permitiendo cuantificar una gran cantidad de molculas, incluyendo hormonas y marcadores tumorales. c) Electroinmunotransferencia ("Western blot" o "Immunoblotting"). La electroinmunotransferencia combina la electroforesis en gel SDSpoliacrilamida y la alta sensibilidad del enzi-

Figura 40-11. Esquema de enzimainmunoanlisis en fase slida (ELISA) para deteccin y cuantificacin de anticuerpos especficos. En el esquema el antgeno se ha unido a un soporte slido; luego el anticuerpo (Ac primario) a pesquisar (suero del paciente) reconoce el antgeno. Posteriormente el conjugado anticuerpo secundario-enzima se une al Ac primario, evento que es reconocido con la adicin del sustrato que catalizado por la enzima forma productos coloreados cuya densidad ptica se lee a una determinada longitud de onda.

Figura 40-12. Inmunodifusin en punto o "dot immunobinding". Enzimainmunoanlisis sobre papel de nitrocelulosa para deteccin de anticuerpos especficos. Los puntos coloreados indican positividad.

mainmunoanlisis para originar una poderosa herramienta que permite estudiar cualitativa y cuantitativamente las reacciones antgenoanticuerpo. Los antgenos son separados en gel SDS-poliacrilamida y transferidos a una membrana de nitrocelulosa unindose inespecficamente e identificados con procedimientos inmunoenzimticos. Debido a que existe un proceso de denaturacin de los antgenos por los

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detergentes utilizados se recomienda utilizar antisueros policlonales en el anlisis ("blotting") para aumentar la probabilidad de detectar eptopos o determinantes antignicos que no se han alterado por la denaturacin. La electroinmunotransferencia se utiliza en el diagnstico viral (confirmacion de anticuerpos anti-HIV), tipificacin de bacterias (Neisseria meningitidis), deteccin de autoanticuerpos (anticuerpos anti-antgenos nucleares extractables), etc. 2.2.3. Radioinmunoanlisis El radioinmunoanlisis (RIA) utiliza antgeno o anticuerpo generalmente marcados con istopos como, 125I o eventualmente 131I. Este inmunoanlisis puede llevarse a cabo en fase soluble o slida. a) RIA en fase soluble. El RIA en fase soluble permite determinar la capacidad de unin de un anticuerpo, por adicin de un moderado exceso de antgeno marcado a un antisuero, los anticuerpos forman complejos solubles y se precipitan por los procedimientos ya indicados. En el precipitado se mide la radiactividad dando una estimacin de la capacidad de unin del anticuerpo especfico por su antgeno. Este inmunoanlisis en fase soluble, tambin permite determinar antgeno (RIA clsico) por adicin de un antgeno marcado a una cantidad fija y limitada de anticuerpo, cuya unin puede ser parcialmente inhibida por la adicin de antgeno no marcado. La extensin de esta inhibicin puede ser usada como una medida del antgeno no marcado. Se debe realizar la medicin de la radiactividad del antgeno radiomarcado libre, que debe estar separado de los otros constituyentes del sistema. b) RIA en fase slida. El RIA en fase slida permite medir un anticuerpo a travs de su capacidad de unin al antgeno que ha sido insolubilizado por adsorcin fsica a un soporte plstico. La inmunoglobulina unida puede ser estimada por la adicin de un anticuerpo antiinmunoglobulinas radiomarcada producida en otra especie. Este procedimiento se ha utilizado en la prueba RAST ("radioallergosorbent test") para la determinacin de IgE especfica en pacientes alrgicos. En este caso, el alergeno es covalentemente unido a un soporte y que luego es incubado con el suero del paciente. La cantidad

de IgE especfica unida al soporte es estimada por la adicin de un anticuerpo anti-IgE radiomarcado. c) Deteccin inmunorradiomtrica para antgenos. En las pruebas inmunorradiomtricas el reactivo marcado es utilizado en exceso. Para la determinacin de antgeno, los anticuerpos estn absorbidos sobre un soporte slido al que se le agrega la solucin de antgeno. Luego el soporte es lavado y la cantidad de antgeno unido puede ser estimado por la adicin en exceso de un anticuerpo radiomarcado. La prueba muestra una mayor especificidad cuando los anticuerpos utilizados reconocen diferentes eptopos del antgeno. La aplicacin clsica de esta prueba es el RIST ("radioimmunosorbent test") para la determinacin de IgE total, donde el anticuerpo anti-IgE se ha unido covalentemente a microcristales de celulosa y se le adiciona el suero del paciente y los sueros controles. La IgE total unida es medida por la adicin de un anticuerpo anti-IgE radiomarcado. 2.2.4. Quimiluminiscencia La quimiluminiscencia es la emisin de luz producida en ciertas reacciones qumicas de oxidacin. La mayoria de las reacciones quimiluminiscente son de oxidacin debido a que la produccin de luz visible requiere reacciones altamente energticas. La reaccin quimiluminiscente ms estudiada ha sido la oxidacin del luminol. Los marcadores ms populares son los derivados de isoluminol y steres de acridina. Para detectar un marcado quimiluminiscente se usa una amplia variedad de luminmetros que miden la emisin de luz. En este ltimo tiempo se est usando como marcador la fosfatasa alcalina que reacciona con sustratos basados en el adamantil 1,2-dioxetano aril fosfato, que los desfoforila para producir un fenxido intermediario y ste al descomponerse produce emisin de luz a 470 nm. Actualmente, los inmunoanlisis quimiluminiscentes son utilizados por varios analizadores automatizados. En ellos se determinan drogas, hormonas, marcadores tumorales y otras protenas. 2.2.5. Bioluminiscencia La bioluminiscencia es un fenmeno natural que se encuentra en muchas formas inferiores de vida. Un sistema natural es la D-luciferina/luciferasa,

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en que la luciferasa cataliza la oxidacin de la Dluciferina en presencia de ATP y Mg +2 a oxiluciferina, con emisin de luz a 546 nm. En los inmunoanlisis bioluminiscentes se est utilizando conjugado anticuerpo-fosfatasa alcalina o conjugado analito-fosfatasa alcalina que reacciona con la D-luciferina-o-fosfato liberando D-luciferina. La D-luciferina es oxidada por la luciferasa con emisin de luz. An no est disponible inmunoanlisis bioluminiscente para aplicacin rutinaria en el laboratorio.

Wild, D., The Immunoassay Handbook, Segunda Edicin, CPL Scientific Publishing, Hardback, U.S.A., 2000.

LECTURAS SUGERIDAS Avrameas, S., Amplification systems in immunoenzymatic techniques, J Immunol. Meth., 150: 23-32, 1992. Chan, D. and Sokoll, L., Immunoassays automation at the millenium, Editorial, J. Clin. Ligand Assay , 22(1), 1999. Diamandis, E. and Christopoulos, T., Immunoassay, Academic Press. U.S.A.,1996. Eisen, H., Immunology, Harper and Row Publishers, U.S.A., captulo 16, pp. 297-336, 1980. Kemeny, D., Titration of antibodies, J. Immunol Meth., 150: 50 76, 1992. MacCrindle, C., Schwenzer, K. and Jolley, M., Particle concentration fluorescence immunoassay: A new immunoassay technique for quantification of human immunoglobulins in serum, Clin. Chem., 31/9:1487-1490, 1985. Porstmann, T. and Kiessig, A., Enzymes immunoassay techniques. An overview, J. Immunol. Meth., 150: 5-21, 1992. Roitt, I., Essential Immunology, chapter 5, Blackwell Scientific Publications, London, 1991. Slagle, K. and Ghosn, S., Immunoassays. Tools for sensitive, specific and accurate test results, Lab. Medicine, 27: 177-183. 1996. Volland, H.; Vulliez Le Normand, B.; Mamas, S.; Grassi, J.; Crminon, C.; Ezan, E. and Pradelles, P., Enzyme immunometric assay for leukotriene C4, J. Immunol. Meth., 175: 97, 1994.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 41
MTODOS DE ESTUDIO DE LA INMUNIDAD CELULAR
Jorge Gonzlez C. y Pilar Vega C

1. Introduccin 2. Preparacin y aislamiento de diferentes poblaciones celulares 2.1. Mtodos de purificacin tradicionales 2.2. Separacin inmunomagntica 3. Estudio de la respuesta inmune celular especfica 3.1. Estudio de las subpoblaciones de linfocitos 3.2. Estudio de las funciones de inmunidad celular especfica 3.3. Estudio de la sntesis de citoquinas y sus receptores 3.4. DNA microarrays 3.5. Pruebas para evaluar reacciones de hipersensibilidad retardada (RHR) 3.6. Estudios de la especificidad de clulas T 3.7. Deteccin de clulas T precursoras

4. Estudio de la inmunidad celular inespecfica 4.1. Ensayos funcionales de neutrfilos 4.2. Ensayos funcionales de eosinfilos 4.3. Ensayos funcionales de monocitos y macrfagos 5. Evaluacin de laboratorios del paciente infectado con el virus de la inmunodeficiencia humana. Un modelo del estudio de las deficiencias en la respuesta celular 5.1. Estudio fenotpico de linfocitos 5.2. Estudio de la respuesta proliferativa 5.3. Estudio de la respuesta citotxica 5.4. Evaluacin de los niveles de citoquinas y subpoblaciones de linfocitos T

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RESUMEN La respuesta inmune celular del hombre debe ser evaluada mediante pruebas de laboratorio, no slo frente a la sospecha de estados inmunes alterados, sino tambin frente a tratamientos con modificadores biolgicos de la respuesta y en eventuales estudios de vacunacin. Frente a cualquiera de estas situaciones, la respuesta inmune celular puede ser evaluada tanto in vivo como in vitro. Las respuestas in vivo, se evalan nicamente mediante pruebas cutneas, llamadas reacciones de hipersensibilidad. Por otro lado, un vasto arsenal de pruebas in vitro, estn disponibles, para evaluar la respuesta celular y la factibilidad de su uso dependen tanto del nivel de equipamiento de cada laboratorio como de la formacin de sus recursos humanos. No obstante, de manera general ningn ensayo aislado es suficiente para un adecuado diagnstico; una visin adecuada del funcionamiento de la respuesta celular puede obtenerse por la combinacin e interpretacin de varios mtodos y parmetros. Especial cuidado debe tenerse en el anlisis, manejo e interpretacin de los resultados. Debe considerarse que los resultados obtenidos podran variar dependiendo de la metodologa empleada, del background gentico de los diferentes individuos e incluso dentro de un mismo individuo. Por ello resulta de especial valor que cada laboratorio determine y maneje con propiedad los parmetros normales para cada prueba, pudiendo as acceder a interpretaciones laboratoriales ms adecuadas. El desarrollo de ensayos sensibles para analizar la respuesta inmune celular tanto en el hombre como en modelos experimentales ha llevado a importantes descubrimientos tanto en inmunologa bsica como clnica. En el futuro, el empleo de mtodos ms sensibles y especficos, sumados a la utilizacin de tecnologas emergentes como los DNA microarrays y el estudio de protenas (proteomica), permitir mejorar el diagnstico y el pronstico de las diferentes enfermedades infecciosas y de base inmunlogica

1.

INTRODUCCIN

La rama celular de la respuesta inmune, confiere inmunidad mediante la generacin de clulas efectoras. Aunque en estos mecanismos, pueden adems participar tanto anticuerpos como factores del complemento, stos juegan un papel secundario. Por ello, tanto clulas especficas como no especficas estimuladas para un mismo antgeno contribuyen a la respuesta inmune mediada por clulas. Las clulas especficas, corresponden a las diferentes subpoblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+, mientras que en las clulas no especficas se incluye a macrfagos, neutrfilos, eosinfilos y clulas "natural killer" (NK). No obstante, la actividad de ambos tipos de clulas depende de las concentraciones locales de citoquinas, que son mediadores solubles secretados por diferentes

poblaciones celulares. De esta forma, mientras la respuesta humoral, permite controlar y eliminar microorganismos extracelulares y neutralizar sus productos, la respuesta celular es responsable del control de microorganismos intracelulares, la destruccin de clulas infectadas por virus, clulas tumorales y el rechazo a injertos. De esta forma se puede afirmar que la respuesta celular est adaptada para reconocer y eliminar clulas alteradas, sean stas infectadas por patgenos intracelulares o que expresen antgenos tumorales. La importancia de la inmunidad mediada por clulas, resulta evidente cuando el sistema es defectuoso. Por ejemplo, en nios con sndrome de Di George, quienes nacen sin timo y por ende son deficientes en clulas T, generalmente controlan patgenos extracelulares, pero no as los intracelulares (ver captulo 29). Esta falla funcional en la respuesta inmune mediada por clulas,

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resulta en infecciones a repeticin por diferentes patgenos intracelulares, donde incluso vacunas atenuadas pueden producir estados infecciosos. La evaluacin de la respuesta inmune celular permite, en pacientes, conocer de manera cualitativa y cuantitativa la funcionalidad de clulas y mediadores de esta rama de la respuesta inmune, de manera de determinar en correlacin con los antecedentes clnicos, el estado inmune del paciente. La deteccin de estados alterados puede corresponder a las llamadas inmunodeficiencias las cuales pueden ser congnitas o adquiridas (ver captulos 29 y 30). Por otro lado, tambin se consideran estados de inmunidad alterada la reactividad contra antgenos propios conocida como autoinmunidad (ver captulo 23) y la hiperreactividad propia de la alergia (ver captulo 22). De igual forma, el monitoreo de los niveles de productos de la funcin celular como citoquinas y monoquinas, puede ser de utilidad clnica en estudios frente a modificadores de la respuesta biolgica (MRB). En el mbito de la investigacin biomdica, ya sea en modelos animales, como en personas, permite conocer y definir de manera experimental las caractersticas de la respuesta inmune celular posibilitando la identificacin de antgenos protectores tanto frente a patgenos como frente a tumores, en eventuales estudios de vacunacin. En este captulo se describe los principales mtodos diagnsticos que permiten evaluar el estado de la rama celular de la respuesta inmune. Muchas de las pruebas que permiten la evaluacin de la respuesta inmune celular han sido utilizadas por muchos aos. Otras son de incorporacin ms reciente al arsenal de pruebas de laboratorio. Algunas de ellas son de reciente aplicacin en el mbito de la inmunologa y aunque no siempre podran ser factibles de aplicar de manera masiva en los laboratorios, es necesario conocer la existencia de ellas y sus posibles proyecciones.

2.1. Mtodos de purificacin tradicionales Utilizan soluciones de ficoll-hipaque o percoll en diferentes densidades, las que mediante centrifugacin permiten la separacin de las diferentes poblaciones celulares, basndose en sus diferencias de tamao y densidad. 2.1.1. Separacin de linfocitos Para ello la sangre total es diluida en buffer fosfato salino en proporcin 1:1, depositndola sobre ficoll-hipaque a densidad de 1,077. Luego de centrifugar, en la interfase entre el plasma diluido y la solucin de ficoll, se forma un anillo blanco rico en leucocitos, mientras que en el pellet se encuentran los eritrocitos y los polimorfonucleares (PMN). 2.1.2. Separacin de polimorfonucleares y linfocitos La sangre heparinizada se mezcla con una solucin de dextrano al 6% y se deja sedimentar a temperatura ambiente. De esta manera, se obtiene un plasma rico en PMN, monocitos y linfocitos pero libre de eritrocitos (figura 41-1). 2.1.3. Separacin de linfocitos y PMN Una buena separacin de linfocitos y PMN se consigue a partir del plasma obtenido por sedimentacin con dextrano al 6%. Esta se obtiene mediante centrifugacin diferencial sobre ficollhipaque con densidad 1,077, observndose en la interfase un anillo blanco que contiene los linfocitos mientras que el pellet contiene los eritrocitos (figura 41-1). En todos los casos los procedimientos de purificacin deben ser monitoreados mediante frotis y evaluacin morfolgica de las clulas recuperadas. La confirmacin del tipo celular recuperado se puede realizar mediante inmunofluorescencia utilizando anticuerpos monoclonales contra marcadores de superficie. El control de la viabilidad de estas clulas debe realizarse mediante pruebas de exclusin con azul tripan, o mediante mtodos fluorescentes utilizando steres de acetoxymetil calcena (calcena-AM). 2.1.4. Aislamiento de monocitos humanos Gradientes de ficoll-hipaque han sido

2. PREPARACIN Y AISLAMIENTO DE DIFERENTES POBLACIONES CELULARES El estudio de la respuesta inmune celular requiere, en algunos casos, disponer de poblaciones celulares puras o enriquecidas que permitan la evaluacin de diferentes parmetros. Se puede utilizar mtodos de purificacin tradicionales y basados en separacin inmunomagntica.

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Figura 41-1. Separacin de PMN y linfocitos. Utilizando dextrano 6% se pueden separar los PMN y linfocitos de los glbulos rojos y a la vez los dos primeros se pueden separar usando ficoll hipaque 1.077 o bien una gradiente doble de ficoll hipaque.

rutinariamente utilizadas para inicialmente aislar clulas mononucleares, de las cuales entre 10-20% corresponden a monocitos. Para aislar los monocitos, se usa su capacidad de adherir al plstico, luego de incubacin por 1 h a 37 C. El procedimiento de aislamiento se desarrolla en esterilidad, a temperatura ambiente, utilizando medios y material de vidrio o plstico que estn libres de endotoxinas, debido a que endotoxinas bacterianas como el lipopolisacrido (LPS) son potentes activadores de monocitos y macrfagos. 2.1.5. Aislamiento de eosinfilos El bajo nmero de eosinfilos en sangre perifrica de individuos normales ha hecho relativamente difcil obtener preparaciones en nmero y pureza apropiadas para estudios funcionales. Para ello, protocolos basados en la separacin de eosinfilos de neutrfilos la principal clula contaminante, mediante densidad han sido utilizados por largo tiempo. Estas tcnicas resultan en clulas de alta viabilidad, no obstante posean bajo rendimiento y grados de pureza variable. Ms an la mayora de los eosinfilos son de alta densidad (1095-1100 g/mL), por lo que presumiblemente representaran poblaciones no activadas. Recientemente, se ha introducido la seleccin negativa, basada en la remocin de neutrfilos por medio de separacin celular magntica usando perlas recubiertas de anticuerpo monoclonal anti-CD16. Este mtodo aumenta la recuperacin y pureza de los eosinfilos con respecto a las tcnicas que utilizan gradiente de densidad. No obstante, estas preparaciones difieren de las obtenidas por gradiente, ya que contienen adems los eosinfilos

hipodensos. Debe tenerse en mente que diferencias funcionales han sido observadas dependientes del mtodo utilizado en la purificacin. Aparentemente, eosinfilos purificados mediante separacin celular magntica son menos respondedores a lpidos quimiotcticos que las clulas obtenidas por gradiente. 2.1.6. Aislamiento de basfilos Los basfilos son los leucocitos de menor abundancia en sangre humana y por ende su purificacin es relativamente difcil. Los procedimientos basados en centrifugacin por gradiente permiten enriquecer las preparaciones de basfilos hasta en un 50%, pero contienen una significativa contaminacin con otros tipos celulares especialmente linfocitos. Durante cualquier procedimiento de enriquecimiento deber tenerse presente en prevenir su estimulacin y degranulacin. 2.2. Separacin celular inmunomagntica Recientemente han sido utilizadas tcnicas basadas en la separacin inmunomagntica de neutrfilos, usando perlas magnticas recubiertas de anticuerpo monoclonal anti-CD16. Aunque el marcador CD16 no es exclusivamente expresado por neutrfilos (tambin est presente en algunos eosinfilos y en algunas clulas mieloides precursoras), el aislamiento inmunomagntico a partir de sangre perifrica permite obtener preparaciones enriquecidas de neutrfilos con ms de 99% de pureza (figura 41-2). De igual manera, usando perlas sensibilizadas con anticuerpos anti-CD14 es posible separar monocitos humanos, mientras

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que perlas magnticas con anticuerpos CD4 y CD8 permiten separar estas poblaciones linfocitarias.

3. ESTUDIO DE LA RESPUESTA INMUNE CELULAR ESPECFICA La evaluacin de la respuesta inmune celular especfica, requiere conocer tanto el nmero de clulas como su capacidad funcional. De igual manera, hoy es necesario conocer su capacidad

para secretar algunos mediadores biolgicos como son las citoquinas. Entonces, es necesario conocer los niveles de linfocitos T (LT), tanto CD4+ como CD8+ y sus propiedades funcionales evaluando las principales citoquinas secretadas por stos. De igual manera es importante ensayar tanto la especificidad de estos linfocitos, basndose en aspectos estructurales, como tambin detectar clulas T precursoras en poblaciones que proliferan en respuesta a un antgeno. En todos los casos, la hiptesis diagnstica permite orientar la investigacin de laboratorio, as como los resultados del laboratorio deben ser interpretados a la luz de los hallazgos clnicos. 3.1. Estudio de las subpoblaciones de linfocitos El estudio de la competencia celular debe comenzar por determinar los niveles de las clulas que participan en esta respuesta. Por ello, el nmero y capacidad funcional de los leucocitos circulantes en sangre perifrica refleja el estado general de competencia inmune de un determinado individuo. De esta manera en una variedad de situaciones clnicas, la evaluacin del nmero y funcin de linfocitos, granulocitos y monocitos han comenzado a ser rutinarias tanto en el diagnstico de diferentes patologas como en el monitoreo de tratamientos con inmunosupresores o inmunorrestauradores. Inicialmente, la determinacin en el laboratorio de linfocitos T y B, se realiz, mediante la utilizacin de eritrocitos de cordero y la formacin de rosetas. Los linfocitos T poseen la capacidad de unirse a los eritrocitos de cordero, formando un complejo en el que estas clulas estn rodeadas de eritrocitos, de manera semejante a una flor, denominada roseta E (eritrocito). La evaluacin de rosetas se realiza mediante lectura microscpica. De igual manera, linfocitos B, polimorfonucleares y macrfagos poseen receptores de superficie para fragmentos Fc de IgG y para complemento. Por ello, en presencia de anticuerpos y el factor C3b del complemento, forman las rosetas EAC (eritrocito, anticuerpo-complemento), las cuales son tambin evaluadas mediante microscopa ptica (figura 41-3). 3.1.1. Determinacin del fenotipo inmunolgico mediante citometra de flujo

Figura 41-2. Separacin inmunomagntica de neutrfilos, utilizando anticuerpo monoclonal CD16 unido a partculas magnticas.

En los ltimos aos, el uso de las pruebas de citometra de flujo (ver captulo 42) en la deter-

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Figura 41-3. Determinacin de linfocitos por formacin de Rosetas E y Rosetas EAC. La roseta E se produce por unin del glbulo rojo al receptor CD2 del LT. La roseta EAC se produce por interconexin entre el receptor para C3b del LB y la unin de C3B al fragmento Fc de IgG. Tambin pueden haber uniones de Fc al receptor que tiene LB humano.

minacin de las diferentes subpoblaciones de linfocitos, se ha transformado en un importante mtodo tanto en el diagnstico como en el pronstico de varias entidades clnicas, incluyendo la evaluacin de las inmunodeficiencias y los desrdenes inmunolgicos. La citometra de flujo, permite la enumeracin de diferentes tipos de linfocitos, los cuales difieren en sus propiedades funcionales, su linaje y su estado de maduracin. Entonces mediante esta tcnica es posible determinar los diferentes tipos de linfocitos mediante el uso de anticuerpos monoclonales marcados con substancias fluorescentes, que reconocen sus marcadores de superficie (figura 41-4). Desde la invencin de los anticuerpos monoclonales, miles de ellos han sido generados contra determinantes de superficie de clulas hematopoyticas. Inicialmente, grupos de estos anticuerpos que demostraron propiedades semejantes en cuanto a su ligacin y distribucin tisular fueron designados como "clusters differentiation" o antgenos CD (ver captulo 45). La identificacin de estos CD en la superficie celular de los linfocitos, mediante anticuerpos monoclonales, ha sido esencial en delinear los componentes del sistema inmune. Estos anticuerpos son ahora rutinariamente usados en la identificacin, recuento y separacin de diferentes subpoblaciones de leucocitos y en la clasificacin de afecciones malignas de estos leucocitos. Los anticuerpos monoclonales usados para reconocer LT totales estn dirigidos contra los

antgenos CD45 y CD3, mientras que las subpoblaciones de LT helper son reconocidos por los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD4. Las subpoblaciones de LT citotxicos y supresores se definen con los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD8, mientras que los linfocitos B presentan el marcador CD19. Por otro lado, las clulas NK, se definen por el fenotipo CD3-, CD16+ o CD56+. No es posible identificar clulas NK mediante un nico antgeno, no obstante, el fenotipo CD3-/CD56+, incluye la mayora de las clulas NK. Por ello se requiere marcacin con dos fluorocromos, siendo que existe un porcentaje de LT que son CD3+/ CD56+. En esta perspectiva, el uso de anti-CD3 marcado con fluorescena y anti-CD16 y antiCD56 marcados con otro fluorocromo (ficoeritrina o texas red) es recomendable para determinar en definitiva el fenotipo de las clulas NK. 3.1.2. Determinacin de subpoblaciones de linfocitos mediante inmunofluorescencia La determinacin de subpoblaciones linfocitarias, es tambin posible mediante microscopa de fluorescencia utilizando anticuerpos anti-CD, marcados con compuestos fluorescentes. Para ello, luego de purificar los linfocitos, se confecciona un frotis con las clulas fijadas, las que se incuban con los respectivos anticuerpos. Al microscopio, se cuentan a lo menos 250 clulas, determinando su fenotipo, mediante la marcacin del anticuerpo. Este mtodo permite calcular el porcentaje de un determinado

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Figura 41-4. Identificacin de clulas natural killer mediante citometra de flujo. Para la identificacin, separacin y recuento de estas clulas se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra sus antgenos marcadores de superficie CD16 y CD56. Uno de estos anticuerpos est marcado con fluorescena y el otro con rodamina por lo que emiten fluorescencia en diferentes longitudes de onda.

fenotipo. Mediante un procedimiento un tanto ms sofisticado, como es la microscopa confocal, es tambin posible utilizar dos o tres diferentes anticuerpos marcados con diferentes fluorocromos. 3.2. Estudio de las funciones de inmunidad celular especfica Es aceptado que las caractersticas fenotpicas de las clulas del sistema inmune no proveen informacin sobre su actividad. Por ello, aunque el anlisis funcional es algo ms complejo por requerir experiencia y adecuados controles de cali-

dad para as lograr una apropiada interpretacin de los resultados, resulta importante evaluar estos parmetros funcionales. La importancia del anlisis funcional resalta porque cada vez son ms frecuentes sus aplicaciones en el diagnstico y monitoreo de pacientes con sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), cncer, enfermedades autoinmunes y en casos de pacientes que requieren trasplantes de rganos. De igual manera, el uso de inmunomoduladores y MRBs en estudios clnicos precisa de un monitoreo confiable del sistema inmune por parte del laboratorio clnico. Entonces, hoy es posible medir un amplio espectro de parmetros funcionales que in-

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cluyen desde la activacin, proliferacin y productos de sntesis hasta la funcin de clulas efectoras. Ms an, considerable progreso se ha obtenido en la separacin y aislamiento de varias subpoblaciones de clulas del sistema inmune. Sin embargo, no slo los ensayos funcionales pueden ser de utilidad sino que tambin los estudios estructurales y la deteccin de clulas T precursoras. As, con un arsenal considerable de ensayos de laboratorio y opciones de evaluar diferentes funciones, la eleccin de las pruebas ms apropiadas permitir al inmunlogo clnico disponer de la informacin que permita conocer el estado de la respuesta inmune celular del paciente. 3.2.1. Activacin de Linfocitos T La activacin de linfocitos T es un proceso caracterizado por una compleja cascada de eventos bioqumicos y moleculares, cuyo resultado final es la produccin de citoquinas, la expresin de receptores, la proliferacin y en algunas clulas la expresin de citotoxicidad. En condiciones fisiolgicas, este fenmeno se inicia con la presentacin antignica en el contexto de molculas del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) clase I o II e involucra complejos mecanismos de sealizacin con participacin de quinasas, fosfatasas y segundos mensajeros (ver captulo 10). Indicaciones clnicas. La activacin de clulas T, debe evaluarse frente a la sospecha de desrdenes inmunolgicos congnitos o adquiridos. Dentro de stos se incluyen la inmunodeficiencia combinada severa (falla en el desarrollo de clulas B y T), el sndrome de Di George (falla en el desarrollo del timo), sndrome de Wiskott-Aldrich, sndrome de Chediak-Higashi (inmunodeficiencia por ataxia telangiectasia con albinismo parcial), inmunodeficiencias variables comunes y frente a infecciones recurrentes por virus, parsitos y hongos. Las disfunciones de clulas T, predisponen a infecciones virales por Herpes simplex, Varicellazoster y Cytomegalovirus. De igual manera la candidiasis mucocutnea recurrente es frecuentemente asociada con disfuncin de clulas T. Dentro de las infecciones por protozoos, Pneumocystis carinii y Toxoplasma gondii a menudo complican el curso de pacientes con SIDA, en los cuales la subpoblacin de linfocitos CD4+ es deficiente. La activacin de clulas T, tambin puede monitorearse, para evaluar el tratamiento mediante

terapias inmunomoduladoras y para detectar la memoria inmunolgica frente a diferentes antgenos como: derivado de protena purificada (PPD), streptoquinasa, Candida, tetanus y difteria. Ciertos desrdenes inmunolgicos como Lupus eritematoso sistmico se manifiestan con mltiples disfunciones de clulas T. Por ello, cuantificar la activacin de clulas T es tambin til para monitorear el efecto de las terapias inmunomoduladoras. Interpretacin de los datos. La capacidad de linfocitos para proliferar, in vitro, en respuesta a lectinas mitognicas como fitohemaglutinina (FHA) y concanavalina A (Con A), es el mtodo ms comn para evaluar la inmunidad mediada por clulas. La proliferacin celular es ensayada 72 horas despus, evaluando la incorporacin de 3 H timidina en el DNA recientemente sintetizado por la clula T. Mtodos de ms reciente aplicacin permiten evaluar eventos tempranos del proceso de activacin, tales como la elevacin de calcio intracelular, la activacin de protena quinasa C (PKC) o eventos que ocurren en las primeras 24 h, tales como la sntesis de IL-2 y la expresin de su receptor IL-2R. Estos ltimos son los abordajes ms directos y presentan varias ventajas tcnicas, como el hecho de requerir un pequeo nmero de clulas mononucleares de sangre perifrica (CMSP), no necesitan enriquecer los linfocitos T de CMSP, su ejecucin requiere menos tiempo y realizada en serie resulta de ms bajo costo. Desde este punto de vista resulta apropiado evaluar la sntesis de IL-2 y su receptor, IL-2R, ya que la sntesis de stos muestra adems que las vas en que participa fosfoinositol/Ca++ y PKC, estn intactas. La IL-2 es evaluada en sobrenadantes de cultivo de CMSP, luego de la estimulacin con mitgenos por 24 h. La cantidad de IL-2 producida por CMSP normales en cultivo, depende del estmulo, las condiciones de cultivo y del mtodo empleado en su cuantificacin. La activacin de clulas T puede ser inducida utilizando diferentes agonistas tales como lectinas, anticuerpos anti-receptor, ionforos y forbol steres. Lectinas como FHA y Con A pueden adicionarse directamente a los cultivos de CMSP. En presencia de monocitos que secretan IL-1, las clulas T producirn IL-2 y desarrollarn una enrgica respuesta proliferativa con "peak" a las 72 h. Las ventajas de usar mitgenos son su estabilidad, bajo costo y fcil

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uso. Agonistas especficos como anticuerpos monoclonales contra el receptor CD3 pueden usarse para activar clulas T y permiten evaluar la capacidad del receptor para iniciar la traduccin de seales por la va fosfoinositol/Ca++/PKC. Una disminucin en la produccin de IL-2 es asociada con una disminucin en la expresin de IL-2R. La disminucin en la sntesis de IL-2 y en la expresin de IL-2R sugiere un defecto en la va fosfatidilinositol/Ca2+/PKC. Entonces para determinar si esta va de sealizacin no es funcional, la medicin de Ca2+ y de la actividad de PKC pueden ser de utilidad. La determinacin de Ca2+ en clulas T puede realizarse usando algunos indicadores fluorescentes como Fura 2 o Quin 2. Por otro lado los ensayos para PKC son sensibles y especficos, no obstante requieren poblaciones enriquecidas en clulas T. En este tipo de ensayo las clulas T deben ser activadas por un agonista, para luego preparar un extracto celular en el cual se evala la incorporacin de P 32ATP en un substrato peptdico sinttico o en histonas. Es claro que ambos ensayos requieren personal entrenado y algunas condiciones del laboratorio por lo que no se realizan de manera rutinaria. 3.2.2. Estudio de proliferacin de linfocitos El reconocimiento entre receptores de superficie de linfocitos y determinados ligandos, inicia una cascada de seales intracelulares que inclu-

yen interacciones de membrana con citoesqueleto, influjos de Ca2+, activacin de fosfolipasa C, liberacin de Ca2+ inducida por inositol-trifosfato y activacin de genes (ver captulo 10). Las seales de transmembrana causan cambios significativos en el linfocito como ser la redistribucin de receptores, secrecin de citoquinas y anticuerpos, movilidad celular, reconocimiento entre clulas o iniciacin de la proliferacin celular. Entonces, la capacidad de un linfocito para responder a un ligando, es utilizada tanto en investigacin bsica como clnica, evaluando la proliferacin. Como ya se describi, diferentes lectinas, anticuerpos y compuestos qumicos pueden estimular la proliferacin de linfocitos. La respuesta proliferativa puede entonces ser evaluada en cultivos de sangre total, o en clulas mononucleares aisladas y en diferentes subpoblaciones de linfocitos. No obstante, debe considerarse que en muchos casos se requiere ms de un tipo celular para responder a un determinado ligando. Frecuentemente, adems de las clulas T, se requiere la participacin de clulas accesorias que expresen asociadas a su membrana molculas MHC clase II, como monocitos y macrfagos. De manera sucinta, un ensayo de proliferacin debera medir el nmero de clulas sobrevivientes y aquellas generadas como consecuencia del estmulo. Esto comnmente se evala de manera indirecta por medio de la incorporacin de un nucletido radiactivo (3H-timidina) en el DNA sintetizado (figura 41-5).

Figura 41-5. Estudio de la proliferacin de linfocitos T, mediante la incorporacin de 3H-timidina al ADN. Se miden las cuentas por minuto (cpm) incorporadas al DNA de los linfocitos T que proliferan luego del estmulo mitognico.

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Indicaciones clnicas. Parece claro que los ensayos de proliferacin o blastognesis poseen amplias aplicaciones clnicas. El ensayo es utilizado para estudiar alteraciones derivadas de inmunodeficiencias congnitas, as como tambin aquellas secundarias derivadas de enfermedades infecciosas, cncer, desnutricin, cirugas y enfermedades autoinmunes. Dentro de las inmunodeficiencias congnitas se incluye la inmunodeficiencia combinada severa, caracterizada por una marcada deficiencia en las funciones de clulas B y T (ver captulo 29). Entonces la utilidad clnica de este ensayo radica en proveer informacin de la capacidad funcional de linfocitos de sangre perifrica. Esta informacin es de valor para conocer el estado del sistema inmune del paciente y como indicador del progreso de una terapia. La aparicin del SIDA, atrajo nuevamente la atencin a la investigacin clnica de las inmunodeficiencias y reafirm la importancia de las determinaciones in vitro de las funciones de la inmunidad celular. Por ejemplo, una disminucin en la respuesta proliferativa a Phytolacca americana (una lectina que acta como estimulador de clulas B y T) o frente a algunos antgenos de memoria tales como Cndida albicans o toxoide tetnico, tiene valor pronstico, por ser la capacidad de proliferar un indicador precoz del deterioro de la funcin inmune en personas infectadas con el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1), en perodos de la infeccin en que los niveles de CD4+ estn an dentro de lmites normales. De igual manera, el ensayo de proliferacin puede ser utilizado para definir otras inmunodeficiencias adquiridas, como el sndrome de fatiga crnica (SFC), que frecuentemente se acompaa con reactivacin frente a virus de alta prevalencia como Epstein-Barr o virus Herpes. Por ejemplo, la respuesta proliferativa a PWM estuvo bajo la media de los controles normales en el 95% de pacientes con SFC. De igual manera, la habilidad de linfocitos estimulados con mitgenos a producir IFN, generalmente se puede correlacionar con respuesta proliferativa. Los antgenos de potencial uso en clnica son numerosos y deben ser escogidos con cuidado de acuerdo al problema a investigar. Para evaluar respuesta frente a antgenos en los cuales altos porcentajes de la poblacin estn expuestos, (marcadores generales de inmunocompetencia celular), Cndida albicans y toxoide tetnico deberan utilizarse.

La reaccin mixta de linfocitos (RML) es una respuesta proliferativa a dos poblaciones de clulas T alognicas cultivadas en conjunto. En otras palabras, se usa para conocer la reactividad de la poblacin de linfocitos de un paciente frente a las clulas de otro individuo. El principal estmulo en este tipo de reacciones son los antgenos del MHC, presentados en la membrana de los linfocitos T. Esta es sin duda la tcnica de ms amplio uso para estudiar la respuesta inmunolgica de los linfocitos. En esta reaccin se verifican tres eventos principales: sntesis de macromolculas, transformacin blstica y proliferacin. Las clulas respondedoras en RML son principalmente linfocitos CD4+. stas reconocen molculas de MHC clase II por lo que antgenos de Clase II son sus principales estimuladores. Adems de poder determinar los niveles de la respuesta de linfocitos, esta reaccin sirve para demostrar la compatibilidad de MHC. Se conoce dos tipos de RML, la unidireccional y la bidireccional. En la unidireccional, una poblacin celular sirve como antgeno (tambin conocidas como clulas estimuladoras) y es usada slo despus de la inhibicin de su propia proliferacin. Entonces slo se determina la respuesta proliferativa de la segunda poblacin celular (tambin llamadas clulas respondedoras). En la RML bidireccional la respuesta proliferativa de ambas poblaciones celulares es evaluada ya que ninguna poblacin celular es inhibida en su divisin. Si existe reconocimiento o reactividad de los linfocitos habr proliferacin e incorporacin de 3H-timidina (figura 41-6). Esta reaccin ha sido usada para evaluar los defectos de la respuesta inmune. No obstante, su aplicacin ms importante es en el rea de tipificacin de tejidos y trasplante de rganos y clulas. Interpretacin, rangos normales y control de calidad. La utilidad clnica del ensayo de proliferacin depende de la habilidad del inmunlogo clnico para interpretar de manera adecuada los resultados. Esto requiere conocer de manera exacta la respuesta a esperar en individuos inmunocompetentes, para poseer los adecuados controles. Esto implica, adems, que cada laboratorio debiera poseer sus propios rangos de valores normales para la respuesta a cada inmungeno, tomando en consideracin aspectos como edad, sexo y grupo tnico.

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Figura 41-6. Cultivo mixto de linfocitos. Las clulas no respondedoras (irradiadas) presentan sus antgenos de superficie a las clulas respondedoras, que como respuesta entran a divisin celular e incorporan 3H-timidina en el DNA.

3.2.3. Estudio de la citotoxicidad celular La citotoxicidad celular es una de las funciones ms importantes de esta rama de la respuesta inmune. La citotoxicidad se entiende como la capacidad de una clula de atacar o ser txica para otra clula blanco. Esta propiedad la poseen los LT citotxicos (LTc), las clulas NK y aquellos tipos celulares que participan de fenmenos de citotoxicidad dependientes de anticuerpos (ADCC) (ver captulo 19). De manera general las clulas citolticas efectoras se pueden dividir en dos grupos: aquellas que requieren sensibilizacin previa con un antgeno y reconocen en el contexto de molculas de HLA y aquellas que no requieren sensibilizacin previa, ya que poseen reactividad espontnea, su respuesta no est restringida a HLA y son activadas por citoquinas. La mayor parte de las clulas T CD8- y CD4-, no actan restringidas a HLA, pero las subpoblaciones (tanto CD4+ como CD8+) pueden ser restringidas a HLA. De igual manera las clulas T L/B (clulas TCR2+) pueden mediar ambos tipos de citotoxicidad, donde la expresin de la molcula CD56 permite separar ambas subpoblaciones. La restriccin de HLA parece ser ms bien relativa que una propiedad constante de los linfocitos T citolticos. Esto podra depender de la naturaleza y presentacin del antgeno, implicando que una clula efectora tiene potencial para ex-

presar diferentes tipos de estructuras de reconocimiento y mediar ms de un tipo de citotoxicidad. Las clulas citolticas efectoras humanas comprenden diferentes tipos celulares los cuales dependiendo de su microambiente difieren en nmero, estado de activacin y en el mecanismo utilizado en reconocimiento y muerte de la clula blanco. Luego del reconocimiento y el contacto de superficie, la clula citoltica efectora activa una cascada de seales, desencadenando una accin irreversible y letal hacia la clula blanco. La clula efectora, generalmente puede asociarse a nuevas clulas blanco en dos o tres ocasiones sin necesitar de reactivar su cascada de seales. En el captulo 19 se describen los diferentes mecanismos de citotoxicidad que presenta los LTc y clulas NK. Significancia clnica e interpretacin de los resultados. La evaluacin de las funciones citolticas provee una medida eficaz para evaluar la eficiencia de las diferentes subpoblaciones celulares en estados de salud y de prdida de ella. Estos ensayos constituyen una parte sustancial de la evaluacin clnica de pacientes inmunocompetentes. Las clulas citolticas efectoras parecen jugar un importante papel en una variedad de enfermedades del hombre. Por un lado, una funcin citotxica ausente o disminuida, al anlisis in vitro de clulas citolticas, se observa en pacientes con inmunodeficiencias como SIDA,

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en pacientes con cncer, en infecciones crnicas por virus y hongos y en ciertas enfermedades autoinmunes. Por otro lado, la activacin de la funcin citoltica se observa en pacientes inmunodeficientes que reciben una terapia exitosa, en pacientes que se recuperan de infecciones virales y en personas con cncer que responden a la terapia. Las clulas citolticas participan en el rechazo a trasplantes (entre ellos los de mdula sea), eliminacin de clulas anormales y en numerosos procesos patolgicos. Ensayos en sangre humana. Los estudios clnicos a menudo requieren monitorear la actividad de clulas NK. Sin embargo, en algunos pacientes incluyendo nios la cantidad de sangre disponible es escasa. Por ello, ha sido necesario desarrollar protocolos sensibles que usen pequeos volmenes de sangre total evitando procesos de purificacin. Estos protocolos han proporcionado resultados comparables con los procedimientos tradicionales. 3.2.4. Linfocitos T citolticos Las clulas T LB+ (TCR2+), que incluyen aquellas clulas que participan en la respuesta citoltica restringida por HLA, son la principal poblacin circulante de clulas T. Una poblacin significativamente menor, aunque importante, corresponde a los linfocitos T g/d+, los cuales pueden mediar reacciones citolticas no restringidas por HLA, o semejantes a NK, despus de cultivarse en presencia de IL-2, pero podran tambin mostrar lisis por antgenos que son restringidos por molculas de HLA clase semejante a I. Las clulas LB TCR2+, de linfocitos citotxicos reconocen segmentos relativamente cortos, de 10-20 aminocidos, que asociados a molculas de HLA se exponen en la superficie de la clula. Por ello la susceptibilidad de una determinada clula blanco al ataque de una determinada clula citotxica, depende primariamente del tipo de va de procesamiento del antgeno en la clula blanco. As, antgenos que son endgenamente procesados y asociados en la superficie celular con molculas de clase I, son reconocidos por LTc, CD8+. Por otro lado, antgenos procesados por medio de proteasas endosomales se asocian con molculas de HLA clase II y son reconocidos por LTc, CD4+. Es claro que bajo ciertas circunstancias, ambos procesamientos pueden ocurrir en la misma clula blanco. Los LTc, son importantes en la inmunidad del husped a infecciones por virus y otros patgenos

intracelulares, en trasplante de rganos y en el control de neoplasias. La actividad antiviral puede ser detectada directamente en CMSP, slo en perodos relativamente cortos en la infeccin aguda. Esta respuesta de LTc, se desarrolla dentro de pocas semanas luego de la infeccin viral. Despus de la resolucin de la infeccin aguda, la respuesta de LTc slo puede detectarse por estimulacin in vitro de CMSP, cultivando estas clulas durante varios das en presencia del antgeno viral especfico. La CMSP de dadores normales generalmente contienen cantidades suficientes de clulas presentadoras de antgeno (monocitos) y clulas ayudadoras (linfocitos T CD4+) para estimular esta respuesta de LTc de memoria. No obstante citoquinas exgenas como IL-2 y IL-6, pueden adicionarse al cultivo para aumentar la diferenciacin de LTc precursoras en clulas killer funcionales. Una excepcin la constituyen los pacientes con SIDA quienes parecen mantener niveles detectables de clulas circulantes maduras con fenotipo CD8+ especfico para HIV. Todas las otras respuestas por LTc pueden ser evaluadas por medio de una estimulacin in vitro de las clulas T de memoria mediante incubacin de CMSP con antgenos relevantes, para as inducir una activacin in vitro y una expansin clonal de las clulas T reactivas al antgeno. Por ello una falla en la respuesta para generar respuesta por LTc in vitro, podra ser indicativo de: a) ausencia de clula T de memoria; b) falla en las clulas T de memoria para activarse, proliferar o diferenciarse en respuesta al antgeno; c) fallas en la presentacin del antgeno por parte de las clulas presentadoras de antgeno; d) incapacidad para inducir la muerte de la clula blanco. Los nuevos abordajes teraputicos como trasplante de mdula sea, transferencia pasiva de clulas y terapia con citoquinas, estn tornando cada vez ms importante identificar la causa de la deficiencia de la respuesta por LTc de manera tan precisa como sea posible. Debe quedar claro que una clula citoltica puede ser capaz de reconocer y matar a una clula blanco por ms de un mecanismo. Entonces la activacin in vitro de LTc puede ser capaz de matar tanto de manera especfica y restricta a HLA como de manera no restricta a HLA y semejante a como matan las clulas NK. Por ello la interpretacin de los ensayos de LTc es a menudo difcil y requiere una cuidadosa consideracin de la historia clnica del paciente, su estado clnico actual y la interpretacin de los parmetros de laboratorio en el contexto de los valores normales establecidos por el laboratorio.

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Los mtodos que evalan citotoxicidad son comunes a todas las clulas involucradas en este tipo de reacciones y se basan en la marcacin previa de las clulas blanco con 51C. Las clulas blanco marcadas son incubadas con las clulas efectoras citolticas y el 51Cr, liberado por las clulas y presente en el sobrenadante, es un ndice de la actividad citoltica (figura 41-7).

est significativamente asociada con el desarrollo de metstasis a distancia. Las clulas NK responden rpidamente a MRB, aumentando la citotoxicidad, por lo que esta propiedad puede ser utilizada como un sensible indicador en estudios in vitro destinados a evaluar la capacidad de las clulas del paciente en responder frente a la activacin de un determinado agente teraputico. De

Figura 41-7. Medicin de la citotoxicidad mediada por clulas. Clulas blanco marcadas con 51 Cr, son incubadas con clulas efectoras (LT, clulas NK) HLA idnticas; luego la lisis de las clulas blanco se detecta cuantificando el 51Cr liberado.

3.2.5. Clulas NK Las clulas NK circulantes, representan entre el 10-15% de las CMSP y son capaces de inducir la lisis espontnea de clulas blanco neoplsicas o infectadas por patgenos intracelulares, sin una necesaria sensibilizacin y sin restriccin de HLA. Evidencias recientes muestran que clulas NK pueden ser activadas para producir citoquinas tales como TNF, e IFN, factor estimulador de colonias de granulocitos y macrfagos, IL-3 y probablemente otros factores necesarios para el desarrollo clulas hematopoyticas. Las clulas NK parecen ser importantes y activos componentes de varios procesos patolgicos en el ser humano. Por ello la medicin de la actividad de clulas NK circulantes o en tejidos parece necesaria para definir la contribucin de estas clulas al proceso patolgico. Por ejemplo en cncer, una baja actividad de clulas NK tiene un valor predictivo en el progreso del tumor, la respuesta pobre al tratamiento y la disminucin en el tiempo de sobrevida sin metstasis. Una baja en la actividad NK tambin puede significar un factor de riesgo en la instalacin de procesos malignos. De igual manera, una baja actividad de NK en la sangre de pacientes

igual manera el monitoreo seriado de la actividad de clulas NK puede ser usado para demostrar cambios en el estado de activacin de clulas inmunes circulantes durante la terapia con MRB. El papel de clulas NK como primera lnea de defensa frente a las infecciones es conocido. Por ende en pacientes inmunocomprometidos, hay una estrecha correlacin entre actividad NK y la presencia de infecciones severas. En el trasplante de mdula sea, clulas NK parecen ser las primeras en re-colonizar la mdula, por lo que estas clulas pueden ser importantes para su instalacin exitosa y control de las infecciones virales postrasplante. Anormalidades en la respuesta NK pueden encontrarse tambin en enfermedades autoinmunes. Por todo lo anterior, la evaluacin seriada de la actividad NK es necesaria para conocer el estado de la respuesta inmune frente a varias enfermedades. 3.2.6. La reaccin de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos Los ensayos de ADCC pueden ser clnicamente tiles para valorar la inmunocompetencia de subpoblaciones de clulas efectoras caracteri-

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zadas por la presencia del receptor FcRII y FcRIII. En el hombre, las clulas NK CD3CD56+ CD16+ y una pequea fraccin de clulas T CD3+ CD16+ participan en ADCC. As, en pacientes con varias enfermedades y especialmente en pacientes con cncer que han sido tratados con MRB, estas pequeas subpoblaciones pueden expandirse in vivo y ser responsables por una fuerte respuesta antitumoral y antiviral. Siendo que las actividades NK y ADCC parecen ser mediadas por diferentes subpoblaciones de CMSP (CD3CD56+CD16- versus CD3- CD56+CD16+ y CD3+CD56+CD16+, respectivamente), podra ser necesario monitorear todas ellas en estados de enfermedad. De igual manera, se sabe que estos dos tipos de citotoxicidad parecen participar en momentos diferentes de una determinada enfermedad. Las clulas NK son la primera lnea de defensa mientras que las reacciones de ADCC asumen un papel importante una vez que las IgG dirigidas contra un patgeno o clula blanco han sido sintetizadas y se encuentran en la circulacin (figura 41-8). Otra de las principales aplicaciones de ADCC es la evaluacin de la reactividad de anticuerpos contra aloantgenos, clulas tumorales y virus. La ADCC puede utilizarse para estudiar el suero de pacientes que recibirn un injerto o estn desarrollando un rechazo a injerto, en pacientes con cncer que estn siendo tratados con anticuerpos monoclonales dirigidos contra el tumor y en pacientes con infecciones virales. Entonces ADCC entrega importante informacin acerca de la funcin de la citotoxicidad mediada por clulas en dichos pacientes durante la enfermedad.

3.2.7. Clulas killer activadas por linfoquinas El ensayo de clulas killer activadas por linfoquinas (LAK) es frecuentemente usado para monitorear la respuesta a la terapia en pacientes tratados con citoquinas u otros MRBs. Clulas efectoras activadas in vivo pueden ser capaces de matar clulas blanco resistentes a NK. As, CMSP no son capaces de matar tales clulas en ensayos de 4 h que miden liberacin de 51Cr, mientras que algunos linfocitos residentes en tejidos pueden tener una actividad LAK espontnea. Entonces, la evaluacin de la actividad LAK en CMSP frescas es una medida de la activacin in vivo de clulas efectoras. Por ello el ensayo de la actividad de clulas LAK, realizado antes y despus de la activacin in vitro de CMSP con IL-2 u otra citoquina es una medida de la capacidad de clulas NK y T para activarse y expresar sus funciones efectoras. 3.2.8. Citotoxicidad por macrfagos En el ensayo para evaluar la competencia de monocitos para destruir clulas blanco, el tipo de clula blanco puede indicar el tipo de mecanismo involucrado en la destruccin in vitro. Alteraciones de la funcin de monocitos se presentan en algunas inmunodeficiencias o pueden ser secundarias a episodios infecciosos, as como tambin en procesos malignos y enfermedades autoinmunes y pueden en general acompaarse de inmunosupresin. Generalmente otros ensayos son ms comunes para evaluar la capacidad funcional de monocitos, no obstante la evaluacin de la citotoxicidad es una funcin especializada que

Figura 41-8. Reaccin de citotoxicidad mediada por clulas dependiente de anticuerpos. Clulas blanco incubadas en presencia de anticuerpos IgG, son reconocidas por clulas efectoras NK que expresan receptores del tipo FcRII y FcRIII. Como resultado final, la clula recubierta de anticuerpos es lisada.

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podra ser importante en pacientes con cncer y en aquellos que padecen de enfermedades infecciosas. El ensayo de la citotoxicidad de monocitos debe ser usado en conjunto con otras pruebas funcionales, para evaluar la regulacin positiva o negativa de la funcin de monocitos luego del tratamiento in vivo o in vitro con MRBs. 3.2.9. Nuevos mtodos de evaluacin de la actividad citotxica a) Ensayos de fragmentacin de DNA. Diferentes observaciones muestran que las clulas sujetas a ataque de linfocitos citotxicos presentan cambios morfolgicos semejantes a los observados en clulas que desarrollan muerte celular programada, tambin llamada apoptosis. Este proceso es acompaado por prdida de la integridad de la membrana celular, lo cual la hace ms simple de cuantificar. Los mecanismos de esa muerte celular estn basados en la induccin de fragmentacin del DNA de la clula blanco, hecho que ocurre pocos minutos luego del contacto con la clula citotxica. El grado de solubilizacin del DNA depende de la naturaleza de la clula blanco. Esta afirmacin se basa en la observacin de que las clulas citotxicas inducen el mismo tipo de dao en el envoltorio nuclear de todas las clulas, sin embargo estos daos llevan a la desintegracin celular slo en algunas clulas. No obstante, evidencias posteriores no mostraron que el envoltorio nuclear resulte daado por los LTc en clulas que no desarrollan desintegracin celular. La verificacin de la fragmentacin del DNA, requiere de electroforesis en geles de agarosa para demostrar el clsico patrn en escala. Para cuantificar la fragmentacin del DNA, es necesario evaluar la fraccin soluble. El principio de esta tcnica se basa en que el DNA de doble hebra que ha sufrido un extensivo dao se mantiene soluble, mientras que el DNA intacto permanece insoluble. Recientemente el uso de 3H-timidina en vez de 125I-UdR ha sido propuesto por poseer ventajas como ser menos txica para el propio DNA. b) Cuantificacin de apoptosis usando colorantes fluorescentes. El uso de compuestos fluorescentes que se asocian a DNA es una tcnica simple que nos permite determinar el porcentaje de clulas que estn en proceso apopttico. La combinacin de bromuro de etidio y naranja de acridina es ampliamente utilizada. Naranja de

acridina tie de verde el DNA y de naranja el RNA, ya que este colorante no intercala RNA. Las clulas muertas son teidas con bromuro de etidio y se ven naranjas, mientras que las clulas vivas excluyen este colorante. c) Cuantificacin de la fragmentacin del DNA. Estas tcnicas se basan en el hecho que DNA fragmentado no sedimenta junto con el cromosoma ntegro cuando es centrifugado. Siendo que esta tcnica es complicada sin ventajas comparativas sobre las otras tcnicas ya descritas, se recomienda slo para evaluar poblaciones celulares que no puedan ser fcilmente marcadas en su DNA, como por ejemplo los linfocitos en reposo. d) Ensayo de prdida de adhesin de clulas blanco. Esta tcnica tiene por objetivo evaluar las consecuencias funcionales resultantes de la interaccin tumor-clulas T. Por ello la medicin de la prdida de la adhesin de las clulas tumorales permite evaluar adems la actividad ltica de esas clulas T. e) Aislamiento de grnulos citoplasmticos. El estudio de grnulos citoplasmticos aislados y purificados entrega conocimientos ms profundos acerca de los mecanismos de citotoxicidad celular, ms all de la simple observacin in vitro de la actividad citotxica. f) Ensayo de esterasa. Las serino esterasas estn dentro de las numerosas molculas biolgicas que participan en los mecanismos de toxicidad celular. El ensayo es simple y confiable y se basa en la medicin de las esterasas liberadas durante las reacciones de citotoxicidad en que participan LTc. Los linfocitos citotxicos pueden ser activados por diferentes mecanismos como anticuerpos monoclonales que semejan el efecto de clulas blanco portadoras de antgeno, por combinacin de ionforos de calcio y proteno quinasa C (o forbol ster) o de manera tradicional incubndolos con clulas blanco. 3.3. Estudio de la sntesis de citoquinas y sus receptores Las citoquinas son glicoprotenas solubles que desempean funciones reguladoras. Son sintetizadas y secretadas por diferentes clulas, siendo capaces de estimular clulas del sistema inmunolgico para inducir cambios en su funcin,

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activacin y expresin gnica (ver captulo 11). Las citoquinas son producidas como resultado de la activacin celular y se caracterizan porque su sntesis y secrecin es breve y autolimitada. Por ello, la evaluacin de ellas en muestras biolgicas puede ser utilizada para monitorear tanto la respuesta inmunolgica como inflamatoria, correlacionndose con el estado de activacin de la respuesta inmune celular. De igual manera, es conocido que los linfocitos T helper, pueden subdividirse en dos subpoblaciones, llamadas Th1 y Th2, las que se pueden caracterizar por el patrn de secrecin de citoquinas. El predominio de una determinada subpoblacin de LT en el hombre, ha sido asociada a la patognesis en algunos desrdenes como el asma, las enfermedades alrgicas, enfermedades autoinmunes como el lupus eritematoso y artritis reactiva, as como tambin en la resistencia a enfermedades infecciosas y parasitarias. Por ello la determinacin de los patrones de citoquinas secretadas por linfocitos humanos es cada vez de mayor relevancia. Aunque las citoquinas pueden ser directamente evaluadas por medio de ensayos biolgicos (evaluando su funcin biolgica sobre clulas blanco) o por medio de enzima inmunoanlisis (ELISA) (ver captulo 39), estos mtodos poseen algunas limitaciones. La primera, se refiere al tipo de muestra disponible. El ensayo de actividad de citoquinas es apropiado para muestras lquidas, tales sobrenadantes de cultivo o fluidos biolgicos, pero no es factible de realizarse en muestras de tejido slido. El segundo aspecto a considerar es que la cantidad de citoquina en un determinado fluido representa un remanente de la cantidad de citoquina producida con respecto a la utilizada o degradada. As, los valores de citoquinas como IL-2 e IL-4 en sobrenadantes de cultivo conteniendo anticuerpos anti-IL-2R o IL-4R que bloquean su utilizacin, son considerablemente ms altos que en mediciones realizadas en cultivos en ausencia de estos anticuerpos, sugiriendo que las concentraciones de citoquinas producidas son generalmente mucho ms altas que lo que las mediciones tradicionales suelen indicar. Entonces, bajo estas circunstancias la medicin en sobrenadantes o en fluidos biolgicos, no siempre podra entregar resultados representativos de los reales niveles de sntesis de una determinada citoquina cuando mtodos basados en la captura y posterior identificacin mediante ensayos tipo ELISA son utilizados.

Aunque los mtodos que cuantifican el mRNA especfico para cada citoquina, resultan algo ms complejos y demandan ms trabajo, se han empleado para evitar los problemas derivados de los mtodos basados en la evaluacin de la protena o de su actividad. La ventaja de este tipo de ensayos radica en que permiten el anlisis de la expresin de una citoquina particular o un grupo de citoquinas en un tejido definido, rgano o grupo de clulas en un perodo de tiempo determinado. Ms an, la alta sensibilidad de estas tcnicas permiten estudiar la expresin de citoquinas en un pequeo nmero de clulas, lo que resulta imposible si se utilizan otros ensayos. Varios mtodos han sido propuestos para cuantificar mRNA de citoquinas. Dentro de los ms usados estn el Northern blotting, ensayo de proteccin para ribonucleasa y la reaccin de polimerasa en cadena- transcriptasa reversa (RT-PCR). Estos mtodos, requieren como primer paso del aislamiento del RNA, previo a evaluar la expresin gnica de las citoquinas o su receptor. Por ello, errores en este procedimiento de aislamiento llevan a menudo a errores en los resultados y en la reproductibilidad del mtodo. Se debe considerar de manera especial que el RNA aislado es inestable y sensible a la degradacin por ribonucleasas presentes tanto en la muestra original como en el material donde se realiza la extraccin. Por ello, para obtener una buena preparacin de ARN se debe minimizar la actividad de ribonucleasas durante la lisis de clulas o tejidos, evitando introducir trazas de ribonucleasas en soluciones o material de vidrio. Para evitar en parte este problema, el material debe ser autoclavado, se deben usar guantes durante todas las fases de la extraccin y agua tratada con dietilpirocarbonato, que es una substancia inhibidora de ribonucleasa. De igual manera, el uso exclusivo de material para la extraccin de RNA es fuertemente recomendado. Los procedimientos de extraccin de RNA, utilizan la mezcla de isotiocianato de guanidina y cloroformo ms agentes reductores como 2mercaptoetanol, los cuales desintegran las estructuras celulares, disocian las nucleoprotenas y al mismo tiempo inactivan las ribonucleasas endgenas. De esta manera, a partir del RNA aislado, se puede purificar el mRNA mediante cromatografa de afinidad en columna de oligo(dT) celulosa, para investigar la expresin de un determinado receptor. No obstante, la mayora de los mtodos utilizados para este propsito, los cuales se describen

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a continuacin, no requieren de este paso de purificacin. 3.3.1. Reaccin de polimerasa en cadenatranscriptasa reversa (RT-PCR) Luego de la descripcin original de esta tcnica orientada a amplificar pequeas cantidades de DNA, el mtodo fue adaptado para la deteccin de RNA, incluyendo un paso inicial que utiliza transcriptasa reversa en el cual el cDNA es sintetizado para ser usado como molde en la amplificacin posterior (ver captulo 44). La PCR usa partidores especficos, ya definidos para la mayora de las citoquinas tanto humanas como murinas (tabla 41-1).

Estos partidores especficos para cada citoquina, permiten su amplificacin a partir de pequeas cantidades del cDNA generado. Los productos de la PCR pueden ser fcilmente detectados por medio de varias tcnicas como la electroforesis en geles de agarosa, los cuales son teidos con bromuro de etidio, el Southern blotting seguido de hibridizacin con sondas marcadas con 32P o mediante tcnicas colorimtricas que usan sondas marcadas con substancias fluorescentes. La sensibilidad de estas metodologas de RT-PCR hacen de ellas mtodos de eleccin para la deteccin de RNA especfico, especialmente cuando se trabaja con pocas cantidades de clulas o con RNA, que normalmente son expresados en pequeas cantidades.

Tabla 41-1. Secuencias de partidores para la deteccin de algunas citoquinas humanas mediante reaccin de polimerasa en cadena Citoquina IL-1B Partidores S5-TACGAATCTCCGACCACCACTACAG-3 A5-TGGAGGTGGAGAGCTTTCAGTTCATATG-3 S5-ACTCACCAGGATGCTCACAT-3 A5-AGGTAATCCATCTGTTCAGA-3 S5-CCTCTGTTCTTCCTGCTAGCATGTGCC-3 A5-CCAACGTACTCTGGTTGGCTTCCTTCA-3 S5-AGCTCAGCTATGAACTCCTTCTC-3 A5-GTCTCCTCATTGAATCCAGATTGG-3 S5-ATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCA-3 A5-TCTCAAGGGGCTGGGTCAGCTATCCCA-3 S5-CCAAGAACTTGCAGCTGAAG-3 A5-TGGGTCTATTCCGTTGTGTC-3 S5-TATGCATCCGCTCCTCAATCCTC-3 A5-CGAAGTTTCAGTTGAACCGTCC-3 S5-CGGGACGTGGAGCTGGCCGAGGAG-3 A5-CACCAGCTGGTTATCTCTCAGCTC-3 S5-AGTTATATCTTGGCTTTTCA-3 A5-ACCGAATAATTAGTCAGCTT-3 S5-ATTGCCGACAGGATGCAGAA-3 A5-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3 P5-CAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGCA-3

IL-2

IL-4

IL-6

IL-10

IL-12p40

IL-13

TNF

IFN

-actina

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3.3.2. Ensayo de proteccin de ribonucleasa (EPR) Es una tcnica sensible y especfica para la deteccin y cuantificacin de mRNA. Se basa en la hibridizacin en fase lquida, de una sonda radiactiva de RNA antisenso con el mRNA, seguida de la exposicin a RNAasas que degradan la sonda remanente as como tambin cualquier RNA no hibridizado. El material remanente "protegido" es separado mediante electroforesis, visualizado y cuantificado mediante autorradiograrfa, densitometra o aparatos y "softwares" que permiten evaluar fosfoimgenes. Entonces la intensidad de las bandas es comparada con las cantidades del RNA blanco, originalmente presentes en la muestra. En los ltimos aos, "kits" comerciales para esta metodologa estn disponibles, los cuales permiten el anlisis simultneo de mltiples citoquinas en una misma muestra. 3.3.3. Tincin intracelular de citoquinas

Estas tcnicas se basan en la deteccin intracelular, previa permeabilizacin de la clula, de una determinada citoquina mediante el uso de anticuerpos anti-citoquina marcados con compuestos fluorescentes, seguida de un corto perodo de activacin de las clulas en presencia de un estimulador conocido de la sntesis y en presencia de bloqueadores del transporte de protenas como Brefeldina A o Monesina. Estos inhibidores impiden la secrecin induciendo la acumulacin citoplasmtica de la citoquina. Las clulas son tambin teidas con anticuerpos dirigidos contra marcadores de membrana (CD3, CD4, CD8, etc.) en atencin a definir la poblacin celular productora de una determinada citoquina. Anticuerpos marcados con diferentes fluorocromos estn disponibles comercialmente. No obstante depender de la poblacin celular a estudiar y de las citoquinas a investigar el tipo de anticuerpo anti-marcador celular y anti-citoquina a ser utilizado. 3.3.4. Evaluacin del interfern

Una eventual limitacin de los mtodos moleculares radica en la imposibilidad de poder seleccionar una determinada clula para su estudio y la imposibilidad de obtener informacin acerca de la identidad y frecuencia de clulas productoras de una citoquina particular dentro de una poblacin celular. Entonces, en ausencia de preparaciones celulares puras, estas tcnicas no pueden ser utilizadas para estudiar la produccin de citoquinas por subpoblaciones definidas de clulas como es el caso de las subpoblaciones Th1 y Th2 de clulas T CD4+. Ms aun considerable evidencia muestra que cambios en la frecuencia de diferentes subpoblaciones celulares puede ocurrir en diferentes enfermedades por lo que la capacidad para detectar la produccin de citoquinas por clulas individuales y fenotpicamente definidas resulta hoy de particular importancia. Inicialmente, mtodos de dilucin limitante y ELISPOT se utilizaron para determinar la frecuencia de clulas productoras de una determinada citoquina. Estos mtodos son laboriosos y consumen mucho tiempo. Por ello, tcnicas de reciente introduccin basadas en la tincin intracelular de citoquinas han simplificado el estudio de la produccin de citoquinas en clulas individuales. Aparte de ser tcnicas de gran sensibilidad y especificidad, no son afectadas por factores como son la presencia de receptores solubles y de membrana para la citoquina en estudio.

Aunque esta molcula fue identificada a fines de la dcada del cincuenta, como una protena antiviral, sus vastos efectos biolgicos la sitan como una molcula inmunorreguladora capaz de alterar una amplia variedad de procesos tales como crecimiento celular, diferenciacin, transcripcin gnica y traduccin. Los interferones son producidos por una variedad de clulas en respuesta a la infeccin, y son por ello sintetizados como producto de la activacin de la respuesta inmune (ver captulo 11). Existen tres tipos conocidos de IFN , y , por lo que tanto el tipo celular como el agente que acta como inductor de su sntesis son importantes en determinar el tipo de IFN producido. De esta manera IFN es producido por linfocitos T y B, macrfagos, clulas NK y linfocitos granulares grandes, en respuesta a variados estmulos como virus, productos bacterianos, polinucletidos, clulas tumorales y clulas alognicas. Estos mismos inductores podran gatillar la sntesis de IFN, al tomar contacto con fibroblastos, clulas epiteliales y en menor medida con linfocitos. Por otro lado, el IFN es producido por linfocitos T CD4+ y CD8+, para cuya sntesis requieren de la cooperacin de monocitos y macrfagos. Esta citoquina es producida de manera especfica cuando clulas T sensibilizadas actan frente a un antgeno o complejos antgeno anticuerpo. De igual manera,

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su sntesis es inducida de forma inespecfica por mitgenos, anticuerpos anti-linfocito o citoquinas como IL-2. Todos los IFNs pueden aumentar o disminuir en una amplia variedad de reacciones inmunes. Los tipos celulares y las funciones que pueden ser modificadas por los IFNs son variados. Los IFNs modifican la reactividad inmune actuando sobre clulas B, T, NK, macrfagos, basfilos o clulas germinales de mdula sea. La alteracin resultante de tales estmulos se traduce en la produccin de anticuerpos, la citotoxicidad de clulas T, reacciones de injerto versus husped, blastognesis mediada por mitgenos y antgenos, alteracin de varias funciones de los macrfagos, hipersensibilidad retardada, citotoxicidad por clulas NK, liberacin de histamina mediada por IgE y maduracin de clulas germinales de la mdula sea. Estos estados de inmunidad alterada pueden ser importantes en la fisiopatologa de la autoinmunidad, inmunodeficiencia, procesos linfoides malignos y en infecciones virales. La sobreproduccin, la subproduccin o la produccin selectivamente localizada de IFN puede ser un importante factor en autoinmunidad y en las inmunodeficiencias. Los tres IFNs son protenas diferentes desde el punto de vista antignico, por lo que anticuerpos pueden utilizarse para su identificacin y evaluacin mediante mtodos de RIA y ELISA (ver captulo 39). Indicaciones clnicas. Se debe evaluar los niveles circulantes de IFNs, en pacientes con una variedad de desrdenes, as como la deteccin in vitro de la produccin de IFN podra ser un marcador de la funcin de clulas T. De igual manera, IFNs pueden ser evaluados en la circulacin de pacientes con desrdenes autoinmunes sistmicos como el lupus eritematoso. En estos pacientes la presencia de IFN se correlaciona con enfermedad clnica activa. Adems, las determinaciones de IFNs son esenciales en el monitoreo de pacientes que participan en estudios clnicos. Ensayos biolgicos deberan usarse para asegurar la actividad biolgica de IFNs que sern administrados a los pacientes. Tambin, es importante monitorear los niveles sricos de IFN de pacientes que estn recibiendo terapia con IFN. La sntesis de anticuerpos anti-IFN, puede ser detectada en el suero de pacientes en respuesta a terapias con IFN. En estos casos, los sueros deberan ser evaluados

mediante algn bioensayo o mediante ELISA. La produccin in vitro de IFN por clulas mononucleares de sangre perifrica, seguida de la estimulacin con mitgenos o antgenos especficos es una manera efectiva de evaluar la funcin de clulas T (en lo que respecta a la produccin de citoquinas) y la interaccin monocito-clula T. Un defecto en la produccin de IFN u otras citoquinas puede ser sugestivo de que el problema de fondo es una aberracin en las seales regulatorias. La depresin en la produccin de IFN, en respuesta a mitgenos, antgenos especficos o a IL-2 puede indicar un defecto en el nmero y funcin de clulas T y un defecto en la habilidad de monocitos para interactuar con clulas T. La alteracion in vitro de los linfocitos para secretar IFN frente a un estmulo, se asocia con enfermedades de base inmune como autoinmunidad, inmunodeficiencia, procesos linfoides malignos e infecciones con ciertos virus incluyendo VIH. a) Ensayos biolgicos Los ensayos biolgicos para IFNs, permiten evaluar la extensin en que esta molcula inhibe una o varias manifestaciones del crecimiento viral como son, la inhibicin de la produccin de partculas virales, la inhibicin del efecto citoptico, la inhibicin de la formacin de placas, la inhibicin de la formacin de antgenos virales o de la sntesis de DNA viral. Estos ensayos requieren la incubacin de clulas con IFN, la remocin del IFN, la infeccin de las clulas con virus y la evaluacin de la reduccin del crecimiento viral. La actividad antiviral observada es cuantificada en unidades (U), donde 1U de IFN corresponde al recproco de la ms alta dilucin de IFN que inhibe una magnitud especfica del crecimiento o de la actividad viral (generalmente el 50%), comparado con un control no tratado con IFN. b) Inmunoensayos para IFN Todos los tipos de IFNs, pueden ser determinados mediante ensayos inmunoenzimticos e inmunorradiomtricos. La principal ventaja de estos ensayos es la rapidez y la posibilidad de tamizar muchas muestras. No obstante, los inmunoensayos no siempre reemplazan a los ensayos biolgicos, especialmente cuando se requiere identificar una molcula biolgicamente activa, como es el caso de la evaluacin de

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diferentes partidas de IFNs para uso en inmunoterapia. Interpretacin. Los ensayos para IFN en suero de pacientes con HIV, evalan la respuesta de clulas linfoides frente a HIV y agentes oportunistas as como alteraciones en los aspectos inmunorregulatorios. La replicacin de HIV puede ser responsable de la presencia de IFN , y , mientras que la respuesta T a protenas de HIV, puede ser responsable de los niveles de IFN. No obstante, debe quedar claro que en la infeccin aguda por diferentes patgenos oportunistas se podra observar sntesis de IFNs. Elevados niveles de IFN, se asocian con anormalidades en la funcin inmune tales como hipergamaglobulinemia o depresin de algunas respuestas celulares. Sin embargo la produccin de IFNs puede asociarse con sntesis de otros factores no relacionados como son produccin de neopterina, aumento de la expresin de molculas de HLA clases I y II, expresin de 2 microglobulina y produccin de 2-5 oligoadenilato sintetasa. Niveles sricos de IFNs son detectados en personas infectadas con HIV y se observan de manera precoz en el desarrollo del sndrome de inmunodeficiencia adquirida. De hecho los niveles sricos de neopterina y 2 microglobulina, las cuales son inducidas por IFNs, se elevan

precozmente en pacientes que desarrollan SIDA y por ello poseen elevado valor pronstico. 3.4. DNA microarrays Este tipo de anlisis, denominados genmicos, se han desarrollado en los ltimos cinco aos y permiten evaluar en forma simultnea la expresin de miles de genes. Los genes de un determinado tipo celular son dispuestos de manera ordenada sobre un soporte slido. Estos genes estn representados ya sea por oligonucletidos o por fragmentos de cDNA. El mRNA de las clulas en que se desea estudiar la expresin gnica es utilizado para generar las sondas de cDNA total para hibridizar con el microarray. Estas sondas estn marcadas con compuestos fluorescentes, por lo que su eventual hibridizacin con genes del microarray es cuantificada mediante fluorescencia, cuya intensidad refleja la abundancia de un determinado mRNA dentro de la clula en estudio. La medicin de la expresin gnica mediante esta tcnica ha mostrado estar en estrecha correlacin con los resultados obtenidos con otras metodologas convencionales como northern blot y PCR cuantitativa. Entonces, es posible mediante este mtodo estudiar a gran escala la expresin gnica durante la activacin de clulas T, durante la respuesta inmune a diferentes agentes infecciosos o durante la terapia con inmunomoduladores (figura 41-9).

Figura 41-9. DNA microarrays. Representacin esquemtica de la preparacin del material gentico, hibridacin, captura y anlisis de imgenes.

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3.5. Pruebas para evaluar reacciones de hipersensibilidad retardada (RHR) La inyeccin intradrmica de antgenos, como tuberculina (PPD), estreptoquinasa y Candida entre otros, puede inducir una o ms de los cuatro tipos de reacciones cutneas: (a) una reaccin circular y enrojecida que alcanza su mxima induracin 15-20 minutos despus de la inoculacin y es debida a la presencia de IgE especfica en la piel, (b) una reaccin de fase tarda mediada por IgE con una mxima induracin entre 12-24 h posteriores a la inyeccin, (c) una reaccin caracterizada por una vasculitis local, denominada reaccin de Arthur, que toma lugar entre 12-24 h luego de la inoculacin y es mediada por anticuerpos fijadores de complemento presentes en el sitio de la inoculacin y (d) una reaccin de hipersensibilidad retardada dependiente de macrfagos y linfocitos, caracterizada por eritema e induracin en el sitio de la inoculacin que se produce en 24-48 h posteriores al contacto con el antgeno. De esta manera las RHR representan un fenmeno de memoria inmunolgica, para uno o ms grupos de antgenos frente a los cuales el individuo se ha sensibilizado. Esto significa que una exposicin previa caus la sensibilizacin a un determinado antgeno y la nueva presencia de ese antgeno recuerda y alerta al sistema inmunolgico. Ello desencadena una respuesta inflamatoria especfica al antgeno, donde el dimetro de la reaccin es un ndice de la hipersensibilidad cutnea. As, las pruebas de hipersensibilidad retardada usando inyeccin intradrmica son an un mtodo vlido, de costo razonable para detectar hipersensibilidad y evaluar inmunidad celular en el hombre (nica prueba funcional in vivo). Respuestas drmicas positivas generalmente se correlacionan con los ensayos in vitro para hipersensibilidad retardada, incluyendo la proliferacin de linfocitos y la medicin de la sntesis de citoquinas. Indicaciones clnicas de la RHR. Es til en la evaluacin de pacientes con sndromes de inmunodeficiencias primarias o adquiridas. Si un paciente no presenta reaccin despus de la inoculacin intradrmica de cualquier antgeno, se dice que es anrgico o presenta un estado de anergia. Esta condicin debe necesariamente ser comprobada utilizando concentraciones ms altas de antgeno. Las RHR, tambin han sido utilizadas para

moniotorear los resultados de inmunoterapia en algunas enfermedades malignas o en inmunodeficiencias, para monitorear el curso de enfermedades como coccidiomicosis y para el diagnstico de algunas enfermedades infecciosas. Interpretacin. Debe considerarse que algunos individuos podran no responder a un determinado antgeno, por no haber tenido contacto previo con l. No obstante, ciertos antgenos son ubicuos y por ello la gran mayora de las personas responden frente a ellos por haber sido sensibilizados un algn momento de sus vidas. Una revisin de la literatura extranjera, acerca de la respuesta de personas sanas a diferentes antgenos, evaluada mediante RHR mostr que: 75,5% responde a paperas; 53,3% a Cndida albicans; 43,5% a Trichophyton; 38,3% a toxoide tetnico; 37,6% a tuberculina (PPD) y 20,4% a coccidina. En base a estos estudios, los referidos antgenos podran ser utilizados en los paneles de evaluacin, o al menos ser utilizados para validar la realidad nacional. En orden a obtener resultados reproducibles, deber existir consenso en lo referente a los antgenos a ser utilizados y establecer criterios uniformes en cuanto a su preparacin, va y forma de administracin del antgeno as como tambin respecto a los criterios a ser utilizados en la evaluacin de la respuesta drmica. 3.6. Estudios de la especificidad de clulas T 3.6.1. Tetrmeros. Las clulas T reconocen pequeos pptidos, los que son presentados en el contexto de molculas de MHC, en asociacin con el receptor para clulas T (TCR). Entonces, es posible utilizar complejos MHC-pptido, marcados con colorantes fluorescentes, los que al asociarse con el TCR permitan visualizar esta ligacin y a la vez evaluar la especificidad de esas clulas T por un determinado antgeno. No obstante, debe considerarse que la asociacin entre TCR y el complejo pptido-MHC es bastante dbil como para producir un complejo estable. Esto, puede ser compensado mediante el uso de multmeros fluorescentes del complejo pptidoMHC, lo cual aumenta su avidez por la clula T. As, dmeros y an mejor, tetrmeros de complejos pptido-MHC clase I, han sido usados en ensayos de citometra de flujo, para enumerar, caracterizar y purificar clulas CD8+, especficas para un determinado pptido. En este tipo de ensayos, tanto la cadena ligera como la pesada de MHC, son

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producidas en Escherichia coli, para luego ser ensambladas in vitro, en presencia del pptido antignico. Los complejos as formados son purificados mediante filtracin en gel. Entonces, una molcula de biotina es adicionada en el carboxilo terminal de la cadena pesada de MHC. Esto permite su incubacin con fluorescena marcada con streptoavidina, permitiendo que estos tetrmeros puedan ser utilizados en ensayos de ligacin. Relevancia clnica. La frecuencia de clulas T evaluadas mediante el ensayo de tetrmeros es generalmente 10 veces ms alta de lo que revelan las mediciones realizadas con mtodos convencionales. Considerando que la ligacin del complejo MHC-tetrmero, requiere la expresin del TCR apropiado, este ensayo no provee evidencia acerca de la funcionalidad de la clula T ya que el ensayo est restringido a epitopos de clulas T previamente identificados. No obstante la caracterstica ms interesante del ensayo de tetrmeros es su capacidad para visualizar todas las clulas T especficas sean stas precursoras, efectoras, funcionales o anrgicas. 3.6.2. Inmunoscopa. La diversidad del repertorio de clulas T, es creada mediante un proceso de rearreglo del DNA somtico denominado recombinacin V(D)J. La tercera regin hipervariable (CDR3) tanto de las cadenas como de TCR, son producto de esta recombinacin. Entonces, mediante PCR utilizando partidores especficos para V y C, las diferentes regiones de CDR3 pueden ser amplificadas y su distribucin de tamaos puede ser analizada mediante electroforesis en geles de agarosa. Varias docenas de segmentos de genes BV y 4 5 de BJ que codifican para la cadena son conocidos en el ratn y el hombre. Por ello, las posibilidades de combinacin de los segmentos V y J con los posibles CDR3 representan ms de 2.000, las que pueden ser analizadas en una nica muestra. Despus de la inmunizacin, unos pocos clones de clulas T son amplificados. Todas las clulas pertenecientes a un mismo clon presentarn el mismo CDR3. Este abordaje, ha sido utilizado para visualizar y cuantificar la expansin clonal tanto en el hombre como el ratn. Utilizando la tecnologa del PCR, el mtodo inmunoscpico es altamente sensible y una nica clula T especfica puede ser detectada en 2 x 105 clulas.

Relevancia clnica. La inmunoscopa provee informacin acerca del repertorio de clulas T que ha sido seleccionado durante la respuesta inmune. En combinacin con la tcnica de tetrmeros es posible evaluar la diversidad de clones de clulas T especficos para un epitopo, expandidas luego de la inmunizacin. De igual manera, el uso simultneo de ambas tcnicas permite el anlisis detallado del repertorio de clulas T sin necesidad de que estas poblaciones celulares sean amplificadas in vitro. 3.7. Deteccin de clulas T precursoras Las clulas T precursoras no tienen ninguna funcin efectora. Sin embargo pueden proliferar al enfrentarse al estmulo antignico. Esta proliferacin ha sido ensayada mediante variados mtodos que utilizan la incorporacin de precursores radiactivos o compuestos fluorescentes. Sin embargo, ninguno de estos mtodos permite purificar y caracterizar las clulas precursoras que proliferan frente a un antgeno. La capacidad de una clula precursora para proliferar, permite la amplificacin de una poblacin especfica para un antgeno, as como tambin determinar la frecuencia de estas clulas precursoras. Esto es posible mediante tcnicas de dilucin limitante y citometra de flujo. Esta ltima, utiliza colorantes fluorescentes para teir la membrana de la clula por lo que es ms sensible y de mayor utilidad. Entonces, las clulas son teidas con colorantes fluorescentes como carboxifluorescena o PKH26. Despus de cada divisin celular, las clulas acaban siendo dos veces menos fluorescentes, producto de la particin del colorante fluorescente en las dos clulas hijas resultantes de cada ciclo. Esto permite deducir el nmero de ciclos celulares a partir de la intensidad de la fluorescencia. De igual manera, la frecuencia inicial de clulas T precursoras puede ser calculada a partir de la fluorescencia observada al final del experimento (generalmente entre 4 y 15 das). Relevancia clnica. El ensayo de la respuesta proliferativa de clulas precursoras mediante citometra de flujo es un mtodo que presenta ventajas sobre aquellos que utilizan la incorporacin de precursores radiactivos, ms an si se considera que se puede utilizar la misma muestra para determinar en paralelo la asociacin de tetrmeros.

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4. ESTUDIO DE LA INMUNIDAD CELULAR INESPECFICA El estudio de este tipo de inmunidad, involucra evaluar las clulas y mediadores que participan en esta va de la respuesta inmunitaria. Dentro de ellos debemos considerar los neutrfilos (leucocitos polimorfonucleares, PMN), monocitos, eosinfilos y basfilos. Los defectos en la fagocitosis y muerte celular llevan a un aumento en la susceptibilidad a infecciones y pueden asociarse a alteracin de estas clulas o bien a deficiencias en factores quimiotcticos como C3a y C5a. stos tambin pueden deberse a fallas en la opsonizacin sea esta por dficit de anticuerpos opsonizantes o de factores opsonizantes del complemento como C3b y C4b. 4.1. Ensayos funcionales de neutrfilos Los neutrfilos o leucocitos PMN constituyen el ms abundante tipo de leucocito en sangre perifrica normal, donde sus concentraciones varan entre 2000 y 5000 clulas/l (ver captulo 3). Estas clulas participan en la fase efectora de la respuesta inmune jugando adems un importante papel en la inflamacin y en la patognesis de muchas enfermedades. Su funcin en el control de microorganismos es potenciada por actuar en interdependencia con algunos factores del sistema de complemento y anticuerpos opsonizantes. Los defectos intrnsecos de los neutrfilos que alteran su funcionamiento son, generalmente, de base gentica, como es el caso de la enfermedad granulomatosa crnica (ver captulo 29). En este proceso se observa una ingestin normal, pero el proceso de destruccin intracelular no ocurre. Esto es debido a la inactivacin de la enzima NADPH oxidasa, responsable de la sntesis de intermediarios reactivos del oxgeno. Por otro lado, la deficiencia gentica de mieloperoxidasa y glucosa 6 fosfato deshidrogenasa, es responsable por los defectos en la capacidad de PMN en inducir la muerte celular de los microorganismos. Los neutrfilos en su calidad de clulas fagocticas, son la principal poblacin celular involucrada en la respuesta inflamatoria aguda. Estas clulas pueden ser aisladas en gran nmero y pureza de la sangre del hombre y animales. a) Medicin de la actividad fagoctica. La actividad fagoctica de neutrfilos puede medirse utilizando una variedad de microorganismos tales

como bacterias (Staphylococcus aureus) y levaduras (Cndida albicans). Los microorganismos fagocitados pueden ser detectados mediante la tincin con colorantes y lectura microscpica as como tambin mediante el uso de clulas microbianas marcadas con substancias fluorescentes (citometra de flujo; ver captulo 42) o precursores radiactivos para luego evaluar la fluorescencia o radiactividad asociada a los PMN. b) Ensayo de actividad microbicida. Para evaluar la actividad microbicida de PMN, clulas purificadas son incubadas con microorganismos (S. aureus, C. albicans), en una proporcin clula: microorganismo igual a 1:5, en presencia de anticuerpos del paciente y de C3b ms controles apropiados. Los tubos se incuban durante 3 h, tomndose alcuotas cada 30 minutos. En cada caso, las alcuotas son centrifugadas, las clulas lisadas y la suspensin resultante es sembrada en medios de cultivo apropiados para mediante el desarrollo bacteriano, evaluar la cantidad de bacterias fagocitadas que permanecen viables. c) Prueba de reduccin del azul de nitrotetrasoliun. La habilidad de neutrfilos para reducir el azul de nitrotetrasolium (NTB) es una medida de su actividad de NADPH oxidasa y su capacidad para generar productos reactivos intermediarios de oxgeno. El O2- y otros productos del estallido respiratorio tienen la capacidad de reducir el NTB a formazn, un precipitado negro azulado que se determina espectrofotomtricamente. Alternativamente, los neutrfilos se pueden fijar y examinar al microscopio, despus de la incubacin con NTB, permitiendo de esta manera determinar el porcentaje de clulas que contienen el colorante reducido (formazan). d) Generacin de anin superxido. La generacin de anin superxido (O2-) puede ser evaluada utilizando tanto en clulas estimuladas como no estimuladas, mediante la medicin de la inhibicin de la reduccin de ferricitocromo c por superxido dismutasa. e) Formacin de perxido de hidrgeno. La generacin de perxido de hidrgeno (H2O2) por neutrfilos se produce como consecuencia del estmulo de membrana y puede medirse mediante el mtodo basado en la oxidacin del cido homovainillnico. Esta reaccin es catalizada por peroxidasa (HPR) y depende del H2O2 generado por

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la clula. Mtodos fluorescentes de reciente introduccin, permiten medir la produccin de H2O2 usando el 10-acetil-3,7-dihidroxifenoxazima, el cual en presencia de HPR, reacciona con H2O2, generando resorufina, compuesto que es altamente fluorescente con emisin mxima a 563 nm. La lectura se realiza en microplaca usando un espectrofluormetro. 4.2. Ensayos funcionales de eosinfilos Los eosinfilos son granulocitos derivados de la mdula sea y cuyos grnulos contienen protenas bsicas que se tien con colorantes cidos como la eosina. En personas sanas no alrgicas, estas clulas corresponden al 2-5% de los leucocitos sanguneos (ver captulo 3). Aunque son capaces de fagocitar, su funcin est dada frente a ciertos agentes infecciosos incluyendo los helmintos. Adems estas clulas juegan un papel significativo en la inflamacin y la injuria celular seguida a las reacciones de hipersensibilidad retardada. La produccin y activacin de eosinfilos est bajo el control de clulas T CD4+ pertenecientes a la subpoblacin Th2, responsables por la produccin de IL-5, que es el principal factor activador de eosinfilos. Despus de su activacin, los eosinfilos aumentan de tamao y disminuyen su densidad. Eosinfilos activados son potentes efectores de reacciones de ADCC y producen una variedad de mediadores inflamatorios incluyendo leucotrienio C4 (LTC4) y O2-. a) Generacin de LTC4. El leucotrienio C4 es un mediador derivado de cido araquidnico que es producido por mastocitos, basfilos y eosinfilos. LTC4 y sus metabolitos derivados, LTD4 y LTE4, son poderosos mediadores de vasocontriccin, jugando un papel central en la patognesis del asma. La produccin de LTC4 por eosinfilos despus de estimulacin con varios agentes (IL-5,GM-CSC, Zynosan, ionforo A23187) puede medirse utilizando diferentes kits comerciales basados en el radioinmunoanlisis. b) Ensayo de anin superxido. Al igual que neutrfilos, los eosinfilos luego de su activacin pueden generar O2-. ste puede medirse inhibiendo la reduccin de ferricitocromo c por superxido dismutasa. c) Ensayo de adhesin de peroxidasa de eosinfilos. La adhesin de eosinfilos al colgeno o a clulas de endotelio vascular humano, es

medida en placas de 96 orificios, detectando los eosinfilos asociados a clula por medio de la medicin de la actividad de peroxidasa propia de los eosinfilos. 4.3. Ensayos funcionales de monocitos y macrfagos Desde los trabajos pioneros de Ellie Metchnikoff, los macrfagos han sido considerados como las clulas responsables de la regulacin de la respuesta inmune. Los macrfagos participan en procesos de recambio celular, incluyendo el remodelamiento tisular durante embriognesis, destruccin tisular y reparacin de los tejidos con posterioridad a injurias e infecciones y renovacin tisular que permite la eliminacin de clulas senescentes o malignas. Los macrfagos son clulas de central importancia en la respuesta inmune. Una de sus caractersticas distintivas que avala su papel central en la inmunidad es su presencia en la mayora de los tejidos de nuestro cuerpo. Entonces su principal funcin es monitorear y regular los fluidos circulantes y reaccionar frente a los cambios. Los macrfagos participan tanto de las vas aferentes como eferentes de la respuesta inmune. Sus funciones son variadas e involucran pinocitosis, degradacin de material ingerido, quimiotaxis, actividad antimicrobiana, secrecin de monoquinas y otros factores, procesamiento y presentacin de antgenos, cooperacin con clulas T y B y actividad citoltica. Los monocitos y los macrfagos son clulas que se originan en la mdula y son programadas para madurar y diferenciar de la clula hematopoytica germinal hasta ser liberada para circular en la sangre perifrica. La diferenciacin de monocitos a macrfagos ocurre en diferentes tejidos, dependiendo de la localizacin tisular y del microambiente al que los monocitos son expuestos. Los monocitos circulantes y los macrfagos tisulares desempean importantes funciones en la defensa del husped contra microorganismos invasores y clulas tumorales. Por otro lado, la fagocitosis, degradacin y muerte de microorganismos permite a monocitos y macrfagos participar en la presentacin de antgenos, primer y esencial paso en el montaje de la respuesta inmune. De igual manera estas clulas pueden responder a un determinado antgeno secretando citoquinas (monoquinas) solubles, que permiten

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activar y reclutar diferentes tipos de clulas efectoras. La primera monoquina secretada frente a un estmulo antignico es interleucina 1 (IL-1), que inicia la respuesta inmune actuando sobre clulas T CD4+ y CD8+, permitiendo la secrecin de IL-2 y la expresin de receptores para IL-2, que permite la proliferacin de estas clulas. Otra monoquina es IL-6, que posee capacidad para activar clulas NK, timocitos y linfocitos T. Monocitos activados tambin producen el factor estimulador del crecimiento de granulocitos y macrfagos, el cual induce la maduracin de monocitos y neutrfilos de la mdula sea y la activacin funcional de los monocitos circulantes. Monocitos estimulados por antgenos tambin producen IL-8. El TNF sintetizado por monocitos activados posee propiedades antitumorales pero adems es capaz de activar monocitos, granulocitos y eosinfilos. No obstante monocitos y macrfagos no slo producen monoquinas capaces de estimular la respuesta inmune sino que adems pueden producir factores inmunosupresores como prostaglandina E2. Entonces el aislamiento de monocitos de sangre perifrica permite evaluar la actividad microbicida y antitumoral de estas clulas as como su funcionalidad en producir monoquinas y prostaglandinas. Indicaciones clnicas. La evaluacin in vitro de la funcin de monocitos se recomienda en pacientes en los cuales se sospecha deficiencias en la inmunidad mediada por clulas. Deficiencia en la funcin de monocitos se puede manifestar clnicamente como aumento en la frecuencia de infecciones las que podran ser debidas a fallas en la capacidad de matar grmenes, en deficiencias en el procesamiento y la presentacin de antgenos o en la produccin de monoquinas. En estos casos, el primer y ms simple ensayo consiste en evaluar la capacidad antimicrobiana seguida de la evaluacin de la capacidad de secretar monoquinas como TNF. En pacientes con cncer, la evaluacin de la capacidad tumoricida puede entregar valiosa informacin acerca de las capacidades funcionales in vivo de estas clulas. Por otro lado la medicin de la produccin de PGE2 por monocitos permite conocer el nivel de actividad supresora de los monocitos. Ciertas enfermedades crnicas como cirrosis, tuberculosis, sarcoidosis, actinomicosis y enfermedad de Crohn, pueden asociarse con disfuncin de monocitos por lo que el monitoreo de la funcin de estas clulas puede ser informativo acerca del estado de la enfermedad.

a) Produccin de intermediarios del metabolismo oxidativo. Durante la fagocitosis y la actividad citotxica, los macrfagos son capaces de producir varios intermediarios del metabolismo del oxgeno. Durante las fases iniciales de la fagocitocis, los macrfagos muestran un aumento en el consumo de oxgeno, cortocircuito de la actividad de hexosa monofosfato y produccin de intermediarios de oxgeno, en un proceso conocido como estallido respiratorio. La generacin de radicales superxido es catalizada por una NADPH oxidasa localizada en la membrana, siendo generado por una apropiada estimulacin de membrana. Esta oxidasa transfiere electrones de NADPH citoslica al oxgeno extracelular, produciendo H2O2, el que es necesario para la muerte de los microorganismos invasores, pero al mismo tiempo causa inflamacin y dao tisular. El estallido respiratorio no necesariamente depende de la fagocitosis pero permite caracterizar la actividad fagoctica. La produccin de O2-, es el paso inicial de la conversin de oxgeno a perxido de hidrgeno y radicales hidroxilo, los cuales son potentes metabolitos microbicidas. Por ello la evaluacin del nivel de produccin de O2-, es un importante indicador del potencial microbicida de los macrfagos. En este aspecto, el mtodo ms apropiado para la medicin de O2- es evaluar la inhibicin de la reduccin de citocromo c Fe3+ a Fe2+, la que es dependiente de superxido dismutasa. b)Estudio de la fagocitosis. Bajo el trmino de fagocitosis se describe la capacidad de clulas de tomar partculas slidas, tales como eritrocitos, diferentes microorganismos, materiales orgnicos e inorgnicos. Diferentes eventos celulares han sido asociados con la internalizacin y subsecuente procesamiento del material ingerido. Cada fase de la fagocitosis es un proceso celular complejo, con caractersticas funcionales propias y diferentes requerimientos metablicos donde participan factores intra y extracelulares. Por ello, la fagocitosis representa uno de los parmetros funcionales usados para caracterizar la funcin de los macrfagos. Para obtener una evaluacin ms objetiva de este proceso biolgico, es importante escoger de manera cuidadosa la partcula a ser fagocitada. Adems de eritrocitos y varias cepas de bacterias, existen partculas comnmente clasificadas como inertes que son empleadas como reactivos para la cuantificacin de la actividad fagoctica. Ellas son slica, metales carboxilados, microcristales y partculas de ltex. No obstante, la fagocitosis de

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bacterias es una de las tcnicas tradicionalmente usadas por ms de una centuria. Prcticamente todas las bacterias pueden ser utilizadas. Entonces cultivos de monocitos se ponen en contacto con los microorganismos por un perodo de tiempo. Luego, los cultivos son lavados y se evala tanto el nmero de bacterias intracelulares por cada 100 monocitos, como el porcentaje de monocitos que contienen bacterias intracelulares. El ndice fagoctico que muestra la relacin entre el porcentaje de macrfagos con a lo menos una bacteria y la media del nmero de bacterias por macrfagos positivos, puede tambin ser considerado. Tradicionalmente, esta evaluacin se ha realizado mediante microscopa ptica, aunque protocolos ms recientes y algunos reactivos comerciales disponibles utilizan bacterias (Escherichia coli K12) marcadas con fluorescena, lo que permite evaluar la fagocitosis por microscopa de fluorescencia, citometra de flujo y espectrofluorometra. Resulta interesante destacar, que las metodologas fluorescentes permiten diferenciar entre microorganismos localizados extracelularmente y los microrganismos intracelulares. Estos protocolos se basan en la observacin de la viabilidad del microorganismo al ser teido con naranja de acridina y luego observado en el rango ultravioleta o con excitacin azul. El microorganismo se mostrar de color verde si estuviese viable o de color rojo si estuviese muerto. Otro posible abordaje, se basa en el uso de microesferas fluorescentes y efectos de bloqueo, que permite la fcil diferenciacin entre las partculas asociadas y aquellas interiorizadas. La tcnica se basa en la propiedad de algunos colorantes como el cristal violeta o el azul tripan de apagar la fluorescencia de partculas fluorescentes libres o asociadas al monocito, mientras que aquellas interiorizadas permanecen fluorescentes. El fenmeno responsable por este bloqueo se llama transferencia de energa de excitacin. La transferencia ocurre cuando el espectro de absorcin del agente bloqueador se sobrepone al espectro de emisin del marcador fluorescente. c) Evaluacin de la actividad microbicida. La actividad microbicida y la fagocitosis puede evaluarse incubando cultivos de monocitos con levaduras, como C. albicans, a diferentes relaciones levadura : monocito (1:3; 1:10; 1:30). Luego de incubacin a 37C por 18 h, las levaduras son marcadas metablicamente con 14C-glucosa, adicionando el istopo en agua, lo que permite la

lisis de los monocitos. Por ello slo incorporarn el istopo aquellas levaduras que permanecen viables, por lo que la radiactividad incorporada se compara con un control en que se cultiv idntico inculo inicial pero en ausencia de monocitos. Tambin es posible evaluar la actividad microbicida mediante recuento microscpico del nmero de clulas infectadas y el nmero de levaduras por cada 100 clulas infectadas. d) Evaluacin de la actividad citosttica frente a tumores. La habilidad de monocitos para controlar el crecimiento tumoral, puede evaluarse mediante la incorporacin de 3H- timidina en clulas tumorales que sobreviven luego de la incubacin con monocitos y que son comparadas con la incorporacin de clulas tumorales que fueron incubadas en ausencia de macrfagos. e) Evaluacin de la actividad tumoricida. La evaluacin de la actividad tumoricida es semejante a la evaluacin de la actividad citosttica, con la diferencia de que las clulas tumorales son marcadas antes de la incubacin con los macrfagos. f) Estudios de induccin de monoquinas. De manera general, cultivos de monocitos purificados son incubados por 24-48 h con algunos inductores de la produccin de monoquinas como el LPS de Escherichia coli. Luego los sobrenadantes son colectados mediante centrifugacin y sometidos a evaluacin o congelados inmediatamente. Tanto ELISA como RIA pueden ser usados para la deteccin de monoquinas. La principal desventaja de estos mtodos es que tambin detectan monoquinas biolgicamente inactivas. Por ello, los mtodos moleculares, principalmente aquellos basados en PCR, presentan grandes ventajas tanto en sensibilidad como en especificidad (ver punto 3.3.1 y captulo 44). Ensayo de IL-1. Para el ensayo de la actividad biolgica de IL-1, sobrenadantes de monocitos estimulados son usados para estimular la proliferacin dependiente de IL1 de una lnea de clulas T (clon de clulas T murinas). El ensayo utiliza IL-1 como control de la proliferacin de las clulas T. La presencia de esta monoquina puede ser identificada mediante ensayos de ELISA utilizando preparados comerciales, los cuales tienen sensibilidad en el rango de 20-50 pg/

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mL, sin reacciones cruzadas con otras monoquinas y citoquinas. Ensayo de IL-6. Los ensayos biolgicos miden la habilidad de sobrenadantes de cultivo de monocitos estimulados en inducir la proliferacin dependiente de IL-6 en una lnea celular de plasmocitoma (por ejemplo T1165 o B9). Diluciones seriadas de IL-6 recombinante son incluidas como control. De igual manera, "kits" comerciales pueden ser utilizados para evaluar los niveles de IL-6. La sensibilidad de estos es de 3.5 pg/mL, de protena por ml, no presentando reacciones cruzadas con otras citoquinas. Estos ensayos son a lo menos tan sensibles como los ensayos biolgicos con la ventaja de ser ms rpidos y la desventaja de su relativo alto costo. Ensayo para GM-CSF. Los ensayos biolgicos de la actividad de factor estimulador de colonias granulocito-monocito (GM-CSF), miden la habilidad de sobrenadantes de cultivo de monocitos estimulados en inducir la proliferacin dependiente de GM-CSF en una lnea celular de leucemia humana (con frecuencia se usan los clones Mo7e o TALL-101). Diluciones seriadas de GM-CSF recombinante humano son utilizados como control. En este caso debe considerarse que las lneas tumorales utilizadas son respondedoras tanto a GM-CSF como a IL-3 por lo que una caracterizacin definitiva de la actividad de GM-CSF, se realiza incubando los sobrenadantes de monocitos esimulados con anticuerpos antiGM-CSF y anti-IL-3, antes de evaluar la actividad de GM-CSF. De igual manera "kits" comerciales de ELISA pueden ser utilizados. Ensayo de TNF. Para el ensayo biolgico de la actividad de TNF, se evala la capacidad de sobrenadantes de cultivo de monocitos estimulados, en lisar una lnea celular de fibrosarcoma murino, caracterizado por ser altamente sensible a TNF (por ejemplo WEHI 164-JD). En este caso las clulas del fibrosarcoma son marcadas con 51Cr y luego incubadas con diluciones seriadas del sobrenadante de cultivo de monocitos. Controles se realizan con clulas incubadas en ausencia de sobrenadantes. Diluciones seriadas de TNF recombinante son incluidas como control y las

unidades de TNF son calculadas en base a una curva estndar. Considerando que tanto TNF como TNF (tambin llamada linfotoxina) son detectados en este ensayo, la neutralizacin con anticuerpos contra cada uno de stos, es necesaria para conocer cul monoquina est siendo detectada. No obstante slo TNF es sintetizado por monocitos, por lo que la deteccin de TNF sugiere que la preparacin pudiese estar contaminada con linfocitos. Si no fuese posible o pertinente marcar las clulas con 51 Cr, el ensayo podra realizarse tiendo las clulas al final de la incubacin con azul tripan para as evaluar la viabilidad celular o teir con cristal violeta que tie las clulas tumorales residuales. Esta tcnica es particularmente apropiada cuando se usan como clula blanco los fibroblastos murinos L929. g) Ensayo de prostaglandina E2. La prostaglandina E2 es detectada por RIA. El sobrenadante de monocitos estimulados es ajustado a pH 12,5 con NaOH y luego es hervido, neutralizado y evaluado. Las concentraciones de PGE 2 son calculadas en base a una curva de referencia.

5. EVALUACIN DE LABORATORIO DEL PACIENTE INFECTADO CON EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA: UN MODELO DE ESTUDIO DE LAS DEFICIENCIAS EN LA RESPUESTA CELULAR Frente a la sospecha inicial de encontrarse frente a un paciente infectado por HIV, el diagnstico de laboratorio se realiza mediante la bsqueda de anticuerpos, utilizando ELISA. Las pruebas de Western blot y PCR se usan como confirmatorias. Por ello, la evaluacin de la respuesta inmune celular en estos pacientes, es de central importancia ya que permite monitorear el curso de la infeccin, evaluar el tratamiento y sus resultados poseen valor pronstico (ver captulo 30). 5.1 Estudio fenotpico de linfocitos En base a lo anterior, el estudio inicial del laboratorio debera incluir el anlisis fenotpico mediante citometra de flujo, de las diferentes subpoblaciones de linfocitos T, evaluando particularmente los marcadores CD3+, CD4+ y

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CD8+. Este examen se orienta particularmente a conocer el porcentaje y recuento absoluto de LT CD4+, ya que stos poseen una relacin estricta con el estado de la infeccin. De acuerdo a la clasificacin del Centro de Control de las Enfermedades Infecciosas de los Estados Unidos (CDC), en relacin a los niveles de clulas T CD4+, se pueden clasificar a los pacientes en tres categoras: a) Recuentos mayores 500 clulas/L, b) Recuentos entre 200-499 clulas/L, c) Recuentos menores a 200 clulas/L. No obstante, el avance en las tcnicas de citometra de flujo, ha permitido proponer nuevos marcadores con valor predictivo. Entre stos se incluye evaluar la prevalencia e intensidad del marcador CD38 de clulas T CD8+, el porcentaje de clulas CD4+ que muestran prdida de marcadores CD26 y CD28 y el porcentaje de clulas CD4+ que expresan el marcador CD95. La intensidad del marcador CD38 en linfocitos CD3/CD8+ se ha podido correlacionar de manera estrecha a la progresin futura de la enfermedad, de manera ms absoluta que el recuento nico de linfocitos CD4+. Pruebas adicionales podran ser realizadas en estudios clnicos orientados a evaluar efectos teraputicos de una determinada droga o el efecto protector de una eventual vacuna. En estos casos podra ser interesante un estudio fenotpico extensivo a otras poblaciones celulares, incluyendo marcadores para monocitos, clulas NK, clulas B y marcadores de la activacin de clulas T, tales como HLA-DR o el monitoreo de la expresin de receptor para IL-2. 5.2. Estudio de la respuesta proliferativa Una de las alteraciones ms tempranas del paciente infectado con HIV, es una marcada reduccin en la habilidad de los linfocitos T para proliferar in vitro, en respuesta a mitgenos, antgenos solubles y aloantgenos. Es por ello importante la evaluacin de la respuesta proliferativa de los linfocitos de pacientes infectados con HIV. De esta manera, el estudio de la respuesta proliferativa de clulas T a mitgenos, antgenos solubles y aloantgenos puede ser de gran valor. 5.3. Estudio de la respuesta citotxica Varias evidencias sugieren que LTc podran ser importantes en la defensa frente a HIV. stas se basan en la observacin que una fuerte

respuesta por LTc se manifiesta en perodos tempranos de la infeccin, en personas en que a pesar de estar infectadas por ms de una dcada no presentan signos de enfermedad, o en trabajadoras sexuales y recin nacidos de padres infectados que no contrajeron la infeccin Aunque en pacientes infectados con HIV los niveles de CD8+ son cercanos a los niveles normales, la habilidad para generar respuesta LTc, la cual requiere IL-2, est disminuida, ya que se observa una reduccin en los niveles de IL-2. Por ello, estudios recientes sugieren la evaluacin de la respuesta citotxica de clulas T de pacientes infectados, frente a clulas blanco infectadas con HIV o que expresan protenas virales. En estos casos se sugiere colectar CMSP y someterlas in vitro a estimulacin previa con diferentes antgenos de HIV tales como nef, gag, po1, vif y env. Esta estimulacin previa parece ser indispensable, ya que permite la estimulacin especfica y la amplificacin de pequeas poblaciones precursoras de clulas T citotxicas, que pudieran encontrarse en la sangre perifrica en el momento de la recoleccin de la muestra. Por encontrarse en bajo nmero, de no mediar una estimulacin previa, la actividad citotxica de estas clulas no sera detectada en ensayos de citotoxicidad convencionales. De igual manera pueden ser importantes, la evaluacin del efecto citotxico de clulas NK. Aunque el porcentaje de NK en pacientes infectados con HIV puede permanecer normal, el nmero absoluto de algunas subpoblaciones de NK pueden estar disminuidas, por lo que la funcin NK se deteriora segn progresa la infeccin. Entonces, la actividad NK puede ser detectada en CMSP, mediante mtodos que miden la liberacin de 51Cr por parte de clulas blanco. Las reacciones de ADCC, especficas para HIV, pueden tambin ser evaluadas, ya que la actividad ADCC, mediada por clulas NK, declina conforme progresa la enfermedad. Dos tipos de ADCC pueden utilizarse en la evaluacin de pacientes infectados con HIV. La primera, es denominada ADCC clsica o indirecta, en la cual se usa suero de pacientes infectados y linfocitos de dadores normales. La lisis de las clulas infectadas es evaluada de mediante la liberacin de 51Cr. Por otro lado, la ADCC directa, usa clulas NK frescas, aisladas de pacientes infectados, las que son cultivadas con anticuerpos citoflicos anti HIV y luego incubadas con clulas blanco infectadas con HIV o recubiertas con antgenos del virus.

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5.4. Evaluacin de los niveles de citoquinas y subpoblaciones de linfocitos T Varias observaciones sugieren, que en la infeccin por HIV, ocurre una alteracin en el balance de la expresin de citoquinas y sus receptores, lo que podra contribuir a la patognesis de la infeccin. Elevados niveles de IL-1, IL-6, GM-CSF, TNF y TNF se han reportado en suero y lquido cefalorraqudeo en pacientes con HIV. De igual manera, segn progresa el sndrome, se observa una disminucin en los niveles de IL-2 y IFN, a la vez que aumentan IL-4 e IL-10. Esta observacin sugiere que durante el transcurso de la enfermedad, la actividad de la subpoblacin Th1 disminuye mientras que la subpoblacin Th2 aumenta. Siendo que Th1 estn asociados a las RHR y a las reacciones de citotoxicidad mientras que Th2 se asocia a la produccin de anticuerpos, este cambio en el predominio de una determinada subpoblacin podra contribuir a la progresin de la enfermedad. La disminucin en la subpoblacin Th1 se puede asociar al hecho que en pacientes con SIDA, se observa una significativa reduccin en la reactividad de las pruebas de sensibilidad cutnea ("skin-test"). De esta manera, la determinacin de citoquinas y sus receptores mediante mtodos moleculares parece ser de central importancia en la evaluacin de la progresin del sndrome. Los procedimientos de laboratorio propuestos en la evaluacin de pacientes con HIV se resumen en la figura 41-10.

LECTURAS SUGERIDAS Abbas A. K., Murphy, K., M, Sher, A., Functional diversity of helper T lymphocytes, Nature 383:787-793, 1996. Abbas A. K., Lichtman, A.H., Pober, J.S., Effector mechanisms of cell-mediated immunity. Cellular and Molecular Immunology, chapter 13, W.B.Saunders Company, 2000. Castillo D., Vega, P., Reid, M., Metodologa inmunidad celular, Manual de Procedimientos Tcnicos de Laboratorio Clnico, Inst. Salud Pblica de Chile, 1994, pp. 26-42. Fernndez-Botran, R. and Vetvicka, V., Advanced Methods in Cellular Immunology, chapters 2, 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11, CRC Press, 2000. Hagmann, M., Doing Immunology on a Chip, Science 290: 82-83, 2000. Kuby, J., Immunology, Chap 3, 10, 11, 12, 13, 15, 21, 23,W.H. Freeman and Company, New York, 1994. Michel, N., Kim. J.H., HIV Protocols. Methods in Molecular Medicine, Humana Press, 1999. Rose, N.R., De Macario, E.C., Fahey, J.L., Friedman, H., Penn, G.M., Manual of Clinical Laboratory Immunology, chapters 22-24, 30, 31, 3336, 41, 42, 59, 64-66, 115, 1992.

Figura 41-10. Flujograma de la evaluacin inmunolgica del paciente infectado con HIV.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 42
LABORATORIO DE HISTOCOMPATIBILIDAD Y TRASPLANTE DE RGANOS
Susana Elgueta M., Alejandra Arenas C. y Cristina Navarrete

1. Introduccin 2. Nomenclatura HLA 2.1. Gentica 3. Tipificacin HLA 3.1. Tcnica serolgica 3.2. Tcnica celular 3.3. Tcnica molecular 4. Anticuerpos HLA 4.1. Anticuerpos reactivos con panel 4.2. Crossmatch 5. Requerimientos de histocompatibilidad para trasplante 6. Otras aplicaciones de la tipificacin HLA

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RESUMEN El Complejo Principal de Histocompatibilidad, HLA en el hombre, tiene un rol fundamental en la regulacin de la respuesta inmune. El gran polimorfismo de este sistema asegura la sobrevida de la especie, al permitir la presentacin de pptidos inmunognicos derivados de distintos agentes patgenos a los linfocitos T. Este polimorfismo es reconocido e identificado en el laboratorio clnico a travs de la llamada tipificacin HLA, la cual ha tenido una evolucin importante, desde la tipificacin serolgica inicial, a las actuales tcnicas moleculares que permiten el reconocimiento de las variantes allicas. Las tcnicas, cada da ms sensibles, de identificacin de anticuerpos anti-HLA del receptor contra los antgenos del donante, en especial la citometra de flujo, han permitido en el rea de trasplantes, evitar rechazos hiperagudos que ponen en riesgo la vida del paciente o sirven como indicador de factor de riesgo para la prdida del injerto Sin embargo, el uso clnico del conocimiento sobre el MHC es an limitado a slo algunas reas de la medicina, pero en la medida que se siga profundizando en el conocimiento y comprensin del rol de estas molculas del MHC y junto al desarrollo tecnolgico, no cabe duda que se ampliarn las fronteras de su aplicacin al paciente.

1. INTRODUCCIN Los antgenos del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC), llamado Human Leucocyte Antigen (HLA) en el hombre, es despus de los grupos sanguneos clsicos ABO, la segunda barrera ms importante para el xito del trasplante de rganos, clulas y tejidos. La compatibilidad de los grupos sanguneos ABO es esencial para el xito de los trasplantes de rganos slidos y la identidad proporciona mejores resultados en los trasplantes hepticos y de clulas hematopoyticas. El rol fundamental de las molculas de HLA de clase I y II es la de unir pptidos antignicos, y presentarlos a los linfocitos T. Los receptores de antgenos de los linfocitos T (TCR, T cell receptor) slo reconocen antgenos presentados como fragmentos peptdicos unidos a las molculas HLA propias. Sin embargo, las molculas de HLA no slo pueden presentar pptidos antignicos derivados de antgenos nominales al sistema inmune como por ejemplo de virus o bacterias, sino que ellas mismas pueden ser reconocidas como antgenos por los receptores de las clulas T. Este reconocimiento puede ser directo, vale decir de la molcula HLA incompatible o ajena presente en

el tejido o clula trasplantada, o indirecto a travs de pptidos antignicos derivados de estas molculas de HLA ajenas presente en estos tejidos o clulas y presentados por molculas HLA propias del receptor. Estos mecanismos se denominan alorreconocimiento directo e indirecto, respectivamente. Es as como estas molculas participan en la fase de induccin y como blanco de la respuesta inmune, en la cooperacin entre clulas inmunes, en la seleccin del repertorio de linfocitos T y en la induccin de tolerancia. En el captulo 8 se explic el sistema HLA en el hombre y se indic sus caractersticas y los loci correspondientes a las molculas de clase I y II. Sin embargo, debemos insistir en su organizacin gnica ya que es fundamental para comprender la nomenclatura actualmente en uso, su polimorfismo y las tcnicas de su determinacin. Una de las caractersticas importante de los genes que codifican las molculas clsicas de HLA clase I (HLA-A,-B,-C) o clase II (HLA-DR,-DQ, DP) es su alto nivel de polimorfismo, representado por la gran cantidad de alelos presente para cada uno de los loci de clase I y II. En las molculas clsicas de clase I (HLAA,-B y -C) el polimorfismo radica en la cadena

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Figura 42-1. Representacin esquemtica del sistema HLA

pesada o alfa, y el nmero de alelos descritos para el locus HLA-A es de 209, para HLA-B es de 414 y para HLAC es de 101. La cadena liviana llamada Beta 2 microglobulina, asociada a las cadenas alfa es constante y est codificada por un gen fuera de la regin del HLA. La determinacin de la secuencia nucleotdica de los genes clsicos de clase I (HLA-A,-B y C) demostr que los alelos o variantes difieren entre s en slo unos pocos aminocidos, presentando una homologa global de 75% a 99%. La mayor variabilidad la presentan los dominios alfa 1 y alfa 2, con diferencias de 7 a 15 residuos de los 90 que posee cada dominio, mientras que el dominio alfa 3 que interacta con la Beta 2 microglobulina es el ms conservado. Existen eptopos comunes a varias molculas clase I como los supertpicos Bw4 y Bw6, y donde se demostr que los aminocidos en las posiciones 79, 80 y 83 son crticos en la definicin de estas especificidades. . A diferencia de los productos de clase I, la homologa entre las cadenas alfa y beta de las diferentes molculas de clase II es moderada, va-

riando entre un 50% y 65%. En las molculas DR el polimorfismo radica en la cadena beta siendo la cadena alfa esencialmente idntica. Se describen de 9 a 18 sustituciones de aminocidos entre los diferentes alelos, en las llamadas zonas de hipervariabilidad correspondientes a los aminocidos 9-13, 26-33 y 67-74. Sin embargo, en las molculas DQ y DP el polimorfismo est presente en ambas cadenas alfa y beta. Se han descrito 21 alelos DQA1 y 45 alelos en DQB1. Similarmente, se han descrito 19 alelos en la cadena DP alfa1 y 93 en la DP beta1. La subregin HLA-DR es la ms compleja ya que el nmero de molculas expresadas vara dependiendo del haplotipo. As, el gen DRB1 determina los antgenos HLA-DR1 a DR18, el gen DRB3 determina el antgeno HLA-DR52, el gen DRB4 codifica para HLA-DR53 y el DRB5 para HLA-DR51. Los genes DRB2,6,7,8 y 9 son pseudogenes. Los dominios alfa 1 y 2 de la cadena pesada de las molculas clase I y los dominios alfa 1 y beta 1 de las molculas clase II forman una hendidura o bolsillo que une el pptido antignico y

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Figura 42-2. Representacin esquemtica de la Regin HLA-DR.

que corresponde a la estructura de una alfa hlice con una base de hoja beta plegada. Los residuos polimrficos, es decir aquellos aminocidos que varan entre diferentes formas allicas, son localizados en los lados de la alfa hlice del "bolsillo" o en la hoja beta que forma el piso de este "bolsillo". El polimorfismo entre clase I y II sirve para crear variacin en la superficie qumica del "bolsillo" que une el pptido. Otros residuos polimrficos de la molcula MHC contactan con el receptor para el antgeno del linfocito T. El polimorfismo de MHC clase I y II determina la superficie qumica del "bolsillo" y es el principal determinante de la especificidad y afinidad de la unin del pptido y el reconocimiento por clulas T.

2. NOMENCLATURA HLA Histricamente los antgenos HLA se denominaron con un nmero que sigue a la identificacin del locus con una letra. Ej.: HLA-A1 es el alelo llamado 1 del locus A del sistema HLA, HLA-A2 es el alelo 2 del locus A, etc. Esta designacin se acord

en las reuniones internacionales de trabajo llamadas workshop, y en aquellos alelos en los que no existe consenso se agrega una w que precede al nmero, como por ejemplo HLA-Bw 70. En el caso de los alelos del locus C siempre se coloca esta w para diferenciarlos de los componentes del complemento. La identificacin de nuevos alelos por tcnicas moleculares dej en claro que la nomenclatura serolgica no era suficiente para dar cuenta de todas las especificidades detectadas, de tal forma que el Comit de Nomenclatura de la OMS acord designar la letra del gen seguido de un asterisco, luego la especificidad serolgica que corresponde a los dos primeros nmeros y luego dos o ms nmeros que corresponden a la especificidad molecular. Por ej.:HLA-B*2701 se refiere a la primera variante descrita para HLA-B27. La nomenclatura incorporando el gen (*) indica que la designacin se ha hecho por mtodos moleculares. En las tablas 42-1 y 42-2 se indica algunos ejemplos de designacin de alelos HLA clase I (HLA-A y B) y II (HLA-DR y DQ), sealndose en cada caso la especificidad serolgica, y en el caso de los HLA clase II la especificidad HLA-D

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Tabla 42- 1. Ejemplos de designacin de alelos HLA. Alelo HLA A*0101 A*0102 A*0201 A*0202 A*0203 A*2301 A*2402 etc B*0702 B*0703 B*0704 B*1401 B*1402 B*1501 B*1502 Especificidad HLA A1 A1 A2 A2 A203 A23(9) A24(9) B7 B703 B7 B64(14) B65(14) B62(15) B75(15) Equivalente previo A2.1 A2.2F A2.3 B7.2 BPOT B7E -

Tabla 42-2. Ejemplos de designacin de alelos DR. Alelo HLA Especificidad serolgica DR 1 DR 1 DR103 DR1 DR52 Especificidad HLA-D asociada Dw1 Dw20 Dw"BON" Dw24 Dw1 Dw2, w21, w19 Dw7, w11 Equivalente previo DR DRH DR1-NASC DR1 CETUS DRB1*01New DR3III, DQA 1.1, 1.9 DQA 1.2, 1.19 DQA 2, 3.7

DRA*0101 DRA*0102 DRB1* 0101 DRB1* 0102 DRB1* 0103 DRB1* 0104 DRB3* 0101 DQA1*0101 DQA1*01021 DQA1*0201

2.1. Gentica de los antgenos HLA Es importante recordar que el sistema HLA es un sistema gentico codominante, es decir se expresan tanto los genes heredados de la madre como del padre y que el alto grado de polimorfismo hace poco frecuente la existencia de individuos homocigotos. Por lo tanto al determinar (o tipificar) en el laboratorio las molculas o antgenos HLA encontraremos la expresin de 2 molculas distintas para

cada locus. En la prctica diaria del laboratorio encontraremos que los individuos heterocigotos presentan 2 antgenos HLA-A, 2 antgenos HLAB, 2 HLA-C, 2 HLA-DR, 2 HLA-DQ. Otros antgenos de clase II, como los codificados por el locus DP, son ms difciles de determinar ya que no existe serologa disponible y slo son detectados con tcnicas celulares o de DNA. Otro aspecto importante del sistema HLA, es la existencia de alelos en diferentes loci HLA cuya frecuencia de combinacin es mayor a la espera-

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da por la frecuencia gnica individual de cada uno de ellos, esto es lo que se denomina desequilibrio de ligamiento (ejemplo A1, B8, DR17) Este patrn de segregacin ha permitido el establecimiento de haplotipos, algunos de los cuales son caractersticos de un tipo de poblacin humana, en cambio otros se encuentran presentes en todos los variados grupos tnicos. El tipo de herencia mendeliana y la expresin codominante determina que entre hermanos exista un 50% de probabilidad de ser semiidnticos en estos antgenos HLA, es decir, compartir un haplotipo (haplotipo son los genes heredados en un mismo cromosoma), un 25% de probabilidad de ser idntico (compartir los 2 haplotipos), y un 25% de probabilidad de no compartir haplotipos. Sin embargo, la determinacin de haplotipos y genotipos slo puede ser hecha por estudios familiares. La probabilidad de posibles haplotipos en individuos no relacionados, debe ser realizada en base a la frecuencia da haplotipos para el grupo tnico al que pertenece el individuo. Los fenotipos y genotipos deben ser expresados de acuerdo a las recomendaciones de la O.M.S., como en los siguientes ejemplos: Fenotipo: HLA-A2,30; B7 (Bw6), 44 (Bw4); Cw5; DR1,4; DQ5,7 Genotipo: HLA-A2, B44(Bw4), Cw5, DR1, DQ5 / A30, B7(Bw6), Cwx, DR4, DQ7. Los antgenos indicados entre parntesis corresponden a antgenos pblicos o supertpicos, presentes en varios alelos.

de conejo se produce la muerte celular en aquellos pocillos en los que se produce reaccin antgeno-anticuerpo. La reaccin se evidencia por tincin con colorantes vitales o con fluorocromos y se visualiza generalmente en microscopio de fase invertida o de fluorescencia.

Figura 42-3. Representacin esquemtica de la tcnica de microlinfocitotoxicidad dependiente de complemento.

3. IDENTIFICACIN DE LOS ANTGENOS HLA Las tcnicas utilizadas en la tipificacin HLA son de tres tipos, bsicamente: Tcnica serolgica, Tcnica celular y Tcnica de biologa molecular. 3.1 Tcnica serolgica. la tcnica de microlinfocitotoxicidad dependiente de complemento, desarrollada por Terasaki fue la tcnica estndar para tipificacin HLA durante muchos aos. La tcnica serolgica permiti la definicin de los antgenos HLA presentes sobre la superficie de las clulas. En esta tcnica, sueros de especificidad conocida (de origen policlonal o monoclonal) se enfrentan con las clulas que se quieren tipificar, y en presencia de complemento

Es importante recalcar algunas caractersticas de esta tcnica que son las grandes limitantes: - Requiere de clulas con viabilidad mayor al 90% y alta pureza - Es difcil obtener antisueros monoespecficos contra determinadas especificidades HLA y ms an contra subtipos. - Reproducibilidad baja entre baterias comerciales - Los antgenos HLA as determinados presentan reaccin cruzada entre ellos, por lo que es aconsejable disponer de dos o ms sueros de distinta procedencia pero con la misma especificidad para asegurar la identificacin del antgeno HLA. - El tipo celular en el que se determinarn los antgenos HLA deben expresar dichos antgenos. Es as como para la tipificacin de molculas clase II (HLA-DR y DQ) se utiliza preferencialmente linfocitos B los que deben ser aislados de los linfocitos totales, ya que representan slo un 15 a 20% de ellos. Para esto se utiliza separacin por columnas de lana nailon o perlas magnticas. Estas ltimas aun-

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que de mayor costo, dan mayor pureza a la separacin celular. La tipificacin de molculas clase I (HLA-A,B y C) es ms simple ya que se puede realizar en linfocitos totales. Algunos antgenos muestran reactividad cruzada entre ellos, lo que est dado por el hecho que diferentes determinantes antignicos o eptopos son compartidos entre diferentes especificidades, esto debe ser considerado en el momento de la interpretacin de la tipificacin serolgica Determinantes antignicos compartidos por muchos antgenos HLA se les denomin eptopos pblicos (ejemplo: Bw4 presente en B51, B52, B44, B49 etc., Bw6 presente en B35, B45, B50 etc). Existen adems eptopos compartidos por un grupo de antgenos y stos son los llamados CREG (cross reactive group), por ejemplo el grupo de los antgenos B5, B35, B51, B52, B53 3.2 Tcnicas celulares. Estas tcnicas permitieron en los primeros aos determinar los antgenos de clase II DR y DP, para los cuales no se dispona de serologa. Estos antgenos se denominaron HLA-Dw y hoy se sabe que las especificidades de los antgenos Dw no tienen correlacin exacta con los antgenos detectados por serologa o por biologa molecular. La identificacin de estos eptopos que estimulan el cultivo mixto linfocitario y que se identifican como alelos Dw se realiza con un panel de clulas homocigotas previamente caracterizadas para cada uno de los alelos Dw conocidos. Estas clulas irradiadas, se usan para estimular la proliferacin de los linfocitos a tipificar, los que respondern ante alelos diferentes y no respondern ante alelos idnticos. Los alelos HLA-DP se identifican por un cultivo mixto secundario de linfocitos, ya que son dbiles estimulantes en cultivos primarios. Se debe disponer de un panel de linfocitos previamente estimulados, los que respondern al enfrentarse a las clulas que presenten el mismo alelo HLA-DP que las estimul primariamente. En este caso la reactividad celular s se correlaciona con el polimorfismo de las molculas DP. Como es obvio estas tcnicas son ms complejas que las serolgicas por lo que su uso est limitado a slo algunos laboratorios con una adecuada infraestructura. Con la introduccin rutinaria de las tcnicas moleculares para la definicin de los antgenos de clase I y II , estas tcnicas celulares han quedado prcticamente obsoletas.

3.3. Tcnicas de biologa molecular. Al igual que en otros campos, las tcnicas moleculares han revolucionado la tipificacin HLA. El extremado polimorfismo de los genes del MHC y la gran homologa entre las secuencias, se han convertido en un desafo importante para los bilogos moleculares. En los ltimos aos, mltiples tcnicas que requieren de DNA se han desarrollado con el fin de ser aplicadas en el laboratorio de Histocompatibilidad, de acuerdo a la urgencia clnica de los resultados, al nmero de muestras, sensibilidad de las determinaciones y equipamiento de cada laboratorio. Los mtodos moleculares ofrecen mayor flexibilidad en la resolucin, reproducibilidad y exactitud comparada con la serologa tradicional. Las tcnicas basadas en la PCR (reaccin en cadena de la polimerasa) son las ms utilizadas para la tipificacin HLA. stas pueden ser clasificadas de acuerdo a la metodologa que utilizan para detectar los alelos: Tcnicas de hibridizacin y sondas: PCR-SSO (oligonucletidos de secuencia especfica) PCR-Oligocaptura en sndwich PCR- Oligocaptura de fase dual Tcnicas basadas en electroforesis PCR-SSP (secuencias de partidores especficos) PCR-RFLP (polimorfismo de largos fragmentos de restriccin) PCR-SBT (tipificacin basada en la secuencia) Tcnicas de anlisis de conformacin de DNA PCR-SSPC (polimorfismo conformacional de hebra simple) PCR-HA (anlisis de heterodplex) PCR-UGH (anlisis de heterodplex con un generador de heterodplex universal). PCR-RSCA (anlisis conformacional mediado por hebras de referencias) Las ms utilizadas, a nivel de laboratorio clnico, son las tcnicas PCR-SSP y PCR-SSO, ya que son capaces de entregar informacin bsica como la serologa. Virtualmente las mayores ventajas que presenta la tipificacin basada en PCR son la flexibilidad de la resolucin que depende del nmero de partidores o sondas que utilice, lo que permite tener pruebas de baja resolucin a alta resolucin y la consistencia en la definicin, ya que siempre se usan los mismos reactivos (primers o sondas).

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Tabla 42-3. Comparacin de tcnica PCR-SSP Y PCR-SSO Caracterstica Partidores Sondas de oligonucletidos Visualizacin Estndares internos de PCR Resolucin PCR-SSP Multiples No Electroforesis S Baja y mediana PCR-SSO nico Mtiples Quimioluminiscente No Mediana y alta

Una ventaja del PCR-SSP sobre el PCR-SSO es que el PCR-SSP detecta polimorfismo unido a un cromosoma individual (cis), mientras que PCRSSO detecta polimorfismo del DNA de ambos cromosomas (cis y trans). As el PCR-SSP tiene un mayor poder para discriminar entre heterocigocidad que involucre dos alelos relacionados fuertemente. Un DNA de buena calidad es imprescindible para la PCR-SSP y PCR-SSO. Sangre con citrato o EDTA como anticoagulante es preferible a la heparina que inhibe la PCR y especficamente la PCR-SSP. La desventaja que se atribuye a trabajar con mtodos moleculares basados en secuencias conocidas es que variantes allicas nuevas pudieran no ser detectadas o discriminadas de alelos conocidos. Para eliminar esta posible falla, tanto para SSO y SSP, se utilizan un gran nmero de partidores o sondas cuyas combinaciones pudieran, potencialmente, detectar estos nuevos alelos y aumentar la resolucin del sistema de tipificacin. Mtodos utilizados a nivel de investigacin: Tipificacin basada en la secuencia Se realiza un secuenciamiento a partir de producto de PCR alelo especfico y su aplicacin est relacionada con laboratorios de referencia por su capacidad para detectar alelos nuevos y con laboratorios de tipificacin para trasplante alogeneico de mdula sea. Anlisis conformacional del DNA La comparacin de secuencias allicas ha permitido comprender que cada alelo individual contiene una nica combinacin de secuencias, cada una de las cuales tiene su forma. Esta forma de

polimorfismo ha complicado la aplicacin de mtodos basados en DNA que permite una identificacin de las secuencias para los tipos de genes HLA. Una alternativa de aproximacin de este problema es el uso del anlisis conformacional del DNA sobre la base de electroforesis en gel de poliacrilamida no denaturante. Se utiliza principalmente para identificar mutaciones. En resumen, podemos decir que las grandes ventajas de la biologa molecular sobre la serologa, dada por su sensibilidad y especificidad, es la identificacin de los verdaderos homocigotos, la asignacin certera de los alelos y la identificacin de subtipos, adems del uso de pequeos volmenes de muestra para la obtencin de DNA, lo que es muy ventajoso en muestras peditricas.

4. ANTICUERPOS HLA Las principales vias de sensibilizacin a los antgenos HLA son los embarazos, transfusiones y trasplantes, lo que se traduce en la presencia de anticuerpos HLA. Esta sensibilizacin se pesquisa en el laboratorio a travs de la determinacin del PRA (Panel reactive antibodies). En trasplantes no slo es importante definir el grado de sensibilizacin, sino tambin determinar la especificidad de dichos anticuerpos. 4.1. Anticuerpos reactivos con panel La tcnica tradicional para determinar el grado de sensibilizacin a antgenos HLA consiste en enfrentar el suero del paciente con un panel de linfocitos, en base a la tcnica de microlinfocitotoxicidad dependiente de complemento. Se define el porcentaje de clulas con las que dicho suero reacciona, lo que se traduce en porcentaje de

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PRA. Por ejemplo, si el panel de clulas est constituido por 40 clulas y el suero reacciona con 20, ese suero tiene un 50% de PRA, si reacciona con las 40 clulas tiene un 100% de PRA y si no reacciona con ninguna tiene 0% de PRA. Es importante en la constitucin del panel celular considerar la distribucin normal de los antgenos HLA de la poblacin, de tal forma que estn representados todos estos antgenos en el panel. Este panel puede ser formado por linfocitos totales o linfocitos T que identificar principalmente anticuerpos anti-HLA clase I, y tambin se puede tener panel de linfocitos B y de clulas de leucemia linfoctica crnica (LLC). Estas clulas se mantienen criopreservadas en nitrgeno lquido, donde mantienen su viabilidad por muchos aos. Tambin es posible determinar el PRA utilizando clulas frescas al azar o preferentemente de individuos previamente tipificados (con antgenos HLA conocidos) En esta reactividad hay que considerar la posibilidad de la presencia de autoanticuerpos, los que darn altos porcentajes de PRA, falsos. Las clulas de LLC, expresan antgenos HLA clase I y II, pero prcticamente no expresan autoantgenos, por lo que son tiles en la interpretacin de esta reactividad. Los autoanticuerpos se identifican por la presencia de un autocrossmatch positivo. Desde hace algunos aos han aparecido nuevas tcnicas para la determinacin de anticuerpos anti-HLA, entre stas destaca el uso de ELISA comerciales, algunos de los cuales son tiles como screening para determinar presencia de anticuerpos anti-clase I y II; detectan anticuerpos no fijadores de complemento. Estos kits comerciales de ELISA, utilizan antgenos HLA clase I y II solubilizados y unidos a las microplacas y el revelado utiliza un conjugado anti IgG o anti IgM

humana unido con enzima, la que convierte un sustrato en producto coloreado, cuando se ha producido la reaccin antgeno-anticuerpo inicial. Ms nueva es la aparicin del uso de la citometra de flujo en la determinacin de PRA, de alta sensibilidad y con capacidad para detectar anticuerpos no fijadores de complemento. Esta determinacin se realiza incubando partculas unidas con antgenos HLA con el suero del paciente, seguido por la adicin de una anti-inmunoglobulina humana marcada con un fluorocromo, y analizndose las muestras en el citmetro de flujo. Estas tres tcnicas tambin pueden ser utilizadas en la determinacin de especificidad de estos anticuerpos anti-HLA. La identificacin de la especificidad puede ser bastante compleja y de alto costo, pero es muy til para la interpretacin de las pruebas cruzadas entre donante y receptor (crossmatch, XM). La determinacin de la especificidad anti-HLA muchas veces requiere contar con un software de anlisis que permita identificar estas especificidades en el suero de los pacientes. Se recomienda que la sensibilidad del test escogido para determinar los anticuerpos -HLA sea similar a la de la tcnica que se utilice en las pruebas cruzadas o crossmatch. 4.2 Crossmatch El objetivo de esta prueba es pesquisar la presencia de anticuerpos preformados contra antgenos HLA presentes en el potencial donante. Esta prueba consiste en enfrentar el suero del paciente con las clulas del donante potencial, lo que se denomina alocrossmatch. La forma clsica utiliza la tcnica de microlinfocitotoxicidad dependiente de complemento, con variantes que aumentan la sensibilidad de la prueba, como lavados, aumento del tiempo de incubacin, uso de anti-

Tabla 42-4 Expresin de molculas clase I y II en distintas poblaciones celulares. Clula MHC-I MHC-II slo activados + + autoAntgeno no MHC + + -

Linfocitos T Linfocitos B LLC*

+ + +

LLC* : leucemia linfoctica crnica + : molcula presente - : molcula ausente

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inmunoglobulina humana (AHG, anti human globulin). Las clulas utilizadas como blancos son preferencialmente linfocitos totales o linfocitos T y linfocitos B, a distintas temperaturas de incubacin. La clase de anticuerpo involucrado en la reaccin se puede definir utilizando algunos reductores como el dithiotreitol (DTT), el cual reduce los puentes disulfuros intermoleculares de la inmunoglobulina M sin inactivar la inmunoglobulina G. La presencia de autoanticuerpos se pesquisa a travs de un autocrossmatch, en el que se enfrenta suero del receptor con sus propias clulas. Se ha definido que los autoanticuerpos no son nocivos para los trasplantes de rganos y son generalmente de clase IgM y por lo tanto pueden ser reducidos con tratamiento con DTT. Hay que tener presente que pueden coexistir auto y aloanticuerpos. De mayor sensibilidad es el crossmatch por citometra de flujo, que permite identificar la clase de anticuerpo de acuerdo al conjugado utilizado (anti-IgG, anti-IgM). En la prctica se usan protocolos de dos o tres colores . En el protocolo de dos colores las clulas y suero son incubados y el complejo antgeno anticuerpo se revela con un anticuerpo anti inmunoglobulina humana marcado con un fluorocromo ( FITC ), al mismo tiempo que un anticuerpo monoclonal marcado con otro fluorocromo ( PE) identifica clulas CD3+ ( LT ) o clulas CD 19+ ( LB ) La interpretacin de los resultados de un crossmatch es de suma importancia, ya que determina la presencia o ausencia de anticuerpos nocivos para el trasplante. An hoy en da existe controversia frente a algunos resultados de crossmatch y el riesgo de fracaso del trasplante.

5. LABORATORIO DE HISTOCOMPATIBILIDAD Y TRASPLANTE El mayor uso de la tipificacin HLA es en el campo del trasplante clnico, principalmente en trasplante de celulas hematopoyticas y trasplante renal, pero existen otras aplicaciones tiles en la clnica diaria como por ejemplo en estudios de asociaciones entre HLA y enfermedades, en proveer plaquetas HLA compatible, en medicina forense y estudios de paternidad. Los requerimientos de estudio de histocompatibilidad varan de acuerdo al rgano o tejido que se trasplante y se discute el efecto de ellos en

el trasplante de los distintos rganos. El trasplante de clulas troncales hematopoyticas es uno de los ms exigentes en cuanto a compatibilidad HLA puesto que el desarrollo de la enfermedad de injerto contra husped (GVHD, graft versus host disease), es uno de los riesgos ms altos que acompaan a este tipo de tratamiento y est directamente ligado al grado de compatibilidad de los antgenos HLA entre el paciente y el donante. De tal modo que la mayora de los laboratorios que apoyan a programas de trasplante de clulas hematopoyticas han adoptado la tipificacin por DNA. La aplicacin de alta resolucin para alelos HLA han indicado que cerca de un 20% de los trasplantes que inicialmente no tenan incompatibilidad DR por serologa a nivel allico presentan incompatibilidades y disminucin de la sobrevida del injerto. Otros grupos han observado correlacin entre incompatibilidad HLA clase I y GvHD. En el trasplante renal la compatibilidad de HLA si bien es importante no es esencial, de tal modo que en estos casos la mayora de los trasplantes se realiza con algn nivel de incompatibilidad. En cambio s existe consenso absoluto de contraindicacin del trasplante frente a un crossmatch positivo con linfocitos T, especialmente si el suero del paciente es reciente o suero actual. Son numerosos los estudios de la compatibilidad de los diferentes loci HLA entre donante y receptor y el efecto en el injerto renal, con resultados dismiles. Muchas de estas discordancias son explicadas por la poblacin analizada, tipo de mismatch considerados, tipo de tipificacin (serolgica o molecular), efecto estudiado (sobrevida, frecuencia de rechazos) etc. Existen muchos factores, no inmunolgicos, que gravitan fuertemente en la sobrevida del injerto y que deben ser considerados en los anlisis multivariables de sobrevida . Opelz en su estudio colaborativo de trasplante (CTS) ha demostrado que mientras mejor es la compatibilidad HLA entre donante y receptor, mejor es la sobrevida del injerto renal (Opelz et al, 1991). Este efecto es ms pronunciado en retrasplantes renales. Las tcnicas de DNA estn tratando de establecer la relacin que podra tener DQ en la sobrevida del injerto, lo que ha sido dificultoso debido al fuerte desequilibrio de unin entre DQ -DR. En el caso de HLA-DP se ha observado que su efecto est claramente relacionado en un segundo trasplante. El uso retrospectivo de SSO para especificidades AB y RFLP para DR,

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ha permitido establecer una diferencia de un 15% en la sobrevida del injerto entre aquellos trasplantes con 0 incompatibilidades AB determinados por PCR-SSP comparados con aquellos con alguna incompatibilidad al A B. En trasplante de corazn se ha demostrado que la compatibilidad HLA sera beneficiosa en la sobrevida de este injerto, por lo tanto se recomienda efectuar crossmatch si el receptor tiene anticuerpos HLA previos al trasplante. En trasplante heptico no se ha demostrado la utilidad del crossmatch ni de la compatibilidad HLA. En trasplante de crnea en pacientes de alto riesgo, son tiles algunos estudios de histocompatibilidad, dndosele mayor valor a la compatibilidad de antgenos clase I que a los de clase II. En Chile, los criterios actualmente en uso para la seleccin de receptores de trasplante renal de donante cadver considera la compatibilidad ABO y crossmatch negativo como criterios de exclusin. A la compatibilidad HLA, tiempo de espera en programa y porcentaje de anticuerpos linfocitotxicos se les asigna un puntaje que define la seleccin. A los receptores menores de 18 aos se le asigna puntaje adicional.

Actualmente las tcnicas moleculares han permitido encontrar nuevas asociaciones de susceptibilidad o resistencia a una enfermedad, de evolucin y pronstico de respuesta a tratamiento. Por ejemplo el 70 a 80% de los pacientes con artritis reumatoidea agresiva, segn la poblacin estudiada, portan uno o ms de uno de los genes del grupo de genes DR4 de susceptibilidad: DRB1*0401, 0404, 0405. Sin embargo, dado que estas enfermedades son generalmente multifactoriales, el uso de esta determinacin tiene utilidad clnica limitada frente a un caso individual Abortos espontneos a repeticin. Se ha identificado que en un porcentaje de abortos espontneos a repeticin en los que se han descartado causas gineco-obsttricas, existe una mayor compatibilidad en antgenos HLA entre la pareja. En muchos de estos casos se ha tenido embarazos exitosos despus de la sensibilizacin de la mujer a los antgenos HLA mediante inyecciones intravenosas o subcutneas de clulas mononucleares del esposo o de un tercero. Medicina forense y pruebas de paternidad. Gracias al uso de tcnicas de DNA es ahora posible la tipificacin HLA en pequeas cantidades de clulas o tejido de distintos origen incluidos folculos, uas etc. Esta determinacin de los antgenos HLA que permite descartar o identificar a una persona, con un alto grado de probabilidad, utilizando el conocimiento de la frecuencia de estos antgenos en la poblacin general est siendo usado en casos de medicina forense y en casos de pruebas de paternidad. Antropologa. Conocer las frecuencias de antgenos HLA en las poblaciones indgenas ha permitido apoyar teoras de migracin poblacional que se dieron hace miles de aos, al comparar las frecuencias gnicas de estas poblaciones. Con las actuales tcnicas moleculares estos estudios han tomado fuerza ya que es posible la tipificacin HLA a partir de productos como el pelo, piel etc.

6. OTRAS APLICACIONES DE LA TIPIFICACIN HLA Adems de la relevancia del sistema HLA en el trasplante clnico, existe un nmero de otras aplicaciones tiles en la clnica diaria como por ejemplo: Refractariedad a transfusin de plaquetas. Esta condicin clnica definida como la incapacidad de cierto grupo de pacientes de obtener incrementos luego de una transfusin de plaquetas, es debido a la presencia de anticuerpos HLA que reaccionan y destruyen las plaquetas incompatibles transfundidas. En estos pacientes la transfusin de plaquetas compatibles para los antgenos HLA, tiene un efecto benfico. HLA y enfermedad. Como se describi en el captulo 8, existen numerosas enfermedades asociadas a un determinado antgeno o alelo HLA. El ms utilizado es la determinacin del HLA-B27 que apoya el diagnstico clnico de Espondiloartritis anquilosante prcticamente en todos los grupos tnicos.

LECTURAS SUGERIDAS A map of the Human Major Histocompatibility Complex, Immunol Tod 18 (2), 1997.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 43
CITOMETRA DE FLUJO: PRINCIPIOS BSICOS Y APLICACIONES
Valeska Simon Z. y Mara Rosa Bono

1. Introduccin 2. Principios generales 2.1. Sistemas de fluidos 2.2. Sistema ptico 2.3. Sistema electrnico 2.4. Reactivos para citometra de flujo 3. Aplicaciones de la citometra de flujo 3.1. Determinacin de poblaciones celulares 3.2. Fenotipificacin de neoplasias hematolgicas 3.2.1. Fenotipificacin de leucemias 3.2.2. Fenotipificacin de linfomas 3.3. Enfermedad de Hodgkin 3.4. Trasplante de mdula sea 3.5. Anlisis de DNA y ciclo celular 3.6. Anlisis de enfermedad residual mnima

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RESUMEN La citometra de flujo tiene aplicaciones en numerosos campos de la biologa. Una de sus principales ventajas es la posibilidad de realizar anlisis multiparamtricos los cuales permiten determinar la presencia de varios marcadores simultneamente, tanto en la membrana como en el citoplasma o ncleo de las clulas, sean stas de origen animal o vegetal. La identificacin de marcadores celulares permite evaluar al interior de una muestra heterognea la proporcin relativa de una poblacin. Gracias a la utilizacin de computadores que poseen una gran capacidad de memoria, es posible analizar poblaciones celulares presentes en proporciones relativamente bajas. Existen adems citmetros capaces de aislar una determinada poblacin celular para estudios posteriores. Finalmente, la cuantificacin de la inmunofluorescencia constituye un avance importante para los estudios farmacolgicos. Esto permite estudiar in vitro la accin de nuevos medicamentos y las modificaciones inducidas por los tratamientos in vivo. El desarrollo de nuevos instrumentos cada vez ms simples en cuanto a la calibracin y alineamiento, capaces de automatizar la adquisicin de datos y anlisis ha hecho del citmetro de flujo un instrumento indispensable en los laboratorios clnicos. En este captulo se describen los principios bsicos de la citometra de flujo y sus aplicaciones, destacando las que son usadas en el laboratorio clnico.

1. INTRODUCCIN La historia de la citometra de flujo es relativamente corta, sin embargo, se ha popularizado enormemente gracias al desarrollo de citmetros de flujo de fcil utilizacin, rpidos y precisos en el anlisis de clulas nicas dentro de un fluido y al desarrollo de una amplia gama de sondas fluorescentes. Esta tecnologa permite medir los ms diversos parmetros celulares tales como antgenos de superficie, citoplasmticos y nucleares, contenido de cidos nucleicos, actividad enzimtica, flujo de calcio, potencial de membranas y pH entre otras. Un citmetro de flujo puede considerarse, muy simplificadamente, como un potente microscopio que cuenta con un sistema transportador de partculas y un sistema de deteccin de la luz. Las partculas suspendidas en una solucin fisiolgica (clulas u otras entidades biolgicas como espermios o levaduras), son inyectadas bajo presin en el sistema de fluidos que las transporta hacia un haz de luz focalizada en el cual, al chocar con las clulas, se desva y es registrado por detectores especiales. Si adems se acoplan a las clulas anticuerpos conjugados con un fluorocromo, estas emitirn luz de determinadas

longitudes de onda la cual puede ser registrada por fotodetectores ubicados perpendicularmente al fluido que las transporta. Las componentes de las emisiones fluorescentes pueden ser separadas utilizando filtros pticos, la informacin transformada en pulsos elctricos por el sistema electrnico y almacenada en la memoria de un computador para ser posteriormente analizadas utilizando programas computacionales especializados. En resumen, una vez comprendidos los principios de operacin del citmetro de flujo, ste se transforma en una herramienta muy til y en continuo desarrollo tanto para la investigacin bsica como para la medicina y la industria. Por otra parte, las posibilidades de automatizacin de esta tecnologa permite su uso en forma rutinaria en laboratorios clnicos y hospitales.

2. PRINCIPIOS GENERALES Los citmetros de flujo estn constituidos fundamentalmente por tres sistemas: el sistema de fluidos, un sistema ptico de iluminacin y deteccin, y el sistema electrnico (figura 43-1).

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Figura 43-1. Diagrama de un citmetro de flujo junto con el sistema computacional.

2.1. Sistema de fluidos El sistema de fluidos es el encargado de transportar las clulas o partculas contenidas en una solucin hacia un punto interceptado por el rayo de luz proveniente de un lser. Est constituido por un fluido transportador, la suspensin celular y los controles de presin, estos ltimos necesarios para movilizarlos a ambos hacia el punto de contacto con el haz de luz. Este sector es denominado cmara de flujo (figura 43-2). La suspensin celular es inyectada dentro del caudal del fluido transportador a travs de la cmara de flujo, hacia un estrecho orificio en el cual las clulas adquieren una rpida aceleracin. Esto focaliza las clulas hidrodinmicamente dentro del fluido y las dirige hacia un orificio cuyo dimetro es similar al de una clula. Las clulas as focalizadas, desfilan una a una frente a la fuente de excitacin luminosa. La velocidad y presin con la que son transportadas las partculas dentro de la cmara de flujo son fundamentales en la resolucin ptica

Figura 43-2. Cmara de flujo del citmetro.

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de un citmetro de flujo. Por ejemplo, al aumentar la presin de la muestra, se incrementa la velocidad del flujo, con lo cual aumenta tambin el dimetro del caudal de la muestra obtenindose una menor calidad de anlisis ptico. 2.2. Sistema ptico El sistema ptico est constituido fundamentalmente por dos componentes: una fuente de iluminacin y un sistema de deteccin de la luz. Generalmente, se utiliza un lser como fuente de excitacin luminosa ya que se requiere una intensa iluminacin debido al tamao de las clulas y a la rpida velocidad a la que estn desfilando frente a sta. El lser produce una luz de baja divergencia, monocromtica, unidireccional y de alta intensidad. La luz lser abarca un amplio rango de longitudes de onda, que representa una mezcla de longitudes de onda especficas (lneas lser), stas pueden ser seleccionadas por espejos que reflejan slo la longitud de onda de inters. La luz del lser excita los fluorocromos unidos a las clulas, los que a su vez emiten luz detectable por los fotomultiplicadores. El lser ms utilizado en los citmetros de flujo es el lser de Argn que emite luz de longitud de onda de 488 nm. Algunos citmetros poseen ms de un lser lo que les permite tener otras posibilidades en cuanto a longitudes de onda de excitacin. El segundo componente del sistema est constituido por dos tipos de detectores: un fotodiodo y 4 fotomultiplicadores. El fotodiodo denominado detector de forward scatter o FSC est ubicado al lado opuesto de la fuente luminosa y recolecta la luz dispersada frontalmente por las partculas al pasar frente al lser. La luz detectada es aproximadamente proporcional al tamao de las clulas. FSC es extremadamente til para discriminar entre diferentes tipos de clulas y desechos celulares. Los fotomultiplicadores recogen la luz difundida perpendicularmente a las partculas al pasar frente a la fuente luminosa. Este sistema permite medir la luz dispersada lateralmente, side scatter o SSC y la luz correspondiente a las emisiones de fluorescencia en 3 rangos de longitud de onda diferentes (FL1, FL2, FL3) (figura 43-3). La luz dispersada lateralmente o SSC entrega informacin respecto a la estructura interna y complejidad de de las clulas y la emisin de fluorescencia determina caractersticas particulares de las clulas dependiendo de la molcula a

la cual est acoplado el fluorocromo. La emisin de fluorescencia tiene una intensidad de varios rdenes de magnitud ms pequea que la luz dirigida hacia el frente (FSC). Esto hace necesario la utilizacin de fotodectores altamente sensibles como son los tubos fotomultiplicadores en los cuales un fotn excita una cascada de electrones lo que amplifica la seal detectada.

Figura 43-3. Configuracin ptica de un citmetro de flujo. Esta configuracin permite la deteccin simultnea de forward scatter (tamao), side scatter (granulosidad) y tres colores distintos de fluorescencia.

2.3. Sistema electrnico La produccin de electrones por los fotodetectores es proporcional a la intensidad de la luz que ha incidido en ellos. Esta se convierte en una seal de voltaje que es procesada por una serie de amplificadores que la transforman en pulsos electrnicos. Generalmente existe una relacin lineal entre el nmero de molculas de fluorocromo unidas a una clula y la intensidad

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de fluorescencia medida. El sistema electrnico convierte las seales de los fotodetectores en valores digitales, los cuales se guardan para su posterior anlisis. El sistema de coleccin de datos consiste de un discriminador de eventos, un convertidor anlogo-digital y una interface donde se guardan los datos (figura 43-4).

certeza en subtipos, determinar el contenido de DNA y analizar las propiedades fisiolgicas de las clulas. Las seales fluorescentes de cada clula son detectadas slo unos pocos milisegundos despus de ser excitadas con la luz. El sistema de deteccin es muy sensible pudiendo incluso dar una seal

Figura 43-4. Sistema de coleccin y anlisis de datos de un citmetro de flujo.

2.4. Reactivos para citometra de flujo Las molculas asociadas a las clulas pueden ser reconocidas por anticuerpos u otras protenas, como son lectinas, hormonas, avidina o estreptoavidina, entre otras. Tambin el DNA o RNA son susceptibles de ser visualizados con reactivos fluorescentes. Esto es la base de la versatilidad de la citometra de flujo. As, aunque las mediciones de FSC y SSC permiten identificar tipos celulares dentro de una poblacin heterognea, son realmente las sondas fluorescentes las que nos permiten clasificarlas con

positiva de fluorescencia en una clula que contiene 1000 partculas del fluorocromo cuando se la compara con la fluorescencia basal o autofluorescencia de las clulas. El fluorocromo ms utilizado en microscopa y citometra de flujo es isotiocianato de fluorescena (FITC). Las ventajas que FITC ofrece por sobre otros fluorocromos son: su alto coeficiente de extincin, su eficiencia cuntica y sus caractersticas de absorcin y emisin mxima, ptimas para trabajar con lser de Argn y lmparas de Mercurio. Adems, se pueden obtener comercialmente una amplia variedad de

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anticuerpos y otras sondas conjugadas con FITC. Sin embargo, tambin presenta algunos inconvenientes tales como la transferencia de energa entre molculas de FITC situadas muy prximas lo que hace disminuir la intensidad global de fluorescencia obtenida (quenching de fluorescencia). De este modo, en el caso de utilizar anticuerpos marcados con FITC, el resultado final en trminos de intensidad de fluorescencia no depende slo del nmero de partculas fluorescentes unidos a la clula, sino tambin de otras caractersticas como la proximidad espacial entre ellos. Si se requiere un segundo o tercer anticuerpo para marcajes simultneos, se utilizan fluorocromos que se exciten a la misma longitud de onda que la fluorescena, como R-ficoeritrina (PE) por ejemplo cuyos rangos de emisin son distinguibles del verde de la fluorescena y por tratarse de un fluorocromo muy sensible que no presenta fenmenos de quenching es el elegido en el caso de buscar antgenos presentes en alta densidad. La mayora de los restantes fluorocromos empleados, ms que fluorocromos individuales, son grupos de dos fluorocromos unidos entre ellos de forma natural (por ejemplo, la protena peridilclorofila o PerCP) o artificialmente (por ejemplo la ficoeritrina-cianina 5, PE/Ci5, conocida tambien como Tricolor). Utilizando sondas capaces de unirse estequiomtricamente al DNA y RNA de las clulas, intercalndose en la doble hebra de cidos nucleicos como Yoduro de Propidio o Bromuro de Etidio, por ejemplo, es posible evaluar contenido de DNA y las diferentes fases del ciclo celular. Tambin es posible medir simultneamente ciclo celular y antgenos, tanto en la membrana como en el citoplasma o ncleo de las clulas. En la tabla 43-1 se muestran ejemplos de fluorocromos y sus principales caractersticas. Es importante recordar que las clulas son entidades vivas y, en consecuencia, cualquier tratamiento al que se les someta puede provocar cambios en ellas. Esto hace imprescindible el uso de controles negativos y positivos que permitan la adecuada interpretacin de los resultados.

y cuantificacin de los antgenos expresados tanto en la membrana como en el citoplasma de las clulas y en el anlisis del ciclo celular. El estudio de las poblaciones celulares linfocitarias identificadas por antgenos de diferenciacin, forman parte actualmente de los exmenes de rutina para la evaluacin del estado inmunolgico de un paciente. En estos estudios se utiliza una nomenclatura estandarizada que categoriza los anticuerpos de acuerdo al antgeno que stos reconocen. Cada categora se donomina grupo de diferenciacin o CD ("cluster of differentiation") seguida por un nmero y en ocaciones por una letra, por ejemplo: CD1, CD1a, CD2, etc. (ver captulo 46). Las aplicaciones ms corrientes estn destinadas a caracterizar las anomalas cualitativas y cuantitativas de las subpoblaciones linfocitarias en las deficiencias inmunitarias congnitas o adquiridas, en la vigilancia de los trasplantes de rganos o de mdula sea y en el estudio del fenotipo de un clon neoplsico en las proliferaciones linfoides malignas. En este ltimo campo, la fenotipificacin por citometra de flujo ha aportado nuevos criterios de clasificacin, pronstico, eleccin de la terapia y seguimiento del tratamiento para evaluar remisin y recada precoz. La citometra de flujo permite, adems, estudiar componentes sricos tales como complejos inmunes circulantes. Si se poseen anticuerpos contra un determinado virus, es posible por lo dems determinar qu poblaciones celulares son infectadas por el virus Las aplicaciones de la citometra de flujo son inmumerables y slo se revisarn a continuacin con ms detalle algunas de las apliciones clnicas de mayor inters. 3.1. Determinacin de poblaciones celulares La disponibilidad de una enorme variedad de anticuerpos monoclonales ha difundido el uso de la citometra de flujo en investigacin bsica y clnica. El diseo de instrumentos en los cuales se ha automatizado la alineacin y calibracin del citmetro, unido al permanente desarrollo de programas computacionales automatizados para la adquisicin y anlisis de datos, ha permitido la expansin de esta metodologa de trabajo hacia los laboratorios clnicos los que pueden obtener resultados rpidos, objetivos y altamente reproducibles.

3. APLICACIONES DE LA CITOMETRA DE FLUJO Las aplicaciones actuales de la citometra de flujo reposan esencialmente en la identificacin

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Tabla 43-1. Caractersticas de los principales fluorocromos utilizados en citometra de flujo. Fluorescencia Marcaje Excitacin Mxima (nm) 495 565,545,480 595 565,545,480 650 565,545,480 470 495,342 493,320 503 445 430 395 372 545 Emisin Mxima (nm) 520 575 620 613 660 670 680 639 637 530(DNA) 640(ARN) 569 580 450 456 656 Tipo de lser 488Ar 488ar 595Dye R6G 488Ar 632HeNe 595 488Ar 488Ar 488Ar 488Ar 488Ar 458Ar 457Ar UV a oK UV A o K 530 K H342 DAPI PY 514 A PerCP PI EB AO APC Abreviatura

Fluoresceinisothiocyanate R-Phycoerythrin Texas Red Tamdem PE-TX Allophycocyanin Tamdem PE-Cy5 Perchlorophyll Propidium iodide Ethidium bromide Acridine orange Mithramycin Chromomycin A3 Hoechst 33342 4',6-diamidino-2phenylindole Pyronin Y

protenas protenas protenas protenas protenas protenas protenas cidos nuclicos cidos nuclicos cidos nuclicos cidos nuclicos cidos nuclicos cidos nuclicos cidos nuclicos cidos nuclicos

FITC R-PE TX

En el anlisis de subpoblaciones de linfocitos, provenientes tanto de sangre perifrica como de mdula sea, ha resultado fundamental la utilizacin simultnea de anticuerpos conjugados con fluorocromos diferentes, siendo de gran utilidad la mezcla de anticuerpos CD45 y CD14 marcados con FITC y PE, que se unen en forma diferencial a las distintas poblaciones de leucocitos, permitiendo identificarlas, cuantificarlas y analizarlas separadamente (figura 435). La produccin reciente de anticuerpos monoclonales conjugados con PerCP permite

realizar marcajes en tres colores simultneamente al utilizarlos junto con anticuerpos marcados con FITC y PE. Existen adems, citmetros con ms de un lser y otros dispositivos detectores de luz que permiten utilizar 4 fluorocromos distintos simultneamente (FL1, FL2, FL3 y FL4). De esta manera es posible obtener rpidamente mucha informacin con una cantidad mnima de muestra. La co-expresin de molculas de superficie o intracelulares en una misma clula permite diferenciar con certeza distintas subpoblaciones (figura 43-6).

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Figura 43-5. Estrategia de anlisis simultneo de subpoblaciones celulares en una muestra de sangre total lisada. Las distintas poblaciones celulares son claramente distinguibles por su tamao, granulosidad y expresin diferencial de antgenos de superficie, detectados con anticuerpos monoclonales dirigidos contra CD45 y CD14.

Figura 43-6. Anlisis simultneo de poblaciones linfocitarias en sangre total lisada de un paciente con SIDA. En A se muestra el grfico de FSC (tamao) versus SSC (granulosidad) de una muestra de sangre total lisada. En ste se distinguen claramente linfocitos, monocitos y granulocitos. En B, C y D se analiza la expresin de CD3, CD4 y CD8 de la poblacin correspondiente a los linfocitos.

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Los protocolos de marcaje de clulas leucocitarias sanguneas y de mdula sea se han visto favorecidos por el desarrollo de reactivos que permiten eliminar fcilmente los glbulos rojos, poblacin mayoritaria en la sangre. La caracterizacin de subpoblaciones linfocitarias es una herramienta de gran utilidad en el seguimiento de la progresin de cuadros de inmunodeficiencia. Esto permite detectar con alta sensibilidad subpoblaciones poco representadas dentro de la poblacin total, como son los linfocitos T CD4+ en el SIDA (Sndrome de Inmunodeficiencia Adquirida). El anlisis de glbulos rojos y plaquetas no requiere purificacin ya que la contaminacin por el resto de las clulas leucocitarias no es importante (menos de 0,1%) y pueden ser fcilmente eliminadas en la etapa de anlisis. 3.2. Fenotipificacin de neoplasias hematolgicas En general la aplicacin de la citometra de flujo en el diagnstico de patologas neoplsicas se ha incrementado considerablemente en los ltimos aos debido a la reproducibilidad de los datos obtenidos. Esta informacin permite determinar sin ambigedad las clulas comprometidas en varias neoplasias como es el caso de las leucemias agudas, linfomas y mielomas entre otras. En estos estudios, la informacin del nmero de clulas neoplsicas presentes, por lo general, es irrelevante, siendo ms importante determinar si estas clulas estn o no presentes y a qu tipo de neoplasia representan. El anlisis multiparamtrico que considera la fluorescencia, el tamao y la granulosidad de las clulas permite obtener una excelente informacin de la heterogeneidad celular (figura 43-7). Las clulas derivadas de la sangre, mdula sea o de rganos linfoides son relativamente fciles de aislar para analizarlas por citometra de flujo. Sin embargo, cuando se trata de estudiar clulas provenientes de tejidos u rganos es recomendable realizar cortes histolgicos antes y durante la disgregacin del tejido para asegurar una adecuada representacin de los diversos tipos celulares que conforman la muestra. La correlacin del estado clnico del paciente, morfologa celular, citoqumica e histoqumica, el inmunofenotipo obtenido por citometra de flujo, el contenido de DNA y anlisis del ciclo celular son antecedentes

que deben ser considerados, en conjunto, para establecer acertadamente un diagnstico y tratamiento apropiado en cada caso. 3.2.1 Fenotipificacin de leucemias Las leucemias agudas (LA) son expansiones clonales de clulas precursoras hematopoyticas (blastos) en la mdula sea con algunas caractersticas en comn como son una baja respuesta a mecanismos regulatorios y una capacidad de diferenciacin disminuida. Su expansin se realiza, generalmente, a expensas de los elementos normales de la mdula sea. Un proceso se clasifica como maligno por la presencia de una hematopoyesis disminuida y un exceso de blastos. Las subclasificaciones se realizan considerando que los blastos presentes mantienen algunas de las caractersticas de sus contrapartes normales. En el anlisis de leucemias se deben tener en cuenta el porcentaje de clulas con morfologa de blastos determinado por histoqumica y/o citoqumica y el linaje celular de los blastos determinado por citometra de flujo. Las leucemias se clasifican en agudas o crnicas dependiendo del grado de madurez de los blastos. Las clulas linfoides o mieloides pueden estar involucradas en la leucemia, incluso simultneamente. Con menos frecuencia se observan leucemias con compromiso de megacariocitos o eritrocitos. Es importante resaltar que no existen marcadores especficos para leucemia y que lo que se realiza es la interpretacin de un conjunto de marcadores celulares comparado con la ontogenia normal. Leucemia aguda linfoblstica (LLA). Es la leucemia ms frecuente en nios menores de 15 aos, con una incidencia mayor entre los 3 y 5 aos, sin embargo, tambin se presenta en nios menores de 1 ao y con menor frecuencia en adultos jvenes. El pronstico es ms favorable en nios entre 1 y 10 aos de edad que en adultos. La mayor parte de las LLA son proliferaciones de clulas B (entre 75 a 85%) variando en el grado de maduracin que presentan las clulas. El fenotipo ms comn de las LLA de clulas B es la LLA comn o cALLa: expresan CD10, CD19, CD20, TdT (transferasa deoxiterminal), HLA-DR y en ocasiones CD34. No expresan inmunoglobulinas de superficie ni citoplasmticas. Este es el fenotipo con mejor pronstico y representa aproximada-

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Figura 43-7. Estrategia de anlisis para una inmunofenotipificacin. La muestra corresponde a una biopsia de ganglio fresca. La poblacin a analizar se define en base al tamao y granulosidad (A). En (B) se muestra el control negativo utilizando un anticuerpo irrelevante. En (C) se muestra la expresin del marcador de activacin celular HLA-DR. En (D) y (G) se analiza la expresin de antgenos especficos de linfocitos B (CD19 y CD20). Puesto que se observa expresin de marcadores de linfocitos B, se analiza la expresin del antgeno CD10 (F). En (E,K y L) aparece la expresin de marcadores de linfocitos T (CD5, CD3, CD4 y CD8). Luego se analiza la expresin de cadenas livianas de inmunoglobulinas ( y ) (H, Y y J). El resultado del anlisis muestra expresin clonal de la cadena liviana kappa en las clulas B, lo cual es caracterstico de un proceso neoplsico.

mente un 50% de los casos. Le siguen en frecuencia (30% de los casos) la LLA que expresa los mismos antgenos ya descritos a excepcin de CD20. Con menor frecuencia, las LLA expresan slo CD19 o, en otros casos, expresan CD19, CD20, HLA-DR, CD10 e inmunoglobulinas de superficie o citoplasmticas. La enzima TdT puede estar presente tanto en LLA de clulas B como T. La expresin de HLA-DR es de mayor intensidad en clulas B ms inmaduras. La leucemia de tipo

Burkitt es la de peor pronstico y presenta clulas morfolgicamente distintas a las de una LLA de clulas B. Los blastos se caracterizan por presentar vacuolas en el citoplasma que se tien con Oil Red O, tienen un fenotipo de clulas B maduras con expresin de inmunoglobulinas en la membrana celular. Las leucemias de clulas T comprenden aproximadamente el 15-25% de los casos siendo, por lo general, bastante agresivas y con menor respuesta al tratamiento. El fenotipo de esta

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patologa es ms complejo que el de LLA de clulas B. Esto se debe a que no existen marcadores de clonalidad ni marcadores especficos frecuentes para las etapas tempranas de maduracin de linfocitos T. El marcador ms til es CD7, que se expresa en aproximadamente 95% de las LLA de clulas T. Sin embargo, CD7 tambin se expresa en los linfocitos T normales en forma aberrante en las LLA de clulas B y en un porcentaje ms alto (25%) en las leucemias de estirpe mieloide. Otros marcadores para LLA de clulas T son CD1a (excepto en el timo ya que los timocitos expresan normalmente CD1a), CD3, CD2 y CD5. Estos dos ltimos estn presentes, con alta frecuencia en este tipo de leucemia. HLADR es frecuentemente negativo en LLA de clulas T y en ausencia de otros marcadores de linfocitos T, la presencia de CD3 citoplasmtico es definitiva para asignar este linaje. En la LLA de clulas T se busca ms bien expresin aberrante (por ejemplo, coexpresin de CD4 y CD8) o ausencia de uno o ms marcadores clsicos de linfocitos T. Leucemias agudas no-linfocticas (LANL). Este grupo de patologas est conformado por las leucemias agudas mieloides (LMA), eritrocticas y megacariocticas. La fenotipificacin de estas leucemias ha sido til para diferenciarlas de las LLA ms que para clasificarlas en subtipos de LMA ya que, en general, desde el punto de vista del tratamiento y diagnstico, no establece diferencias importantes. Las LMA son ms fecuentes en adultos entre los 15 y 40 aos. Solamente alrededor del 20% de las leucemias en nios son LMA. Una caracterstica particular de los blastos LMA es su homogeneidad en tamao y granulosidad dentro de la heterogeneidad habitual de las clulas de la mdula sea. Los marcadores celulares CD13, CD14, CD33 y CD34 nos indican si las clulas son de linaje mieloide y el grado de diferenciacin monoctico. Aunque HLA-DR no es un marcador mieloide especfico, es til para diferenciar las leucemias promielocticas en las que HLA-DR est generalmente ausente o tiene una expresin dbil. Por otra parte la ausencia de CD45 en conjunto con la presencia de otros marcadores como CD71 o glicoforina A es un indicio de leucemia de linaje eritroide. Si adems estn presentes marcadores de plaquetas como CD61 y/o CD41a esto indica una leucemia megacarioblstica. La expresin de CD14 est virtualmente restringida a los monocitos ms maduros, por esto, es de gran ayuda para

diferenciar los monocitos normales, de los blastos o de los precursores de monocitos. CD11c en conjunto con CD14 permiten diferenciar entre leucemia mielomonoctica y leucemia aguda monoctica ya que, por lo general, no se expresan en otras formas de LLA o LMA. La coexpresin del antgeno CD15 es muy til ya que ste se va adquiriendo durante la maduracin de la serie mieloide granuloctica, a la vez que disminuyen la expresin de CD45. Leucemia linfoctica crnica (LLC). Esta es una patologa asociada a adultos mayores, y ocurre con mayor frecuencia en hombres que en mujeres. Esta enfermedad, que involucra la mdula sea, los ndulos linfticos y/o el bazo, es una expansin clonal de linfocitos inmunolgicamente competentes. La enfermedad es prcticamente indistinguible de un linfoma bien diferenciado y es denominada LLC si la mdula sea est extensamente comprometida. Si la enfermedad se inicia en los ndulos linfticos o en el bazo se utiliza el trmino linfoma bien diferenciado o linfoma de linfocitos pequeos. Morfolgicamente, estas clulas son muy similares a los linfocitos normales, de all la relevancia del anlisis por citometra de flujo en este tipo de patologa. La mayor parte de las LLC estn compuestas por clulas B monoclonales, las que presentan una expresin monotpica de cadenas livianas de inmunoglobulinas y coexpresin de CD5, CD20 y CD19. Leucemia mieloide crnica (LMC). Es una patologa de clulas troncales multipotenciales y puede, por lo mismo, involucrar ms de un linaje celular. La inmunofenotipificacin de esta enfermedad no es frecuente, excepto en los casos de crisis blstica que es la forma progresiva y agresiva de esta patologa. En este caso, el fenotipo se utiliza para definir el tipo celular involucrado en la proliferacin blstica. 3.2.2 Fenotipificacin de linfomas Los linfomas son tumores del sistema inmune que se presentan principalmente en los ndulos linfticos, bazo, mdula sea, en tejidos linfoides asociados a mucosas y, con menor frecuencia en la piel u otros rganos. Ocasionalmente los blastos pueden detectarse en gran cantidad en la circulacin sangunea. El mtodo bsico en el diagnstico y

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clasificacin de los linfomas es la microscopa. En los ltimos aos, se han desarrollado gran variedad de esquemas histolgicos para la clasificacin de estos tumores. La clasificacin del "Intenational Lymphoma Study Group" presentada en el ao 1994 no categoriza estos tumores clnicamente como de alto o bajo grado de malignidad (actualmente se reconoce que cada entidad tiene sus propias caractersticas individuales), sino que las agrupa dependiendo del tipo celular involucrado en la neoplasia, basndose en las caractersticas antignicas, citogenticas, morfolgicas y la observacin clnica. De este modo, en el caso de los linfomas noHodgkins, existen 10 que son de origen linfoide B y stas son la leucemia/linfoma linfoblstica de clulas B precursoras y las neoplasias de clulas B perifricas llamadas: leucemia linfoctica crnica de clulas B, inmunocitoma, linfoma del manto, linfoma folicular, linfoma MALT, leucemia de clulas velludas, plasmocitoma, linfoma B difuso de clulas grandes y linfoma de Burkitt. Otra categora importante, aparte de la enfermedad de Hodgkin, son las neoplasias que tienen su origen en clulas T y clulas "Natural Killer" (NK). En este grupo se encuentran la leucemia/linfoma T linfoblstico de clulas precursoras y las neoplasias de clulas T perifricas y de clulas NK llamadas: leucemia linfoctica crnica de clulas T, leucemia de linfocitos grandes granulares, micosis fungoide / sndrome de Szary, linfomas de clulas T perifricas inespecficos, linfoma angioinmunoblstico de clulas T, linfoma angiocntrico, linfoma intestinal de clulas T, leucemia/linfoma de clulas T del adulto y linfoma de clulas anaplsticas grandes. No es la intencin de este captulo hacer un estudio extenso de cada clasificacin por lo que nos limitaremos a resaltar las caractersticas inmunofenotpicas ms relevantes en el estudio de estas neoplasias por citometra de flujo. Leucemia/linfoma linfoblstico B. Se presenta tpicamente como una leucemia. Aunque el compromiso de la mdula sea y la sangre es muy comn, unos pocos casos se localizan como tumores slidos, usualmente en los ndulos linfticos. La enfermedad, aunque es agresiva, puede ser curada, particularmente cuando se trata de nios. Tpicamente expresa TdT, CD10 (aunque a veces est ausente), puede expresar cadenas pesadas de inmunoglobulina en el citoplasma, pero es ms frecuente que este

marcador sea negativo. Expresa otros marcadores de clulas B como son CD19, CD20, CD79a y CD22. Por lo general, muestra trisoma 12 o anormalidades 13q en algunos casos. Inmunocitoma (linfoma linfoplasmoctico). Esta neoplasia de origen B tiene tendencia a diferenciarse a un estado de clulas plasmticas. Es posible detectar IgM en el citoplasma o como inclusiones intranucleares (cuerpos de Dutcher) en las clulas de aspecto plasmoctico. Si la IgM tambin aparece en el suero como paraprotena, la enfermedad corresponde a una Macroglobulinemia de Waldenstrms. La fuerte positividad para IgM citoplasmtica y de superficie, en conjunto con la ausencia de CD5, puede ayudar a distinguir esta enfermedad de las neoplasias linfocticas pequeas. El resto de los marcadores de clulas B, CD19, CD20, CD22 y CD79a son positivos. CD10 es negativo. Es una enfermedad de adultos que suele seguir un curso indolente aunque puede transformarse en un linfoma de clulas grandes ms agresivo. Linfoma de clulas del manto. Esta enfermedad se presenta, por lo general, con linfoadenopatas, pero puede encontrarse en sitios extranodales, principalmente en el tracto gastrointestinal. Las clulas son, en la mayora parte de los casos, pequeas y de alto SSC debido a sus ncleos irregulares. Presentan el marcador CD5 y carecen de CD23. Existe asociacin con una anormalidad citogentica caracterstica, la traslocacin recproca (t) (11;14) lo que determina la produccin de la ciclina D1, la cual puede ser identificada por citometra de flujo. Expresan tambin los marcadores de clulas B CD19, CD20 CD22 y CD79a, y tienen expresin clonal de cadenas livianas de inmunoglobulina, con mayor frecuencia cadenas lambda. CD10 es frecuentemente negativo. Esta enfermedad se presenta preferentemente en adultos, siguiendo un curso moderadamente agresivo. Linfoma folicular. Esta enfemedad es de progresin lenta, pero esencialmente incurable. Las clulas presentan los marcadores de clulas B CD19, CD20, CD22 y CD79a. Son CD5 y CD23 negativas y CD10 positivas. Presentan expresin clonal de cadenas livianas de inmunoglobulina (kappa con mayor frecuencia). La traslocacin (14;18) est presente en dos tercios de los casos acompaada de la expresin de la protena BCL2, sin embargo, los casos que carecen de esta

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traslocacin tambin expresan la protena BCL-2 y presentan las mismas caractersticas clnicas de aquellos que s la tienen. Linfoma de clulas B marginales (tipo MALT). Este linfoma es tambin conocido como linfoma de clulas pequeas. Se origina en el ducto gastrointestinal o en otros sitios extranodales, generalmente en el tejido epitelial glandular. Este linfoma tiende a mantenerse localizado, por lo que es en general de buen pronstico, aunque puede transformarse en un linfoma B de clulas grandes. Estas clulas tienen el fenotipo de clulas B con expresin de CD19, CD20, CD22, CD79a e inmunoglobulinas de superficie. No expresan CD5, CD10 ni CD23. El perfil citogentico suele presentar t (11;18) en muchos casos y trisoma 3 en algunos. Este mismo fenotipo se encuentra en el linfoma B de la zona marginal del bazo que representa una forma rara de leucemia crnica conocida como linfoma esplnico de linfocitos velludos y se diferencia del linfoma tipo MALT en la alta incidencia de enfermedad en la mdula sea. Leucemia de clulas velludas o tricoleucemia. Es una leucemia de clulas B, las que expresan todos los marcadores B adems de CD25, CD103 y CD11c. No expresan CD5, CD10 ni CD23. Es, por lo general, una enfermedad de adultos que sigue un curso indolente pudiendo presentar esplenomegalia y pancitopenia. Plasmocitoma / Mieloma de clulas plasmticas. Las clulas plasmticas son caractersticas del Mieloma mltiple o plasmocitoma. Por lo general las clulas no expresan los marcadores B CD19, CD20 y CD22, pero son positivas para inmunoglobinas citoplasmticas (clonal para una cadena liviana) acompaada en aproximadamente un 50% de los casos de CD79a. Expresan CD38, CD138 y, en un elevado nmero de casos CD56. Los pacientes son en su mayora adultos (mayores de 50 aos) que responden inicialmente al tratamiento, pero que recaen luego de un perodo de remisin variable. Linfoma difuso de clulas B grandes. Es uno de los linfomas no-Hodgkin ms comunes. Expresan marcadores B (CD19, CD20, CD22, CD79a) y en algunos casos CD5 y CD10. Expresan las inmunoglobulinas con ms frecuencia en la superficie que en el citoplasma. La citogentica muestra t (14;18) en aproximadamente 30% de los

casos y rearreglamientos (40%) y/o mutacin (75%) de BCL-6. Es una enfermedad tanto de nios como de adultos. Sigue un curso agresivo, pero puede ser curable. Linfoma de Burkitt. Este tipo de linfoma se presenta con mayor frecuencia en nios que en adultos. Es una enfermedad agresiva pero responde a una terapia intensa, especialmente en nios. El fenotipo es de clulas B perifricas: CD19, CD20, CD22, CD79a e IgM de superficie positivas. CD10 es siempre positivo. No expresa CD5 ni CD23. El marcador Ki67 es positivo en 85% de los casos. La citogentica muestra t(2;8), t(8;14) o t(8;22), rearreglamiento de c-Myc en el cromosoma 8 y en el gen para cadenas pesadas de las inmunoglobulinas. Con menos frecuencia estn involucradas las cadenas livianas. Leucemia/linfoma T linfoblstico de clulas precursoras. Esta leucemia es morfolgicamente indistinguible de las neoplasias de origen B. Se presenta, por lo general, como leucemia aguda pero ocasionalmente puede dar origen a tumores en los ndulos linfticos o timo. Presenta positividad para antgenos de lnea T, aunque debido a su inmadurez, el CD3 puede ser citoplasmtico, es positivo para TdT, CD7, CD4 o CD8. CD1a es frecuentemente positivo. Leucemia linfoctica crnica de clulas T. Esta patologa involucra la sangre perifrica y se asemeja a la de tipo B en la morfologa. Cuando las clulas presentan nuclelos ms prominentes y citoplasma algo ms abundante, se clasifican como leucemia prolinfoctica de clulas T, siendo menos frecuente y de peor pronstico. Estos linfomas expresan marcadores de clulas T CD2, CD3, CD5, CD4 con ms frecuencia que CD8 y siempre son CD7 positivas. La citogentica muestra trisoma 8q e Inv 14(q11;32) en el 75% de los casos . Es una enfermedad de adultos y ms agresiva que su equivalente de tipo B. Leucemia linfoctica de clulas granulares grandes. Se subdividen fenotpicamente en aquellas que se originan de clulas T y aquellas que probablemente derivan de clulas NK. La primera, se presenta como una enfermedad de curso indolente y los pacientes suelen ser asintomticos. El pronstico es por lo general bueno. En cambio en el segundo tipo, de clulas NK, los pacientes son de menor edad (40 aos como promedio) y los snto-

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mas son ms agudos pudiendio presentar esplenomegalia masiva, compromiso del tracto gastrointestinal y coagulopata. Esta patologa tiende a seguir un curso ms agresivo. Fenotpicamente ambas son similares, presentando antgenos comunes como CD2 y CD56; CD3 es positivo en el caso de clulas T, CD8 puede ser positivo en ambas, CD16 y CD57 son positivos en el caso de ser clulas NK. Micosis fungoide/ Sndrome de Szari. La Micosis fungoide es un linfoma de clulas T que se ve con ms frecuencia en la piel y se define como sndrome de Szari cuando las clulas se detectan tambin en la circulacin. Si la enfermedad progresa, puede involucrar los ganglios linfticos. Esta enfermedad sigue un curso variable pudiendo extenderse y transformarse en tumores de clulas grandes. Estas clulas expresan antgenos de clulas T: CD2, CD3, CD5 y CD4. Son CD7, CD8 y CD25 negativos. En muchos casos CD30 es positivo, lo que es til para diferenciar esta patologa de una dermatitis. Linfoma perifrico inespecfico de clulas T. Tpicamente, esta enfermedad contiene una mezcla de clulas neoplsicas pequeas y grandes, con una marcada presencia de otros tipos celulares no neoplsicos, incluido macrfagos y eosinfilos. Es una enfermedad de adultos, de curso agresivo pero potencialmente curable. Presenta una variedad de patrones antignicos de clulas T siendo CD4 positivo con ms frecuencia que CD8. CD3 puede ser positivo o negativo. El resto de los antgenos de clulas T se presentan en forma variable. Linfoma angioinmunoblstico de clulas T. Es una enfermedad sistmica con linfoadenopata, fiebre, prdida de peso y rash cutneo. Presenta hipergammaglobulinemia policlonal. Es moderadamente agresiva y se consiera un linfoma de alto grado. Aunque las clulas presentan fenotipo de clulas T con preferencia CD4 positivas, su caracterstica ms relevante es la presencia de otros tipos celulares como histiocitos, clulas plasmticas, eosinfilos y clulas dendrticas foliculares. El diagnstico es ms bien morfolgico por presentar una arquitectura particular. Linfoma angiocntrico. Esta patologa se presenta tanto en nios como en adultos. Involucra zonas extranodales como nariz, paladar y piel. El curso clnico vara de indolente hasta agresivo. El

virus Epstein Barr est siempre presente en las clulas neoplsicas. Estas clulas se originan, ms probablemente, en clulas NK que expresan CD2 y CD56. Sin embargo, tambin se puede detectar marcadores de clulas T como CD5, CD7, CD4 o CD8. Por lo general se encuentra CD3 citoplasmtico. Linfoma intestinal de clulas T. Es una enfermedad de adutos que sigue un curso agresivo. Por lo general, los pacientes presentan una historia larga de enfermedad celaca, mientras que en otros se presenta directamente como linfoma. El pronstico es malo debido a que esta neoplasia suele ser multifocal. Las clulas presentan fenotipo de clulas T. Son CD3 y CD7 positivas. CD8 es con frecuencia positivo. En muchos casos las clulas expresan la integrina CD103. Leucemia/linfoma de clulas T del adulto. Esta patologa se asocia a la infeccin con el retrovirus HTLV-1. Los ndulos linfticos son reemplazados difusamente por clulas T neoplsicas y en algunos casos stos se detectan en la sangre perifrica. La enfermedad se asocia con lesiones seas e hipercalcemia. Sigue un curso por lo general agresivo, pudiendo ser, en escasas ocasiones, indolente. El fenotipo es de clulas T CD3, CD2, CD4, CD5 y CD25 positivo. CD7 es negativo. Linfoma anaplstico de clulas grandes. Las clulas expresan el antgeno CD30 o Ki-1, un antgeno presente en las clulas de Reed-Sternberg y suelen ser ms grandes que en otros linfomas. En algunos casos es dificil hacer diagnstico diferencial con linfoma de Hodgkin. Tpicamente, el tumor invade los ganglios linfticos y en otros, se confina en la piel. Con poca frecuencia expresan marcadores de linfocitos, pero cuando los hay stos indican un origen de clulas T. 3.3. Enfermedad de Hodgkin La utilidad de la citometra de flujo en el diagnstico de esta patologa es escasa ya que se utilizan, con mayor xito, criterios morfolgicos. La clasificacin es compleja y est mejor definida en el campo de los patlogos, por lo que no ser descrita en esta ocasin. 3.4. Trasplante de mdula sea La citometra de flujo tiene aplicacin en las

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diferentes etapas del trasplante de mdula sea. Contribuye, en conjunto con otras tcnicas, a la evaluacin de la enfermedad residual en el momento de la decisin terapetica as como tambin en la evaluacin de las clulas progenitoras CD34+. Las clulas progenitoras pueden definirse como clulas que tienen la capacidad de duplicarse y diferenciarse en una amplia variedad de lineas hematopoyticas que, al ser trasplantadas en un receptor aplsico (pancitopenia resultante tanto de una enfermedad como de una terapia mielosupresora) son capaces de reconstituir la mdula sea del paciente. Se considera que el nmero de clulas CD34+ trasplantadas se correlaciona con el xito y rapidez de la reconstitucin lo cual contribuye a disminuir el perodo de tiempo en que el paciente se encuentra inmunosuprimido o bajo los efectos de una quimioterapia de altas dosis. La movilizacin de clulas CD34+ desde la mdula sea hacia la sangre perifrica con factores de crecimiento de colonias (en pacientes cuya mdula sea no se encuentra comprometida), ha permitido recolectar clulas progenitoras desde la mdula sea o por leucoafresis, evaluarlas y criopreservarlas para ser utilizadas en trasplantes alognicos o autotrasplantes de pacientes sometidos a quimiorradioterapia. Los protocolos utilizados para incrementar los niveles de clulas progenitoras en la sangre son muy variados, los mecanismos de este proceso de movilizacin no se conocen y la caracterizacin biolgica de las clulas movilizadas es limitada. Ha sido demostrado que los trasplantes realizados con clulas mononucleares enriquecidas en clulas progenitotras CD34+ permiten la reconstitucin de la hematopoyesis. En estos casos, es de gran importancia cuantificar la poblacin responsable de la reconstitucin rpida y sostenida de la hematopoyesis del receptor del trasplante. La medicin de las clulas CD34+ por citometra de flujo provee de un mtodo rpido y reproducible para cuantificar esta poblacin. Para esto se realiza doble marcaje utilizando anticuerpos dirigidos contra CD45 y CD34 y se utiliza un anlisis multiparamtrico de la muestra considerando las caractersticas de tamao y granulosidad de las clulas progenitoras de manera a analizar exclusivamente los leucocitos de la muestra y expresar los resultados en valores absolutos de clulas CD45+.

3.5. Anlisis de contenido de DNA y ciclo celular Una de las aplicaciones importantes de la citometra de flujo es la evaluacin del contenido de DNA y ciclo celular. Las clulas marcadas con un fluorocromo, que se une estequiomtricamente a los cidos nucleicos, emiten una fluorescencia proporcional al contenido cromosmico global. Las clulas malignas son con frecuencia afectadas de una anomala en el contenido de DNA, es decir, son aneuploides. En muchos tumores humanos la ploida representa un factor pronstico. La medicin del contenido de DNA y del ciclo celular pueden ser combinadas con el estudio simultneo de la expresin de antgenos de la membrana, citoplasmticos o nucleares, con lo cual un tipo particular de clulas puede ser evaluada dentro de una poblacin heterognea en conjunto con la ploida y las fases del ciclo celular. El anlisis por citometra de flujo del ciclo celular puede reflejarse en una curva que muestre las variaciones del contenido de DNA versus el nmero de clulas analizadas (figura 43-8). Las clulas que no estn creciendo o involucradas en la divisin celular se denominan en el estado G0. Cuando se gatilla la divisin, la clula entra primero en el estado G1 del ciclo celular, luego comienza a sintetizar DNA y entra a la fase S del ciclo celular. Durante esta fase el contenido de DNA de la clula aumenta hasta duplicarse, luego la clula ingresa a la fase G2 del ciclo y se prepara finalmente para entrar en mitosis (M) y volver a dividirse retornando a G1 si la clula es estimulada o bien mantenerse en G0. Las clulas somticas son diploides, es decir tienen un nmero 2n de cromosomas. El nmero de cromosomas de un tumor es con frecuencia mayor que 2n (hiperploide) y algunas veces menor (hipoploide). Un nmero anormal de cromosomas se denomina aneuploida y refleja cambios en el contenido de DNA. El contenido de DNA de un tumor se expresa como el ndice de DNA el cual se define como la razn entre el contenido de DNA de las clulas tumorales con respecto a clulas normales diploides.Utilizando la citometra de flujo es posible analizar el contenido de DNA tanto de clulas frescas como de biopsias en parafina. Para esto es necesario obtener suspensiones de ncleos o clulas evitando la degradacin del DNA. Cuando se estudian tejidos neoplsicos, generalmente stos contienen algn porcentaje de clulas normales diploides que sirven como control interno de la muestra. Alternativamente, se

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Figura 43-8. Comparacin del contenido de DNA. Se muestran clulas mononucleares de sangre normal (A), clulas mononucleares de sangre de un paciente con leucemia (B) y mdula sea del mismo paciente (C). En cada grfico se muestra adems el contenido de DNA de ncleos de eritrocitos de pollo (CEN) los cuales se utilizan para la calibracin del citmetro de flujo. Se detecta una pequea poblacin aneuploide (hipodiploide) en ambas muestras del paciente siendo sta mayor en la mdula sea, concordante con el porcentaje de blastos detectados en la inmunofenotipificacin por citometra de flujo.

pueden utilizar otros controles, como linfocitos aislados, eritrocitos u otra clula cuyo contenido de DNA sea estable (figura 43-8). En lneas generales, la cuantificacin de DNA proporciona dos tipos de informacin biolgica distinta: por un lado, nos orienta sobre la existencia o no de anomalas clonales de DNA- aneuploidasy por otra, nos permite conocer la proporcin de clulas en las distintas fases del ciclo celular. Esta metodologa permite obtener adems informacin sobre la dinmica del ciclo celular si se incluye la incorporacin de anlogos de nucletidos como la bromodeoxiuridina (BrdU) y as determinar con exactitud las celulas en fase S. Actualmente se ha incorporado la utilizacin del compuesto fluorescente verde 5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) que se une covalentemente a macromolculas intracelulares, permitiendo realizar cultivos mixtos de linfocitos y respuesta a mitgenos y aloantgenos en conjunto con el estudio del ciclo celular. Desde el punto de vista pronstico, la presencia de aneuploida de DNA dentro de los tumores malignos, se ha asociado con una peor respuesta al tratamiento y con supervivencia ms cortas. No obstante, en algunas situaciones concretas como en la leucemia linfoblstica aguda del nio, el mieloma mltiple, el neuroblastoma y el rabdomiosarcoma, la presencia de aneuploida, y en particular de hiperploida, se asocia con un mejor pronstico de la enfermedad. El estudio del ciclo celular mediante citometra de flujo en lesiones tumorales

ha demostrado poseer una clara utilidad clnica, tanto en su aplicacin diagnstica como pronstica. La existencia de una elevada tasa proliferativa en tumores slidos y en hemopatas malignas se asocia globalmente con un diagnstico histopatolgico de malignidad, con caractersticas clnicas, biolgicas e histolgicas de mal pronstico y en definitiva con una peor evolucin de la enfermedad y una supervivencia ms corta. Sin embargo, en los sndromes mielodisplsicos, la existencia de una mayor proporcin de clulas en fase S en la mdula sea se asocia con un mejor pronstico. Pese a lo prometedor de los resultados obtenidos hasta ahora en este campo, el valor clnico de la deteccin de aneuploida debe ser tomado con cautela. Un anlisis detallado de la literatura muestra la existencia de un elevado grado de discrepancias en relacin tanto, con la incidencia de aneuploidas para un mismo tumor, como en sus posibles implicaciones clnicas. Las causas de estas discrepancias son probablemente metodolgicas, van desde la calidad de la muestra, procesamiento y mtodos de tincin del DNA, hasta la interpretacin de los resultados. 3.6. Anlisis de enfermedad residual mnima El desarrollo actual de tratamientos de quimioterapia muy efectiva ha permitido alcanzar una elevada incidencia de remisiones completas en pacientes con leucemias agudas. Sin embargo,

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un porcentaje importante de estos pacientes, luego de alcanzar la remisn completa, recae debido a la persistencia de clulas tumorales residuales (enfermedad residual mnima o ERM). En la actualidad, la confirmacin de la remisin completa se basa en la existencia de menos de 5% de blastos en mdula sea y sangre perifrica, detectables por tcnicas morfolgicas y citoqumicas convencionales, as como por la ausencia de estas clulas en el lquido cefalorraqudeo. De este modo entre los individuos en remisin completa, se incluye un grupo de pacientes muy heterogneo cuya masa tumoral residual puede variar desde 109 a 1011 clulas leucmicas. En los ltimos aos, diversos grupos han volcado sus esfuerzos en la deteccin de ERM en leucemias agudas. Su inters se ha centrado en el desarrollo de mtodos que permitan aumentar la sensibilidad de las tcnicas morfolgicas y citoqumicas convencionales (1-5%) y en establecer la posible utilidad clnica de este tipo de anlisis y sus implicaciones teraputicas. De entre todos los mtodos investigados para la deteccin de ERM en leucemias agudas, el inmunofenotipo obtenido por citometra de flujo, junto con anlisis de biologa molecular aparecen como las tcnicas ms atractivas debido a la rapidez, alta sensibilidad y objetividad de los resultados. Como ha sido mencionado ampliamente, la citometra de flujo permite analizar varios parmetros simultneamente en una misma clula, cuantificar la expresin de un marcador molecular en un nmero muy grande de clulas en corto tiempo, analizar una diversidad de marcadores de superficie o citoplasmticos, adems del contenido de DNA permitiendo as acotar con bastante exactitud la poblacin de clulas neoplsicas. En general, la eficacia de cualquier mtodo, cuyo objetivo sea la deteccin de ERM en leucemias agudas y otras patologas, depende de su especificidad (capacidad para diferenciar entre clulas normales y clulas neoplsicas), de su sensibilidad (lmite de deteccin del mtodo), de su reproducibilidad (debe ser objetivo y fcil de estandarizar) y de su aplicabilidad (debe ser rpido y susceptible de ser utilizado en la rutina de un laboratorio clnico). Las clulas leucmicas, salvo raras excepciones, no presentan antgenos especficos que permitan diferenciarlas de las clulas normales. Sin embargo el conocimiento actual

basado en la experiencia de muchos aos ha puesto de manifiesto la existencia de mltiples aberraciones antignicas con respecto a los patrones fenotpicos detectados en las clulas normales. Este es el eje central para la posterior deteccin de ERM, el cual necesariamente debe estar apoyado en el inmunofenotipo del paciente al momento del diagnstico. Los patrones de aberracin antignica en conjunto con otras caractersticas celulares son de gran utilidad en la deteccin de ERM. No obstante lo ms acertado es utilizar al menos dos parmetros, para identificar la poblacin neoplsica en la muestra. Un atractivo complemento a esta estrategia, no disponible an, sera el empleo de anticuerpos monoclonales contra protenas de productos de fusin de algunos genes implicados en traslocaciones cromosmicas. Estos anticuerpos seran marcadores leucmicos especficos, ausentes en clulas normales, y que conjugaran dos requisitos importantes para la investigacin de ERM: especificidad y sencillez. Aunque los estudios sobre ERM son escasos en nmero y el seguimiento de los pacientes incluidos en la mayora de los estudios es relativamente corto, se ha constatado en forma unnime, que la presencia de clulas blsticas durante la fase de tratamiento, de mantenimiento o en remisin completa permite anticipar, con una elevada probabilidad, la recada.

LECTURAS SUGERIDAS Braylan, R., Benson N. and Iturraspe J., Analysis of lynphomas by Flow Cytometry: Current and emerging strategies, Annalas of the News York academy of sciences. 677: 364-378, 1993. Braylan, R. Lynphomas en Clinical Flow Cytometry: Principles and applications, pp. 203-234. De Bauerm, K., Duque, R. and Shankey, T., 1993. Duque R. Acute Leukemia en Clinical Flow Cytometry: Principles and applications, pp. 235-245. De Bauer, K., Duque, R. and Shankey, T., 1993. Locken, M., Immunofluorescence techniques en Clinical flow cytometry: Principles and applications, pp. 341-353. De Bauer, K., Duque, R. and Shankey, T., 1993.

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Longobardi, A., Flow Cytometry: First principles, Wiey-Liss, Inc., 1992. Steen, H., Charateristic of Flow Cytometers en Clinical flow cytometry: Principles and applications, pp. 235-245. De Bauer, K., Duque, R. and Shankey, T., 1993. Stewart, C. and Stewart, S. Multiparameter analysis of leucocyte by flow cytometry en Methods in cell biology: Flow Cytometry, Vol. 14, pp. 61-78. Ed. Darzynkiewics, Z., Robinson, J. and Crissman, H., 1994. Visscher, D. and Crissman, J. Dissociation of intact cell from tumor and normal tissue en Methods in cell biology: Flow Cytometry, Vol. 14, pp. 1-13. Ed. Darzynkiewics, Z., Robinson, J. and Crissman, H., 1994.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 44
ANTICUERPOS MONOCLONALES
Mara Ins Becker C. y Alfredo E. De Ioannes I.

1. Introduccin 2. Fundamentos del desarrollo de hibridomas 2.1. Mielomas 2.2. Fusin celular 2.3. Medio de seleccin 3. Etapas de la produccin de hibridomas murinos 3.1. Inmunizacin 3.2. Fusin 3.3. Seleccin y crecimiento 3.4. Subclonacin y congelacin 3.5. Cultivo masivo

4. Anticuerpos monoclonales versus anticuerpos policlonales 4.1. Especificidad 4.2. Avidez y afinidad 5. Aplicaciones de los anticuerpos monoclonales 5.1. Investigacin bsica 5.2. Medicina 5.3. Biotecnologa 6. Otros tipos de hibridomas 6.1. Heterohibridomas 6.2. Hibridomas humanos

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RESUMEN Durante dcadas, uno de los grandes anhelos de los inmunlogos fue producir in vitro, anticuerpos monoespecficos de especificidad predefinida. Sin embargo, su principal problema era que los medios de cultivo disponibles no eran capaces de sustentar el crecimiento de las clulas productoras de anticuerpos. No fue hasta 1975 que George Khler y Csar Milstein publicaron un procedimiento que permita inmortalizar los linfocitos B de ratones previamente inmunizados mediante su fusin con clulas mielomatosas, constituyndose de esta forma un hibridoma (o clon de clulas hbridas) capaz de secretar anticuerpos monoespecficos (monoclonales) al medio de cultivo. Desde entonces, los anticuerpos monoclonales han sido una poderosa herramienta de anlisis en investigacin bsica y aplicada en diversas reas de la biologa y biotecnologa as como tambin en medicina, especialmente en el campo del inmunodiagnstico y la inmunoterapia. Entre las razones de su xito se debe destacar que debido a su monoespecificidad, tienen la capacidad de interactuar con un solo eptopo del antgeno. Adems, como la clula que los secreta es de naturaleza tumoral, brinda la posibilidad de disponer de un anticuerpo homogneo, que no cambia sus propiedades en el tiempo, en cantidades ilimitadas. Entre los aspectos ms relevantes del desarrollo de los hibridomas se encuentra disponer de un procedimiento que permita crecer slo a los hbridos. Con este propsito, se utilizan lneas celulares mielomatosas mutantes, con defectos en la produccin de las enzimas envueltas en la sntesis de novo de nucletidos. En estas condiciones, es posible inducir las vas de rescate de la sntesis de DNA a partir de nuclesidos exgenos como Timidina e Hipoxantina, slo si estn presentes la enzima Timidina Kinasa para las pirimidinas, o la enzima Hipoxantina-GuaninaFosforibosil Transferasa para purinas, respectivamente. Habitualmente, para preparar hibridomas, se utilizan clulas mieloides mutantes para TK o HGPRT que han sido seleccionadas por su sensibilidad a Aminopterina un anlogo del cido flico -inhibidor de la dihidrofolato reductasaque bloquea la sntesis de purinas y pirimidinas. De esta forma, en un medio que contiene Aminopterina slo es posible el crecimiento de los hbridos, que gracias al aporte del linfocito B, poseen todo el panel de enzimas que conforman las vas de rescate de sntesis de DNA y, por lo tanto, pueden utilizar la Hipoxantina y Timidina adicionada al medio de cultivo (medio HAT). El procedimento bsico en el desarrollo de hibridomas secretores de anticuerpos monoclonales murinos se puede resumir en las siguientes etapas: (i) Inmunizacin: se debe desarrollar atendiendo cuidadosamente a las propiedades del antgeno y a los propsitos a los cuales est destinado el anticuerpo; (ii) Fusin: se requiere linfocitos esplnicos de un animal inmunizado y clulas mielomatosas. Como agente fusgeno generalmente se utiliza Polietilnglicol. (iii) Seleccin en medio HAT, para asegurar que slo los hbridos crezcan. En torno a los 14 das post-fusin, se inician las pruebas -ya sea mediante ELISA, aglutinacin, inmunofluorescencia o alguna otra tcnica sencilla- para determinar la especificidad de los sobrenadantes. Posteriormente, todos los microcultivos positivos se expanden a un mayor volumen de medio para continuar con la caracterizacin del anticuerpo; (iv) Subclonacin; procedimiento que se realiza con los hibridomas de inters para asegurar la monoespecificidad del clon y por ende, del anticuerpo que ste secreta; (v) Congelacin: Permite preservar por un tiempo indefinido las lneas de hibridomas en presencia de un medio crioprotector; (vi) Cultivo masivo: permite disponer de mayores cantidades de anticuerpo monoclonal ya sea creciendo el hibridoma en grandes volmenes de medio de cultivo (en frascos o en biorreactores) y tambin, mediante la induccin de tumores secretores de lquido asctico, inyectndo las clulas de hibridoma en ratones singnicos. Por las propiedades de los anticuerpos monoclonales, rpidamente se visualiz su aplicacin en inmunoterapia en humanos, sin embargo, stos, por ser de ratn, son inmunognicos en humanos, razn que impuls el desarrollo de los hibridomas humanos con algunos problemas an no resueltos. Entre los ms importantes estn la fuente de linfocitos B y la ausencia de lneas mielomatosas de humanos con crecimiento estable. Para salvar estos problemas se est utilizando la ingeniera gentica. Es as, como hoy da se dispone de anticuerpos quimricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos que tienen asociadas molculas con funciones no inmunolgicas y fragmentos que contienen las regiones CDR de un anticuerpo unidas por una molcula ligadora

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flexible. Finalmente, para demostrar una vez ms que la creatividad humana no tiene lmites, actualmente es posible ensamblar anticuerpos en la superficie de fagos filamentosos, procedimiento que permitir conocer ms profundamente sobre los mecanismos involucrados en la maduracin de la respuesta inmunolgica de los vertebrados.

1. INTRODUCCIN Desde que Burnet en 1959 postul la teora de la seleccin clonal -donde propone que cada linfocito B o su progenie terminalmente diferenciada, la clula plasmtica, es capaz de producir slo un tipo de inmunoglobulina, cuya regin constante puede modificarse durante la diferenciacin del linfocito pero no as su regin variable, la cual mantiene su singular especificidad- surge en Inmunologa el concepto de monoclonalidad y la idea de producir anticuerpos monoespecficos contra un antgeno conocido. El concepto de monoclonalidad permiti comprender la naturaleza de la enfermedad conocida como mieloma, caracterizada por la transformacin neoplsica de un clon individual del linaje de los linfocitos B, en que todos secretan la misma inmunoglobulina constituyendo as, la primera fuente conocida de anticuerpos monoclonales, aun cuando se desconoce el antgeno. Durante aos, debido a la imposibilidad de cultivar in vitro los linfocitos B, numerosos cientficos intentaron modificarlos experimentalmente para lograr su crecimiento estable, asegurando de esta forma una fuente continua de anticuerpos homogneos. Aplicaron procedimientos tales como la induccin de mielomas en ratn y su posterior crecimiento in vivo o in vitro, a pesar de que no eran antgeno especficos. Tambin ensayaron procedimientos para transformar linfocitos B, con virus Epstein Barr o SV40, que permitieron establecer algunas lneas productoras de anticuerpos monoespecficos, pero con un inconveniente: los secretaban en muy pequeas cantidades. Slo en el ao 1975, Khler y Milstein demostraron que la hibridacin o fusin de dos clulas somticas -entre un linfocito B, que posee la informacin para sintetizar un solo tipo de anticuerpo y una clula de mieloma, que tiene una capacidad ilimitada de proliferacin celular- poda utilizarse para establecer un cultivo continuo de clulas secretoras de anticuerpos monoclonales de especificidad predefinida. Dichas lneas celu-

lares, en adelante denominadas hibridomas, podan mantenerse en cultivo indefinidamente o congelarse y ser luego recuperadas para crecerlas in vitro o in vivo, inyectndolas intraperitonealmente en ratones histocompatibles, donde formaban tumores secretores de lquido asctico enriquecido en el anticuerpo monoclonal original. Por su trabajo al establecer las bases de la metodologa para desarrollar hibridomas, en que se asegura una perpetua fuente de anticuerpos homogneos, Khler y Milstein recibieron el Premio Nobel de Medicina en el ao 1984.

2. FUNDAMENTOS DEL DESARROLLO DE HIBRIDOMAS La preparacin de hibridomas se sustenta en la aplicacin de tres herramientas metodolgicas generadas independientemente por bilogos celulares y genetistas: la induccin de mielomas en ratn, la fusin de clulas somticas y el uso de medios de cultivo in vitro selectivos. 2.1. Mielomas Los mielomas de ratn, inducidos experimentalmente con aceite mineral, segn un procedimiento desarrollado por Potter en 1960, constituyeron un modelo decisivo para estudiar la expresin gentica y la regulacin de la sntesis de inmunoglobulinas, bsicamente, porque estas clulas podan ser trasplantadas in vivo y tambin porque podan crecer continuamente in vitro. Esta ltima propiedad permiti clonarlas para obtener variantes de la secrecin de anticuerpos. Adems, podan ser manipuladas genticamente para obtener mutantes en la estructura de las inmunoglobulinas. El conocimiento surgido de ambas lneas de investigacin, llev a conocer la gentica de las clulas productoras de anticuerpos, cuyos principios se resumen a continuacin: a) Cuando se fusionan dos clulas mieloides productoras de anticuerpos, la expresin de las

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inmunoglobulinas es codominante; es decir, las inmunoglobulinas de las dos clulas parentales son expresadas, lo que sugiere estabilidad en la expresin de los anticuerpos y un control independiente de los genes codificadores de anticuerpos en ambas clulas parentales. b) Cuando una lnea mieloide no productora de anticuerpos se fusiona con una lnea mieloide que s es productora, la produccin de inmunoglobulina no cesa, y tampoco se induce produccin en la variante no secretora. c) Los hbridos producen slo aquellas cadenas de inmunoglobulinas codificadas en las clulas parentales al momento de la fusin, lo cual indica que no se producen nuevas cadenas de inmunoglobulinas. d) Los hbridos de dos clulas parentales productoras de anticuerpos, pueden ensamblar sus cadenas pesadas y livianas en todas las combinaciones posibles, para constituir un anticuerpo completo; aunque lo habitual es que las cadenas parentales se asocien preferencialmente. e) La fusin de clulas de mieloma con otras clulas que no son del linaje de las clulas B, tales como clulas fibroblsticas o epiteliales, inhibe la secrecin de inmunoglobulinas.

en torno a la membrana plasmtica de las clulas permitiendo su aglutinacin. 2.3. Medio de seleccin Para desarrollar hibridomas secretores de anticuerpos monoclonales, fue fundamental disponer de un procedimiento que slo permitiera crecer a los hbridos compuestos de un linfocito B y una clula mieloide. Con este propsito, Khler y Milstein utilizaron un procedimiento desarrollado en el ao 1963 por Littlefield quien aisl, con medios selectivos, lneas celulares fusgenas mutantes, con defectos en la produccin de las enzimas envueltas en la sntesis de novo de nucletidos. Como se esquematiza en la figura 441, en estas condiciones, es posible inducir en las clulas de mamferos las vas de rescate de la sntesis de DNA a partir de nuclesidos exgenos como Timidina (T) e Hipoxantina (H), slo si estn presentes la enzima Timidina Kinasa (TK) para las pirimidinas, o la enzima Hipoxantina-GuaninaFosforibosil Transferasa (HGPRT) para purinas, respectivamente. Para seleccionar lneas mieloides deficientes en alguna de estas dos enzimas, se cultivan en Bromodeoxiuridina (clulas TK negativas) y en 8-Azaguanina o Tioguanina (clulas HGPRT negativas): las clulas as seleccionadas son incapaces de usar la va de rescate en la sntesis de ADN. Para preparar hibridomas, se utilizan clulas mieloides mutantes para TK o HGPRT que han sido seleccionadas por su sensibilidad a Aminopterina (A), un anlogo del cido flico que bloquea la sntesis de novo de purinas y pirimidinas, inhibiendo la enzima dihidrofolato reductasa. De esta forma, en un medio que contiene Aminopterina slo es posible el crecimiento de los hbridos, que gracias al aporte del linfocito B, poseen todo el panel de enzimas que conforman las vas de rescate de sntesis de DNA y, por lo tanto, pueden utilizar la Hipoxantina y Timidina adicionada al medio de cultivo. Las clulas mieloides no fusionadas se mueren y los linfocitos B no fusionados tienen una vida limitada in vitro, pues al no estar transformados, no proliferan y eventualmente tambin mueren. Los compuestos A, H y T componen el medio de seleccin habitual de los hibridomas murinos conocido como medio HAT.

2.2. Fusin celular Como se deduce de los antecedentes expuestos anteriormente, otra herramienta fundamental en el desarrollo de la metodologa de hibridomas fue la posibilidad de realizar fusin de clulas in vitro, en presencia de agentes que promueven la fusin de la membrana plasmtica, para formar hbridos que poseen una comunin de propiedades de las clulas parentales. Los primeros hibridomas secretores de anticuerpos monoclonales se prepararon utilizando como agente fusgeno virus Sendai. Sin embargo, debido a las complicaciones que tiene este tipo de agente, rpidamente se reemplaz por fusgenos como la Isolecitina y el Polietilenglicol (PEG), siendo este ltimo el ms utilizado para desarrollar hibridomas murinos. Aunque el mecanismo de fusin va PEG no est totalmente entendido, se ha postulado que por ser un compuesto altamente hidroflico, absorbe la capa de agua

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3. ETAPAS DE LA PRODUCCIN DE HIBRIDOMAS MURINOS En la figura 44-2 se ilustra las etapas para preparar hibridomas murinos y, a continuacin, se resumen los principales pasos a seguir para que el procedimiento sea exitoso. 3.1. Inmunizacin La obtencin de anticuerpos monoclonales tiles a nuestros propsitos slo se logra si el animal de experimentacin presenta un ttulo adecuado de anticuerpos. Los animales ms frecuentemente utilizados para preparar hibridomas son los ratones, especialmente los de la cepa BALB/c, aunque tambin se han empleado ratas y hamster. Dado que el perodo de inmunizacin puede tomar varios meses, los animales deben presentar buen estado de salud y deben mantenerse en condiciones controladas de higiene, luz, temperatura y alimentacin.

Figura 44-1. Principales vas de rescate envueltas en la sntesis de DNA: Fundamento del medio HAT (Hipoxantina, H; Aminopterin, A; Timidina, T) de seleccin de hibridomas. HGPRT (Hipoxantina-Guanina-Fosforibosil Transferasa), TK (timidina kinasa), PRPP (5-Fosforibosil-1-Pirofosfato)

Figura 44-2. Procedimiento general para desarrollar hibridomas secretores de anticuerpos monoclonales murinos. PEG (Polietilenglicol), HGPRT (Hipoxantina-Guanina-Fosforibosil Transferasa), TK (timidina kinasa), HAT (Hipoxantina, Aminopterin, Timidina)

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Antes de iniciar el perodo de inmunizacin, es preciso analizar las caractersticas del antgeno; entre las ms importantes se encuentran su naturaleza qumica y su tamao molecular relativo, puesto que si se trata de un hapteno, ser necesario acoplarlo qumicamente a una protena transportadora de inmunogenicidad probada. Entre estas protenas, una de las ms utilizadas es la Hemocianina cuya funcin es el transporte de oxgeno en moluscos y artrpodos- extraida de una lapa californiana llamada Keyhole limpet (Megathura crenulata) y se conoce como KLH. Una protena similar, que ha mostrado excelentes resultados es la Hemocianina que se extrae del molusco Loco (Concholepas concholepas). Tambin se debe tener presente la especie de origen del antgeno y su grado de conservacin. Si es una protena de ratn, difcilmente ser inmunognica en esta especie, a menos que se trate de un antgeno de diferenciacin o de antgenos tumorales. La solubilidad y toxicidad del antgeno deben ser consideradas. Debido a la diversidad de antgenos, no es posible definir a priori un protocolo de inmunizacin comn para todos, siendo lo habitual administrar al menos dos dosis del antgeno espaciadas por 15 a 30 das. Si el antgeno tiene un alto grado de pureza y es suficientemente inmunognico, son necesarias dosis en torno a 50 ug. Sin embargo, es recomendable el uso de coadyuvantes, quienes aportan seales de peligro necesarias para activar vigorosamente la respuesta inmune innata y adaptativa. El ms utilizado en animales de experimentacin es el coadyuvante completo de Freunds -consiste de una emulsin de aceite en agua que adems contiene Micobacterium atenuado- que se emplea en la primera inyeccin de antgeno. En posteriores inmunizaciones, se utiliza el mismo coadyuvante pero incompleto, es decir sin Micobacterium. Unos diez das despus de cada inmunizacin, es aconsejable tomar una muestra de suero de los animales de experimentacin y verificar la presencia de anticuerpos contra el antgeno usando una tcnica sencilla, como ELISA, IFI o aglutinacin. Si el ttulo de anticuerpos es bajo, se administra un par de inyecciones ms con el antgeno en coadyuvante incompleto, en dosis y tiempos similares a los descritos anteriormente. Si el ttulo de anticuerpos es adecuado, bastar una inyeccin de refuerzo con una dosis de unos 100 g de antgeno en solucin por va endovenosa, 3 a 4 das antes de la fusin somtica .

3.2. Fusin Habitualmente, alrededor de una semana antes de la fusin somtica para preparar hibridomas, se descongela un inculo de clulas y se mantiene en crecimiento exponencial (ms o menos 500.000 clulas/ml) para asegurar una alta viabilidad y eficiencia de fusin. En la tabla 44-1 se muestra algunas de las lneas que se han utilizado para preparar hibridomas de diversas especies animales. En cuanto a la seleccin de la lnea mieloide parental a utilizar, el ideal es que no sea secretora de inmunoglobulina. Actualmente para hibridomas de ratn, las ms usadas son las lneas NSO/2 y SP2/0 -ambas deficientes en enzima HGPRT- por su crecimiento estable y buena eficiencia de fusin. Como se seal anteriormente, la fusin se realiza entre 3 y 4 das despus de la ltima inyeccin de antgeno, para disponer de suficientes linfoblastos, que corresponden al estado de diferenciacin en que los linfocitos B presentan la mejor capacidad de fusin, probablemente por sus caractersticas de activa proliferacin similares a las de las clulas mieloides, lo que permitira una mejor integracin del material nuclear. No se debe olvidar que los hibridomas son tetraploides y que, dado que su constitucin ocurre totalmente al azar, es frecuente la prdida de cromosomas, lo que se traduce en inestabilidad e incapacidad de crecer; esto explica en parte el bajo rendimiento de dicha metodologa. Aproximadamente el 1% de las clulas utilizadas se fusionan y slo 1 de cada 10.000 forma hbridos viables. El bazo es el rgano utilizado de preferencia para las fusiones somticas por su fcil acceso, menores riesgos de contaminacin en comparacin con los ganglios o placas de Peyer y por el elevado nmero de linfocitos B que concentra (en torno a 108 linfocitos/bazo). Antes de la fusin, las clulas mieloides y los linfocitos esplnicos se mezclan y se lavan rigurosamente para eliminar el suero fetal que se adiciona a los medios de cultivo, porque ste inhibe la accin del PEG. Se debe tener especial cuidado en la eleccin de este compuesto, ya que su origen y pureza son determinantes para la eficiencia de la fusin. PEG, en un rango de peso entre 4000 y 6000 es el ms aconsejable, ya que el PEG de bajo peso molecular es altamente txico para las clulas. En nuestra experiencia, PEG 4.000 a temperatura ambiente, a pH 7,2 en amortiguador fosfato glucosado, a una concentracin del 50%, presenta ptimos resultados, es decir, un rendi-

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Tabla 44-1. Antisueros convencionales versus Anticuerpos Monoclonales Caracterstica Composicin Antisueros Heterognea: contiene anticuerpos diferentes para diferentes eptopos de un antgeno. Reconocen varios eptopos de un antgeno. Variable, depende del animal y la sangra. Reacciones cruzadas parciales. Variable, depende del grado de inmunizacin. Es esencial Hasta 1 mg/mL Monoclonales Homognea: contiene un solo anticuerpo

Reconocimiento antgeno Especificidad

Reconocen un solo eptopo del antgeno. Estndar Mnimas reacciones cruzadas. Se selecciona Hasta un 20% Hasta 100 g/mL en el sobrenadante de cultivo. Hasta 20 mg/mL en asctico Ninguna en cultivo in vitro Ilimitada, es producido por clulas tumorales.

Afinidad Pureza del antgeno Rendimiento de anticuerpo til Inmunoglobulinas contaminantes Duracin

Hasta un 100% Hasta que se acaba el suero del animal

miento en torno a 2.000 hibridomas cuando se utilizan 108 linfocitos esplnicos y 2,5 x 107 clulas mieloides. 3.3. Seleccin y crecimiento La suspensin de clulas resultantes de una fusin somtica se siembra en placas de micropozos en medio de seleccin HAT, que permite slo el crecimiento de los hbridos. Dentro de los 10 a 14 das siguientes, los clones alcanzan un tamao suficiente -visible a simple vista- para iniciar la seleccin primaria de los hibridomas de inters. Debido al escaso volumen de medio de las placas de multipozos y a la activa proliferacin de los hbridos -con un ciclo celular de alrededor de 10 horas- la seleccin debe hacerse con una tcnica sencilla y rpida para expandirlos a un mayor volumen de medio; de este modo, se asegura que continen su crecimiento y tambin se dispone de mayor cantidad de medio de cultivo

enriquecido en el anticuerpo de inters, para determinar sus propiedades. Para realizar la seleccin primaria de los hibridomas las tcnicas ms utilizadas son los ensayos tipo ELISA, ya sea directos, de captura o de competencia. En nuestra experiencia, se debe tener especial cuidado al elegir la tcnica para realizar la seleccin primaria de los hibridomas, porque si sta no es la adecuada se pierde tiempo, esfuerzo y recursos. A modo de ejemplo. Si se quiere obtener anticuerpos de alta afinidad (sobre 108 M-1), lo ms aconsejable ser la seleccin por ELISA o RIA y no por aglutinacin, en que la avidez de un anticuerpo prima por sobre su afinidad. Actualmente, existen herramientas ms poderosas y sensibles para seleccionar los hibridomas secretores de anticuerpos de inters, como por ejemplo se puede utilizar un equipo separador de clulas activado por fluorescencia (FACS). En este caso, el antgeno marcado con un fluorocromo se agrega a las clulas fusionadas y aquellas que ex-

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presen en su superficie el anticuerpo blanco pueden ser separadas desde la mezcla de clulas resultantes de la fusin. Para un buen crecimiento de los hibridomas los factores ms crticos son la calidad del medio de cultivo -que debe ser rico en glucosa, porque los hbridomas utilizan la va glicoltica como fuente de energa- y la del suero fetal de bovino, que se agrega descomplementado. Es aconsejable probar los sueros antes de realizar una fusin. Con este propsito se utiliza el procedimiento conocido como eficiencia de clonacin, que consiste en sembrar mediante dilucin lmite clulas mieloides y determinar la capacidad del suero de sustentar el crecimiento de las clulas en las diluciones mayores (1 a 0,1 clulas /pozo). Para asegurar un mejor crecimiento de los hibridomas, el medio de cultivo se puede enriquecer con una suspensin de clulas de bazo de un animal histocompatible no inmune, las que prcticamente no crecen, pero aportan al medio factores de crecimiento, interleuquinas e intermediarios metablicos. 3.4. Subclonacin y congelacin Una vez que se tiene un hibridoma de inters, se debe proceder rpidamente a su reclonacin por dilucin lmite para asegurar la monoespecificidad de la lnea celular, puesto que es probable que al sembrar la suspensin de clulas resultantes de la fusin, caiga por azar ms de un hbrido por pozo. Si un hbrido secretor de anticuerpos est mezclado con uno no secretor y de mayor tasa de proliferacin, se perder en el tiempo el hibridoma secretor y por lo tanto, se perder el anticuerpo monoclonal. Para asegurar la preservacin de una lnea de hibridomas, es importante congelar inculos de clulas representativos de cada una de las etapas de su crecimiento, esto es, clulas parentales (pre-subclonamiento) y de los reclones. Con este propsito, se preparan inculos con una concentracin de clulas totales en torno a 1 2 millones, en presencia de una mezcla crioprotectora, siendo ptima la mezcla compuesta por un 10% de DMSO y un 90% de suero fetal de bovino. Las clulas as tratadas se mantienen indefinidamente en estanques con N2 lquido. 3.5. Cultivo masivo Los hibridomas pueden ser cultivados in vivo,

en la cavidad peritoneal de ratones histocompatibles o irradiados, previamente tratados con aceite mineral para inducir la formacin de plasmacitomas. En estas condiciones, se alcanzan concentraciones de anticuerpo de hasta 20 mg/ ml a diferencia de un sobrenadante de cultivo in vitro, en que se obtienen concentraciones entre 20 y 50 g/ml. Si se precisa aumentar la concentracin de anticuerpos obtenidos in vitro, los hibridomas deben crecer en biorreactores, los cuales pueden ser del tipo de los fermentadores, en que las clulas se crecen en suspensin con agitacin -individuales o formando acmulos, encapsuladas en microesferas- o sistemas en que son empacadas e inmovilizadas en columnas de fibra hueca de material semipermeable.

4. ANTICUERPOS MONOCLONALES VERSUS ANTICUERPOS POLICLONALES En la tabla 44-2 se presenta una comparacin de algunas caractersticas de los anticuerpos monoclonales con respecto a los antisueros convencionales -tambin denominados anticuerpos policlonales- y a continuacin se comenta los aspectos ms destacables. 4.1. Especificidad Un anticuerpo monoclonal, por su naturaleza monoespecfica, es capaz de interactuar con un solo eptopo de un antgeno; en cambio, un antisuero convencional, debido a su naturaleza policlonal, contiene no slo anticuerpos que pueden interactuar con varios eptopos de un antgeno, sino que tambin, contiene una familia de anticuerpos que difieren en estructura, afinidad y avidez, los que compiten por unirse a cada eptopo del antgeno, como se ilustra en la figura 44-3. Adems, no se puede dejar de mencionar que en los sueros convencionales tambin estn presentes los anticuerpos que constituyen la inmunidad humoral natural del animal del cual se obtuvo. Por lo tanto, es posible que se produzcan reacciones cruzadas de los anticuerpos, difciles de eliminar, cuando se trata de antgenos similares que comparten numerosos eptopos o cuando se trata de antgenos diferentes con un eptopo en comn, o muy similar. Este problema puede evitarse con el uso de anticuerpos monoclonales seleccionados por su capacidad de unirse a un eptopo exclusivo de un antgeno. Un ejemplo de esta exquisita es-

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Tabla 44-2. Lneas celulares inmortales usadas como parentales para constituir hibridomas Especie Lnea celular Fenotipo Celular Expresin de Ig No No No IgG1() No IgE () IgG() no secretor IgG() IgG2() IgG2()

Ratn

X653 NS0/2 SP2/0 NS1 Y3-Ag 1.2.3. YB2/0 SK007 RH-L4 GM1500 KR4

Mieloma Mieloma Mieloma Mieloma Mieloma Mieloma Mieloma Linfoblastoide Linfoblastoide Linfoblastoide Mieloma hbrido

Rata Humana

Humana/ratn

SHM-D33

pecificidad es el caso de los anticuerpos monoclonales que permiten discriminar entre el grupo sanguneo A y B de humanos, donde la nica diferencia en el trisacrido que constituye el determinante antignico de cada grupo est constituida por un azcar, N-acetilgalactosamina y Galactosa, respectivamente.

Sin embargo, existen algunos casos en que la especificidad de los anticuerpos monoclonales puede ser cuestionada, por presentar reacciones cruzadas mayores que las observadas con un antisuero convencional, lo que enfatiza la importancia de los procedimientos de seleccin y caracterizacin de los anticuerpos monoclonales. Es

Figura 44-3. Heterogeneidad de anticuerpos presentes en el antisuero de un mamfero. El antgeno esquematizado tiene los eptopos A, B, C y D. En el eptopo A se pueden unir dos anticuerpos de la misma clase pero de diferente especificidad y afinidad. En el eptopo B se pueden unir dos anticuerpos de diferente clase, especificidad y afinidad. En el eptopo C se pueden unir dos anticuerpos de diferente clase pero de la misma afinidad y especificidad y, en el eptopo D, se pueden unir dos anticuerpos de diferente clase pero de la misma especificidad y afinidad.

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posible que un anticuerpo muestre reaccin cruzada con un eptopo presente en un antgeno que no fue considerado al realizar los estudios de especificidad de dicho anticuerpo. Por ejemplo, en el caso de dos glicoprotenas que comparten una secuencia oligosacrida; si el anticuerpo monoclonal reconoce esta regin, es posible observar un 100% de reaccin cruzada; en cambio, con el antisuero convencional, que contiene anticuerpos dirigidos contra los eptopos no comunes de ambas glicoprotenas, la reactividad cruzada ser menor. Tambin es posible que un anticuerpo monoclonal totalmente especfico con un antgeno en un tipo de ensayo dado, muestre reactividad cruzada con otro al ser utilizado en otro tipo de ensayo, especialmente si la sensibilidad de las tcnicas es diferente. Un ejemplo de este fenmeno se observa en algunos anticuerpos monoclonales dirigidos contra la hormona Gonadotrofina Corinica humana (hCG), compuesta por dos subunidades: y . En ensayos de aglutinacin indirectos, cuando se hace reaccionar a estos anticuerpos con partculas de ltex recubiertas con hCG, se produce una reaccin de aglutinacin altamente especfica, ya que, aunque se agreguen elevadas concentraciones de hormona Luteinizante humana (hLH) que comparte la subunidad con hCG, no se observa inhibicin de la aglutinacin, pero s se observa al agregar las mismas concentraciones de hCG. Sin embargo, los mismos anticuerpos se unen a ambas hormonas en ensayos tipo ELISA directo. 4.2. Avidez y Afinidad La avidez y afinidad de un antisuero es una propiedad promedio del conjunto de anticuerpos especficos que lo componen, sin embargo, los anticuerpos monoclonales responden a las caractersticas de un nico componente, cuya avidez y afinidad depender del grado de inmunizacin del animal de experimentacin utilizado como fuente de linfocitos B y del mtodo de seleccin utilizado durante su preparacin. Un ejemplo ilustrativo de esta informacin se encuentra en el desarrollo de anticuerpos monoclonales para tipificar grupos sanguneos humanos mediante aglutinacin. Los anticuerpos aglutinantes por excelencia, son los que se producen masivamente en la respuesta primaria contra un antgeno y que corresponden a la clase IgM, cuyas caractersticas fundamentales son su gran tamao y gran avidez. Pues bien, slo

se logra un nmero significativo de hibridomas secretores de anticuerpos monoclonales de tipo IgM cuando se realizan protocolos de inmunizacin cortos, sin estimulaciones reiteradas con el antgeno para evitar una maduracin de la respuesta hacia IgG. En cuanto a la seleccin, si se desea anticuerpos aglutinantes, la seleccin por ELISA no ser apropiada porque el antgeno se presenta en otra configuracin, lo que se demuestra al constatar que la mayora de los anticuerpos seleccionados por ELISA no presentan caractersticas aglutinantes. Finalmente, se pueden preparar mezclas de dos o ms monoclonales de especificidad conocida, lo que se denomina reactivo oligoclonal. En ellas es posible combinar y potenciar las caractersticas individuales de avidez y afinidad de cada uno de los anticuerpos monoclonales que la componen.

5. APLICACIONES DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES 5.1. Investigacin bsica La metodologa de hibridomas ha sido una herramienta insustituible para el avance cientfico -tecnolgico en el campo de la Biologa, bsicamente por su alto grado de especificidad y porque al aislar varios anticuerpos monoclonales especficos para diferentes eptopos de un antgeno, se puede conocer la estructura y funcin de diferentes partes de una molcula o tipos celulares. Por ejemplo, se han usado en la purificacin y caracterizacin de receptores de hormonas y factores de crecimiento, con sus respectivos ligandos; en el estudio de vas metablicas y las enzimas involucradas; en el estudio de la estructura y funcin de numerosas protenas; en el conocimiento de la organizacin del citoesqueleto y de la matriz extracelular; en el desarrollo embrionario de diversos organismos, permitiendo identificar antgenos de diferenciacin; en la clasificacin y caracterizacin de numerosas bacterias y sus toxinas; en la caracterizacin de protenas de virus que infectan humanos; y as, la lista podra extenederse largamente. Sin embargo, uno de los campos de la biologa donde los hibridomas secretores de anticuerpos monoclonales han tenido mayor impacto ha sido en el estudio del sistema inmune al permitir, por ejemplo, conocer los mecanismos genticos

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involucrados en la generacin de la diversidad de los anticuerpos, en la caracterizacin del microambiente tmico y, especialmente, en el anlisis del linaje de las clulas B y T mediante la identificacin de marcadores de superficie especficos. stos han permitido reconocer, aislar y cuantificar subpoblaciones celulares, como en el caso de los anticuerpos monoclonales anti-CD3, anti-CD4 y anti-CD8, adems de un conjunto de otros marcadores. Es importante mencionar tambin, el desarrollo de numerosos anticuerpos monoclonales especficos contra molculas del Complejo Principal de Histocompatibilidad de clases I y II. Entre los aspectos de activa investigacin con los anticuerpos monoclonales, se encuentra su uso en la construccin de biosensores y tambin la posibilidad de utilizarlos como enzimas, de ah su denominacin como anticuerpos catalticos. Se han producido anticuerpos monoclonales especficos de haptenos, que tienen capacidad cataltica en ciertas reacciones que son caracterizadas por estados de transicin semejantes a las formas estables del hapteno, tanto por su geometra molecular como carcter electrnico. Este tipo de anticuerpos tienen un potencial ilimitado de aplicacin en qumica y biomedicina. Por ejemplo, ellos podran proteger clulas normales de quimiotoxicidad o activar pro-drogas en el sitio blanco. 5.2. Medicina Los anticuerpos monoclonales han permitido un espectacular avance en la medicina a travs del conocimiento de los mecanismos moleculares de numerosas patologas. Poco despus de su creacin, los anticuerpos monoclonales murinos fueron utilizados en el diagnstico clnico en humanos, en aspectos como la determinacin de hormonas, enzimas, antgenos de grupos sanguneos y de histocompatibilidad, monitoreo de drogas teraputicas, antgenos relacionados con enfermedades infecciosas y tambin en la identificacin de marcadores tumorales, entre otros. Por las propiedades de los anticuerpos monoclonales, muy pronto se visualizaron las posibles aplicaciones teraputicas de los anticuerpos monoclonales, que se pueden resumir bsicamente en: a) Anticuerpos monoclonales inmunosupresivos, para el tratamiento de enfermedades autoinmunes

y para la prevencin del rechazo de trasplantes. Entre esta familia de anticuerpos, se destaca el anticuerpo anti-CD3 denominado OKT3, que ha sido extensamente utilizado en pacientes trasplantados y que fue uno de los primeros anticuerpos de ratn humanizado por las razones que explicaremos ms adelante en este captulo. Ms recientemente, se ha desarrollado un anticuerpo monoclonal murino, denominado anti-Tac, contra un receptor particular de Il-2, Il-2R. Este receptor no se encuentra en clulas normales, se expresa en una poblacin de clulas T envueltas en rechazo de trasplantes, en clulas T que median enfermedades autoinmunes y tambin, en ciertas leucemias y linfomas producidos por el retrovirus HTVL-I. El monoclonal anti-Tac ha sido humanizado (Hu-anti-Tac), siendo utilizado exitosamente en la inmunoterapia de algunas leucemias adultas muy agresivas producidas por el virus HTVL-1. Se postula que el anticuerpo previene la interaccin de Il-2 con Il2R+llevando a una deprivacin de la citoquina que induce a la muerte de la clula tumoral por apoptosis. b) Anticuerpos monoclonales para el tratamiento de infecciones bacterianas, que inhiben la acumulacin de neutrfilos y as se reduce el dao tisular, por ejemplo, en la meningitis y la injuria por reperfusin del miocardio. Recientemente, se han patentado anticuerpos para la prevencin de la infeccin respiratoria producida por el virus sincitial y tambin para prevenir la infeccin por citomegalovirus en trasplantados renales. c) Anticuerpos monoclonales para el tratamiento del cncer, dirigidos contra antgenos tumorales especficos. Por ejemplo, en el caso del antgeno c-erb B-2 (tambin conocido como HER-2/neu) sobre-expresado en ciertos carcinomas gstricos, pulmonares, mamarios y de prstata, se ha desarrollado un anticuerpo humanizado que contiene las regiones determinantes de complementariedad de un anticuerpo monoclonal murino que se une a Her-2/neu, mejorando significativamente la eficacia de la quimioteraopia con Taxol y Doxorubicina d) Anticuerpos que se pueden utilizar en la forma inmunotoxinas, es decir, anticuerpos a los cuales se les adiciona potentes toxinas de plantas o bacterias -como la Ricina, presente en Ricinus communis y Abrus precatorius o la exotoxina

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diftrica de Coynebacterium diphtheriae-- para que destruyan selectivamente las clulas que expresan dichos antgenos. e) Monoclonales como sondas para la localizacin de tumores y metstasis cuando se les acopla radioistopos de corta vida media, permitiendo una evaluacin dosimtrica precisa de la radioterapia. 5.3. Biotecnologa La incorporacin de la tecnologa de hibridomas a la investigacin, desarrollo y fabricacin de vacunas y especialmente de reactivos de inmunodiagnstico -clsicamente preparados con sueros convencionales- produjo una gran revolucin, al simplificar enormemente los procedimientos de produccin y control de calidad, ya que las propiedades de un anticuerpo monoclonal no cambian en el tiempo; adems, porque han permitido desarrollar test de diagnstico de mayor especificidad. Por otra parte, su incorporacin en numerosos procesos productivos de la industria farmacutica, alimenticia y petroqumica, entre otras, han simplificado y rebajado los costos de procesos conducentes a la purificacin de nume-

rosas molculas de inters, con la ventaja de un mejor rendimiento: a diferencia de muchos procesos qumicos de purificacin, los antgenos separados mediante columnas de afinidad con anticuerpos monoclonales mantienen mejor su actividad. 6. OTROS TIPOS DE HIBRIDOMAS 6.1. Heterohibridomas Al fusionar un hibridoma secretor de anticuerpos contra un antgeno, con otro hibridoma o con linfocitos B de un animal inmunizado contra otro antgeno, se obtiene un heterohibridoma que secreta anticuerpos bifuncionales, capaces de interactuar con dos antgenos diferentes, como se ilustra en la figura 44-4. Este procedimiento fue aplicado pioneramente por Cuello y Milstein para preparar un anticuerpo que se una a Peroxidasa y a Somatostatina y se utiliz para la deteccin inmunohistoqumica de Somatostatina. Se prepar fusionando un hibridoma de ratn productor de un monoclonal anti-peroxidasa y linfocitos esplnicos de una rata inmunizada con Somatostatina acoplada a Tiroglobulina.

Figura 44-4. Produccin de anticuerpos bifuncionales. A: Fusin de dos hibridomas o de un hibridoma y un linfocito B. B: Reasociacin qumica de fragmentos de anticuerpos diferentes. C: agregacin qumica de anticuerpos completos.

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Los anticuerpos bifuncionales se pueden producir tambin por reasociacin qumica de fragmentos monovalentes de anticuerpos, con una desventaja, es muy difcil disociar cadenas de inmunoglobulinas sin provocar algn grado de desnaturacin, con la consiguiente prdida de actividad del anticuerpo. Sin embargo, un mtodo alternativo para evitar estos problemas, consiste en acoplar anticuerpos completos, como se muestra en la figura 44-4. 6.2. Hibridomas humanos Las principales razones que impulsaron el desarrollo de los hibridomas secretores de anticuerpos monoclonales humanos fueron las siguientes: En primer lugar, los anticuerpos murinos no son compatibles con los humanos y por lo tanto, inducen una xenosensibilizacin en los pacientes: estos producen, por una parte, anticuerpos antiidiotpicos que disminuyen la eficiencia teraputica del anticuerpo monoclonal, al neutralizar el sitio de combinacin con el antgeno; por otra parte, tambin producen anticuerpos anti-isotipo, los cuales aparentemente neutralizan y eliminan de la circulacin los anticuerpos teraputicos, especialmente en el caso de las IgG. En segundo lugar, para algunos antgenos humanos los ratones no tienen repertorio, lo que provoca la ausencia de respuesta inmune humoral o la produccin de anticuerpos de muy baja afinidad. Tal es el caso de los antgenos del sistema Rh de grupo sanguneo humano. En tercer lugar, la necesidad de substituir o reforzar las fracciones globulnicas de uso teraputico rutinario, especialmente debido a la posible contaminacin de las preparaciones convencionales de anticuerpos humanos con virus como el del SIDA y de la Hepatitis B y C. Finalmente, los anticuerpos monoclonales humanos permitirn conocer las particularidades de la respuesta inmune humana y ciertos aspectos de la estructura antignica no percibidos por otros animales. Aunque el problema de la xenosensibilizacin se controla en parte con drogas inmunosupresivas, la aproximacin radical a este problema surgi gracias al avance de la ingeniera gentica y a las tcnicas de biologa molecular, puesto que la produccin de hibridomas humanos presenta serios problemas, entre los que se debe destacar: 1. La fuente de clulas B; a diferencia de los ratones, los humanos no pueden ser inmunizados repetidamente con un antgeno, por lo tanto, los hibridomas humanos se preparan con

linfocitos B perifricos o drenados desde los ndulos linfticos. 2. La inmunizacin de humanos con la mayora de los antgenos no es ticamente posible. 3. Las lneas mieloides humanas no son tan estables como las de ratn. Muchas de ellas no son verdaderos mielomas y carecen de suficiente retculo endoplsmico, mitocondrias y aparato de Golgi para una alta produccin y secrecin de anticuerpos. Frente a todos los problemas sealados anteriormente, la estrategia bsica de la ingeniera gentica ha consistido en redisear las partes inmunognicas de la molcula de anticuerpo y actualmente, ha llevado a la construccin de los diversos tipos de anticuerpos que se muestran en la figura 44-5. stos son: Los anticuerpos de tipo quimrico, en los cuales la regin variable de ratn es combinada genticamente con una regin constante humana para conservar las funciones efectoras del anticuerpo; los anticuerpos de ratn humanizados, en que se trasplantan las regiones responsables del reconocimiento antignico del ratn (regiones CDR) en un anticuerpo humano; los anticuerpos con funciones adicionales no inmunes, a los cuales se les puede acoplar una droga o una toxina y, finalmente, los fragmentos Fv en que las regiones variables de la cadena liviana y pesada del anticuerpo -que conforman el sitio activo del anticuerpo- son producidas en bacterias y posteriormente se unen mediante una molcula ligadora sinttica, para mantener la conformacin de la regin de reconocimiento antignico. Estos anticuerpos, son potencialmente los menos inmunognicos y, por su pequeo tamao, tienen la capacidad de penetrar los tejidos del cuerpo que normalmente son restrictivos para molculas de mayor tamao. Otra forma de producir anticuerpos monoclonales alternativa a los hibridomas, es mediante genotecas de expresin en fagos filamentosos denominados anticuerpos coliclonales- como se ilustra en la figura 44-6. Se preparan a partir de una genoteca de expresin de mRNA de bazo de animales normales o inmunes. Utilizando partidores especficos, se obtiene el cDNA correspondiente a las regiones variables (Fv) de los anticuerpos representados en el mRNA esplnico, los que son ligados a un cosmidio que contiene la informacin gentica del fago filamentoso y permite la expresin de la informacin gentica para las regiones variables de una cadena liviana y una pesada insertadas aleatoriamente. Una vez generados los cosmidios, se reconstituyen las partcu-

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Figura 44-5.Tipos de anticuerpos construidos mediante ingeniera gentica. A: Anticuerpo quimrico, contiene las regiones variables de ratn y las regiones constantes de humano. B: Anticuerpo humanizado, se han reemplazado las secuencias gnicas que codifican para las regiones que unen antgeno (CDR) de un anticuerpo humano, por las regiones CDR de un anticuerpo de ratn. C: Anticuerpo con funciones adicionales no inmunes, en el cual los dominios CH2 y CH3 de la regin constante se han substituido por un gen no relacionado con inmunoglobulinas, que puede ser una droga o toxina. D: Fragmento Fv de un anticuerpo producido por la transformacin de bacterias con un plasmidio que contiene los genes de las regiones variables de la cadena liviana y pesada (VL y VP) en tndem, separadas por una secuencia codificadora de una molcula ligadora flexible (U), que le permite la formacin adecuada del sitio de combinacin con el antgeno y le confiere mayor flexilidad al fragmento.

las virales para su posterior amplificacin en bacterias. Los fagos recombinantes expresan en su superficie en forma funcional los fragmentos Fv y de esta manera, es posible seleccionar en forma rpida y eficiente las especificidades presentes en la genoteca. Adems, con esta tecnologa es posible disponer de las regiones del DNA que codifica para las partes variables de los anticuerpos presentes en la genoteca, lo que permite reinsertar los genes que codifican para las partes variables de los coliclonales seleccionados en plasmidios que expresan las regiones constantes de cualquier clase de anticuerpo. La metodologa sealada anteriormente, a diferencia de la preparacin de hibridomas tradicionales, puede ser aplicada a cualquier especie animal

con el solo requisito de disponer de los partidores adecuados. Sin embargo, una limitante importante de este procedimiento es que en la genoteca de expresin no ocurre el proceso de hipermutacin somtica que ocurre naturalmente en los animales despus de una inmunizacin y que contribuye al aumento de la afinidad de los anticuerpos en la respuesta inmune humoral secundaria. Este problema puede ser solucionado utilizando para construir la genoteca mRNA de animales hiperinmunizados. Actualmente, se investiga activamente en los mecanismos involucrados en la hipermutacin somtica de los genes de inmunoglobulinas, con el propsito de reproducir este proceso a nivel de las genotecas de expresin para lograr la maduracin de la afinidad de los anticuerpos in vitro.

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Figura 44-6. Anticuerpos monoclonales preparados en bacterias. En la parte superior de la figura se muestra un elemento representativo de la genoteca recombinante: el vector, que corresponde a la partcula del bacteriofago filamentoso conteniendo una molcula de DNA circular de simple hebra con informacin para las protenas estructurales del fago y sus elementos de regulacin. En un extremo de la partcula, se encuentran clonadas copias de la protena menor de la cubierta del fago, codificada por el gen 3 y en su extremo 5 han sido insertados los genes que codifican para las regiones variables del anticuerpo (VH y VL). De esta forma, la secuencia seal natural del gen 3 es retenida y por lo tanto, la protena de fusin madura tiene el dominio N-terminal del anticuerpo seguido por la protena completa del gen 3. Esta protena de fusin es ensamblada en la partcula del fago, el cual presenta los fragmentos de anticuerpo sobre su superficie, de la forma que se muestra en el esquema inferior de la figura. Los anticuerpos pueden ser expresados en la forma de cadenas simples (Fvs) en que VH y VL se unen va un pptido ligador flexible o como Fabs, uniendo ya sea VH-CH1 o la cadena liviana al gen 3 y expresando la cadena parental en forma soluble. Los anticuerpos expresados de esta forma, mantienen las caractersticas de unin del anticuerpo original y debido a la exposicin del sitio de unin hacia el medio, permiten su seleccin por cromatografa de afinidad con el antgeno de inters.

LECTURAS SUGERIDAS Bach, J.B.; Fracchia, G.N.; Chatenoud, L. Safety and efficacy of therapeutic monoclonal antibodies in clinical therapy, Immunology Today 14: 421 425, 1993. Becker, M.I.; Juica, F.; Jamett, S.; Tzichinovsky, S.; Barros, S.; De Ioannes, A.E., Development of anti-human B blood group monoclonal antibodies suitable for blood typing reagent, Hybridoma 13: 304 310, 1994.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 45
MTODOS FUNDAMENTALES DE BIOLOGA MOLECULAR
Claudio Vsquez G. y Enrique Gonzlez V.

1. Introduccin 2. Bases de la Biologa Molecular 2.1. El DNA es el material gentico 2.2. Componentes del DNA 2.3. Estructura del DNA 3. Las nuevas tecnologas 3.1. Endonucleasas de restriccin 3.2. Clonamiento del DNA 3.3. Transferencia de Southern 3.4. Transformacin de clulas 3.5. Secuenciacin de DNA 3.6. Reaccin de la polimerasa en cadena 3.7. Animales transgnicos y knock out de genes 4. La expresin gnica en organismos eucariticos 4.1. Estructura de los genes eucariticos

4.2. El proceso de expresin gnica y sus etapas 4.3. La expresin diferencial de genes y su regulacin 5. Mtodos de anlisis de la expresin gnica 5.1. Hibridacin Northern 5.2. Reaccin de la polimerasa en cadena acoplada a la reaccin de la transcriptasa reversa (RT-PCR) 5.3. Anlisis del perfil transcripcional mediante el mtodo de differential display de mRNAs 5.4. Hibridacin sustractiva

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RESUMEN Difcilmente existe una molcula ms importante que el DNA. Ella tiene codificada en su estructura la informacin hereditaria que determina cmo son, cmo se reproducen y cmo funcionan los organismos vivos. Desde este punto de vista, podemos considerarla la molcula de la vida. El desarrollo de tcnicas de DNA recombinante y su aplicacin a la biologa, ha trado consigo una revolucin de conocimientos que ha hecho que la gente de ciencia se replantee una serie de conceptos acerca del conocimiento que se tiene de los organismos vivos en general. Prcticamente no existen hoy reas de la biologa experimental moderna que no descansen de cierto modo en alguna de estas nuevas tecnologas. Dado que la investigacin cientfica en las ciencias de la vida est sujeta a una dinmica continua, sin duda que este tipo de aproximaciones (y con seguridad otras por desarrollar) ayudarn a entender mejor el enigma del fenmeno vital.

1. INTRODUCCIN Las Ciencias Biolgicas han sufrido una verdadera revolucin durante las ltimas dcadas. Esto se ha debido, principalmente, al desarrollo de una serie de metodologas que han permitido una mejor aproximacin experimental, para estudiar y comprender los mecanismos y/o estructuras moleculares subyacentes a complejos procesos como el crecimiento, metabolismo, diferenciacin y divisin de la clula. Estas tcnicas adems han posibilitado manipular y modificar in vitro molculas claves que se encuentran involucradas en dichos procesos. Esto ltimo es importante, pues de este modo se puede correlacionar la estructura y funcin de estas molculas al observar los cambios que ocurren en un organismo particular cuando se han reincorporado a l molculas que han sido alteradas en el tubo de ensayo. En forma resumida se describirn los mtodos fundamentales de la Biologa Molecular. Antes se har una breve resea de la molcula de DNA.

codifican la informacin gentica que especifica la estructura primaria de todas las protenas de un organismo vivo. Desde este punto de vista, la unidad fundamental de informacin de los organismos vivos es el gen, definido como aquel segmento de DNA que codifica la informacin necesaria y requerida para producir un producto biolgico funcional. Este ltimo puede ser tanto una protena como una molcula de cido ribonucleico particular. Los procesos ms importantes que dan cuenta de la utilizacin de la informacin gentica por parte de la clula, estn enmarcados en el llamado Dogma Central de la Biologa Molecular, el cual resume las rutas generales de flujo de informacin a travs de los complejos procesos celulares de replicacin, transcripcin y traduccin (figura 45-1).

2. BASES DE LA BIOLOGA MOLECULAR Entre los actores macromoleculares ms importantes de la clula se encuentran los cidos nucleicos (DNA y RNA) y las protenas. Ellos son polmeros lineales compuestos por subunidades nucleotdicas y aminoacdicas, respectivamente. Los cidos nucleicos

Figura 45-1. El Dogma Central de la Biologa Molecular. El DNA se replica obtenindose una copia idntica, se transcribe a mRNA y se traduce en una protena en los ribosomas.

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2.1. El DNA es el material gentico Entre las numerosas propiedades de los organismos vivos, hay una que es esencial para la continuacin de la vida: un organismo debe ser capaz de replicarse y para hacerlo, debe poseer una descripcin completa de s mismo. Esta descripcin es una forma de informacin, un conjunto de instrucciones que especifican cada paso necesario para que la clula construya una rplica idntica de s misma. Como cada generacin engendra la siguiente, los descendientes han de recibir una copia del conjunto de instrucciones para que a su vez, puedan replicarse. En una clula, la informacin necesaria para replicarse se encuentra en el material gentico como una macromolcula llamada DNA. 2.2. Componentes del DNA Este material gentico celular, el cido desoxirribonucleico, es un biopolmero ensambla-

do a partir de 4 desoxirribonucletidos precursores, los cuales a su vez se encuentran constituidos por una base nitrogenada, un azcar de 5 tomos de carbono (desoxirribosa) y un grupo fosfato. Las bases nitrogenadas son compuestos heterocclicos, planares, que derivan de dos compuestos orgnicos parentales, la purina y la pirimidina. Las bases pricas que se encuentran en el DNA son la adenina y la guanina, mientras que las pirimdicas estn representadas por la timina y la citosina (figura 45-2). Las bases se encuentran unidas covalentemente a travs de enlaces N-glicosdicos (N1 de las pirimidinas y N9 de las purinas) al carbono 1 de la desoxirribosa. El grupo fosfato entretanto, se encuentra esterificando el carbono 5 del azcar. Los desoxirribonucletidos son as compuestos solubles que, en soluciones acuosas, absorben fuertemente la luz ultravioleta en la regin de 260 nm. Es esta propiedad, precisamente, la que es explotada para cuantificar la concentracin de ellos

Figura 45-2. Componentes de los cidos nucleicos. Una base nitrogenada (purina o pirimidina) ms un azcar (ribosa o 2 desoxirribosa) forman un nuclesido, que al unrsele una molcula del cido fosfrico forma un nucletido, los cuales estructuran los cidos nucleicos (DNA y RNA). Se muestran las estructuras de las bases nitrogenadas y azcares.

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(y por ende, de cidos nucleicos en general) en una fraccin de material biolgico determinada. 2.3. Estructura del DNA En la estructura primaria del cido desoxirribonucleico, los nucletidos se encuentran enlazados entre s a travs de puentes de grupos fosfato formando largas cadenas. Especficamente, el grupo 5 OH de la desoxirribosa de un residuo est unido al grupo 3 OH del azcar del nucletido precedente a travs de un enlace fosfodister. Todos los enlaces de este tipo en el DNA tienen la misma orientacin a lo largo de la cadena, dndole a sta una polaridad con extremos 5 y 3 bien definidos. Cadenas de estas subunidades de DNA existen como dos hebras asociadas en polaridad opuesta con respecto al esqueleto azcar-fosfato (antiparalelas), enrolladas una alrededor de la otra formando una estructura de doble hebra o dplex (figura 45-3).

sintetizar el cido nucleico en cuestin. sta agrega, normalmente, slo la base correcta, la cual es especificada por la hebra molde durante la elongacin de la hebra nueva. Es precisamente la constancia y especificidad de este apareo de bases complementarias lo que constituye la base de la funcin del DNA como depositario de la informacin gentica. Una caracterstica crucial de la estructura general del DNA es que ella es independiente de la secuencia particular de los nucletidos constituyentes, la cual a su vez es importante no slo en el sentido de la estructura per se, sino que ella define la secuencia de aminocidos que constituye el correspondiente polipptido. La relacin entre la secuencia del DNA y la secuencia de la protena correspondiente se conoce como cdigo gentico.

3. LAS NUEVAS TECNOLOGAS Muchos mtodos de amplia utilizacin en laboratorios de Biologa Molecular en general, sacan partido de la relativa simpleza de los sistemas celulares procariticos como las bacterias. En procariotes, la secuencia lineal de DNA se corresponde directamente con las secuencias lineales del RNA y la protena. Sin embargo, en eucariotes la informacin que determina una protena en el DNA posee a menudo interrupciones (intrones) en la secuencia traducible. El DNA eucaritico es as primero copiado en un transcrito primario (RNA heteronuclear, ARNhn), el cual es procesado en el ncleo por escisin de las secuencias que determinan la protena (exones). stos son unidos linealmente en el RNA maduro, el cual puede seguir siendo procesado antes de ser exportado al citoplasma para su traduccin en la protena correspondiente. El conocimiento y la comprensin de la estructura, funcin, regulacin y organizacin de los genes y/o sus productos dentro de la clula, resultan claves para la realizacin de un estudio serio de un sistema biolgico dado. Como punto de partida para ello, el investigador de hoy debe ser capaz de obtener y estudiar un gen determinado en forma aislada in vitro. En este sentido, el desarrollo de tcnicas de clonamiento molecular del DNA ha provisto de poderosos mecanismos para aislar segmentos discretos y nicos de DNA desde una poblacin de genes, purificarlos a homogeneidad y amplificar-

Figura 45-3. Apareamiento especfico entre bases complementarias de las hebras antiparalelas del dplex de DNA. Adenina (A), timina (T), guanina (G) y citosina (C).

Ambas hebras del dplex se asocian establemente entre s, debido al potencial de formacin de puentes de hidrgeno entre bases especficas en una hebra con bases definidas en la hebra opuesta o complementaria. La base adenina aparea siempre con timina (2 enlaces de hidrgeno) y guanina siempre lo hace con citosina (3 enlaces de hidrgeno). La fidelidad del correcto apareo de bases est dada por la maquinaria celular encargada de

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los de modo de producir suficiente material para realizar anlisis genticos, qumicos y bioqumicos. 3.1. Endonucleasas de restriccin Muchos de los logros de la gentica molecular en las ltimas dcadas se deben al descubrimiento de un tipo especial de enzimas, denominadas endonucleasas de restriccin. Estas son enzimas aisladas de bacterias que tienen la habilidad de hidrolizar el cido desoxirribonucleico en secuencias bien definidas, generando fragmentos discretos de DNA. Los segmentos de DNA generados por una enzima particular, pueden ser separados en base a sus tamaos relativos por electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida, desde donde los fragmentos individuales pueden ser aislados y purificados (figura 45-4). Con los datos obtenidos se puede construir un mapa fsico que representa una verdadera "huella digital molecular" del cido nucleico en cuestin. 3.2. Clonamiento del DNA En general, el proceso de clonamiento se basa en llevar a cabo determinadas reacciones enzimticas en el laboratorio, utilizando generalmente enzimas bacterianas especficas y bien ca-

racterizadas para copiar, cortar y unir fragmentos especficos de DNA. Luego de hacer que formen parte de crculos de DNA autorreplicativos (generalmente plasmidios bacterianos o algunos virus), estas molculas pueden ser introducidas a clulas vivas mediante la utilizacin de tcnicas relativamente simples de practicar, aun cuando no siempre bien comprendidas. Luego de mltiples ciclos de duplicacin celular, las molculas hbridas pueden ser reaisladas y purificadas, generando cantidades suficientes del material clonado (figura 45-5). Una vez que se dispone del segmento de DNA aislado y purificado, se puede determinar rpidamente su secuencia nucleotdica, lo cual lleva a la prediccin de la secuencia de la protena codificada. La marcacin radiactiva de este fragmento le permite al experimentador buscar copias de secuencias relacionadas en genomas complejos o mRNA entre ms de un milln de secuencias no relacionadas. Un ejemplo de ello ha sido el clonamiento, expresin y produccin comercial de interleuquinas. Haciendo ingeniera del DNA clonado se puede permitir su expresin en bacterias o levaduras u otras clulas eucariticas, convirtindose en fuentes abundantes de grandes cantidades de protenas puras, las que pueden tener una gran importancia mdica y/o econmica y que podran ser difciles de conseguir por otros medios ms tradicionales.

Figura 45-4. Las enzimas de restriccin hidrolizan el DNA en secuencias muy especficas. Aqu se muestra el caso de la enzima Bst VI, que corta el DNA cada vez que en l est presente la secuencia indicada, generando extremos cohesivos complementarios (a). Esto posibilita la creacin de molculas hbridas de DNA al permitir el apareamiento especfico entre diferentes ADNs que han sido previamente tratados con la misma enzima (b).

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Figura 45-5. Clonamiento del DNA. El DNA a clonar es unido covalentemente a una molcula portadora llamada vehculo o vector de clonamiento, la que puede ser un DNA plasmidial o viral. Una vez obtenida la molcula de DNA hbrida, sta es introducida por transformacin a clulas que han sido preparadas para el efecto, las que luego son presionadas para desarrollarse en un medio que contiene el antibitico particular. De este modo, slo aquellas clulas que hayan incorporado molculas conteniendo el gen de resistencia (y el DNA clonado) podrn desarrollarse.

Tambin se pueden concebir en el laboratorio versiones alternativas del DNA clonado, ya sea cambiando su estructura y/o secuencia. Estas construcciones pueden ser reintroducidas en clulas aisladas o en animales vivos para estudiar los resultados de estos cambios (mutaciones) hechos por el hombre y as tratar de entender ms cabalmente el complejo fenmeno del funcionamiento y de la regulacin de la expresin gnica. 3.3. Transferencia de Southern Los fragmentos de DNA que han sido resueltos en un gel de agarosa por ejemplo, pueden ser desnaturados y transferidos a filtros de nitrocelulosa u otro soporte slido donde quedan inmovilizados. De este modo, mediante la utilizacin de sondas especficas de DNA marcadas, genes determinados (o partes de

ellos) pueden ser fcilmente identificados (figura 45-6). 3.4. Transformacin de clulas Molculas de DNA que han sido manipuladas in vitro, pueden ser introducidas de una forma relativamente fcil a clulas que han sido preparadas para tal efecto. Clsicamente, en el caso de bacterias esto se logra tratando previamente las clulas con soluciones de cloruro de calcio. En el caso de eucariotes, el mismo efecto se consigue depositando sobre una monocapa de clulas el DNA a introducir, conjuntamente con sales de fosfato de calcio o mediante el uso de ciertos virus que actan como vectores.

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Figura 45-6. Mtodo de transferencia (blotting) de Southern. Esta metodologa permite realizar anlisis de hibridacin DNA-DNA. Para ello, muestras de DNA de un espcimen dado son hidrolizadas utilizando enzimas de restriccin y sometidas a electroforesis en geles de agarosa. Los fragmentos resueltos en el gel son desnaturados y transferidos a un soporte slido, usualmente membranas de nitrocelulosa, donde los fragmentos de DNA de una hebra quedan inmovilizados. Mediante el uso de sondas especficas es posible determinar la existencia de secuencias homlogas en el material analizado. El mtodo ha resultado adems una poderossima herramienta para el anlisis de genomas complejos, como el genoma eucaritico. Permite determinar con precisin la existencia y el nmero de sitios de reconocimiento para endonucleasas de restriccin en un gen determinado (los cuales son de mucha utilidad como puntos de referencia moleculares), adems del nmero de copias de se y otros genes en el genoma. Por otro lado, en combinacin con el uso de varias enzimas de restriccin, el mtodo de transferencia de Southern resulta muy til para determinar pequeas variaciones o polimorfismos en determinados genes.

3.5. Secuenciacin del DNA La determinacin del orden (secuencia) de los desoxirribonucletidos en la cadena del DNA, resulta de fundamental importancia para conocer detalles ntimos de la estructura y funcin de esta biomolcula primordial. A partir de ella se puede deducir la existencia de marcos de lectura abiertos en una y otra hebra y por lo tanto, de acuerdo al cdigo gentico, la secuencia aminocida de la(s) protena(s) codificada(s). Tambin permite determinar dnde empiezan y dnde terminan procesos como la transcripcin y traduccin, la existencia de intrones, seales de control y procesamiento, etc. Dos mtodos, uno qumico (Maxam y Gilbert) y uno enzimtico (Sanger) han sido desa-

rrollados para alcanzar este objetivo, siendo este ltimo el de mayor aplicacin. Aun cuando ambos mtodos difieren en su parte operativa, ellos se basan en el mismo principio: la generacin de fragmentos discretos de DNA en que cada uno contiene un desoxirribonucletido ms que el anterior. En el caso particular del mtodo de Sanger, se establecen cuatro mezclas de reaccin en que cada una contiene los 4 desoxirribonucletidos (uno de ellos marcado radiactivamente), el DNA a secuenciar, un iniciador de sntesis especfico (partidor o primer), una DNA polimerasa, adems de un 2-didesoxirribonucletido trifosfato por tubo. La presencia de estos ltimos causar el trmino de la elongacin de las cadenas prematuramente y al azar, generando segmentos de distin-

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tos largos de DNA. Las mezclas obtenidas son posteriormente resueltas por electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturantes y analizadas por autorradiografa (figura 45-7). 3.6. Reaccin de la polimerasa en cadena Una de las tcnicas ms poderosas desarrolladas ltimamente es la reaccin de la polimerasa en cadena (PCR), la cual permite amplificar segmentos cortos de DNA genmico. Lo nico que se requiere es conocer la secuencia de desoxirribonucletidos a ambos lados de la regin blanco que va a ser amplificada. Brevemente, el DNA a ser amplificado es

desnaturado trmicamente e hibridado a partidores cortos (20-31 bases) que son complementarios a las hebras del dplex a ambos lados de la regin blanco. Utilizando una DNA polimerasa, se pueden extender las cadenas de DNA partiendo de los extremos 3OH de cada partidor. Si la enzima utilizada es termoestable, el ciclo completo puede ser repetido una y otra vez, desnaturando por calor los productos de amplificacin y permitiendo el apareamiento y reinicio de la sntesis de DNA (figura 45-8). De este modo, una secuencia cualquiera puede ser amplificada ms de un milln de veces en unos 25-31 ciclos, lo que constituye una herramienta de eleccin en el anlisis molecular de numerosos procesos biolgicos. Manipulando

Figura 45-7. Determinacin de la secuencia de DNA por el mtodo de los didesoxirribonucletidos de Sanger. El DNA a secuenciar (generalmente de una hebra) es hibridado a un partidor especfico que se encuentra marcado usualmente con 32P en su extremo 5. Se adiciona una DNA polimerasa capaz de extender las cadenas y la mezcla se distribuye en cuatro tubos que contienen los 4 dNTPs adems de uno de los ddNTP por tubo. Una vez finalizada la reaccin, las mezclas de fragmentos marcados se resuelven por electroforesis en geles muy delgados de poliacrilamida y la secuencia es finalmente leda del gel luego de la correspondiente autorradiografa.

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adecuadamente las condiciones de hibridacin de partidores especficos con el templado, el mtodo puede ser utilizado para detectar mutaciones en regiones muy pequeas y, por lo tanto, resulta adecuado para identificar diferencias de secuencia en posiciones bien definidas del genoma. Una reciente tcnica que utiliza estos principios es la hibrizacin de oligonucletidos alelo-especfica. 3.7. Animales transgnicos y knock out de genes Hoy es posible obtener animales transgnicos introduciendo secuencias nuevas de material hereditario en clulas de la lnea germinal del organismo. La transferencia de un gen modificado in vitro

al genoma de una clula viva, es posible mediante eventos de recombinacin de DNA homloga entre secuencias que residen en el cromosoma y secuencias introducidas a la clula. Si la receptora es una clula troncal derivada del embrin, pluripotencial, se puede transferir un gen modificado especficamente por manipulacin en el tubo de ensayo a la lnea germinal de un organismo vivo (figura 45-9). Este tipo de clulas ha sido aislado, a la fecha, de embriones de ratn y de hamster y se investiga sobre la posibilidad de obtenerlas a partir de cerdo, ovejas, vacas, etc. Los animales transgnicos han sido utilizados para un sinnmero de estudios, como por ejemplo: examinar el efecto de genes que normalmente no se encuentran presentes in vivo, para expresar genes normales en clulas que normalmente no los expresan,

Figura 45-8. Esquema de la reaccin de la polimerasa en cadena (PCR). Esta es una tcnica que representa una manera fcil y eficiente de amplificar enormemente secuencias definidas de DNA (Ver texto).

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para suprimir poblaciones de clulas especficas con transgenes que expresan protenas txicas, etc. As, los animales transgnicos representan poderosas herramientas (tubos de ensayo vivos) para expresar genes que pueden ser dirigidos especficamente a tipos especiales de clulas o tejidos.

los genes que ella posee. 4.1. La estructura de los genes eucariticos La estructura bsica de un gen consta de tres elementos: la regin codificadora, la seal control del inicio de la transcripcin o promotor transcripcional y la seal de trmino de la transcripcin o terminador (figura 45-10). La regin codificadora contiene la informacin gentica que ser transcrita en una molcula de RNA. Esta informacin est codificada en una de las cadenas del DNA (la hebra codognica) en tanto que la cadena complementaria (hebra molde) acta como templado para la generacin del RNA respectivo. En el caso de genes que codifican para protenas, la regin codificadora contiene un marco de lectura abierta (ORF) el que corresponde a una sucesin continua de tripletes de bases nitrogenadas o codones, comprendido entre un triplete ATG (inicio del ORF) y un triplete sin sentido (trmino del ORF). Esta sucesin de codones especifica la estructura primaria de la protena codificada por el gen de acuerdo a la equivalencia codn:aminocido establecida en el cdigo gentico (figura 45-10a). Una caracterstica importante de algunos genes eucariticos es la presencia de intrones. Ellos corresponden a secuencias de DNA sin codificacin para aminocidos las que se intercalan en la regin codificadora generando interrupciones dentro del ORF. En consecuencia, los genes que contienen tales secuencias poseen una estructura segmentada en la que se alternan exones (segmentos que contienen codificacin) e intrones (figura 45-10b). Incluido dentro de la regin codificadora, se ubica el terminador transcripcional. Este elemento corresponde a una secuencia particular de bases, las que al ser transcritas permiten la formacin de una estructura secundaria en el RNA, la que acta como seal de trmino de la transcripcin. En los genes eucariticos que codifican para protenas, el promotor transcripcional se localiza previo a la regin codificadora, en lo que se denomina regin ro arriba. Este elemento corresponde a una secuencia particular de bases nitrogenadas, la cual al ser reconocida por el sistema transcripcional establece el punto de inicio de la sntesis de RNA. Su presencia es esencial para la realizacin del proceso de transcripcin.

Figura 45-9. Esquema que representa la obtencin de ratones transgnicos. En este caso, se muestra la tcnica de microinyeccin de proncleos. Tambin es posible lograr transferencias de genes mediadas por retrovirus o por clulas troncales de la lnea germinal del animal.

4. LA EXPRESIN GNICA EN ORGANISMOS EUCARITICOS El trmino "expresin gnica" ha sido acuado para referirse a la sumatoria de eventos que conducen a la aparicin del producto codificado por un gen determinado (RNA o protenas), en su forma activa y en el lugar donde ejercern su rol biolgico. En eucariotes, este proceso reviste especial complejidad a causa de la organizacin y estructura tanto de la clula eucaritica como de

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Figura 45-10. Estructura de genes eucariticos. Dos tipos de genes estn presentes en los organismos eucariticos: genes sin intrones (a) y genes con intrones (b). P: promotor transcripcional, T: terminador de la transcripcin.

4.2 El proceso de expresin gnica y sus etapas. En los organismos superiores, la expresin gnica es un proceso de alta complejidad que involucra una serie de etapas. Si se considera el caso de genes que codifican para protenas, la aparicin del polipptido codificado por un gen particular en su forma tridimensional activa y en la localizacin intra o extracelular donde ejercer su funcin incluye los siguientes eventos: a) transcripcin, b) procesamiento postranscripcional, c) traduccin, d) procesamiento postraduccional, e) transporte de la protena y f) plegamiento de la protena (figura 45-11). a) Transcripcin. En el ncleo de la clula eucaritica, existen tres sistemas transcripcionales. Los genes que codifican protenas

son transcritos por el sistema de la RNA polimerasa II y sus factores de transcripcin asociados. En un primer evento, los factores de transcripcin generales (comunes para todos los genes transcritos por la RNA polimerasa II) reconocen y se unen en forma secuencial al promotor transcripcional de tales genes generando el complejo de iniciacin. En un segundo evento la RNA polimerasa II se une al complejo de iniciacin y comienza la sntesis de un RNA complementario a la hebra molde de la regin codificadora, la que procede hasta la regin del terminador transcripcional. En el caso de genes sin intrones, se sintetiza un precursor de mRNA (pre-mRNA) que contiene un ORF continuo. Para los genes que contienen intrones se producir un pre-mRNA, tambin denominado RNA heterogneo nuclear (hnRNA) el que

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contiene secuencias provenientes tanto de los exones como de los intrones y por lo tanto el ORF se encuentra interrumpido. b) Procesamiento postranscripcional. Previo a abandonar el ncleo, el pre-mRNA debe ser procesado a fin de generar el mRNA maduro. Tal procesamiento implica, la modificacin de ambos extremos de la molcula a fin de aumentar su estabilidad. En el extremo 5 se produce la reaccin de capping que hace al mRNA refractario a la accin de ribonucleasas. En el extremo 3 se realiza la reaccin de poliadenilacin o adicin de una cola de poliAMP, razn por la cual los mRNA tambin de denominan RNA poliA+. En el caso del hnRNA se incluye adems el "splicing" o remocin de las secuencias de RNA provenientes de los intrones a fin de generar un ORF continuo. Una vez concluido el procesamiento, el mRNA maduro es transferido al citoplasma para su posterior traduccin. f) c) Traduccin. El mRNA maduro generado en la etapa anterior se une al ribosoma, donde el mensaje contenido en esta molcula es descifrado para sintetizar la protena codificada. En este proceso, cada triplete del ORF es interpretado de acuerdo al cdigo gentico para asignar el aminocido correspondiente en la estructura primaria del polipptido. Dependiendo del destino final de la protena a sintetizar, la traduccin se verificar en ribosomas libres (protenas intracelulares) o en ribosomas unidos al retculo endoplsmico (protenas de membrana o extracelulares).

algunas protenas mitocondriales y de cloroplasto en clulas vegetales, las protenas localizadas en los diferentes organelos celulares son codificadas por genes nucleares, realizndose su traduccin en el citoplasma. En consecuencia, las protenas sintetizadas deben ser dirigidas hacia los diferentes compartimentos intra o extracelulares donde ejercern su funcin. Para ello, en la estructura primaria de cada polipptido se incluye una secuencia de aminocidos que acta como seal de destinacin. As, por ejemplo, las protenas extracelulares poseen un pptido seal que indica que ellas deben ser sintetizadas en ribosomas asociados al RE y, por consiguiente, son dirigidas hacia la ruta de secrecin de protenas. Por su parte una seal diferente opera para dirigir protenas hacia el ncleo o mitocondrias. Estas seales de destinacin son interpretadas por un complejo sistema de transporte que determina finalmente el trfico intracelular de protenas. Plegamiento de protenas. Esta es ltima etapa del proceso de expresin gnica y se produce en forma coordinada con los eventos de procesamiento pos traduccional y transporte. La protena expresada adopta finalmente su estructura tridimensional definitiva, lo que le permite cumplir con su rol funcional en la localizacin que le corresponde. El plegamiento incluye la adopcin de la estructura terciaria de la protena a travs de la interaccin entre los grupos laterales de los aminocidos que la constituyen y, en el caso de protenas que poseen estructura cuaternaria, la interaccin entre los diferentes polipptidos o subunidades que la conforman.

d) Procesamiento postraduccional. Un gran nmero de protenas y polipptidos celulares son sintetizados como precursores, por lo que no poseen su estructura tridimensional activa, debiendo ser procesados para cumplir su funcin biolgica. Las modificaciones postraduccionales ms comunes son: procesamiento proteoltico, adicin de carbohidratos o glicosilacin (protenas de membrana y extracelulares), fosforilaciones, adicin de aminocidos al extremo amino o carboxilo terminal y adicin de grupos prostticos, entre otras. e) Transporte de protenas. Con excepcin de

4.3. La expresin diferencial de genes y su regulacin An cuando todas las clulas de un organismo poseen la misma informacin gentica, los distintos tipos celulares que lo componen poseen caractersticas estructurales y funcionales diferentes y por consiguiente poseen un patrn de expresin gnica que les es caracterstico. Cada clula de un organismo expresa slo aquella fraccin de la informacin gentica contenida en su genoma que le permita producir las protenas requeridas para el desarrollo de la funcin que le es propia,

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Figura 45-11. Etapas del proceso de expresin gnica en eucariotes

generando as un perfil de expresin gnica tejido o clula-especfico. Del mismo modo, tal patrn de expresin gnica puede ser modificado en respuesta tanto a condiciones o seales exgenas (por ej. factores medioambientales), como de naturaleza endgena (por ej. programas de desarrollo y diferenciacin celular, estableciendo de esta manera perfiles de expresin estadio-especficos. La expresin tejido y/o estadio especfica, es lo que se denomina expresin diferencial de genes. En el contexto anterior, y considerando su modo de expresin, los genes pueden ser clasificados en dos grupos. La primera categora corresponde a los denominados genes "housekeeping", la que incluye a todos aquellos que codifican para protenas esenciales para el funcionamiento basal de la clula por lo que son expresados en forma constante o constitutiva. La segunda categora in-

cluye a los genes de expresin regulada, esto es, genes cuya expresin no es permanente sino que aparece inducida o reprimida en respuesta a condiciones particulares. No obstante que la regulacin de la expresin de estos genes puede ser ejercida a varios niveles dentro de este proceso, la gran mayora de los mecanismos regulatorios opera a nivel transcripcional. En forma general, tales mecanismos involucran la interaccin especfica entre dos tipos de elementos regulatorios: elementos cis y elementos trans. Los elementos cis, tambin denominados enhancers, corresponden a pequeas secuencias especficas de bases nitrogenadas, generalmente localizadas ro arriba de la regin codificadora. Tales elementos (adicionales al promotor transcripcional) son caractersticos de los genes de expresin regulada y no se encuentran presentes en los genes constituti-

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vos. Por su parte, los elementos trans corresponden a un tipo particular de protenas de unin a DNA, las que al reconocer y unirse a un elemento cis particular, actan como factores de transcripcin especficos. La interaccin entre ambos elementos facilita la unin de los factores de transcripcin generales y la RNA polimerasa II al promotor, induciendo la transcripcin del gen sometido a regulacin (figura. 45-12). La unin de los factores de transcripcin especficos a su respectiva secuencia blanco o enhancer corresponde generalmente a la etapa final de una va de transduccin de seales. A modo ejemplo, en el mecanismo de activacin de la expresin gnica por hormonas esteroidales del tipo glucocorticoides la hormona ingresa al citoplasma de la clula blanco donde se une a su receptor especfico, el que corresponde a un elemento trans inactivo. El complejo hormona-receptor constituye el factor de transcripcin activo que migra al ncleo donde se une al GRE (glucocorticoid responsive element), elemento

cis presente en todos los genes que respondern a la accin hormonal (figura. 45-13a). En forma anloga, otros sistemas de transduccin de seales involucran la participacin de protenas quinasas especficas, las que al fosforilar un factor de transcripcin determinado producen su activacin, posibilitando su unin a su respectiva secuencia blanco en la regin regulatoria de los genes bajo su control (figura. 45-13b) La capacidad de un organismo para responder a una gran variedad de seales externas e internas determina la existencia de una compleja red de vas de transduccin de seales y de mecanismos moduladores de la expresin gnica. La diversidad de sistemas regulatorios que operan en un organismo eucaritico requiere de una gran cantidad de elementos cis y trans distintos. Estimaciones para algunas especies indican que aproximadamente el 10% de los genes presentes en su genoma codifican para factores de transcripcin especficos.

Figura 45-12. Interaccin entre elementos reguladores cis y trans durante la regulacin de la expresin gnica.

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Figura 45-13. Mecanismos de activacin de la expresin gnica en respuesta a seales externas. a) Activacin de la transcripcin inducida por hormonas esteroidales y la secuencia de eventos involucrados (etapas 1-5). b) Activacin en respuesta a otro tipo de factores exgenos (hormonas peptdicas, seales de estrs, elicitores, etc.). La secuencia de los principales eventos asociados a este tipo de mecanismos se describe en las etapas 1-7.

5. MTODOS DE ANLISIS DE LA EXPRESIN DIFERENCIAL DE GENES Dado que la gran mayora de los mecanismos regulatorios de la expresin gnica operan a nivel de la iniciacin de la transcripcin, los mtodos de anlisis de la expresin gnica ms corrientemente utilizados se dirigen hacia la deteccin de transcritos de RNA especficamente generados en tejidos determinados y/o en condiciones particulares. Las tcnicas a utilizar varan dependiendo del propsito del anlisis: el estudio de la expresin de un gen especfico o la determinacin del perfil global de expresin gnica en una muestra determinada.

5.1. Hibridacin Northern Esta tcnica se deriv de la hibridacin Southern descrita anteriormente en este captulo (3.). En este mtodo lo que se persigue es detectar la presencia de un transcrito proveniente de un gen especfico dentro de la poblacin total de RNAs presentes en una clula o de un tejido determinado. A diferencia de la hibridacin Southern, el RNA total obtenido desde las clulas de un tejido es sometido a un fraccionamiento por tamao mediante electroforesis en geles desnaturantes de agarosa/formaldehdo. Posteriormente el RNA fraccionado es transferido a una membrana de nailon o un filtro de nitrocelulosa

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en forma anloga a como se describe para la transferencia Southern. El RNA adherido a la membrana es sometido a hibridacin con una sonda molecular la que generalmente corresponde a un fragmento del gen cuya expresin se desea analizar y que ha sido marcado radiactivamente. Tal hibridacin es realizada en condiciones de temperatura y fuerza inica que permitan el apareo de la sonda slo a molculas de RNA con las que posea un alto grado de complementariedad. Tras una serie de lavados que remueven la sonda adherida en forma inespecfica la membrana es expuesta a una placa autorradiogrfica que permite detectar la presencia de secuencias de RNA complementarias a la sonda molecular (figura 45-14). Este mtodo, an cuando posee algunas desventajas, es ampliamente utilizado. Su sensibilidad, baja si se compara con otros mtodos de reciente desarrollo, dificulta su aplicacin para la deteccin de genes dbilmente expresados.

5.2. Reaccin de la polimerasa en cadena acoplada a la reaccin de la transcriptasa reversa (RT-PCR) La asociacin de la tecnologa de PCR a la reaccin catalizada por la enzima transcriptasa reversa, ha permitido desarrollar una poderosa herramienta para el anlisis de la expresin de un gen en particular. La transcriptasa reversa es una DNA polimerasa sintetizada en clulas infectadas por retrovirus la que se caracteriza por utilizar mRNA como templado para sintetizar un DNA de doble cadena complementario al molde (cDNA). En la primera etapa de este mtodo, el RNA poliA+ (mRNA total) obtenido de las muestras en estudio es utilizado como molde para sintetizar un cDNA de cadena simple complementario, utilizando como partidor oligodT12-18 (polmero de dTMP de 12-18 nucletidos de largo), el que se aparea con la extensin de poliadeninas presente en los mRNAs eucariticos. En esta reaccin se obtiene una coleccin de cDNAs representativa de todos los genes expresados en la muestra analizada. En la segunda etapa se determina si en la poblacin de cDNAs sintetizados por la transcriptasa reversa est representado el producto de expresin de un gen determinado. Para ello la coleccin de cDNAs es utilizada como molde en una reaccin de PCR estndar, en condiciones similares a las descritas anteriormente en este captulo. Como partidores para la amplificacin del DNA se utiliza oligonucletidos de secuencia complementaria a regiones especficas del gen cuya expresin se investiga. Los productos de amplificacin generados son analizados por electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. La aparicin de un fragmento de DNA del tamao esperado es indicativo de la efectiva expresin del gen en estudio (figura 45-15). Las principales ventajas de la tcnica descrita son su alta sensibilidad y la rapidez del anlisis. 5.3. Anlisis del perfil transcripcional mediante el mtodo de differential display de mRNAs. Esta tcnica corresponde a una variacin del mtodo de RT-PCR, adaptada para la deteccin de grupos de genes cuya expresin es inducida o reprimida en un tejido especfico o en determinadas situaciones. Para ello es necesario establecer el perfil de mRNAs presentes tanto en la muestra problema y contrastarlo con el de una muestra

Figura 45-14. Esquema del mtodo para la deteccin de la expresin especfica de genes mediante hibridacin "Northern".

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Figura 45-15. Deteccin de la expresin especfica de genes mediante la reaccin de la polimerasa en cadena acoplada a la transcriptasa reversa (RT-PCR). La deteccin de transcritos especficos en el tejido 2 es verificada mediante el usos de partidores especficos para el gen en anlisis (GSP1 y GSP2)

control. Ello significa seleccionar dos tejidos diferentes (para el anlisis de expresin tejido-especfica) o bien el mismo tejido sujeto a dos condiciones experimentales distintas (anlisis de expresin inducida por factores exgenos y endgenos). Dado que la cantidad de transcritos distintos presentes en una clula (10-20 mil) excede la capacidad de anlisis, la poblacin global de mRNAs debe ser previamente dividida en subpoblaciones. Este fraccionamiento se realiza a nivel de la sntesis de cDNA por la transcriptasa reversa. Para ello se requiere de partidores cuya secuencia nucleotdica corresponde a la estructura general 5-TTTTTTTTTTTTMN-3, donde M:= A, G o C y N=A, G, C, o T. En consecuencia, existen 12 oligonucletidos posibles, cada uno de los cuales se aparear slo a una fraccin del RNA poliA+ y generar una subpoblacin de cDNAs

de cadena simple. A modo de ejemplo, al emplear el partidor T11CG, se seleccionar como molde para la sntesis de cDNA slo a los mRNAs que posean en su extremo 3 la secuencia 5CGAAAAAAAAAAAA-3, por consiguiente los cDNA obtenidos representarn slo una fraccin de los mRNAs presentes en la muestra analizada. En la segunda etapa de este mtodo, la subpoblacin de cDNAs generada en la reaccin de la transcriptasa reversa es empleada como sustrato en una reaccin de PCR. Como partidores se utilizan el oligonucletido T11MN empleado para la sntesis de cDNA y un decmero de secuencia arbitraria (AP), el cual se aparear al azar sobre el cDNA molde. Los parmetros de amplificacin y en particular la temperatura de apareo se han modificado respecto de una reaccin estndar a fin de maximizar la unin de los

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partidores al molde. La reaccin de PCR se realiza en presencia de S35-a-dATP a fin de generar fragmentos marcados radiactivamente. Los productos de amplificacin son analizados mediante electroforesis en geles desnaturantes de poliacrilamida/urea y analizados mediante autorradiografa (figura 45-16). Los resultados que se generan en este anlisis corresponden a un perfil parcial de los mRNAs presente en un tejido o tipo celular especfico y en una condicin experimental determinada. La comparacin del patrn obtenido con aquel determinado para otro tejido o para el mismo tipo celular pero en diferentes condiciones experimentales, permite identificar los genes cuya expresin es inducida o reprimida en cada situacin. 5.4. Hibridacin sustractiva Esta tcnica es una alternativa al differential display y como ella se utiliza para detectar e iden-

tificar grupos de genes expresados diferencialmente en un tejido determinado y en una condicin experimental particular. Existen numerosas variantes de este mtodo, una de las cuales se describe a continuacin (figura 45-17). Como en el mtodo anterior se requiere una muestra de referencia adems de la muestra problema. Ambas muestras son procesadas para la extraccin y purificacin del RNA poliA+. A partir del RNA poliA+ total de la muestra problema, se sintetizan los respectivos cDNAs de doble cadena. Tales cDNA son posteriormente ligados a un vector de clonamiento molecular e introducidos mediante transformacin en clulas de E. coli, de acuerdo a los mtodos descritos anteriormente en este captulo. Se obtiene as lo que se denomina una genoteca de expresin, esto es, una coleccin de bacterias que en su conjunto contienen todos los genes expresados en la muestra en estudio. Una rplica de esta genoteca es transferida a un filtro

Figura 45-16. Identificacin de transcritos diferencialmente expresados mediante la tcnica de differential display de mRNAs.

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de nitrocelulosa y procesada para hibridacin. Paralelamente, una fraccin del mRNA de la muestra problema es empleada para sintetizar su respectivo cDNA de hebra simple, generando una coleccin representativa de todos los mRNAs presentes en la muestra problema. Esta coleccin es hibridada con un gran exceso de RNA poliA+ de la muestra de referencia. En estas condiciones todos los mRNAs de la muestra de referencia comunes con los de la muestra problema se aparearn con el respectivo cDNA, formando hbridos cDNA/mRNA. Los cDNAs correspondientes a mRNAs especficos de la muestra problema permanecern al estado de hebra simple y pueden ser separados de los dplex cDNA/mRNA. Tales cDNA son marcados radiactivamente y utilizados como sondas moleculares para hibridacin con los filtros de nitrocelulosa que contienen a la genoteca de expresin. Tras la exposicin autorradiogrfica, las seales de hibridacin positiva indican la presencia de clones bacterianos conteniendo genes

de expresin especfica en la muestra problema.

LECTURAS SUGERIDAS Alberts, A.; Bray, D.; Lewis, J.; Raff, M.; Roberts, K. y Watson, J.D., Molecular Biology of the cell, 3rd Edition, Garland Publishing Inc., New York, 1994. Brown, T.A., Genomes, Bios Scientific Publishers, John Willey & Sons Inc., New York, 1999. Glick, B. y Pasternak, J., Molecular Biotechnology, ASM Press, Washington D.C., 1994. Lewin, B., Genes VII, Oxford University Press, 2000. Watson, J.D., Gilman, M.; Witkowski, J. y Zoller, M., Recombinant DNA, 2nd Edition, Scientific American Books, 1992.

Figura 45-17. Mtodo de hibridacin sustractiva para la deteccin y aislamiento de genes diferencialmente expresados.

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Fundamentos de Inmunologa Bsica y Clnica Ivn Palomo G., Arturo Ferreira V., Cecilia Seplveda C., Mario Rosemblatt S., Ulises Vergara C. Editorial Universidad de Talca, 2002

Captulo 46
GRUPOS DE DIFERENCIACIN ANTIGNICA
Ivn Palomo G., Flavio Carrin A. y Cristin Rodrguez G.

1. Introduccin 2. Estructura de los antgenos de membrana 2.1. Protenas de transmembrana tipo I 2.2. Protenas de transmembrana tipo II 2.3. Protenas de transmembrana tipo III 2.4. Protenas ancladas a glicofosfatidilinositol 3. Molculas CD asociadas a lneas celulares 3.1. Molculas CD expresadas principalmente en "stem cell" 3.2. Molculas CD expresadas principalmente en clulas B

3.3. Molculas CD expresadas principalmente en clulas T 3.4. Molculas CD expresadas principalmente en clulas NK 3.5. Molculas CD expresadas principalmente en granulocitos 3.6. Molculas CD expresadas principalmente en monocitos-macrfagos 3.7. Molculas CD expresadas principalmente en plaquetas 4. Familias de molculas CD 5. Algunas aplicaciones de la nomenclatura CD en Inmunologa

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RESUMEN En este captulo se muestra los criterios generales utilizados en la clasificacin de las molculas CD. Fundamentalmente fue la produccin de anticuerpos monoclonales por diferentes centros y que reconocan las mismas molculas lo que impuls a los investigadores a realizar talleres tendientes a universalizar la nomenclatura a usar. Como una forma de facilitar la comprensin de las caractersticas estructurales de las molculas CD, se describe las cuatro formas en que las protenas de membrana se orientan en ella o se unen a la membrana: protenas de transmembrana tipos I, II y III, y unidas a Protenas. Se han descrito ms de 240 molculas CD. De estas molculas, existen algunas que principalmente se expresan en algunas lneas celulares; a modo de ejemplo: CD19 (LB), CD3 (LT), CD56 (clulas NK), CD66a (granulocitos), CD14 (monocitos-macrfagos) y CD61 (plaquetas). Algunas molculas CD presentan similitud estructural entre s y en algunos casos con otras protenas no incluidas en esta clasificacin. As hay molculas CD que integran algunas familias de protenas, como por ejemplo: Superfamilia de las Ig, Familia de las lectinas, Tetra-span family", etc. En los ltimos aos, se ha empezado a usar la nomenclatura CD en clnica, as por ejemplo se usa en SIDA, inmunodeficiencias primarias, leucemias agudas, etc.

1. INTRODUCCIN Alrededor de 1980, cinco aos despus que Kohler y Milstein publicaron un mtodo para obtener anticuerpos monoclonales a partir de la fusin de clulas de ratn y una lnea celular de mieloma mltiple, se iniciaron los trabajos de produccin de estos anticuerpos en varios centros de investigacin. La tecnologa de los anticuerpos monoclonales (ver captulo 44) revolucion la clasificacin de los antgenos celulares de superficie. La especificidad de estos anticuerpos permiti identificar y estudiar protenas de la membrana de linfocitos, plaquetas, monocitos y granulocitos, que usando heteroantisueros preparados en conejos no haban sido descritas. La produccin de anticuerpos monoclonales en diferentes centros, condujo a que anticuerpos con diferente nombre reconocieran una misma molcula, debido a que la denominacin de los anticuerpos inclua abreviaciones de los nombres de los investigadores que los producan o de sus instituciones. Esta situacin motiv a que en 1982 se realizara en Pars el Primer Taller (workshop) Internacional sobre Antgenos de Diferenciacin de Leucocitos, que tuvo como propsito compa-

rar la reactividad de los anticuerpos monoclonales con clulas hematopoyticas de diferentes linajes. Los organizadores del taller separaron los anticuerpos en una serie de paneles codificados sobre la base de especificidad putativa de los anticuerpos. Los paneles fueron distribuidos a investigadores de 55 laboratorios quienes usaron los anticuerpos para inmunotipificacin, anlisis de unin cuantitativo, estudios inmunoqumicos de las estructuras reconocidas por los anticuerpos y estudios funcionales. Los datos obtenidos en los laboratorios fueron tabulados por los organizadores, quienes desarrollaron una nmina tentativa de especificidades. Los anticuerpos monoclonales que tienen patrones de reactividad similares con varios tejidos, tipos de clulas y/o molculas, se asignaron a un grupo de diferenciacin ("Cluster of Diferentiation, CD), seguido de un nmero. Se agrega un sufijo "w" a los CD que estn siendo sometidos a estudio en los talleres o worshops. La designacin CD tambin se usa para identificar la molcula que reconoce el anticuerpo monoclonal, y en tal caso es ms adecuado hablar de molcula CD. La posterior determinacin de la funcin y estructura molecular de estos antgenos ha permitido un mayor entendimiento de las interacciones celulares involucradas

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en la respuesta inmune. Los workshops sobre CD se organizan en secciones dedicadas a: a) clulas B, b) clulas T, c) clulas NK, d) clulas mieloides, e) plaquetas, f) clulas endoteliales, g) molculas de adhesin y h) receptores de citoquinas. El VI workshop realizado en Kobe, Japn en noviembre de 1996 privilegi la clasificacin de las molculas CD segn participaran en la respuesta inmune y/o res-

puesta inflamatoria. Las bases de datos actualizadas sobre molculas CD se puede obtener desde Internet a trves de algunas de las siguientes direcciones: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/prow/, http://www.immunologylink.com/CDantigen.htm, www.hlda.org o http://members.aol.com/ researchd1/rdicdabs/cdindex.htm. Actualmente se han descrito ms de 240 molculas CD (tabla 46-1).

Tabla 45-1. Principales caractersticas de los antgenos de grupos de diferenciacin (CD)

Designacin CD (Sinnimo) Estructura molecular Principal expresin celular Timocitos corticales, clulas dendrticas (incluyendo clulas de Langerhans); LB (CD1c); epitelio intestinal (CD1d) Timocitos, LT, clulas NK LT activados y algunas clulas NK LT, Timocitos Funcin

CD1a CD1b CD1c CD1d

43-49 kDa; asociada a 2 SFIg

Molcula MHC clase I asociada a b2m. Puede participar en la presentacin antignica.

CD2 (T11; LFA 2;receptor de eritrocitos de cordero) CD2R (T11-3) CD3 (T3; Leu-4)

45-58 kDa transmembrana tipo I SFIg 45-58 kDa SFIg Complejo de cinco cadenas ( , , , , ) de 16-28 kDa c/u 55 kDa; Protenas transmembrana tipo I SFIg 67 kDa; Protenas transmembrana tipo I Receptor scavenger 100-130 kDa; Protenas transmembrana tipo I Receptor scavenger 40 kDa; Protenas transmembrana tipo I SFIg Compuesto por dos cadenas de 33-34 kDa expresado como dmeros o SFIg

Molcula de adhesin, ligando de CD58(LFA-3); activacin de LT Eptopo conformacional de CD2, dependiente de activacin. Transduccin de la seal como resultado del reconocimiento antignico por LT Se une a molcula MHC clase II. Transduccin de seal va lck. Receptor de gp120 de VIH-1 y VIH-2. Ligando de CD72 En la activacin celular y/o adhesin. Posiblemente juega un rol en la transduccin de seales Desconocida. Marcador para clulas T en LLA y leucemia a clulas indiferenciadas. Adhesin (se une a molculas MHC clase I); transduccin de seales

CD4 (T4)

LT helper, macrfagos y clulas dendrticas LT; subpoblacin de clulas B y timocitos Subpoblacin de LT; timocitos y algunos LB Timocitos, LT, clulas hematopoyticas pluripotenciales LT citotxicos y subpoblacin de timocitos monocitos,

CD5 involucrado (T1;Lyt-1) CD6 (T12) CD7 (Gp40)

CD8 (T8; Leu-2; Lyt-2)

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CD9 (p24)

22-27 kDa; Protenas transmembrana tipo III Molcula tetra-span

Plaquetas, megacariocitos, monocitos, clulas pre-B, eosinfilos, basfilos y LT activados Clulas pre B, LB de centros germinales, algunos neutrfilos, precursores de LT y clulas epiteliales Linfocitos, neutrfilos, monocitos y macrfagos Granulocitos, monocitos, clulas NK y subset de LT y LB

Participa en la agregacin y activacin plaquetaria

CD10 (Neural endopeptidasa; Common Acute Lymphocytic Leukemia Antigen o CALLA) 100 kDa; Protenas transmembrana tipo II Metaloproteasa dependiente de Zn que rompe enlaces peptdicos en el extremo amino de los aminocidos hidrofbicos. Marcador de LLA. Adhesin: unin a ICAM-1 (CD54), ICAM2 e ICAM-3.

CD11a (cadena de LFA-1)

180 kDa, asociado con CD18 forma la integrina LFA-1; Protenas transmembrana tipo I. 170 kDa, asociado con CD18 forma la integrina CR3. Protenas transmembrana tipo I ver CD11a

CD11b

Ligando de CD54, iC3b y protenas de la matriz extracelular.

CD11c (p150,95; CR4)

150 kDa, asociado a CD18 forma integrina CR4. Protenas transmembrana tipo I ver CD11a 90-120 kDa 150-170 kDa; Protenas transmembrana tipo II 53-55 kDa; Protenas, unida a Protenas I

Monocitos, macrfagos, neutrfilos, clulas NK y algunos LT y LB Monocitos, neutrfilos y plaquetas Granulocitos, monocitos y clulas mielomonocticas Monocitos, macrfagos, neutrfilos, algunas LB y clulas dendrticas Neutrfilos, eosinfilos y monocitos

Funcin similar a CD11b. Une fibringeno

CDw12 CD13 (gp150, aminopeptidasa N) CD14 (Mo2; gp55)

Desconocida Participa en la explosin oxidativa Receptor para lipopolisacrido (LPS) y para el complejo LPS-LBP (LPS-binding protein) Forma parte del grupo Sialil Lewis X; ligando para E-selectina (CD62E)

CD15 y CD15S (Lewis X y Sialil Lewis X) CD15u (Sulphated CD15) CD16a CD16b (FcRIII) CDw17 (lactosilceramida) CD18 (2 Integrina)

Pentasacrido ramificado expresado en glicolpidos y Protenass de membrana.

50-65 kDa

Clulas NK, granulocitos y macrfagos Monocitos, neutrfilos y plaquetas La misma distribucin que CD11a, CD11b y CD11c combinado

Componente del receptor Fc de baja afinidad: ADCC y activacin de clulas NK Lactosilseramida

Eptopo carboxihidratado 95 kDa; Protenas transmembrana tipo I.

Ver CD11a, CD11b y CD11c

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CD19 (B4)

95 kDa; Protenas transmembrana tipo I SFIg

Todos los LB y sus precursores

Forma complejo con CD21 CR2) y CD81 (TAPA-1). Molcula accesoria de transduccin de seales en LB Posible papel en la regulacin de la activacin de LB.

CD20 (B1; Bp35)

Heterodmero de tres cadenas de 33, 35 y 37 kDa; Protenas transmembrana tipo I. Molcula tetra-span

LB

CD21 (CR2; Receptor de C3d; B2) 145 kDa; Protenas transmembrana tipo I. SF de protenas de control del complemento LB, clulas dendrticas foliculares, farngeas y clulas epiteliales cervicales, algunos timocitos, y algunas LT LB Receptor para C3d, tambin relacionado con el virus de Epstein-Barr. Con CD19 y CD81 forma correceptor de LB

CD22 (BL-CAM) CD23 (FcRII)

135 kDa; Protenas integral de membrana tipo I. SFIg 45 kDa; Protenas transmembrana tipo II

Participa en la adhesin celular y activacin de LB Receptor de baja afinidad para IgE. Ligando para los correceptores CD19,CD21, CD81. Puede jugar un rol en la induccin de la proliferacin y/o diferenciacin de LB Cadena del receptor para la IL-2. El receptor de alta afinidad para la IL-2 est compuesto por las cadenas (CD25),y (CD122) y (CD132) Dipeptidilpeptidasa IV, Proteasa implicada en el ingreso de VIH a la clula Participa como seal coestimulatoria en la activacin de LT y LB

LB maduras, macrfagos activados, clulas dendrticas foliculares y plaquetas LB y Pre-B, neutrfilos y al menos el 2% de los timocitos LT activados, LB y monocitos

CD24

42 kDa; protena unida a Protena tipo I

CD25 (TAC; IL-2R)

:55 kDa,SP de control del complemento; Protenas de transmembrana tipo I.

CD26 (Dipeptidilpeptidasa IV) CD27

110 kDa; Protenas transmembrana tipo II 110 kDa (55 cada cadena); Protenas transmembrana tipo I. SP de receptor NGF

LT y B activados, macrfagos LT maduros, timocitos medulares

CD28 (Tp44) 44 kDa; Protenas transmembrana tipo I SFIg Leucocitos Subpoblacin de LT y timocitos. LB activados Subunidad 1 de integrinas. Receptor para seal coestimuladora (segunda seal). Ligando de CD80 (B7-1) y CD86 (B7-2) Asociada a CD49 a forma VLA-1. Adhesin a las protenas de la matriz extracelular, adhesin clula-clula. Se asocia a proliferacin celular y muerte celular en lneas celulares de linfomas.

CD29

130 kDa (Integrina 1)

CD30 (Ki-1)

105-120 kDa. Protenas transmembrana tipo I. SP de receptor NGF

LB y T activados

762

Sin ttulo-2

762

5/26/06, 10:27 AM

CD31 (PECAM-1)

130-140 kDa; Protenas transmembrana tipo I. SFIg

Granulocitos, plaquetas, clulas endoteliales, monocitos Monocitos, granulocitos, LB, eosinfilos Clulas mieloides y precursores mieloides Stem cells y endotelio capilar Monocitos, granulocitos, clulas dendrticas, eritrocitos, LB y eosinfilos Monocitos, plaquetas LB maduros, algunos LT monocitos y granulocitos Clulas plasmticas, timocitos, LT y B activados

Participa en la adhesin leucocito-endotelio

CD32 (FcRII) CD33

40 kDa SFIg 67 kDa; Protenas transmembrana tipo I SFIg 105-120 kDa

Receptor Fc de IgG; papel en fagocitosis, ADCC Desconocida

CD34 CD35 (CR1)

Ligando para CD62 (Lselectina) Unin y fagocitosis de partculas opsonizadas con C3b y C4b

250 kDa SF de protenas de control del complemento

CD36 (GPIV) CD37

58-90 kDa; Protenas transmembrana tipo III 40-52 kDa; protena tipo III Familia tetra-span 45 kDa; Protenas transmembrana tipo II

Adhesin plaquetaria Molcula implicada en la transduccin de seales

CD38 (T10)

Molcula implicada en la activacin y proliferacin celular. Tambin se le asocia con el metabolismo del calcio. Puede facilitar la adhesin de LB Receptor para seal coestimuladora para LB; se une al ligando de CD40 (CD40L) presente en LT Activacin y agregacin plaquetaria: receptor de fibringeno y fibronectina Adhesin plaquetaria, unin a factor von Willebrand

CD39

78 kDa

Macrfagos, clulas dendrticas, LB maduras y clulas NK activadas LB, monocitos, clulas dendrticas

CD40

Heterodmero de cadenas de 44 y 48 kDa; Protenas transmembrana tipo I SF de receptor NGF (ProtenasIIb) Heterodmero de 120 y 23 kDa:

CD41 Plaquetas, megacariocitos

CD42a (GPIX) CD42b (GPIb-) CD42c (GPIb-b) CD42d (GPV) CD43 (Sialoforina,leuco-sialina) CD44 (Pgp-1; Hermes) CD44R (CD44v; CD44v9)

17-23 kDa 160kDa (135,23) 22 kDa 82 kDa 115-135 kDa (neutrfilos) 95-115 kDa (linfocitos T) 80-100 kDa

Plaquetas y megacariocitos Ver CD42a Ver CD42a Ver CD42a Leucocitos (excepto LB en reposo) Leucocitos, eritrocitos

Participa en la adhesin y activacin de clulas T. Se une a CD54 (ICAM-1) Receptor de cido hialurnico, involucrado en metstasis tumoral Receptor de cido hialurnico, involucrado en metstasis tumoral

85-250 kDa

Leucocitos, eritrocitos

763

Sin ttulo-2

763

5/26/06, 10:27 AM

CD45 (T200, B220, antgeno comn leucocitario o LCA) CD45RO

180-240 kDa

Clulas epiteliales, monocitos y linfocitos activados Subpoblacin de LT y LB, monocitos y macrofagos LB, subgrupo de LT CD4 y monocitos. Subpoblacin de LT, LB, monocitos, macrofagos, granulocitos

Molcula asociada a la adhesin celular de los leucocitos al endotelio y sitios de inflamacin Isoforma de CD45 la cua lno contiene los exones A,B y C. Isoforma de CD45, contiene exn C. Ver CD45

180 kDa

CD45RA (B220)

205-220 kDa

CD45RB CD45RC CD46 (MCP)

190-220 kDa

Isoforma de CD45, contiene exn B. Isoforma de, contiene exn C.

56-66 kDa

Timocitos, leucocitos, clulas epiteliales fibroblastos, plaquetas No tiene tejidos especficos

Protena cofactor de membrana, se une a C3b y C4b para permitir su degradacin por factor I Puede participar en el flujo de cationes en la membrana. Se asocian a grupo sanguneo y Rh Desconocida. Denominacin antigua: CDw149 Participa en la adhesin celular va CD2 Adhesin a colgeno, laminina. Se asocia a CD29

CD47 (Protenas47-52; IAP)

47-52 kDa

CD47R (MEM-133) CD48 (BLAST-1) CD49a (VLA-1), 40-47 kDa; Protenas unida a Protenas I 210 kDa integrina 1

Amplia Leucocitos, epitelio bronquial y glndulas salivares LT y B activados, monocitos, endotelio neurovascular Plaquetas, LT y B, fibroblastos y clulas endoteliales

CD49b (VLA-2; gpIa)

160-170 kDa; Protenas transmembrana tipo I. integrina 2

Adhesin a la matriz extracelular: receptor para colgeno. Se asocia a CD29, se une a colgeno y laminina Adhesin a fibronectina, laminina. Se asocia a CD29, se une a colgeno Adhesin a fibronectina, se asocia a CD29, HEV de placas de Peyer y UCAM-1 Adhesin a fibronectina. Se une a CD29

CD49c (VLA-3) 125 kDa; Protenas transmembrana tipo I. Integrina 3 membranas basales 150 kDa(integrina 4) (VLA-4) LB, glomrulos renales, tiroides y algunas y laminina LT, B, NK, monocitos, eosinfilos, eritroblastos, timocitos y cultivos mieloides Monocitos, neutrfilos, leucocitos, fibroblastos, plaquetas, mieloblastos y LT de memoria Plaquetas, macrfagos, monocitos, timocitos, LT de memoria

CD49d

CD49e (VLA-5)

Dmero de 125 y 35 kDa, asociado a CD29. Integrina 5.

CD49f (VLA-6) Dmero de 125 y 25 kDa asociado a CD29 Integrina 6 Adhesin a la matriz extracelular: receptor para aminina. Se asocia a CD29

764

Sin ttulo-2

764

5/26/06, 10:27 AM

CD50 (ICAM-3) CD51 (cadena del receptor de vitronectina)

108-140 kDa; protena transmembrana tipo Y Heterodmero de 120 y 24 kDa

Timocitos, LT, B, monocitos y granulocitos Clulas endoteliales, monocitos, macrfagos, plaquetas, algunas clulas B, osteoclastos y clulas uterinas Leucocitos Leucocitos, plaquetas, osteoblastos y osteoclastos Leucocitos y clulas endoteliales

Ligando para CD11a/CD18 (LFA-1) Adhesin: receptor para vitronectina, fibringeno, factor von Willebrand y trombospondina. Se asocia a CD61 Blanco para inmunoterapia, mitognico Transduccin de seales Adhesin: ligando para CD11a/CD18 (LFA-1), CD11b/CD18 (Mac-1). Receptor para rinovirus Regulacin de la activacin del complemento, DAF (decay accelerating factor), se une a C3b, desensambla convertasas de C3 y de C5. Adhesin homotpica: isoforma de molculas de adhesin de clulas neurales (NCAM)

CD52 (CAMPATH-1) CD53 (OX-44; MEM-53) CD54 (ICAM-1)

21-28 kDa 35-42 kDa; protena tipo III 85-110 kDa; Protenas transmembrana tipo I SFIg 70-73 kDa; Protenas transmembrana unida a Protenas I

CD55 (DAF)

Todas las clulas hematoyticas (incluidos los eritrocitos)y no hematopoyticas Clulas NK,clulas embrionarias, mieloblastos, astrocitos, epitelio tirodeo y subgrupo de LT Clulas NK, algunos LT, unos pocos LB y monocitos Muchas clulas hematopoyticas y fibroblastos Muchas clulas hematopoyticas incluidos glbulos rojos, endotelio vascular, clulas epiteliales y placenta Subgrupo de LT, algunos monocitos y plaquetas Subgrupo de LT, algunos monocitos y plaquetas Subgrupo de LT, algunos monocitos y plaquetas Plaquetas, macrfagos megacariocitos, clulas endoteliales, osteoclastos y clulas uterinas Endotelio

CD56 (Leu-19)

Hetrodmero de 135 y 220 kDa

CD57 (HNK-1; Leu-7) CD58 (LFA-3) CD59 (MEM-43; LY6; MIRL)

110 kDa. Olgosacarido presente en glicoprotenas 55-70 kDa; protena de transmembrana tipo I o unida a Protenas I 19 kDa; Protenas unida a protenas I

Desconocida Adhesin: ligando de CD2

Regulacin de la accin del complemento (formacin MAC); se une a C8 y C9.

CD60a (GD3) CD60b (9-O-acetyl-GD3) CD60c (7-O-acetyl-GD3) CD61 (ProtenasIIIa)

Olgosacarido presente en glucosidos Olgosacarido presente en glucosidos Olgosacarido presente en glucosidos 105 kDa

Anticuerpos anti-CD60 proporcionan una Seal coestimulatoria para LT. Anticuerpos anti-CD60 proporcionan una Seal coestimulatoria para LT. Anticuerpos anti-CD60 proporcionan una Seal coestimulatoria para LT. Desconocida. Se une a CD51 y CD41

CD62E (ELAM-1; E-selectina)

140 kDa, lectina tipo C

Adhesin de leucocitos al endotelio; se liga a sialil Lewis x, media el rolling de los neutrfilos

765

Sin ttulo-2

765

5/26/06, 10:27 AM

CD62L (LAM-1; L-selectina)

150 kDa, lectina tipo C

LB, T, y otros leucocitos

Adhesin de leucocitos al endotelio; se une a CD34, glyCAM-1, media rolling de neutrfilos Adhesin de monocitos y neutrfilos a plaquetas activadas y clulas endoteliales, se liga a sialil Lewis x Facilita la adhesin al endotelio activado, protena lisosomal translocada a superficie post activacin Receptor Fc de alta afinidad: participa en la fagocitosis, ADCC, y activacin de macrfagos Participa en la activacin de neutrfilos Anticuerpos anti-CD65s inhiben fagocitosis Participan en la adhesin. Miembro de la familia antgeno carcinoembrionario El CD67 ha sido definido como CD66b Molcula inductora de activacin. Desconocida. Antgeno de activacin temprano Ligando para CD27 Receptor para transferrina: participa en el metabolismo de hierro, crecimiento celular Ligando para CD5: interaccin de LT-LB Regula el metabolismo de nucleotidos, defosforilandolos para permitir su liberacin Asociado con molculas de MHC clase II recientemente sintetizadas

CD62P (P-selectina;GMP-140), PADGEM

140 kDa, lectina tipo C

Plaquetas activadas, clulas endoteliales y megacariocitos

CD63 (gp53, PMT)

53 kDa

Plaquetas activadas, monocitos, macrfagos, clulas endoteliales Monocitos, macrfagos, y neutrfilos activados

CD64 (FcRI)

72 kDa; Protenas transmembrana tipo I. SFIg

CD65 (VIM-2) CD65s (sialil-CD65) CD66 a,b,c,d,e

Carbohidrato, componente de ceramida dodesacrido

Clulas mieloides, y algunas clulas monociticas, granulocitos Clulas mieloides, y algunas clulas monociticas, granulocitos

220 kDa, Protenas fosforilada, existen variantes (CD66a CD 66e) 110 kDa, protena intracelular, macrosialina Homodmeros de 28-34 kDa, Protenas fosforilada 70, 95, 170 kDa

Granulocitos, neutrofilos. c y e: carcinoma de colon e: epitelio de colon adulto Monocitos, macrfagos, neutrfilo, linfocitos grandes, basfilos LT y B activados, macrfagos y clulas NK LB y T activados. Macrfagos LB y T activados, macrfagos y clulas proliferativas LB

CD68 (KPI) CD69 (AIM) CD70 (Ki-24) CD71 (T9; receptor de

Homodmero de 90-95 kDa; Protenas transmembrana tipo II

CD72 (Lyb-2 (ratn), lectina tipo C) CD73 (Ecto-5'-nucleotidasa)

Homodmero de 42 kDa

69 kDa; Protenas de membrana unida a Protenas I

Algunos LB, T, timocitos, algunas clulas epiteliales y endoteliales y clulas dendrticas LB, monocitos, clulas dendrticas y LT activadas, macrfagos, clulas MHC clase II. LB maduros y algunos LT

CD74 (cadena MHC clase II invariante (g))

33/35/41 kDa; Protenas de transmembrana tipo II

CD75 (Lactosaminas) CD75s (Alpha-2,6 sialylated lactosamines)

53 y 87 kDa

Adhesin celular. Ligando para CD22

766

Sin ttulo-2

766

5/26/06, 10:27 AM

CD77 (Gb3, Grupo sanguneo Pk) Eptopo carbohidratado Clulas B de centro germinal Puede actuar como receptor de verotoxina de E. coli y toxina Shiga de S. Dysenteriae Molcula accesoria que media la expresin de Ig y la transduccin de seales Ver CD79a Coestimulador para la activacin de linfocitos T; ligando para CD28 y CTLA-4 (CD152) Asociado a CD19 y CD21. Participa en la activacin de LB Transduccin de seales

CD79a (Ig, MB1) 33-33 kDa; Protenas transmembrana tipo I 37-39 kDa; Protenas transmembrana tipo I 60 kDa; Protenas transmembrana tipo I LB

CD79b (Ig, B29, IgSF) CD80 (B7; B7-1; BB1)

LB Clulas dendrticas, LB activados y macrfagos

CD81 (TAPA-1, tetraspasmina) 22 kDa; molcula tipo III Variados grupos celulares, incluyendo linfocitos

CD82 (R2) 50-53 kDa; Protenas transmembrana tipo III Epitelio, endotelio y linfocitos activados, leucocitos Algunas lneas celulares B y T activadas, clulas dendrticas circulantes Monocitos, linfocitos B circulantes, plaquetas Clulas plasmticas y dendrticas, LB y monocitos

CD83 (HB15) 40-43 kDa; Protenas transmembrana tipo I Puede participar en la presentacin antignica

CD84 (2G7, Gr6) CD85 (GR4) 120 kDa Existe evidencia de que CD85participa en la activacion de LT. Pertenece a la familia ILT/LIR Su unin a CD28 presente en los LT induce una seal coestimulatoria mientras que su unin a CD152 (CTLA-4) induce una seal inhibitoria Receptor para el activador del plasmingeno tipo uroquinasa Receptor para el componente del complemento C5a: participa en la inflamacin por complemento Citotoxicidad dependiente de IgA (receptor de IgA) 73 kDa Desconocida

CD86 (FUN-1, GR65, B7-2, B70) 80 kDa; Protenas transmembrana tipo I LB activados, clulas dendrticas y monocitos

CD87 (UPA-R) CD88 (C5a-R)

50-65 kDa; Protenas unida a ProtenasI 40 kDa. SF Rodopsina

LT activados, monocitos y neutrfilos activados Neutrfilos, macrfagos, eosinfilos, clulas mastoides

CD89 (FcR) CD90 (Thy-1)

50-70 kDa; Protenas transmembrana tipo I SFIg 25-35 kDa; protena unida a ProtenasI SFIg 600/G kDa (515/85)

Neutrfilos, monocitos, macrfagos, y algunos LT y B Timocitos, LT perifricas (ratn), neuronas, protimocitos CD34+ Monocitos

Marcador para LT; rol en la activacin de LT Receptor para 2macroglobulina

CD91 (2M-R)

767

Sin ttulo-2

767

5/26/06, 10:27 AM

CD92 (GR9) CD93 (GR11) CD94 (Kp43) CD95 (APO-1; Antgeno FAS) CD96 (Tactile) CD97 (GR1)

70 kDa 120 kDa Dmero de 43 kDa cada unidad

Neutrfilos, plaquetas y monocitos Neutrfilos, monocitos y clulas endoteliales Clulas NK y unas pocas LT LT y lneas celulares mieloides LT activados Monocitos y granulocitos maduros clulas activadas

Desconocida Desconocida El CD94 est implicado en la inhibicin de la clula NK Participa en la muerte celular programada, ligando tipo TNF Desconocida Niveles altos de expresin de CD97 han sido encontrados en sitios de inflamacin como piel y pulmones. Involucrado en la activacin celular. Potencial transportador de aminocidos Desconocida

42 kDa; protena de transmembrana tipo I Formas de 160 kDa; protena transmembrana tipo I Formas de 74, 80, 90 kDa

CD98 (4F2, 2F3)

Dmero de 40 y 80 kDa cada subunidad; Protenas transmembrana tipo II 33 kDa; Protenas transmembrana tipo I 150 kDa

Monocitos, clulas endoteliales, LT, B, NK Timocitos, linfocitos perifricos y clulas mieloides LT, B, NK, macrfagos, monocitos, avisa la expresin en clulas hematopoyticas Granulocitos, monocitos y algunos LT

CD99 (E2; MIC2) CD100 (BB188, CrR3)

Asociada a actividad AT Pasa y serina quinasa. Coestimula con PMA, CD3 y CD2 para inducir proliferacin de LT Anticuerpos anti-CD101 inhiben la respuesta T alognica Ligando para integrina CD11a/CD18 (LFA-1) pero no para CD11b/CD18 (Mac-1) Junto con la integrina 7, forma un receptor que facilita la adhesin al endotelio Forma parte de un receptor para laminina, facilitando la adhesin de clulas a la matriz extracelular Jugara un papel en la adhesin.

CD101 (BB27; BA27, BPC#4) CD102 (ICAM-2)

Dmero de subunidades de 140 kDa

55-65 kDa; Protenas transmembrana tipo I

Clulas endoteliales, monocitos y otros leucocitos

CD103 (HLM-1)

Dmero de subunidades de 150 y 25 kDa; Protenas transmembrana tipo I 220 kDa; Protenas transmembrana tipo I

Linfocitos intra-epiteliales 2-6% linfocitos perfericos, y otros tipos celulares Epitelio, timocitos, unas pocas clulas neuronales, linfocitos, clulas tumorales Clulas epiteliales, macrfagos activados in vitro, clulas endoteliales subset de clulas de mdula sea Clulas endoteliales activadas, macrfagos, clulas dendrticas, estroma medular Plaquetas activadas

CD104 (Integrina 4)

CD105 (Endoglina)

Dmero de 95 kDa; Protenas transmembrana tipo II

CD106 (VCAM-1, IgSF)

90-110 kDa; Protenas transmembrana tipo I

Receptor para la integrina VLA-4: rol en la adhesin, activacin linfoctica, hematopoyesis Protena lisosomal de funcin desconocida

CD107a (LAMP-1)

110 kDa; Protenas transmembrana tipo I

768

Sin ttulo-2

768

5/26/06, 10:27 AM

CD107b (LAMP-2) CD108 (GR2) CD109 (GR56) CD110 (MPL, TPO R) CD111 (PRR1/Nectin1) CD112 (PRR2) 64-72 kDa Clulas mieloides, neuronales, epiteliales y endoteliales Monocitos, granulocitos, plaquetas y clulas endoteliales Placenta, macrfagos, monocitos y sus precursores Monocitos, granulocitos, clulas endoteliales, clulas dendrticas y fibroblastos Progenitores hematopoyticos, clulas mastoides, melanocitos y algunas clulas NK Amplio espectro celular (INF , R) CD119 (IFN-R) CD120a (TNFRI) CD120b (TNFRII) CD121a (IL-1R, tipo I) CDw121b (IL-1R, tipo II) CD122 (IL-2R) 75 kDa; Protenas transmembrana tipo I 80 kDa; Protenas transmembrana tipo I 68 kDa; Protenas transmembrana tipo I 75 kDa; protena transmembrana tipo I 90-100 kDa; Protenas transmembrana tipo I 50-60 kDa Macrfagos, monocitos, LB, clulas epiteliales, endotelio y fibroblastos Muchos tipos celulares, mayor expresin en clulas epiteliales Muchos tipos celulares, mayor expresin en clulas mieloides LT, timociots, condrocitos, clulas sinoviales, hepatocitos, fubroblastos LB, monocitos y macrfagos LT en reposo, LB (algunas lneas), monocitos, y clulas NK Clulas troncales de mdula sea, granulocitos, monocitos, megacariocitos Molcula de adhesin intercelular. Receptor 2 relacionado con el poliovirus (PRR2) Receptor del factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) Receptor del factor estimulador de colonias de monocitos (M-CSF) Cadena del receptor de GM-CSF (CSF-R) 120 kDa; Protenas transmembrana tipo I 75-83 kDa; Protenas de membrana unida a Protenas I 170/150 KDa; Protenas de membrana unida a Protenas I 70-95 KDa Plaquetas activadas LT activados, algunas clulas estromales LT activados, plaquetas activadas y clulas endoteliales stem cells, plaquetas y megacariocitos Clulas mieloides Protena lisosomal de funcin desconocida Posible funcin en la adhesin celular Desconocida

Receptores para la eritropoyetina

CD114 (G-CSFR, CSF3R, HG-CSFR) CD115 (c-fms) CD116 (GM-CSFR)

130 kDa

150 kDa; Protenas transmembrana tipo I. SFIg 70-85 kDa

CD117 (c-kit)

145 kDa; Protenas Transmembrana tipo I SFIg

Receptor de factor stem cell (SCF)

CD118

Receptor del interfern y Receptor de IFN-

Receptor de TNF y

Receptor de TNF y

Receptor para IL-1 Tipo I, se une a IL-1 y Receptor para IL-1 Tipo II, se une a IL-1 y Cadena del receptor de IL-2

CD123 (IL-3R)

70 kDa

cadena + del receptor de la IL-3

769

Sin ttulo-2

769

5/26/06, 10:27 AM

CD124 (IL-4R)

130-150 kDa; Protenas transmembrana tipo I

LB maduras, LT, epitelio, endotelio, precursores hemopoyticos y fibroblastos Eosinfilos y basfilos Clulas plasmticas, leucocitos, clulas epiteliales, fibroblastos, clulas nerviosas y hepatocitos Precursores de LB, timocitos, LT maduros y monocitos Neutrfilos, basfilos, Monocitos y algunos LT Neutrfilos, basfilos, monocitos, y algunos LT La mayora de los leucocitos, clulas epiteliales, fibroblastos, hepatocitos y clulas nerviosas, clulas endoteliales, LB activados y plasmocitos Clulas mieloides

Receptor de IL-4

CDw125 (IL-5R) CD126 (IL-6R)

55-60 kDa 80 kDa; protena transmembrana tipo I

Receptor de IL-5 Receptor de IL-6, subunidad

CD127 (IL-7R, superfamilias de fibronectina tipo II) CDw128a (IL-8RA, CXCR1) CDw128b (IL-8RB, CXCR2) CD130 (gp130, IL-6R)

75 kDa; Protenas transmembrana tipo I 58-67 kDa 58-67 kDa 130-140 kDa; Protenas transmembrana tipo I

Receptor de IL-7

Receptor A de IL-8 Receptor B de IL-8 Receptor de IL-6, subunidad

CDw131

120 kDa

Cadena comn de para receptor IL-3, IL-5 y GMCSF Cadena comn de receptores para IL-2,IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15

CD132 (Cadena comn)

64 kDa LT, LB, clulas NK, monocitos y granulocitos stem cells

CD133 (AC133) CD134 CD135 (F1t3/Flk2) CDw136 (MSP-R) Cdw137 (4-1BB) CD138 (SYNDECAN-1) CD139 CD140a CD140b 209,228 kDa 180 kDa 180 kDa 20 kDa Plasmocitos, clulas epiteliales LB de centros germinales Indetectable en la mayora de las clulas normales Subpoblacin de clulas endoteliales, clulas estromales, Clulas endoteliales 30 kDa Subpoblacin de LT 180 kDa 48-50 kDa 130-150 kDa Subpoblacin de LT activados Subpoblacin de clulas progenitoras Tejidos epiteliales Adhesin de LT activados. Ligando de gp34 Receptor de tirosina quinasa y factor de crecimiento Receptor de protena estimulante de macrfagos Participa como molcula coestimulatoria en la activacin de LT. Ligando para colgeno tipo I Desconocida Receptor de PDGF Receptor de PDGF

CD141 (Trombomodulina)

100 kDa

Participa en la regulacin de la coagulacin

770

Sin ttulo-2

770

5/26/06, 10:27 AM

CD142 (Factor tisular) CD143 (ACE) CD144 (VE-Cadhesina) CDw145 CD146 (MUC18/S-endo) CD147 (Neurotelina/Basigina)

45 kDa

Monocitos activados, clulas endoteliales activados Subpoblacin de clulas endoteliales Clulas endoteliales Clulas endoteliales, algunas clulas estromales Clulas endoteliales, LT activados Clulas endoteliales, monocitos, subpoblacin de LT, plaquetas, eritrocitos Clulas hematopoyticas

El complejo CD142:VIIa inicia la cascada de coagulacin Enzima convertidora de angiotensina (ACE) Molcula de Adhesin Desconocida Participa en la adhesin de LT activados Potencial molcula de adhesin

170 kDa 135 kDa 25,90,110 kDa 118 kDa 50-60 kDa

CD148 (HPTP-ETA/DEP-1) CD150 (IPO-3/SLAM) CD151 (PETA-3) CD152 (Protena-4 asociada a LT citotxicos o CTLA-4) CD153 (CD30L) CD154 (CD40L) CD155 CD156a (ADAM-8) CD156b (TACE/ADAM17) CD157 (BST-1) 42-45 kDa 100-120 kDa 80-90 kDa 60 kDa 33 kDa 40 kDa 44 kDa 27 kDa 75-95 kDa

Desconocida. Tyrosina phosphatasa RPTPasa, tipo III Molcula coestimulatoria para LB y clulas dendrticas. Desconocida Ligando de CD80 y CD86. Regulacdor negativo de la activacin de los LT Ligando de CD30 (CD30L). Funcin desconocida Ligando de CD40 (CD40L). Receptor del virus polio (PVR) Desconocida Proteasa dependiente de Zn. Libera las formas solubles de TNF y TGF- Esta molcula tiene actividad de ADP-ribosil ciclasa y ADP-ribosa hidrolasa cclica Protena perteneciente a la familia KIR (Killer cell immunoglobulin (Ig)-like receptors) presente en las clulas NK Regulacin de actividad de las clulas NK Regulacin de actividad de las clulas NK Regulacin de actividad de las clulas NK

LT,LB, timocitos Plaquetas, clulas endoteliales LT activados, algunos LB activados LT activados LT activados, mastocitos, basfilos Monocitos, macrfagos, timocitos Monocitos, macrfagos, granulocitos Amplia expresin celular

Monocitos, neutrfilos, clulas endoteliales

CD158

Clulas NK

CD158a (p58.1, p50.1) CD158b (p58.2, p50.2) CD158c (p58.3, p50.3) CD159a (NKG2A)

50-58 kDa 50-58 kDa 50-58 kDa

Clulas NK, subpoblacin de LT Clulas NK, subpoblacin de LT Clulas NK, subpoblacin de LT Clulas NK

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CD160 (BY55)

27 kDa. Glicoptotena

Clulas NK y LT CD8+ citotoxicos

Funcin desconocida. Se encuentra alterada en Hemoglobinuria nocturna paroxistica Regulacin de citotoxicidad mediada por clulas NK Molcula de adhesin. Ligando de la P-selectina Desconocida Desconocida Molcula de adhesin

CD161 (NKR-P1) CD162 (PSGL-1) CD162R (PEN5) CD163 (KiM4) CD164 (MGC-24)

60 kDa 110 kDa

Clulas NK, subpoblacin de LT LT, subpoblacin de LB, granulocitos, monocitos Clulas NK

130 kDa 80 kDa

Monocitos LT, monocitos, granulocitos, subpoblacin de LB, clulas progenitoras Clulas epiteliales tmicas

CD165 (AD2/gp37) CD166 (ALCAM) CD167a (DDR1) CD168 (RHAMM) CD169 (Sialoadhesina) CD170 (Siglec-5) CD171 (L1) CD172a (SIRP alpha) CD173 (Grupo de sangre H tipo 2) CD174 (Lewis y) CD175 (Tn) CD175s (Sialyl-Tn) CD176 (TF) CD177 (NB1) CD178 (Ligando del Fas) CD179a (Vpre-B)

37 kDa

Molcula implicada en la adhesin timocito-epitelio tmico Molcula de adhesin. Ligando de CD6 Receptor tirosina quinasa. Es activado por colgeno Adhesin

100 kDa

Linfocitos T y B activados, clulas endoteliales, fibroblastos Clulas epiteliales

Adhesin Adhesin 140-230 kDa Clulas epiteliales y mielomonociticas y subsets de LT y LB Molcula de adhesin implicada en la neurohistogenesis Adhesin Desconocida Desconocida Desconocida

Desconocida Clulas mieloides Linfocitos Desconocida Molcula implicada en la muerte celular programada

16-18 kDa

Linfocitos pro-B y pre-B

Se une a CD179b para conformar la cadena liviana necesaria para la constitucin del receptor de la clula B (BCR)

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CD179b (Lambda 5)

22 kDa

Linfocitos pro-B y pre-B

Se une a CD179a para conformar la cadena liviana necesaria para la constitucin del receptor de la clula B (BCR) Participa en el reconocimiento de LPS Receptor para quimoquinas CXC como IP10, Mig y ITAC. Se expresa en LT presentes en los sitios de inflamacin. Efecto quimiotctico Receptor para quimoquinas CXC. Receptor para quimoquinas CC Receptor para quimoquinas CC Desconocida

CD180 (RP105) CD183 (CXCR3)

95-105 kDa 41 kDa

Linfocitos B, monocitos y clulas dendriticas LT y subsets de LB y NK

CD184 (CXCR4) CD195 (CCR5) CDw197 (CCR7) CD200 (OX2) CD201 (EPC R) CD202b (Tie2, Tek) CD203c (NPP3, PDNP3) 270 kDa

LT y subsets de LB y NK LT LT

Clulas endoteliales Clulas endoteliales

Desconocida Desconocida

Clulas mieloides basofilos Clulas mieloides

Enzima que cataliza la hidrolosis de oligonucleotidos.

CD204 (Macrophage scavenger R) CD205 (DEC205) CD206 (Macrophage mannose R) CD207 (Langerin) CD208 (DC-LAMP) CD209 (DC-SIGN) CDw210 (IL-10 R) CD212 (IL-12 R) CD213a1 (IL-13 R 1) CD213a2 (IL-13 R 2) CDw217 (IL-17 R) CD220 (Insulina R) CD221 (IGF1 R) CD222 (Mannose-6-phosphate, IGF2 R) CD223 (LAG-3) CD224 (Gamma-glutamil transferasa) 250-300 kDa

Clulas dendrticas Clulas dendrticas Clulas dendrticas Clulas dendrticas Clulas dendrticas Receptor de la IL-10 Receptor de la IL-12 Receptor 1 de la IL-13 Receptor 2 de la IL-13 Receptor de la IL-17 Receptor de la insulina Receptor de IGF1 Molcula involucrada en la internalizacin de protenas y enzimas hacia los lisosomas.

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CD225 (Leu13) CD226 (DNAM-1, PTA1) CD227 (MUC.1) CD228 (Melanotransferrina) CD229 (Ly9) CD230 (Protena Prion) CD231 (TALLA-1/A15) CD232 (VESP R) CD233 (Band 3) CD234 (Fy-glycoprotein o DARC) CD235a (Glicoforina A) CD235b (Glicoforina B) CD235ab (Glicoforina A/B CD236 (Glicoforina C/D CD236R (Glicoforina C) CD238 (Kell) CD239 (B-CAM) CD240CE (Rh30CE) CD240D (Rh30D) CD240DCE (Rh30D/CE) CD241 (RhAg) CD242 (ICAM-4) CD243 (MDR-1) CD244 (2B4) CD245 (p220/240) CD246 (Anaplastic lymphoma kinase) CD247 (Zeta chain) Clulas eritroides Clulas eritroides Clulas eritroides Clulas eritroides Stem cells Clulas NK Linfocitos T Linfocitos T Linfocitos T Clulas eritroides Clulas eritroides Clulas eritroides Clulas eritroides Clulas eritroides Clulas eritroides Clulas eritroides Clulas eritroides Clulas eritroides Clulas eritroides LT de la LLA-T Funcin desconocida. Es un marcador especfico para la LLA-T 220-350 kDa 65 kDa. Glicoprotena Clulas NK, plaquetas, monocitos y un subset de LT Clulas epiteliales Adhesin celular

Adhesin y sealizacin celular

AcMo, anticuerpo monoclonal; ADCC, citotoxicidad dependiente de anticuerpo; 2m, Beta 2 microglobulina; CFS, factor estimulador de colonias; , cromosoma; GM, granulocito-monocito; Protenas, glicoprotena;ProtenasI, glicofosfatidilinositol; HEV, vnula de endotelio columnar; INF g, interfern gama;+IL, interleuquina; LB, linfocito B; LT, linfocito T; MAC, complejo de ataque a membrana; M, monocito; SF, superfamlia; SFIg, superfamilia de las inmunoglobulinas; TNF, factor de necrosis tumoral.

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Actualmente se sabe que la mayora de las molculas CD reconocidas por anticuerpos monoclonales murinos se expresan en ms de una lnea celular hematopoytica. Otras molculas CD tambin son expresadas por clulas no hematopoyticas (ej. clulas endoteliales, clulas estromales) que son fundamentales en las respuestas inmune y/o inflamatoria.

2. ESTRUCTURA DE LOS ANTGENOS DE MEMBRANA Las protenas de membrana se clasifican en cuatro grupos, dependiendo de la orientacin de la molcula en la membrana plasmtica o de su unin a ella. 2.1. Protenas de transmembrana tipo I Las protenas de transmembrana tipo I tienen el extremo carboxilo en el interior de la clula y el extremo amino en el exterior de la misma (figura 46-1). Generalmente estas protenas tienen una secuencia seal en el extremo amino, la que es removida luego que la molcula entra al retculo endoplsmico. Posteriormente, si presenta sitios de glicosilacin, puede ser glicosilada en el aparato de Golgi y expresada en la superficie celular. La mayora de las molculas CD son glicoprotenas de transmembrana tipo I. Estas pro-

tenas generalmente participan como receptores de superficie celular y/o ligandos. Varias de ellas pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas (SFIg), como por ejemplo las molculas CD2, CD4, CD8 y CD19. Las protenas de transmembrana tipo I, generalmente presentan un dominio de transmembrana de aproximadamente 25 aminocidos hidrofbicos, seguido por un grupo de aminocidos bsicos. Estos aminocidos con carga positiva permiten la unin de estas protenas a las cargas negativas de los fosfolpidos aninicos ubicados en la capa interna de la membrana celular. El dominio de transmembrana no contiene algunos aminocidos como arginina, asparragina, cido asprtico, cido glutmico, glutamina, histidina o lisina, excepto cuando est asociado con el dominio de transmembrana de otras protenas de membrana, formando un complejo multimrico. Por ejemplo, las protenas del complejo CD3 y las dos protenas del TCR (ver captulo 7). 2.2. Protenas de transmembrana tipo II Las protenas de transmembrana tipo II tienen una orientacin opuesta a las protenas de transmembrana tipo I. El extremo amino se encuentra en el interior de la clula y el extremo carboxilo en el exterior de la misma (figura 46-2). Entre las molculas CD que presentan esta estructura se encuentran CD10, CD13, CD23 y CD26.

Figura 46-1. Esquema de una protena de transmembrana tipo I. Estas protenas tienen el extremo carboxilo orientado hacia el interior y el extremo amno hacia el exterior de la clula. Como ejemplo se muestra la molcula CD4.

Figura 46-2. Esquema de las protenas de transmembrana tipo II. Estas protenas presentan su extremo amino orientado hacia el interior de la clula y el extremo carboxilo hacia el exterior de la misma, respectivamente.

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Estas protenas a menudo presentan secuencias seal para dominios de transmembrana que no han sido removidas lo que permite su remocin y liberacin de la superficie celular. As, estas protenas se pueden comportar tanto como antgenos de superficie y protenas plasmticas. 2.3. Protenas de transmembrana tipo III

nales a travs de la bicapa lipdica, para transporte de iones o molculas pequeas. Un subgrupo de este tipo de protenas de transmembrana es la denominada tetra-span family las cuales se caracterizan por cruzar cuatro veces la membrana y presentar ambos extremos de la molcula hacia el interior de la clula. Un ejemplo de esta familia de molculas es el CD9. 2.4. Protenas unidas a glicofosfatidilinositol

Las protenas de transmembrana tipo III cruzan la membrana celular ms de una vez, pudiendo presentar el extremo carboxilo en el interior de la clula y el extremo amino en el exterior de la misma, o bien ambos extremos en el interior de la clula (figura 46-3). Entre las molculas CD que presentan esta estructura estn: CD9, CD20, CD36, CD37, CD53, CD63 y CD81. La caracterstica de cruzar ms de una vez la membrana, permite a estas protenas formar ca-

Este tipo de protenas est totamente expuesto en el exterior de la clula y se une a la bicapa lipdica a travs de una unin covalente (va un oligosacrido especfico) a fosfatidilinositol ubicado en la cara externa de la membrana. A esta unin se le llama glicofosfatidilinositol (figura 46-4). Entre las protenas que presentan esta estructura se encuentran las molculas CD14, CD24, CD48, CD58 y CD87.

Figura 46-3. Esquema de protena de transmembrana tipo III. Estas protenas cruzan la membrana celular ms de una vez y pueden presentar sus extremos carboxilo y amino en dos orientaciones: a) El extremo carboxilo en el interior de la clula y el extremo amino en el exterior de la misma, y b) ambos extremos en el interior de la clula.

Figura 46-4. Esquema de protenas ancladas a glicofosfatidilinositol. Este tipo de protenas se une a la bicapa lipdica de la membrana celular a travs de glicofosfatidilinositol (GPI).

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Inmediatamente despus de finalizada la sntesis proteica, la protena precursora permanece unida a la membrana del retculo endoplsmico a travs de una secuencia de 15-20 aminocidos hidrofbicos en su extremo carboxilo mientras que el resto de la protena se ubica en el lumen del organelo. Inmediatamente, una enzima corta la protena liberndola del segmento hidrofbico unido a la membrana mientras que el nuevo extremo carboxilo se une a un grupo amino de una molcula GPI previamente formada. 3. MOLCULAS CD ASOCIADAS A LNEAS CELULARES Una de las utilidades de las molculas CD ha sido el reconocimiento del linaje celular y el estadio madurativo de las clulas hematopoyticas, particularmente de los leucocitos. As por ejemplo el antgeno CD3 identifica a los LT, CD20 a los LB, CD66 de los granulocitos y CD61 a las plaquetas. Sin embargo, la mayora de los antgenos son expresados en diferente cantidad por varios tipos de clulas; para la identificacin de algunos tipos celulares se requiere la identificacin de dos o ms antgenos, lo que actualmente se realiza por citometra de flujo (ver captulo 31). En el captulo 12 se describe las molculas CD asociadas a la ontogenia de las clulas B y T. En el estudio de las leucemias agudas, linfomas, e inmunodeficiencias, es particularmente importante conocer la lnea celular afectada. Adems de las molculas CD asociadas, preferentemente, a ciertas lneas celulares en particular, se han identificado molculas CD asociadas a la activacin de LB, LT y plaquetas. 3.1. Molculas CD expresadas principalmente en "stem cells" Molcula CD34. La molcula CD34 es el principal marcador utilizado en el reconocimiento de las clulas progenitoras hematopoyticas o stem cells. Se trata de una sialoglicoprotena de transmembrana de 105-120 kDa (reducida). Forma parte de la familia cell surface mucin junto a las molculas CD43 y CD68. La molcula CD34 es potencialmente adhesiva y probablemente interacta con CD62E (E-selectina) y CD62L (Lselectina). Las stem cells representan un pequeo porcentaje de las clulas de la mdula sea y sangre perifrica. Tambin se encuentran en el hgado fe-

tal. Actualmente, estas clulas son utilizadas en trasplantes las cuales son obtenidas a partir de sangre perifrica, realizando leucofresis y seleccionando las clulas CD34+. 3.2. Molculas CD expresadas principalmente en linfocitos B Molcula CD10. La molcula CD10, tambin conocida como CALLA (common acute lymphocytic leukemia antigen) tiene un peso molecular de 10 kDa y es miembro de una familia de peptidasas de superficie celular. Molcula CD19. La molcula CD19 es una glicoprotena de transmembrana tipo I de 95 kDa (reducida). Es miembro de la SFIg; los dos dominios extracelulares que presenta son del tipo inmunoglobulinas. Su expresin est restringida a las clulas B normales y neoplsicas. Se expresa desde el estadio de clula pre-B a clula plasmtica. Se asocia no covalentemente con CD21, CD81 y Leu-3, formando un complejo que en forma independiente del BCR (ver captulo 6) participa en la transduccin de seales. Molcula CD20. La molcula CD20 se encuentra en todas las clulas B y en algunos precursores de LT. Es una fosfoprotena que se expresa en tres isoformas (33, 35 y 37 kDa) como consecuencia de una diferente fosforilacin de las serinas y treoninas existentes en los extremos de la molcula. Esta molcula presenta cuatro dominios transmembrana y los extremos amino y carboxilo se encuentran en el citoplasma. A pesar de su disposicin en la membrana, esta molcula no integra la familia "tetra-spans". Su estructura sugiere que podra actuar como canal inico, particularmente de Ca2+. Molcula CD21. La molcula CD21 se expresa en una subpoblacin de clulas B. Es una glicoprotena de transmembrana tipo I (140 kDa) que presenta 15 16 dominios de 60-70 aminocidos (extracelular), seguido por un dominio de transmembrana y 34 aminocidos intracitoplasmticos. La molcula CD21 es el receptor de los fragmentos C3d (CR2), C3dg e iC3b del complemento. A trves de un dominio de unin diferente acta como receptor del virus EpsteinBarr. Es miembro de la familia gnica de

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reguladores de la activacin del complemento, integrada tambin por las molculas CD35, CD46 y CD55. Tambin participa como ligando de CD23. Junto con CD19, CD81 y Leu-3, forma parte de un complejo que transduce seales al interior de los LB. Molcula CD22. La molcula CD22 es una glicoprotena de transmembrana tipo I de 140 kDa. Es miembro de la familia sialoadhesina (sialoadhesina, CD33, glicoprotena asociada a mielina). Se conocen dos isoformas ( y ); la forma tiene siete dominios tipo Ig (dos ms que la forma ) y una cola citoplasmtica 23 aminocidos ms larga que la forma . La molcula CD22 se expresa en una subpoblacin de las clulas B y acta como una molcula de adhesin con capacidad de unin para cido silico de carbohidratos que presentan por ejemplo las molculas CD45RO, CDw75 y CDw76. Molcula CD23. La molcula CD23 es una glicoprotena de transmembrana tipo II de 45-50 kDa (reducida). Dado que presenta hacia su extremo carboxilo un dominio tipo lectina, pertenece a la familia de lectinas dependiente de calcio, al igual que las molculas CD69, CD72 y CD94. La molcula CD23 se expresa en una subpoblacin de LB. Existen dos formas, FcRIIa y FcRIIb las que difieren slo en el extremo amino. Continuamente el CD23 est siendo liberado de la superficie celular como un polipptido de 33 kDa que se ha visto acta como factor de crecimiento de LB. Molcula CD24. La molcula CD24 es una glicoprotena unida a GPI. Tiene aproximadamente 42 kDa (reducida) y est marcadamente glicosilada. Se expresa en clulas B (desde clula pre-B hasta clula plasmtica) y en granulocitos. Varias protenas unidas a la membrana a travs de ProtenasI, entre ellas CD24, se han encontrado asociadas con protenas tirosinas kinasas, fundamentales en la transduccin de seales y activacin celular. Molcula CD40. La molcula CD40 es una glicoprotena de transmembrana tipo I de 44-48 kDa (reducida). Integra la familia de receptores TNF/NGF (factor de crecimiento de nervio), al

igual que las molculas CD27, CD30, CD95, CD120a y CD120b. El dominio extracelular presenta cuatro repeticiones ricas en cisteina. Es contrareceptor de CD40L (CD154) que se expresa en los LT activados, por lo que est involucrada en la interaccin LB-LT durante el cambio de clase de inmunoglobulinas. Molcula CD72. La molcula CD72 es una protena de transmembrana tipo II que tiene la estructura de un homodmero de 39 y 42 kDa (reducida). Junto con las molculas CD23, CD69 y CD94 integra la familia de lectinas dependiente de calcio. Puede actuar como ligando de la molcula CD5 expresada en todos los LT y en una subpoblacin de LB. Se expresa en todos los estadios madurativos de las clulas B, excepto en las clulas plasmticas. Molcula CD80. La molcula CD80 es una protena de transmembrana tipo I de 60 kDa (reducida). La regin extracelular consiste en un dominio tipo variable y un dominio tipo constante de Ig; la cola citoplasmtica presenta 16 aminocidos. Se expresa en LB en reposo y activados, monocitos, clulas dendrticas y LT activados. Acta como ligando de molculas accesorias de LT, como son CD28 y CTLA-4 (CD152), regulando as el desarrollo de la respuesta inmune. 3.3. Molculas CD expresadas principalmente en linfocitos T Molcula CD3. La molcula CD3 es un heteropentmero formado por las cadenas, , , , y , que se encuentra asociado al TCR (ver captulo 7). Se expresa exclusivamente en las clulas T. La mayora de los anticuerpos CD3 reconocen la cadena del complejo CD3. Molcula CD2. La molcula CD2 es una glicoprotena de transmembrana tipo I de 50 kDa. La regin extracelular consiste en un dominio tipo variable y un dominio tipo constante de Ig; presenta una larga cola citoplasmtica rica en prolina y aminocidos bsicos. La molcula CD2 se expresa en todas las clulas T incluyendo timocitos inmaduros y clulas de memoria. Adems, se expresa en una subpoblacin de clulas NK.

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CD2 es el receptor que une eritrocitos de cordero alrededor de los LT formando las denominadas rosetas E, fenmeno que dio origen a uno de los primeros mtodos utilizados para reconocer y aislar linfocitos T. Es una molcula de adhesin que se une a las molculas CD58 (LFA-3), CD48 y probablemente CD59. Participa en la transduccin de seales en las clulas T, representando una va alternativa de activacin de estas clulas. Molcula CD4. La molcula CD4 es una glicoprotena tipo I de 59 kDa (reducida) que pertenece a la superfamilia gnica de las Ig. La regin extracelular presenta cuatro dominios tipo Ig y el segmento intracitoplasmtico tiene un dominio que une la tirosina kinasa p56lck La molcula CD4 se expresa en una subpoblacin de clulas T, la mayora LTh. Tambin puede expresarse en bajas concentraciones en monocitos y macrfagos. Las molculas CD4 de los LTh se unen a regiones no polimrficas de las molculas MHC clase II, estabilizando la interaccin entre las clulas T CD4+ y las clulas presentadoras de antgenos (CPA). La molcula CD4 adems es el ligando para la gp120 del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Molcula CD5. La molcula CD5 es una glicoprotena de transmembrana tipo I de 67 kDa (reducida). Al igual que la molcula CD6 pertenece a la "scavenger receptor family". La regin extracelular consiste en tres dominios "scavenger receptor" ricos en cistena. La molcula CD5 se expresa en las clulas T y en una poblacin de LB asociada a enfermedades autoinmunes. Molcula CD7. La molcula CD7 es una glicoprotena de transmembrana tipo I de 40 kDa (reducida). La regin extracelular consiste en un dominio tipo Ig, seguido hacia la membrana de una regin O-glicosilada. La molcula CD7 se expresa en una subpoblacin de LT inmaduros que corresponden a precursores pretmicos en la mdula sea. Molcula CD8. La molcula CD8 es un homodmero (/) o heterodmero (/, CD8b) unido por un puente disulfuro. La regin extracelular (amino terminal) presenta un dominio tipo Ig separado del dominio transmembrana por

una regin bisagra. El segmento citoplasmtico de la cadena presenta un dominio para unin de la tirosina kinasa p56lck. La molcula CD8 se expresa en una subpoblacin de las clulas T, los LTc, y se une a las molculas MHC clase I de las clulas blanco, estabilizando la interaccin celular. Molcula CD27. La molcula CD27 es una protena de transmembrana tipo I de 55 kDa (reducida) que forma homodmeros unidos por puentes disulfuro. Es miembro de la familia de receptores TNF/NGF, al igual que las molculas CD30, CD40, CD95, CD120a y CD120b. El segmento extracelular presenta dos regiones ricas en cistena. La molcula CD27 es ligando para la molcula CD70 que pertenece a la familia TNF (CD30L, CD40L, CD70 y CD95L; L, ligando). Se ha propuesto que esta interaccin CD27/CD70 podra ser importante en la regulacin de los LT y en facilitar la diferenciacin a LTc. Se expresa en una subpoblacin de clulas T maduras y de timocitos. Molcula CD28. La molcula CD28 es una glicoprotena de transmembrana tipo I de 44 kDa (reducida) que forma homodmeros por puentes disulfuro. Presenta en la regin extracelular un dominio tipo Ig, por lo que pertenece a la SFIg. Se expresa en una subpoblacin de linfocitos T. Esta molcula participa como ligando de las molculas CD80, CD86 y B7-3. Es una de las molculas que participan como seales coestimuladoras en la activacin de clulas T. 3.4. Molculas CD expresadas principalmente en clulas NK Molcula CD16. La molcula CD16 tambin llamada FcRIIIa es una protena de transmembrana tipo I de 50-65 kDa (reducida). El segmento extracelular presenta dos dominios tipo Ig. Acta como receptor de baja afinidad para IgG. Tambin se expresa en monocitos activados y granulocitos. Molcula CD56. La molcula CD56 es una glicoprotena de 175-185 kDa. El segmento extracelular presenta cinco dominios tipo Ig y dos dominios tipo fibronectina tipo III. Acta como una molcula de adhesin homotpica. Tambien se expresa en LT activados.

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Molcula CD57. La molcula CD57 tiene estructura de carbohidrato, probablemente unida a varias protenas y lpidos. Tiene un peso molecular de 110 kDa (reducida). Se expresa tambin en LT y una subpoblacin de LB. 3.5. Molculas CD expresadas principalmente en granulocitos Molcula CD66. La molcula CD66 es una fosfoprotena de aproximadamente 220 kDa (reducida) marcadamente glicosilada. Integra la familia gnica de antgeno carcinoembrionario (ACE). El segmento extracelular presenta cuatro dominios tipo inmunoglobulina, uno variable y tres constantes. Como consecuencia de un procesamiento (splicing) alternativo del mRNA se obtienen varias isoformas (CD66a - CD66e). La molcula CD66 presenta caractersticas de una molcula de adhesin y puede unirse a bacterias. 3.6. Molculas CD expresadas principalmente en monocitos-macrfagos Molcula CD11b. Las molculas CD11b tienen un peso molecular de 170 kDa y estructuralmente son protenas de transmembrana tipo I. Adems de las clulas monocito-macrfagos, se expresa en las clulas NK. Junto con CD18 forma una molcula de adhesin (CR3) de la familia de las Integrinas. Molcula CD14. La molcula CD14 tiene 53-55 kDa y se une a la membrana a travs de GPI. Adems de los monocitos y macrfagos se expresa en neutrfilos, algunos linfocitos B y clulas dendrticas. Molcula CD64. La molcula CD64 tiene 75 kDa y estructuralmente corresponde a una protena de transmembrana tipo I. Pertenece a la SFIg y se expresa en monocitos, macrfagos y neutrfilos activados. Su funcin es la de actuar como receptor de alta afinidad de IgG (FcRI). Molcula CD68. La molcula CD68 es una protena de transmembrana de 110 kDA (reducida) y que se encuentra marcadamente glicosilada. Junto a las molculas CD34 y CD43 integran la familia cell surface mucin. Adems, al igual que las molculas CD107a y CD107b caractersticas de

plaquetas activadas. La molcula CD68 es una protena asociada a lisosomas, que se traslada a la membrana celular durante la activacin. Molcula CD91. La molcula CD91 es una glicoprotena que sufre una ruptura en el aparato de Golgi en dos cadenas polipeptdicas, la cadena (85 kDa) y la cadena (515 kDa), las cuales no estn unidas covalentemente. La cadena presenta varias copias de varios tipos de dominios: rico en cistena, factor de crecimiento epidermal y repeticiones de YWTD. Acta como receptor de varias molculas, entre otras 2-macroglobulina y activadores del plasmingeno. 3.7. Molculas CD expresadas principalmente en plaquetas Molcula CD41. La molcula CD41, tambin llamada GPIIb (GP: glicoprotena), es un heterodmero de 140 kDa formado por protenas de transmembrana. El heterodmero (cadena 120 kDa y cadena 22 kDa), unido por puente disulfuro, se origina en una ruptura postraduccional de la protena. La molcula CD41 forma un complejo dependiente de calcio con la molcula CD61 (GPIIIa). Este complejo une protenas adhesivas importantes en la hemostasia: fibringeno, factor von Willebrand y fibronectina. Molcula CD42a. La molcula CD42a, tambin denominada GPIX, es una glicoprotena de transmembrana de 23 kDa (reducida). Esta molcula forma una complejo no covalente (complejo CD42) con las molculas CD42a y CD 42b (unidas covalentemente forman la GPIb) o con la molcula CD42d (GPV). La molcula CD42a se expresa slo en las plaquetas. El complejo CD42 es responsable de la unin al factor von Willebrand. Molcula CD42b. La molcula CD42b (GPIb-) es una protena de transmembrana de 135 kDa. En su extremo amino presenta el sitio de unin para el factor von Willebrand. Unida covalentemente a la molcula CD42c (GPIb-) forma la GPIb. La molcula CD42b se expresa slo en las plaquetas. Molcula CD42c. La molcula CD42c (GPIb-) es una glicoprotena de transmembrana de 22 kDa. Al unirse covalentemente a la molcula CD42b

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(GPIb-) forma la GPIb. La molcula CD42c se expresa slo en las plaquetas. Molcula CD42d. La molcula CD42d, tambin denominada GPV es una protena de transmembrana de 85 kDa (reducida) que al igual que la molcula CD42a (GPIX) se puede unir a la GPIb (CD42b-CD42c) y formar el complejo CD42. La molcula CD42d se expresa slo en las plaquetas. Molcula CD51. La molcula CD51, tambin llamada cadena del receptor de vitronectina (VnR) es un heterodmero de 125 y 25 kDa (reducida) unido por puente disulfuro. El heterodmero se produce por ruptura postraduccional de la glicoprotena. Puede asociarse no covalentemente con las integrinas 1 (CD29), 3 (CD61), 5, 6 o 8. El complejo v1 une vitronectina, fibronectina y colgeno tipo I; el complejo v3 (GPIIb-IIIa) une vitronectina, fibronectina, fibringeno, factor von Willebrand, trombospondina, osteopontina y colgeno; el complejo v5 une vitronectina y v6 une fibringeno. Molcula CD61. La molcula CD61, tambin denominada cadena 3 de las integrinas y GPIIIa, es una glicoprotena de transmembrana tipo I de 110 kDa (reducida). La molcula CD61 se puede asociar a la molcula CD41 (GPIIb) formando un complejo dependiente de calcio (GPIIb-IIIa) y con la molcula CD51 (integrina v) formando el receptor de vitronectina (v3).

"Tetra-span family". Estas molculas presentan cuatro dominios transmembrana y ambos extremos, amino y carboxilo, estn en el interior de la clula. Integran esta familia las molculas CD9, CD37, CD53, CD63, CD81 y CD82. "Scanaver receptor family". Las molculas de esta familia se caracterizan por presentar en la regin extracelular tres dominios ricos en cistena. Entre otras molculas, se incluyen en esta familia las molculas CD5 y CD6. Familia de receptores de TNF y NGF. Esta familia la integran CD27, CD30, CD40, CD95, CD120a, CD120b. Familia de reguladores del complemento. Forman esta familia las molculas CD21, CD35, CD46 y CD55. Superfamilia rodopsina. Las molculas de esta familia se caracterizan por presentar siete dominios de transmembrana y unirse a protenas que unen GTP. Las molculas CD incluidas en la familia rodopsina son CD88, CDw128a y CDw128b. Familia cell surface mucin. Estas molculas se caracterizan por ser protenas de transmembrana tipo I que estn marcadamente O-sialitizadas (cido sialico). Son miembros de esta familia las molculas CD34, CD43 y CD68 Familia sialoadhesina. Las molculas que integran esta familia son: sialoadhesina, CD33 y gp asociada a mielina.

4. FAMILIAS DE MOLCULAS CD Las molculas CD se pueden agrupar independientemente de los anticuerpos monoclonales que las reconocen, en base a su estructura molecular y/o funcin. As, se han descrito entre otras, las siguientes familias: Superfamilia de las Ig. Estas molculas se caracterizan por presentar en la regin extracelular, uno o ms dominios tipo Ig. Entre otras molculas, integran esta familia: CD4, CD8, CD28, CD54 y CD64. Familia de las lectinas. Las molculas de esta familia presentan en la regin extracelular uno o ms dominios tipo lectina. Integran esta familia las molculas CD23, CD69, CD72 y CD94. 5. ALGUNAS APLICACIONES DE LA NOMENCLATURA CD EN INMUNOLOGA El advenimiento de la nomenclatura CD, gracias al desarrollo de los anticuerpos monoclonales y tcnicas de la citometra de flujo, la inmunohistoqumica y la biologa molecular, se ha acompaado de una acelerada aplicacin de estos marcadores en el campo de la investigacin bsica y la inmunologa clnica. Como se describi antes, desde un punto de vista conceptual, la expresin de estas molculas en clulas del sistema inmune se puede resumir en la presencia de molculas de linaje (lnea celular), de activacin y de madurez.

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Las molculas de linaje son aquellas que definen en forma mayoritaria y ocasionalmente excluyente, un tipo celular; por ejemplo CD4 para LT helper y CD8 para LT citotxicos. Estas molculas pueden aparecer en algn momento del desarrollo y a su vez cumplen funciones biolgicas definidas, pueden compartirse con otras clulas (ej. CD4 expresada en macrfagos/monocitos) si bien con expresin ms baja o en un fenotipo morfolgico o inmune muy distinto. Las molculas de activacin suelen expresarse frente a estimulacin celular y no en forma excluyente de un tipo celular (ej. CD25, CD38, CD71). Algunas de estas molculas suelen disminuir su expresin en la superficie celular frente a un estado de activacin celular ya que son escindidas y pueden detectarse en forma soluble (ej. molculas de adhesin como la L-selectina (CD62L), o CD23 en linfocitos B. Existe finalmente un conjunto de molculas que se expresan mayoritariamente durante algunas etapas del desarrollo de las clulas inmunes, lo que ayuda a definir estadios de madurez celular (ej. CD10, CD34). Sin embargo, debido al estado biolgico de las clulas inmaduras, es factible detectar con mayor frecuencia o intensidad algunos marcadores de activacin (ej. CD71). Finalmente, existen molculas CD que se asocian a la respuesta inmune especfica y son expresadas en los linfocitos, y aquellas que participan en la inflamacin, fundamentalmente expresadas en granulocitos, monocitos/macrfagos y clulas endoteliales. Algunos usos de las molculas CD en clnica son los siguientes:

Sndrome de la Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). Uno de los elementos clsicos en el diagnstico y seguimiento de pacientes con SIDA ha sido la cuantificacin de LT CD4+ y LT CD8+. Los valores absolutos de estas subpoblaciones al igual que su relacin o ndice CD4/CD8, han sido utilizados en la determinacin de conductas teraputicas como inicio de tratamiento antiretroviral o profilaxis antibitica. Sin embargo, estudios de seguimiento de series grandes de pacientes han detectado que estos valores en ocasiones anticipan lo suficiente para ser tiles. Durante los ltimos aos, al ir dilucidndose la patogenia del SIDA donde la activacin inmune ha sido revelada como factor esencial en la progresin de la enfermedad, se han detectado cambios precoces en la expresin de marcadores de activacin linfocitarios en adultos y nios infectados por VIH (Ej. CD38 y HLA-DR en LT CD8+ y CD62L y CD23 en linfocitos B, disminucin de expresin de CD25 en LT CD4+ cambio de expresin de CD45RA a CD45RO tanto en LT CD4+ y LT CD8+) (tabla 46-2). Inmunodeficiencias Primarias. El uso de las molculas CD ha permitido clasificar en forma ms precisa las diversas inmunodeficiencias primarias, tanto celulares como humorales (tabla 46-3). La asociacin entre la presencia o ausencia de alguna molcula CD ha permitido en ocasiones dilucidar la funcin de tal molcula, si sta se desconoca, o bien si sta se conoca, explicar el mecanismo subyacente de una inmunodeficiencia en particular. Leucemias y Linfomas. Las leucemias son un grupo heterogneo de enfermedades resultantes de

Tabla 46-2. Marcadores inmunofenotpicos utilizados en el estudio y seguimiento de pacientes VIH positivos Clula Marcadores de linaje celular CD3, CD4, CD8 Marcadores de activacin CD25, CD38, CD28, CD69 CD45 RA/RO, HL-DR CD23, CD62L, CD69, CD71 CD57

Linfocitos T

Linfocitos B Clulas NK

CD19, CD20, CD10 CD16, CD56

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Tabla 46-3. Marcadores CD usados en Inmunodeficiencias Primarias Disgenesia Reticular Defecto de LT: Inmunodeficiencia Combinada Severa, Anomala de Di George, otros Deficiencia de LB o Anticuerpos: Agamaglobulinemia ligada a X, Inmunodeficiencia Comn Variable Sndrome de Hiper IgM Deficiencias de Clulas NK Sndrome de Wiskott Aldrich Sndrome de Leucocito Desnudo Defecto de Molculas de Adhesin CD34 CD3, CD4, CD8; CD25; CD152 TCR /, TCR/, CD69, CD132 CD19, CD20, CD5. CD19/CD40, CD3/CD154 CD16/CD56 CD43 HLA clase I y II en LT CD4 y LT CD8; CD74 CD11a,b,c; CD18

una proliferacin descontrolada de uno o ms tipos de clulas hematopoyticas. La importancia de clasificar este grupo de enfermedades en distintas categoras radica en que existen modalidades teraputicas distintas en cada grupo. Igualmente, el pronstico clnico de las distintas categoras sea esta aguda o crnica, linfoide o mieloide es distinto. Por lo tanto, el propsito de la caracterizacin de las leucemias es agrupar pacientes con enfermedades similares para optimizar la terapia o identificar aquellos pacientes con peor pronstico frente a los tratamientos actuales. La forma clsica de clasificar las leucemias es la Franco-Americana-Britnica (FAB) que utiliza morfologa, histoqumica y algunos marcadores de superficie para clasificar las leucemias mieloides en M0 a M7, y las linfoides en L1 a L3. Sin embargo, la limitante de

esta clasificacin es la definicin de subgrupos de leucemias linfoides, ej. diferenciacin T y B, y requiere de un observador entrenado, siendo adems de interpretacin subjetiva. El uso de una inmunotipificacin en su mayora con marcadores CD de superficie aporta criterios descriptivos ms objetivos de las clulas leucmicas, en especial si son evaluados por citometra de flujo (ver captulo 31), que puede analizar dos o ms marcadores por clula en forma simultnea (tabla 46-4). Patologa Inflamatoria. En enfermedades inflamatorias como las vasculitis, artrtis reumatodea, lupus eritematoso sistmico, sepsis o rechazo de trasplantes, la pesquisa de la expresin de molculas de activacin (CD25, integrinas, ICAMs, CD64, etc.) tanto en la superficie celular de leucocitos perifricos como

Tabla 46-4. Marcadores CD de linaje y no linaje, usados en la inmunofenotipificacin de leucemias agudas Linfocitos B CD19 CD20 CD22 CD39 CD79a,b Linfocitos T CD3 CD5 CD7 Clula mieloide CD13 CD33 No-linaje HLA-DR CD10 CD73 CD38

* Las leucemias monoblsticas presentan la molcula CD14.

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de tejido, adems de la forma soluble en el suero u otros fluidos, se est incorporando como mtodo til y precoz, y posiblemente especfico, para determinar reactivacin o respuesta a tratamiento de estas patologas. Estos estudios an se encuentran en desarrollo, pero es factible postular que a futuro la determinacin de estas molculas sern incluidas en el estudio de todo cuadro inflamatorio. Trasplantes: En esta rea, actualmente se monitorea la efectividad de drogas como anticuerpos anti-CD3, midiendo los niveles de linfocitos CD3 perifricos, con el fin de controlar rechazo agudo de trasplantes. Otra aplicacin es la obtencin, desde sangre perifrica, de stem cells usando como marcador la molcula CD34 que expresan estas clulas. Las stem cells son utilizadas en pacientes a los que debe repoblarse la mdula sea. Sin duda son numerosas las otras aplicaciones de estas molculas en investigacin y clnica y muchas ms estn por desarrollarse.

Ochs, H.D., Smith, C.I.E., Puck, J.M., Primary Immunodeficiency Diseases- A Molecular Approach, Editorial Oxford University Press, 1999. Plaeger-Marshall, S. et al., T cell activation in pediatric AIDS pathogenesis: Three-color immunophenotyping, Clin Immunol Immunopahtol. 71, 19-26. 1994. Rich, R., Clinical Immunology. Principles and Practice, Editorial Mosby, 1996. Rodrguez, C. et al., HIV disease in children is associated with a selective decrease in CD23+ and CD2L+B cells, Clin Immunol Immuopatol 81 (2): 191-199. 1996. Stiehm, E., Immunologic. disorders in Infants and Children, 4th Edition, WB Saunders, 1996. Stockinger, H., Majdic, O. and Knapp, W., Directory for the human leukocyte clusters of differentiation, Transfusion 36:268-285, 1996. Anti-human CD clustered (CD) antibodies. Disponible en http://members.aol.com/researchd1/ rdicdabs/cdindex.htm CD antigens. Disponible en http:// www.immunologylink.com/CDantigen.htm Protein Reviews on the Web. Disponible en http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/prow/ Workshops and Conferences on Human Leucocyte Differentiation Antigens. 7th Workshop and Conference. Disponible en www.hlda.org

LECTURAS SUGERIDAS Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. and Watson, J., Molecular Biology of cell, Chap.10 and 12, Third edition, Garland Publishing Inc., USA, 1994. Bower, K., Duque, R., Sharkey, T.V., Clinical Flow Cytometry. Principles and Application, Williams & Wilkins, 1993. Kipps, T.J., The cluster of differentiation (CD) antigens en Hematology, Eds. Beuther, E., Lichtman, M., Coller, B. and Kipps, T., Fifth edition, McGraw-Hill Inc., New York, 1995. Landay, A. et al., Application of Flow Cytometry to the Study of HIV infection, AIDS, 4:479-497, 1990. LeBien, T.W., A little bit of CD history, Transfusion. 36(3):197-199, 1996. Loken, M., et al., A Selected 12-Reagen Immunophenotyping Panel Facilitates Assignement of Lineage in Acute Leukemia. Clinical Monogragh N 3. Becton Dickinson Immunocytometry Systems.

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GLOSARIO

ADCC (Antibody Dependent Cell Mediated Citotoxicity"): Citotoxicidad mediada por clulas dependiente de anticuerpos. Reaccin citotxica en la que clulas con capacidad ltica, portadoras de receptores para Fc, reconocen las clulas blanco a travs de los anticuerpos especficos que recubren a estas ltimas. Adyuvante: Sustancia que intensifica inespecficamente la respuesta inmunitaria frente a un antgeno. Adyuvante completo de Freunds: Emulsin leo-acuosa que contiene micobacterias muertas y aumenta la respuesta inmune cuando se mezcla en una emulsin que contiene un antgeno. Afinidad: Expresin termodinmica de la fuerza de unin entre un determinante antignico (eptopo) y el sitio de combinacin del anticuerpo (paratopo) y as, de la compatibilidad estereoqumica entre ellos. Agammaglobulinemia Ausencia de protenas plasmticas en la regin gamma de una electroforesis de suero sanguneo. Aglutinacin: Reaccin antgeno-anticuerpo, en la cual un antgeno slido o particulado forma una malla de interacciones con un anticuerpo que se encuentra en solucin. Como la aglutinacin es visible fcilmente, es la reaccin bsica de numerosas pruebas serolgicas. Aglutinacin directa: Aglutinacin de eritrocitos, microorganismos u otras sustancias, directamente por anticuerpos.

Aglutinacin indirecta: Aglutinacin de partculas o de eritrocitos recubiertos con un antgeno (adsorbido o acoplado qumicamente) por anticuerpos. Aglutininas fras: Anticuerpos que aglutinan bacterias o eritrocitos ms eficientemente a temperaturas inferiores a 37C. Agretopo: Porcin de un antgeno o fragmento antignico, que interacta con una molcula MHC. Alelo: Uno de los dos genes presente en un locus, que controlan una caracterstica particular. Alergeno: Agente que provoca una serie de reacciones mediadas por inmunoglobulina E. Ej.: polen, polvo, caspa animal, etc.; o por clulas T como es el caso de algunos haptenos. Ej.: el compuesto exudado por el litre o compuestos qumicos como el dinitrofluorbenceno. Alergia (Hipersensibilidad tipo I): Enfermedad o reaccin causada por una respuesta inmune a uno o ms antgenos ambientales, resultando en inflamacin tisular y disfuncin orgnica. Aloanticuerpos: Anticuerpos dirigidos contra antgenos presentes en algunos miembros de la misma especie (aloantgenos). Aloantgenos: Diferentes formas (allico) de un antgeno codificado por el mismo locus gentico, en todos los individuos de una especie. Alognico: Se refiere a las variaciones que puede tener un antgeno codificado por un mismo locus de una misma especie.

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Aminas vasoactivas: Productos, como la histamina y la 5-hidroxitriptamina, liberados por los basfilos, los mastocitos y las plaquetas, que actan sobre el endotelio y la musculatura lisa de vasos locales. Anafilaxia: Reaccin inmune aguda y severa, antgeno especfica, mediada por IgE, que da lugar a vasodilatacin y contraccin de los msculos lisos, incluidos los bronquiales, y que puede originar la muerte del animal. Anafilotoxina: Pptidos del complemento (C3a y C5a) que originan la desgranulacin de los mastocitos y la contraccin de la musculatura lisa. Anemia hemoltica autoinmune: Destruccin de eritrocitos, mediada por autoanticuerpos. Anergia: Un estado de disminucin o ausencia de inmunidad mediada por clulas, mostrado por una ausencia de reaccin a varios antgenos diferentes inoculados subcutneamente. Anticuerpo: Molcula de inmunoglobulina producida en los vertebrados por las clulas plasmticas (estadio final de la diferenciacin de los linfocitos B) en respuesta a un antgeno; tiene la propiedad de combinarse especficamente con el antgeno que indujo su formacin. Anticuerpo anti-idiotpico: anticuerpo dirigido contra eptopos (idiotopos) de la regin variable de una inmunoglobulina o un receptor linfocitario. Anticuerpo bifuncional: Anticuerpo preparado a partir de dos anticuerpos, cuya caracterstica es que se une a dos antgenos diferentes. Anticuerpo cataltico: Anticuerpos con propiedades similares a una enzima. Anticuerpo humanizado: Anticuerpo de ratn en el cual todas las regiones de las cadenas pesadas y livianas no involucradas en la unin del antgeno, han sido reemplazadas por secuencias humanas. Anticuerpo natural: Anticuerpo presente en el suero del que se desconoce el antgeno. Anticuerpo quimrico: Anticuerpo de ratn en el cual las regiones constantes han sido reemplazadas, mediante ingeniera gentica, por la regin

constante de anticuerpos humanos. Antigenicidad: Reactividad de un antgeno, es decir, capacidad de unirse en forma especfica a los anticuerpos. Antgeno: Molcula que puede ser reconocida por un anticuerpo o receptor de clulas T. Si es capaz de estimular la respuesta inmune se le denomina inmungeno. Antgeno de diferenciacin: Antgeno que permite distinguir un tipo celular de otro. Antgeno homlogo: Antgeno que reacciona con anticuerpos que l mismo ha inducido. Antgeno heterlogo: Antgeno que reacciona con anticuerpos que l no ha inducido. Antgenos T: Antgenos tumorales presentes slo en clulas neoplsicas; probablemente protenas producidas por genoma viral. Antgenos timo dependientes: Antgenos que dependen de la interaccin de las clulas B con las clulas T para estimular la sntesis de anticuerpos. Antgenos timo independientes: Antgenos que pueden inducir una respuesta inmune sin la participacin de linfocitos T, aparentemente. Antisuero: Conjunto de anticuerpos presentes en el suero de un animal que ha sido inmunizado con un antgeno. Antitoxinas: Anticuerpos que neutralizan las toxinas solubles producidas por las bacterias. Asociacin gentica: Trmino usado para describir la condicin en la que determinados genotipos se asocian con ciertos fenmenos, tales como determinadas enfermedades. Atopia: Manifestacin clnica de las reacciones de hipersensibilidad tipo I, incluyendo eccema, asma y rinitis. Autoanticuerpo: Anticuerpo con especificidad para antgenos propios. In vitro, tales anticuerpos son detectados por sus reacciones con antgenos similares obtenidos de otros individuos de la misma especie.

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Autoantgenos: Molculas que son constituyentes normales de un individuo y contra las cuales ste desarrolla una respuesta inmune. Autlogo: Perteneciente al mismo individuo. Autorradiografa: Tcnica para detectar cidos nucleicos o protenas en secciones de tejido o geles con istopos radiactivos, cuya emisin es grabada en una pelcula fotogrfica. Autosomas: Cromosomas distintos a los cromosomas sexuales X e Y. Avidez: Fuerza de la unin anticuerpo-antgeno, la cual depende de la afinidad entre eptopo y paratopo, y de las valencias del anticuerpo y del antgeno. BCG (Bacillus Calmette-Gurin): Cepa atenuada de Mycobacterium tuberculosis, usada como vacuna, adyuvante o modificadora de la respuesta inmune. Beta2-microglobulina: Polipptido monomrfico codificado fuera del MHC, que se asocia de modo no covalente con la cadena codificada por el MHC, formando las molculas de clase I. Bolsa (Bursa) equivalente: rgano anlogo a la bolsa de Fabricio existente en aves. En el hombre corresponde a la mdula sea. Bolsa (Bursa) de Fabricio: rgano linfoepitelial situado entre el intestino posterior y la cloaca de las aves. Constituye el lugar donde maduran las clulas B. Bradiquinina: Nonapptido vasoactivo; es el mediador de la inflamacin ms importante generado por el sistema de las quininas. C1-C9: Componentes de las vas clsica y ltica del complemento responsables de mediar las reacciones inflamatorias, la opsonizacin de las partculas y la lisis de las membranas celulares. Cadena Invariante (Ii): Glicoprotena de membrana asociada al correcto ensamblaje, transporte y expresin de las molculas MHC de clase II. Cadena J: Glicopptido monomrfico, presente en la IgA e IgM polimricas.

Cadena kappa (): Uno de los isotipos de las cadenas livianas de las inmunoglobulinas. Cadena lambda (): Uno de los isotipos de cadenas livianas de las inmunoglobulinas. Cadenas livianas (L, light): Cadenas polipeptdicas presentes en todas las inmunoglobulinas. Existen dos tipos y en cada especie se ha observado la predominancia de una de ellas; se denominan kappa () y lambda (). Cadenas pesadas (H, heavy): Par de cadenas polipetdicas idnticas que forman parte de las inmunoglobulinas. La cadena pesada contiene aproximadamente el doble del nmero de aminocidos de la cadena liviana. Calnexina: Protena de 88 kDa que acta como chaperonina en el correcto ensamblaje y transporte de molculas MHC y otras protenas. Cambio de clase: Proceso por el cual una clula B individual puede unir nuevos genes C (constante) de cadena pesada a su gen V (variable) recombinado, y producir as una clase de inmunoglobulina diferente con la misma especificidad. Este proceso se refleja tambin en el cambio global de clase que tiene lugar durante la maduracin de una respuesta inmune. Cariotipo: Constitucin cromosmica de una clula, que puede variar entre los individuos de una misma especie, dependiendo de la presencia o ausencia de cromosomas sexuales particulares o de la incidencia de traslocaciones entre secciones de cromosomas diferentes. Carrier: Protena transportadora de alta inmunogenicidad utilizada para inducir respuesta inmune contra haptenos que le han sido acoplados qumicamente. Uno de los ms utilizados es la hemocianina, protena que transporta el oxgeno en la mayora de los moluscos y artrpodos. Clulas accesorias: Incluyen eosinfilos, basfilos, clulas cebadas, plaquetas y clulas presentadoras de antgeno. Tienen un rol importante tanto en la respuesta inmune innata como adquirida. Clulas de Microglia: Son las clulas fagocticas que residen en el cerebro. Migran a este rgano

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antes del nacimiento y durante el perodo neonatal. Clulas de Kupffer: Macrfagos que tapizan los sinusoides hepticos. Clulas de Langerhans: Clulas dendrticas de la piel que actan como clulas presentadoras del antgeno. Clulas dendrticas: Clulas mononucleares presentadoras de antgeno en tejido linfoide, pero distintas de la lnea monocito-macrfago. Clulas efectoras: Trmino que generalmente se refiere a clulas T capaces de mediar citotoxicidad, supresin, o funcin de ayuda ("helper"). Clulas formadoras de placa: Son clulas secretoras de anticuerpos que se miden en un ensayo en que cada una produce una clara zona de lisis (placa) en una capa de eritrocitos sensibilizados con el antgeno. Es una reaccin de una extrema sensibilidad. Clulas LAK: (Clulas asesinas activadas por linfoquinas). Son linfocitos T singnicos generados in vitro mediante tratamiento con citoquinas tales como IL-2 e IFN. Clula mastoide (clula cebada o mastocito): Clula tisular que posee receptores de alta afinidad para IgE y genera mediadores inflamatorios en la alergia. Clulas NK ("Natural Killer"): Clulas del linaje linfoide con capacidad intrnseca para reconocer y destruir algunas clulas tumorales o infectadas por virus. Clulas plasmticas: Clulas sintetizadoras de anticuerpos. Se diferencian a partir de los linfocitos B. Clulas pluripotenciales: Clulas capaces de autorrenovacin y de diferenciacin hacia progenitores celulares hematopoyticos y linfopoyticos. Clulas T : Clulas T que reordenan y expresan receptor de clulas T con cadenas alfa y beta. La mayora de las clulas T son de este tipo. Clulas T citotxicas: Linfocitos con marcador

celular CD8+, que participan en la inmunidad celular. Clula T : Clulas T cuyo receptor de clulas T est formado por cadenas gamma y delta en el receptor de clulas T. Clulas T "helper" (Cooperadoras): Subpoblacin funcional de clulas T que pueden ayudar a la generacin de clulas T citotxicas y cooperar con las clulas B en la produccin de una respuesta de anticuerpos. Clulas T supresoras: Subpoblacin de linfocitos T que suprimen la sntesis de anticuerpos por las clulas B o inhiben otras reacciones inmunes celulares de clulas T efectoras. Centros germinales: Grupo especializado de linfoblastos B, macrfagos y clulas plasmticas que aparecen en los folculos primarios de los tejidos linfoides seguido en respuesta a un estmulo antignico. Cepa inbred: Son animales obtenidos por cruzamientos sucesivos entre hermanos, dando una cepa con idnticos sets de autosomas. Cepa congnica: Son razas idnticas excepto por un cambio en un locus determinado. Cepas transgnicas: Son derivadas desde animales que han recibido genes que han sido insertados cuando ocurre la fecundacin. Todas las clulas del animal transgnico llevan el nuevo gen, aunque l pueda ser expresado en algunos o en un linaje celular. Cepas Knockout: Son animales transgnicos que han sufrido una delecin o mutacin de genes especficos. CDR ("Complementary Determining Regions"): Partes de la regin variable (V) de las inmunoglobulinas o de los receptores de clulas T, responsables de la unin con el antgeno. Ciclofosfamida: Frmaco citotxico usado frecuentemente como inmunosupresor. Ciclosporina: Frmaco inmunosupresor particularmente til para suprimir el rechazo del injerto.

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Citometra de Flujo: Es una tcnica que mide en un citmetro equipo especfico para este propsito- las caractersticas individuales de una poblacin de clulas, incluyendo tamao, granularidad y fluorescencia si es que se les ha incorporado una sonda fluorescente. Citoquinas: Trmino genrico para designar las molculas solubles que median las interacciones celulares. Citosttico: Que tiene la capacidad de detener el crecimiento celular. Citotxico: Que tiene la capacidad de destruir clulas. Clases de inmunoglobulinas: Subdivisin de las inmunoglobulinas, basada en el determinante antignico de la regin Fc de la cadena pesada (H). En humanos son cinco clases de inmunoglobulinas: IgG, IgA, IgM, IgD e IgE. Clon: Grupo de clulas que forman parte de la progenie de una sola clula. Complejo de ataque a membrana: Componentes terminales del sistema del complemento (C5bC9) que, cuando son activados, causan lisis de la clula blanco. Complejo inmune: Producto de la unin producida por un anticuerpo con un antgeno. Tambin se le denomina complejo antgeno-anticuerpo. Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC): Regin gentica presente en todos los mamferos, cuyos productos son responsables del rechazo rpido de los injertos entre individuos y que actan como seales entre los linfocitos y las clulas que expresan antgenos. Complemento: Grupo de protenas sricas que intervienen en el control de la inflamacin, en la activacin de los fagocitos y en el ataque ltico sobre las membranas celulares. El sistema puede activarse por interaccin con el sistema inmunitario. Componente secretor: Molcula de 95 kDa presente en las clulas epiteliales y que se asocia a inmunoglobulinas secretoras, particularmente IgA e IgM.

Concanavalina A (Con A): Es una lectina obtenida del poroto Conavalia eusiformis, que se une a glicopiransidos, manopiransidos y fructopiransidos. Como stos son constituyentes habituales de las glicoprotenas de la membrana celular, la Con A se une a ellas. Aglutina clulas de muchos tipos y acta como mitgeno para las clulas T. Congnico: Animales derivados genticamente y que difieren slo en un locus particular. Conjugado: Reactivo formado por el acoplamiento covalente de dos molculas diferentes. Ej.: fluorescena unida a una molcula de inmunoglobulina. CPA, (Clula presentadora de antgenos): Clula que procesa una protena antignica, fragmentndola a pptidos que se presentan en la superficie celular en conjunto con molculas MHC de clase II, para interactuar con el receptor de clulas T apropiado. Las clulas B, clulas dendrticas, monocitos y macrfagos pueden cumplir esta funcin. CR1, CR2, CR3: Receptores para los fragmentos activados del componente C3 del complemento. Cromatografa de afinidad: Mtodo de purificacin en el cual una sustancia con una selectiva afinidad de unin es unida covalentemente a una matriz insoluble como agarosa. As una sustancia puede ser purificada desde una mezcla. CSF ("Colony Stimulating Factors"): Grupo de citoquinas que controlan la diferenciacin de las clulas hematopoyticas. Chaperoninas: Protenas que participan en el plegamiento, ensamblaje y/o transporte de otras protenas. Delecin clonal: Un concepto relacionado con la teora de la seleccin clonal de Burnet, la cual sugiere que la tolerancia a un autoantgeno resulta de la delecin de clones de linfocitos autorreactivos en la vida embrionaria. Determinante antignico: Regin del antgeno donde se une un anticuerpo, tambin se denomina eptopo.

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Determinante conformacional: Corresponde a eptopos derivados del arreglo espacial o plegamiento de la cadena peptdica de una protena, que generalmente se destruyen al desnaturalizarla. Determinante lineal: Corresponde a eptopos formados por aminocidos adyacentes (estructura primaria) en la secuencia polipeptdica de una protena. Desetopo: Parte de la molcula MHC que se une con el antgeno ya procesado. Desgranulacin: Exocitosis de grnulos a partir de clulas, tales como mastocitos y basfilos. Determinante antignico: Ver eptopo. DNP (Dinitrofenol): Es un hapteno que se puede unir a los grupos amino de las protenas. Domicilinas o Adresinas: Ligandos en las clulas de la mucosa endotelial para receptores especficos presentes en linfocitos derivados desde las Placas de Peyer. Dominio: Regin de un pptido que tiene una estructura terciaria particular. Las inmunoglobulinas, las molculas MHC de clases I y II, y otras molculas de la llamada "superfamilia de las inmunoglobulinas" tienen dominios similares. Dominios C: Dominios constantes de los anticuerpos y de los receptores de clulas T. Estos dominios no contribuyen al sitio de unin para el antgeno y presentan una escasa variabilidad. Dominios V: Dominios N-terminal de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos, y de las cadenas , , de los receptores de clulas T. Varan entre los distintos clones y forman el sitio de unin con el antgeno. DTH ("Delayed Type Hypersensitivity"): Hipersensibilidad de tipo retardada. Trmino que incluye las reacciones cutneas retardadas asociadas con la hipersensibilidad tipo IV. Duplicados en tndem: Copias adyacentes de genes relacionados, unidos en un cromosoma. Electroforesis: Separacin de molculas en un campo elctrico.

Electroinmunodifusin: Mtodo de inmunodifusin en el cual un antgeno y un anticuerpo son guiados uno contra el otro en un campo elctrico. La reaccin antgeno-anticuerpo se visualiza como un arco o banda de precipitacin. ELISA (Enzime Linked Immunosorbent assay): Tcnica de laboratorio, que permite la deteccin y cuantificacin de inmunoglobulinas contra diferentes antgenos. Es un mtodo muy verstil que permite numerosas variaciones, razn por la cual se ha transformado en el ensayo ms utilizado en la deteccin y cuantificacin de numerosos antgenos no slo de inters clnico, sino que tambin otros compuestos tales como residuos de alimentos y contaminantes ambientales. Endocitosis: Proceso por el cual material externo a la clula es internalizado. Puede tomar la forma de pinocitosis (lquidos) y fagocitosis (partculas). Endgeno: Originado dentro del organismo o dentro de una clula. Endotelio: Clulas que tapizan el lumen de los vasos sanguneos y linfticos. Endotoxinas: Lipopolisacridos derivados desde la pared celular de microorganismos Gram negativos. Tienen un efecto txico y pirognico cuando son inyectados in vivo. Enfermedad de cadenas pesadas: Grupo heterogneo de desrdenes paraprotecos caracterizado por la presencia de cadenas pesadas monoclonales incompletas, sin cadenas livianas en suero u orina. Enlaces disulfuro: Enlace qumico S-S entre aminocidos que contienen grupos sulfidrilos, los cuales unen las cadenas H y L, intra-cadenas H-H y L-L, contribuyendo en este caso a la formacin de los dominios. Eptopo: Determinante antignico presente en una molcula. Es la regin del antgeno que se combina con el paratopo del anticuerpo o del receptor de clulas T. Exclusin allica: Es el proceso por el cual una clula usa un gen de su cromosoma materno o uno paterno, pero no ambos. Ocurre en linfocitos B para constituir la cadena pesada y liviana de la

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inmunoglobulina y tambin en linfocitos T, para constituir los dmeros . Exocitosis: Proceso por el cual material intracelular es llevado al exterior de la clula. Exn: Segmento del gen que codifica para parte de una protena. Fab: Parte de la molcula de inmunoglobulina que contiene el sitio de combinacin con el antgeno. Est compuesto por una cadena liviana y parte de la cadena pesada y se obtiene por digestin enzimtica (papana) de las inmunoglobulinas. Factor activador plaquetario: Mediador inflamatorio que activa plaquetas y clulas inflamatorias. Factor inhibidor de la migracin (MIF): Grupo de pptidos producidos por los linfocitos que tienen la capacidad de inhibir la migracin de los macrfagos. Factor quimiotctico de macrfagos (MCF): Linfoquina que atrae selectivamente monocitos o macrfagos al rea donde se produjo el factor. Factores B, P, D, H e I: Componentes de la va alternativa del complemento. Fagocitosis: Proceso por el cual las clulas engloban una partcula y la encierran dentro de una vacuola (fagosoma) citoplasmtica. Fagocitos: Incluyen monocitos sanguneos, macrfagos y neutrfilos. Su funcin es incorporar patgenos, antgenos y restos celulares para reducirlos a pequeas molculas. Fagolisosoma: Producto de la fusin de un fagosoma y un lisosoma. Fenotipo: Caractersticas expresadas en un individuo. Fluorescencia: Emisin de luz de un color, cuando una sustancia es irradiada con una luz de un color diferente. Fragmento Fc: Regin de las inmunoglobulinas que contiene los dominios CH2 y CH3 de las cadenas pesadas. Es responsable de la unin a los

receptores celulares para inmunoglobulinas y al componente C1q del complemento. GALT ("Gut Associated Lymphoid Tissue"): Tejido linfoide de la mucosa gastrointestinal. Gammaglobulinas: Protenas sricas con movilidad electrofortica en la regin gamma. La mayora de las inmunoglobulinas migran en esta regin. Gammapatas monoclonales: Desrdenes que se caracterizan por presentar inmunoglobulinas monoclonales. Un ejemplo de estas enfermedades es el Mieloma mltiple. Generacin de diversidad: Se refiere al proceso mediante el cual se produce un gran nmero de regiones V de los anticuerpos. Genes C: Segmentos gnicos que codifican la regin constante de las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas y de las cadenas alfa, beta, gamma y delta de los receptores de clulas T. Genes D: Segmentos gnicos situados entre los genes V y J en las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas, y en los genes de las cadenas beta y gamma de los receptores de las clulas T, que se recombinan con V y J durante la ontogenia. Genes J: Segmentos gnicos en los genes de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas, y en los genes para las cadenas de receptores de clulas T, que se combinan durante la diferenciacin linfocitaria. Codifican parte de los dominios variables. Genes V: Genes que codifican la mayor parte de los dominios V de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos, y de las cadenas alfa, beta, gamma y delta de los receptores de clulas T. Genoma: Todo material gentico contenido dentro de la clula. Genotipo: Material gentico heredado de los padres. El individuo no expresa necesariamente todo este material. Gradiente de Ficoll: Es utilizado para aislar clulas de diferente densidad. En particular es muy utilizado para separar linfocitos. El Ficoll es un polmero sinttico.

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Grupo inmunodominante: Elemento estructural de un eptopo que aporta la mayor energa para la interaccin con un anticuerpo. GVH ("Graft Versus Host"): Proceso causado por linfocitos donantes alognicos que reaccionan contra los tejidos del husped en un receptor inmunolgicamente comprometido. H-2: Complejo Principal de Histocompatibilidad del ratn. Haplotipo: Conjunto de determinantes genticos situados en un solo cromosoma. Hapteno: Molcula pequea que puede actuar como eptopo, pero es incapaz de provocar por s misma una respuesta de anticuerpos. Hematopoyesis: Proceso por el cual se forman, diferencian y maduran las clulas sanguneas. Hemolisina: Un anticuerpo u otra sustancia capaz de producir lisis eritrocitaria. HEV (High Endothelial Venule): Vnula de endotelio columnar (alto). rea especializada de las vnulas post-capilares, a travs de las cuales los linfocitos migran hacia los ganglios linfticos. Heterohibridoma: Clula hbrida -constituida por dos hibridomas diferentes- que secreta un anticuerpo bifuncional. Heterlogo: Se refiere a las diferencias antignicas intraespecies. Hibridoma: Lnea celular creada in vitro mediante fusin de dos tipos de clulas linfoides, uno de los cuales es tumoral. Los hibridomas ms conocidos son aquellos constituidos con un linfocito B, confirindoles la propiedad de secretar anticuerpos monoclonales. Hipersensibilidad inmediata: Sensibilidad inmunolgica mediada por anticuerpos que se manifiesta por reacciones tisulares pocos minutos despus de la unin antgeno-anticuerpo. Hipogammaglobulinemia: Deficiencia de las clases mayores de inmunoglobulinas sricas (IgG, IgM, IgA).

Histamina: Amina vasoactiva contenida en los grnulos de mastocitos y basfilos, que causa contraccin de la musculatura lisa de bronquiolos humanos y vasos sanguneos pequeos. Aumenta la permeabilidad capilar y la secrecin de glndulas de las mucosas bronquial y nasal. Hipergammaglobulinemia monoclonal: Incremento de las inmunoglobulinas producidas por un solo clon de clulas B. Contiene una clase de cadenas H y un tipo de cadenas L. Hipergammaglobulinemia policlonal: Incremento de las gammaglobulinas de varias clases. Contiene diferentes cadenas H y L. Hipersensibilidad: Ver alergia. Histocompatibilidad: Situacin que permite que se acepten injertos entre individuos. HLA (Human Leukocyte Antigen): Complejo Principal de Histocompatibilidad humano. Homlogo: De la misma especie. Humoral: Relativo a los lquidos extracelulares incluyendo el suero y la linfa. ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule1): Molcula de la superficie celular, que se encuentra en varios tipos de leucocitos y en clulas no hematopoyticas, que interacta con LFA-1 e interviene en el trnsito celular. Idiotipo: Antigenicidad de la regin V de un receptor linfocitario T o B. Corresponde al conjunto de idiotopos de ese receptor. Idiotopo: Determinante antignico nico de la regin V de un anticuerpo o de un receptor linfocitario. IgA: Inmunoglobulina predominante en las secreciones. Se caracteriza por la presencia de cadenas pesadas alfa (). IgA secretora: Dmero de molculas de IgA unidas por una cadena J y que presenta un componente secretor. IgD: Inmunoglobulinas de 185 kDa y glicosilada en 9-14% . Se encuentra en la membrana de los

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linfocitos B circulantes. Tiene cadenas pesadas delta () IgE: Inmunoglobulina involucrada en reacciones de hipersensibilidad inmediata. Caracterizada por cadenas pesadas de tipo psilon (). IgG: Inmunoglobulina de aproximadamente 150 kDa con capacidad de fijar complemento y atravesar la placenta. Se encuentra predominante en el suero. Presenta cadenas pesadas de tipo gamma (). IgM: Inmunoglobulina pentamrica de 900 kDa que representa aproximadamente el 10% de las inmunoglobulinas presentes en el suero. Sus cadenas pesadas son de tipo mu (). Imagen interna: Anticuerpo anti-idiotpico cuyo sitio de combinacin se asemeja o representa al eptopo de un antgeno. Infeccin oportunista: Infeccin producida en individuos inmunodeprimidos, por microorganismos de baja virulencia en individuos inmunocompetentes. Inflamacin: Es la respuesta de un tejido a la injuria, la cual es funcin de la llegada de molculas del suero y clulas del sistema inmune al sitio del dao. La reaccin consiste de tres componentes locales: Incremento de la circulacin, incremento de la permeabilidad capilar y salida de clulas desde los vasos sanguneos al tejido daado Inmunidad adquirida o especfica: Respuesta inmune mediada por anticuerpos y clulas T caracterizada por ser especfica y presentar memoria. Inmunidad innata o inespecfica: Mecanismos de defensa presentes desde el nacimiento, los cuales no presentan especificidad ni memoria inmunolgica. Inmunidad mediada por clulas: Inmunidad en la que predomina la participacin de linfocitos y macrfagos. Inmunidad pasiva: Proteccin adquirida por la introduccin de anticuerpos preformados o clulas inmunes en individuos no inmunizados.

Inmunizacin: Administracin natural o artificial de un antgeno, para provocar una respuesta inmune; particularmente cuando sta conlleva a la proteccin del husped contra alguna enfermedad como es el caso de las vacunas. Inmunocomplejo: Complejo antgeno-anticuerpo, que puede contener tambin componentes del sistema del complemento. Inmunodeficiencias primarias: Son defectos genticos del sistema inmune y se manifiestan generalmente en la infancia. Inmunodeficiencias secundarias: Procesos desarrollados por una variedad de condiciones patolgicas, drogas inmunosupresoras o infecciones de las clulas del sistema inmune. Inmunodifusin radial: Mtodo para cuantificar antgenos por inmunodifusin, en el cual un antgeno se pone en un gel para que difunda por el agar que contiene el anticuerpo. Los crculos de precipitacin resultantes reflejan la concentracin del antgeno. Inmunoelectroforesis: Mtodo que combina una separacin electrofortica inicial de protenas seguidas por una inmunodifusin con el resultado de formacin de arcos de precipitacin. Inmunofluorescencia: Mtodo que permite la identificacin microscpica mediante el microscopio de luz o citometra de flujo, de antgenos localizados en tejidos o clulas, utilizando anticuerpos conjugados con fluorocromos. Inmunogenicidad: Capacidad de generar una respuesta inmune especfica, que produce anticuerpos y/o linfocitos T-activados. Inmungeno: Sustancia que cuando es introducida en un animal, estimula la respuesta inmune. Inmunoglobulina: Glicoprotena compuesta por cadenas H y L, que acta como anticuerpo. Los anticuerpos son inmunoglobulinas. Inoculacin: Introduccin de un antgeno o antisuero en un animal para conferir inmunidad.

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Integrinas: Familia de glicoprotenas dimricas de transmembrana que promueven la adhesin celular. Son un tipo de molculas de adhesin. Interferones: Grupo heterogneo de protenas de bajo peso molecular, elaboradas por clulas infectadas. Son un tipo de citoquinas. Interleuquinas (IL): Grupo de molculas, tambin denominadas citoquinas que intervienen en la sealizacin entre las clulas del sistema inmune. Intrn: Segmento del gen, ubicado entre los exones, que no codifica ninguna secuencia proteica. Isoelectroenfoque: Separacin de molculas sobre la base de su carga. A lo largo de un gradiente de pH, cada molcula migra hasta alcanzar una carga neta nula. Islogo: De constitucin gentica idntica. Isotipo: Se refiere a la variacin gentica dentro de una familia de protenas o pptidos, de forma que cada miembro de la especie tendr todos los isotipos de la familia representados en su genoma. Ej.: las clases de inmunoglobulinas. Lectinas: Sustancias derivadas de plantas. Se unen especficamente a azcares y oligosacridos, y tienen actividad de pan-aglutinina para eritrocitos. Las lectinas tambin son comnmente mitgenos. LES (Lupus Eritematoso Sistmico): Enfermedad autoinmune del ser humano, en la que habitualmente intervienen anticuerpos antinucleares. Leucotrienos: Grupo de metabolitos del cido araquidnico que tienen potentes efectos farmacolgicos. LFA (Leucocyte Functional Antigens): Grupo de tres molculas que median en la adherencia intercelular entre los leucocitos y otras clulas, de un modo antgeno-inespecfico. Son un tipo de molculas de adhesin. LGL (Large Granular Lymphocytes): Grupo de linfocitos morfolgicamente definidos que contienen la mayor parte de la actividad de las

clulas K y NK. Poseen marcadores linfocitarios y de monocitos/macrfagos. Ligamiento: Condicin en la que dos genes se hallan muy prximos en un cromosoma y suelen heredarse juntos. Ligando: Cualquier molcula que forma un complejo con cualquier otra molcula. A esta ltima se le llama receptor. Lnea celular: Clulas producidas por crecimiento continuo in vitro de un determinado cultivo celular. Las lneas celulares suelen contener varios clones. Lnea germinal: Material gentico transmitido a travs de los gametos, antes de que sea modificado por recombinaciones somticas o mutaciones. Linfoblasto: Precursor inmaduro de los linfocitos, presente normalmente en mdula sea. Linfoquinas: Trmino genrico para designar molculas que transmiten seales entre las clulas del sistema inmune, es decir son citoquinas y son producidas por los linfocitos. Linfocito: Son las clulas fundamentales en una respuesta inmune porque reconocen el antgeno en forma especfica va un receptor localizado en su membrana. Pueden ser de tipo B o T. Clula mononuclear de 7-12 m de dimetro, que presenta un ncleo con cromatina densamente compacta y escaso citoplasma. Linfocito activado: Linfocito que ha sido estimulado por un antgeno especfico o por un mitgeno no especfico, como por ejemplo una lectina. Linfocito B (Clula B): Clulas precursoras de las clulas plasmticas, productoras de anticuerpos. Linfocito T (Clula T): Clulas derivadas del Timo que participan en una variedad de reacciones inmunes mediadas por clulas. Lisosoma: Organelo que contiene enzimas hidrolticas y que est presente en el citoplasma de algunas clulas, como por ejemplo monocitos y macrfagos.

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LPS (Lipopolisacrido): Producto de las paredes celulares de algunas bacterias Gram negativas, capaz de actuar como mitgeno para las clulas B. Locus: Sitio del cromosoma en el que se encuentra un determinado gen. Macrfago: Clulas fagocticas mononucleares que se encuentran en algunos tejidos y que derivan de los monocitos. Presentan funciones accesorias en la inmunidad celular. Maduracin de la afinidad: Aumento de la afinidad de los anticuerpos. Se presenta con frecuencia durante una respuesta inmune secundaria. MALT (Mucosa Associated Lymphoid Tissue): Trmino genrico con que se denomina al tejido linfoide del tubo gastrointestinal, rbol bronquial y otras mucosas. Marcadores CD (Cluster of Diferentiation): Molculas de la superficie celular que pueden distinguirse con la ayuda de anticuerpos especficos. Se utilizan generalmente para diferenciar las distintas poblaciones celulares y estadios de maduracin de las clulas del Sistema Inmune. Medio HAT: Medio de cultivo utilizado para seleccionar los hbridos de una fusin entre linfocitos B y clulas mieloides. Contiene Hipoxantina, Aminopterina y Timidina. Memoria inmunolgica: Mayor respuesta de un animal inmune a la segunda o subsecuente administracin de un antgeno. Mieloma mltiple: Tumor de clulas plasmticas. Las clulas del mieloma producen una inmunoglobulina monoclonal llamada paraprotena, la cual es detectable en el suero del paciente (componente monoclonal). Mimotopo: Pptido sinttico que imita o contiene la estructura de un eptopo. Eptopo sinttico. Mitgeno: Sustancia que estimula la sntesis del DNA, transformacin blstica y finalmente divisin de linfocitos. MLR/MLC (Mixed Lymphocyte Reaction/ Mixed Lymphocyte Culture): Sistema analtico para observar el reconocimiento de las clu-

las alognicas, por parte de las clulas T. La respuesta se mide por la proliferacin que se produce en presencia de las clulas estimulantes. Molculas MHC clases I, II, III: Tres clases principales de molculas codificadas dentro del MHC. Las molculas de clase I poseen un pptido MHC, asociado con la Beta2-microglobulina; las molculas de clase II poseen dos pptidos codificados por el MHC, asociados de forma no covalente. Monoclonal: Derivado de un solo clon, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que son producidos por un nico clon de clulas B y tienen carcter homogneo. Mutacin gentica: Cambio, delecin, insercin o inversin de una base o secuencia nucleotdica en la molcula de DNA. Mutacin somtica: Proceso que ocurre durante la maduracin de las clulas B y que afecta la regin V de los anticuerpos, aumentando la afinidad del anticuerpo por el antgeno. Oligoclonal: Conjunto de anticuerpos de especificidad restringida. Opsonizacin: Proceso por el cual se facilita la fagocitosis mediante depsito de opsoninas (un Ej.: anticuerpos y C3 b) sobre el antgeno. rganos linfoides primarios: rganos linfoides que son esenciales para la diferenciacin de los linfocitos. Estos rganos son el Timo para los linfocitos T y la Mdula sea, bolsa de Fabricio en las aves, para los linfocitos B. rganos linfoides secundarios: rganos linfoides perifricos en los cuales se producen las respuestas inmunes adquiridas. Estos rganos son el bazo, los ganglios linfticos y el tejido linfoide asociado a mucosas. PAF (Platelet Activating Factor): Factor activador de las plaquetas. Factor liberado por los basfilos que causa agregacin plaquetaria. Paraproteinemia: Condicin presente en un grupo heterogneo de enfermedades caracterizada por la presencia de inmunoglobulina monoclonal en el suero u orina.

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Paratopo: Parte de la molcula del anticuerpo que se une al eptopo. Patgeno: Microorganismo que causa enfermedad. PHA (Phitohemaglutinin): Mitgeno para clulas, principalmente linfocitos T. Estimula la sntesis de DNA y la transformacin blstica de los linfocitos. Pinocitosis: Proceso mediante el cual la clula capta lquidos o partculas muy pequeas. Placas de Peyer: Tejido linfoide ubicado en la mucosa del intestino delgado. Contienen todos los elementos involucrados en una respuesta inmune: linfocitos B, clulas plasmticas, centros germinales, macrfagos y reas dependientes de clulas T, entre otros. Plsmido: Pequeo DNA circular de origen bacteriano que contiene resistencia a antibiticos. Se utiliza como vector de clonamiento. Plasmina: Enzima fibrinoltica capaz de digerir proteolticamente la protena C1 del complemento. Policlonal: Se refiere a la activacin policlonal y mitosis de clulas T o B que tienen diferentes receptores en su superficie, es decir, en una respuesta policlonal participan mltiples clones de diferente especificidad. Presentacin antignica: Proceso por el cual las clulas presentadoras de antgeno expresan el antgeno en molculas MHC en su superficie; de esta manera el antgeno es reconocible por los linfocitos T. Procesamiento antignico: Modificacin del antgeno en una forma que puede ser reconocido por los linfocitos T. Proteasoma: Es un complejo de proteasas multicatalticas que rompe protenas citoslicas en pequeos fragmentos. Dos de sus componentes (LMP-2 y LMP-7) son codificados dentro del MHC. El proteasoma produce trocitos de antgeno que pueden ser cargados sobre molculas MHC de clase I.

Prostaglandinas: Derivados farmacolgicamente activos del cido araquidnico. Las diferentes prostaglandinas son capaces de modular la movilidad de las clulas y las respuestas inmunes. Protena bsica mayor: Protena txica de la membrana de los eosinfilos que produce dao tisular en alergias y enfermedades inflamatorias. Protena de Bence-Jones: Cadena liviana monoclonal presente en la orina de pacientes con gammapatas monoclonales. Protenas de fase aguda: Protenas sricas cuyos niveles aumentan durante la infeccin o las reacciones inflamatorias. Protenas G: Protenas regulatorias que ligan guanidn-nucletidos, y que acoplan la seal desde el receptor a una activacin de enzimas asociadas a la membrana o a la actividad de canales inicos. Prueba Coombs: Mtodo para detectar inmunoglobulinas unidas a glbulos rojos. En la Prueba de Coombs directa, los eritrocitos de un individuo sensibilizado son aglutinados por anticuerpos anti-gammaglobulinas (Suero de Coombs). En la Prueba de Coombs indirecta, el suero del paciente es incubado con eritrocitos normales y las clulas sensibilizadas son aglutinadas con una anti-inmunoglobulina. Prpura trombocitopnico inmune: Sndrome clnico, en el cual existe trombocitopenia persistente asociada a la presencia de autoanticuerpos circulantes. Quimiotaxis: Aumento de la migracin direccional de las clulas, particularmente en respuesta a gradientes de concentracin de ciertos factores quimioatractantes o quimiotcticos. Quininas: Grupo de mediadores vasoactivos que se producen tras la lesin tisular. Radioinmunoensayo: Mtodo analtico cuantitativo en el cual un istopo radiactivo es usado para detectar antgenos o anticuerpos en alguna forma de inmunoensayo. Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR): Mtodo de amplificacin de segmentos de DNA

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o RNA de composicin conocida, usando partidores para iniciar la polimerizacin por las DNA o RNA polimerasas termoestables. Reaccin cruzada: La reaccin de un anticuerpo con un antgeno diferente del que estimul su secrecin. Receptor: Molcula de la superficie celular que se une especficamente a su ligando (protenas o pptidos). Receptor Fc: Receptor para los fragmentos Fc de inmunoglobulinas, presente en varias clulas. Receptor de clulas T: Receptor antignico de las clulas T que consta de un dmero alfa/beta (TCR-2) o gamma/delta (TCR-1), asociado al complejo CD3. Recombinacin: Proceso por el cual la informacin gentica se redistribuye durante la meiosis. Este proceso tiene lugar tambin durante la redistribucin somtica del DNA, que ocurre en la formacin de los genes que codifican las molculas de anticuerpo y los receptores antignicos de las clulas T. Regin constante: Regin carboxilo terminal, relativamente invariable de las cadenas pesadas y livianas de las inmunoglobulinas, y las cadenas alfa, beta, gamma y delta de los receptores de clulas T. Regin hipervariable: Se refiere a las tres zonas ms variables de la regin V en las cadenas de inmunoglobulinas y de los receptores de clulas T. Estas regiones contribuyen al sitio de unin con el antgeno. Repertorio: Es la suma total de receptores para antgeno producido en el sistema inmune de una especie dada. El repertorio inicial est parcialmente determinado por los genes del TCR y por las cadenas H y L de las inmunoglobulinas. Respuesta inmune celular: Proceso en el cual, la actividad inmune es llevada a cabo por linfocitos T citotxicos y clulas NK principalmente. Respuesta inmune humoral: Proceso en el cual, la actividad inmune es mediada por inmunoglobulinas que se encuentran principal-

mente en el suero, las que pueden activar el sistema del complemento. Respuesta primaria: Es la respuesta inmune (celular o humoral) que se produce despus de un encuentro inicial con un determinado antgeno. Respuesta secundaria: Respuesta inmunitaria que sigue a un segundo o subsiguiente encuentro con un determinado antgeno. Respuesta tipo Th1 y tipo Th2: El sub-set de linfocitos Th1 promueve las respuesta de tipo celular, mientras que el sub-set Th2 promueve respuestas mediadas por anticuerpos. Cada modo de respuesta modula a la otra. Por ejemplo, el IFN producido por linfocitos Th1 limita la proliferacin de clulas Th2. Restriccin MHC: Los linfocitos T reconocen antgenos asociados con ciertas molculas MHC. Por ejemplo, un linfocito T que reconoce un antgeno asociado con H-2Kb no lo reconoce si est asociado con H-2Db H-2Kk. La base de esta observacin, es que los linfocitos T pueden interactuar con molculas MHC propias que han sido selectivamente expandidas en el timo, y que estn preparadas para responder a antgenos sobre clulas presentadoras de antgeno que tienen estos mismos MHC. Retrovirus: Virus que contiene y utiliza una transcriptasa inversa. Roseta E: Formacin de un grupo (roseta) de clulas consistente en eritrocitos y linfocitos T humanos. Roseta EAC: Grupo de eritrocitos sensibilizados con anticuerpo y complemento, alrededor de linfocitos B humanos. Segmentos de andamiaje: Secciones de las regiones V del anticuerpo, situadas entre las regiones hipervariables. Seudogenes: Genes con estructuras homlogas a las de otros genes, pero que no pueden ser expresados. S.I.D.A.: Inmunodeficiencia, causada por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH).

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Sinergismo: Interaccin cooperativa. Singnico: Animal perteciente a cepas obtenidas mediante procreacin endogmica, de forma que las parejas de autosomas dentro de un individuo son idnticas. Sistema fagoctico mononuclear (SFM): Incluye monocitos y macrfagos. Sistema linftico: Es el sistema de vasos que recorre el cuerpo y recibe el exudado de los tejidos llevndolo a la sangre. Este lquido transparente recibe el nombre de linfa. Este sistema tambin acta como una ruta importante en el movimiento de antgenos desde la periferia a los ndulos linfticos y en la re-circulacin de linfocitos y clulas dendrticas. Subclases de inmunoglobulinas: Subdivisin de las clases de inmunoglobulinas basado en diferencias antignicas y estructurales en las cadenas pesadas (H). En humanos existen cuatro subclases de IgG: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Superfamilia de las inmunoglobulinas: Grupos de genes relacionados estructuralmente que codifican a las inmunoglobulinas, receptor de clulas T, molculas MHC y otras molculas. Supresin: Una subpoblacin de linfocitos T (T supresores o Ts) modula la actividad de otros linfocitos. TAP-1 y TAP-2: (Protenas transportadoras de antgeno) Son miembros de la familia de transportadores ABC codificados en el MHC. Ellas transfieren pptidos a travs de la membrana del retculo endoplsmico, para ser presentados a molculas MHC de clase I. Timo: rgano linfoide primario habitualmente ubicado en la parte superior del trax, en el cual se produce el desarrollo y maduracin de las clulas T. Ttulo de anticuerpos: Concentracin relativa de los anticuerpos presentes en una muestra de suero u otro fluido. TNF (Tumor Necrosis Factor): Citoquina liberada por los macrfagos activados.

Tolerancia: Falta de respuesta inmune especfica. Toxoide: Derivado antignico no txico proveniente de una toxina. Transcriptasa reversa: Enzima que cataliza la transcripcin del RNA a DNA. Transferencia pasiva: Tratamiento basado en la transferencia de anticuerpos o clulas inmunes extrados de un individuo sensibilizado a un antgeno, a otro individuo. Vacunacin: Inmunizacin con antgenos administrados para la prevencin de enfermedades infecciosas. Vacuna anti-idiotpica: Vacuna que contiene un anticuerpo anti-idiotpico como inmungeno. El anticuerpo anti-idiotpico es una imagen interna de un antgeno. Vacuna recombinante: Vacuna que contiene un antgeno preparado mediante tecnologa del DNA recombinante o un virus recombinante como inmungeno. Vacuna gnica: Contiene DNA que codifica un antgeno. Vacuna sinttica: Vacuna que contiene pptidos sintticos como inmungeno. Va alternativa del complemento: Va de activacin del sistema del complemento en que interviene C3 y los factores B, D, P, H e I. Interactan en la vecindad de una superficie activadora para constituir una va alternativa en la formacin de la C3-convertasa. Va clsica del complemento: Va por la cual los complejos antgeno-anticuerpo pueden activar el sistema del complemento; en la generacin de C3 convertasa participan los componentes C1, C2 y C4. Va de la lipoxigenasa: Metabolismo enzimtico de la membrana celular. A partir del cido araquidnico se generan leucotrienos. Va ltica: Participan los componentes C5-C9 (Complejo de ataque a membrana), responsable

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de la lisis de las membranas en las clulas sensibilizadas. Xenognico: Dcese de las diferencias antignicas interespecies. Xenosensibilizacin: Respuesta inmune de una especie animal contra antgenos de otra especie.

Referencia Palomo I., Ferreira A., Seplveda C., Rosemblatt M., Vergara U., (Eds.), Fundamentos de Inmunologa, Editorial Universidad de Talca, 1998. Modificado por Palomo I., Carrin F., Becker M. I.

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NDICE ALFABTICO GENERAL DE MATERIAS

A
ABO (ver Sistema ABO) 111, 440 Activacin 65, 195, 202, 205 Adenina 740 Adenosin deaminasa 499 ADN 739 Adyuvante de Freund`s 600 Afinidad 136 Agammaglobulinemia 499 Alelos, exclusin 142 Alergeno 114 Alergia 381 Aloinjerto 621 Aloinmunidad 442, 447 Alognico 621 Anafilctico, shock 393 Anemia hemoltica inmune 439 Anergia clonal 272 Anticuerpo (ver adems Inmunoglobulina) afinidad 136 anti-citoplasma de neutrfilos 455 antiespermticos 321 antifosfolpidos 425 anti-idiotipo 283 anti-injerto 623 avidez 136 biosntesis 146 biotecnologa (usos) 731 cadenas livianas 127 pesadas 127 clases 130 diversidad 136 estructura 120 monoclonal 721 Antigenicidad 106

Antgeno 105 asociacin MHC 185, 187 clasificacin 113 caractersticas 113 de diferenciacin 759 determinante antignico 106 eptopo (ver en E) eritrocitario 111, 439 hapteno 108 histocompatibilidad 174 neutrfilos 453 plaquetas 446 procesamiento y presentacin endgena 185 exgena 187 Anti-idiotipo 283 Antihistamnicos 381 Apoptosis 271 Artritis Reumatodea 411 Asma bronquial 381, 395 Atpico 380 Autoanticuerpo 404 Autoantgeno 404 Autotrasplante 621 Autoinmune 404 Autotolerancia 404

B
2-microglobulina 171 Bacteria, inmunidad frente a Basfilo 74 Bazo 82 533

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C
C, regin inmunoglobulina 127 receptor clula T 152 Cadena MHC clase I 174 MHC clase II 174 MHC clase II 174 clula T 152 anticuerpo 133 receptor clula T 153 anticuerpo 131 receptor clula T 153 Invariante (Ii) 188 127 127 Calnexina 188 CD, molculas 759 CDR 136 Clula de Langerhans 65 endotelial columnar (CEC) 81 M 304 mtodos de separacin 658 leucocito (ver en L) presentadora de antgenos (CPA) 183 Centro germinal 80 CSF 56 CFU 56 Chaperonina 187 Citolisis complemento 344 linfocitos Tc 352 natural killer 358 Citopenia inmune 439 Citoquina (ver Interleuquina) Citosina 740 Citotoxicidad anlisis de 658 mediada por clula 349 Clonamiento 742 Colgeno 55 Complejo ataque membrana 344 Complejo Principal de Histocompatibilidad ( MHC) antgeno (o molcula) 169 clase I 171

clase II 172 clase III 173 Complejo inmune 383 Complejo multicataltico (ver proteasoma) Complemento va alterna 341 clsica 337 C1 333 C2 333 C3 333 C4 333 C5 333 C6 333 C7 333 C8 333 C9 333

D
D, regin genes cadenas H de Ig 137 Deficiencia inmunitaria combinada grave (SCID) 498 Dficit adenosin desaminasa 498 adhesin leucocitaria 498 mieloperoxidasa 498 purn-nuclesido-fosforilasa 499 Delecin clonal 272 Desoxirribosa 740 Dermatitis por contacto 385 Determinante antignico (ver Eptopo) Diacilglicerol 194 Difusin en gel agarosa 643 Di George, anomala de 507 Disociacin, constante de 136 Disgenesia reticular 505 Dominios de inmunoglobulinas dominios constantes 130 dominios variables 128 Donante 621

E
Efecto carrier 598 Electroforesis 462 ELISA 650 Endotelio columnar 81 Enzimas de restriccin 742 Eosinfilo 73

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Eptopo 106 Exon 747

F
Fab 128 Factor B (Complemento) 332 D (Complemento) 332 estimulante de colonias granulocito/macrfago (ver GM-CSF) H (Complemento) 332 I (Complemento) 332 necrosis tumoral (TNF) 217 quimiotctico 67 Fagocitosis 70 fagosoma 70 opsonizacin 70, 330 Fibronectina 55 Fluorescencia 649, 701 Fluorocromos 706 Fusin 725

Hipersensibilidad manifestaciones orales 749 tipo I 381 tipo II 382 tipo III 383 tipo IV 384 Hipogammaglobulinemia 498 Histamina 75, 380, 390 Homing linfocitario 253

I
Idiotipo 130 Idiotopo 130 IgA secretora 133, 305 Inflamacin 96 Inmunidad adquirida 58, 100 innata 87 Immunoblotting 651 Inmunodeficiencia manifestaciones orales 480 primaria 497 secundaria 513 Inmunodifusin 643 Inmunoelectroforesis 463, 644 Inmunofluorescencia 649 Inmungeno 590 Inmunogenicidad 106 Inmunoglobulina (ver adems Anticuerpo) IgA 132 IgD 133 IgE 134 IgG 131 IgM 132 BCR 120 Inmunomodulador 629 Inmunoprecipitacin 641 Inmunosupresin 624 Inmunoterapia 613, 629 Inmunotoxinas 614 Infeccin 533, 547, 559, 569 Inositol 1,4,5-trisfosfato (IP3) 199 Integrinas 245 Interleuquinas 211 Intron 747 Isotipo 130

G
Gammaglobulinas 461 Ganglios linfticos 80 Gen 739 Glucocorticoides 631 GM-CSF 56 G-CSF 56 Granulocito 65 Guanina 740

H
Hapteno 108 Haplotipo 176, 691 HAT (medio seleccin) 723 Hemaglutinacin 647 Hematopoyesis 55 Heterohibridomas 731 Hibridomas 722 HLA 171, 687

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J
J, cadena IgA 132 IgM 132

M
Macrfago 63 MALT (Mucosal Associated Lymphoid Tissue) 83 Mastocito 75, 381, 389 M-CSF 56 Mdula sea 75 Megacariocito 56 MHC (ver Complejo Principal de Histocompatibilidad) Mieloma mltiple 467 Molculas de adhesin Integrinas 245 Superfamilia de las Ig 246 Selectinas 248 Molculas CD (ver CD, molculas) Monocito 62 Monoclonal (ver anticuerpo monoclonal)

K
Ka (constante de asociacin o afinidad) 136 (cadena Kappa) 127 Kd (constante de disociacin) 136

L
(cadena Lambda) 127 Laminina 55 Leucocito basfilo 74 eosinfilo 73 linfocito 57 monocito 62 neutrfilo 65 Leucoplasia pilosa 481 Leucotrieno 90 Linfocito B activacin 62 de memoria 60 diferenciacin 266 funcin 59 marcadores 777 receptor antignico (BCR) 120 T activacin 62 citotxico 59, 352 de memoria 60, 352 diferenciacin 59, 269 helper 59 molculas accesorias 163 MHC 181 receptor (TCR) 152 CD3 154 Th1, Th2, Th0 226, 282 Linfoquinas (ver Interleuquina) LMP 185 Lisozima 93 Litre 114 Lupus Eritematoso Sistmico 402, 416

N
Natural killer 58, 351 Neutrfilo 65 Neutropenia inmune 453

O
Opsonizacin 330 rganos linfoides primarios 75 secundarios 80

P
Papana 128 Parsito, respuesta inmune a 569 Paratopo 127 Pptidos reconocimiento por TCR 181 unin a molculas MHC 184 vacunas sintticas 596 Perforina 355 Plaqueta 56, 445 Plasma protenas, inflamacin 98 Plasmacitoma 470

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Polimorfismo molculas MHC 170, 687 Polimorfonuclear separacin de 658 evaluacin de funcin 678 Properdina 332 Prostaglandinas 96 Proteasoma 185 Protena de Bence-Jones 461 Protena Kinasa 196

Q
Quimioquinas 237 Quimiotaxis 67

R
Radioinmunoanlisis 652 Reaccin de la polimerasa en cadena 745 Receptor de clulas B (BCR) 120 de clulas T (TCR) 152 citoquinas 219 Fc 68, 127 fracciones del Complemento 332 molculas de adhesin 244 Respuesta inmune clulas que intervienen 55 funciones efectoras 329, 351, 367 regulacin 277 seleccin clonal 62 Rinitis alrgica 381 Ribosa 740 RNA 739

Shock anafilctico (ver, Anafilctico shock) SIDA 513 Sndrome antifosfolpido 425 de Good Pasture 402, 382 de Sjgren 432 de Wiskott-Aldrich 507 Hiper-IgM 501 Inmunodeficiencia adquirida o secundaria 511 Sistema antgeno leucocitario humano (HLA) 169, 687 Sistema ABO (grupo sanguneo) (ver ABO) complemento 329 endocrino 292 fagoctico-mononuclear 62 inmune, clula 55 linftico 57 quininas 94 Southern blot 743 Superantgeno 114 Superfamilia de las Inmunoglobulinas 246

T
Timina 740 Timo desarrollo clula T 269 estructura 78 Timocito 270 Tiroiditis Hashimoto 402 Tirosina kinasa (ver Protena Kinasa) Tolerancia oral 309 Transgnico 746 Transmigracin linfocitaria 250 Trasplante (Inmunologa) 621 Trombocitopenia inmune 445 Tumor (Inmunologa) 607

S
S, protena 332 Segundo mensajero 199 Seleccin clonal 62 negativa 272 positiva 271 Selectinas E-Selectina 248 L-Selectina 248 P-Selectina 248

U
lcera oral recurrente (aftas) 484 Unin, antgeno-anticuerpo 640 Uracilo 740

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V
V (regin variable) inmunoglobulinas 128 receptor de clulas T 152 Vacunas adyuvantes 600 anti-idiotpicas 596 efecto carrier (ver efecto carrier) naturales (tradicionales) 590 recombinantes 593 sintticas 596 Virus, inmunidad frente a 559

W
Western blot (ver Immunoblotting)

X
Xenoantgeno 621 Xenotrasplante 621

Z
Zona exceso 642 equivalencia 642

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Este libro se termin de imprimir en Impresora Gutenberg-Talca, en una tirada de 450 ejemplares en Octubre de 2002.

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